JPS5927900A - 固定化オリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｃ１１発明の背景 技術分野 本発明は、一定の長さのオリ−ｒ（ｄＮ）の５′−末端
リン酸基にプルキレン基またはアリレン基を介してアミ
ン基が導入されたオリゴヌクレオチド誘導体、そのアミ
ン基の部分で担体と結合した固定化オリゴヌクレオチド
およびそれらの製造法に関する。

生化学の領域で、生体高分子を純化することは重要な研
究線順の一つであり、過去多数の研究者により多大の努
力が払われてきた。そのような目的に対しては、アフイ
ニテイクロマトグラフイー技術ならびにポリアクリルア
ミドゲルを主体とする電気泳動法が開発されて、賞用さ
れるに到っている。

生体高分子の多くは、特定の物質と特異的に結合ないし
相互作用する固有の性質をもっている。

アフイニテイクロマトグラフイーは、生体高分子のもつ
この生物学的識別の原理を巧妙に利用した方法といえる
。

このよりなアフイニテイ法が急速に発展しつつある今日
では、タンパク質、酵素はもとより核酸、脂質、ホルモ
ン、ビタミン、レセプターなどあらゆる生体物質の精製
、分離に広（活用されている。

とりわけ、核酸をリガンドと１−るアフイニテイクロマ
トグラフイーは、分子生物学的にも重要な核酸やタンノ
ξり質の単離をはじめとし゛〔、今後も広（応用される
と予想される。また、効率的な単離のためにもリガンド
と担体との架橋方法の開発が太いに興味のあることであ
る。

先行技術 このような観点から、核酸を結合させた担体を用いるア
フイニテイクロマトグラフイーの中では、オリ：ｉ’　
（ｄＴ　）−セルロースまたはポリ（ｔ・）−アガロー
スカラムを使って３′−末端にポリ（Ａ）’！に含むＲ
ＮＡ　’（ｒ単離するという方法が、最も広（利用され
ている（　Ｏｎｏ、　Ｍ、、　Ｋｏｎｄｏ、　Ｔ、、　
Ｉ（ａｗａｋａｍｉ　、　Ｍ、　：Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、；　８１　、９４１　（１９７７））。

ポリ（Ｕ）、ポリ（ｄＡ）−セルロースなどは、ヌクレ
オチｒの塩基部分’１ＢｒｃＮなどで活性化した担体と
結合させる方法であるため、多点で結合して安定である
という反面、親和活性に必要な塩基部分が担体との結合
に使われているので吸着能が弱められ木という難点があ
る（　Ｌｉｎｄｂｅｒｇ、　Ｕ、。

Ｐｅｒｉｓｏｎ、　Ｔ、、　：　Ｅｕｒ、Ｊ、　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、、　３１．２４６　（１９７２））。

また、オリ＝ｒ（ａＴ）−セルロースなどは、ＤＣＣ（
ジシクロへキシルカルゼイミド）など金用いズ、担体の
水酸基とオリゴヌクレオチドのリン酸基とを結合させて
いるといわれているが、非特異的な吸着を起こしたり、
吸着能に再現性を欠くという問題がある。

以上のようなヌクレオチドのホモポリマーを固定化した
例以外に、天然から得られたＤＮＡ　ｋ固定化した例が
二、三あるｐ’　（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｊ、Ｎ、、　
Ｍｏｎａｈａｎ。

Ｊ、Ｊ、、　ＯＭａｌｌｅｙ、　Ｂ、Ｗ、：　Ｊ、　Ｂ
ｌｏｔ、ｅｈｅｍ、、　２５２．５７８９（１９７７）
）、一定の長さで任意の塩基配列金もつオリゴヌクレオ
チドを、特定の位置でのみ担体と結合させてその固定化
に成功したという例はかつて一件も報告されていない。

これらの状況から、任意の塩基配列をもつオリ２ヌクレ
オチド全特定の部位で担体と結合させることができれば
、その技術は固定化ヌクレオチドホモポリマーを利用し
たアフイニテイクロマトグラフイーによるｍＲＮＡの単
離精製ばかりでな（、特定な塩基配列をもつｍＲＮＡの
単離精製、さらには特異的塩基配列を認識する各種核酸
関連酵素類の精製、などにも利用できる可能性が考えら
れる。

なお、リガンドとしてモノまたはジ程度のヌクレオチＰ
を用いたアフイニテイ担体の研究も数多（行なわれ、そ
のうちいくつかのものは既に市販されている。しかし、
ヌクレオチドが直接またはスペーサを介して担体と結合
している部位は、はとんどその塩基部分である＆λヌク
レオチドをその塩基部分以外で結合させるものもあるカ
リ）原料リガンドの合成に手間がかかるうえ、全合成に
わたりめんどうであるという難点をかかえている。

また、いずれの方法もオリゴヌクレオチドに用いること
はできない。

ａ）　Ｌｅｅ、　Ｃ１Ｙ、　、　Ｌａｐｐｌ　、　Ｄ、
Ａ、　、　Ｗｅｒｍｕｔｈ、　Ｂ、、　Ｅｖｅｒ＋ｓｅ
。

Ｊ、、　Ｋａｐｌａｎ、　Ｎ、Ｏ，：　Ａｒｃｈ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｌｏｐｈｙｓ、。

１６８、５６１（１９７４） Ｉｓｌｗａｔａ、　Ｋ、　、　Ｙｏｇｈｉｄａ、　Ｈｏ
：　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

８３、７８３（１９７８） 、特開昭５２−２５７９５号、同５３−１０１３９６号
、同５３−１３３２８３号および同５５−３６２７７号
各公報ｂ）　Ｊｅｒｖｌｓ、　Ｌ、、　Ｐｅｔｔｉｔ、
　Ｎ０Ｍ、：　Ｊ、Ｃｈｒｅｍａｔｏｇ、。

９７、３３（１９７４） Ｌａｍｅｄ、　Ｒｏ、　Ｌ＠ｖｌｎ、　Ｙ、、　Ｗｌｌ
ｃｈｅｋ、　Ｍ、：　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｌｏｐｈｙｓ、Ａｅｔａ、　３０４．２３１（１９７
３）Ｊａｎｓｋｉ、　Ａ、、　Ｏｌｅｇｏｎ、　Ａ、Ｅ
、：　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

７１．４７１（１９７６） 〔１〕発明の概要 要旨 このような点から、本発明者らは、核酸の精製に有用な
、アフイニテイ樹脂にも利用することのできる、有用な
固定化オリゴヌクレオチドおよびその製造法を開発した
。

本発明者らは、既に同相合成法によって完全に精製され
たオリゴヌクレオチドを合成する方法を開発している。

そこで、本発明者らは同相合成法によって合成された目
的物と副生成物の５′−水酸基の保護基の違いに着目し
、目的物にのみ他の担体に結合できるような官能基を新
たに導入し、さらに選択的にこの部分で担体と結合させ
るという固定化の方法を見出した。

このような方法により、任意の配列を有するオリゴヌク
レオチドに特定な位置で担体を結合させた、固定化オリ
ゴヌクレオチドを効果的に合成することに成功した。

本発明は、アフイニテイ樹脂としても使用することがで
きる、固定化オリゴヌクレオチド並びにこの中間体とし
て使用することができる、複数のオ＋Ｊｊ’ヌクレオチ
ド誘導体およびそれらの製造法に関する。

すなわち、本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体は、
下式（２）、（４）および（５）で表わされるものであ
る。

また、本発明による下式（２）、（４）および（５）で
表わされるオリゴヌクレオチド合成法の製造法は、とれ
らを概念的にかつ総括的にいえば、化合物（１）ヲ化合
物（０）に反応させ、化合物（２）全生成させ、一方核
酸合成法により得られた化合物（３′）と、化合物（２
）の司′末端”リン酸の保護基Ｒ４に脱離させた誘導体
穴全縮合させて、化合物（４）全生成させ、これより保
護基金すべて脱離することにより化合物（５）を得る、
ことからなるものである。

ＨＯ（Ｎ’Ｐｘ）ｍＲ３（０） Ｒ２−ｍ−Ｒ’−ｏｐｔ　　　　　　　　　　　　（１
）ＨＯ（Ｎ’ＰＸ）ｎＮ’０ＣＯＲ’　　　　　　　（
３’）Ｒ２−ＮＨ−ｇ’−ｐｘ（Ｎ’ｐｘ）ｍＲ３（２
）Ｒ２−ＮＨ−Ｒ’−Ｐｘ（Ｎ’ＰＸ）ｍ＋ｎＮ’０Ｃ
ＯＲ３（４）ＮＨ２−Ｒ”−？Ｐ（ＮＰ）ｍ＋ｎＮＯＨ
（５）Ｐ。

（ここで、令記号は下記の意味等）を持つ、Ｎ′　アシ
ル化（アシル基は、たとえば、低級脂肪族モノカルヂン
酸（０２〜Ｃ４）からのもの、たとえば、アセチル基、
インブチリル基、または芳香族カルゼン酸からのもの、
たとえば、ベンゾイル基、アニソイル基）された、アデ
ニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチ
ミン（Ｔ）からなる群より選ばれた塩基残基金もつヌク
レオシドのうち、リゼシド骨格の３′および５′の酸素
を除いたもの。たｙし、ｍまたはｍ＋ｎ　（後記）が２
以上の場合の複数のＮ′は、塩基部分および（または）
アシル部分について同一でも異なってもよい。

保護されていない上記塩基残基金もつヌクレオシドのう
ち、リゼシｒ骨格の３′および５′の酸素を除いたもの
。たｇし、ｍ＋ｎ（後記）が２以上の場合の複数のＮは
、同一でも異なってもよい。

リン酸トリエステル結合、すなわち −０−Ｐ−０−（ＲＯは置換されたフェニルＲＯ 基） Ｐ　リン酸ジエステル結合、すなわち １ Ｈ Ｒ１直鎖ま−ｆは分岐鎖の二価炭化水素基、Ｒ２Ｒ３基
脱離の際安定であり、かつオリゴヌクレオチド部分が安
定なまま脱離できる置換基（たとえばトリフルオロアセ
チル基 （Ｔｆａ−）　マタハｏ−ニトロフェニルスルフェニル
基（ＮＰａ−）など） Ｒ３他のすべての保護基が安定な条件で、容易に脱離さ
れて、末端のリン酸トリエステル結合を遊離のリン酸ジ
エステル結合とすることができる置換基（たとえば、シ
アノエチル基（ＣＦ）、）！・リクロロエチル基、ホス
ホロアミデート基等） Ｒ４通常のオリゴヌクレオチド合成法に用いられる３′
−末端水酸基保護基（−ＣＯＲ４）液相合成法におけば
低級アルキル基（たとえばメチル基）またはアリル基（
たとえばニトロベンジル基など）であり、また固相合成
法においてはスペーサを介したポリスチレンまたはポリ
アクリルアミド系樹脂などである。

Ｒ５通常のオリゴヌクレオチド合成法を用いることがで
きろ５′−末端水酸基の保護基（たとえば、置換または
非置換のトリチル基があげられる） ｍＯ〜４０の整数（好ましくは、０〜２０）ｎ　Ｏ〜６
の整数（好ましくは、１〜４））なお上記式中、Ｐまた
はＰ工あるいはＨＯまたは０のうちＮ′またはＮあるい
はこれらを含むカッコの右側に位Ｉｆｆするものはこの
ヌクレオシＰの３′−水酸基に、左側に位置するものは
このヌクレオシドの５′−水酸基に１、それぞれ結合す
るものを表わす。

また、本発明による固定化オリゴヌクレオチドは、下式
（６）で表わされるものである。

本発明による下式（６）で表わされる固定化オリゴヌク
レオチドの製造法は、化合物（５）にセファロース全反
応させて、化合物（６）を得ることからなるものである
。

ＮＨ２−Ｒ’−Ｐ（ＮＰ）ｍ＋ｎＮｏＨ（ｓ）〔セフ却
−ス）−ＮＨ−Ｒ１−ｐ（Ｎｐ）、、、ＮｏＨ（６）〔
ここで、各記号は下記の意味を゛もつ、Ｎ、　Ｎ’、Ｐ
、Ｐ、Ｒ１、Ｒ２５Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、ｍおよびｎは前
記と同じである、 〔セファロース〕　アミン基と結合可能なセファロース
、たとえば、活性化ＣＨ−セファロース、＋３ｒＣＮ　
活性化セファロース、エポキシ化セファロース、および
ＡＨ−セファロースからなる群から選ばれたセファロー
ス〕 なお、本発明で使用する記号化された上記諸式のより具
体的な内容を、たとえば式（４）について示せば、下式
の通りである。

（たｙし、ＲＯはリン酸基金保護する置換基であり、通
常置換されたフェニル基、たとえば０−ニトロフェニル
基などが多く用いられる。ＢおよびＢ′は、塩基部分お
よび（または）アシル部分について同一または異なるア
シル化された塩基である。）効果 本発明によれば、一定の長さでしかも任意の塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドを、特定の部位で担体に結合
させた、アフイニテイ樹脂としても有用な固定化オリゴ
ヌクレオチｒｔ効果的に合成づ−ることかでき、さらに
従来の方法では得られなかった結合も本発明の手法金も
ってすれば良質の樹脂として合成可能になった。

これは、オリゴヌクレオチドと担体との結合における官
能基として、１級アミン基を導入したことによる。すな
わち、これによって下記の効果が実現されると考えられ
る。

１）オリげヌクレオチド中に存在する他の官能基（水酸
永、リン酸基および塩基部分のアミン基など）よりも反
応性が高い。

２）シたがって、脱保護したオリゴヌクレオチドの混合
物を精製せずに担体との縮合に用いても、反応条件等に
より選択的にこの部分でのみ結合させることができる。

またこの結果、固相法および液相法いかなる方法で合成
された、どのような塩基配列をもつオリゴヌクレオチド
をも固定化することが可能となった。

さらに、吸着活性を阻害する塩基部分での結合を避けた
ことにより、本発明により得られた固定化オリゴヌクレ
オチドは、すぐれた吸着能を有する。

したがって、従来のもの（オ！Ｊ：’（ｄＴ）−セルロ
ースおよびポリ（Ｕ）−アガロース）よりも、吸着能、
再現性、選択性および耐久性にすぐれた高良質のオリ−
？（ｄＮ）−セファロースが得られ、位置特異的な合成
法により、簡単な工程しかも効果的な架橋により、いか
なるオリザヌクレオチＦ″をも固定化することが可能と
なった。

本発明は合成可能な任意の塩基配列をもつオリゴヌクレ
オチド全担体に結合させた、固定化オリゴヌクレオチド
製造の一環として捉えることができ、この観点から固相
法により合成されたオリゴヌクレオチドから出発して、
固定化オリゴヌクレオチドに至る反応をその最適実施態
様に則して示せば第１図の通りである。

この反応スキーム中の記号の意味は、前記の通りおよび
下記の通りである。

ＭＳＮＴ　　メシチレンスルホニトリルトリアゾリドＴ
ＭＧ−０棉ｒｐｖＯ，５Ｍ−テトラメチルグアノシン−
ビリジン−２−カルゼアミドキシメイトのジオキサン−
水（９：ｉ）溶液 以下においては、この反応スキームに基いて具体的な化
合物（１）〜（６）について、この順序で説明を行なう
ものとする。

２、化合物（１） 化合物（１）は、式（１）で表わされる。

Ｒ２−Ｎｕ−Ｒ’　−０）（（１） 化合物（１）は、ω−アミノアルコール（ＮＨ２−Ｒ１
−ＯＨ）のアミノ保護基としてＲ２を置換させることに
より得ろことができる。

Ｒ１は直鎖または分岐鎖の二価の炭化水素であり、アル
キレン基（Ｃ２〜０２０％好ましくはＣ２〜Ｃ１２）ま
たはアリレン基（Ｃ４〜Ｃ２０、好ましくはＣ２〜Ｃｌ
２）である。（υ−アミノアルコールとしては、Ｃ２〜
Ｃ１２のものが市販されている。

Ｒ２は、後に示す化合物（２）におげろ、Ｒ３基（−Ｃ
Ｅ）の脱離条件（たとえばＥｔ３Ｎ−Ｐｙ−Ｒ２０１：
　３　：　１　）中、あるいはリン酸化の条件（たとえ
ば、ｐｙ−１−メチルイミダゾール、ｐｙ中ＤＭＡＰ　
（ジメチルアミノピリジン））中などで安定であり、さ
らに、　　はオリゴヌクレオチＰの部分を安定なまま脱
離できる保護基であればいい。

できることならば、オリザヌクレオチｒの保護基の脱離
条件（たとえば濃アンモニア水）中で同時に除去するこ
とが可能である保護基であればさらに好都合である。

アミノ基の保護基である置換基Ｒ２の具体例としては、
濃アンモニア水で除去できるトリフルオロアセチル基、
および弱酸性またはメルカフトエタノールで除去できる
０−ニトロフェニルスルフェニル基、などがあげられる
。

３、化合物（２） （１）定義 化合物（２）は、式（２）で表わされる新規物質である
・Ｒ２−ＮＨ−Ｒ’−Ｐｘ（Ｎ’ＰＸ）ｍＲ３（２）化
合物（２）の置換基の定義および好ましい具体例は、前
記した通りである。

（２）合成 化合物（２）は、下式（０）で表わされるオリゴヌクレ
オチド訪導体の５′−水酸基をリン酸化（たとえば、ホ
スホシトリアシリＰ、ホスホジクロリド、またはホスホ
ジペンゾトリアシリ）４を用いる）し、次いで化合物（
１）全縮合条件下（好ましくは１−メチル−イミダゾー
ル存在下）に反応させることにより得ることかでさる。

反応条件の具体例については、後記実験例を参照された
い。

ＨＯ（Ｎ′Ｐｘ）ｍＲ３（０） ４、化合物（３） 化合物（３）は、式（３）で表わされる。

Ｒ５−０（Ｎ’ＰＸ）ｎＮ　’ＯＣｏ　Ｒ４（３）化合
物（３）は広い意味においては完全に保護されたオリゴ
ヌクレオチドであり、いかなる方法で合成されたもので
あるかは問わない。

化合物（３）においてオリゴヌクレオチＰの３′末端は
カルダニル基を有していて、Ｒ４で保護されている。Ｒ
４としては、低級アルキル基、アリル基または通常の同
相合成法に用いられる、適当なスペー−（ＣＨ２）　２
ＣＯＮ）Ｉ（ＣＨ２）　２ＮＨ−ＣＯ−１−（ＣＨ２）
２ＣＯＮＩ（（（ＣＪ（２）２Ｎ）Ｉ″１ｎ−ＣＨ２−
１−（ＣＩ（２）２ＣＯ（ＮＩ（（ＣＨ２）２ＣＯ″）
ｎＮＨ−１−（ＣＭ、２）２ＣＯＮＩ（ＣＨ２÷など）
をもつ担体（ポリスチレン誘導体、ポリアクリルアミド
誘導体など）などがある。とりわけ操作および処理が容
易であるということから、固相合成法によって得られる
第三の基（すなわち担体。ちなみに、第一の基は低級ア
ルキル基、第二の基はアリル基である）が好ましい。

オリゴヌクレオチドの５′末端のＲ５は、通常用いられ
る保護基である。一般的に置換または非置換トリチル基
（好ましくは・ジメトキシトリチル基）が用いられる。

５、化合物（４） （１）定義 化合物（４）は、式（４）で表わされる新規物質である
。

Ｒ２−ＮＩ（−Ｒ’−ＰＸ（Ｎ’Ｐｘ）ｒｎ＋ｎＮ’０
ＣＯＲ４（４）化合物（４）の置換基の定義および好ま
しい具体例は、前記した通りである。

（２）合成 化合物（４）は、化合物（２）のＲ３基および化合物（
３）のＲ５基をそれぞれ脱離させ、縮合剤の存在下で反
応させることにより得ることができる。

出発化合物（２）のＲ３基は容易に脱離される保護基で
あり、オリ２ヌクレオチ゛ドの３′−末端リン酸基ＰＯ
０（遊離の形）であってもよく、適当な塩の形であって
もよい。Ｒ３基は通常シアノエチル基が用いられ、塩の
場合の代表例は第三級アミン塩、たとえばトリエチルア
ンモニウム塩、である。

出発化合物（３）のＲ５が通常用いられるトリチル基で
ある場合は、脱離は酢酸またはＺｒＢｒ２　／溶媒中で
行なわれるが、後者の方が好ましい。

縮合は、縮合剤の存在下に行なうことが好まｌ〜い。こ
の工程で使用することができる縮合剤の具体例としては
トシルクロリド、メシチレンスルホニルクロリド、メシ
チレンスルホニルテトラソリ）’　（ＭＳ’ｌ”ｊ’　
）　オよびメシチレンスルホニルニトロトリアゾリド（
ＭＳＮＴ　）などが挙げられる。反応条件の具体例につ
いては、後記実験例を参照され６、化合物（５） （１）定義 化合物（５）は、式（５）で表わされる新規物質である
。

Ｎｌ２−Ｒ１−Ｐ　（ＮＰ）、ｎＮＯＨ（５）化合物（
５）の置換基の定義および好ましい具体例は、前記した
通りである。

（２）合成 化合物（４）のＣＯＲ’基、Ｒ２基、塩基上のアシル基
およびリン酸トリエステル中の保護基（通常アリル基、
たとえば。−クロロフェニル基など）を、オリザヌクレ
オチドを安定なまま脱離させることにより得ることがで
きる。

Ｃｏ　Ｒ４基およびリン酸トリエステルキっ０−クロロ
フェニル基はＴＭＧ−０麩盟溶液を用いて脱離させるの
が好ましい。その他の保護基（Ｒ２基および塩基部分の
アシル基）もアルカリ処理（＃アンモニア水）を行なう
ことにより脱離される。なお、ＴＭＧ−０斧（ツ啓液は
、０．５　Ｍ　ＴＭＧ　（テトラメチルグアノシン）−
Ｐｙ（ピリジン）−２−カルゼアルドキシメイトのジオ
キサン−水（９：１）溶液、である。

Ｒ２がＴｆａ−の場合は、アンモニア処理により充分脱
離されるが、ＮＰｓ−の場合はさらにメルカプトエタノ
ニル処理が必要である。他の保護基を用いろ場合は、オ
リ２ヌクレオチ゛ド分が安定な限りで、さらに別の処理
を加えることも考えられる。

反応条件の具体例については、後記実験例を参照された
い。

７、化合物（６） （１）定義 化合物（６）は、式（６）で表わされる新規物質である
。

〔セファロース〕−Ｎ）Ｉ−Ｒ１−Ｐ（ＮＰ）、ｎＮＯ
Ｈ（６）化合物（４）の置換基の定義および好ましい具
体例は、前記した通りである。

（２）合成 化合物（６）は、化合物（５）に〔セファロース〕を縮
合させることにより得られる。縮合剤は、結合させる〔
セファロース〕の種類によっては必要なことも不要なこ
ともある。

〔セファロース〕は、アミノ基と結合可能なものであれ
ばよい。具体的例は、活性化ＣＨ−セファロース、Ｂｒ
ＣＮ活性化−セファロース、エポキシ化セファロース、
　ＣＨ−セファロースおよヒＭ（−セファロースなどが
上げられる。このうち、ＣＨ−セファロースまたは届−
セファロースを用いる場合は縮合剤（たとえばＤＣＣ）
の存在が必要である。

また、結合させるべき化合物（５）を考慮すれば、−級
アミン基とのみ選択的に反応する活性化ＣＨ−セファロ
ースが最も好ましい。

縮合は、通常の方法で行なわれる。反応条件の具体例に
ついては、後記実験例を参照されたい。

（３）結合量および吸着能の検定 化合物（５）とセファロースとの結合量は、セファロー
ス１ｍｇ　あたりに結合した化合物（５）の量、または
吸着物質としてＨＯＡ１３またはｎｏＴｔ３ｔ：用いて
吸着した量、をＯＤ単位で示すことにする。

また、本発明により合成された化合物（６）と従来方法
で合成された担体〔オーリ−？（ｄＴ）−セルロースま
たはオリｆ（ｄＡ）−セルロース（共に市販品）〕と全
比較するため、同様の吸着実験も行なう。

化合物（６）の生成を確認する（すなわち、結合量を求
めろ）のと同様に、トリデカアデニル酸（ＨＯＡｔ３）
、トリデカチミジル酸（■ＩＯ′乃３）なと本発明によ
る５パ−末端リン酸基から延長したアミン基のな′いオ
リゴヌクレオチドのセファロースとの結合を調べること
は、結合位置を確定するうえで重要なことである。

この結果、化合物（６）は結合量０．０６０Ｄ／　ｍｇ
に近い値を示すものをも得ることができ、化合物（５）
は塩基配列を問わずすべてが結合可能であることがわか
る。また、アミン基をもたないオリゴヌクレオチドにお
ける担体との結合が全く行なわれていないことより、化
合物（５）はその塩基部分では全（結合せず、その−級
アミン基のみで結合していることもわかる。

一方、本発明者の実験によれば、市販の樹脂のうちオリ
ゴ（ｄＴ）−セルロースでは、０．０１０〜０．０３７
０Ｄ／ｍｇ　　程度の吸着能が検定されたこともあった
が、再度の検定に際し豊現性のある値は得られていない
。また、オリゴ（ｄＡ）−セルロースには、はとんど吸
着能は存在しない（オリゴ（ｄＴ）−セルロースに比べ
てオリｑ　（ａ人）−セルロースは良質のものがないこ
とが従来より知られているが、それがこの理由であると
解される）。

したがって、本発明の化合物（６）は、新たに開発した
スペーサの先端にある一級アミノ基でのみ担体と結合し
、それ以外での（塩基部分のアミノ基など）非特異的な
結合が全くな（、しかも合成可能ないかなる塩基配列を
もつオリゴヌクレオチドをも担体に結合させることがで
きる、非常に良質のアフイニテイ担体であることがいえ
る。

実施例 実施例１−１　　（Ｒ１＝Ｈｅｘ　（すなわち（＝Ｃ６
１１１２−）、Ｒ２＝Ｔｆａの場合） １）試料 ６−アミンヘキサノール　　（１，１７ｇ、　１０ｍｍ
ｏｌ　）トリフルオロアセチルチオエチル（Ｔｆａ−Ｓ
Ｅｔ）（１，８０ｍ１　、１４．４ｍｍｏｌ）ジオキサ
ン　　　　　　（１５ｍｌ） ２）合成 ６−アミンヘキサノール（量は上記）をジオキサン（１
５ｍｌ）に溶解し、トリフルオロアセチルエチ／Ｉ／　
（、Ｔｆｔ−’−ｓｐｔ　）　（量は上記）を徐々に加
えて、室温にて一夜反応させる。反応後、濃縮し、残有
をエーテルに溶解し、水で３回抽出する。エーテル層を
乾燥（無水ＮＩＬ２ＳＯ４）後、濃縮する。残渣にエー
テル全方えて溶解したのち、ペンタンを加先て結晶化さ
せると、粉末状の化合物（１−１）が得られる。

収量　１．４０ｇ（収率　７０％） 実施例１−２　　（Ｒ１＝Ｅｔ　（丁なわち＝Ｃ１（２
ＣＨ２−）、Ｒ２＝ＮＰＳの場合） ２−アミノエタノ−Ａ／（ＮＨ２−ＥｔＯＨ）　　およ
び〇−二トロフェニルスルフェニルクロ！Ｊ　）’　（
ＮＦＳ−ＣＩ）を用い、実施例１−１と同様の操作全行
なう。

実施例１−３　　（Ｒ１＝Ｈｅｘ、　Ｒ２＝ＮＦＳの場
合）６−アミノヘキサノール（ＮＨ２−Ｈ１！ｌ　ｘＯ
Ｈ）および〇−二ｉ四フェニルスルフェニルクロ９　）
’　（Ｎｐｓ−Ｃｔ）を用い、実施例１−１と同様の操
作を行なう。

表１ 実施例２−１　　（Ｒ’＝１１ｅｘ、　Ｒ２＝’、Ｌ’
ｆａ、　Ｎ’＝ＡＢ”、ｍ＝２およびＲ３＝　ＣＥの場
合） １）試料 １（０４ＺＡｉ”ＣＥ　（ＢｚはＮ６−ベンゾイル基）
Ｘ （８００ｍｇ、　０．７１ｍｍｏｌ　）ｏ−クロロフェ
ニルホスホロジトリアゾリド（１，０ｍｍｏｌ　） ジオキサン　　（６，Ｏｍｌ　） 化合物（１−１）　　（３００ｍｇ、　　１．４ｍｍｏ
ｌ　）１−メチル−イミダゾール （１１５ｍｇ、　　１．４ｍｍｏｌ　）２）合成 Ｐｙ共沸により無水にした）ＴＯＡｐ、７Ａζ’ＣＥ（
量は上記）に０−り四ロフェニルホスホロジトリアソリ
ド（量は上記−）のジオキサン（量は上記）溶液を加え
て２時間反応させる。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ　３−Ｍｅ　ｏ
Ｈ＝＝　１４　；１）でＭｅＯＨ分解物および水分解物
をチェックしたのち、化合物（１−１）（量は上記）お
よび１−メチル−イミダゾール（量は上記）を加えて、
２時間反応させる。ＴＬＣで反応の進行をチェックした
のち、水を加えて過剰のトリアシリｒを分解し、溶媒を
留去する。残渣’ｋｃＨｃ１３に溶かし、水、０．５　
Ｍ　−ＮａＨ２ＰＯ２、飽和Ｎａ１ＩＣＯ３および５　
％　ＮａＣ１水溶液で洗浄したのち、無水Ｎａ　２ＳＯ
４で乾燥させる。ＣＨＣｌ　３層を濃縮し、シリカゲル
ショートカラムで精製する（溶出液；　０〜４　％　Ｍ
ｅＯＨ／ＣＨＣｌ　３）。

目的物を集めて濃縮し、これをペンタンに滴下して、粉
末状の化合物（２−１）ｔ−得る。

収　量　６１０ｍｇ　　（収率５７％）実施例２−２〜
実施例２−６ 実施例２−１と同様の操作を行ない、結果を下表２に示
す。

よびＲ４＝バーＧｒの場合） １）試料 ＤＭＴｒ”ＯＡ”０ＣＯ−ＪＡＡ−ｅ　（３００ｍｇ、
　０．０３３ｍｍｏｌ　）Ｄ請ｒ−ＯＡ萼ｔ　０Ｅｔ３
ＮＨ （１５０ｍｇ、　０．１ｍｍｏｌ） ＭＳＮＴ　　　　　（１５０ｍｇ　０．５ｎｏｎｏｌ　
）＊　ＤＭＴｒはジメトキシトリｆ）’Ｉｙ、−Ａ″′
Ａ−［相］ハ（ＣＨ２）２ＣＯＮＩ（ＣＨ２合［相］（
［相］はポリスチレン）、である。

２）合成 りＭＴｒ−ＯＡ”０ＣＯ−ＡＡＡ−ｅ　（量は上記）を
取り、（１）　１ｓｏＰｒＯＨ−ＣＨ２Ｃ１２（１５：
　８５　ｖ／ｖ　、　１０　ｍｌ　Ｘ　３　）で洗浄、
（２）　０．Ｉ　Ｍ　ＺｒＢｒ２の１ｓｏＰｒＯＨ−Ｃ
Ｈ２Ｃ１２（１５：８５ｖ／ｖ、　８　ｍｌ　Ｘ　４、
計加分）溶液で脱トリチル化、（３）　１ｉｏＰｒＯＨ
−ＣＨ２Ｃ１２１５：　８５　ｖ／ｖ　、　１０　ｍｌ
　Ｘ　３　）で洗浄、（４）ピリ・ジン（Ｐｙ、）（ｌ
ｏｍｌ　ｘ　３　）で洗浄後、（５）　Ｐｙ−Ｅｔ３Ｎ
−Ｈ２Ｏ（３：　１　：　１　ｖ／ｖ　、　１０’ｍｌ
　、　３０分）処理し、無水にしてＤＭｒｒ−ω者Ａ鰭
０Ｅｔ３ＮＨ（量は上記）のｐｙ溶液を加えて、ｐｙ共
沸して完全に無水とする。（６）これにＭＳＮＴ　（量
は上記）と無水取（２ｍｌ）とを加えて、９０分間振盪
しながら反応させる。（７）Ｐｙ　（１０ｍ１　Ｘ　３
　）で洗浄後、（８）触媒量のジメチルアミノピリジン
（ＤＭＡＰ）’を含むＡｃ２Ｏ−Ｐｙ　（１：　９　ｖ
／ｖ、１０ｍ１　’）　を加えて１０分反応させて、未
反応５′−水酸基を保護する。（９）　Ｐｙ（ｘｏｍｔ
ｘ３）　で洗浄して、１回の縮合全路える。

この操作を同様に６回繰り返して、目的の化合物（３−
１）（）リデカアデニン酸）を得る。

各回のトリチル基の定量による収率は、８９％、８；３
％、８０チ、７９％、８１チおよび９０係である。

通算収率　３４％ 実施例３’−１（脱保獲） ＤＩｖｆｆＴｒ−０（ＡＢ、”）１２ＡＢｚＯＣＯ−／
ＩＡＡ−■（１５ｍｇ　）ｆｉｇ遠沈に取り、０５　Ｍ
　ＴＭＧ−ＯｘＩｍｅのＰｙ−Ｈ２Ｏ（９：　１　ｖ／
ｖ）溶液（１００μｍ）ｔ−加えて室温でＵ時間放置す
る。

これに濃アンモニア（２，５ｍ１）を加えて密閉し、圓
℃で一夜放置する。樹脂を戸別し、Ｆ液を濃縮後、水に
溶解し、エーテルで３回抽出する。水層全濃縮後、セフ
ァデックスＧ　−５０（１，５Ｘ　１２０の）で脱塩す
る（溶出液：　０，０５　Ｍ　−ＴＥＡＢ　（重炭酸ト
リエチルアンモニウム）緩衝液ｐ）（７，５）。

溶出パターンは第２図に示す。

得られた−２−りの部分を集め、濃縮したのち、８０４
“酢酸（２ｍｌ、１０分）で処理すると、トリデカカア
デニル酸（ＨＱＡ１３　）が得られる。これはＨＰ　Ｌ
Ｃ（／１−Ｂｏｎｄａｐａｋ　Ｃ−１８）　　により純
度全チェックし、得られる溶出パターンを第３図に示す
。

実施例３′−２〜３−６ 実施例３−１と同様の操作を行なって各種の化合物（３
）ヲ本発明者らが合成したことは既に報告済みである。

平均すると一回の縮合につき８５チ程度の収率を上げて
いる。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１９７９．
３６３５（１９７９）Ｎｕｃｊｅｌｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅ１ｅａｃｈ　８．５４７３　（１９８０）Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　８．５４．９１
　（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ　８．５５０７（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　
５ｅｒｉｅｓ＋７．２８１（１９８０） Ｊ、Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　１０３　７０６（
１９８１）Ｎｕｃｌａｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ　１０．１９７（１９８１）実施例４−１　　（Ｒ
’＝＝Ｈｅｘ　、　Ｒ２＝Ｔｆ　ａ　、　Ｎ’＝Ａ”、
ｍ＝２、ｎ＝１２．　Ｒ４＝五〇） １）試料 化合物（３−１）　（ＤＭＩ’ｒ−０（Ａｐ、”）１２
Ａ、　０ＣＯ−Ａ−Ａ−■）（１１５ｍｇ、　３．４５
／ｊｍｏｌ　）化合物（２−１）　（Ｔｆａ−ＮＨ−Ｈ
ｅｘＰＸ（４，”）２ＣＥ）（６０ｍｇ１０．０４ｍｍ
ｏｌ　） ＭＳＮＴ　　　　　（６０ｍｇ　Ｏ，２ｍｒｎｏｌ　）
２）合成 化合物（３−１）　（ＤＭｒｒ−０（４，”）ＡＢｃ＋
ｃｏ　　　ｅ　）（量は上記）を取り、１ｓｏＰｒＯＨ
−ＣＨ２Ｃ１２（＋５　：　８５φ、１０ｍ１Ｘ３）　
　でよ（膨潤させたのち、１　Ｍ　−ＺｎＢｒ２のｉｇ
ｏＰｒＯＨ−ＣＨ２Ｃ１２（１５：　８５　ｖ／ｖ。

５ｍ１Ｘ６．３０分）溶液で脱トリチル化する。樹脂’
ｋ　１ｓｏＰｒＯＨ−ＣＨ２Ｃ１２（１５：　８５　ｖ
／ｖ　、　５　ｍｌ　Ｘ　３　）　　　　’で、続いて
Ｐ’！　（５ｍｌ　Ｘ　３　）で、洗浄する。一方、化
合物（２−１）　（Ｔｆ　ａ−ＮＨ−ＨｅｘＰｘ（４，
”）２ＣＥ）　（量は上記）を取り、Ｐｙ−Ｅｔ３Ｎ−
Ｈ２Ｏ（３：　１　：　１．３ｍｌ、１５分）で処理し
て、脱シアンエチル化する。溶媒を留去後、〜で２回共
沸する。これｅＰｙに溶解させ、先はどの樹脂に加えて
〜共沸して、完全に無水とする。これにＭＳＮＴ　（量
は上記）および無水Ｐｙ’　（１５ｍ１　）　’ｆｒ、
加えて、振盪しながら９０分反応させる。反応波樹脂ｅ
Ｐｙ及びＭｅＯＨで洗浄し乾燥することにより、化合物
（４−１）　’！ｒ得る。

収量１２０ｍｇ 実施例４−２ 実施例４−１と同様に、化合物（３−２）（ＤＭｒｒＯ
（ＴＰＸ）１２’１ｂＣＯＪ〜■〕と化合物（２−３）
ＣＴｆｔｓ−ＮＨ−Ｈｅｘ−Ｐｘ（ＴＰｘ）２ＣＥ：］
とを用いて、化合物（４−２）　（Ｔｆａ−ＮＨ−Ｈｅ
ｘ−ＰＸ（’１’ＰＸ）１４ＴＯＣＯ−”＼Ｓ）　）ｆ
合成する。

実施例４−３ 実施例４−１と同様に、化合物（３−３）（ＤＭＴｒｏ
　（Ａ園）　ｇＡ”０ＣＯ−ＮＳＡ−■〕と化合物（２
−１）（Ｔｆ　ａ−ＮＨ−Ｈｅｘ−Ｐｃ（Ａ”Ｐｘ）２
ＣＥ）　　とを用いて、化合物（４−３）　［：Ｔｆ　
ａ　−ＮＨ−Ｈｅ　ｘ−Ｐ、　（Ａ”１−人４ＬＡ”ｏ
ｃｏ−ＡＭ−（Ｑ　：）を合成する。

実施例４−１と同様に、化合物（３−４）匣′。背臂堂
〜′ゆ臂ｃＢ”ｌｐ、、、ｌｌ＋、、、吹鳴ｘ　　Ｘ　
　ｘ ＣＢｚＯＣＯＪ随Ｏ〕ト化合物（２−３）（Ｔ”　ｆ　
ａ　−Ｎｉ＋−Ｉ（ｅ　ｘ　Ｐｘ　（９，）２ＣＤ’：
ｌとを用いて、化合物（４−４）（Ｔｆａ−ＮＨ−Ｈｅ
ｘ−Ｐ、（ＴＰ、）２吋臂臂夾４．”Ｃ４：ｕ　ＣＢｚ
ＩＪ７ｐ、１．Ｎｉ；　Ｃ，＆、ＣＥｚ　ＣＢｚ　−ｏ
ｃｏ　五■〕全合成する。

実施例４−５ 実施例４−１と同様に、化合物（３−２）（ＤＭＴｒＯ
（’１’ＰＸ）１２ＴＯＣＯ−”Ａ−ｅ　）と化合物（
２−５）（Ｔｆ　ａ−ＮＨ−ＮＰＳ−Ｐｘ（昨、）２Ｃ
Ｅ）とを用いて、化合物（４−５）（Ｔｆａ−Ｎｌ（−
ＮＰＳ−ＰＸ（’ｌ’Ｐ、）ｌ、ＴＯＣＯ−ＮＡ−■〕
　を合成する。

実施例４−６ 実施例４−１と同様に、化合物（３−５）浄苦胸ＣＯ−
〇〕 と化合物（２−６）　Ｃ’Ｊ’ｆａ−ＮＨ−Ｐｅｎ−Ｐ
会ｆｃｒｄ：”）２ＣＥ３とを用いて、化合物（４−６
）　（Ｔｆａ−Ｎｕ−Ｐｅｎ−ＰｘｒＰＰＡｐ　Ａ　ｏ
ｃｏ−ＡＭ−（８〕ｙ合ｙ、ｊ　６゜ｘ 実施例４−７ 実施例４−１と同様に、化合物（３−６）Ｃ’ｐｌ″ｚ
Ａ＆Ｚ（３ｐ”ｌｒ　ＯＣＯ−Ｍ＋−６）　）　ト、化
合物（２−６）Ｘ　　ｘ　　Ｘ （Ｔｆａ−ＮＨ−Ｐｅｎ−Ｐｘ（Ｇｐｊ；）２Ｃ１とを
用いて、化合物（４−６）　（Ｔｆａ−ＮＨ−Ｐｅｎ−
ｐｘ（Ｇｐ”　）２斌喝、Ｔｏｃｏ−ｗ”＠］を合成す
る。

実施例５−１ 化合物（４−ｔ）（Ｔｆａ−ＮＨ−Ｈｅｘ−Ｐｘ（Ａｐ
、”）１，４”（）Ｃｏ　　　ｅ’１（１５ｍｇ）ｅ遠
沈管に取り、０．５　Ｍ　ＴＭａ−ｏｙｐＨρＰｙ−Ｏ
Ｈ（９：　１　ｖ／ｖ　）溶液（１００ｍｌ　）　を加
えて、室温でＵ時間放置する。これに濃アンモニア水（
２，５ｍ１）ｅ加えて密閉し、５０”Ｃで一夜放置する
。樹脂をヂ別し、Ｐ液を濃縮後、水に溶解し、エーテル
で３回抽出する。水層を濃縮後、セファデックスＧ−５
０（１，５Ｘ１２０（：ｒｒＬ）で脱塩精製する（溶出
液：　５０　ｍＭ　ＴＥＡＢ緩衝液、ｐｎ　７．５　）
　、その溶出ＪＲパターン第４図に示す。

ピークを集めて濃縮後、得られた化合物（５−１）につ
いてＨＰＬＣ（１１−Ｂｏｎｄａｐａｋ　Ｃ１８）にて
純度を検定する。その溶出パターンを第７図に示す。

実施例５−２ 実施例５−１と同様に、化合物（４−２）　’ｅ脱保護
して、化合物（５−２）　（ＮＨ２−Ｈｅ　ｘ−Ｐ　（
ＡＰ）１４ＡＯＨ）　ｋ合成する。その溶出パターンを
第５図および第７図に示す。

実施例５−３ 実施例５−１と同様に、化合物（４−３）　　’を脱保
護して、化合物（５−３）　（ＮＨ２−Ｈｅ　ｘ−ｐ（
Ｔｐ）１４′ｒｏｕ）　ｋ合成するＯ 実施例５−４ 実施例５−１と同様に、化合物（４−４）　　ｅ脱保護
して、化合物（５−４）　ＣＮＩ２−Ｈｅ　ｘ−Ｐ　（
Ｔｐ）２Ｇｐ　（３ｐ　ＧｐＡｐＡｐ　Ｇｐ　ＣｐＴｐ
　ＴｐＣｐ　ＣｐωＨ〕　を合成する。その溶出ノぐタ
ーンを第６図および第９図に示す。

実施例５−５ 実施例５−１と同様に、化合物（４−６）を脱保護して
、化合物（５−５）　［Ｎ）Ｉ２−Ｐｅｎ−ｐ（Ｇｐ）
２ＧｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＴｐＣｐＡｐＣｐＧｐ
ＴｐＡｐＡＯＣＯ篇［株］〕ケ合成する。

ス１上Ｊ二」 実施例５−１と同様に、化合物（４−７）ｋ脱保護して
、化合物（５−６）　ＣＮＩ（２−Ｐｅｎ−，１’（Ｇ
ｐ）２Ｇｐ””ｐ０ｐＧｐＡｐ９ｐＴｐＡＰＡｐ０ｐＧ
ｐ０ｐＡｐＧｐＴ０００−ｅ　）を合成する。

の合成〕 実施例６−１ １）試料 ＢｒＣＮ活性化−セファロース４Ｂ　　　　　（４０ｍ
＊）化合物（ｓ−１）〔Ｎ［（２−ｕｅｘ−ｐ（ＡＰ）
１４Δ０■（〕（４，００Ｄ　） ２）反応 ＢｒＣＮ活性化セファロース４Ｂ（：ｔａ：は上記）を
取り、１　ｍＭ−ＨＣｌで洗浄し、さらに０．５　Ｍ−
ＮａＣ１゜０、Ｉ　Ｍ−ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８，３）溶
液で洗浄後、化合物（５−１）　（量は上記）の’＜）
　、　５　Ｍ　−ＮａＣ１，０，１Ｍ−ＮａＨＣＯ３（
ｐＨ８，３）溶液（２００μｍ　）　ｅ加えておだやか
に振盪しながら、室温で一夜反応させる。反応後濾過し
、樹脂’ｅ　１０　ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７
，５）および０．５ＮａＣ１，１０ｍＭ−Ｔｒｉｍ−Ｈ
ＣＩ　（ｐＨ７，５）で洗浄する。

３）吸着能の検定 この樹脂約半量（２０ｍｇ）ｔ−取り、合成トリデカチ
ミジル酸を用いて、アフイニテイクロマトグラフイーを
行なって、吸着量を検定する。

吸着量：　１　、１４０Ｄ／　２０　ｍｇ樹脂（０，０
５７０Ｄ／ｍｇ　＞（第１０図）。

４）結合部位の検定 化合物＜　６−’１　＞の代わりに、トリデカアデニル
（Ｉ■０Ａｉ３）（粗精製物）を用いて同様の操作を行
なう。はとんど結合されてなく、吸着能を検定しても全
く検出されない。

アフイニテイクロマトカラムの結果を第１１図に示すが
、吸着能ははｒ　００Ｄ／　１５ｍｇ　（ＯＯｆ）７ｍ
ｇ　）である。

５）結論 以上のことより、アデニン部分のアミノ基上では全（反
応がおこらないことがわかる。したがって、化合物（６
−１）における担体との結合は、すべて５′末端リン酸
基より延長されたアミノ基でのみ起こっているといえる
。

実施例６−２ １）試料 活性化ＣＨ−セファロース４Ｂ　　　　　　（３０ｍｇ
）化合物（５−１）　（ＮＩ（２−Ｈｅ　ｘ−Ｐ　（Ａ
ｐ　）１４ＡＯＨ）（４，００Ｄ　） ２）反応および吸着能の検定 活性化ＣＨ−セファロース４Ｂ（量は上記）を取り、１
　ｍＭ　ＨＣＩでよ（洗浄する。樹脂’ｆｒ：　０，５
　Ｍ　−ＮａＣ１。

０．１　Ｍ　−ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８，３）ですばや（
洗浄したのち、化合物（５−１）　（量は上記）の０．
５　Ｍ−Ｍａｉｌ　。

０．１　Ｍ−ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８，３）溶液（１６０
μｍ）’に加えて、おだやかに振盪しながら室温で３時
間反応させる。反応波濾過し、樹脂ｆ　１０ｍＭ−Ｔｒ
ｌＢ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）および０．５　Ｍ−ＮａＣ
１、１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）で洗
浄する。

樹脂について、トリデカチミ・ジル酸を用いて実施例６
−１と同様に吸着量を算出する（第１２図）。

吸着量：　０，６２０Ｄ／１５ｍｇ　（０，０４２０Ｄ
／ｍｇ　）３）結合部位の検定 実施例６−１と同様に反応を行なつズ、吸着能の検定を
行なう（第１３図） 吸着能：はｒ　ＯＯＤ／　１５　ｒｎｇ　（００Ｄ／　
ｍｇ　）４）結論 実施例６−１と同様、０．０４２０Ｄ　／　ｍｇの結合
はすべて５′−末端リン酸基より延長されたアミン基で
のみ起こっていることがいえろ。

市販のオリゴ（ｄＡ）−セルロースは７７’二ンノ塩基
部分で結合しているといわれているが、との縮合条件で
は可能性として考えられたアデニン塩基部分での結合が
全（起っていないと考えられる。

実施例６−３ １）試料 ＢｒＣＮ活性化−セファロース４Ｂ　　　（３０ｍｇ）
化合物（５−２）　　　　　　　　　（３，４３０Ｄ）
ＨＯＴ１３　　　　　　　　　　　　　　　（２，４７
０Ｄｒ２）反応および結合量の検定 実施例６−１の結果から、アミン基をもたないオリゴチ
ミジン酸（ＨＯＴ１３）はＨＯ人３よりもさらに反応性
がなく、ＢｒＣＮ活性化−セファロースと反応しないも
のと考えられたので、ＨＰＬＣでの分析を容易にするた
め、内部標準物質としてＨＯＴ１３　ｋ加えて反応を行
なう。

反応は、実施例６−１と同様の操作により行なう。

反応前の溶液のＨＰＬＣノ’！ターンより、化合物（５
−２）ユ３．２０Ｄ、　ＨＯＴ１３二２．ＩＯＤ、未知
物質上〇、６０Ｄ　（計５，９０Ｄ　）であったが、反
応後は化合物（５−２）ユ２．１０Ｄ、　ＨＯＴ１３ユ
２．ＯＯＤ、未知物質上〇、５０Ｄ　（計４，９０Ｄ）
となり（第１４図）、セファロースはほとんど化合物（
５−，２）と反応していることがわかる。

結合量１．１０Ｄ／３０ｒｎＦＣ（０，０３７０Ｄ／ｍ
ｇ　）３）吸着能の検定 ｄＡｌｌ　（粗精製物、５６％の不純物を含む）を用い
、アフイニテイカラムにより吸着能を検定する。

（１）粗ｄＡ１１　（０，５５０Ｄ％　ｄＡｌｌ　＝　
０．２４０Ｄに相当）をアプライした結果、目的のみし
かもほぼ完全に精４！Ｒｊることかできる（第１５図（
Ａ））非吸着部分：　０，３４０Ｄ 吸着部分７　０，２３０Ｄ （２）粗ｄＡ１１　（０，９５０Ｄ　、　ｄＡ１１＝　
０．４１０Ｄに相当・、）を吸着・溶出した結果、非吸
着部分０．７３０Ｄ、吸着部分００２７０Ｄであった。

この結果、用いたカラムの吸着能力が０，２７０Ｄであ
ることがわかり、ＨＰＬＣかも算出された結合量の約半
分であることがわかる。これは、反応液を洗浄する際の
損失と考えられるが、架橋後の残りのＨＯＴ１３が５，
２００程度であった゛と考えれば説明される。

吸着部分のＨＰＬＣ、Ｒターンを第１６図に示す。この
ｄＡｌｌは非常に純粋であることがわかる。

（３）上記非吸着部分（０，７３０Ｄ、　ｄＡ１１＝ｏ
、１５０Ｄ）のうち０．３１０Ｄ　（ｄＡ１１＝　０．
０６０Ｄ相当）の部分を再度このカラムにより溶出させ
る。非吸着部分０．２８００’、吸着部分０，０５０Ｄ
である。

非吸着部分のＨＰＬＣノ＃ターンより、非吸着部が全＜
　ｄＡｌｌｔ−含んでいないことがわかる（第１７図）
。

以上のクロマトグラフィーの結果をまとめて示せば、第
１５図の通りである。

実施例６−４〜実施例６−８ 実施例６−３と同様の操作を行ない、結果を後記衣６に
示す。また、実施例６−４において、実施例６−３の第
１４図に相当するものを第１８図に示す。

比較例１ １）樹　脂 市販のオリゴ（ｄＡ）−セルロース （Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅａｌｓ　Ｌｏｔ　Ｎｏ、
１１５５７７　）２）吸着能の検定 上記の樹脂５２０　ｍ　ｇ取り、０．５　Ｍ−ＮａＣ１
、１０ｍＭ−Ｔ’ｒｌｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）　　
溶液で膨潤させたのち、カラムに充填し、１０ｍＭ−Ｔ
ｒｉａ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）および０．５　Ｍ−Ｎ
ａＣ１，１０ｍＭ−Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）
溶液で洗浄する。これについて、合成トリデカチミジル
酸（ＨＯＴ１３　）　’ｅ用いて吸着能を検定する。

溶離液：　１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，
５）１両分＝１５滴（３５０μ１） （１）　　ＨＯ’ｌ’１３１，３３０Ｄの０．５　Ｍ−
ＮａＣ１、１０ｍＭ−Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ溶液２４ｍ１’
ｉｉアゾライしたが、はとんど吸着されない。

（２）上記（１）の溶出液を回収し、再び吸着を試みる
。

全く吸着されない。

（３）改めてカラムを作成し、同様に検定を行なう。以
上の３点については、その結果を第１９図に示す。

３）結論 市販されている吸着用樹脂でありながら、はとんど吸着
能がないことがわかる。

従来より、オリ：ｒ（ｄＴ）−セルロースに比べてオＩ
Ｊ　−ｒ　（ａＡ　）−七ルｐ−スは良質のものがな〜
・と知られているが、この結果はそれを裏書きするもの
と解される。

比較例２ １）樹脂 市販のオリゴ（ａ’ｒ）−セルロース （Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｌｏｔ　Ｎｏ、
　６７５１３０　）２）吸着能の検定 比較例１と同様、ＨＯＡ１３　を用いて検定し、第加図
より算出される結果を下表５に示す。

３）結　輪 生検体の量または濃度の違いにより、あるいは吸着、お
よび溶出を繰り返すごとに吸着能が変化することによっ
て、再現性のある結果が得られない。

以上の結果をまとめて表６に示す。

ａ＝ＢｒｃＮ活性化−セファロース４Ｂｂ＝活性化ＣＨ
−セファロース４Ｂ （ａおよびｂはＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌＩＩ製）Ｃ＝ニオリボｄＡ）−セルロース（
Ｌｏｔ　Ｎｏ、１１５５７７　）ｄ＝オリ（（ｄＴ）−
セルロース（Ｌｏｔ　Ｎｏ、６７５１３０　）＊　＝　
”ＨＯＣ：ＰＧＰＧＰＡＰＡＰＧＰＣＰＴＰＴＰＣＰＣ
ＰＣＯＩ（”　’＊＊−自己相補性のためカラムに吸着
されず、測定不能。

＊＊＊　＝５’ＨＯＧｐＡｐＡｐＧｐＣｐｉ’ｐＴｐ’
１ｐＣＰＡｐＣｐ（ＴＰＴＩ、ＡＰＡＯＨ３’　−＊＊
＊＊　＝”’ＨＯＧｐＴｐＣｐＧｐ−ＡｐＣｐＴｐＡｐ
ＡｐＣｐ（７ｐＣｐＡｐＧｐＴＯ１（３’

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明が関係する一連の反応を示すスキーム
である。 第２．４．５および６図は、セファデックスヵラムクロ
マトダラム金示すものである。 第３．７．８．９．１４．１６．１７および１８図は、
イスレモＨＰＬＣノリーンを示すものである。 第１０．１１．１２．１３．１５．１１７１９および加
図は、いずれもアフィニティ担体にょるカラムクロマト
グラムを示すものである。 ａ）　セファディクスＧ−５０カラムによる精製条件カ
ラム：セファデックスＧ−５０ カラムゼリューム：　　１．５　Ｃｍ　Ｘ　１２０　ｃ
ｒｎ溶出液：　５０　ｍＭ　ＴＥＡＢＭ衝液、ｊｉＨ７
，５分画量：３５滴／分画 ｂ）　　ＨＰＬＣによる分析条件 カラム：　μｍ　Ｂｏｎｄａｐａｋ　Ｃ１８（Ｗａｔｅ
ｒｓ　）溶出液：　ＣＨ３ＣＮ　ｉｎ　Ｏ，０２Ｍ　Ｅ
ＤＡＡ緩衝液（ｐＨ７，８）勾　起上図中に示す 流速：２ｍ１１分 チャートスｆ−ド：１０龍／分 温度：５０℃ Ｃ）　アフイニテイクロマトカラムによる検定条件洗浄
液：　０．５　Ｍ　ＮａＣ１、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ　（ｐＨ７，５）溶出液：　１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）分画量：１５滴（３５０μｌ
） 生検体のアプライｔＡで、溶出開始？Ｂで示す。 出願人代理人　　　猪　股　　　　清 第１図 第４図 会画数 第５図 分　画　数 莞６図 分画数 ￥７図 原符時間（８） 第８図 イ珂（持　　　Ｂデｔ　　　間　　　（４）第９図 イ米　　　　才寺　　　時　　　間　　　　１分）第１
０区　　　　　　第１１図 分画数　　　分画数 第１２図　　　　　第１３図 分画数　　　分画数 第１６閃 保持時間（分） 第１７図 保　　　持　　　８寺　　　間　　　（イとト）第１９
図 （Ａ）　　　　　　　　　　　　　　（Ｂ）（ＯＤ）　
　　　　　　　　　　　　　　（ＯＤ）分画数　　　　
分画数 （Ｃ） 分画数 第２０図 （Ａ）　　　　　　　　ＣＢ）　　　　　　　（Ｃ）（
Ｄ）　、　　　　　　　　　（Ｅ） 手続補正書 １．事件の表示 昭和５７年！１１許願第１３８１３６号２、発明の名称 固定化オリゴヌクレオチドおよび その製造法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 湧水製薬株式会社 するＯ 明　　　　　細　　　　書 １、発明の名称　　固定化オリゴヌクレオチドおよびそ
の製造法 ２、特許請求の範囲 １、下式〔■〕で示されるものであることを特徴とする
、固定化オリゴヌクレオチド。 〔ただし、ｍお↓びｎはそれぞれ０または任意の自然数
であり、Ｒは二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素残基で
あり、Ｂはヌクレオチドを構成する塩基である（Ｂが複
数個存在するときは、それらは同一でも異なってもよい
）。〕２、塩基Ｂがアデニン、チミン、シ小シンおよび
グアニンからなる群より選ばれたものである、特許請求
の範囲第１項記載の固定化オリサヌクレオチド。 ３、Ｒ１が炭素数２〜旬の直鎖または分岐鎖のアルキレ
ン基である、特許請求の範囲第１項または第２項記載の
固定化オリゴヌクレオチド。 ４、　ｍが０または６までの自然数、ｎがＯまたは４０
までの自然数である、特許請求の範囲第１〜＼ ３項のいずれか１項に記載の固定化オリゴヌクレオチド
。 ５、担体がセファロースである、特許請求の範囲第１〜
４項のいずれか１項に記載の固定化オリゴヌクレオチド
。 ６、セファロースが活性化上ファロースである、特許請
求の範囲第５項に記載の固定化オリゴヌクレオチド。 ７、下式ＣＭ）で示されるオリゴヌクレオチド誘導体の
末端アミノ基とそのアミノ基と結合可能な担体とを反応
させて式〔■〕で示される固定化オリゴヌクレオチドを
得ること、を特徴とする化合物〔■〕の製造法。 〔ただし、ｍおよびｎはそれぞれＯまたは任意の自然数
であり、Ｒ１は二価の直鎖または分岐鎖′の炭化水素残
基であり、Ｂはヌクレオチドを構成する塩基である（Ｂ
が複数個存在するときは、それらは同一でも異なっても
よい）。〕３、発明の詳細な説明 発明の背景 技術分野 本発明は、一般に、固定化オリゴヌクレオチドに関する
。さらに具体的には、本発明は、ヌクレオチドの塩基以
外の部分に担体を結合させてなる固定化オリゴヌクレオ
チドに関する。 本発明は、また、このような固定化オリゴヌクレオチド
の製造法にも関する。 先行技術 生化学の領域で、生体高分子を純化することは重要な研
究課題の一つであって、従来より多くの研究者達により
種々検討が重ねられてきた。従って、この分野では、現
在、アフイニテイクロマトグラフイー技術ならびにポリ
アクリルアミドゲルを主体とすな電気泳動法が開発され
て賞用されるに至っている。 このうちアフイニテイクロマトグラフイーは、生体高分
子のもつ生物学的識別の原理、すなわち、特定の物質と
特異的に結合ないし相互作用する固有の性質をもつこと
、を巧妙に利用した方法であって、タンパク質、酵素は
もとより、核酸、脂質、ホルモン、ビタミン、レセプタ
ーなどあらゆる生体物質の精製、分離に広く活用されて
いる。とりわけ、核酸をリガンドとするアフイニテイク
ロマトグラフイーは、分子生物学的にも重要な核酸やタ
ンパク質の単離なはじめとして、今後も広く応用される
ことが予想される。また、効率的な単離のためにもリガ
ンドと担体との架橋方法の開発が望まれるところである
。 このような観点から、核酸を結合させた担体を用いるア
フイニテイクロマトグラフイーの中では、オリゴ（ｄＴ
）−セルロースまたはポリ（Ｕ）−アガロースカラムを
使って３′−末端にポリ（Ａ）を含むＲＮＡを単離する
という方法が、最も広（利用されている（　Ｊ、　Ｂｌ
ｏｃｈｅｍ、、　８１　、９４１（１９７７）　）。 しかしながら、ポリ（Ｕ）　−、ポリ（ｄＡ）−セルロ
ースなどは、ヌクレオチドの塩基部分を臭化シアンなど
で活性化した担体と結合させる方法であるため、ヌクレ
オチドは多点で結合して安定であるという反面、親和活
性に必要な塩基部分が担体との結合に使われているので
吸着能が弱められるという難点がある（　Ｅｕｒ、　Ｊ
、、Ｂｉｏｃｈｅｍｏ、虱、２４６（１９７２））。 また、オリ♂（ｄＴ）−セルロースなどは、ジシクロヘ
キシルカルゼイミド（以下ＤＣＣと記す）などを用いて
、担体の水酸基とオリゴヌクレオチドのリン酸基とを結
合させているといわれているが、非特異的な吸着を起こ
したり、吸着能に再現性を欠くという問題点がある。 以上のようなヌクレオチドのホモポリマーを固定化した
例以外に、天然から得られたＤＮＡを固定化した例が二
、三あるが（Ｊ、Ｒｌｏｔ、Ｃｈｅｍ、、２５２．５７
８９（１９７７）　）　、一定の長さで任意の塩基配列
をもつオリゴヌクレオチドを、特定の位置でのみ担体と
結合させてその固定化に成功したという例はかつて一件
も報告されていない。 これらの状況から、任意の塩基配列をもつオリゴヌクレ
オチドを特定の部位で担体と結合させることができれば
、その技術は固定化ヌクレオチドホモポリマーを利用し
たアフイニテイクロマトグラフイーによるｍＲＮＡの単
離精製ばかりでなく、特定な塩基配列をもつｍＲＮＡの
単離精製、さらには特異的塩基配列を認識する各種核酸
関連酵素類の精製、などにも利用できる可能性が考えら
れる。 なお、リガンドとしてモノまたはジ程度のヌクレオチド
を用いたアフイニテイ担体の研究も数多く行なわれ、そ
のうちい（つかのものは既に市販されている。しかし、
ヌクレオチドが直接またはスペーサを介して担体と結合
している部位は、はとんどその塩基部分である″）。一
方、ヌクレオチドをその塩基部分以外で結合させるもの
もあるがｂ）、原料リガンドの合成に手間がかかるうえ
、全合成にわたりめんどうであるという難点をかかえて
いる。また、いずれの方法もオリゴヌクレオチドに用い
ることはできない。 ａ）　Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｅｈｅｍ、　１３１ｏｐｈｙｇ
、、塵、５６１（１９７４）、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
、發、フ８３（１９７８）、　特開昭５２−２５７９５
号、同５３−１０１３９６号、同５３’　−１３３２８
３号および同５５−３６２７７号各公報。 ｂ）　Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ、、９７．３３（１９
７４）　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。 Ｂｌｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、　３０４．２３１（１９７
３）、Ａｎａｌ。 Ｂｉｏｃｈｅｍｌ、旦、４７１（１９７６）。 発明の概要 要旨 本発明は上記の点に解決を与えることを目的とし、特定
のオリビデオキシリゼヌクレオチドのヌクレオチドの塩
基以外の特定部位に担体な結合させてなる固定化オリゴ
ヌクレオチドによってこの目的を達成しようとするもの
である。 従って、本発明による固定化オリゴヌクレオチドは、下
式〔■〕で示されるものであること、を特徴とするもの
である。 また、本発明による固定化オリザヌクレオチドの製造法
は、下式（Ｖｌ〕で示されるオリゴヌクレオチド誘導体
の末端アミン基とそのアミン基と結合可能な担体とを反
応させて式〔■〕で示される固定化オリゴヌクレオチド
を得ること、を特徴とするものである。 ＢＯＢ 〔ただし、ｍおよびｎはそれぞれ０または任意の自然数
であり、Ｒ１は二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素残基
であり、Ｂはヌクレオチドを構成する塩基である（Ｒ７
り″−複数個存在するときは、それらは同一でも異なっ
てもよい）。〕 効果 本発明者らの合成した固定化オリゴデオキシリゼヌクレ
オチドは、前記の核酸をリガンドとするアフイニテイク
ロマトグラフイーの短所を回避することができる。すな
わち、吸着活性を阻害する塩基部分での結合を避けたこ
とにより、この固定化オリゴデオキシリゼヌクレオチド
はすぐれた吸着能を有する。従って、従来のもの（オ＋
）　−！　（ｄＴ）−セルロース、ポリ（Ｕ）−アガロ
ース等）よりも吸着能、再現性、選択性および耐久性に
すぐれた高品質のアフイニテイ用樹脂を得ることができ
る。 また、本発明者らの製造方法に従えば、従来困難であっ
た、特定の長さ、特定の配列をもつ固定化オリゴヌクレ
オチドを合成することができる。 本発明による固定化オリザヌクレオチドは、前記の式〔
■〕で示されるものである。 式中、記号上は、２′−デオキシリゼヌクレオシドの３
′−および５′−水酸基を除いたデオキシリゼヌクレオ
シド残基な示すのに慣用されているものであって、具体
的には下記のものである。 置換基Ｂはヌクレオチドを構成する塩基を示し、通常は
アデニン、チミン、シトシンまたはグアニンである。化
合物ＣＭ）中にＢが複数個存在するときは、それらは同
一でも異なってもよいＯｍおよびｎは、それぞれＯまた
は自然数を示す。 本発明の固定化オリサヌクレオチＰの重合度がｍ＋ｎで
表示されているのは、本発明の好ましい製造方法で重合
度が各々ｍおよびｎのフンクションを縮合させているこ
とによるものである（詳細後記）。その場合のｍは実用
的にはＯｍ６、特に１〜４、ｎは実用的には０〜４０、
特に０〜２０、である。 基Ｒ１は、化合物〔■〕の核酸部分と担体部分とを連結
する二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素残基である。こ
れは、特に炭素数２〜２０程度の直鎖または分岐鎖のア
ルキレン基が適当である。好ましく・Ｒ１は、炭素数２
〜６のアルキレン基である。 化合物〔■〕の合成 一般的説明 化合物〔■〕、すなわち本発明による固定化オリゴヌク
レオチド、は合目的的な任意の方法によって合成するこ
とができる。 一つの好ましい方法は、前記の式ＣＭ）のオリゴヌクレ
オチド誘導体、すなわちオリビデオキシヌクレオチドの
５′−末端リン酸基に基Ｒ１を介して−級アミノ基が導
入されたもの、のアミノ基に担体な結合させることから
なるものである。 一方、式〔■〕の化合物は、オリゴヌクレオチドの合成
および生成オリゴヌクレオチドの５′−水酸基延長上で
のム級アミン基の導入からなる方法で合成す゛ることか
できる。 第１図は、この好ましい合成法の一例を示すフローチャ
ートである。フローチャート中の記号は、下記の意味を
持つ（その意義ないし詳細は、後記した通りである）。 ＲＯＩＪン酸基を保護する置換基であって、通常オルト
クロロフェニル基が用いラレル。 Ｒ１二価の炭化水素残基である。 Ｒ２５′−末端水酸基の保護基であって、通常ジメトキ
シトリチル基が用いられる。 Ｒ３他のすべての保護基が安定な条件で容易に脱離され
て、リン酸ジエステルを与えることができる置換基であ
って、通常シアンエチル基が用いられる。 Ｒ４アミノ基の保護基であって、通常トリフルオロアセ
チル基が用いられる。 ｑ　ｎより小さい任意の自然数。 ｍＯまたは任意の自然数。 ｎｏおよび任意の自然数。 Ｂ　塩基を示す。 Ｂ′　保設された塩基を示すが、通常はＲ６−ベンゾイ
ルアデニン、Ｎ−インブチリルグアニン、Ｒ６−ベンゾ
イルシトシンおよびチミン（すなわち、保護不要）より
選択される。 −一のスペーサーを介した担体であって、通常は下記の
ものである。 ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２− 化合物［［の合成 一般にオリゴヌクレオチド合成法としては、トリエステ
ル法、ホスファイト法およびそれぞれの固相法および液
相法がある。本発明者らは既に同相法によるオリゴヌク
レオチド製造技術を確立しており、化合物［Ｍｌの合成
には本発明者らの下記の方法が好ましい。 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１９７９．
３６３５（１９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　８’、５４７３　（１９８０）Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　ＡｃｉｄｇＩ？、ｅ！Ｉｅａｒｃｈ　８．５
４９１（１９８０）Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ　８．５５０７（１９８０）Ｎｕｃｌｅｌ
ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ８５ｅａｒｃｈ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕ
ｍ　５ｅｒｉｅｓ　７　。 ２８１（１９８０） また、上記で合成したオリゴヌクレオチドの５′−水酸
基にリン酸基を介して一級アミン基を導入除去したもの
と化合物ＣＩ〕の保護基Ｒ２を除去したものとを縮合さ
せ、これらの操作をくり返すことによつ℃、化合物〔■
〕を合成する。オリゴヌクレオチド化合物（Ｉｌｌ）の
合成法は、上記分備→公知である。 一方、式〔■〕の化合物の合成は、化合物ＣＤのＲ２を
除去して５′−水酸基化合物とし、これにリン酸化剤（
たとえば、ホスホジトリアゾリド、ホスホジクロリドま
たはホスホジペンゾトリアゾリド等）を作用させてリン
酸化し、ついでアミノ基が保護されているアミノアルコ
ール化合物Ｒ２−Ｎ）１−Ｒ’−ｏＩ（ｃこの化合物は
オメガ−アミノアルコール（ＮＨ２Ｒ’　ＯＲ）のアミ
ノ基をＲ２で保護することにより得ることができる〕を
縮合させることにより、化合物〔■〕を得ることができ
る（詳細は後記実験例参照）。 この化合物１゛■〕の保護基Ｒ３を除去し、化合物し＋
［〕の保保護基２を除去したものと縮合させて、化合物
〔■〕を合成する。縮合は、化合物〔ｍ〕の合成の際の
縮合と本質的には変らない方法で行なうことができる。 このようにして合成された化合物〔ｖ〕の保護基なすべ
て除去すれば、化合物〔■〕が得られる。保護基ＣＯＡ
■、リン酸トリエステル中のオルト−クロロフェニル基
および塩基部分のアシル基は、０．５Ｍのテトラメチル
グアニジン−ビリジン−２−カルゼアルドキシムのジオ
キサン−水（９：１゜（Ｖ／Ｖ）　）溶液で処理後、ア
ルカリ処理（＃アンモニア水）を行なうことより除去さ
れる。Ｒ４がトリフルオロアセチル基の場合は、アンモ
ニア処理により充分脱離されるが、オルトニトロフエ＝
ｙスルフェニル基である場合はメルカプトエタノール処
理が必要で・ある。Ｒ４として他の保護基を用いた場合
は、オリゴヌクレオチド部分が安定な条件で、さらに別
の処理を加えることも可能である。 なお、デオキシオリサリセヌクレオチドの合成法は既に
各種のものが公知であって、保護基の種類およびその導
入ないし除去ならびに縮合その他について上記以外の詳
細は核酸の化学合成に関する放置や総説たとえば「ヌク
レオシド・ヌクレオチドの合成」（丸善１９７７年）、
　「核酸有機化学」（化学同人１９７９年）、「核酸」
（朝食書店１９７９年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　、
　３４．３１４３（１９７８）、有合化、３４．７２３
（１９７８）および化学の領域、３３．５６６（１９７
９）等を参照することができる。 化合物〔■〕の合成 固定化オリゴデオキシリボヌクレオチド（化合物〔■〕
）は、上記化合物〔■〕の５′−末端延長上のることか
できる。担体としては、天然の不溶性担体として、アガ
ロース、デキストラン、セルロース、ガラス粒が、合成
ポリマーとしてポリアクリルアミド、等が考えられるが
、上記化合物と結合反応させやすいように、そのもの自
体でなくその誘導体が好ましい。アガロースの場合は、
その誘導体としてセファロース誘導体（ファルマシア社
）が数種市販されている。 両者の結合は、例えば担体がセファロース誘導体であれ
ばその誘導体中のカルゼキシル基と化合物［Ｍ〕のアミ
ン基との間の脱水によるアミド結合を実現することので
きる任意の方法によって行なうことができる。化合物〔
■〕中にセファロース誘導体のカルゼキシル基との反応
が可能なアミン基または水酸基が存在するときは、それ
らを適当に保肢した状態でこの反応を行なうことができ
る。 従って、本発明で［式［ＶＩ）で示されるオリゴヌクレ
オチド誘導体の末端アミン基に担体を結合させて式し■
〕で示される固定化オリゴヌクレオチドな得る」という
表現は、化合物［ＭＴｌがこのように保護されている場
合をも包含するものである。また、この表現は担体がそ
の機能的誘導体の形にある場合をも包含するものである
。 担体が化７７０ニスの場合は、セファロースの機能的訪
導０体の具体例としては、臭化シアン活性化セファロー
ス（ロ）、活性化ＣＨセファロース（■）およびエポキ
シ化セファロース（■）等がある。またセファロースの
その他の誘導体としては、ＣＨ−セファロース（■）お
よびＡＨ−セファロース（■）等がある（この場合は化
合物〔■〕との反応に際して縮合剤（例えばＤＣＣ）が
必要である）。結合させるべき化合物ＣＭ）の５′−末
端延長上の一級アミン基とのみ選択的に反応し、なおか
つ縮合剤のいらいいことから考えて、活性化ＣＨ−セフ
ァ　ｏ　−スｌ：ｒ’ｈ最も好ましい（これらの詳細は
下記参照）。 縮合反応は合目的的な任意のものであり、所与の反応系
に対する具体的な反応方法は放置や文献（アフイニテイ
クロマトグラフイー、ＥＩＩ！ＩｅｖｉｅｒＳｅｌｅｎ
ｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂ、　Ｃｏ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ　（
１９７８）％　　Ａｇｒｉｃ。 Ｂｌｏｔ、Ｃｈｅｍｏ、３７．４６５（１９７３）、１
ｂｉｄ、　３７．１１９１（１９７３）、１ｂｌｄ　、
郡、４０９（１９７６）　、蛋白質・核酸・酵素（別冊
）　ｆｆ１２２　（１９８０）　）　および後記実■　
セファロース−〇−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ２−０−Ｈ ■　セファロースーＮ）Ｉ（ＣＨ２）５−ＣＯＯＨ■　
セファロース−ＮＨ（ＣＨ２）５−ＮＨ２結合量および
吸着能の検定 化合物１］■〕と担体（ここではセファロース）との結
合量は、担体１ｒｎ９あたり結合した化合物ＣＭ）の量
、門たは吸着物質としてトリデカアゾニル酸（ＨＯＡ１
３）　またはトリデカチミジル酸（ＨＯＴ　１３）を用
いて吸着した量をＯＤ年単位示すことにする。 また、本発明により合成された化合物〔■〕と従来方法
で合成された担体〔オリゴ（ａＴ）−セルロースまたは
オリゴ（ｄＡ）−セルロース（共に市販品）〕との吸着
能を比較するため、市販品についても化合物〔■〕と同
様の吸着実験を行なった。 一方、化合物［■］の生成を確認（結合部を求める）す
るのと同様に、第２図のフローチャートで〔■〕に相当
するトリデカアデニル酸（ＨＯＡ１３）、トリデカチミ
ジル酸（ＨＯＴ　１３）等による５′−水酸基化合物と
担体との結合を調べた。このことは、化合物〔■〕と担
体との結合位置を確定するために重要なことである。 従って、化合物〔■］を製造後、吸着能および結合部位
の検定を行なった。なお、ＨＯＡ１３、ＨＯＴ１３等の
製造は、化合物〔■〕を合成する際に用いた化合物シ■
〕の保護基をすべて除去することによって行なわれる。 第２図のフローチャートに従って、本発明化合、　　物
（同図の化合物■）を製造した。 第２図で、記号は次の意味を持つ。 Ｂ′　ベンゾイル化アデニン Ｂ　アデニン ＤＭＴｒ　）メトキシトリチル ＣＩＬ２　ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２− ＲＯオルトクロロフェニル Ｅｔ　　　エチル ＣＥ　　−シアノエチル ２ 一一去 　　１２ 化合物（■〕（第２図の、■）の合成 実験１−１ ジメトキシトリチルアデノシン／樹脂〔■〕（樹脂は担
体に過ぎないが　樹脂に担持された目的化合物は外観的
には樹脂そのものと変らないので、樹脂に担持された当
該化合物を以下において単に樹脂と呼ぶことにする）　
３００　ｍｇ（０，０３３ｍｍｏｌ　）をインプロパノ
−ルー塩化メチレン（１５：　８５、Ｖ／Ｖ　）溶液１
０ｍ１で３回洗浄後、臭化亜鉛ノ１．０Ｍのイソプロノ
にノール−塩化メチレン溶液８ｍｌで５分間ずつ４回反
応（脱トリチル化）させて樹脂〔■〕を得る。樹脂〔■
〕をイソプロノミノール−塩化メチレン溶液１０ｍ１で
３回洗浄し、これにジヌクレオチド〔■’：ｌ　１５０
ｍｇ　（０，１ｍｍｏｌ）のピリジン溶液を添加後、共
沸させて系を無水とし、メシチレンスルホニルニトロト
リアゾリド（以下ＭＳＮＴと記す）　１５０ｍｇ　（０
，５ｍ　ｍｏｌ　）と無水ピリジン２ｍｌ　　とを添加
して９０分間反応（縮合）させる。反応後、ビリ・ジン
１０ｍ１で３回洗浄し、触媒量（約１０ｍｇ）のジメチ
ルアミノピリジン（以下ＤＭＡＰ　）を含む無水酢酸−
ビリジ７（１：９、（Ｖ／Ｖ））溶液１０ｍ１を添加し
１０分間反応させて未反応５′−水酸基をアセチル化し
て保護し、これを２リジンで洗浄して、化合物〔■’］
（ｎ＝２）　　を得る。以上のような操作を６回くり返
して、化合物〔■］（ｎ＝１２）を得る。 一方、５′−ヒドロキシ−ジヌクレオチド〔■〕８００
　ｍｇ　（０，７１ｍ　ｍｏｌ　）とオルトクロロフェ
ニルホスホジトリアゾリドとを後者のジオキサン溶液（
１，０ｍｍｏｌ、　６ｍｌ　）　　中で２時間反応させ
、続いてトリフルオロアセチル−６−アミンヘキサノー
ル３００　ｍｇ　（ｔ４　ｍ　ｍｏｌ　）および１−メ
チル−イミダゾール１１５　ｍｇ　（１，４ｍ　ｍｏｌ
　）を加えてさらに２時間反応させる。反応終了後、溶
媒を留去し、残渣をクロロホルムに溶解した後、水、０
．５Ｍリン酸二水素す）　ＩＪウム水溶液、飽和炭酸水
素ナトリウム水溶液および５チの塩化す）　ＩＪウム水
溶液でそれぞれ洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥する
。クロロホルム層を濃縮後、シリカゲルカラムで精製（
溶出液として０〜４％のメタノール含有クロロホルムを
使用）シ、溶出液を濃縮後ペンタン中に滴下し粉末状の
化合物〔■〕を得る。 上記で合成した化合物［■］　（ｎ　＝１２　）　１１
１ｍｇ　、　”（３，４５μｍｏｌ）を前述と同様の方
法で脱トリチル化したもの〔■〕に、化合物〔■１６０
　ｍｇ　（０，０４ｍ　ｍｏｌ　）をトリエチルアミン
−ピリジン−水（ｌ：ｌｌｖ、’ｖ　）溶液３ｍｌ　で
処理（脱シアンエチル化）した化合物〔■〕を加え、無
水にしたのち、ＭＳＮＴ５０ｍｇ（０，２ｍｍｏｌ）お
よびピリジン１ｍｌを加え９０分間反応（縮合）させ、
反応終了後ぎりジンおよびメタノールで洗浄し、乾燥し
て、完全に保護されたオリゴヌクレオデド誘導体〔■〕
ヲ得ル。 オリゴヌクレオチド誘導体［■］１．５　ｍｇを０．５
　Ｍテトラメチルグアニジン−ピリジン−２−カルゼア
ルドキシメイトの・ジオキサン−水（９；１、Ｖ／Ｖ　
）溶液２００μｍ　を加え、遠沈管中、室温でｕ時間反
応させる。反応後、濃アンモニア水（２，５ｍ１）を加
えて密閉し、５０℃で一夜反応させる。反応終了後、許
過し、涙液を濃縮後、水に溶解させてからエーテルで抽
出を行なう。水層な濃縮後、セファデックスＧ−５０（
φ１゜５　Ｘ　１２０　ｃｍ、溶出液ハ０．０５Ｍ　の
Ｍ炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液ｐＨ７，５）で脱
塩精製しペンタデカアデニル酸誘導体〔［Ｆ］〕を得た
。 また同様の方法で実験１−２．１−３．１−４．１−５
および１−６のオリゴヌクレオチド誘導体を得た。実験
例１−１〜１−６の化合物の塩基配列その他を第１表に
示す。 ただし、この表で人はアデニン、Ｔはチミン、Ｇはグア
ニン、Ｃはシトシンを示す。 なお、実験例１−１．１−２および１−３についてのセ
ファデックスおよび高速液体クロマトグラフィーの結果
を第３〜４．５〜６および７〜８図に示す。これらの結
果より、化合物〔■〕が生成していることがわかる。 固定化オリゴヌクレオチド〔■〕の製造実施例 臭化シアン活性化セファロース４Ｂ（４０ｍｇ）を１　
ｍＭ−塩酸で洗浄し、さらに０．５Ｍ塩化ナトリウム−
〇、Ｉ　Ｍｌ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，３）
で洗浄後、化合物〔■〕（実験例１−１；４、ＯＯＤ量
）の０．５Ｍ塩化ナトリウム−０，１Ｍ、炭酸水系ナト
リウム緩衝液（ｐＨ８，３）　２００μｌを加え、振盪
しながら室温で一夜反応させる。反応後沖過し、樹脂を
１０ｍＭ）！Ｊス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）および０．
５　ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ　）リス塩酸緩衝液
（ｐＨ７，５）で洗浄して、樹脂〔■〕を得る。 イ）吸着能の検討 樹脂〔■Ｔｌ　’Ａ）　ｍｇ　を用い、合成トリデカチ
ミジル酸（実験例１−２を製造する際に用いた化合物〔
■〕の３′−末端保瞳基を除去した〔＠〕に相当する化
合物）“を試料として、アフイニテイクロマトグラフイ
ーを行なった。このときの溶出ノぞターンを第９図に示
す。 口）結合部位の検定 上記で製造した樹脂〔■〕のかわりに、トリデカアデニ
ル酸（実験例１−１を合成する際に用いた化合物１■〕
の３′−末端保獲基を除去した〔■〕に相当する化合物
１．以下ＨＯＡ１３とする）の粗精製物を用いて、イ）
と同様にトリデカチミジル酸を試料としてアフイニテイ
クロマトグラフイーを行なった。 このときの溶出パターンを第１０図に示す。 ハ）結果の解析 第９図の場合は、累通り画分が殆どなく、溶出溶媒をか
えることにより物質の浴出がみられた。 第１０図では供試試料は殆ど素通りしており、溶媒をか
えても物質の溶出がみられなかった。 従って、樹脂〔■〕は、アデニン部分（塩基部分）のア
ミン基がセファロースとオリゴヌクレオチド誘導体との
結合に関与しておらず、オリゴヌクレオチド誘導体の５
１−末端延長上のアミン基のみが選択的にセファロース
と結合しているものであるといえる。またこの結果から
樹脂〔■〕はＨＯＡ　１３と特異的に結合しているので
アフイニテイ樹脂として用いることができるといえる。 実施例 活性化ＣＩ■−セファロース４Ｂ（３０ｍｇ）を１　ｍ
Ｍ塩酸で洗浄する。樹脂を０．５Ｍの塩化ナトリウム−
０１Ｍの炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，３）で洗
浄したのち、化合物（実験例１−１　：　４．００Ｄ量
）の０．５Ｍの塩化ナトリウム−０，１Ｍの炭酸水素ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ８，３）１６０μｌ　を加えて、
振盪しながら室温で３時間反応させる。 反応波濾過し、樹脂を１０　ｍＭのトリス塩酸緩衝液（
ｐＨ７，５）および０．５Ｍの塩化ナトリウム−１０ｍ
Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）で洗浄して、樹脂
〔■〕を得る。 イ）吸着能の検討、および口）結合部位の検定は上記実
験例２−１と同様にトリデカチミジル酸を用いて行った
。その際のアフィニティークロマトグラフィーの溶出、
ｅターンを第１１および１２図に示した。 ハ）結果の解析 実験例２−１と同様の結果が得られている。ただし、素
通り画分で物質ＨＯＴ　１３が溶出している（第１１図
）のは、試料の添加液が多過ぎたため吸着しきれずに溶
出したものと考えられた。 従って、この実験例で製造した樹脂でも、塩基部分のア
ミン基でな（てオリザヌクレオチドの５′−末端延長上
のアミン基がセファロースとの結合反応に選択的に関与
しているということができ、またこの樹脂はアフイニテ
イ樹脂として用いることができるといえる。 実施例 樹脂の製造は臭化シアン活性化セファロース４　Ｂ　（
３０ｍｇ）と化合物（実験例１−２　：　３゜４３　Ｏ
Ｄｍｌ）とを用い、上記実験例と同様の操作で行なつた
。ところで、この操作に際して、内部標準物質としてト
リデカチミジル酸（ＨＯＴ１３）を添加した。 というのはＨＯＴ　１３は反応性がなく（塩基部分にア
ミノ基をもたない）、臭化シアン活性化セファロースと
も反応せずかつ高速液体クロマトグラフィーでの分析を
容易にするためである。そのときの結果を第１３図に示
した。Ａ）はＨＯＴ　１３と化合物１−２との混合物の
ものであり、Ｂ）はセファロースと化合物１−２との結
合反応後のものである。 第１３図のＡ）およびＢ）を比較しても、セファロース
と化合物１−２とが反応していることがわかるが、ＯＤ
の収支からもこのように推察される。ＯＤの収支を第２
表にまとめた。 第２表 イ）結合量の検討は上記実験例と同様の操作で行なった
。 口）吸着能の検定 ウンデカデオキシアデニル酸（以下ｄＡ１１とする）の
粗精製物で５６チの不純物を含むものを用いてアフイニ
ナイクロマトグラフイーな行なう。 粗ｄＡ１１　（０，５５０Ｄすなわち０．２４０Ｄに相
当）を用いた結果、非吸着部分が０．３４０Ｄ、吸着部
分が０．２３０Ｄとなった。この際の吸着部分の高速液
体クロマトグラフィーを行なった結果、単一ピークを得
た（ｗ、１４図）。また、非吸着部分の高速液体クロマ
トグラフィーを行なった結果、物質のピークが得られな
かった（第１５図）ので、この部分はｄＡｌｌを含んで
いないと考えられる。従って、ここで製造した樹脂はｄ
Ａｌｌと親和性をもち、セファロースとオリゴヌクレオ
チドの５′−末端アミノ基とのみが選択的に反応してい
ることがわかる。 実験例２−４〜２−８ これらの実験例については、実験例２−３と同様の操作
を行なった。その除用いた担体とオリゴヌクレオチド誘
導体を第３表にまとめた。 第３表 ａ：活性化ＣＨ−セファｔｆｆ−７；４Ｂｂ＝臭化シア
ン活性化−セファロース４Ｂ比較例 現在市販されている下記のものと、本発明者らの製造し
たものとの吸着能を比較するために下記の試料を用いて
吸着能の検定を行なった。 ■：オリザ（ｄＡ）−セルロース （Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｌｏｔ　Ｎｏ、
１１５５７７）■：オリザ（ｄＴ）−セルロース （Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅａｌｓ　Ｌｏｔ　Ｎｏ、
６７５１３０）比較例−１ 樹脂■（２０ｍｇ）　　を０．５Ｍ、塩化ナトリウム−
１０ｍＭ　　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）で膨潤さ
せたのち、カラムに充填し１．１０　ｍＭのトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７，”＋　、）および０．５Ｍの塩化ナト
リウム−１０ｍ’Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）
で洗浄する。このカラムにトリデカチミジル酸（ＨＯＴ
　１３）をかけ℃吸着能の検定を行なった。なお、溶離
液は１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＩ（７，５）を用
いた。 この樹脂を用いて計３回カラムクロマトグラフィーを行
なった。すなわち、１回目はＨＯＴ　１３（１，３３０
Ｄ　Ｍ’ｃ　）を２．１　ｍｌ　かけたが殆ど吸着され
ず、このときの溶出液を回収して再度カラムにかけた（
２回目）。３回目はカラムを作成しなおして上記と同様
の実験を行なった。そのときの溶出パターンを第１６図
に示した。この結果から、ＨＯＴ１３は殆ど吸着されて
いないことがわかる。 比較例−２ 樹脂■を用いて上記例−１と同様の吸着実験を行なった
。なお、カラムの供試試料としても上記と同様ＨＯＡ　
１３を用いた。カラムクロマドグ２フイーを５回行なっ
たが、そのときの溶出パターンを第１７図に示し、吸着
能を第４表に示した。 第４表 これらの結果から、樹脂■では素通り画分が多く、吸着
能も一番よいのが０．０３７０Ｄ／ｍｇであった。また
、検体の量または濃度の違いにより、あるいは吸着、お
よび溶出を繰り返すごとに吸着能が変化することにより
、再現性のある結果が得られない。 以上の実験例および比較例から、本発明の７フイニテイ
樹脂としての能力を、吸着能および結合量の点から市販
品と比較したものの一覧表を第５表に示した。 第５表 ＊１＝塩基配列５′ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣ３’のオ
リゴヌクレオチド リボヌクレオチド ５′ ＊３＝塩基配列　ＡＣＴＧＣＧＴＴＡＧＴＣＧＡ３’の
オリゴヌクレオチＰ ＊４＝測定不能は、樹脂の自己相補性のためカラムに吸
着されなかったためである。 結果のまとめ 以上の結果から総合判断すると、本発明の樹脂〔■〕は
、支持体であるセファロース誘導体との結合がオリゴヌ
クレオチド銹導体の５′−末端延長上の一級アミン基の
みが関与して生成したものであるといえる。また、この
樹脂〔■〕は、アンイニテイ樹脂として用いることがで
きる。そしてまた、結合壁および吸着能の比較から、本
発明の方法によれば合成可能ないかなる塩基配列をもつ
オリゴヌクレオチドをも支持体に結合させることができ
、非常に良質のアフイニテイ樹脂が合成できるといえる
。 ４、図面の簡単な説明 第１図は、本発明の化合物を合成する方法の一例を示す
フローチャートである。 第２図は、実験例で示した本化合物のフローチャートで
ある。 第３、；５および７図は、化合物〔Ｖ〕（それぞれ実験
例１−１．１−２および１−４）についてのセファデッ
クスＧ−５０での溶出、ｅターンを示したものである。 第４．６および８図は、化合物〔■〕（それぞれ実験例
１−１．１−２および１−４）についての高速液体クロ
マトグラフィーの溶出、ｅターンを示したものである。 第９および１０図は、実験例２−１で合成した樹脂およ
びその比較としてＨＯＡ１３を用いて各々アフイニテイ
クロマトグラフイーを行なったときの溶出Ａターンを示
したものである。 第１１および１２図は、実験例２−２で合成した樹脂お
よびその比較としてＨＯＴ　１３を用いて各々アフイニ
テイクロマトグラフイーな行なったときの浴出／Ｒター
ンを示したものである。 第１３図は、実験例２−３での高速液体クロマトグラフ
ィーの結果である。Ａは化合物１−２とセファロース誘
導体との反応前の、Ｂは反応後の、溶出パターンをそれ
ぞれ示したものである。 第１４図は実験例２−３で合成した樹脂を用いてアフイ
ニテイクロマトグラフイーを行なったときのカラム吸着
部分の高速液体クロマトグラフィーの溶出パターンであ
り、第１５図は非吸着部分の高速液体クロマトグラフィ
ーの結果である。 第】６図は市販の樹脂（■）を用いた際のアフィニテイ
クロマトグラフイーの浴出パターンであって、Ａ、Ｉ３
およびＣはそれぞれ１回目、２回目および３回目の結果
である。 第１７図は市販の樹脂（■）を用いた際のアフイニテイ
クロマトグラフイーの溶出ノぞターンであって、Ａ、Ｂ
、Ｃ，ＤおよびＥはそれぞれ１回目〜５回目までの結果
である。 なお、弗９〜１２図および第１６〜１７図の横軸欄外の
記号ＡおよびＢは溶出液の添加時期を示し、Ａ〜Ｂでは
主に洗浄をし、Ｂで溶出液をかえて物質の溶出を試みた
ことを示すものである。 出願人代理人　　　猪　股　　　　清 児３図 方　　画　　数 范４図 保１子時間（労） 第５図 力　画　　数 尾６図 イ５唾　特　　８岬Ｆ　間　（５）） 鬼７図 分　　画　　数 保持時間彷） 南１１図　　　　　　児１２図 分画Ｉ！　　　分画数 為１４図 保持時間４分） 鬼１５図 保持時間（２） 帛１７図 （Ａ）　　　　　　　　　　（Ｂ）　　　　　　　　　
（Ｃ）方向数　　　　方向数　　　方向数 （Ｄ）　　　　　　　　　　（Ｅ） 方向数　　　　分画数

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．３′末端リン酸基およびヌクレオチドの塩基部分が
   適当に保護されたオリザヌクレオチドの５′末端リン酸
   基に、適度の長さのスペーサを介して、脱離可能な保護
   基で保護されたアミン基を有する、オリビヌクレオチド
   誘導体。 ２、下式（２）で表わされる、特許請求の範囲第１項記
   載の誘導体。 Ｒ２−ＮＨ−Ｒ’−Ｐ　（Ｎ’Ｐ　）・Ｒ３（２）Ｘ　
   　　　　　Ｘｍ 〔ここで、置換基は下記の意味を持′つ、Ｎ　それぞれ
   アシル化された、アデニン、グアニン、シトシンおよび
   チミン、からなる群より選ばれた塩基残基金もつヌクレ
   オシドのうち、リゼシド骨格の３′および５′の酸素を
   除いたもの、たｙし、ｍ（後記）が２以上の場合の複数
   のＮ′は、塩基部分および（または）アシル部分につい
   て同一でも異なってもよい。 Ｐ　リン酸トリエステル結合 Ｒ１置換または非置換の二価炭化水素基、Ｒ２Ｒ３脱離
   の際安定であり、かつオリビヌクレオチｒ部分が安定な
   まま脱離できる置換基。 Ｒ３他のすべての保護基が安定な条件で、容易に脱離さ
   れ末端リン酸トリエステルを遊離のリン酸ジエステルと
   することができる保護基。 ｍ　Ｏから６、とりわけ１から４の整数である。〕 ３、Ｒ２がトリフルオロアセチル基（Ｔｆａ−）である
   、特許請求の範囲第２項記載の誘導体。 ４、Ｒ２が０−ニトロフェニルス／Ｉ／フェニル基（Ｎ
   、、−）である、特許請求の範囲第２項記載の誘導体。 ５、Ｒ１が直鎖桑たは分岐鎖アルキレン基（０２〜勉、
   好ましくは０２〜Ｃｌ２）またはアリレン基（Ｃ４〜ｃ
   ２０．好ましくは０４〜Ｃｌ２）である、特許請求の範
   囲第２項から第４項記載の誘導体。 ６、Ｒ３がシアノエチル基（−ＣＥ　）である、特許請
   求の範囲第一シ項から第５項記載の誘導体。 ７、特許請求の範囲第２項から第６項記載のオリゴヌク
   レオチド誘導体を製造するにあたり、下式（０） ％式％（０） （式中、Ｎ′、Ｐ　、ｍおよびＲ３は前記と同じ）で表
   わされる、３′末端リン酸基を保護されたオリゴヌクレ
   オチドの５′水酸基と下式（１）％式％（１） （式中、Ｒ１およびＲ２は前記と同じ）で表わされる化
   合物とをホスホジトリアゾリド、ホスホジクロリＰ１ホ
   スホジベンズトリアゾリド法などのリン酸化試薬を用い
   て結合させること全特徴とするオリゴヌクレオチド誘導
   体の製造法。 ８、下式（４）で表わされる、特許請求の範囲第１項記
   載の誘導体。 Ｒ２−ＮＨ−Ｒ１−ＰＸ（Ｎ’Ｐｘ）ｎ、＋ｎＮ’Ｏ・
   Ｃｏ−Ｒ４（４）〔ここで、置換基は下記の意味を持つ
   、Ｎ’、Ｐ　　Ｒ’、Ｒ２およびｍは前記と同じ、１ Ｒ４通常のオリゴヌクレオチド合成法に用いられる３′
   −水酸基保護基、たとえば低級アルキル基、アリル基、
   またはスペーサを介したポリスチレンまたはポリアクリ
   ルアミド系樹脂、 ｎ　ｏから４０、とりわけＯから加の整数である。〕 ９、Ｒ２がＴｆａ−である、特許請求の範囲第８項記載
   の誘導体。 １０、Ｒ２がＮｐ５−である特許請求の範囲第８項記載
   の誘導体。 １１、Ｒ１が直鎖ま・ｔＬは分岐鎖アルキレン基（Ｃ２
   〜Ｃ□２、好ましくはＣ２〜ｃ１２）またはアリレン基
   （０４〜Ｃ２０−好ましくは０４〜Ｃｌ２）である、特
   許請求の範囲第８項から第１０項記載の誘導体。 １２、Ｒ４がポリスチレン樹脂またはポリアクリルアミ
   ド樹脂などの高分子物質である、特許請求の範囲第８項
   から第１１項記載の誘導体。 １３、特許請求の範囲第８項から第１２項記載のオリゴ
   ヌクレオチド誘導体を製造するにあたり、特許請求の範
   囲第２項から第６項記載のオリゴヌクレオチド誘導体よ
   りＲ３基を脱離させて遊離または塩の形に変え、これに
   下式（３′）ＨＯ（Ｎ’Ｐ　）　Ｎ’０ＣＯＲ’　　　
   　　　　　（３’）　ｎ （式中、Ｎ’、　ｐ　、　Ｒ４およびｎは前記と同じ）
   で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体と縮合剤によっ
   て結合させること’ｒ％徴とする製造法。 １４．３’末端水酸基、リン酸部分および塩基部分にお
   いて全く保護されていないオリゴヌクレオチドの５′末
   端リン酸基に、適度の長さのスペーサを介して、−級ア
   ミノ基金有する、オリゴヌクレオチド誘導体。 １５、下式（５）で表わされる、特許請求の範囲第１４
   項記載の誘導体。 ＮＨ２−Ｒ’−Ｐ（ＮＰ）ｍ＋ｎＮＯＨ（５）〔ここで
   、置換基は下記の意味を持つ、Ｒ１、ｍおよびｎは前記
   と同じである、Ｎ　それぞれ、アデニン、グアニン、シ
   トシンおよびチミンからなる群より選ばれた塩基成育を
   もつヌクレオシドのうち、リゼシド骨格の３′および５
   ′の酸素を除いたもの。たｙし、ｍ＋ｎが２以上の場合
   の複数のＮは、同一でも異なってもよい。 Ｐ　リン酸ジエステル結合。〕 １６、Ｒ１が直鎖御な味は枝鎖アルキレン基（Ｃ２〜智
   、好ましくはＣ２〜Ｃ□２）またはアリレン基（Ｃ４〜
   ｃ２０．好ましくはＣ４〜Ｃｌ２）である、特許請求の
   範囲第１５項記載の誘導体。 １７、％許請求の範囲第１５項および第１６項記載のオ
   リゴヌクレオチド誘導体を製造するにあたり、特許請求
   の範囲第８項から第１２項記載のオリゴヌクレオチド誘
   導体よりＲ２基、　ＣＯＲ’基、塩基部分の保護基（ア
   シル基）およびリン酸部分の保護基をすべて脱離させる
   ことを特徴とする製造法。 １８、オリゴヌクレオチドの５′末端リン酸を適度の長
   さのスペーサを介して一級アミン基をもって担体と結合
   させた、固定化オリゴヌクレオチド。 １９、担体がセファロースである、特許請求の範囲第１
   ８項記載の固定化オリゴヌクレオチド。 加、、下式ω）で表わされる、特許請求の範囲第１９項
   記載の固定化オリゴヌクレオチド。 〔セファロース］−ＮＨ−Ｒ１−Ｐ（ＮＰ）　　　Ｎｏ
   ）（（６）ｍ＋ｎ 〔ここで、置換基は下記の意味を持つ、Ｒ１、ｍ、ｎ、
   ＮおよびＰは前記と同じである、〔セファロース〕　ア
   ミノ基と結合可能なセファロースである。〕 ２１、ＩｉＬ’が直鎖まミな畦仕岐鐵アルキレン基（Ｃ
   ２〜もい好ましくはＣ２〜Ｃｌ２）またはアリレン基（
   Ｃ４〜Ｃ２０、好ましくはＣ４〜Ｃｌ２）である、特許
   請求の範囲第加須記載の固定化オリ２ヌクレオチド。 ２２、　（セファロース）　カＢｒＣＮ活性化−セファ
   ロースまたは活性化ＯＨ−セファロースである、特許請
   求の範囲第九項または第２１項記載の固定化オリザヌク
   レオチＰ７ ｎ、特許請求の範囲第１項記載のオリゴヌクレオチド誘
   導体の３′−保護基および５′−末端リン酸に存在する
   保護基を脱離し、先端の一級アミン基をもって担体と結
   合させることを特徴とする特許請求の範囲第１５項記載
   の固定化オリビヌクレオチＰの製造法。 ２、特許請求の範囲第８項記載のオリゴヌクレオチド誘
   導体のＲ２、−ＣｏＲ４基、塩基部分のアシル基および
   、Ｐ　（リン酸トリエステル）部分の保護基を脱離し、
   下式（５） ％式％（５） （式中、Ｎ、Ｐ、Ｒ’、ｍおよびｎは前記と同じ） で表されるオリゴヌクレオチド誘導体を形成し、さらに
   セファロースと反応させることを特徴とする特許請求の
   範囲第九項から第２２項記載の固定化オリゴヌクレオチ
   ドの製造法。