JPH03228679A - 有機化合物に関する改良 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、トスポウイルス感染に対する感受性が低い
植物、この耐性を生み出すのに使用される遺伝物質、単
離または診断用プローブ並びに上記植物および遺伝物質
およびプローブを得る方法に関するものである。

［従来の技術］ 一般に、ウィルス感染は、例えば植物の生長、形態およ
び収量に対して様々な有害な影響を与える。また、ウィ
ルス感染の結果として、感染植物の他の植物病原体およ
び植物害虫に対する感受性が高められることが多い。植
物ウィルスの伝染は、一般に昆虫もしくは真菌媒介体に
よるか、または機械的に行なわれる。

植物品種数良家は、特定ウィルス株に対する耐性または
抵抗性を示す種類の農作物品種の開発を絶えず試みてい
る。伝統的に、ウィルス耐性遺伝子は、品種改良によっ
て野生近縁体から商業的品種へ導入される。野性近縁体
の遺伝子プールから栽培変種への既存抵抗性の導入は、
まず耐性遺伝子（複数も可）を供給源（ドヂー）である
植物の種類中において同定することを要し、耐性遺伝子
を商業的品種の完全な遺伝子プールと結び合させなけれ
ばならない冗長なプロセスである。この方法で生み出さ
れた抵抗性または耐性は、多くの場合問題のウィルスの
うちの１種または数種に対してしか活性を示さない。ま
た、特定種類のウィルスへの耐性に関する品種改良によ
る栽培変種は、農作物の種類内においてこの耐性に関す
る遺伝子供給源が欠如していることにより制限されるこ
とが多い。植物に対するウィルス病の影響を阻止または
低減化するための他の方法は、ウィルス媒介体に対して
作用する化学薬品または他の方法の使用、例えば殺虫剤
、殺菌剤または良好な植物衛生作用条件の使用である。

しかしながら、化学薬品を用いて媒介体を殺すことによ
りウィルス病と闘う方法は、政府が強要するますます厳
しい使用規制を受けなければならず、栽培者は、許容さ
れた化学植物保護剤の領域の減少に直面することになる
。

別法として、「交差防御」と呼ばれるノステムが使用さ
れ得る。交差防御とは、植物が−ウイルス株に感染する
ことによって、第２の関連ウィルス株による重感染から
植物が保護される現象である。

すなわち、この後記方法では、優先的に無毒性ウィルス
株を用いて植物を感染させ、同ウィルスの毒性株による
２次感染を阻止する。しかしながら、この天然交差防御
システムの使用は幾つかの不利益を有する。この方法は
、植えられた農作物全ての接種を必要とするため非常に
面倒であり、また突然変異の結果、前記無毒性株がさら
に毒性の高い株になることにより、それ自体による病気
が発生するという危険が生じる。また、ある種の植物に
ついては無毒性のウィルス株が別種の植物については毒
性株として作用する可能性がある。

幾つかの研究は、防御性ウィルスのウィルスコート蛋白
質が交差防御において重要な役割を演しること、および
定住ウィルスおよび攻撃性ウィルスが同一または密接に
関連したコート蛋白質構造を有する場合に防御が行なわ
れることを示した。

遺伝子操作および植物形質転換システムの最近の進展に
より、ウィルス抵抗性を生み出す新たな方法が出現した
。遺伝子工学による交差防御は、表現型的に天然交差防
御と似ているウィルス抵抗性の一形態であるが、遺伝子
操作による植物のゲノムからのウィルスコート蛋白質の
遺伝子情報の発現により達成される。遺伝子工学による
ウィルス抵抗性の発生に成功した最初の実験は、ビーチ
−等（１９８５）およびアベル等（１９８６）により遂
行された。彼等は、トランスジェニック植物のゲノムか
らタバコ・モザイク・ウィルス株ＬＪＩ（ＴＭＶ−０１
）コート蛋白質遺伝子を発現させた結果、’Ｉ”　Ｍ　
Ｖ株による感染後に症状の発現が遅れることを示した。

アルファルファ・モザイクウィルス（Ａ　Ｍ　Ｖ　）、
ジャガイモウィルスＸ（ＰＶＸ）およびキュウリ・モザ
イクウィルス（ＣＭＶ）におけるコート蛋白質介在防御
に関しても似た結果が得られた。

ＴＭＶｌＣＭＶ、ＡＭＶおよびＰＶＸは異なるウィルス
群に属するが、それらは共通の構造を共有する。これら
全てのピリオンにおいて、ウィルスＲＮＡは、個々独立
ではあるが同一の多数のウィルスコート蛋白質から成る
ウィルスコートにより包模された正ｍＲＮＡである。

トスポウイルス（Ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓ）ぼ、本質的に
はこれらの植物ピリオンとは異なる。トスポウイルス属
は、ブニャビリダエ（Ｂ　ｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）に
属する。トスポウイルスは全てアザミウマにより伝染す
る。ウィルス粒子は球形状（直径８Ｏ−１２０ｎ霞）で
あり、糖蛋白質表面突起が散在した脂質エンベロープに
より囲まれた内部ヌクレオカプシドを含む。マル・チパ
ータイト（ｍｕｌｔｉｐａｒｔｉｔｅ）ゲノムは、陰性
またはアンビセンス（ａｍｂｉｓｅｎｓｅ）極性の線状
１本鎖ＲＮＡ分子により構成される。これらのＲＮＡ分
子の末端ヌクレオチドは、５°　ＡＧＡＧＣＡＡＵＸ、
、、、、、、、、、、、、ＧＡＵＵＧＣＵＣＵ　３’（
ここで、ＸはＣまたはＵである）という共通配列をコー
ドする、。トスポウイルスの代表的構成員は、トマト・
スボッテド・ウイルトウイルス（ＴＳＷＶ）、およびＴ
ＳＷＶアイ（ｅｙｅ　ｔｙｐｅ）型としても知られてい
るホウセンカ属（インペイシャンズ、１ｓｐａｔ　１ｅ
ｎｓ）ネクローシス・スポット・ウィルスである。

ＴＳＷＶピリオンは、４つの異なる構成蛋白質を含む。

すなわち、２９ｋｄの内部ヌクレオカプシド蛋白質Ｎ並
びに２つの膜種蛋白質：約７８ｋｄのＧ、および約５８
ｋｄのＧ、。さらに、少量の巨大蛋白質しく約２６０　
ｋｄ）がウィルス粒子から検出された。ＴＳＷＶのゲノ
ムは、±２９００ｎｔ（Ｓ　ＲＮＡ）、±５０００ｎＬ
（Ｍ　ＲＮＡ）および±７５００ｎｔ（Ｌ　ＩＩＮＡ）
の３種の線状１本鎖ＲＮＡ分子により構成され、各々ヌ
クレオカプシド蛋白質および数コピーのし蛋白質と堅く
結合して環状ヌクレオカプシドを形成している。ＴＳＷ
Ｖピリオンの大部分の特性を概説する概要構造を第１図
に示す。これらおよび他の特性に基づき、’ｒｓｗｖは
、トスポウイルス群の代表として分類されている。

さらに、ＴＳＷＶは、トスポウイルスの型構成員として
考えられる。Ｍ　ｒｔＮＡコード化遺伝子が、直接的ま
たは間接的にＧＩ膜糖蛋白質の合成に関与することを示
唆する情況証拠のみが提示された（パークレイジおよび
ピーターズ、１９８３）。他のＲＮＡ分子の暗号化特性
およびゲノムＲＮＡの極性はこの発明以前にはまだ未知
であった。

先に述べた通り、’ｒ　ｓ　ｗ　ｖなどのトスポウイル
スは、ある種のアザミウマにより伝染する。ＴＳＷｖの
媒介体はスリピダエ（Ｔｒｉｐｉｄａｅ）科に属し、タ
バコ・スリラプス（フランクリニエラ・フスカ（ヒンズ
）、Ｆｒａｎｋｌｊｎｉｅｌｌａ　ｆｕｓｃａ（Ｈｉｎ
ｄｓ、））、ウエスタン・フラワー・スリラプス（エフ
・オクンデンタリス（ペルガンデ）、Ｆ、　ｏｃｃｉｄ
ｅｎｔａｌｉｓ（Ｐｅｒｇａｎｄｅ））、コモン・ブロ
ツサム・スリラプス（エフ・シュルツェイ（トリボム）
、Ｆ、　ＳｃｈｕｌＬｚｅｉ（Ｔｒｙｂｏｍ））、チリ
・スリラプス（シルトスリラプス・ドルサリス（フード
）、５ｃｉｒｔｏｔｈｒｉｐｓ　ｄｏｒｓａｌ　１ｓ（
ｆｌｏｏｄ））、スリラプス・セトスス（モールトンＸ
Ｔｈｒｉｐｓ　ｓｅｔｏｓｕｓ（Ｍｏｕｌｔｏｎ））、
オニオン・スリラプス（ティー・タバン（リンデマン）
、Ｔ、　ｔａｂａｃｉ（Ｌｉｎｄｅ＋＋＋ａｎ））、エ
フ・イントンサ（Ｆ、　１ｎｔｏｎｓａ）およびティー
・パルミ（Ｔ、　ｐａｌａｉ）を含む。アザミウマは、
それらの幼虫期中にのみウィルスを獲得する。幼虫は、
それらがふ化する前にウィルスを伝染させ得るが、より
一般的には成虫かウィルスを伝染させろ。成虫は、寿命
のある間終始感染性を残し得る。

ＴＳＷＶは、今や全ての大陸全土にわたって分布してい
るため、最も広く分布した植物ウィルスの一つとなって
いる。このウィルスは、世界中の温帯、亜熱帯および熱
帯気候領域に広まっている。

単子葉植物および双子葉植物の両方を含め、５０科の植
物を代表する少なくとも３７０種の植物が自然感染して
いる。ＴＳＷＶは、食物および鑑賞作物の生産に深刻な
影響を与える。植物がＴＳＷＶ株により感染すると、一
般に例えば発育阻害、輪紋、暗紫色−褐色の窪んだ斑点
、茎の褐変、花の亀裂、壊死および色素病変およびパタ
ーン、黄色および非壊死的斑点、緑葉におけるモザイク
が現れるか、さらに植物全体の死に至る。大部分の宿主
はこれらの兆候の一部しか呈しない。ＴＳＷＶにより生
じる広範な兆候は診断を複雑にするため、個々の病気に
幾つかの異なる名称が与えられてしまう。また、同種の
植物内におけるＴＳＷＶ兆候は、植物の年齢、植物の生
活環中における感染時間、栄養レベルおよび環境条件、
特に温度により異なり得る。

ＴＳＷＶは何年も前から知られており、広く分布し、農
作物および鑑賞植物において経済的に重大な病気を誘発
しているが、ＴＳＷＶ耐性遺伝子の供給源の同定におけ
る進歩は限られている。多遺伝子ＴＳＷＶ耐性はりコペ
ルシコン轡ベルビアヌム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　
ｐｅｒｕｖｉａｎｕｓ＋）において同定されたが、この
耐性はまだ品種改良されたトマトには導入されておらず
、他の種類の作物に関する耐性供給、源も同定されては
いない。天然交差防御システムを用いてきついＴＳＷＶ
Ｉによる損害を減少させる方法についてあまり詳しくは
記録されていない。限られた陽性結果は、トマトおよび
レタスについて報告されている。

従って、遺伝子操作手段によりトスポウイルス感染に対
する耐性を与える遺伝情報を植物遺伝子プールへ導入す
ることにより、品種数良家および栽培者にトスポウイル
ス病と闘う新たな方法が提供される。

［発明の構成］ この発明は、 ａ））スボウイルスのＲＮ　Ａ配列またはそれに相同的
なＲＮＡ配列、 ｂ）１個またはそれ以上のコドンがそれらの同義コドン
（すなわち、同じアミノ酸または終止シグナルに対応す
るコドン）により置換されている、トスポウイルス蛋白
質をコードするａ）記載のＲＮＡ配列、またはその一部
分、またはそれに相同的ムＲＮ　Ａ配列、 ？）ａ）また（まり）記載のＲＮＡ配列に相補的なＲＮ
Ａ配列 への転写をコードするＤＮＡ配列を含み、前記ＤＮＡが
植物において機能するプロモーターの発現制御下におか
れ、植物において機能するターミネータ−を有するしの
である、組換えＤＮＡ構築物を提供する。

便宜上、上記ａ）、ｂ）およびＣ）記載のＤＮＡ配列を
以後ｒＴＳＷＶ関連ＤＮＡ配列」と称する。所望ならば
、この発明によるＴＳＷＶ関連ＤＮＡ配列を修飾するこ
とにより、この配列に相同的な突然変異体または修飾配
列が作成され得、それらは当業界の熟練者に周知の方法
、例えば部位突然変異を用いてＴＳＷＶ関連ＤＮＡ配列
から誘導される。

従って、それらの突然変異体または修飾暗号化配列は、
この発明の意図および範囲内に含まれる。

トスポウイルスのＲＮＡ配列という語は、トスポウイル
スのＳ、ＭまたはＬ　ＲＮＡ鎖、特にＳまたはＬ　ＲＮ
Ａ＠、好ましくはＳ　ＲＮＡ鎖の配列を意味する。

トスポウイルスのＲＮＡ配列に相同的なＲＮＡ配列とい
う語は、若干のヌクレオチドが欠失および／または付加
されているが、まだ適当なハイブリダイゼーション条件
下においてトスポウイルスのＲＮＡ配列に相補的なヌク
レオチド配列とハイブリダイゼーションし得るトスポウ
イルスの１ｔＮＡ配列を意味する。この発明の目的にお
いて、適当なハイブリダイゼーション条件としては、好
都合には５×標準食塩水くえん酸（Ｓ　Ｓ　Ｃ）、０．
５％ドデンル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５×デンハー
ド溶液、５０％ホルムアミドおよび１００μ９／ｍＱ担
体ＤＮＡを含む緩衝系（以後、緩衝系と称す）中１６時
間４２℃でインキュベージタンし、次いで６５℃で毎回
約１時間１ｘｓｓｃおよび０゜１％ＳＤＳを含む緩衝液
により３回洗浄する。

この発明の目的に関して好ましいハイブリダイゼーショ
ン条件では、緩衝系中４９℃で１６時間インキユベーシ
ブンし、５５℃で毎回約１時間０ｔｘｓｓｃおよび０．
１％ＳＤＳを含む緩衝液により３回洗浄する。この発明
の目的において最も好ましいハイブリダイゼーション条
件では、緩衝系中５５℃で１６時間インキユベーンヨン
し、６５℃で毎回約１時間０．１ＸＳＳＣおよび０，１
％ＳＤＳを含む緩衝液により３回洗浄する。

ＴＳＷＶ関連ＤＮＡ配列の長さは、後の記載から明らか
な通り、特に従う予定の特定戦略により異なる。一般に
、ＴＳＷＶ関連ＤＮＡ配列は少なくとし２０個、好適に
は５０個またはそれ以上のヌクレオチドを含むのが望ま
しい。

この明細書で使用されているプロモーターという語は、
＊ＲＮＡのリーダー配列（リーダー配列は、リポソーム
結合部位を含み、ＡＵＧ出発コドンから翻訳を開始する
）をコードする領域を含む転写に必要とされる全調節領
域を含む、転写出発部位から上流のヌクレオチド配列を
包含する。

この発明のＤＮＡ構築物での使用に適したプロモーター
の例には、植物細胞において機能するウィルス、真菌、
動物および植物誘導性プロモーター−がある。プロモー
ターは、構成的または着火的にＤＮＡを発現し得る。Ｄ
ＮＡ発現を着火的に調節するプロモーターの適当な例は
、病気媒介体、例えばアザミウマにより誘導され得るプ
ロモーター、例えばいゆわる創傷誘導性プロモーターで
ある。使用されるプロモーターは、形質転換植物のトス
ポウイルス感受性の低減化に必要なＲＮＡの量を生産さ
せるのに充分な割合で’ｒ　ｓ　ｗ　ｖ関連ＤＮＡ配列
の発現を誘発すべきであるものとする。

転写されるＲＮＡの必要櫃は、関与する植物の型により
異なり得る。特に好ましいプロモーターには、カリフラ
ワー・モザイク・ウィルス３５Ｓ（ＣａＭＶａ５Ｓ）プ
ロモーター、その誘導体、および病気媒介体、例えばア
ザミウマによる創傷後に誘導され得るプロモーター、例
えば創傷誘導性プロモーターがある。

この明細書で使用されているターミネータ−という語は
、転写の終結を表示する転写単位の最後のＤＮＡ配列を
意味する。ターミネータ−は、ポリアデニル化シグナル
を含むＤＮＡ３″−非翻訳配列であり、ポリアデニル化
配列を１次転写物の３°−末端に付加させる。植物細胞
において活性を示すターミネータ−は公知であり、文献
に記載されている。それらは、例えば細菌、真菌、ウィ
ルス、動物および植物から単離され得る。この発明のＤ
ＮＡ構築物におけろ使用に特に適したターミネータ−の
例は、ニー・ツメファシェンス（＾。

Ｌｕａｅｆａｃｉｅｎｓ）のツバリン・シンターゼ・タ
ーミネータ−１ＣａＭＶの３５Ｓターミネータ−および
ゼア・メイス（Ｚｅａ　５ａｙｓ）由来のゼイン・ター
ミネータ−である。

この明細書で使用されている用語法によると、ＲＮＡ配
列は、適当なハイブリダイゼーション条件（上記）下で
の塩基対合律に従い、それが別のＲＮＡ配列との水素結
合複合体を結合し得る場合、そのＲＮＡ配列に相補的で
ある。

この発明はまた、植物中にこの発明のＤＮＡ横薬物を導
入させ得るベクターおよび前記ベクターの製造方法を提
供する。

この明細書で使用されているベクターという語は、その
ＤＮＡフラグメントが宿主生物に組み込まれ得る手段に
よる媒体を包含する。

植物という語は、この明細書では広い意味で使用されて
おり、適当な条件下で成熟植物、その子孫およびその一
部分、例えば前記植物の伐採物および果実に発展し得る
分化植物および非分化植物素材、例えばプロトプラスト
、植物細鉋、種子、苗木等を包含する。

さらに、この発明は、ゲノムにこの発明のＤＮＡ構築物
を含む植物、および前記植物の製造方法を提供する。

この発明による植物は、トスポウイルスにより誘導され
る疾患に対する感受性が低く、上述の古典的方法により
得られる植物の不利点および限界をもたない。

トスポウイルス、例えばＴＳＷＶに対して感受性を示す
植物の例には、アゲラツム（Ａｇｅｒａｔｕａ＋）、ア
ルファルファ、ヒエ属（Ａｓａｒａｎｔｈｕｓ）、アン
シリヌム（Ａｎｔｈｉｒｒｈｉｎｕｓ）、アキレギア（
Ａｑｕｉｌｅｇｉａ）、ナス、ビート、ベゴニア（Ｂｅ
ｇｏｎｉａ）、ソウマメ、ブロッコリ、芽キャベツ、キ
ャベツ、カリフラヮ、セロリ、チクリ、キク属（Ｃｈｒ
ｙｓａｎｔｈｅＩｌｕｓ）、シネラリア（Ｃｉｎｅｒａ
ｒｉａ）、クローバ−、コスモス（Ｃｏｓｍｏｓ）、サ
サゲ、キュウ１ハシクラメン、ダリア（Ｄａｈｌｉａ）
、チョウセンアサガオ属（Ｄａｔｕｒａ）、デルフィニ
ューム属（Ｄｅｌｐｈｉｎｉｃ＋＋＊）、エンダイブ、
ガーベラ（Ｇｅｒｂｅｒａ）、グラジオラス（Ｇｌａｄ
ｉｏｌｕｓ）、オオイワギリソウ（Ｇｌｏｘｉｎｉａ）
、ヒョウタン、アメリカホトイモ（ｇｒｏｕｎｄｎｕｔ
）、ヒラペアストラム属（Ｈｉｐｐｅａｓｔｒｕｓ）、
ホウレンソウ（Ｉａｐａｔｉｅｎｓ）、レタス、メロン
、メセンブリアンテｖ　（ｉｌｅｓｅｓｂｒｙａｎｔｈ
ｅｓｕｍ）、玉ねぎ、パパイヤ、エントウ、落花生、コ
シヨウ、ペチュニア、パイナツプル、ジャガイモ、プリ
ムラ（Ｐｒｉｍｕｌａ）、セントポーリア（Ｓａｉｎｔ
　Ｐａｕｌｉａ）、サフラワー、サルビグｏ−、シス属
（Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ）、さや豆、大豆、ホウレ
ンソウ、カポチャ、テンサイ、ヒマワリ、マンジュギク
属（’ｉａｇｅｔｅｓ）、タバコ、トマト、バーベナ属
（Ｖｅｒｂｅｎａ）、ツルニヂニチソウ属（Ｖｉｎｃａ
）、スイカ、百日草（ｚｉｎｎｉａ）があるが、これら
に限定されるわけではない。この発明は、特に植物ゲノ
ム中にこの発明のＤＮＡ構築物を含むこれらの列挙され
た植物に関するものである。

ＴＳＷＶはトスポウイルスのタイプメンバーであるため
、以下、トスポウイルスの詳しい特徴を、−例としてＴ
ＳＷＶを用いることにより説明を行つ。

Ｓ、ＭおよびＬＲＮＡは１本鎖ＲＮ　Ａ分子である。５
ＩＩＮＡは約２９００ヌクレオチド長であって２個の遺
伝子を含み、その一方はウィルス・センスで非構造的蛋
白質（ＮＳｓ）をコードし、他方はウィルス相補的セン
スでヌクレオカプシド蛋白質（Ｎ）をコードする。Ｎ５
ｓ−およびＮ−遺伝子間の遺伝子開領域は、ヘアピン構
造に折り畳まれ得る。５ＩＩＮＡの５°−および３°−
末端配列は、最初のヌクレオチドが前記Ｓ　ＲＮＡ鎖の
最後のヌクレオチドの反対に（および相補的に）なる形
で互いにハイブリダイゼーションし得る。以後、両ＲＮ
Ａ末端のハイブリダイゼーションにより得られる２本鎖
構造を便宜上「パン−ハンドル」と称する。

Ｍ　ＲＮＡ鎖は約５０００ヌクレオチドを有する。それ
は、ウィルス相補的センスで１つの長い転写解読枠を含
む。この転写解読枠は、形成期ポリペプチド鎖が共翻訳
的に開裂されて各々スパイク蛋白質Ｇ、およびＧ、が形
成される小胞体に位置するポリソームにおいて翻訳され
る。Ｓ　ＲＮＡと同様に、Ｍ　ＲＮＡｊｌｌの末端は、
互いに相補的であり、同じくハイブリダイゼーションす
ることにより「パン−ハンドル」を形成し得る。

Ｌ　ＩＩＮＡ鎖は約７５００ヌクレオチドを有し、ウィ
ルス相補的センスで１つの転写解読枠を含む。

この転写解読枠は、恐らく約２６０ｋｄの推定分子量を
有するウィルス転写酵素をコードする遺伝子と一致する
と思われる。突然変異株の中には、野生型完全長Ｌ　Ｒ
ＮＡに加えて短いＬ　ＲＮＡ分子か見出される場合もあ
る。しかしながら、これらの短いＬ　ＲＮＡは、常に特
徴的な末端ヌクレオチド配列を有するとは限らないため
、１−パン−ハンドル」構造を形成し得る。それらはま
た、ヌクレオカプシド蛋白質により包膜され、ウィルス
粒子に含まれる。それらの存在が兆候の発現を抑制する
結果、深刻で有害な影響は低下する。従って、これらの
短いＬ　ＲＮＡ分子は、当業界の熟練前に周知の用語で
ある欠損干渉性（ＤＩ）ＩＩＮＡとして見なされ得る。

この発明の好ましい態様は、「パン−ハンドル」のトス
ポウイルスーＲＮＡ配列またはそれに相同的なトスポウ
イルスーＩＩＮＡ配列への転写をコードするこの発明の
ＤＮＡ構築物に関するものである。

この発明の別の好ましい態様は、ウィルス相補的センス
での（すなわら、陰性極性を有する）転写解読枠のトス
ポウイルスーＲＮＡ配列、または１個もしくはそれ以上
のコドンがそれらの同義コドンにより置換された対応す
るＲＮＡ配列、またはそれらに相同的なＲＮＡ配列への
転写をコードするこの発明のＤＮＡ構築物に関するもの
である。

この発明のさらに別の好ましい態様は、ヘアピンのトス
ポウイルスーＲＮＡ配列またはそれに相同的なＩｔ　Ｎ
　Ａ配列への転写をコードするこの発明のＤＮＡ構築物
に関するものである。

好ましくは、上記トスポウイルスーＲＮＡ配列は、少な
くとも２０個、さらに好ましくは少なくと６５０個のヌ
クレオチドをａする。

この発明による使用に適したＤＮＡ構築物の例としては
、下記配列への転写をコードする’ｒ　ｓ　ｗＶ関連Ｄ
ＮＡ配列がある（Ｓ　　ＲＮＡヌクレオチド配列につい
ては第４図、Ｍ　Ｉ’ｌＮＡヌクレオチド配列について
は第６Ａ図およびＬ　ＲＮＡヌクレオヂト配列について
は第６Ｂ図を参照）。

ｉ）　　　　５ＴＩＮＡヌクレオチド配列１〜２９１５
、 ｉｉ）　　　Ｓ　　ＲＮＡヌクレオチド配列８９〜１４
８３． １ｉｉ）　　　Ｓ　　ＲＮＡヘアピン、ｉｖ）　　　　
Ｓ　　ＲＮＡｒパン−ハンドル」、Ｖ）　　　　５ＲＮ
Ａヌクレオチド配列２７６３〜１９８７、 ｖｉ）　　　ｔ、　ＲＮＡヌクレオチド配列４４６２〜
１１ ｖｉｉ）　　　Ｌ　ＲＮＡヌクレオチド配列４１〜２、
ｖｉｉｉ）　　Ｌ　　ＲＮＡヌクレオチド配列３９８０
〜４６、 ｉｘ）　　　ＬＲＮＡヌクレオチド配列（６７０６＋ｎ
）〜（４４６２＋ｎ）（ここで、ｎは、第６Ｂ図に示さ
れたヌクレオチド４４６２（Ｕ）およびその後に示され
たヌクレオチド（Ｃ）間のギャップのヌクレオチドの数
である）、 Ｘ）　　　　ＬＲＮＡヌクレオチド配列（６７０６＋ｎ
）〜（６０１６＋ｎ）（ここで、ｎは上記の意味を有す
る）、 ｘｉ）　　　　Ｌ　　ＲＮＡｒパン−ハンドル」、ｘｉ
ｉ）　　　Ｓ　ＲＮＡヌクレオチド配列１９８７〜２７
６３に相補的なＲＮＡ配列、 ｘＨｉ）　　Ｓ　ＲＮＡヌクレオチド配列８９〜１４８
３に相補的なＲＮＡ配列、 ｘｉｖ）　　　Ｌ　ＩＩＮＡヌクレオチド配列１〜４４
６２に相補的な１１　Ｎ　Ａ配列、 ｘｖ）　　　ＬＲＮＡヌクレオチド配列２〜４１に相補
的なＲＮＡ配列、 ｘｖｉ）　　　Ｌ　ＲＮＡヌクレオチド配列４６〜３９
８０に相補的なＩＩＮＡＲＮＡ 配列ｉｉ）　　Ｌ　　ＲＮＡヌクレオチド配列（４４６
２＋ｎ）〜（６７０６＋ｎ）に相補的なＲＮＡ配列（た
だし、口は上記の意味を有する）、 ｘｖｉｉｉ）　　Ｌ　ＲＮＡヌクレオチド配列（６０１
６＋ｎ）〜（６７０６＋ｎ）に相補的なｒｌＮＡＲＮＡ
配列し、ｎは上記の意味）、 ｘｉｖ）　　　１個またはそれ以上のコドンがそれらの
同義コドンにより置換されている、Ｓ　ＲＮＡヌクレオ
チド配列８９〜１４８３、 ｘｘ）　　　　１個またはそれ以上のコドンがそれらの
同義コドンにより置換されている、Ｓ　ＲＮＡヌクレオ
チド配列２７６３〜１９８７、ｘｘｉ）　　　１個また
はそれ以上のコドンがそれらの同義コドンにより置換さ
れている、Ｌ　ＲＮＡヌクレオチド配列３９８０〜２３
６、 にｘｉｉ）　　　１個またはそれ以上のコドンがそれら
の同義コドンにより置換されている、Ｌ　ＲＮＡヌクレ
オチド配列４４６２〜２３６、 ｘｘｉｉｉ）　　１個またはそれ以上のコドンがそれら
の同義コドンにより置換されている、Ｌ　ＲＮＡヌクレ
オチド配列（６６７２＋ｎ）〜（４４６２＋ｎ）（ただ
し、ｎは上記の意味）、 ｘｘｉｖ）　　　１個またはそれ以上のコドンがそれら
の同義コドンにより置換されている、ＬＲＮＡヌクレオ
チド配列（６６７２＋ｎ）〜（６０１６＋ｎ）（ただし
、ｎは」二記の意味）、 ＸＸＶ）　　　Ｍ　ＲＮＡヌクレオチド配列（ｍ−５７
４）〜ｆｆ１（ここで、ｍは、ＭＲＮＡのヌクレオチド
の総数を示す）、 ｘｘｖｉ）　　Ｍ　ＲＮＡヌクレオチド配列（ｍ−５７
４）〜１１（ただし、鵬は上記の意味）に相補的なＲＮ
Ａ配列、 ｘｘｖｉｉ）　　上記ｉ）〜ｘｖｉｉｉ）、ｘｘｖ）ま
たはｘｘｖｉ）項記載のヌクレオチド配列に相同的なＲ
ＮＡ配列、ｘｘｖｉｉｉ）　１個またはそれ以上のコド
ンがそれらの同義コドンにより置換されている、Ｍ　Ｒ
ＮＡヌクレオチド配列（ｍ　−２６）〜（ｍ　−５７４
８ただし、鋤は上記の意味）、 ｘｘｉｘ）　　上記ｉ）〜ｘｘｖｉｉｉ）項記載のＤＮ
Ａ配列のフラグメント。

好ましいＴＳＷＶ関連ＤＮＡ配列は、上記ｉｉ）、１ｉ
ｉ）、ｉｖ）、Ｖ）、ｖｉｉｉ）、ｉｘ）またはｘｉ）
にょるＲＮＡ配列、またはそれらに相同的なＲＮＡ配列
、または少なくとも２０個、さらに好ましくは５０個の
ヌクレオチドを含むそれらのフラグメントへの転写をコ
ードする。

この発明の別の好ましい態様によると、この発明のＩ）
Ｎ、Ａ構築物は、ウィルスＳ、ＭまたはＬの各ＲＮＡ、
さらに好ましくはＳまたはＬ　ＲＮＡ、特にＳ　ＲＮＡ
の５°および３°末端配列の組み合わせへの転写をコー
ドするＴＳＷＶ関連ＤＮＡ配列を含む。

さらにこの発明は、トスポウイルス、例えばＴＳＷＶに
よる感染が疑われる植物を診断するためのプローブを提
供する。それらのプローブは、トスポウイルス、例えば
ＴＳＷＶのＲＮＡ配列に相補的な（相補的という語の定
義については上記参照）標識オリゴヌクレオチド（ＲＮ
ＡまたはＤＮＡ）配列を含む。配列の望ましい長さおよ
びプローブの診断的用途に関する適当な方法は、当業界
の熟練者には公知のものである。適当なプローブは、好
都合にはトスポウイルス、例えばＴＳＷＶのＲＮＡ配列
に相補的な、少なくとも１５個、好ましくは３０個より
大、さらに好ましくは約４００〜６００個のヌクレオチ
ドを含む。

この発明によるプローブは、当業界の熟練者がそれらを
用いることにより、例えば病気の兆候が完全に発現する
前の診断を目的として、感染した植物におけるトスポウ
イルスＲＮＡまたはその一部分の同定が可能になる点で
有用である。

従って、この発明はまた、ドツト−プロット・タイプ検
定においてこの発明のプローブを用いることによりトス
ポウイルス複製型を検出することを含む、植物における
トスポウイルス感染を測定する診断的方法を提供する。

この発明によるプローブは、当業界の熟練者がそれらを
用いることにより、トスポウイルスのＲＮＡ配列に対応
するＤＮＡ配列を含むキメラ遺伝子を構築し、使用する
ことが可能になる点で有用である。

この発明のＤＮＡ構築物は、適当な発現ベクターにＴＳ
ＷＶ関連ＤＮＡ配列を挿入することにより得られ、その
場合、それは植物において機能するプロモーターの発現
制御下で行なわれ、その転写はターミネータ−により終
結される。

ここで使用されている適当な発現ベクターという語は、
植物細胞において機能するプロモーターおよびターミネ
ータ−を含むベクターを指す。

適当な発現ベクターへのＴＳＷＶ関連ＤＮＡ配列の挿入
は、自体公知の方法で行なわれ得ろ。また、適当な方法
は後記実施例で説明されている。

同様に、適当な発現ベクターの構築は、自体公知の方法
で行なわれ得る。

この発明による植物は、 ａ）植物細胞のゲノム中にこの発明によるＤＮＡ構築物
を挿入し、 ｂ）形質転換細胞を得、そして Ｃ）形質転換細胞から遺伝子的に形質転換された植物を
再生させる ことにより製造され得る。

この発明のＤＮＡベクターは、ＴＳＷＶ感染に感受性の
ある植物の植物ゲノム中に挿入され得る。

前記植物形質転換は、植物の形質転換に関する自体公知
の技術、例えばアグロバクテリウム・ツメファシェンス
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｓ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓ）、ニー・リゾゲネス（Ａ、　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ
）から誘導されたＴｉプラスミドまたはその修飾体を含
む植物形質転換技術、単離された植物細胞または組織さ
れた植物構造の裸のＤＮＡ形質転換またはエレクトロポ
レーション、ＤＮＡを送達するためのマイクロ発射体の
使用、レーザー・システム、リポソーム、または形質転
換ベクターとしてのウィルスもしくは花粉の使用などの
技術を用いて実施され得る。

この発明の植物は、当業界で公知の方法、例えばノーザ
ン分析、サザーン分析、ＰＣＲ技術および／または免疫
学的技術によりＴＳＷＶ関連ＤＮＡ配列の発現について
モニターされ得る。この発明の植物は、病気徴候の割合
が接種物におけるＴＳＷＶ濃度と一次的に相関する範囲
の濃度で優先的に前記植物を’ｒｓｗｖに暴露する試験
により立証された通り、ＴＳＷＶ感染に対して低い感受
性を示す。

ＴＳＷＶ接種に適した方法は当業界において公知であり
、機械的接種および特に適当なベクターの使用が含まれ
る。

勿論、この発明の植物はまた、この発明に従って得られ
た植物を別の植物と交差させて、植物ゲノム中にこの発
明のＤＮＡ構築物を有する植物を生成させることにより
得られる。

以下、非限定的実施例および添付図面によりこの発明に
ついて説明する。

第１図は、トマト・スボッテド・ウイルトウイルスの構
造の概観を示す。

第２図は、ＴＳＷＶ　　Ｓ　　ＲＮＡに使用されるクロ
ーニング戦略の概略を示す。

第３図は、ＴＳＷＶ　　Ｌ　　ＲＮＡに使用されるクロ
ーニング戦略の概略を示す。

第４図は、ＴＳＷＶ　　Ｓ　ＲＮＡの配列およびゲノム
組織を示す。非構造蛋白質ＮＳｓのアミノ酸配列（８９
−１４８３）は上に表示され、ヌクレオカプシド蛋白質
Ｎ（２７６３−１９８７）のアミノ酸配列は対応するＲ
ＮＡヌクレオチド配列の下に表示されている。

第５図は、Ｓ　　ＲＮＡ（第５Ａ図）およびＬ　　ＲＮ
Ａ（第５Ｂ図）の全解読枠に関する翻訳開始および終止
コドンの分布を示す。太い棒線は停止コドンを示し、細
い棒線はＡＴＧ出発コドンを示す。

第６図は、現在までに解明されたＴＳＷＶ　ＭＲＮＡ（
第６Ａ図）およびＬ　ＲＮＡ（第６Ｂ図）のヌクレオチ
ド配列を示す。

第７図は、適当な発現ベクター（ｐＺＵ−Ａ）の構築の
概略図を示す。

第８図は、適当な発現ベクター（ｐＺＵ−Ｂ）の構築の
概略図を示す。

第９図は、ヌクレオカプシドＮ蛋白質遺伝子を含む適当
なプラスミド（ｐＴＳＷＶ−Ｎ）の構築の概略図を示す
。

第１０図は、ヌクレオカプシドＮ５ｓ−蛋白質遺伝子を
含む適当なプラスミド（ｐＴ　Ｓ　ＷＶ　−Ｎ　Ｓｓ）
の構築の概略図を示す。

第１１図は、この発明によるＤＮＡ構築物、植物形質転
換ベクターｐＴＳＷＶ−ＮＡＢの構築の図解例を示す。

第１２図は、この発明によるＤＮＡ構築物、植物形質転
換ベクターｐＴＳＷＶ−ＮｍｕｔＢＢの構築の図解例を
示す。

第１３図は、この発明によるＤＮＡ構築物、植物形質転
換ベク９−ｐＴＳＷＶ−ＮＳｓＡＢの構築の図解例を示
す。

第■４図は、この発明によるＤＮＡ構築物、植物形質転
換ベクターｐＴＳＷＶ−ＮＳｓｎ＋ｕｔＢＢの構築の図
解例を示す。

第１５図は、ＴＳＷＶ　　Ｓ　　ＲＮＡの「パン−ハン
ドル」領域を示す。

第１６図は、ＴＳＷＶ　Ｓ　ＲＮＡのヘアピン領域を示
す。

第１７図は、被疑植物のドツト・プロット分析を示す。

Ｓ　ＲＮＡまたはそれに相同的なＲＮＡ配列のヘアピン
構造の配列への転写をコードする好ましいＴＳＷＶ関連
ＤＮＡ配列の適当な例は、５ＲＮＡの１５８３−１７０
８ヌクレオチド配列、ＳＲＮ　Ａの■７０９〜１８３５
ヌクレオチド配列、Ｓ　ＲＮＡの１５８３−１８３５ヌ
クレオチド配列またはそれらの配列に相同的な配列をコ
ードする配列である。

Ｓ　ＲＮＡまたはそれに相同的なＲＮＡ配列の「パン−
ハンドル」領域の配列への転写をコードする好ましいＴ
ＳＷＶ関連ＤＮＡ配列の適当な例は、５ＲＮＡの１−７
０および２８５０−２９１６ヌクレオチド配列またはそ
れらの配列に相同的な配列をコードする配列の組み合わ
せである。

Ｌ　ＲＮＡまたはそれに相同的なＲＮＡ配列の「パン−
ハンドル」領域への転写をコードする好ましい’ｒ　ｓ
　ｗ　ｖ関連ＤＮＡ配列の適当な例は、ウィルスＬ　ｒ
ｔＮＡの５゛−末端から最初の８０、特に最初の６５ヌ
クレオチドおよびウィルスＬ　ＲＮＡの３°−末端から
最後の８０、特に最後の６５ヌクレオチド、または上記
配列に相同的な配列またはそれらの誘導体をコードする
配列の組み合わせである。

この発明の他の目的、特徴、利点は下記実施例から明白
になる。

参考文献は省略して最初の著者名だけとし、参考文献の
詳細は後で列挙する。

（原材料および方法） ここに示されたＴＳＷＶ　ＲＮＡ誘導配列は全て、単に
一律性のみを目的としたＤＮＡ配列として描かれている
。当技術分野に精通しておれば、これは便宜上為された
ものに過ぎないことは明白である。

植物形質転換試験で使用されるニコチアナ・タバクム（
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）およびペチュニ
ア・ヒブリダ（Ｐｅｔｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ）の栽
培変種を標準温室条件下で育てる。適当な植物ホルモン
およびしょ糖濃縮物を含む標準ＭＳ培地（ムラシゲおよ
びスクーグ、１９６２）上で、無菌外植体を育てる。

エシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）菌を、標準ＬＢ
培地中３７℃で回転源とう器上において培養する。アグ
ロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｓ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株を、０．１％
グルコースヲ補ったＭｉｎＡ培地（アウスベル等、１９
８７）中２８℃で培養する。

全クローニング方法において、エシェリヒア・コリ株Ｊ
Ｍ８３、（Ｆ−１Δ（ｌａｃ−ｐｒｏ）、ａｒａ、　ｒ
ｐｓＬ１φ８０、ｄｌａｃＺＭ　Ｉ　５）を、組換えプ
ラスミドの受容体として使用する。

バイナリ−ベクターを、ヘルパー株としてプラスミドｐ
ＲＫ２０１３を含む、エシェリヒア・コＩＪ　ＨＢ　１
０１を用いた標準３親交配においてＴｉプラスミドｖｉ
ｒ領域を含む株（ホエケマ等、１９８３）、アグロバク
テリウム・ツメファシェンス株ＬｎＡ４４０４にコンジ
ュゲートする。（フィブルスキーおよびヘリンスキー、
１９７９）。適当なアグロバクテリウム・ツメファシェ
ンス受容体が、リファンピシン（５０μ９／１１２）お
よびカナマイシン（５０μ９７Ｍ（１）を含む培地から
選択される。

ベクターｐＵｃ１９（ヤニシューペロン等、１９８５）
、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）、ｐＢＩ
Ｎ＋９（ベパン等、１９８４）または誘導体におけるフ
ラグメントのクローニング、ＤＮＡの制限酵素分析、エ
シェリヒア・コリ受容株への形質転換、小および大規模
でのプラスミドＤＮＡの単離、ニック翻訳、インビトロ
転写、ＤＮＡ配列決定、サザーン・プロッティングおよ
びＤＮＡゲル電気泳動は、標準的方法に従い行なわれる
（マニアチス等、１９８２、アウスベル等、１９８７）
。

［実施例］ 実施例１ ＴＳＷＶ粒子およびそこに存在する遺伝物質の単離。

トマト・スボッテド・ウィルトウイルス株ＣＰＮＨＩと
いうトマトからのブラジル産分離株を、移植によりトマ
ト上で維持する。本質的にタス等（１９７７）の記載に
従って機械的接種をした後、全体的に感染したニコチア
ナ・ルスティカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｒｕｓｔｉｃａ
）の葉からウィルスを精製する。この単離方法において
使用される全物質を４℃で維持することが不可欠である
。１２日後、１００グラムの感染した葉の接種物を採取
し、ワーリング・ブレンダーにおいて５倍容量の抽出緩
衝液（０゜１モルＮａＨｔＰＯ４，０，Ｏ１モルＮａｔ
ＳＯ３、ｐｔｔ７）中、低速度設定で５−１Ｏ秒間粉砕
する。懸濁液をチーズクロスによりろ過し、ろ液を１６
０００×９で１０分間遠心分離する。生成した沈澱物を
、３倍容量の再懸濁緩衝液（０，０１モルＮａＨ，ＰＯ
，，０，０１モルＮａｔＳＯｓ、ｐＨ７）に再懸濁する
。沈澱物を４℃で注意深く撹はんしながら溶かす。１２
５００ｘ＠で１０分間遠心分離後、沈澱物を捨て、上清
を再び５００００Ｘ９て２０分間遠心分離する。沈澱物
を０．２容量の再懸濁緩衝液（０，０１モルＮａＨｔＰ
Ｏａ、０．Ｏ１モルＮａｔｓＯ３、ｐｌ−１７）に再懸
濁し、氷上で３０分間保つ。非感染ニコチアナ・ルステ
ィ力からの物質に対しウサギにおいて生じた抗血清を前
記溶液に加え、１時間注意深く撹はんし、１６０００Ｘ
９で１０分間の遠心分離により非ウィルス性複合体を沈
澱させる。澄んだ上清を、再懸濁緩衝液（０，０１モル
ＮａＨｔＰＯ＊、０．０１モルＮ　ａ　ｔ　Ｓ　０３、
ｐＨ７）中−次５−４０％しょ糖勾配上に載せ、９５０
００　×ｇで４５分間回転させる。ＴＳＷＶピリオンを
含むオパールのような光彩を発する帯を注射器により注
意深く集め、再懸濁緩衝液で４回洗浄する。洗浄したピ
リオンを２１０００Ｘ９で１゜５時間の遠心分離により
沈澱させ、ｌ容量の再懸濁緩衝液に再懸濁する。−船釣
に、Ｉ００グラムの葉材料から、約０　、５　ｍｇのＴ
ＳＷＶピリオンが得られる。５ＤＳ−フェノール抽出、
次いでエタノール沈澱によりＴＳＷＶ　ＲＮＡを精製ウ
ィルス標本から優先的に回収する。１１９の’ｔ’　ｓ
　ｗ　ｖから１−５μ９のＲＮＡが抽出される。単離さ
れたＲＮＡ分子の無傷状況をアガロース・ゲル電気泳動
により分析する。各々２９００ヌクレオチド（ＳＲＮＡ
）、５０００ヌクレオチド（ＭＲＮＡ）および７５００
ヌクレオチド（Ｌ　ＲＮＡ）の見かけ上のサイズを有す
る３つの異なるＲＮＡ分子が同定される。

実施例２ ＴＳＷＶウィルスＲＮＡの３°−末端の配列決定。

直接ＲＮＡ配列決定を行うため、本質的にバークレイシ
等（１９８３）Ｊ、：従い、ＴＳＷＶ　　ＲＮＡを精製
ヌクレオカプシドから抽出する。接種の１２日後、感染
した！ｌ１１００グラムを採取し、ワーリング・ブレン
ダーにおいて４倍容量のＴＡＳＥ緩衝液（０，０１モル
ＥＤＴＡ、０．０１モルＮａ＊Ｓｏ、、０．１％システ
ィン、０．１モル　トリス、ｐＨ８）中、低速度設定で
５−１０秒間粉砕する。

懸濁液をチーズクロスによりろ過し、ｌ１００ｘ９で１
０分間遠心分離する。６６０００　Ｘ９で３０分間の遠
心分離によりヌクレオカプシドをこの上清から回収する
。沈澱物を１容量のＴＡＳ−Ｒ緩衝ｔｆｆｌ（１％ノニ
デットＮＰ−４０，０，Ｏ１モルＥＤＴＡ、０．０１モ
ルＮａｔＳＯ，，０１％システィン、０．０１モルグリ
シン、０．０１モル　トリス、ｐＨ７，９）に注意深く
再懸濁する。沈澱物を、４℃で３０分間注意深く撹はん
することにより溶かす。１６０００Ｘ９で１０分間の遠
心分離により上清を透明にする。１０５０００Ｘ９で１
時間３０％しょ糖緩衝剤による沈降により、粗ヌクレオ
カプシドを透明上清から集める。ヌクレオカプシド沈澱
物を４００μＱの０．０１モルＮａ＜えん酸、ｐＨ６，
５に再懸濁し、２０−４０％しよ糖（０，０１モルＮａ
−＜えん酸ｐＨ６、５中）上で層状に重ね、２８０００
０　Ｘ９で２時間回転させる。３つの異なるオパールの
ような光彩を発する帯である、Ｌ、ＭおよびＳの各ヌク
レオカプシドを別々に集める。５ＤＳ−フェノール抽出
、次いで工タノール沈澱により、ＴＳＷＶ　ＲＮＡを精
製ヌクレオカプシド標本から優先的に回収する。常用の
手順により、１００グラムの感染した葉から１００μ９
のＲＮＡが得られる。ＲＮＡリガーゼおよび５°−［”
Ｐ］ｐＣｐを用イテ、個＃　ノ’ｒ　ｓ　ｗ　ｖＲＮＡ
の３゛−末端を標識する。これらの末端標識ＲＮＡ分子
を、低ゲル化温度アガロースゲル（ピースラング−１１
９７９）上で分離する。クラークスーバン・ハースター
およびビショップ（１９８０）およびクラークスーバン
・ハースター等（＋９８２）により記載された酵素的方
法を用いて、ＳおよびＭの両Ｉｔ　Ｎ　Ａの３°−およ
び５゛−末端の３０末端ヌクレオチドを決定する。

市販されているシステム（アプライド・バイオシステム
ズ）を用いて、３°−末端に相補的な合成オリゴヌクレ
オチドを合成し、逆転写酵素によるジデオキシ−配列決
定に使用する。

実施例３ ＴＳＷＶ遺伝物質のｃＤＮＡクローニング。

ＳおよびＬ　ＲＮＡの３°−末端に相補的なオリゴヌク
レオチドを、第１１１ｃＤＮＡ合成のプライミングに使
用する。原則としてグプラーおよびホフマン（＋９８３
）に従い、これらのプライマーを用イテ、２本！ＩＤＮ
Ａｈ（ＴＳＷＶ　ＲＮＡに合成される。２つの異なる方
法を用いて、ＴＳＷＶウィルスＲＮＡに対するｃＤＮＡ
クローンを生成させる。分断化１本鎖うし胸腺ＤＮＡを
用いたＴＳＷＶ　　ＲＮＡのランダム・プライミング、
次いで第１および第２鎖ｃＤＮＡ合成により第１シリー
ズのクローンが得られる。Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼを
用いてｃＤＮＡをプラント末端にし、Ｔ４リガーゼによ
りｐＵｃＩ９の５ｅａ１部位にライゲーションする。Ｔ
ＳＷＶ　ＲＮＡの３°−末端における２０個の末端ヌク
レオチドに相補的なオリゴヌクレオチドで第１ＩＩＤＮ
Ａ合成をプライミングすることにより、第２シリーズの
ＴＳＷＶｃＤＮＡクローンが得られる。第２の鎖合成、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理してプラント端を作成後
、本質的にヒュイン等（１９８５）に従い、燐酸化Ｅｃ
ｏＲＩリンカ−をｃＤＮＡの末端にライゲーションする
。ＥｃｏＲＩによりこれらのｃＤＮＡ分子を制限した後
、ｃＤＮＡフラグメントをラムダｇ１１０のＥｃｏＲ［
部位においてライゲージジンする。本質的に、プローブ
として［３！　］　ｐ−標識無作為にプライムした第１
鎖ｃＤＮＡを用いたグルンスタインおよびホグネス（１
９７５）の方法に従い、ウィルス挿入体を含む両シリー
ズからのｃＤＮＡクローンをコロニー・ハイブリダイゼ
ーションにより選別する。サザーン分析、次いでプラス
ミドおよび／またはファージ・ウオーキングにより、部
分重複するｃｌ）ＮＡクローンのセットを選別すること
により、Ｓ（第２図）およびＬ　　ＲＮＡ（第３図）の
ｃＤＮＡ誘導配列に基づいた制限地図を構築する。

実施例４ ＴＳＷＶ　　Ｓ、ＭおよびＬ　ＲＮＡの配列決定。

Ｓ　Ｉ’１ｌＮＡの配列を決定するため、選別された４
つのｃＤＮＡクローンをＭ１３ｍｐ１８においてサブク
ローニングすると、上記の通り、プラスミドｐｓ６１４
、ｐｓ　６０８、ｐｓ　５２０およびｐＳ５１４が得ら
れる（第２図）。ヤニシューベロン等（１９８５）の標
準プロトコルを用いて、これらのり［１−ンを両方向で
配列決定する。Ｓ　　ＲＮＡの３゜末端のヌクレオチド
配列を、３°−末端の２０ヌクレオチドに相補的な合成
オリゴヌクレオチド５ｔ（５°ｄ（ＧＡＧＣＡＡ’ｌ”
ＣＧＴＧ’ｌ’ＣＡＡＴＴＴＴＧ））のプライマー伸長
により決定する。ウィルスＳ　ＲＮＡの５°−末端から
ヌクレオチド３０〜５０に相補的な第２合成ヌクレオチ
ドＳ３を用いて、Ｓ　ＲＮＡの５゛−末端配列をプライ
マー伸長により証明する。ＴＳＷＶ　　Ｓ　　ＲＮＡ（
２９＋６　ｎｔ）からの配列データを第４図に要約する
。

ウィルス鎖およびウィルス相補鎖における６つの異なる
解読枠をコンピューターでシミュレーション翻訳すると
、２つの推定されている転写解読枠の存在が示される（
第５Ａ図参照）。ウィルス鎖において、恐らく分子１１
５２．４ｋｄの４６４アミノ酸から成る蛋白質をコード
すると思われる、８９位から始まり、１４８３位のＵＡ
Ａ停止コドンで終わる転写解読枠が見出される。この蛋
白質は、恐らく仮にＮＳｓと命名された非構造蛋白質で
あると思われる。他の転写解読枠は、２７６３〜１９８
７位のウィルス相補鎖に位置し、分子１１２８゜８ｋｄ
を有する２５８アミノ酸長のポリペプチドをコードする
。この転写解読枠は、恐らくウィルス・ヌクレオカプシ
ド蛋白質Ｎをコードすると思われる。

この仮定を証明するため、精製ヌクレオカプシド蛋白質
のアミノ酸組成を測定し、５配列データから誘導された
組成と比較する。また、推定されているヌクレオカプシ
ド暗号化Ｎ蛋白質遺伝子をｐＢ　１ｕｅｓｃｒｉｐｔに
挿入する。Ｔ７　　ＲＮＡポリメラーゼを用いて、Ｎ蛋
白質遺伝子をインビトロ転写する。続いて、このインビ
トロ合成転写物を、［３５Ｓ］標識メチオニンの存在下
インビトロうさぎ網状赤血球リゼイトにューイングラン
ド・ヌクリアー：Ｎ　Ｅ　Ｎ）システムにおいて翻訳す
る（ＮＥＮ）。

本質的に上述した方法（パン・グリスベン等、１９８６
）に従い、精製ヌクレオカプシド蛋白質に対して産生じ
た抗体を使用すると、天然ヌクレオカプシド蛋白質と同
じ分子量を有する蛋白質が合成放射性蛋白質から沈澱し
得る。これは、Ｎ蛋白質遺伝子がウィルス・ヌクレオカ
プシド蛋白質をコードすることを示す。第５Ａ図は、各
々ＮＳｓおよびＮ蛋白質遺伝子を示す、Ｓ　ＲＮＡのウ
ィルス性およびウィルス性相浦鎖の暗号化能力を示し、
両遺伝子はサブゲノム５ＲＮＡから発現される。すなわ
ち、植物ウィルスＲＮＡがアンビセンス遺伝子配列を有
するという特有の状況が生じる。

このＳ　　ＲＮＡ配列の他の重要な特徴は、いわゆる「
パン−ハンドル」構造を形成し得る相補的末端反復の存
在である。これらの構造は、ウィルスＲＮＡの複製およ
び転写において重要な役割を演じる。別の推定的調節要
素は、５ＲＮＡの遺伝子開領域におけるヘアピン構造で
あり、恐らく谷々ＮおよびＮ５ｓ−蛋白質をコードする
、両サブゲノムｌｌｌＲＮＡに関する転写終結シグナル
を含むと思われる。

同じ戦略および方法を用いてＳ　ｒｌＮＡのヌクレオチ
ド配列を測定することにより、ＴＳＷＶＭおよびＬ　Ｒ
ＮＡのヌクレオチド配列が解明された。第３図は、Ｌ　
ＲＮＡ誘導部分重複ｃＤＮＡクローンに関するクローニ
ング戦略を示す。ＴＳＷＶ　ＭおよびＬ　ＲＮＡの要約
した配列データを各々第６Ａ図および第６Ｂ図に示す。

コンピューターでシミュレーションした翻訳は、このウ
ィルスＬ　ＲＮＡが、ウィルスｒｌＮＡの３°−末端か
ら３４のヌクレオチドより出発し、ウィルスＲＮＡの５
°−末端からヌクレオチド２３６で止まる単−転写解読
枠を含む陰性極性を有することを示唆している（第５Ｂ
図）。恐らくこの転写解読枠を含む−ＲＮＡ（ウィルス
Ｌ　Ｉ’ｌＮＡに相捕的）は、ウィルス転写酵素に翻訳
されると思われる。

実施例５ 発現ベクターｐｚ　Ｕ　−Ａの構築。

３５Ｓカリフラワー・モザイク・ウィルス（ＣａＭＶ）
プロモーター・フラグメントを、組換えプラスミドｐＺ
Ｏ２７、すなわち４４４　ｂｐｌ−１１ｎｄｌｌｌＰｓ
ロフラグメントとしてＣａＭＶ株Ｃａｂｂ−Ｓの３５８
プロモーターのＨｉｎｃｌｌ−Ｈｐｈｌ領域を含むｐＵ
ｃ１９の誘導体から単離する（フランク等、ｌ９８０）
。ＣａＭＶ味のヌクレオチド配列は、異なる株の場合と
非常に似ている。ポリリンカー領域の一部分、非転写領
域の４３７　ｂｐ、転写開始部位および非翻訳リーダー
領域の７ｂｐは含むが、３５Ｓ翻訳イニンエーターは一
切含まない４７２ｂｐＥｃｏＲＩ　−Ｐ　ｓｔ　Ｉフラ
グメントとして、ｐＺＯ２７から３５９プロモーター・
フラグメントを削り取る。

この３５Ｓプロモーター・フラグメントを、Ｔ４リガー
ゼを用いてＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ線状化ｐｚｏ。

０８にライゲーションする。このプラスミドｐＺ０００
８は、２７０　ｂｐＰ　ｓＬ　Ｉ　−Ｈ１ｎｄｌｌｌフ
ラグメントとしてツバリン・ンンターゼ（ＳＯ５）ター
ミネータ−をもつ。生成した組換えプラスミドｐｚＵ−
Ａは、３５Ｓプロモーター、特有のＰｓ目部位およびＳ
ＯＳターミネータ−を有する（第７図）。

植物発現ベクターＰＺＵ−Ａにおいて使用される３５Ｓ
プロモーターの配列は次の通りである。

１０１　　Ｔτ？Ｃ）＋ＡＣＡＡＡ　　ＧＧＧＴＡＡＴ
ＡＴＣＣＧＧＡＡＡＣＣＴＣＣτＣＧＧ＾丁ＴＣＣＡＴ
ＴＧＣＣＣＡＧＣ１５１　　Ｔλ丁ＣＴＧＴＣＡＣ？Ｔ
ＣＩＴＣ入入入λ　ＧＧＡＣＡＧ丁＾ＧＡ　　ＡＡＡＧ
Ｇλ入ＧＧＴ　　ＧＧＣ入ＣＣ’ｒＡＣ入ベクターｐＺ
　Ｕ　−Ａにおいて使用されるＳ　ＯＳターミネータ−
からの完全な配列は次の通りである。

２５ｉ　　ＡＣＴＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＭＡＧＣ’！’
Ｔ実施例６ 発現ベクターｐＺＵ−Ｈの構築。

組換えプラスミドｐＺＯ３４７は、タバコ・モザイク・
ウィルスの非翻訳リーダー領域、いわゆるΩ−領域の６
７ｂｐフラグメント（こ結合された、ＣａＭＶ味Ｃａｂ
ｂ−Ｓの４２６ｂｐ３５Ｓプロモーター・フラグメント
（Ｈｉｎｃｌｌフラグメント）を含む４９６　ｂｐＢ　
ａｍＨＩ−３ｍａｌフラグメントをもツｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔの誘導体である。この結果、ＴＭＶの非翻訳リ
ーダーに対するＣａＭＶのプロモーター間の完全な転写
融合体を体うキメラ・プロモーターが得られろ。インビ
トロ突然変異を用いることにより、ＴＭＶ　ＡＴＧ開始
コドンの本来の位置が５ｅａｌ部位に変化する。

プラスミドｐＺＯＯＯ８は、２６０ｂｐＰｓ目−Ｈ１ｎ
ｄｌｌｌフラグメントとしてツバリン・ンンターゼ（Ｎ
ＯＳ）ターミネータ−をらつ。このＰｓｔｌ−Ｈｉｎｄ
ｌｌｌフラグメントをＰＺＯＯＯ８から削り取り、Ｔ４
リガーゼを用いてＰｓローＨｉｎｄｌｌｌ線状化ｐＺＯ
３４７にライゲージタンする。生成した組換えプラスミ
ドｐＺＵ−Ｂは、別の植物発現ベクターである。植物発
現ベクターｐｚｕ−ｓにおいて使用されるこの３５Ｓ−
Ωプロモーターの配列は、次の通りである。

３コＩ　　ＡＧＧＧＡＴＧＡＣＧ　　ＣＡＣＡＡＴＣＣ
ＣＡ　ＣＴＡＴＣＣ？？ＣＧ　　Ｃｈ）ｈＧｋｃｃｃＴ
Ｔ　　ＣＣＴＣＴＡＴＡ？Ａ３５１　＾ＧＧＡＡＧＴτ
ＣＡ　　ＴＴＴＣＡττＴＧＧ　　ＡＣ；ＡＧＧＡＣＴ
τＴ　　ＴＴＡＣλ入ＣＡＡτ　τＡＣＣλＡニッ。

生成した組換えプラスミドｐＺ　Ｕ　−Ｂは、３５ＳＨ
ｉｎｃｌｌ−ＴＭＶΩ融合体（３５Ｓ−Ω）、特有の５
ｅａｌおよびＰｓ口部位およびＮＯＳターミネータ−を
含む（第８図）。この発現ベクターは、キメラ・プロモ
ーター３５Ｓ−Ωの下流に発現される遺伝子の翻訳的融
合体の構築において優先的に使用される。

実施例７ ＴＳＷＩＮ蛋白質遺伝子のサブクローニング。

ｃｌ）ＮＡクローンｐｓ６１４およびｐｓ　５２０の融
合により、ＴＳＷＶ−Ｎ蛋白質暗号化配列が得られる（
第２図参照）。ｃＤＮＡクローンｐｓ　５２０をＥｃｏ
ＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌｌ二重消化に付し、ＴＳＷＶＮ蛋
白質遺伝子の３°−末端を含むフラグメントを電気泳動
により分離し、ＤＥＡＥ膜（ＮＡ４５、シュライヒエル
およびジュール）を用いてゲルから精製し、ＥｃｏＲＩ
　−Ｈ１ｎｄｌｌｌ線状化ｐＢｔｕｅｓｃｒｉｐｔ（ス
トラタジーン）においてクローン化すると、組換えプラ
スミドｐ９５２０　Ｅ／Ｈが得られる。ＴＳＷＶ−Ｎ蛋
白質の５°−末端含有フラグメントを、ＥｃｏＲＩ消化
によりｐｓ６１４から取り出す。このフラグメントを電
気泳動により分離し、ＤＥＡＥ膜（ＮＡ−４５、シュラ
イヒエルおよびジュール）を用いてゲルから精製し、Ｅ
ｃ。

Ｒ１線状化ｐｓ５２０Ｅ／Ｈにおいてクローン化すると
、組換えプラスミドｐＴＳＷＶ−Ｎ３が得られる。ＴＳ
ＷＶ−Ｎ遺伝子含有プラスミドｐＴＳＷＶ−Ｎ３を、Ｐ
ｖｕｌｌによる消化により線状化する。Ｐｓｔｌリンカ
−５°ｄ（ＣＣＴＧＣＡＧＧ）を、Ｔ４リガーゼにより
線状ＤＮＡのプラント末端にライゲーションする。続い
て、前記ＤＮＡをＰｓｔｌにより消化し、ＴＳＷＶ−Ｎ
蛋白質配列含有フラグメントを電気泳動により分離し、
ゲルから取り出す。ＴＳＷＶ−Ｎ蛋白質遺伝子含有フラ
グメントを、Ｐｓｔｌ線状化ベクター、例えばｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）にライゲーションす
ることにより、組換えプラスミドｐ’ｌ’５ＷＶ−Ｎが
得られる（第９図）。この制限部位の付加により、さら
に別のプラスミドの構築が容易になる。（別法として、
異なる方法、例えば部位突然変異または他の合成オリゴ
ヌクレオチド・リンカ−のライゲーションにより部位を
付加することらできるが、これらに限定されるわけでは
ない。これらの方法は全て当業界の熟練者に周知のもの
である）。

実施例８ ＴＳＷＶ　　Ｓ　ＲＮ／’Ｍ７）ＴＳＷＶ非構造蛋白質
遺伝子（ＮＳｓ−遺伝子）のサブクローニング。

非構造蛋白質ＮＳｓの配列を、ｃＤＮＡクローンｐｓ　
５１４から単離する。Ｎ５ｓ−蛋白質遺伝子は、Ｅｃｏ
Ｒ１フラグメント上に位置する。ＥｃｏＲＩによるｃＤ
ＮＡクローンｐｓ　５１４の制限後、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼで処理すると、プラント末端が作成される。ＮＳ
ｓ遺伝子含有フラグメントをアガロースゲル電気泳動に
より分離し、ゲルから取り出す。このＮ５ｓ−蛋白質遺
伝子を含むプラント末端化フラグメントに、合成Ｐｓｔ
ｌリンカ−（５’ｄ（ｃｃＴｃｃＡｃＧ）−３°）を、
Ｔ４ポリメラーゼを用いてライゲーションする。Ｐｓｔ
ｌにより制限後、Ｎ５ｓ＝蛋白質遺伝子含有フラグメン
トをＰｓｔｌ線状化ｐＢ　１ｕｅｓｃｒｉｐｔにおいて
ライゲーションすると、組換えプラスミドｐＴＳＷＶ−
ＮＳｓが得られる（第１Ｏ図）。

実゛施例９ ’ｒ　ｓ　ｗ　ｖ配列を含む植物形質転換ベクターの構
築。

実施例９Ａ：ｐＺＵ−ＡにおけるＮ−蛋白質遺伝子構築
物。

３５Ｓプロモーターにより推進され、ＮＯＳターミネー
タ−により終結されるＮ蛋白質遺伝子を含む植物形質転
換ベクターを作成するため、ｐ′ｒＳＷＶ−ＮのＰｓｔ
ｌフラグメントを単離し、Ｐｓｔｌ線状化１）ＺＵ−Ａ
に挿入することにより、キメラ遺伝子カセット・ベクタ
ーｐＴＳＷＶ−ＮＡを作成する。３５Ｓプロモーター、
Ｎ−蛋白質遺伝子およびＮＯＳターミネータ−を含むカ
セットを、Ｘｂａｌによる制限によりｐＴＳＷＶ−ＮＡ
から取り出し、ベバン等により開発された（１９８４）
バイナリ−形質転換ベクターである、ｐＢＩＮ＋９の特
有なＸｂａ１部位においてライゲーションする。生成し
たプラスミドｐＴＳＷＶ−ＮＡＢ（第１Ｉ図）は、当業
界の熟練者によく知られた方法を用いて植物形質転換実
験で使用される。

実施例９　Ｂ　：ｐＺ　Ｕ　−ＨにおけるＮ＝蛋白質構
築物。

Ｎ蛋白質遺伝子からのＡＴＧ出発コドンが３５Ｓ−Ωプ
ロモーターのＴＭＶ非翻訳リーダーの３゜末端に直接融
合されている融合体を作成するためには、Ｎ遺伝子の出
発コドンを突然変異させなければならない。部位突然変
異を用いて、ｐＴｓＷ　Ｖ　−Ｎ　ニに　Ｉ＋　’、ｌ
　配列５°ｄ（Ａ　ＣＧ　Ａ　Ｔ　ＣＡ　Ｔ　ＣＡ１”
　Ｇ　Ｔ　Ｃ１’　）を５°ｄ（ＡＣＧＡＴＡＴＣＡＴ
ＧＴＣ′１゛）に突然変異させることにより、Ｎ遺伝子
のＡＴＧ出発コドンに隣接してＥｃｏＲＶ部位：５°ｄ
（ＧＡ　’ｌ’　Ａ　Ｔ　Ｃ）が作成される。生成した
組換えプラスミドをｐＴ　Ｓ　Ｗ　Ｖ　−Ｎ　ｍｕｔと
呼ふ。突然変異Ｎ蛋白質遺伝子を、ＥｃｏＲＶ−Ｐｓｔ
ｌ消化によりこのプラスミドから取り出す。このフラグ
メントを単離し、Ｓｍａｌ−Ｐｓｔｌ線状化ｐＺＵ−Ｈ
に挿入すると、組換えプラスミドｐＴＳＷＶ−Ｎｍｕｔ
Ｂが得られる。

３５Ｓ−Ωプロモーター、突然変異Ｎ遺伝子およびＮＯ
Ｓターミネータ−を含むキメラ・カセットを、［３ａｍ
Ｈｌ／　Ｘ　ｂａｌ消化によりプラスミドｐ’ｒｓＷＶ
−ＮＩＩｌｕｔＢから取り出す。次いで、単離されたキ
メラ遺伝子カセットをＢ　ａｍＨＩ／　Ｘ　ｂａｌ線状
化ｐｎｌＮＩ９に挿入することにより、バイナリ−形質
転換ベクターｐＴ　Ｓ　Ｗ　Ｖ　−ＮｍｕｔＢ　Ｂが作
成される。生成したプラスミドｐＴＳＷＶ−ＮａｕｔＢ
Ｂ（第１２図）は、当業界の熟練者によく知られた方法
を用いて植物形質転換実験で使用される。

実施例９Ｃ：ｐＺＵ−１とおけるＮ５ｓ−蛋白質遺伝子
構築物。

３５Ｓプロモーターにより推進され、ＮＯＳターミネー
タ−により終結されるＮ５ｓ−蛋白質遺伝子を含む植物
形質転換ベクターを作成するため、ｐ’ｌ”５ＷＶ−Ｎ
ＳｓのＰｓｔｌフラグメントを単離し、Ｐｓｔｌ線状化
ｐｚＬＪ−ｎに挿入することにより、キメラ遺伝子カセ
ット・ベクターｐｉ”　Ｓ　Ｗ　Ｖ　−Ｎ　ｓＡが作成
される。３５Ｓプロモーター、Ｎ５ｓ−蛋白質遺伝子お
よびＮＯＳターミネータ−を含むカセットを、Ｅｃｏｌ
ｉｌおよびＸｂａｌによる制限によりｐＴＳＷＶ−Ｎｓ
Ａから取り出し、Ｅ　ｃｏＲＬＸ　ｂａｌ線状化ｐ１３
１　Ｎ　Ｉ　９にライゲーションする。生成したプラス
ミドｐ’ｌ’５ＷＶ−ＮｓＡＩ３（第１３図）は、当業
界の熟練者によく知られた方法を用いて植物形質転換実
験で使用される。

実施例９　Ｄ　：ｐＺ　Ｕ　−ＨにおけるＮ５ｓ−蛋白
質遺伝子構築物。

Ｎ５ｓ−蛋白質からのＡＴＧ出発コドンが３５ＳΩプロ
モーターのＴＭＶリーダーの３°−末端に直接融合され
ている融合体を作成するためには、ＮＳｓ遺伝子の出発
コドンを突然変異させなければならない。当業界の熟練
者に周知の方法である部位突然変異を用いて、配列５°
ｄ（Ａ　Ａ　ＣＣＡ　ＴＡ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｔ　ＣＴ　＞
を５°ｄ（ＡＡＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴ）に突然変異させ
ることにより、ＮＳｓ蛋白質遺伝子のＡＴＧ出発コドン
を含むＮｄｅ１部位＝５°ｄ（ＣＡ　Ｔ　Ａ　’Ｉ’　
Ｇ　）が作成される。生成した組換えプラスミドをｐ’
ｒ　Ｓ　Ｗ　Ｖ　−Ｎ　Ｓ　ｓｍｕｔと呼ぶ。プラスミ
ドｐＴ　Ｓ　Ｗ　Ｖ　−Ｎ　Ｓ　ｓｍｕｔをＮｄｅｌに
より線状化し、次いで’Ｉ’　４　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラ
ーゼで処理することにより、プラント端を作成する。こ
の線状化ＤＮＡをＰｓｔｌで消化し、突然変異ＮＳｓ遺
伝子を含むフラグメントを単離し、Ｓｓ＋ａｌ−Ｐｓｔ
ｌ線状化１）Ｚ　Ｕ　−［３に挿入４”ると、組換えプ
ラスミドｐ’ｒ　Ｓ　Ｗ　Ｖ　−Ｎ　５ｓｕｔ［３が得
られる。３５Ｓ−Ωプロモーター、突然変異Ｎ５ｓ−蛋
白質遺伝子およびＮＯＳターミネータ−を含むキメラ・
カセットを、ＢａｍＨｌ／Ｘｂａｌ消化によりプラスミ
ドｐ’ｒ　Ｓ　Ｗ　Ｖ　−Ｎ　ｓｍｕｔ　Ｂから取り出
ず。次いで、単離されたキメラ遺伝子カセットをＢａ＋
＊Ｉ刊／Ｘｂａｌ線状化ｐＢＩＮ１９に挿入することに
より、バイナリ−形質転換ベクターｐＴＳＷＶ−Ｎｓｍ
ｕｔＢＢが作成される。生成し１ニブラスミドｐＴＳＷ
Ｖ−ＮｓｍｕｔＢＢ（第１４図）は、当業界の熟練者に
よく知られた方法を用いて植物形質転換実験で使用され
る。

実施例９　Ｅ　：ｐＺ　Ｕ　−ＡおよびＩ）ＺＵ−Ｂに
おける５°−および３°−末端「パン−ハンドル」構築
物。

ＤＮＡ分析プログラムを用いることにより、ウィルスＴ
ＳＷＶ　　Ｓ　　ＲＮＡにおける「パン−ハンドル」ル
ープの場所を探し出す。検出される最強の「パン−ハン
ドル」ループは、ウィルスＳ　　ｎＮＡの５゜末端にお
ける最初の７０個のヌクレオチド（１〜７０）およびウ
ィルスＳ　　ＲＮＡの３°−末端における最後の６７個
のヌクレオチド（２８５０〜２９１６）を含む（第１５
図）。ウィルスＳ　ｎＮＡにおけるこの「パン−ハンド
ル」ループを含むＤＮＡ配列は次の通りである。

および ２８５０　　ＧＴＴＣＴＴＡＡＴＧ　　ＴＧＡＴＧＡＴ
ＴＴＧ　　ＴＭＧＡＣＴＧＡＧ　　ＴＧτ丁入ＡＧＧＴ
Ａ　　ＴＧＡＡＣＡＣＡＡＡ２９００　人ＴＴＧＡＣＡ
ＣＧＡ　　ＴＴＧＣＴＣＴＤ　Ｎ　Ａ分析プログラムを
用いろことにより、ウィルスＴＳＷＶ　　Ｌ　　ＲＮＡ
におけろ「パン−ハンドル」ループの場所を探し出す。

検出される強い「パン−ハンドル」ループは、ウィルス
Ｌ　　ＲＮＡの５゜−末端における最初の８０個のヌク
レオチド（１〜８０）およびウィルスＬ　　ＲＮＡの３
ニー末端における最後の８０個のヌクレオチドを含む。

ウィルスし　ＲＮＡにおけるこの「パン−ハンドル」ル
ープを含むＤＮＡ配列は次の通りである。

および これらの領域を市販のＤＮＡシンセサイザーにおいて合
成し、適当なリンカ−配列を加える。ＳおよびＬ　　Ｒ
ＮＡの「パン−ハンドル」ベクターの構築の結果、各々
ｐＴｓＷＶ−ｔｅｒｍｓおよびｐ’ｒｓＷＶ−ｔｅｒｍ
Ｌが得られる。適当な制限酵素の組み合わせを用いるこ
とにより、これらのフラグメントは、ｐＺＵ−ＡのＣａ
ＭＶ３５Ｓプロモーターお上びＮＯＳターミネータ−間
またはｐｚ　Ｕ　−Ｂの３５Ｓ−Ωプロモーターおよび
ＮＯＳターミネータ−間に挿入され、キメラ・カセット
、ｐ’ｒＳＷＶ−ｔｅｒ＋＊５ＡＳｐＴＳＷＶ−ｔｅｒ
＋ｓＬＡ、ｐ’ｌ’５ＷＶ−ｔｅｒｓｓＩ３およびｐＴ
　Ｓ　Ｗ　Ｖ　−１ｅｒｍ　Ｌ　Ｂが生成される。

次に、適当な酵素の組み合わ仕を用いて、これらのカセ
ットをバイナリ−形質転換ベクターｐＢＩＮ１９に導入
すると、プラスミドｐ’ｌ”　Ｓ　Ｗ　Ｖ　−ｔｅｒｍ
ＳＡＩ３．ｐＴＳＷＶ−ｔｅｒｓＬＡＢ、ｐ’ｒＳＷＶ
−１ｅｒｗ＋ＳＢＢおよびｐ’ｒ　Ｓ　Ｗ　Ｖ　−ｔｅ
ｒｓＬ　［３１１が得られる。

別法として、上記よりも大きいか、または他のＤＮＡ配
列により分離された３°−および５°−末端を含む「パ
ン−ハンドル」構築物を設計することにより、組換え遺
伝子から生成された転写物の植物における安定性を高め
ることが可能である。ｆｐ＜ンーハンドル」構築物は全
て短いトスポウイルスＲＮＡ、各ＴＳＷＶ　ＲＮＡ分子
と似テイルタメ、欠損干渉性ＲＮＡと見なされ得る。

実施例９Ｆ：ｐＺＵ−ＡおよびｐＺ　Ｕ　−Ｈにおける
ＴＳＷＶ　　Ｓ　　ＲＮＡヘアピン領域を含む構築物。

ＤＮＡ分析プログラムを用いることにより、ウィルス’
ｒＳＷＶ　　Ｓ　　ＲＮＡにおけろヘアピン・ループの
場所を探し出す。検出される最強のヘアピン・ループは
、ヌクレオチド１５９２から出発し、ヌクレオチド１８
３４で終わる（第１６図）。このヘアピン・ループを含
む配列は次の通りである。

２５１　丁Ｔ＾ ヘアピン領域を有する５２６ｂｐのＨｉｎｄｌｌｌフラ
グメントをｐＳ　５１４から単離する。このフラグメン
トをアガロース・ゲルから取り出し、続いてＴ４ポリメ
ラーゼで処理することにより、プラント端が作成される
。次の段階では、Ｐｓｔｌリンカ−をこれらのプラント
端にライゲーションする。

Ｐｓｔｌで消化後、フラグメントをＰｓｔｌ線状化ｐｚ
Ｕ−Ａにおいてクローン化すると、組換えプラスミドｐ
’ｒＳＷＶ−ＨｐＳＡが得られる。プラスミドｐＴＳＷ
Ｖ−ＨｐＳＡをＨｉｎｄｌｌ＋で消化し、キメラ遺伝子
を含むフラグメントをアガロース・ゲルから取り出し、
Ｈｉｎｄｌｌｌ線状化ｐｎ　Ｉ　Ｎ　＋　９にライゲー
ションすると、形質転換ベクターρＴＳＷＶ−ＨｐＳＡ
Ｂが得られろ。

別法として、ｐｓ５１４のｌｌ１ｎｄｌｌ１７ラグメン
トをＴ４ポリメラーゼで処理することによりプラント端
を作成し、続いて発現ベクターｐｚ　Ｕ　−Ｂの５ｅａ
１部位でクローン化すると、組換えプラスミドｐＴＳＷ
Ｖ−ＨｐＳＢが得られろ。プラスミドｐＴＳＷＶ−Ｈｐ
ＳＢをＨｉｎｄｌｌｆで消化し、キメラ遺伝子を含むフ
ラグメントをアガロース・ゲルから取り出し、Ｘｂａｌ
線状化ｇ）Ｂ　Ｉ　Ｎ　ｌ　９にライゲーションすると
、形質転換ベクターｐＴＳＷＶ−ＨｐＳＢＢが生成され
る。

（当業界の熟練者であれば、他のフラグメントらまた、
機能に抵触４−ることなく上記ヘアピン領域を含むＴＳ
ＷＶ　　Ｓ　　ＲＮＡのｃＤＮＡクローンから単離され
得ることは明らかである。また、ヘアピン領域を含むフ
ラグメントはＤＮＡンンセサイザーを用いて合成され得
る）。

実施例１０ 植物材料へのバイナリ−ベクターの形質転換。

バイナリ−ベクターを植物材料へ導入する方法は充分に
確立されており、当業界の熟練者に周知である。例えば
使用される栽培変種および植物の種類によって使用され
るアグロバクテリウム株、外植材料の供給源、再生シス
テムか異なるため、方法の変形が存在する。

上記バイナリ−植物形質転換ベクターは、次の手順によ
る植物形質転換実験で使用される。構築されたバイナリ
−ベクターを二組交配により受容体アグロバクテリウム
・ツメファシェンス株に導入し、次いで接合完了体のサ
ザーン分析により受容味への構築物の適切な導入を証明
し、選抜されたアグロバクテリウム・ツメファシェンス
株を用いて無菌外植材料の接種および共培養（ｃｏｃｕ
ｌｔｉｖａｔ　１ｏｎ）を行い、適当な抗生物質により
使用されたアグロバクテリウム・ツメファノエンス株を
選択的に殺し、カナマイノン含有選択培地での培養によ
り形質転換細胞を選抜し、発芽誘導培地へ組織を導入し
、選択されたｍ条を根付き誘導培地へ導入し、土壌へ苗
木を導入し、トランスジェニック植物から単離された総
ＤＮＡのザザーン分析により構築物の無傷状況について
検定し、蛋白質のノーザン分析および／または酵素検定
およびウェスタン・プロット分析により挿入されたキメ
ラ遺伝子の正しい機能について検定する。

実施例ＩＩ 植物細胞におけるＴＳＷＶ　　ＩｔＮＡ配列の発現。

次のプロトコルを用いて再生植物の葉からＩｔＮＡを抽
出する。液体窒素中で２００ｍｇの葉材材を微細粉末に
粉砕する。８００μＱのＲＮ　Ａ抽出緩衝液（１００ミ
リモルのトリス−ｏｃｌ（ｐｕｓ、ｏ）、５００ミリモ
ルＮａＣ１，２ミリモルＥＤ’ｒ’Ａ、２００ミリモル
β−メルカプト−エタノール、０゜４％５ＤＳ）を加え
、フェノールによりホモジネートを抽出し、アルコール
沈澱により核酸を集める。核酸を０．５肩ｇの璽０ミリ
モル・トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８、０）、ｌミリモルＥ　
Ｄ　’ｒ　Ａに再懸濁し、ＬｉＣ１を加えて２モルの最
終濃度とし、最大４時間水上で放置し、遠心分離により
ｒｌＮＡを集める。

４００μＱのｌθミリモル・トリス−ＨＣ１（ｐＨ８。

０）、１ミリモルＥＤＴＡに再懸濁し、アルコールによ
り沈澱させ、最後に５０μｇのｌθミリモル・トリス−
ＩＣＩ（ｐＨ８，０）、１ミリモルＥＤ′Ｉ″八に再懸
濁する。ＲＮＡをグリオキサル／アガロース・ゲル上で
分離し、パン・グリンスベン等（１９８６）による記載
に従いシーンスクリーンにプロットする。［”Ｐ］、［
”Ｓｌまたは非放射性標識技術の使用により標識された
ＤＮＡまたはｎＮＡプローブを用いることにより、ＴＳ
ＷＶウィルスＲＮＡが検出される。これらのノーザン分
析に基つき、再生植物がとの程度キメラＴＳＷＶ遺伝子
を発現するかが測定される。

また、ＴＳＷＶ蛋白質遺伝子を含むキメラ構築物により
形質転換された植物をウェスタン・ブ〔！、ソト分析に
かける。ラエムリ（１９７０）に従い試料緩衝液中で粉
砕することにより、形質転換植物の葉から蛋白質を抽出
する。本質的にラエムリ（！９７０）による記載に従い
、５０μ９分量の蛋白質を１２゜５％５ＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動に付す。トービン等（＋９７９
）による記載に従い、分離された蛋白質を電気泳動的に
ニトロセルロースに移動させる。トービン等（＋９７９
）に従い、移動した蛋白質を、精製ＴＳＷＶヌクレオカ
プシドに対して産生じた抗血清と反応させる。

ウェスタン分析の結果に塙つき、形質転換植物が挿入さ
れたキメラ遺伝子によりコードされへ′Ｉ″ＳＷ■蛋白
質を実際に含むことが測定される。

実施例１２ ＴＳＷＶ感染に対する植物の抵抗。

標準検疫条件下、温室で形質転換植物を生育することに
より、病原体による感染を完全に阻止する。形質転換体
を自家授粉させ、種子を採取する。

子孫植物を挿入遺伝子の分離について分析し、続いて機
械的接種によりＴＳＷＶＪ、：ｌ＠染させる。ＴＳＷＶ
により全体的に感染した植物からの組織を、５倍容量の
水冷接種緩衝液（１％ＮａｔＳＯｓを補ったＩＯミリモ
ル燐酸緩衝液）中で粉砕し、約５退会の実生の最初の２
枚の充分に広がった葉をカーポランダム粉末の存在下で
こすり合わせる。接種後３週間、接種された植物を徴候
発現についてモニターする。

’ｔ’　ｓ　ｗ　ｖ関連ＤＮＡ配列を含む植物は、徴候
発現の遅延が例証する通り、’ｒ　ｓ　ｗ　ｖ感染に対
して低い感受性を示すが、非影質転換対照植物は接種後
７０以内に重い全体的ＴＳＷＶ徴候を示す。

実施例Ｉ３ 診断用としての合成オリゴヌクレオチドの使用。

次のプロトコルに従い、被疑植物の葉からＩｔＮＡを抽
出する。優先的に病気の徴候を示す１グラムの葉材材を
３ｊρの１００ミリモル・トリス−ＨＣｌ、５０ミリモ
ルＥＤＴＡ、１．５モルＮａＣ１および２％ＣＴＡＢ（
ｐｌ（Ｂ、０）中で粉砕する。粉砕後、Ｉｘ（ｌのホモ
ジネートをクロロホルム抽出に付し、６５℃で１０分間
インキュベーションする。

次いで、無機相を集め、フェノール／クロロホルム（１
：ｌ）により抽出し、次にクロロホルムにより最後の抽
出をする。ＬｉＣ１を加えて２モルの最終濃度とするこ
とにより、核酸全部を含む無機相からリボ核酸を分離す
る。この標本を４℃で１時間インキュベーションした後
、リボ核酸を遠心分離により集める。リボ核酸沈澱物を
２５μＱの１０ミリモル・トリス−ＨＣｌ、１ミリモル
■シＤ　’ｒ　Ａ（ｐＨ８，０）に再懸濁する。リボ核
酸を標準アルコール沈澱により回収する。リボ核酸沈澱
物を２５μＱのｌＯミリモル・トリス−ＩＣＩ、１ミリ
モルＥＤＴＡ（ＰＩ−１８，０）に再懸濁する。

ｌμＱの精製リボ核酸を落としてナイロン・プロッティ
ング膜（例、ハイボンド−Ｎ、アマ−ジャム、イギリス
）上に斑点を付ける。ピリオンから単離された配列の一
部分０１数も可）を用いるかまたは優先的にはプローブ
として開示された配列情報に基づいて合成オリゴマーを
設計することにより、標準ハイブリダイゼーションを用
いて植物から’ｒ　ｓ　ｗ　ｖの存在が検出される。（
別法として、’ｒ　ｓ　ｗ　ｖゲノム領域のインビトロ
転写物を用いて、病気の植物から’ｔ’　ｓ　ｗ　ｖ関
連ＲＮ　Ａ配列を検出する）。病気の植物からのＲＮＡ
物質を含むドツトにおけるハイブリダイゼーションの発
生により病気の植物を診断する。

この明細書に記載された方法を用いて、畑から選ばれた
ウィルス感染の疑いがある１２のコンヨウ植物（ＡＩ−
Ｄ３）からＲＮＡを単離する。同様に、３つのＴＳＷＶ
接種したタバコ植物（ＥＩＥ３）および３つの非接種タ
バコ植物（Ｆｌ−Ｆ３）からＲＮＡを抽出する。谷植物
から得られたＩμＱのＲＮＡ試料をハイボンド膜上にた
らす。このフィルターを、標準条件下、１゛３ポリメラ
ーゼおよび放射性標識としてα−［”ＰＩＵＴＰを用い
てｃＤＮＡクローンｐＳ　６１４から合成されたインビ
トロ転写物とハイブリダイゼーションさせる。対照非感
染植物（Ｆｌ−Ｆ３）はシグナルを示さず、対照ＴＳＷ
Ｖ感染植物（Ｅｌ−Ｅ３）は実際に強いシグナルを示す
が、被疑コシヨウ植物は全て、強さが弱〜強の範囲のシ
グナルを示す（第１７図参照）。

（参考文献） アベル壽ピー・ピー、ネルソン・アール−ニス、デ・ビ
ー、ホフマン・エフ、ロジャーズ拳ニス・ジー、フレイ
ジー・アール・ティーおよびビーチ−・アール・エフ（
１９８６）、ｒタバコ・モザイク・ウィルス・コート蛋
白質遺伝子を発現′４°るトランスジェニック植物にお
ける病気発現の遅延Ｊ１［サイエンスＪ（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）　２３２．７３８−７４３゜アウスベル・エフ・エ
ム、ブレンド・アール、キングストン・アール・イー、
ムーア・デイ−・デイ−、セイトマン・ジエイ・ジー、
スミス・ジエイ・ニー、ストルール・ケー（＋９８７）
、［カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バ
イオロジーＪ（Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　
ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉ。

ｌｏｇｙ）、グリーン・パブリッシング・アソーンエイ
ツ・アンド・ウィリー・インターサイエンンーズ、ニュ
ーヨーク、ヂチェスター、ブリスベーン、トロントおよ
びンンガボール。

ビーチ−・アール・エフ、フレイジー・アール・ティー
およびロジャーズ・ニス・ノー、ｒ＞　Ｐ。

２２３４５２、「ウィルス感染からの植物の保護」、モ
ンサンド・カンパニー・アンド・ワシントン・ユニバー
シティ− ベバン・エム（１９８４）ｒ植物形質転換用バイナジー
・アグロバクテリウム・ベクター」、［ヌクレイツク・
アシッズ・リサーチＪ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄＲｅｓ）
、１２．８７１１−８７２１０クラークスーバン・ハー
スター・シー・エムおよびピノヨップ・デイ−・エッチ
・エル（１９８０）、「カンジキウサギおよびヌク〔７
ス・ブニャウイルスの３°−末端ｒｌＮＡ配列の分析」
、「パイ［１０ノーｊ（Ｖ　ｉｒｏｌｏｇｙ）　Ｉ　０
５．５６４−５７４゜クラークスーバン・ハースター・
ノー・エム、クラーゲス・ジェイ・ピー・エム、半島エ
ッチ、明石エッチ、フユーラー・エフおよびヒンヨップ
・デイ−・エッヂ・エル（１９８２）、「ブニャウイル
スおよびナイ［Ｊウィルス（ブニャビリダエ）の３°−
末端ＲＮＡ配列の分析：ウィルス科内における末端配列
遺伝的差異の証拠」、「ツヤ−ナル・才ブ・ジェネラル
・パイロロジーＪ（、Ｊ　、　Ｇｅｎ、　Ｖ　１ｒｏ１
．）６１．２８９−２９２゜ フィブルスキー・デイ−、ヘリンスキー・デイ−・アー
ル（１９７９）、「トランス（ｔｒａｎｓ）で提供され
るプラスミド機能により異なるプラスミドＲＫ、の誘導
体を含むオリジンの複製」、「プロソーデインゲス・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシー
ズ・オブ・ザ・ニー・ニス・ニーＪ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ）、７６：
１６４８−１６５２゜ フランク・ニー、ギジー・エッヂ、ノヨナード・ノー、
リヂャーズ・ケーおよびヒース・エル（１９８０）、［
セルｊ（Ｃｅｌｌ）２　＋、２８５−２９４゜グルンス
タイン・ジェイ・エムおよびホグネス・デイ−・ニス（
１９７５）、ｒコロニー・ハイブリダイゼーション：特
異遺伝子を含むクローン化ＤＮＡの単離方法」、［プロ
シーデインゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンノーズ・オブ・ザ・ニー・ニス・ニーＪ
（ＰｒｏｃＮａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ
）７２．３９６Ｉ３９６５゜ グプラー・ニー、ホフマン・ピー・ノエイ（１９８３）
、ｒｃＤＮＡライブラリー生成に関する単純で非常に有
効な方法」、「ノーンＪ（Ｇｅｎｅ）２５．２６３−２
６９゜ ホエケマ・ニー、ヒルシュ・ピー・アール、ポーイカス
・ピー・ジェイ・ノエイ、シルペルート・アール・ニー
（＋９８３）、ｒアグロバクテリウム・ツメファノエン
スＴｉ−プラスミドのｖｉｒ−およびＴ−領域の分離に
基づくバイナリーヘクター系」、［ネイチ−？　−ｊ（
Ｎ　ａｔｕｒｅ）、３０３：１７９１８０゜ フィン・ティー・エッチ、ヤング・アール・ニーおよび
デーヒス・アール・ダブリュー（１９８５）、「コンス
トラクノヨン・アンド・スクリーニングｃＤＮＡライブ
ラリーズ・イン・ラムダｇｔｌＯアンド・ラムダｇｉ１
１．イン・ＤＮＡクローニング・テクニクス・ア・プラ
クティカル・アプローチ−１（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏ
ｎ　ａｎｄ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｃＤＮＡ　ｌ１ｂｒ
ａｒｉｅＳｉｌ　ｌａａ＋ｂｄａ　ｇ口Ｏａｎｄ　ｌａ
ｍｂｄａ　ｇｔ　Ｉ　１．　Ｉｎ：ＤＮＡｃｌｏｎｉｎ
ｇ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：　ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ
　ａｐｐｒｏａｃｈ）、（グローバー・デイー編）アイ
・アール・エル・プレス、オフスフオード、４９−７８
頁。

ラエムリ・ニー・ケー（１９７０）ｒバクテリオファー
ノＴ４のヘッドの組立中における構造蛋白質の開裂」、
「ネイヂ’ｒ　　ｊ（Ｎａｔｕｒｅ）２４４．２９３０
゜ マニアチス・ティー、フリッチ・イー・エフ、ザムブル
ソク・ノエイ（１９Ｂ２）、［モレキコラー・り「ノー
ニング、ア・ラボラトリ−・マニュアルＪ（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ
　ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバ−・
ラボラトリ−ニューヨーク。

ムラシゲ・ティー、スクーグ・エフ（Ｊ９６２）、「急
速生長用修正培地およびタバコ組織培養による生物検定
」、［フィシオロジア・プランタルムＪ（Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ、Ｐｌａｎｔ）、　　＋５：４７３　〜４９７゜ゲス
・ピー・ダブリュー・エル、ボニルジャン・エム・エル
およびピーターズ・デイ−（１９７７）、「トマト・ス
ボッテド・ウィルト・ウィルスの構造蛋白質」、［ジャ
ーナル・オブ・ジェネラル・パイロロジーＪ（Ｊ　、　
Ｇｅｎ、　Ｖ　１ｒｏ１．）、３６．８−９１０ トービン・エッチ、スタチクリン・ティーおよびゴート
ン・ジェイ（＋９７９）、「ポリアクリルアミド・ゲル
からニトロセルロースへの蛋白質の移動：方法および幾
つかの適用性」、［ブロシーデインダス・オブ・ザ・ナ
ンヨナル・アカデミ−・オブ・サイエンンーズ・オブ・
ザ・ニー・ニス・工Ｊ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、７６．４３５０−４３５
４８ パン拳グリンスベン・エム・キュー・ジェイ・エム、ギ
ーレン・ノエイ・シェイパエル、ゼトフ・ジェイ・エル
・ニー、ニジキャンプ・エッチ・ノエイ・ノエイおよび
クール・アー・ジエイ（１９８６）、「ペチュニア・ハ
イブリダにおける葉緑体遺伝子発現の転写および転写後
調節」、「ｔル°７アル・テンＪ（Ｔｈｅｒ、　Ａｐｐ
ｌ、　Ｇｅｎ、）、７３．９４〜１１０ バーフレイノ・エフ・エフおよびビーターズ・デイ−（
＋９８３）、「トマト・スボッテド・ウィルト・ウィル
スの欠損形態の特性検定」、［ジャーナル・オブ・ジェ
ネラル・パイロロジーｊ（Ｊ、Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏυ、
６４．６７７−６８６゜ビースランダー・アール（１９
７９）、「低ゲル化温度アガロース・ゲルでの電気泳動
的分離後における無傷の高分子ｍＲＮＡおよびＤＮＡの
簡単な回収方法」、［アナリティカル・バイオケミスト
リーＪ（Ａ　ｎａｌ　、　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　）、
９８．３０５−３０９゜ ヤニシューペロン・シー、ビエイラ・ジェイおよびメッ
ノング・ジェイ（１９８５）、「改良されたＭＩ３ファ
ージ・クローニング・ベクターおよび宿主株：Ｍ　ｌ　
３ＩＩｌｐｌ　８およびｐＵｃ１９ベクターのヌクレオ
チド配列」、［ジーンＪ（Ｇｅｎｅ）、３３．１０３〜
１１９゜

【図面の簡単な説明】

第１図は、トマト・スボッテド・ウイルトウイルスの構
造の概略図である。 第２図は、ＴＳＷＶ　　Ｓ　　Ｉ？ＮＡに使用されるク
ローニング法の概略図である。 第３図は、ＴＳＷＶ　　Ｌ　　ＲＮＡ＋、：使用される
クローニング法の概略図である。 第４図は、ＴＳＷＶ　　Ｓ　　ＲＮＡの配列およびゲノ
ム構成を示す。 第５Ａ図および第５Ｂ図は、それぞれ、５ＲＮＡおよび
Ｌ　ＲＮＡの全解読枠に関する翻訳開始および終止コド
ンの分布を示す図である。 第６Ａ図および第６Ｂ図は、それぞれ、ＴＳＷＶ　Ｍ　
ＲＮＡおよびＬ　ＲＮＡのヌクレオチド配列を示す図で
ある。 第７図は、適当な発現ベクター（ｐＺＵ−Ａ）の構築の
概略図を示す。 第８図は、適当な発現ベクター（ｐＺＬＩ−Ｂ）の構築
の概略図を示す。 第９図は、ヌクレオカプシドＮ蛋白質遺伝子を含む適当
なプラスミド（ｐＴＳＷＶ−Ｎ）の構築の概略図を示す
。 第１Ｏ図は、ヌクレオカブンドＮＳｓ〜蛋白質遺伝子（
ＴＳＷＶ−Ｎ蛋白質遺伝子）を含む適当なプラスミド（
ｐＴ　ＳＷＶ　−Ｎ　Ｓｓ）の構築の概略図を示す。 第１１図は、この発明によるＤＮＡ構築物である植物形
質転換ベクターｐＴＳＷＶ−ＮＡＢの構築の例を示す概
略図である。 第１２図は、この発明によるＤＮＡ構築物である植物形
質転換ベクターｐＴ　Ｓ　Ｗ　Ｖ　−Ｎ　ｍｕｔＩ３１
３の構築の例を示す概略図である。 第１３図は、この発明によるＤＮＡ構築物である植物形
質転換ベクターｐＴ　Ｓ　ＷＶ　−Ｎ　ＳｓＡ　Ｂの構
築の例を示す概略図である。 第１４図は、この発明によるＤＮＡ構築物である植物形
質転換ベクターｐＴ　Ｓ　Ｗ　Ｖ　−Ｎ　Ｓ　ｓｍｕｔ
Ｉ３　ｒ３の構築の例を示す概略図である。 第１５図は、ＴＳＷＶ　　Ｓ　　Ｉ？ＮＡのｒパン−ハ
ンドル」領域を示す図である。 第１６図は、ＴＳＷｖ　Ｓ　ＲＮＡのヘアピン領域を示
す図である。 第１７図は、被疑植物のドツト・プロット分析を示す図
である。 特許出馳人　ザーデュニー・ベスローテム・ペンノット
ンヤップ 代理　人　弁理士　青　山　葆　はか１名ヱ Ｃ１ ＣΣ 」〕 −（ 一寸の０寸０ （１）　ｙ−０（Ｎ　Ｆ（Ｄ ＣＤ　　Ｃｏ　　ｌｒ＞　Ｉｆ） Ｆ１９゜ ５Ａ Ｆｉｇ。 ８ く ・：）＜００（Ｊ　）ＤフＱ ３５Ｓ　フｂ千−フー Ｆｉｇ。 ＯＳ ターミネーター ＡＴＧ ＡＴＧ ＦＩＱ。 ７Ｇ＾ ＧＡ ＴＧ＾ ＡＴＧ ＡＡ Ｆｉｇ・ ０ 図面の浄書（内容に変更なし） Ｆｉｇ。 ７ ） −５５３− り 計 コυく　　υココベ　（ペペ　　にコＵにＵ（（Ｌ５：
ｌ　　　ｕ＜＜コ　０００　　　：５＜ｕｏｕ。

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. （１） ａ）トスポウイルスのＲＮＡ配列またはそれに相同的な
   ＲＮＡ配列、 ｂ）１個またはそれ以上のコドンがそれらの同義コドン
   （すなわち、同じアミノ酸または終止シグナルに対応す
   るコドン）により置換されている、トスポウイルス蛋白
   質をコードするａ）記載のＲＮＡ配列、またはその一部
   分、またはそれに相同的なＲＮＡ配列、 ｃ）ａ）またはｂ）記載のＲＮＡ配列に相補的なＲＮＡ
   配列 への転写をコードするＤＮＡ配列を含み、前記ＤＮＡが
   植物において機能するプロモーターおよびターミネータ
   ーの発現制御下におかれている、組換えＤＮＡ構築物。
2. （２）ＤＮＡ配列が、 ｉ）ＳＲＮＡヌクレオチド配列１〜２９ １５、 ｉｉ）ＳＲＮＡヌクレオチド配列８９〜１ ４８３、 ｉｉｉ）ＳＲＮＡヘアピン、 ｉｖ）ＳＲＮＡ「パン−ハンドル」、 ｖ）ＳＲＮＡヌクレオチド配列２７６３ 〜１９８７、 ｖｉ）ＬＲＮＡヌクレオチド配列４４６２ 〜１、 ｖｉｉ）ＬＲＮＡヌクレオチド配列４１〜２、ｖｉｉｉ
   ）ＬＲＮＡヌクレオチド配列３９８０〜４６、 ｉｘ）ＬＲＮＡヌクレオチド配列（６７０６＋ｎ）〜（
   ４４６２＋ｎ）（ここで、ｎは、第６Ｂ図に示されたヌ
   クレオチド４４６２（Ｕ）およびその後に示されたヌク
   レオチド（Ｃ）間のギャップのヌクレオチドの数である
   ）、 ｘ）ＬＲＮＡヌクレオチド配列（６７０６ ＋ｎ）〜（６０１６＋ｎ）（ここで、ｎは上記の意味を
   有する）、 ｘｉ）ＬＲＮＡ「パン−ハンドル」、 ｘｉｉ）ＳＲＮＡヌクレオチド配列１９８７〜２７６３
   に相補的なＲＮＡ配列、 ｘｉｉｉ）ＳＲＮＡヌクレオチド配列８９〜１４８３に
   相補的なＲＮＡ配列、 ｘｉｖ）ＬＲＮＡヌクレオチド配列１〜４４６２に相補
   的なＲＮＡ配列、 ｘｖ）ＬＲＮＡヌクレオチド配列２〜４１ に相補的なＲＮＡ配列、 ｘｖｉ）ＬＲＮＡヌクレオチド配列４６〜３９８０に相
   補的なＲＮＡ配列、 ｘｖｉｉ）ＬＲＮＡヌクレオチド配列（４４６２＋ｎ）
   〜（６７０６＋ｎ）に相補的なＲＮＡ配列（ただし、ｎ
   は上記の意味を有する）、 ｘｖｉｉｉ）ＬＲＮＡヌクレオチド配列（６０１６＋ｎ
   ）〜（６７０６＋ｎ）に相補的なＲＮＡ配列（ただし、
   ｎは上記の意味）、 ｘｉｖ）１個またはそれ以上のコドンがそれらの同義コ
   ドンにより置換されている、ＳＲＮＡヌクレオチド配列
   ８９〜１４８３、 ｘｘ）１個またはそれ以上のコドンがそれらの同義コド
   ンにより置換されている、ＳＲＮＡヌクレオチド配列２
   ７６３〜１９８７、 ｘｘｉ）１個またはそれ以上のコドンがそれらの同義コ
   ドンにより置換されている、ＬＲＮＡヌクレオチド配列
   ３９８０〜２３６、 ｘｘｉｉ）１個またはそれ以上のコドンがそれらの同義
   コドンにより置換されている、ＬＲＮＡヌクレオチド配
   列４４６２〜２３６、 ｘｘｉｉｉ）１個またはそれ以上のコドンがそれらの同
   義コドンにより置換されている、ＬＲＮＡヌクレオチド
   配列（６６７２＋ｎ）〜（４４６２＋ｎ）（ただし、ｎ
   は上記の意味）、 ｘｘｉｖ）１個またはそれ以上のコドンがそれらの同義
   コドンにより置換されている、ＬＲＮＡヌクレオチド配
   列（６６７２＋ｎ）〜（６０１６＋ｎ）（ただし、ｎは
   上記の意味）、 ｘｘｖ）ＭＲＮＡヌクレオチド配列（ｍ−５７４）〜ｍ
   （ここで、ｍは、ＭＲＮＡのヌクレオチドの総数を示す
   ）、 ｘｘｖｉ）ＭＲＮＡヌクレオチド配列（ｍ−５７４）〜
   ｍ（ただし、ｍは上記の意味）に相補的なＲＮＡ配列、 ｘｘｖｉｉ）上記ｉ）〜ｘｖｉｉｉ）、ｘｘｖ）または
   ｘｘｖｉ）項記載のヌクレオチド配列に相同的なＲＮＡ
   配列、ｘｘｖｉｉｉ）１個またはそれ以上のコドンがそ
   れらの同義コドンにより置換されている、ＭＲＮＡヌク
   レオチド配列（ｍ−２６）〜（ｍ−５７４）（ただし、
   ｍは上記の意味）、 ｘｘｉｘ）上記ｉ）〜ｘｘｖｉｉｉ）項記載のＤＮＡ配
   列のフラグメント への転写をコードする、請求項１記載のＤＮＡ構築物。
3. （３）パン−ハンドルのトスポウイルス−ＲＮＡ配列に
   おける転写、またはそれに相同的なＲＮＡ配列への転写
   をコードする、請求項１記載のＤＮＡ構築物。
4. （４）ウィルス相補的センスにおける転写解読枠のトス
   ポウイルス−ＲＮＡ配列、または１個またはそれ以上の
   コドンがそれらの同義コドンにより置換された対応する
   ＲＮＡ配列、またはそれに相同的なＲＮＡ配列への転写
   をコードする、請求項１記載のＤＮＡ構築物。
5. （５）ヘアピンのトスポウイルス−ＲＮＡ配列またはそ
   れに相同的なＲＮＡ配列への転写をコードする、請求項
   １記載のＤＮＡ構築物。
6. （６）トスポウイルス−ＲＮＡ配列、または１個または
   それ以上のコドンがそれらの同義コドンにより置換され
   たトスポウイルス−ＲＮＡ配列、または少なくとも２０
   個のヌクレオチドを有するそれに相同的なＲＮＡ配列へ
   の転写をコードする、請求項１〜５のいずれか１項記載
   のＤＮＡ構築物。
7. （７）トスポウイルス−ＲＮＡ配列、または１個または
   それ以上のコドンがそれらの同義コドンにより置換され
   たトスポウイルス−ＲＮＡ配列、または少なくとら５０
   個のヌクレオチドを有するそれに相同的なＲＮＡ配列へ
   の転写をコードする、請求項６記載のＤＮＡ構築物。
8. （８）ＤＮＡ配列が、ウィルスＳまたはＬＲＮＡの各々
   ５′ｎおよび３′末端配列の組み合わせへの転写をコー
   ドする、請求項１記載のＤＮＡ構築物。
9. （９）プロモーターが、植物細胞において機能するウィ
   ルス、真菌、細菌、動物または植物誘導性プロモーター
   である、請求項１〜８のいずれか１項記載のＤＮＡ構築
   物。
10. （１０）ターミネーターが、植物細胞において機能する
    ウィルス、真菌、細菌、動物または植物誘導性ターミネ
    ーターである、請求項９記載のＤＮＡ構築物。
11. （１１）請求項１〜１０記載のＤＮＡ構築物をそのゲノ
    ム中に含む植物。
12. （１２）トスポウイルスのＲＮＡ配列に相補的な１本ま
    たは２本鎖オリゴヌクレオチド配列を含むプローブ。
13. （１３）オリゴヌクレオチドが、トスポウイルスＳＲＮ
    Ａ配列、トスポウイルスＬＲＮＡヌクレオチド配列また
    は少なくとも１５個のヌクレオチドを含む上記配列のフ
    ラグメントに相補的である、請求項１２記載のプローブ
    。
14. （１４）オリゴヌクレオチド配列が４００個〜６００個
    のヌクレオチドを有する、請求項１２または１３記載の
    プローブ。
15. （１５）請求項１１記載の植物の製造方法であって、ａ
    ）植物細胞のゲノムに請求項１記載のＤＮＡ構築物を挿
    入し、 ｂ）形質転換細胞を得、 ｃ）形質転換細胞から遺伝学的に形質転換された植物を
    再生させる ことを含む方法。