EP0654094A1 - Sequences d'oligonucleotides pour la detection specifique de mollicutes par amplification de genes conserves - Google Patents

Sequences d'oligonucleotides pour la detection specifique de mollicutes par amplification de genes conserves

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Publication number
EP0654094A1
EP0654094A1 EP93917845A EP93917845A EP0654094A1 EP 0654094 A1 EP0654094 A1 EP 0654094A1 EP 93917845 A EP93917845 A EP 93917845A EP 93917845 A EP93917845 A EP 93917845A EP 0654094 A1 EP0654094 A1 EP 0654094A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
primers
primer
nucleotides
dna
mollicute
Prior art date
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Ceased
Application number
EP93917845A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Odile Grau
Rémi KOVACIC
Rémy Griffais
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut Pasteur
Original Assignee
Institut Pasteur
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Filing date
Publication date
Application filed by Institut Pasteur filed Critical Institut Pasteur
Publication of EP0654094A1 publication Critical patent/EP0654094A1/fr
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • Oligonucleotide sequences for specific detection of mollicutes by amplification of conserved genes Oligonucleotide sequences for specific detection of mollicutes by amplification of conserved genes
  • the subject of the invention is means and in particular oligonucleotide sequences, for the specific detection of determined mollicutes, this detection calling for an amplification reaction of gene fragments conserved in this class of microorganisms, when a mollicute determined is present in a biological sample.
  • Mollicutes represent a class of micro ⁇ organisms including in particular microorganisms belonging to the genera Myco lasma, Ureaplasma, Acholeplasma, Spiroplasma.
  • groups of mollicutes have also been distinguished.
  • mollicutes can constitute pathogens of their various hosts, in particular plants, humans, animals, or cell cultures, in particular laboratory lines.
  • Various studies aimed at detecting mollicutes in biological samples have been the subject of publications.
  • European patent application EP 0250662 proposes probes for the detection of mycoplasmas, these probes being derived from the ribosomal AR gene (rRNA) of mycoplasmas, in particular 16S rRNA. This request proposes so-called specific probes for mycoplasmas, as they differ from the E. coli 16S rRNA gene or other prokaryotic organisms.
  • rRNA ribosomal AR gene
  • A. Blanchard et al FEMS Microbiology Letters, 1991 n ° 81, p37-42, FEM 04480 used the alignment of the 16S rRNA sequences in order to define an appropriate pair of oligonucleotides, for a PCR reaction (Polymerase Chain Reaction). This pair of primers would allow the amplification, at the level of a biological sample, of several species belonging to the genus ycoplasma. According to Blanchard et al, the two primers described do not amplify the DNA of bacteria or eukaryotic cells and they are obtained from the alignment of conserved regions among the species of the genus Mycoplasma.
  • the mycoplasmas detected must be identified after the amplification reaction, using a species-specific probe or by sequencing the amplified DNA.
  • a probe of M. pirum whose natural host remains undetermined according to Blanchard et al, is described.
  • the inventors posed the problem of specific and sensitive detection of mollicutes and in particular of mycoplasmas in biological samples, using the techniques of amplification of fragments of genes conserved within mollicutes or prokaryotes in general.
  • M. pirum Mycoplasma pirum
  • ribosomal RNA gene for example 16S ribosomal RNA, 5S ribosomal RNA, 5.8S, 23S, transfer RNA, the tuf gene, the genes involved in the cellular function of the translation (initiation factor, elongation factor, for example the tuff gene, termination gene, ribosomal proteins), or enzyme genes such as topoisomerases such as DNA gyrases.
  • 16S ribosomal RNA of mollicutes and in particular of mycoplasmas is strongly conserved between the different genera and species.
  • This homology between the nucleotide sequences of the genes transcribed into 16S rRNA of mollicutes can be between 80% and 100% of the sequence and it is stronger within the same group of mycoplasmas belonging to different species.
  • the homology between M. pirum and M. pneumoniae, M. qallisepticum, U urealyticum is approximately 92%, 94% and 86% respectively.
  • the subject of the invention is therefore nucleotide sequences which can be used as primers for the amplification of a specific nucleic acid of a desired mollicute.
  • the invention also relates to nucleotide sequences which can be used as probes for the detection of amplification products.
  • the means proposed in the invention are also very sensitive, allowing the detection of determined mollicutes without prior culture of the sample.
  • the sensitivity of the means proposed in the invention decreases reproducibly to 10 organisms present in the sample.
  • the invention defines a first group of primers.
  • the subject of the invention is, according to a first embodiment, a pair of primers for the amplification of a DNA sequence of a determined mollicute, from a biological sample, characterized in that it comprises :
  • a) a first primer and a second primer each having the following properties:
  • each primer comprises n nucleotides, n having a value equal to or greater than 10, preferably n being between 18 and 25,
  • each primer has an overall homology equal to or greater than 50% with a nucleotide sequence known as "corresponding sequence”, of a determined conserved gene of a mollicute known as a “reference mollicute", said "corresponding sequence” belonging to a region variable of the conserved gene, this homology being distributed within the primer in such a way that:
  • the last 2 nucleotides of the primer, located at the 3 • end, are identical to the nucleotides of 1 • corresponding sequence of the conserved gene
  • ol 1 homology of the nucleotides of the 5 ′ part of the primer corresponding to approximately one third of the n nucleotides of the primer is at least 55%, preferably at least 60% with the fragment corresponding to the corresponding sequence of the conserved gene of the reference mollicute and;
  • the first primer being further such that:
  • o the homology of the 3 ′ part of the primer corresponding to approximately one third of the n nucleotides of the primer is, after exclusion of the last 2 nucleotides of the 3 ′ end, at least 60% with the corresponding fragment of the corresponding sequence of the conserved gene of the reference mollicute and,
  • o at least one of the 2 nucleotides of its 3 ′ end is different from the corresponding nucleotide of the aligned nucleotide sequence of the conserved gene present in another mollicute capable of being detected in humans;
  • the second primer being further such that:
  • the homology of the 3 ′ part of the primer corresponding to approximately one third of the n nucleotides of the primer is at least 50% with the corresponding fragment of the conserved gene of the reference mollicute.
  • the primer called "first primer” is characterized with regard to the property identified under b), in that at least the last nucleotide of its 3 • end, preferably the the last two nucleotides from its 3 'end is (are) different from the corresponding nucleotide of the aligned nucleotide sequence of the conserved gene present in another mollicute (another species) capable of being detected in humans.
  • the first and second primers are further characterized in that at least the last nucleotide of the 3 'end of 1 • one of the first or second primers is different from the corresponding nucleotide of the aligned nucleotide sequence of the conserved gene present in another mollicute (another species) capable of being detected in humans, and two additional nucleotides distributed among the last three nucleotides of the 3 'end of one of the primers or the two primers, are also different from the corresponding nucleotide of the aligned nucleotide sequence of the conserved gene present in another mollicute (another species) capable of being detected in humans.
  • the primers called "second primers” have a lower second level homology than the first primer with regard to their 3 'part.
  • the condition relating to the difference with respect to a mollicute different from the reference mollicute, of at least one of the two nucleotides forming the 3 'end of the primer may not be satisfied, as soon as a sufficient homology, that is to say greater than 50% is established in the remaining part of the sequence and in particular for the 3 ′ terminal half of the primer.
  • the said first and / or second primer is (are) further characterized in that the homology of the nucleotides of the central part of the primer corresponding to approximately one third of the n nucleotides of the primer is at least 15% with the corresponding fragment of the corresponding sequence of the conserved gene of the reference mollicute.
  • the first primer and the second primer can be, as the case may be, the primer hybridizing with the 5 ′ end of the fragment to be amplified, or the primer hybridizing with the 3 ′ end of the fragment to be amplified.
  • this central part is deleted in whole or in part or has a weaker homology.
  • At least one primer of the couple defined above is chosen for its ability to be present at a very low frequency, less than 1, within the human genome.
  • the frequency of appearance of this primer in the human genome can be verified using the technique described by Griffais et al (Nucl. Acids. Res. 1991, vol. 19 no. 14 p 3887-3891) or in Meth in Enzymology 1990, vol 183 p 237- Claverie et al.
  • Griffais et al Nucl. Acids. Res. 1991, vol. 19 no. 14 p 3887-3891
  • Meth in Enzymology 1990, vol 183 p 237- Claverie et al One can also use a computer research program available on the market for example the FIND program of the company GCG Inc, (W Biotechnology Center, 1710 Univ. Avenue, Madison Wisconsin 53705 - USA)
  • the primers whose definition has been given previously can also be used for the amplification of RNA sequences corresponding to the DNA of a mollicute, provided that primers capable of hybridizing with said RNA are used.
  • the “matching sequence” is the nucleotide sequence of the conserved gene chosen to define primers, which can be aligned with the primer or its complementary reverse sequence.
  • the "corresponding fragment” is a fragment included in the "corresponding sequence” which can be aligned with the fragment forming the 5 'part, the central part or the 3' part of the primer, or its complementary reverse sequence.
  • the term homology referred to above refers to the identity of the nucleotides of the primer, with respect to the aligned nucleotides of the sequence of the selected conserved gene of the reference mollicute.
  • a homology equal to or greater than 50% with the nucleotide sequence, said corresponding sequence means that at least half of the nucleotides of the primer are identical to the corresponding nucleotides when the primer is aligned with the corresponding sequence of the gene. preserved from which the amplification is carried out in order to detect a determined mollicute (reference mollicute).
  • variable region of the DNA of the conserved gene from which the primers for a mollicute are derived is called a region, the rate (percentage) of conservation between different corresponding sequences obtained in mollicutes of distinct genera or species, is less than 80 %, preferably less than 50%.
  • variable regions were defined in Gutell et al, 1985 Prog. Nucleic Acid Res Mol Biol 32: 155-216; Woese et al 1983, Microbol Rev 47: 621-669; Neefs et al 1991.
  • primer derived from a gene means that this primer is defined, selected from the data available on the chosen gene and in particular on its sequence.
  • a step for the selection of a primer corresponding to the preceding characteristics consists, after having chosen a conserved mollicute gene, in establishing a compilation of the different gene sequences for several determined mollicutes and, if appropriate, for other organisms having related genes , and to select from the variable regions of the sequences thus aligned, the nucleotide sequences corresponding to the characteristics defined above.
  • reference mollicute or "determined mollicute” corresponds to a particular species of mollicutes, taken inside a genus, for example the genus Mycoplasma or the genus Spiroplasma or even the genus Ureaplasma.
  • phylogenetic studies and in particular those reported by Weisburg et al have made it possible to determine the existence of certain groups such as the group of M. pneumoniae, the group of M. hominis, the group of spiroplasms, or the group of acholeplasms to which Acholeplasma laidlawii belongs.
  • primers as defined above are used, in the form of pairs of primers.
  • the invention also relates to another group of primers (group 2), capable of forming part of a pair of primers, the two primers of which correspond to the definition given of the abovementioned first primer of the first group above.
  • group 2 another group of primers
  • the reference mollicute is a mycoplasma capable of being detected in humans.
  • this mycoplasma is M. pirum.
  • the primer is defined from a reference mollicute chosen from M. fermentans, M. hominis, U. urealyticum, M. pneumoniae or A. laidlawii.
  • a reference mollicute chosen from M. fermentans, M. hominis, U. urealyticum, M. pneumoniae or A. laidlawii.
  • the sequences of the previously mentioned mollicutes were described in the catalog of bacteria and bacteriophages distributed by 1 ⁇ TCC (American Type Culture Collection) in the I8 th Edition in 1992. The access numbers to these strains are given in this catalog and the publications describing them are also given for reference.
  • primers described above can be modified by extension or deletion of certain nucleotides or replacement.
  • a primer of the invention can be extended at its 5 ′ end and / or at its 3 * end, in particular by the nucleotides adjacent to the corresponding sequence of the conserved gene from which it is defined.
  • this gene is the mollicute gene transcribed into 16S ribosomal RNA.
  • a first primer preferred according to the invention is the sequence MYCPIRP corresponding to the formula:
  • Another preferred primer according to the invention is the primer MYCPIRN corresponding to the formula:
  • the primer MYCPIRP is used as primer 5 ', that is to say at the N-terminal end of the fragment to be amplified and the primer MYCPIRN is used as primer 3 •, that is to say at 1 C-terminal end of the fragment to be amplified.
  • DNA size of the RNA gene 16S ribosome of M. pirum from which these primers are defined is approximately 173 nucleotides.
  • FIG. 1 represents the position of the sequences of the 16S rRNA gene of different mollicutes and makes it possible in particular to locate the sequences of this gene corresponding to the primers MYCPIRP and MYCPIRN of M. pirum between positions 52 and 82 for the first, 207 and 239 for the second. These positions are given with reference to the sequence of the 16S ribosomal RNA gene from E. coli (Brosius et al, 1978, PNAS, USA, vol 75, p4801-4805).
  • Figure 1 represents a compilation with alignment of the sequences for the different mollicutes.
  • the invention relates to the primers defined from the gene corresponding to the 16S RNA of mollicutes different from M. pirum, these primers being derived from the nucleotide fragments of FIG. 1 for each of the mollicutes, located between positions 52 and 82 d on the one hand, 207 and 239 on the other.
  • primers have the advantageous property of being specific for the detection of specific bacterial strains or defined phylogenetic groups.
  • the invention also relates to a pair of primers characterized in that it comprises a primer corresponding to the definition given above and having in particular the characteristics identified by a) (1 and 2), b) or c), and a primer capable of hybridizing under strong stringency conditions with a DNA or cDNA fragment obtained from a conserved gene of the specified mollicute called "reference mollicute".
  • strong stringency is meant the hybridization of the primers with the DNA of the sample, when this hybridization is carried out at 55 ° C. for 1 minute in the "Taq" buffer marketed by Amersham.
  • the pair of primers is chosen such that each of the primers is distant from the other by approximately 150 to 300 nucleotides.
  • a particular pair of primers includes MYCPIRP and MYCPIRN.
  • the specific primers according to the invention can be used in pairs for the detection of specific strains or families.
  • the following pairs of primers are advantageously used for the detection of the strains identified below:
  • PENETP 5 'CATGCAAGTCGGACGAAGCA 3' PENETN: 5 ” AGCATTTCCTCTTCTTACAA 3 'for the detection of M. penetrans
  • TIRE 5 'CCTGCAAGGGTTCGTTATTT 3' TIRE: 5 ' ATGGTACAGTCAAACTCTAG 3 ' for the detection of M. pneumoniae
  • HOI- ⁇ IP 5'-ATACATGCATGTCGAGCGAG-3 'HOMIN: 5'-CATCTTTTAGTGGCGCCTTAC-3' for the detection of M. hominis
  • UREUREP 5'-CGTAAAGTTGCTTATGGACGTCGTT-3 • UREUREN: 5'-TTGTGTCTCCTAATCTAACGCTATC-3 'for the detection of U. urealyticum
  • MYCARGP 5'-ATGCATGTCGAGCGAGGTTC-3 'MYCARGN: 5'-TTAGCTGCGTCAGTGAACTC-3' for the detection of M. arqinini
  • MYCORAP 5 • -CGTTGTGAAAGGAGCGTTTC-3 'MYCORAN: 5'-GAAGCATTTCCTCAACTAAC-3' for the detection of oral M.
  • MYCHYOP 5'-TAAATTCTAAAAAAGATCGACTAAC-3 'MYCHYON: 5'-TTCAGTAATTGCTTCTAAATTAACG-3' for the detection of M. hyorhinis
  • the primers UREUREP and UREUREN allow the amplification and the detection of a fragment of the urease gene.
  • the primers MYCHYOP and MYCHYON make it possible to amplify and detect a fragment of the gene for the 115 kDa protein.
  • the invention also relates to nucleotide sequences, which can be used in particular as probes when they are labeled, these sequences being chosen from the conserved or variable regions of the mollicutes which it is sought to detect. These probes are also determined relative to the primers used in the amplification reactions; they are internal fragments with respect to these primers.
  • Two probes of interest in the context of the invention are probes suitable for the detection of an amplification product of the 16S ribosomal RNA gene of M. pirum.
  • a nucleotide sequence capable of being used as a probe in the context of the invention is characterized by the following properties: it comprises at least 10 nucleotides, preferably from 25 to 30 nucleotides, it specifically hybridizes under the following conditions with the DNA sequence amplified from the conserved gene of a reference mollicute, when the amplification is carried out using 2 primers chosen according to the invention for a reference mollicute.
  • 5X Denhardt solution a basic solution 5 times concentrated.
  • Such sequences may be derived from or derived from the variable regions or from the constant regions of the reference mollicute.
  • a sequence thus constituted When a sequence thus constituted is derived, that is to say defined from a variable region of the reference mollicute, it hybridizes in a specific manner, with the nucleotide chain amplified from the two primers.
  • the term “specific hybridization” is understood to mean a hybridization which takes place with a nucleotide sequence of the particular mollicute gene from which the sequence is defined and which does not hybridize with any fragment of the corresponding gene of a gene from another mollicute or d 'a bacterium or a eukaryotic cell in particular which does not hybridize with human genoi ⁇ DNA likely to be present in a biological sample.
  • nucleotide sequences derived from the constant regions of a reference mollicute can exhibit homologies with corresponding sequences of other mollicutes or possibly other organisms.
  • these sequences can be used as probes in a specific reaction for the detection of a specific mollicute, insofar as the fragment which it is desired to amplify from the primers, capable of hybridizing with this sequence derived from a constant region, will have a known size. When the size of the amplified fragment corresponds to the expected size, the presence of the desired mollicute is confirmed.
  • MYCPIRS1 5'CAAATGTACTATCGCATGAGAAACATTT3 'OR MYCPIRS2 5'GGGTGAGTAACACGTATCCAATCTACC3'.
  • PENETS 5 'CATGAGAAAATGTTTAAAGTCTGTTTG 3' TIRES: 5 'GAAGAATGACTTTAGCAGGTAATGG 3' HOMINIS: 5 'CGCATGGAACCGCATGGTTCCGTTG 3' UREURES: 5'-CCATCAGGTACTGCTATTCGTTTTGAACC- 3 'MYCARGS: 5'-TTTTGAACCTAGCGGCGAATGGGTGAGT -3 "MYCORAS: 5'-GTCCGCTAAGAGATGAGGGTGCGGAACA -3' MYCHYOS: 5'-AAATTTAATTAGTGAGCAAG-3 'ALAIDLS: 5'-TGACCGAGCAACGCCGCGTGAACGACGA -3'
  • sequences described above can be modified by addition, deletion and / or replacement of nucleotides.
  • these probes can be extended at their 5 'end and / or at their 3' end by the addition of one or more nucleotides, in particular nucleotides adjacent to the probe sequence, in the corresponding sequence of the gene. of the reference mollicute.
  • These probes can, if necessary, be extended at their 5 ′ end and / or at their 3 ′ end by adjacent nucleotides in the corresponding fragment of the corresponding region of the reference mollicute gene used.
  • the distance separating two selected primers can be known, either by reference to the data available on the sequence of the mollicute in question, or when the sequence is not known, by reference to molecular weight markers. Consequently, an amplified fragment which would have a size different from the size expected for the amplification of a fragment of a reference mollicute, would correspond to DNA or to RNA of another organism.
  • the invention also relates to a nucleotide sequence characterized in that it is reverse and complementary DNA to a previously defined sequence or a nucleotide sequence characterized in that it is a reverse and complementary RNA of a sequence defined above.
  • Such a reverse and complementary RNA is capable of being used as antisense RNA, if necessary to block the transcription of the gene for the reference mollicute used for the definition of the primers and of the above sequences or to block the RNA transcribed from of this gene.
  • the subject of the invention is also a DNA fragment as obtained by amplification of a DNA from a conserved gene of a reference mollicute or of a corresponding cDNA, the amplification being carried out by means of a pair of primers defined above, the amplified DNA fragment specifically hybridizing with a probe constituted by a specific sequence of a variable region or of a constant region of the gene preserved reference mollicute, internal relative to the positions of the 2 primers.
  • the invention also relates to a complementary and reverse RNA with respect to the DNA described above.
  • kits for the detection of a specific mollicute said
  • reference mollicute in a biological sample, characterized in that it comprises: at least one pair of primers derived from a gene conserved from a reference mollicute, capable of hybridizing under stringent conditions at the 5 'ends and 3 ′ of a DNA fragment of the reference mollicute, these 2 primers being such that: a) the first primer and the second primer each have the following properties:
  • each primer comprises n nucleotides, n having a value equal to or greater than 10, preferably n being between 18 and 25,
  • each primer has an overall homology equal to or greater than 50% with a nucleotide sequence known as "corresponding sequence”, of a determined conserved gene of a mollicute known as a “reference mollicute", said "corresponding sequence” belonging to a region variable of the conserved gene, this homology being distributed within the primer in such a way that:
  • the last 2 nucleotides of the primer, located at the 3 • end, are identical to the nucleotides of the corresponding sequence of the conserved gene
  • o the homology of the nucleotides of the 5 ′ part of the primer corresponding to approximately one third of the n primer nucleotides is at least 55% preferably at least 60% with the corresponding fragment of the corresponding sequence of the conserved gene of the reference mollicute and;
  • the first primer being further such that:
  • o the homology of the 3 ′ part of the primer corresponding to approximately one third of the n nucleotides of the primer is, after exclusion of the last 2 nucleotides of the 3 ′ end, at least 60% with the corresponding fragment of The corresponding sequence of the conserved gene of the reference mollicute and,
  • o at least one of the 2 nucleotides of its 3 ′ end is different from the corresponding nucleotide of the aligned nucleotide sequence of the conserved gene present in another mollicute capable of being detected in humans;
  • the second primer being further such that:
  • the homology of the 3 ′ part of the primer corresponding to approximately one third of the n nucleotides of the primer is at least 50% with the corresponding fragment of the conserved gene of the reference mollicute.
  • the reagents necessary for the polymerization of the DNA fragment of the reference mollicute from the nucleotide primers in particular sufficient polymerization enzymes to carry out the amplification; - At least one probe corresponding to a nucleotide sequence of the conserved gene of the reference mollicute, internal with respect to the primers.
  • the primer called "first primer” is characterized with regard to the property identified under b), in that at least the last nucleotide of its 3 • end, preferably the last two nucleotides at its 3 'end is (are) different from the corresponding nucleotide of the aligned nucleotide sequence of the conserved gene present in another mollicute (another species) capable of being detected in humans.
  • the first and second primers of the kit are further characterized in that at least the last nucleotide of the 3 'end of one of the first or second primers is different from the corresponding nucleotide of the aligned nucleotide sequence of the conserved gene present in another mollicute (another species) capable of being detected in humans, and two additional nucleotides distributed among the last three nucleotides of the 3 'end of one primers, or both primers, are also different from the corresponding nucleotide of the aligned nucleotide sequence of the conserved gene present in another mollicute (another species) capable of being detected in humans.
  • the two primers of the pair meet the definition given for the aforementioned first primer and therefore, they verify the properties identified by a) 1 and 2 and b).
  • this kit may contain the primers corresponding to the definition of the variants given in the preceding pages.
  • the primers can be marked with a chemical, physical or enzymatic marker and / or fixed to a solid support, in particular a particulate or membrane support, for example magnetic beads.
  • the probes used for producing the kit of the invention can also be labeled at their 5 • end and / or at their 3 ′ end with a substance which can be detected, or fixed to a solid support.
  • radioactive isotopes examples include radioactive isotopes, suitable chemical enzymes or markers, fluorochromes, haptens, antibodies, basic analogs or even physical markers.
  • the attachment to a support can be made on a solid particulate or membrane support, for example on magnetic beads.
  • a particular kit of the invention is characterized in that the primers that • it contains are MYCPIRP and MYCPIRN, the probe being MYCPIRS1 or MYCPIRS2 or both.
  • kits according to the invention are defined using the following primers and specific probes, for detecting the strains indicated below:
  • PENETP primer 5'-CATGCAAGTCGGACGAAGCA-3 '
  • MYCARGS oligonucleotide probe 5 ⁇ -TTTTGAACCTAGCGGCGAATGGGTGAGT-3 '
  • MYCORAS oligonucleotide probe 5'-GTCCGCTAAGAGATGAGGGTGCGGAACA -3 '
  • - MYCFERS oligonucleotide probe 5'-GAAGCTTTCTTCGCTGGAGGAGCGGGGT-3 '
  • the kit also comprises: an internal control of the amplification reaction, consisting of a DNA fragment capable of being easily detected, for example a fragment containing a gene for resistance to an antibiotic, this fragment being different from the DNA of the reference mollicute capable of being amplified from the sample, this fragment being additionally provided at each of its ends with an amplification primer described above;
  • an internal control of the amplification reaction consisting of a DNA fragment capable of being easily detected, for example a fragment containing a gene for resistance to an antibiotic, this fragment being different from the DNA of the reference mollicute capable of being amplified from the sample, this fragment being additionally provided at each of its ends with an amplification primer described above;
  • Means for detecting the amplification of internal control for example a probe capable of specifically hybridizing with the DNA contained in the internal control.
  • a kit according to the invention can comprise several pairs of specific primers of different mollicutes and, in particular, a pair specific primers for each of the following mollicutes: M. pirum, M. pneumoniae, M. fer entans, U urealyticum and A. laidlavii.
  • the kit also includes a specific probe for each of these mollicutes.
  • the subject of the invention is also a kit corresponding to one of the definitions above, characterized in that it further comprises a reverse transcriptase for obtaining cDNA from the 16S ribosomal RNA present in the biological sample tested.
  • a method for the detection of an infection by a mollicute or several determined mollicutes in particular of the species M. pirum or several determined mollicutes, on a biological sample characterized in that it comprises the steps of: contact of the nucleic acid of the biological sample tested, if necessary under conditions allowing accessibility in the form of single-stranded DNA, with at least one pair of nucleotide primers described above, said primers being able to hybridize with the the nucleic acid of the specific mollicutes sought if they are present, and initiating the synthesis of the elongation product of said primers, each strand of DNA of mollicutes serving as template when it is paired with the primers; b) separation of the strands of DNA synthesized from their template; c) repetition of the synthesis of elongation product, from each DNA strand present at the end of step b) and capable of hybridizing with the primers, until an amplification of l DNA sought, sufficient to be detected, d)
  • the amplification techniques include, for example, the PCR (Polymerase Reaction Chain) technique described in the European patent applications of CETUS (n ° 0200363, 0201184, and 0229701), or even the "Q ⁇ replicase” technique described in Boitechnology (vol. 6, October 1988).
  • Other techniques are “LCR” (ligase chain reaction), “3SR” (self sustained sequence replication), “Ampliprobe” (amplification from RNA). These techniques are described in J of Virological methods, 1991, 35, 117-126.
  • the contacting of the biological sample tested is preceded by a step of processing the sample so as to extract the nucleic acid therefrom.
  • this method is characterized in that prior to contacting with the primers, o treats the nucleic acid of the sample with a reverse transcriptase, to obtain the synthesis of cDNA from the RNA possibly present in the sample testé.Il poss the carrying out the method according 1'invention equal ⁇ nt by using primers together with the reverse transcriptase.
  • Different samples can be used for the implementation of the invention and advantageously a culture of the sample will not be carried out. prior to the mollicute detection operation. Indeed, the sensitivity of the means defined for this detection allows the realization of the invention on tissues or other samples without prior culture. Thus, it will be possible to use, as samples, human or animal tissues, or alternatively cell lines used for example in the laboratory, in order to detect an infection or contamination by a mollicute or several determined mollicutes.
  • the invention allows the amplification, from primers, of the genomic DNA of mollicutes contained in the samples tested, after extraction of this DNA or on the contrary directly without prior extraction, by "in situ" PCR.
  • the invention relates in particular to the detection in a patient infected with an HIV retrovirus, of an infection with one or more mollicutes and in particular determined mycoplasmas.
  • the primers and other sequences of the invention can be obtained by any suitable technique, in particular by chemical synthesis.
  • Figure 1 Alignment of 16S ribosomal DNA sequences from M. pirum and representative species of mollicutes and bacteria.
  • the numbers indicate the nucleotide positions relative to the sequence of E. coli 16S rDNA (Brosius et al. 1978).
  • the asterisks indicate the nucleotides conserved.
  • the sequences (direct or complementary depending on the case) of the oligonucleotides MYCPIRP, MYCPIRN, MYCPIRS1 and MYCPIRS2) are underlined.
  • Figure 2 hybridizations with the MYCPIRS1 (A) or MYCPIRS2 (B) probe of the PCR products, after electrophoresis and transfer to the membrane. Track 1: M.
  • PCR was carried out from 100 fg of DNA for M. pirum, and from 10 ng of DNA for the other mollicutes.
  • Figure 3 hybridization with the MYCPIRS1 probe of the PCR products, after electrophoresis and transfer to the membrane.
  • Track l M. hominis
  • track 2 M. oral
  • track 3 M. arginini
  • track 4 M. fermentans
  • track 5 M. hyorhinis
  • track 6 A. laidlawii
  • track 7 C. innocuum
  • track 8 M. pirum 70-159
  • track 9 M. pirum BER
  • track 10 C. ramosum
  • track 11 B. subtilis
  • track 12 E.coli
  • track 13 M. pirum NOU
  • track 14 M VUC pirum.
  • the PCR was carried out from 100 fg of DNA for M. pirum, and from 10 ng of DNA for the other bacteria.
  • Figure 4 polyacrylamide gel electrophoresis of PCR products from the genomic DNA of M. pirum.
  • Tracks 2 to 8 dilutions of the DNA of M. pirum by 10 in
  • Tracks 10 to 15 and 17 dilutions of the DNA of M. pirum from 10 to 10 from 1 ng to 1 fg, in the presence of DNA from PBMCs.
  • Lane 18 DNA control of PBMCs alone (1 ⁇ g).
  • Figure 5 Hybridizations with the MYCPIRS1 probe of the PCR products carried out from the genomic DNA of M. pirum. Tracks 1 to 7: 10-fold dilutions of M. pirum's DNA
  • Lane 8 M. pirum's DNA is replaced by water.
  • Track 1 to 5 different subclones of the line.
  • Lane 6 M. pirum (10 pg).
  • Tracks 2 to 8 and 10 to 16 PCR on dilution of M. penetrans from 10 to 10 from lfg (1 genome) to lng (10 6 genomes), in the absence (lane 2 to 8) or in the presence (lane 10 to 16) of 1 ⁇ g of PMBCs DNA with the primers PENETP and PENETN. Lane 7: negative control (sterile distilled water). Lane 9: PCR carried out on 1 ⁇ g of DNA from PBMCs. The PCR products were subjected to electrophoresis, transferred to a nylon membrane and hybridized with the internal probe to the amplified fragment PENETS.
  • Lanes 1 and 24 PCR using 100 fg of DNA (100 genomes) from M. penetrans.
  • Tracks 3 to 22 PCR from 10 ng (10 7 genomes) of the following mycoplasmas: M. gallisepticum, M. pirum, M. pneumoniae, M. génitalium, M. iowae, M. matris, U. urealyticu, M. hyorhinis, M. arginini, M. oral, M. hominis, M. fermentans, M. mycoides, M. capricolum, S. citri, A. laidlawii, C. innocuum, C. ramosum, B. subtilis and E. coli.
  • Tracks 2 and 23 negative controls (sterile distilled water).
  • Tracks 1 to 6 and 8 to 13 PCR on dilution of M. pneumoniae from 10 to 10 from 100 pg (10 5 genomes) to 1 fg (1 genome), in the absence (tracks 1 to 6) or in the presence ( lanes 8 to 13) of 1 ⁇ g of DNA from PBMCs with the primers PNEUP and PNEUN. Lane 7: negative control (sterile distilled water). Lane 14: PCR carried out on 1 ⁇ g of DNA from PBMCs. The PCR products were subjected to electrophoresis, transferred to a nylon membrane and hybridized with the internal probe to the amplified fragment PNEUS.
  • Tracks 2 to 8 'and 10 to 17 PCR on dilutions of M. hominis from 10 to 10 from 10 ng (10 7 genomes) to 1 fg (1 genome), in the absence (tracks 2 to 8') or in the presence (lanes 10 to 17) of 1 ⁇ g of DNA from PBMCs with the primers HOMIP and HOMIN. Lane 1: negative control (sterile distilled water). Lane 9: PCR carried out on 1 ⁇ g of DNA from PBMCs. The PCR products were subjected to electrophoresis, transferred to a nylon membrane and hybridized with the internal probe to the amplified fragment HOMIS. EXAMPLES
  • M. mycoides PG1 (ATCC 10114), M. hominis PG21 (ATCC 23114), M. arqinini G230 (ATCC23838), M. oral CH19299 (ATCC 23714), M. hyorhinis BS7 (ATCC 17981), M. pirum 70-159 (ATCC 25960), M. pneumoniae FH (ATCC 15531), M. genitalium G37 (ATCC 33530) M. fermentans PG18 (ATCC 19989), M. penetrans GTU-54-6A1 (ATCC 55252), Ureaplasma urealyticum 960 (NCTC 10177 ), M. arthritidis MY5121TR, M.
  • agalactiae PG2 (ATCC 10123), M. pulmonis My 5031, M. salivarium PG20 (ATCC 23064), M. ripened RIII4 (ATCC 33757) and Acholesplasma laidlawii PG8 (ATCC 23206) standard known as Escherichia coli K12 and Bacillus subtilis 168.
  • M. pirum strains BER, NOU, and VUC
  • strain AOU clinical strain of M. fermentans
  • M. matured RIII4 (ATCC 33757), Spiroplasma citri R8A2 (ATCC 27556), M. capricolum Cal. Kid (ATCC 27343), Clostridium innocuum B-3 (ATCC 14501) and C. ramosum 113-1 (ATCC 25582), M. gallisepticum PG31 (ATCC 19610) and M. iowae 695 (ATCC 33552) were used.
  • PBMC peripheral blood cells
  • the tubes are centrifuged for a few seconds at 1800 rpm to drop the drops, then the samples containing 2 x (10 ml on 5 ml of Ficoll) are centrifuged for 30 minutes at 1800 rpm at 4 ° C.
  • the plasma, the red cells and the lymphocytes are thus separated.
  • the band corresponding to the lymphocytes (4 2 ml Safelock R tubes) is recovered and also 2 ml samples of plasma (in a 2 ml Safelock R tube). These samples are centrifuged for 30 minutes at 20,000 g at 4 ° C.
  • the supernatant is removed and the centrifugation pellet is washed with PBS (phosphate buffered saline) with removal of the supernatant and sedimentation of the cells from the pellet at 20,000 g after each washing. Centrifugation at 20,000 g allows the sedimentation of mycoplasmas which may have adhered to eukaryotic cells. The centrifugation pellets are stored at -20 ° C.
  • PBS phosphate buffered saline
  • lysis buffer 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, EDTA ImM, 1% SDS.
  • the cells are resuspended gently with the flexible disposable pipettes.
  • the base remains compact. Take care not to splash liquid which could contaminate the other tubes.
  • Phenol extraction, chlorophor extraction and precipitation in 2 volumes of absolute ethanol in the presence of 0.1 M NaCl are carried out.
  • Washing is carried out with 70% ethanol. Gently vortex and unhook the pellet. Centrifuge at 15,000 g. Remove the supernatant. If too much ethanol remains at the bottom of the tube, dry the open tubes for a few tens of minutes under the laminar flow hood.
  • 200 ⁇ l of DNA at 1 ⁇ g / 10 ⁇ l and 200 ⁇ l of DNA at 10 ng / 10 ⁇ l are prepared (two quantities of DNA 1 ⁇ g and 10 ng).
  • the sterile distilled water which was used to make the dilutions is stored in a tube and will constitute the "water” control of the PCR reaction (tube n ° 1 of the PCR reaction) (see “PCR reaction”).
  • the reaction is carried out in a volume of 50 ⁇ l, consisting of 40 ⁇ l of "mix” to which the Taq DNA polymerase (Amersha International pic) has been added, and of 10 ⁇ l of DNA.
  • the reaction volume contains: the DNA to be amplified; the 4 dNTPs at 200 ⁇ M each; the 2 primers at 0.4 ⁇ M each (20 pmol); Taq buffer;
  • a stock of 10 mM dNTPs is prepared from the 100 mM stock solution.
  • the stock solution at 100 mM of each of the dNTPs is aliquoted in 100 ⁇ l tubes.
  • the stock of 10 mM dNTPs is prepared by adding 900 ⁇ l of water to the 100 ⁇ l of stock solution. It is aliquoted into 250 ⁇ l tubes.
  • 33 is the quantity in ⁇ g of DNA for an OD of 1 330 is the average mass of a nucleotide
  • the concentration thus obtained is 20 ⁇ M.
  • a dozen tubes containing volume v are prepared from the stock solution and stored at -20 ° C. It will remain to add the volume 1000-v of water to obtain the stock solution at 20 ⁇ M.
  • the stock solution at 20 ⁇ M is itself aliquoted by 250 ⁇ l.
  • dNTPs 10 mM 200 ⁇ l of each, i.e. 800 ⁇ l primers 20 ⁇ M: 200 ⁇ l of each, ie 400 ⁇ l 10X Taq: 1000 ⁇ l
  • the mix is aliquoted in 1 ml tubes.
  • tube n ° 1 "water” control corresponding to the dilution of the DNA.
  • tube n ° 2 witness "lysis solution”.
  • tubes n ° 3 to 2n + 2 DNA samples from the series.
  • tubes n ° 2n + 3 witness "lysis solution”.
  • tubes n ° 2n + 4 "water” indicator corresponding to the handling present.
  • each cycle consists of a denaturation step at 94 ° C for 1 minute, a priming hybridization step (primers) at 55 ° C for 1 minute and an elongation step from the primer and the matrix to 72 "C for 2 minutes and 30 seconds.
  • the DNA (17 ⁇ l of the PCR reaction) was analyzed by electrophoresis on a 1.5% agarose gel and transferred to a nylon membrane (Hybond N + Amersham International pic), according to the alkaline transfer technique ( Reed et al, 1985, Nucleic Acids Res. 3,2: 7207-7221). After the transfer, the filters were air dried for 1 hour and the DNA was fixed by UV irradiation for 3 minutes. Prehybridization was carried out in a solution containing 5 x SSC, 5 x Denhardt solution, 0.1% SDS and 200 ⁇ g or (10 mg / ml DNA) of denatured salmon sperm, at 42 ° C for 2 hours.
  • Hybridization was carried out overnight at the same temperature in the same mixture, but by adding one of the two oligonucleotide probes MYCPIRS1 and MYCPIRS2, labeled in 5 ′ with ( 7 "32 P) ATP and the kinase polynucleotide T4 (United States Biochemical Corp.) and purified by chromatography on a sephadex column (Pharmacia LKB Biotechnology). After hybridization, the membranes were washed twice for 15 minutes at room temperature in 2 x SSC, 1% SDS, 2 times for 10 minutes at 55 "C in 0.2 SSC, 0.1% SDS, then quickly rinsed in 2 x SSC at room temperature. The hybridization signals were visualized by autoradiography on photographic film.
  • the primers MYCPIRP and MYCPRIN were developed from the 16S rDNA (ribosomal DNA) sequence of M. pirum) (Weisburg et al, 1989, J. Bacteriol. 171: 6455-6467).
  • 16S rDNA ribosomal DNA sequence of M. pirum
  • the conserved sequences can be used to detect a group of organisms (Lane et al, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
  • variable regions can be used to specifically detect a given organism.
  • the rDNA sequences of different mollicutes were analyzed (Weisburg et al, 1989) the ribosomal DNA sequence of gram-positive bacteria phylogenetically related to mollicutes (C. innocuum, C. ramosum and B.
  • FIG. 1 shows the alignment of part of the rDNAs of the 16S subunits (corresponding to nucleotides 49 to 233, based on the numbering of the rDNAs of the 16S subunit of E. coli (Brosius and al, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7_5: 4801-4805)), of all mollicutes belonging to the same phylogenetic group as M. pirum and designated by Weisburg as the "M. pneumoniae group” (Weisburg and al, 1989 cited above) (i.e. M. pneumoniae, M. pirum, M. matris, M. qallisepticum, M.
  • the objective being the specific detection of M. pirum in animal or human tissues, which means the detection of a rare event in an environment of animal or human DNA, the primers have have been defined to achieve the best sensitivity in such an environment. This is especially necessary when it comes to detecting M. pirum in the blood, a tissue known to contain inhibitors of the PCR reaction such as hemoglobin.
  • the best sensitivity is obtained when human DNA is not amplified with the primers used, that is to say when no additional band (due to non-specific amplification of human DNA) appears on the gel. after coloring with ethydium bromide. Consequently, primers were sought whose sequence corresponds to nucleotide sequences present with a low frequency in the human genome. Such primers were determined from octamers constituted by a nucleotide chosen initially and the 7 nucleotides preceding it in the sequence of M. pirum.
  • MYCPIRP Two primers MYCPIRP and MYCPIRN corresponding respectively to the following sequences: MYCPIRP:
  • CATCCTATAGCGGTCCAAAC3 were chosen in the regions of the ribosomal DNA of the 16S subunit containing the variable regions V6 for the first primer and Vil' for the last primer (Neefs et al, 1991, Nucleic ACid Res. 19: 1987-1999).
  • the first nucleotide of MYCPIRP corresponds to position 52 of the rRNA of the 16S subunit of E. coli; the first nucleotide of MYCPIRN corresponds to position 207 of this same RNA (Brosius et ai, 1983).
  • the 3 'end of these primers is specific for M. pirum.
  • MYCPIRS1 and MYCPIRS2 located inside the amplified fragment, were chosen for perform Southern analyzes.
  • MYCPIRS1 (5 » CAAATGTACTATCGCATGAGAAACATTT3 ', position 182) corresponds to the variable regions VIO and VIO' and is specific for M. pirum.
  • MYCPIRS2 (5'GGGTGAGTAACACG TATCCAATCTACC3 *, position 110) corresponds to the conserved regions 7 and 8 and is not a specific sequence for M. pirum (FIG. 1).
  • genomic DNA 10 ng, i.e. approximately 10 million genomes
  • M. pirum M. pneumoniae, M. génitaliu, M. matured, M. iovae, M. qallisepticum and U. urealyticum
  • MYCPIRP and MYCPIRN the primers MYCPIRP and MYCPIRN and the internal probes MYCPIRS1 and MYCPIRS2.
  • No amplification signal of the expected size that is to say approximately 173 nucleotides was detected either on the agarose gels stained with ethydium bromide, or after Southern and hybridization with either other probe (figure 2).
  • the signal obtained was comparable in intensity with the signal corresponding to the amplification of 100 fg (ie 10 3 genomes) of DNA from M. pirum.
  • This signal can be explained by the fact that one of the two primers is homologous to the rDNA of the 16S subunit of M. qallisepticum.
  • 10 ng of DNA from mollicutes belonging to other phylogenetic groups were also tested, again without obtaining an amplification signal.
  • No amplification signal was obtained with 10 ng of DNA from two gram-positive bacteria with a low percentage of G + C bases, phylogenetically very close to the mollicutes, such as for example C. innocuum and C. ramosum, nor d another grain-positive bacteria B. subtilis.
  • DNA from E. coli and mononuclear cells were also tested, leading to negative results ( Figures 2 and 3).
  • the means described above make it possible to amplify and detect the DNA of M. pirum in the PBMCs of infected macaques.
  • Detection of pathogens by PCR is a powerful diagnostic tool, provided that appropriate technical means are used to avoid obtaining a false positive.
  • the detection of mycoplasmas used in these techniques is particularly indicated as their culture is tedious.
  • the invention makes it possible for the first time to use 16S rDNA sequences of mollicutes for the specific detection by PCR of a given species of mollicutes, thus showing that the ribosomal sequences constitute a powerful tool for the detection of microorganisms.
  • a couple of primers and two internal probes have been developed to detect specifically and with high sensitivity M. pirum by PCR in human tissues. M. pirum has also been detected in the blood of macaques experimentally infected with this mycoplasma. Detection of M.
  • Example 2 Primers for the diagnosis of M. penetrans, M. pneumoniae and M. hominis.
  • M. penetrans and M. pneumoniae which belong to the same phylogenetic group
  • 16S ribosomal DNAs were aligned (Weisburg et al., 1989): - Phylogenetic group of M. pneumoniae: M. penetrans, M. pneumoniae, M. pirum, M. qallisepticum, M. matris, M. iowae and Ureaplasma urealyticum.
  • M. hominis M. hominis and M. hyorhinis.
  • M. hominis M. hominis, M. oral, M. salivarium, M. arthritidis, M. arginini, M. lipophilum, M. bovigenitalium, M. californicum, M. fermentans, M. agalactiae, M. pulmonis, M. sualvi, M. mobile, M. neurolyticum, M. hyopneumoniae and M. hyorhinis.
  • M. pneumoniae M. pneumoniae, M. pirum and U. urealyticum.
  • an amplification signal of the expected size (407 base pairs) was obtained after electrophoresis of the amplification products and staining with ethydium bromide, as well as after transfer and hybridization with the internal PENETS probe, radioactively labeled with 32 P.
  • the sensitivity descended reproducibly to 10 fg of DNA (ie 10 genomes) of M. penetrans.
  • the same sensitivity was obtained in the presence of 1 ⁇ g of human genomic DNA extracted from PBMCs (mononuclear cells of peripheral blood) (Fig 7). Assessment of the specificity of the test:
  • No amplification signal (neither after staining with ethydium bromide nor after hybridization with PENETS) was obtained with excess DNA (10 ng, ie 10 7 genomes) of the following mycoplasmas: M. pirum, M. pneumoniae, M. genitalium, M. gallisepticum, M. iowae, M. matris, U. urealyticum, M. hyorhinis, M. arginini, M. oral, M. hominis, M. fermentans, M. mycoides, M. capricolum, S. citri, A. laidlawii, C. innocuum, C. ramosum, B. subtilis and E. coli (Fig 8).
  • no amplification was obtained (neither after staining with ethydium bromide, nor after hybridization), from 1 ⁇ g of human PBMCs (FIG. 7).
  • An amplification signal of 286 base pairs is obtained in a reproducible manner up to 10 fg (ie 10 genomes) of DNA from M. pneumoniae, after transfer and hybridization with PNEUS and this even in the presence of 1 ⁇ g of DNA human genomics extracted from PBMCs (F: ' i 9).
  • An amplification signal of 170 bp of the rDNA16S fragment is obtained up to 10 fg of DNA (ie 10 genomes), after transfer and hybridization with HOMIS. This is verified even when the PCR is carried out in the presence of 1 ⁇ g of human genomic DNA extracted from PBMCs (FIG. 10).
  • No amplification signal (after staining with ethyl bromide or after hybridization with the HOMIS probe) is obtained with excess DNA (10 ng, ie 10 7 genomes) of the following mycoplasmas: M. penetrans, M. pirum, M. pneumoniae, M. qenitalium, M. gallisepticum, M. iowae, M. matris, U. urealyticum, M. hyorhinis, M. arginini, M. oral, M. fermentans, M. mycoides, M. capricolum, S. citri, A. laidlawii, C. innocuum, C. ramosum, B. subtilis and E. coli (not shown).
  • no amplification is obtained (neither after staining with ethydium bromide, nor after hybridization), from 1 ⁇ g of human PBMCs (FIG. 10).
  • Example 3 Detection by PCR of Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum.
  • This test was carried out using: a pair of primers specific for M. hominis (MYCHOMP and MYCHOMN), determined from the 16S rRNA sequence.
  • MYCHOMS an oligonucleotide probe, MYCHOMS, for the detection of the amplification products obtained with MYCHOMP and MYCHOMN (Table 1).
  • Amplified gene Fragment of the urease gene The components of this test can be combined in the form of a kit.
  • Negative primer 400 nM dATP, dTTP, dGTP, dCTP 200 ⁇ M each
  • the mixture was covered with 50 ⁇ l of mineral oil.
  • the gel was then transferred onto a nylon membrane (Genescreen +, Du Pont, NEN) according to the alkaline transfer protocol recommended by the suppliers.
  • the membrane was pre-hybridized for 3 h at 37 ° C in the following solution:
  • the labeled probe was added to the prehybridization solution and the hybridization carried out for 16 h.
  • the mixture was left at 37 ° C for 30 min, then at 65 ° C for 10 min.
  • the labeled oligonucleotide was purified by chromatography on a Sephadex column (Pharmacia LKB), then added to the pre-hybridization solution.
  • the mollicutes DNA was extracted according to conventional techniques. For example, lysis using a detergent (triton X100 or SDS) and proteinase K, phenol, chloroform, RNase A, phenol, chloroform, ethanol precipitation in the presence of 0.1M NaCl and glycogen which acted as a trainer, washing with 70% ethanol, drying and resuspension in sterile water. For example, 10 ⁇ l of the suspension obtained was used in the PCR reaction.
  • a detergent triton X100 or SDS
  • the M. hominis strains tested were as follows:
  • Test sensitivity Reproducible results have been obtained up to 10 fg of DNA, or approximately 10 organisms (or 1 CFU), even in the presence of 1 ⁇ g of human genomic DNA.
  • Example 4 PCR detection kit for the five main contaminating mycoplasmas of cell cultures.
  • M. arginini MYCARGP and MYCARGN
  • M. oral MYCORAP and MYCORAN
  • M. hyorhinis MYCHYOP and MYCHYON
  • M. fermentans MYCFERP and MYCFERN
  • Acholeplas a laidlawii ALAIDLN
  • oligonucleotide probes for the detection of the amplification products obtained from MYCARGP and MYCARGN, MYCORAP and MYCORAN, MYCHYOP and MYCHYON, MYCFERP and MYCFERN, ALADP (See Tables 3 to 7).
  • the components of these tests can be grouped together in a kit.
  • Table 3 Specific primers of M. arginini,
  • Table 5 Specific primers of M. hyorhinis.
  • Table 7 Specific primers of A. laidlawii.
  • Negative primer 400 nM dATP, dTTP, dGTP, dCTP 200 ⁇ M each
  • the mixture was covered with 50 ⁇ l of mineral oil.
  • reaction mixture ie 17 ⁇ l
  • a third of the reaction mixture ie 17 ⁇ l
  • the gel was then transferred onto a nylon membrane (Genescreen +, Du Pont, NEN) according to the alkaline transfer protocol recommended by the suppliers.
  • the membrane was pre-hybridized for 3 h at 37 ° C in the following solution:
  • the labeled probe was added to the prethybridization solution and the hybridization carried out for 16 h.
  • the mixture was left at 37 "C for 30 min, then at 65" C for 10 min.
  • the labeled oligonucleotide was purified by chromatography on a Sephadex column (Pharmacia LKB), then added to the pre-hybridization solution.
  • the membrane was then washed at 55 ° C: (4 X 5 min in 2XSSC, 1% SDS 4 X 5 min in 0.2XSSC, 0.1% SDS) then dried at room temperature and autoradiography.
  • the DNA was extracted according to conventional techniques (for example, lysis using a detergent (triton X100 or SDS) and proteinase K, phenol, chloroform, RNase A, phenol, chloroform, precipitation with ethanol in the presence of 0.1M NaCl and glycogen which acts as a trainer, washing with 70% ethanol drying and resuspension in a few tens of ⁇ l of sterile water. For example, 10 ⁇ l of the suspension obtained in the reaction was used of PCR.
  • a detergent triton X100 or SDS
  • the results were reproducible up to 10 fg of DNA, or approximately 10 organisms (or 1 CFU), even in the presence of 1 ⁇ g of human genomic DNA.
  • Another subject of the invention is the primers contained in the pairs of primers defined in the above pages.

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Abstract

L'invention vise des amorces pour la détection spécifique de mollicutes en particulier de mycoplasmes sur des échantillons biologiques. Elle vise aussi des sondes, ainsi que des kits de détection.

Description

Séquences d'oligonucléotides pour la détection spécifique de mollicutes par amplification de gènes conservés
L'invention a pour objet des moyens et en particulier des séquences d'oligonucléotides, pour la détection spécifique de mollicutes déterminés, cette détection faisant appel à une réaction d'amplification de fragments de gènes conservés dans cette classe de microorganismes, lorsqu'un mollicute déterminé est présent dans un échantillon biologique.
Les mollicutes représentent une classe de micro¬ organismes comprenant notamment les microorganismes appartenant aux genres Myco lasma, Ureaplasma, Acholeplasma, Spiroplasma. Sur la base de critères phylogenetiques des groupes de mollicutes ont aussi été distingués. On a par exemple défini le groupe de M. pneumoniae, le groupe de M. hominis, le groupe des spiroplas es. Pour la définition des genres, groupes et espèces de mollicutes on se reportera à l'article de W.G. eisburg et al (J. of Bact. Dec 89, vol n° 171, p6455-6467) .
Ces mollicutes peuvent constituer des agents pathogènes de leurs différents hôtes notamment de plantes, de l'homme, d'animaux, ou encore de cultures cellulaires, notamment de lignées de laboratoire. Différents travaux visant à détecter des mollicutes dans des échantillons biologiques ont fait l'objet de publications.
Ainsi la demande de brevet européen EP 0250662 propose des sondes pour la détection de mycoplasmes, ces sondes étant dérivées du gène de l'AR ribosomique (ARNr) de mycoplasmes, en particulier de l'ARNr 16S. Cette demande propose des sondes dites spécifiques des mycoplasmes, dans la mesure où elles diffèrent du gène de l'ARNr 16S de E.coli ou d'autres organismes procaryotes.
A. Blanchard et al (FEMS Microbiology Letters, 1991 n° 81, p37-42, FEM 04480) ont utilisé l'alignement des séquences de l'ARNr 16S en vue de la définition d'un couple d'oligonucléotides approprié, pour une réaction de PCR (Polymerase Chain Reaction ou Réaction de Polymérisation en chaîne). Ce couple d'amorces permettrait l'amplification au niveau d'un échantillon biologique, de plusieurs espèces appartenant au genre ycoplasma. Selon Blanchard et al, les deux amorces décrites n'amplifient pas l'ADN de bactéries ou de cellules eucaryotes et elles sont obtenues à partir de l'alignement de régions conservées parmi les espèces du genre Mycoplasma.
Selon les auteurs de cet article, les mycoplasmes détectés doivent être identifiés après la réaction d'amplification, en utilisant une sonde spécifique d'espèce ou en séquençant l'ADN amplifié. Une sonde de M. pirum dont l'hôte naturel reste indéterminé selon Blanchard et al, est décrite.
S. Deng et al (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1054-9803/92 (PCR Methods and Applications, 1992, n° 1 p202-204)) décrivent l'utilisation de la technique PCR pour détecter à l'aide d'amorces universelles, différents représentants de la classe des mollicutes. Pour distinguer les produits amplifiés issus de mollicutes, de produits provenant éventuellement de bactéries Gram+, Deng et al ont recours à la comparaison de fragments de restriction pour constituer des profils RFLP (Restriction Fragment Lenghth Polymorphism) .
Les inventeurs ont posé le problème de la détection spécifique et sensible de mollicutes et en particulier de mycoplasmes dans des échantillons biologiques, en faisant appel aux techniques d'amplification de fragments de gènes conservés au sein de mollicutes ou de procaryotes en général.
Il ont été en mesure de définir des moyens de détection suffisamment spécifiques pour distinguer différentes espèces de mollicutes et ont notamment réussi à mettre en évidence de façon spécifique la présence de Mycoplasma pirum (M. pirum) dans un échantillon de tissu humain en l'absence de toute culture préalable de l'échantillon prélevé chez un patient infecté par un rétrovirus HIV.
Différents gènes conservés ( présentant une homologie d'au moins 50% entre différentes espèces déterminées) peuvent être mis en oeuvre à cet effet. On peut citer à titer d'exemples, le gène des ARN ribosomiques par exemple de l'ARN ribosomique 16S, ARN ribosomique 5S,5,8S, 23S, ARN de transfert,le gène tuf, les gènes intervenant dans la fonction cellulaire de la traduction (facteur d'initiation, d'élongation, par exemple le gène tuf, de terminaison, protéines ribosomiques) , ou des gènes d'enzymes tels que les topoisomérases comme les DNA gyrases.
Il est ainsi connu dans l'art antérieur, que l'ARN ribosomique 16S de mollicutes et en particulier de mycoplasmes est fortement conservé entre les différents genres et espèces. Cette homologie entre les séquences nucleotidiques des gènes transcrits en ARNr 16S de mollicutes peut être comprise entre 80% et 100% de la séquence et elle est plus forte à l'intérieur d'un même groupe de mycoplasmes appartenant à des espèces différentes. Par exemple 1'homologie entre M. pirum et M. pneumoniae, M. qallisepticum, U urealyticum est respectivement d'environ 92%, 94% et 86%.
Malgré cette forte homologie de séquences nucleotidiques au sein de gènes conservés, les inventeurs ont établi la possibilité de définir des amorces nucleotidiques spécifiques d'espèce pour les mycoplasmes ou d'autres genres de mollicutes et sont parvenus à définir des moyens pour la détection spécifique d'espèces différentes de mollicutes.
L'invention a donc pour objet des séquences nucleotidiques utilisables comme amorces pour l'amplification d'un acide nucléique déterminé d'un mollicute recherché. L'invention concerne aussi des séquences nucleotidiques utilisables comme sondes, pour la détection des produits d'amplification.
Ces moyens sont dits spécifiques dans la mesure où ils permettent de réaliser une discrimination entre différentes espèces à 1'intérieur de la classe des mollicutes, notamment entre différentes espèces de mycoplasmes. Ces moyens spécifiques permettent d'éviter la détection de "faux positifs" qui pourraient résulter de la détection de séquences d'ADN apparentées à celle du gène conservé utilisé pour la définition des amorces, séquences issues d'autres espèces de microorganismes présents dans l'échantillon biologique testé ou apportés par contamination, ou encore de séquences apparentées naturellement présentes dans l'échantillon testé, telles que l'ADN génomique ou de l'ADN des organelles (mitochondries) , des cellules qu'il contient.
Les moyens proposés dans 1'invention sont également très sensibles, permettant la détection de mollicutes déterminés sans culture préalable de l'échantillon. La sensibilité des moyens proposés dans l'invention, descend de façon reproductible jusqu'à 10 organismes présents dans l'échantillon.
Parmi les moyens destinés à la détection spécifique de différentes espèces du genre Mycoplasma ou de différents genres de mollicutes, l'invention définit un premier groupe d'amorces.
L'invention a pour objet selon un premier mode de réalisation, un couple d'amorces pour l'amplification d'une séquence d'ADN d'un mollicute déterminé, à partir d'un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend :
a) une première amorce et une deuxième amorce ayant chacune les propriétés suivantes :
1) chaque amorce comprend n nucléotides, n ayant une valeur égale ou supérieure à 10, de préférence n étant compris entre 18 et 25,
2) chaque amorce présente une homologie globale égale ou supérieure à 50% avec un enchaînement nucléotidique dit "enchaînement correspondant", d'un gène conservé déterminé d'un mollicute dit "mollicute de référence", ledit "enchaînement correspondant" appartenant à une région variable du gène conservé, cette homologie étant répartie au sein de 1'amorce de façon telle que :
o les 2 derniers nucléotides de l'amorce, situés à 1'extrémité 3• , sont identiques aux nucléotides de 1•enchaînement correspondant du gène conservé,
o l1homologie des nucléotides de la partie 5' de 1'amorce correspondant à environ un tiers des n nucléotides de l'amorce, est d'au moins 55% de préférence d'au moins 60% avec le fragment correspondant de 1'enchaînement correspondant du gène conservé du mollicute de référence et ;
b) la première amorce étant en outre telle que :
o 1'homologie de la partie 3' de 1'amorce correspondant à environ un tiers des n nucléotides de l'amorce est, après exclusion des 2 derniers nucléotides de 1'extrémité 3' d'au moins 60% avec le fragment correspondant de l'enchaînement correspondant du gène conservé du mollicute de référence et,
o l'un au moins des 2 nucléotides de son extrémité 3' est différent du nucléotide correspondant de la séquence nucleotidique alignée du gène conservé présent chez un autre mollicute susceptible d'être détecté chez l'homme ;
c) la deuxième amorce étant en outre telle que :
o 1'homologie de la partie 3' de l'amorce correspondant à environ un tiers des n nucléotides de l'amorce est d'au moins 50% avec le fragment correspondant du gène conservé du mollicute de référence.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, l'amorce appelée "première amorce" est caractérisée s'agissant de la propriété identifiée sous b) , en ce que au moins le dernier nucléotide de son extrémité 3• , de préférence les deux derniers nucléotides de son extrémité 3' est (sont) différent(s) du nucléotide correspondant de la séquence nucleotidique alignée du gène conservé présent chez un autre mollicute (une autre espèce) susceptible d'être détecté chez l'homme. Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, la première et la deuxième amorces sont en outre caractérisées en ce que au moins le dernier nucléotide de 1'extrémité 3' de 1•une des première ou deuxième amorces est différent du nucléotide correspondant de la séquence nucleotidique alignée du gène conservé présent chez un autre mollicute (une autre espèce) susceptible d'être détecté chez l'homme, et deux nucléotides supplémentaires répartis parmi les trois derniers nucléotides de l'extrémité 3' de l'une des amorces ou des deux amorces, sont également différents du nucléotide correspondant de la séquence nucleotidique alignée du gène conservé présent chez un autre mollicute (une autre espèce) susceptible d'être détecté chez l'homme.
Les amorces appelées "deuxièmes amorces" présentent une homologie de second niveau plus faible que la première amorce s'agissant de leur partie 3' . En particulier pour cette deuxième amorce, la condition relative à la différence par rapport à un mollicute différent du mollicute de référence, de l'un au moins des deux nucléotides formant 1*extrémité 3 ' de l'amorce, peut ne pas être vérifiée, dès lors qu'une homologie suffisante, c'est-à-dire supérieure à 50% est établie dans la partie restante de la séquence et en particulier pour la moitié 3' terminale de l'amorce.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la susdite première et/ou la deuxième amorce est (sont) en outre caractérisée(s) en ce que l'homologie des nucléotides de la partie centrale dε 1'amorce correspondant à environ un tiers des n nucléotides de l'amorce, est d'au moins 15% avec le fragment correspondant de l'enchaînement correspondant du gène conservé du mollicute de référence. La première amorce et la deuxième amorce peuvent être selon les cas 1'amorce hybridant avec 1'extrémité 5' du fragment à amplifier, ou l'amorce hybridant avec l'extrémité 3' du fragment à amplifier.
Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, cette partie centrale est délétée en tout ou en partie ou présente une homologie plus faible.
Au moins une amorce du couple ci-dessus défini est choisie pour sa capacité à être présente à une fréquence très faible, inférieure à 1, au sein du génome humain. La fréquence d'apparition de cette amorce dans le génome humain, peut être vérifiée à l'aide de la technique décrite par Griffais et al (Nucl. Acids. Res. 1991, vol. 19 n°14 p 3887-3891) ou dans Meth in Enzymology 1990, vol 183 p 237- Claverie et al. On peut également avoir recours à un programme informatique de recherche disponible sur le marché par exemple le programme FIND de la société GCG Inc, (W Biotechnology Center, 1710 Univ. Avenue, Madison Wisconsin 53705 - USA)
Les amorces dont la définition a été donnée précédemment peuvent aussi être utilisées pour l'amplification de séquences d'ARN correspondant à l'ADN d'un mollicute, à condition d'utiliser des amorces susceptibles d'hybrider avec ledit ARN.
L'"enchaînement correspondant" est la séquence nucleotidique du gène conservé choisie pour définir des amorces, qui peut être alignée avec l'amorce ou sa séquence inverse complémentaire.
Le "fragment correspondant" est un fragment inclu dans 1*"enchaînement correspondant" qui peut être aligné avec le fragment formant la partie 5', la partie centrale ou la partie 3' de l'amorce, ou sa séquence inverse complémentaire. Le terme homologie dont il est question ci-dessus fait référence à l'identité des nucléotides de l'amorce, par rapport aux nucléotides alignés de l'enchaînement du gène conservé choisi du mollicute de référence. Ainsi une homologie égale ou supérieure à 50% avec l'enchaînement nucleotidique dit enchaînement correspondant, signifie qu'au moins la moitié des nucléotides de l'amorce est identique aux nucléotides correspondant lorsqu'on aligne l'amorce avec l'enchaînement correspondant du gène conservé à partir duquel on réalise l'amplification en vue de détecter un mollicute déterminé (mollicute de référence) .
Cette homologie globale avec l'enchaînement correspondant dans le gène ciblé du mollicute de rβiérence, ne suffit pas à définir les amorces du premier groupe, utilisables dans l'invention. En effet il est nécessaire de définir à 1'intérieur même de ces séquences susceptibles de se comporter comme des amorces lors d'une réaction d'amplification, une répartition de l' homologie globale selon un "second niveau" défini par rapport à des segments contenus dans ces amorces. Cette homologie est déterminée par rapport au fragment correspondant de l'enchaînement correspondant dont question ci-dessus du gène conservé à partir duquel sont déterminées ces amorces.
On appelle région variable de l'ADN du gène conservé dont sont dérivées les amorces pour un mollicute, une région dont le taux (pourcentage) de conservation entre différentes séquences correspondantes obtenues chez des mollicutes de genres ou d'espèces distincts, est inférieur à 80%, de préférence inférieur à 50%.
Pour le gène de l'ARN ribosomique 16S, les régions variables ont été définies dans Gutell et al, 1985 Prog. Nucleic Acid Res Mol Biol 32:155-216; Woese et al 1983,Microbol Rev 47:621-669; Neefs et al 1991.
L'expression "amorce dérivée d'un gène", signifie que cette amorce est définie, sélectionnée à partir des données disponibles sur le gène choisi et en particulier sur sa séquence.
Une étape pour la sélection d'une amorce répondant aux caractéristiques précédentes consiste, après avoir choisi un gène conservé de mollicute, à établir une compilation des différentes séquences du gène pour plusieurs mollicutes déterminés et le cas échéant pour d'autres organismes présentant des gènes apparentés, et à sélectionner au sein des régions variables des séquences ainsi alignées, les séquences nucleotidiques répondant aux caractéristiques ci-dessus définies.
L'expression "mollicute de référence" ou "mollicute déterminé" correspond à une espèce particulière de mollicutes, prise à l'intérieur d'un genre, par exemple le genre Mycoplasma ou le genre Spiroplasma ou encore le genre Ureaplasma. Outre cette classification des mollicutes en genres et en espèces, des études phylogenetiques et en particulier celles rapportées par Weisburg et al, ont permis de déterminer 1'existence de certains groupes tels que le groupe de M. pneumoniae, le groupe de M. hominis, le groupe des spiroplasmes, ou le groupe des acholéplasmes auquel appartient Acholeplasma laidlawii.
Pour la mise en oeuvre de l'invention, on a recours aux amorces telles que définies ci-dessus, sous la forme de couples d'amorces.
L'invention vise aussi un autre groupe d'amorces (groupe 2) , susceptibles d'entrer dans la constitution d'un couple d'amorces dont les deux amorces répondent à la définition donnée de la susdite première amorce du premier groupe ci-dessus. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, le mollicute de référence est un mycoplasme susceptible d'être détecté chez l'homme. En particulier ce mycoplasme est M. pirum.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'amorce est définie à partir d'un mollicute de référence choisi parmi M. fermentans, M. hominis, U. urealyticum, M. pneumoniae ou A. laidlawii. Les séquences des mollicutes précédemment cités ont été décrites dans le catalogue des bactéries et des bactériophages diffusé par 1ΑTCC (American Type Culture Collection) dans la I8ème Edition en 1992. Les numéros d'accès à ces souches sont donnés dans ce catalogue et les publications les décrivant sont également données à titre de référence.
Les amorces décrites ci-dessus peuvent être modifiées par allongement ou délétion de certains nucléotides ou remplacement. Par exemple une amorce de l'invention peut être allongée à son extrémité 5' et/ou à son extrémité 3 * , notamment par les nucléotides adjacents à l'enchaînement correspondant du gène conservé à partir duquel elle est définie. En particulier ce gène est le gène de mollicutes transcrit en ARN ribosomique 16S.
Une première amorce préférée selon 1*invention est la séquence MYCPIRP répondant à la formule :
5'TACATGCAAGTCGATCGGAT3'
Une autre amorce préférée selon 1'invention est 1'amorce MYCPIRN répondant à la formule :
5'CATCCTATAGCGGTCCAAAC3 '
L'amorce MYCPIRP est utilisée comme amorce 5', c'est-à-dire à l'extrémité N-terminale du fragment à amplifier et l'amorce MYCPIRN est utilisée comme amorce 3• , c'est-à-dire à 1'extrémité C-terminale du fragment à amplifier. La taille de l'ADN du gène de l'ARN ribosomique 16S de M. pirum à partir duquel sont définies ces amorces est d'environ 173 nucléotides.
La figure 1 représente la position des séquences du gène de l'ARNr 16S de différents mollicutes et permet notamment de localiser les séquences de ce gène correspondant aux amorces MYCPIRP et MYCPIRN de M. pirum entre les positions 52 et 82 pour la première, 207 et 239 pour la seconde. Ces positions sont données par référence à la séquence du gène de l'ARN ribosomique 16S de E.coli (Brosius et al, 1978, PNAS, USA, vol 75, p4801-4805) . De plus la figure 1 représente une compilation avec alignement des séquences pour les différents mollicutes.
Cette compilation permet de définir des séquences nucleotidiques intéressantes dans une utilisation en tant qu'amorce pour une amplification d'un ADN dans un échantillon biologique déterminé. Ainsi l'invention concerne les amorces définies à partir du gène correspondant à l'ARN 16S de mollicutes différents de M. pirum, ces amorces étant dérivées des fragments nucleotidiques de la figure 1 pour chacun des mollicutes, situés entre les positions 52 et 82 d'une part, 207 et 239 d'autre part.
Ces amorces ont la propriété intéressante d'être spécifiques pour la détection de souches bactériennes déterminées ou des groupes phylogenetiques définis. A cet égard, on se reportera avantageusement à la description détaillée donnée dans les exemples.
L'invention se rapporte également à un couple d'amorces caractérisé en ce qu'il comprend une amorce répondant à la définition précédemment donnée et possédant notamment les caractéristiques identifiées par a) (1 et 2) , b) ou c) , et une amorce capable d'hybrider dans des conditions de stringence forte avec un fragment d'ADN ou d'ADNc obtenu à partir d'un gène conservé du mollicute déterminé dit "mollicute de référence". Par "stringence forte" on entend l'hybridation des amorces avec l'ADN de l'échantillon, lorsque cette hybridation est réalisée à 55°C pendant 1 minute dans le tampon "Taq" commercialisé par Amersham.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, les deux amorces du couple dont question ci-dessus répondent à la définition correspondant aux caractéristiques a) 1 et 2 et b) ou c) données précédemment ou à des variantes de ce premier groupe.
De préférence, le couple d'amorces est choisi de telle façon que chacune des amorces est distante de l'autre d'environ 150 à 300 nucléotides.
Un couple d'amorces particulier comprend MYCPIRP et MYCPIRN.
Les amorces particulières selon 1'invention peuvent être utilisées par couples pour la détection de souches ou de familles spécifiques. Ainsi, on a avantageusement recours aux couples d'amorces suivants pour la détection des souches identifiées ci-après :
PENETP: 5' CATGCAAGTCGGACGAAGCA 3' PENETN: 5» AGCATTTCCTCTTCTTACAA 3' pour la détection de M. penetrans
PNEUP: 5' CCTGCAAGGGTTCGTTATTT 3' PNEUN: 5» ATGGTACAGTCAAACTCTAG 3» pour la détection de M. pneumoniae
HOI-ÏIP: 5'-ATACATGCATGTCGAGCGAG-3 ' HOMIN: 5'-CATCTTTTAGTGGCGCCTTAC-3 ' pour la détection de M. hominis
UREUREP: 5'-CGTAAAGTTGCTTATGGACGTCGTT-3• UREUREN: 5'-TTGTGTCTCCTAATCTAACGCTATC-3' pour la détection de U. urealyticum
MYCARGP: 5'-ATGCATGTCGAGCGAGGTTC-3 ' MYCARGN: 5'-TTAGCTGCGTCAGTGAACTC-3' pour la détection de M. arqinini
MYCORAP: 5•-CGTTGTGAAAGGAGCGTTTC-3 ' MYCORAN: 5'-GAAGCATTTCCTCAACTAAC-3 ' pour la détection de M. orale
MYCHYOP: 5'-TAAATTCTAAAAAAGATCGACTAAC-3 ' MYCHYON: 5'-TTCAGTAATTGCTTCTAAATTAACG-3 ' pour la détection de M. hyorhinis
ALAIDLP: 5'-GCTAATACTGGATAGGATGT-3 ' ALAIDLN: 5'-TGGTACCGTCAATTTTTAATTTTTC-3' pour la détection de A. laidlawii
Les amorces UREUREP et UREUREN permettent l'amplification et la détection d'un fragment du gène de 1'uréase. Les amorces MYCHYOP et MYCHYON permettent d'amplifier et de détecter un fragment du gène de la protéine de 115 kDa.
L'invention concerne par ailleurs des séquences nucleotidiques, utilisables notamment comme sondes lorsqu'elles sont marquées, ces séquences étant choisies dans les régions conservées ou variables des mollicutes que l'on cherche à détecter. Ces sondes sont également déterminées par rapport aux amorces utilisées dans les réactions d'amplification ; il s'agit de fragments internes par rapport à ces amorces.
Deux sondes intéressantes dans le cadre de l'invention sont des sondes propres à la détection d'un produit d'amplification du gène de l'ARN ribosomique 16S de M. pirum. Une séquence nucleotidique susceptible d'être utilisée comme sonde dans le cadre de l'invention est caractérisée par les propriétés suivantes : elle comprend au moins 10 nucléotides, de préférence de 25 à 30 nucléotides, elle hybride de façon spécifique dans les conditions suivantes avec la séquence d'ADN amplifiée à partir du gène conservé d'un mollicute de référence, lorsque l'amplificaton est réalisée au moyen de 2 amorces choisies selon l'invention pour un mollicute de référence.
Conditions d'hybridation de la sonde: 42°C en présence d'un tampon d'hybridation contenant notamment 5 X SSC, 5 X solution Denhardt, 0,1% SDS. Par 5X solution Denhardt on entend une solution de base 5 fois concentrée.
De telles séquences peuvent être issues ou dérivées des régions variables ou des régions constantes du mollicute de référence.
Lorsqu'une séquence ainsi constituée est dérivée, c'est-à-dire définie à partir d'une région variable du mollicute de référence, elle s'hybride de façon spécifique, avec l'enchaînement nucleotidique amplifié à partir des deux amorces. On entend par "hybridation spécifique" une hybridation qui a lieu avec un enchaînement nucleotidique du gène du mollicute particulier à partir duquel est définie la séquence et qui n'hybride avec aucun fragment du gène correspondant d'un gène d'un autre mollicute ou d'une bactérie ou d'une cellule eucaryote en particulier qui n'hybride pas avec l'ADN génoiαique humain susceptible d'être présent dans un échantillon biologique.
Pour apprécier la spécificité de l'hybridation, on se place dans les conditions de forte stringence décrites plus haut. Au contraire, les séquences nucleotidiques dérivées des régions constantes d'un mollicute de référence peuvent présenter des homologies avec des enchaînements correspondants d'autres mollicutes ou éventuellement d'autres organismes. Cependant, ces séquences peuvent être utilisées comme sondes dans une réaction spécifique de détection d'un mollicute particulier déterminé, dans la mesure où le fragment que l'on cherche à amplifier à partir des amorces, susceptible d'hybrider avec cette séquence dérivée d'une région constante, aura une taille connue. Lorsque la taille du fragment amplifié correspond à la taille attendue, la présence du mollicute recherché est confirmée.
Des séquences nucleotidiques avantageusement utilisées dans le cadre de l'invention sont les suivantes :
MYCPIRS1 5'CAAATGTACTATCGCATGAGAAACATTT3 ' OU MYCPIRS2 5'GGGTGAGTAACACGTATCCAATCTACC3' . PENETS: 5' CATGAGAAAATGTTTAAAGTCTGTTTG 3' PNEUS: 5' GAAGAATGACTTTAGCAGGTAATGG 3 ' HOMINIS: 5' CGCATGGAACCGCATGGTTCCGTTG 3' UREURES: 5'-CCATCAGGTACTGCTATTCGTTTTGAACC- 3 ' MYCARGS: 5'-TTTTGAACCTAGCGGCGAATGGGTGAGT -3« MYCORAS: 5'-GTCCGCTAAGAGATGAGGGTGCGGAACA -3' MYCHYOS: 5'-AAATTTAATTAGTGAGCAAG-3' ALAIDLS: 5'-TGACCGAGCAACGCCGCGTGAACGACGA -3'
Les séquences décrites ci-dessus peuvent être modifiées par addition, délétion et/ou remplacement de nucléotides. En particulier, ces sondes peuvent être allongées à leur extrémité 5' et/ou à leur extrémité 3' par l'addition d'un ou plusieurs nucléotides, notamment des nucléotides adjacents à la séquence de la sonde, dans l'enchaînement correspondant du gène du mollicute de référence. Ces sondes peuvent le cas échéant être allongées à leur extrémité 5' et/ou à leur extrémité 3' par des nucléotides adjascents dans le fragment correspondant de la région correspondante du gène du mollicute de référence utilisé.
La distance séparant deux amorces choisies peut être connue, soit par référence aux données disponibles sur la séquence du mollicute en question, soit lorsque la séquence n'est pas connue, par référence à des marqueurs de poids moléculaire. En conséquence, un fragment amplifié qui aurait une taille différente de la taille attendue pour l'amplification d'un fragment d'un mollicute de référence, correspondrait à un ADN ou à un ARN d'un autre organisme.
L'invention concerne également une séquence nucleotidique caractérisée en ce qu'il s'agit de l'ADN inverse et complémentaire d'une séquence précédemment définie ou une séquence nucleotidique caractérisée en ce qu'il s'agit d'un ARN inverse et complémentaire d'une séquence définie plus haut.
Un tel ARN inverse et complémentaire est susceptible d'être utilisé comme ARN antisens, le cas échéant pour bloquer la transcription du gène du mollicute de référence utilisé pour la définition des amorces et des séquences ci-dessus ou pour bloquer l'ARN transcrit à partir de ce gène.
L'invention a également pour objet un fragment d'ADN tel qu'obtenu par amplification d'un ADN d'un gène conservé d'un mollicute de référence ou d'un ADNc correspondant, l'amplification étant réalisée au moyen d'un couple d'amorces défini ci-dessus, le fragment d'ADN amplifié hybridant de façon spécifique avec une sonde constituée par une séquence spécifique d'une région variable ou d'une région constante du gène conservé du mollicute de référence, interne par rapport aux positions des 2 amorces.
L'invention vise également un ARN complémentaire et inverse par rapport à l'ADN ci-dessus décrit.
Entre également dans le cadre de 1'invention un kit pour la détection d'un mollicute déterminé dit
"mollicute de référence" dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend : au moins un couple d'amorces dérivées d'un gène conservé d'un mollicute de référence, capables d'hybrider dans des conditions stringentes aux extrémités 5' et 3 ' d'un fragment d'ADN du mollicute de référence, ces 2 amorces étant telles que: a) la première amorce et la deuxième amorce ont chacune les propriétés suivantes :
1) chaque amorce comprend n nucléotides, n ayant une valeur égale ou supérieure à 10, de préférence n étant compris entre 18 et 25,
2) chaque amorce présente une homologie globale égale ou supérieure à 50% avec un enchaînement nucleotidique dit "enchaînement correspondant", d'un gène conservé déterminé d'un mollicute dit "mollicute de référence", ledit "enchaînement correspondant" appartenant à une région variable du gène conservé, cette homologie étant répartie au sein de l'amorce de façon telle que :
o les 2 derniers nucléotides de l'amorce, situés à 1'extrémité 3 • , sont identiques aux nucléotides de 1'enchaînemen correspondant du gène conservé,
o l'homologie des nucléotides de la partie 5' de 1'amorce correspondant à environ un tiers des n nucléotides de l'amorce, est d'au moins 55% de préférence d'au moins 60% avec le fragment correspondant de 1*enchaînement correspondant du gène conservé du mollicute de référence et ;
b) la première amorce étant en outre telle que :
o l'homologie de la partie 3' de l'amorce correspondant à environ un tiers des n nucléotides de l'amorce est, après exclusion des 2 derniers nucléotides de l'extrémité 3' d'au moins 60% avec le fragment correspondant de 1'enchaînement correspondant du gène conservé du mollicute de référence et,
o l'un au moins des 2 nucléotides de son extrémité 3 ' est différent du nucléotide correspondant de la séquence nucleotidique alignée du gène conservé présent chez un autre mollicute susceptible d'être détecté chez l'homme ;
c) la deuxième amorce étant en outre telle que :
o l'homologie de la partie 3' de l'amorce correspondant à environ un tiers des n nucléotides de l'amorce est d'au moins 50% avec le fragment correspondant du gène conservé du mollicute de référence.
les réactifs nécessaires à la polymérisation du fragment d'ADN du mollicute de référence à partir des amorces nucleotidiques, notamment des enzymes de polymérisation en quantité suffisante pour réaliser l'amplification ; - au moins une sonde correspondant à un enchaînement nucleotidique du gène conservé du mollicute de référence, interne par rapport aux amorces. Selon un mode de réalisation préféré du kit, l'amorce appelée "première amorce" est caractérisée s'agissant de la propriété identifiée sous b) , en ce que au moins le dernier nucléotide de son extrémité 3• , de préférence les deux derniers nucléotides de son extrémité 3' est (sont) différent(s) du nucléotide correspondant de la séquence nucleotidique alignée du gène conservé présent chez un autre mollicute (une autre espèce) susceptible d'être détecté chez l'homme.
Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, la première et la deuxième amorces du kit sont en outre caractérisées en ce que au moins le dernier nucléotide de l'extrémité 3' de l'une des première ou deuxième amorces est différent du nucléotide correspondant de la séquence nucleotidique alignée du gène conservé présent chez un autre mollicute (une autre espèce) susceptible d'être détecté chez l'homme, et deux nucléotides supplémentaires répartis parmi les trois derniers nucléotides de 1'extrémité 3 ' de 1'une des amorces ou des deux amorces, sont également différents du nucléotide correspondant de la séquence nucleotidique alignée du gène conservé présent chez un autre mollicute (une autre espèce) susceptible d'être détecté chez l'homme.
Dans un mode de réalisation particulier du kit de l'invention, les deux amorces du couple répondent à la définition donnée pour la susdite première amorce et par conséquent, elles vérifient les propriétés identifiées par a) 1 et 2 et b) .
Par ailleurs il est entendu que ce kit peut contenir les amorces correspondant à la définition des variantes données dans les pages précédentes.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, les amorces peuvent être marquées par un marqueur chimique, physique ou enzymatique et/ou fixées à un support solide, notamment un support particulaire ou membranaire, par exemple des billes magnétiques.
Les sondes mises en oeuvre pour la réalisation du kit de 1•invention peuvent être également marquées à leur extrémité 5• et/ou à leur extrémité 3' par une substance que l'on peut détecter, ou fixées à un support solide.
A titre de marqueur, on peut citer les isotopes radioactifs, les enzymes ou marqueurs chimiques appropriés, les fluorochromes, les haptènes, les anticorps, les analogues de base ou encore des marqueurs physiques.
La fixation à un support peut être faite sur un support solide particulaire ou membranaire, par exemple sur des billes magnétiques.
Un kit particulier selon l'invention est caractérisé en ce que les amorces qu•il contient sont MYCPIRP et MYCPIRN, la sonde étant MYCPIRS1 ou MYCPIRS2 ou les deux à la fois.
D'autres kits particuliers selon l'invention sont définis à l'aide des amorces et sondes spécifiques suivantes, pour détecter les souches indiquées ci- dessous :
1) M. penetrans:
- amorce positive PENETP: 5'-CATGCAAGTCGGACGAAGCA-3'
- amorce négative PENETN: 5'-AGCATTTCCTCTTCTTACAA-3 '
- sonde interne au fragment amplifié PENETS: 5'-CATGAGAAAATGTTTAAAGTCTGï TG-3'
2) M. pneumoniae:
- amorce positive PNEUP:
5'-CCTGCAAGGGTTCGTTATTT-3 '
- amorce négative PNEUN: 5 '-ATGGTACAGTCAAACTCTAG-3 '
- sonde interne PNEUS:
5'-GAAGAATGACTTTAGCAGGTAATGG-3 '
3) M. hominis:
- amorce positive HOMIP:
5 '-ATACATGCATGTCGAGCGAG-3 '
- amorce négative HOMIN:
5'-CATCTTTTAGTGGCGCCTTAC-3 '
- sonde interne HOMINIS:
5'-CGCATGGAACCGCATGGTTCCGTTG-3 '
4) U. urealyticuro:
- amorce positive UREUREP:
5 '-CGTAAAGTTGCTTATGGACGTCGTT-3 '
- amorce négative UREUREN:
5 '-TTGTGTCTCCTAATCTAACGCTATC-3 '
- sonde oligonucléotidique UREURES: 5 '-CCATCAGGTACTGCTATTCGTTTTGAACC-3 '
5) M. arqinini:
- amorce positive MYCARGP: 5 '-ATGCATGTCGAGCGAGGTTC-3 '
- amorce négative MYCARGN: 5 '-TTAGCTGCGTCAGTGAACTC-3 '
Sonde oligonucléotidique MYCARGS: 5 ι-TTTTGAACCTAGCGGCGAATGGGTGAGT-3 '
6) M. orale:
- amorce positive MYCORAP: 5 '-CGTTGTGAAAGGAGCGTTTC-3 '
- amorce négative MYCORAN: 5'-GAAGCATTTCCTCAACTAAC-3 *
Sonde oligonucléotidique MYCORAS: 5'-GTCCGCTAAGAGATGAGGGTGCGGAACA -3 '
7) M. hyorhinis:
- amorce positive MYCHYOP:
5 '-TAAATTCTAAAAAAGATCGACTAAC-3 '
- amorce négative MYCHYON: 5 '-TTCAGTAATTGCTTCTAAATTAACG-3 '
- sonde oligonucléotidique MYCHYOS:
8) M. fermentans:
- amorce positive MYCFERP: 5 ι-TTTTCGCATGAAGATTACGG-3 '
- amorce négative MYCFERN: 5 '-TCAATAGGTACCGTCAAAAC-3 '
- sonde oligonucléotidique MYCFERS: 5'-GAAGCTTTCTTCGCTGGAGGAGCGGGGT-3 '
9) A. laidlawii:
- amorce positive ALAIDLP: 5 »-GCTAATACTGGATAGGATGT-3 '
- amorce négative ALAIDLN:
5 '-TGGTACCGTCAATTTTTAATTTTTC -3 '
- sonde oligonucléotidique ALAIDLS: 5 '-TGACCGAGCAACGCCGCGTGAACGACGA -3 '
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le kit comporte également : un contrôle interne de la réaction d'amplification, constitué par un fragment d'ADN susceptible d'être aisément détecté, par exemple un fragment contenant un gène de résistance à un antibiotique, ce fragment étant différent de l'ADN du mollicute de référence susceptible d'être amplifié à partir de l'échantillon, ce fragment étant en outre muni à chacune de ses extrémités d'une amorce d'amplification ci-dessus décrite ;
- des moyens pour la détection de l'amplification du contrôle interne, par exemple une sonde capable d'hybrider de façon spécifique avec l'ADN contenu dans le contrôle interne.
Avantageusement, un kit selon l'invention peut comporter plusieurs couples d'amorces spécifiques de différents mollicutes et, en particulier, un couple d'amorces spécifique de chacun des mollicutes suivants : M. pirum , M. pneumoniae, M. fer entans, U urealyticum et A. laidlavii. Dans ce cas, le kit comprend également une sonde spécifique de chacun de ces mollicutes.
L'invention a également pour objet un kit répondant à l'une des définitions ci-dessus caractérisé en ce qu'il comprend en outre une réverse-transcriptase pour obtenir de l'ADNc à partir de l'ARN ribosomique 16S présent dans l'échantillon biologique testé.
Un procédé pour la détection d'une infection par un mollicute ou plusieurs mollicutes déterminés en particulier de l'espèce M. pirum ou plusieurs mollicutes déterminés, sur un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : a) mise en contact de l'acide nucléique de l'échantillon biologique testé, si nécessaire dans des conditions permettant l'accessibilité sous forme d'ADN simple brin, avec au moins un couple d'amorces nucleotidiques ci-dessus décrit, lesdites amorces pouvant hybrider avec l'acide nucléique des mollicutes spécifiques recherchés s'ils sont présents, et initier la synthèse du produit d'élongation desdites amorces, chaque brin d'ADN de mollicutes servant de matrice lorsqu'il est apparié avec les amorces ; b) séparation des brins d'ADN synthétisés, de leur matrice ; c) répétition de la synthèse de produit d'élongation, à partir de chaque brin d'ADN présent à l'issue de l'étape b) et susceptible d*hybrider avec les amorces, jusqu'à obtention d'une amplification de l'ADN recherché, suffisante pour être détectée, d) mise en contact du produit de l'étape c) avec une sonde nucleotidique dans des conditions permettant de détecter spécifiquement la présence du fragment d'ADN amplifié recherché ; e) détection des produits de l'hybridation éventuellement formés et comparaison de la taille de ces produits avec la taille du fragment d'ADN du mollicute de référence, situé entre les 2 amorces.
Les techniques d'amplifications utilisables comportent par exemple, la technique PCR (Polymerase Reaction Chain) décrite dans les demandes de brevet européen de CETUS (n° 0200363, 0201184, et 0229701), ou encore la technique de "Qβ replicase" décrite dans Boitechnology (vol.6, octobre 1988). D'autres techniques sont la "LCR"( ligase chain reaction) , la "3SR"( self sustained séquence replication) , "Ampliprobe" ( amplification à partir de l'ARN). Ces techniques sont décrites dans J of Virological methods, 1991, 35,117-126.
Selon un mode de réalisation particulier de ce procédé, la mise en contact de l'échantillon biologique testé est précédée d'une étape de traitement de l'échantillon de façon à en extraire l'acide nucléique.
Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, ce procédé est caractérisé en ce que préalablement à la mise en contact avec les amorces, o traite l'acide nucléique de l'échantillon avec une réverse-transcriptase, pour obtenir la synthèse d'ADNc à partir de l'ARN éventuellement présent dans l'échantillon testé.Il est poss le de réaliser le procédé selon 1'invention égale, ^nt en mettant en oeuvre les amorces en même temps que la réverse transcriptase.
Différents échantillons peuvent être utilisés pour la mise en oeuvre de 1'invention et avantageusement on ne procédera pas à une culture de l'échantillon préalablement à l'opération de détection d'un mollicute. En effet, la sensibilité des moyens définis pour cette détection permet la réalisation de l'invention sur des tissus ou autres échantillons sans culture préalable. Ainsi, on pourra utiliser comme échantillons des tissus humains ou animaux, ou encore des lignées cellulaires utilisées par exemple en laboratoire, afin de détecter une infection ou une contamination par un mollicute ou plusieurs mollicutes déterminés.
L'invention permet l'amplification, à partir des amorces, de l'ADN génomique de mollicutes contenus dans les échantillons testés, après extraction de cet ADN ou au contraire directement sans extraction préalable, par PCR "in situ".
L'invention vise en particulier la détection chez un patient infecté par un rétrovirus HIV, d'une infection par un ou plusieurs mollicutes et en particulier mycoplasmes déterminés.
Les amorces et autres séquences de 1'invention peuvent être obtenues par toute technique appropriée notamment par synthèse chimique.
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 : alignement des séquences d'ADN ribosomique 16S de M. pirum et d'espèces représentatives de mollicutes et de bactéries. Les nombres indiquent les positions nucleotidiques par rapport à la séquence du rDNA 16S d'E.coli (Brosius et coll. 1978) . Les astérisques indiquent les nucléotides conservés. Les séquences (directes ou complémentaires selon les cas) des oligonucléotides MYCPIRP, MYCPIRN, MYCPIRS1 et MYCPIRS2) sont soulignées. Figure 2 : hybridations avec la sonde MYCPIRS1 (A) ou MYCPIRS2 (B) des produits de PCR, après electrophorèse et transfert sur membrane. Piste 1 : M. mycoides, piste : S. citri, piste 3 : M. mûris, piste 4 : M. iovae, piste 5 : M. génitalium, piste 6 : M. pneumoniae, piste 7 : M. allisepticum, piste 8 : U. urealyticum, et piste 9 : M. pirum 70-159. La PCR a été effectuée à partir de 100 fg d'ADN pour M. pirum, et à partir de 10 ng d'ADN pour les autres mollicutes.
Figure 3 : hybridations avec la sonde MYCPIRS1 des produits de PCR, après electrophorèse et transfert sur membrane. Piste l : M. hominis, piste 2 : M. orale, piste 3 : M. arginini, piste 4 : M. fermentans, piste 5 : M. hyorhinis, piste 6 : A. laidlawii, piste 7 : C. innocuum, piste 8 : M. pirum 70-159, piste 9 : M. pirum BER, piste 10 : C. ramosum, piste 11 : B. subtilis, piste 12 : E.coli, piste 13 : M. pirum NOU, piste 14 : M. pirum VUC. La PCR a été effectuée à partir de 100 fg d'ADN pour M. pirum, et à partir de 10 ng d'ADN pour les autres bactéries.
Figure 4 : electrophorèse sur gel de polyacrylamide des produits de PCR à partir de l'ADN génomique de M. pirum.
Pistes 2 à 8 : dilutions de l'ADN de M. pirum de 10 en
10 de 1 ng à 1 fg, en l'absence de PBMCs.
Pistes 10 à 15 et 17 : dilutions de l'ADN de M. pirum de 10 en 10 de 1 ng à 1 fg, en présence d'ADN de PBMCs.
Piste 9 : contrôle H20.
Piste 18 : contrôle d'ADN de PBMCs seul (1 μg) .
Pistes 1 et 16 : marqueur V (Boehringer Mannheim) .
Figure 5 : hybridations avec la sonde MYCPIRS1 des produits de PCR effectuée à partir de l'ADN génomique de M. pirum. Pistes 1 à 7 : dilutions de l'ADN de M. pirum de 10 en
10 de 1 ng à 1 fg.
Piste 8 : l'ADN de M. pirum est remplacé par de l'eau.
A : en l'absence d'ADN de PBMCs.
B : en présence de 1 μg d'ADN de PBMCs.
Figure 6 : détection de M. pirum dans des surnageants de cultures de la lignée 8E5 (Folks et al, 1986, J. exp. Med. Vol. JL64 Juillet 86, 280-290).
Piste 1 à 5 : différents sous-clones de la lignée.
Piste 6 : M. pirum (10 pg) .
A : avant traitement par des antibiotiques (gel d'agarose et hybridation avec MYCPIRS1) .
B : après traitement (hybridation avec MYCPRIS1) .
Figure 7 : Amorces pour le diagnostic de M. penetrans: étude de la sensibilité.
Pistes 2 à 8 et 10 à 16: PCR sur dilution de M. penetrans de 10 en 10 de lfg (1 génome) à lng (106 génomes), en l'absence (piste 2 à 8) ou en présence (pistes 10 à 16) de 1 μg d'ADN de PMBCs avec les amorces PENETP et PENETN. Piste 7: contrôle négatif (eau distillée stérile). Piste 9: PCR effectuée sur 1 μg d'ADN de PBMCs. Les produits de PCR ont été soumis à electrophorèse, transférés sur membrane de nylon et hybrides avec la sonde interne au fragment amplifié PENETS.
Figure 8 : Amorces pour le diagnostic de M. penetrans: étude de la spécificité.
Pistes 1 et 24: PCR à partir de 100 fg d'ADN (100 génomes) de M. penetrans. Pistes 3 à 22: PCR à partir de 10 ng (107 génomes) des mycoplasmes suivants: M. gallisepticum, M. pirum, M. pneumoniae, M. génitalium, M. iowae, M. mûris, U. urealyticu , M. hyorhinis, M. arginini, M. orale, M. hominis, M. fermentans, M. mycoides, M. capricolum, S. citri, A. laidlawii, C. innocuum, C. ramosum, B. subtilis et E. coli. Pistes 2 et 23: contrôles négatifs (eau distillée stérile).
Figure 9 : Amorces pour le diagnostic de M. pneumoniae: étude de la sensibilité.
Pistes 1 à 6 et 8 à 13: PCR sur dilution de M. pneumoniae de 10 en 10 de 100 pg (105 génomes) à 1 fg (1 génome), en l'absence (pistes 1 à 6) ou en présence (pistes 8 à 13) de 1 μg d'ADN de PBMCs avec les amorces PNEUP et PNEUN. Piste 7: contrôle négatif (eau distillée stérile). Piste 14: PCR effectuée sur 1 μg d'ADN de PBMCs. Les produits de PCR ont été soumis à electrophorèse, transférés sur membrane de nylon et hybrides avec la sonde interne au fragment amplifié PNEUS.
Figure 10 : Amorces pour le diagnostic de M. hominis: étude de la sensibilité.
Pistes 2 à 8' etlO à 17: PCR sur dilutions de M. hominis de 10 en 10 de 10 ng (107 génomes) à 1 fg (1 génome), en l'absence (pistes 2 à 8') ou en présence (pistes 10 à 17) de 1 μg d'ADN de PBMCs avec les amorces HOMIP et HOMIN. Piste 1: contrôle négatif (eau distillée stérile) . Piste 9: PCR effectuée sur 1 μg d'ADN de PBMCs. Les produits de PCR ont été soumis à electrophorèse, transférés sur membrane de nylon et hybrides avec la sonde interne au fragment amplifié HOMIS. E X E M P L E S
Exemple 1 : Amorces pour la détection de M. pirum
MATERIELS ET METHODES
Souches bactériennes
M. mycoides PG1 (ATCC 10114), M. hominis PG21 (ATCC 23114), M. arqinini G230 (ATCC23838) , M. orale CH19299 (ATCC 23714) , M. hyorhinis BS7 (ATCC 17981) , M. pirum 70-159 (ATCC 25960) , M. pneumoniae FH (ATCC 15531) , M. génitalium G37 (ATCC 33530) M. fermentans PG18 (ATCC 19989) , M. penetrans GTU-54-6A1 (ATCC 55252) , Ureaplasma urealyticum 960 (NCTC 10177) , M. arthritidis MY5121TR, M. agalactiae PG2 (ATCC 10123), M. pulmonis My 5031, M. salivarium PG20 (ATCC 23064), M. mûris RIII4 (ATCC 33757) et Acholesplasma laidlawii PG8 (ATCC 23206) , les souches de référence connues sous la dénomination Escherichia coli K12 et Bacillus subtilis 168.Trois souches cliniques supplémentaires de M. pirum (souches BER, NOU, et VUC) et une souche clinique de M. fermentans (souche AOU) ont été isolées au laboratoire chez des patients atteints de SIDA.
Les ADNs de M. mûris RIII4 (ATCC 33757) , Spiroplasma citri R8A2 (ATCC 27556), M. capricolum Cal. Kid (ATCC 27343), Clostridium innocuum B-3 (ATCC 14501) et C. ramosum 113-1 (ATCC 25582) , M. gallisepticum PG31 (ATCC 19610) et M. iowae 695 (ATCC 33552) ont été utilisés.
Les étapes principales de la réalisation d'une amplification par PCR sont données ci-dessous.
EXTRACTIONS D'ADN L'ADN a été extrait de cellules ononucléées du sang périphérique (PBMC) , préparées à partir de sang veineux héparinisé dans un gradient de Ficoll et a également été extrait de cultures cellulaires selon la méthode suivante :
Pour chaque patient on utilise 2 x 10 ml de sang sur HL.
On centrifuge les tubes quelques secondes à 1800 rpm pour faire tomber les gouttes puis les échantillons contenant 2 x (10 ml sur 5 ml de Ficoll ) sont centrifugés 30 minutes à 1800 rpm à 4°C. On sépare ainsi le plasma, les hématies et les lymphocytes. On récupère la bande correspondant aux lymphocytes (4 tubes SafelockR de 2 ml) et également des échantillons de 2 ml de plasma (dans un tube SafelockR de 2 ml) . Ces échantillons sont centrifugés 30 minutes à 20000 g à 4°C. On enlève le surnageant et on lave le culot de centrifugation avec du PBS (tampon phosphate salin) avec prélèvement du surnageant et sédimentation des cellules du culot à 20000 g après chaque lavage. La centrifugation à 20000 g permet la sédimentation des mycoplasmes qui ont éventuellement adhéré aux cellules eucaryotes. Les culots de centrifugation sont conservés à -20°C.
Extraction de l'ADN des culots lymphocytaires
Pour chaque patient, r partir d'un tube de culot lymphocytaire, on effectue .. as étapes suivantes :
On additionne 50 μl de protéinase K (pK) à 20 mg/ml à 5 ml de tampon de lyse ( Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA ImM, SDS 1%). _ On additionne 500 μl, de préférence 400 μl, de tampon de lyse à chaque culot;
On resuspend les cellules doucement avec les pipettes souples à usage unique. Le culot reste compact. Prendre garde à ne pas éclabousser du liquide qui pourrait contaminer les autres tubes.
On fait incuber la nuit à 37βC au bain marie. _ On réalise une extraction au phénol, une extraction au chlorophorme, puis on ajoute de la RNase pancréatique DNase-free (Boehringer Mannheim Biochemica) à 20μg/ml. _ On incube 1H à 37"C pour hydrolyser les ARNs.
On réalise une extraction au phénol, une extraction au chlorophorme et une précipitation dans 2 volumes d'éthanol absolu en présence de NaCl 0,1M. Pour précipiter l'ADN du plasma ou des surnageants de cellules et des hématies, additionner 1 μl de glycogène lors de la précipitation par l'éthanol.
On précipite une nuit à - 20°C puis centrifugation 15 minutes à 15000 g. Oter le surnageant.
On effectue un lavage à l'éthanol 70%. Vortexer doucement et décrocher le culot. Centrifuger à 15000 g. Oter le surnageant. S'il reste trop d'éthanol au fond du tube, sécher quelques dizaines de minutes les tubes ouverts sous la hotte à flux laminaire.
On ajoute 100 μl d'eau.
On agite avec un appareil Vortex doucement pour resuspendre l'ADN. On vérifie que le culot est bien dissous. Au besoin, resuspendre à la P50 ou P250.
On prélevé 5 μl et on les met dans 500 μl d'eau, pour prendre la DO à 260 nm dans un spectrophomètre. Prélever 5 μl dans un autre tube, pour dosage sur gel d'agarose par migration à coté d'une quantité connue d'un marqueur de poids moléculaire. Précautions PCR :
Eau, NaCl, glycogène, solution de lyse et proteinase K doivent être aliquotés. Tous les tubes entamés sont jetés en fin de manipulation. Prélever la quantité de phénol, de chlorophorme, d'éthanol absolu et d'éthanol 70% nécessaire pour la manipulation dans un tube en polyallomère, qui est jeté en fin de manipulation. Toute poche de tubes Safelock" entamée est jetée en fin de manipulation.
Préparations des échantillons
On prépare 200 μl d'ADN à 1 μg/10 μl et 200 μl d'ADN à 10 ng/10 μl (deux quantités d'ADN lμg et 10 ng) .
On aliquote 10 tubes avec 12 μl, pour chacune des deux concentrations.
L'eau distillée stérile qui a servi à faire les dilutions est conservée dans un tube et constituera le témoin "eau" de la réaction de PCR (tube n° 1 de la réaction de PCR) (voir "Réaction de PCR").
Pour les réactions de PCR, 10 μl d'ADN sont ajoutés au mélange réactionnel (voir "Réaction de PCR") .
REACTION DE PCR
La réaction est réalisée dans un volume de 50 μl, constitué de 40 μl de "mix" auquel on a ajouté la Taq DNA polymérase (Amersha Intern- ional pic) , et de 10 μl d'ADN.
Au-dessus, il y a 50 μl d'huile minérale (pour limiter 1'évaporation et les contaminations). Le volume réactionnel contient : le DNA à amplifier ; les 4 dNTPs à 200 μM chacun ; les 2 amorces à 0,4 μM chacune (20 pmoles) ; le tampon Taq ;
H20.
I - Réactifs
1-1 Préparation des dNTPs à 10 mM
Un stock de dNTPs à 10 mM est préparé à partir de la solution-mère à 100 mM.
Précautions "PCR" :
La solution-mère à 100 mM de chacun des dNTPs est aliquotée en tubes de 100 μl.
Le stock de dNTPs à 10 mM est préparé en ajoutant 900 μl d'eau aux 100 μl de solution-mère. Il est aliquoté en tubes de 250 μl.
1-2 Préparation des amorces à 20 μM
Resuspendre l'oligo dans 200 μl d'eau. Lire La DO à 260 mm après avoir fait une dilution au l/1000e. Calculer la concentration c de l'oligo en réalisant le calcul :
DO260 x 33 x dilution pour lecture DO x 1000 c = (μM)
longueur oligo x 300
33 est la quantité en μg d'ADN pour une DO de 1 330 est la masse moyenne d'un nucléotide
Calculer le volume v, quantité d'oligo à ajouter dans un volume final de 1 ml :
1000 x 20 v = (en μl )
c
H20 = 1000 - v (en μl)
La concentration ainsi obtenue est de 20 μM.
Précautions "PCR" :
Une dizaine de tubes contenant le volume v sont préparés à partir de la solution-mère et conservés à -20°C. Il restera à ajouter le volume 1000-v d'eau pour obtenir la solution-stock à 20 μM.
La solution-stock à 20 μM est eile-même aliqotée par 250 μl.
1-3 Tampon PCR (concentrations finales)
10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM Kcl, 1,5 mM MgCl2, 100 μg/ml gélatine.
1-4 Préparation du mix
Préparer 8 ml de mix :
dNTPs 10 mM : 200 μl de chaque, soit 800 μl amorces 20 μM : 200 μl de chaque, soit 400 μl 10X Taq : 1000 μl
(le volume final est de 10 ml, car il faut tenir compte de 1•échantillon)
H20 : 5800 μl
TOTAL 8000 μl
Précautions "PCR" :
Le mix est aliquoté par tubes de 1 ml.
Les deux amorces utilisées sont désignées par MYCPIRP et MYCPIRN. Pour une série correspondant à n prélèvements les échantillons seront donc les suivants :
tube n' 1 : témoin "eau" correspondant à la dilution du DNA . tube n° 2 : témoin "solution de lyse" . tubes n° 3 à 2n+2 : échantillons d'ADN de la série. tubes n° 2n+3 : témoin "solution de lyse" . tubes n° 2n+4 : témoin "eau" correspondant à la manipulation présente.
Par conséquent pour un nombre donné de réactions de PCR à faire, on a réalisé l'étape suivante :
Prélever la quantité de mix nécessaire, en prévoyant quelques réactions en plus (à titre d'exemple, pour 20 réactions, prévoir pour 24 réactions, soit 960 μl de mix) .
Additionner la Taq à raison de 1,5 U/réaction (par exemple pour 8 sujets à tester et 2 concentrations d'ADN il faut additionner 7,2 μl de Taq à 5U/μl) . Mélanger doucement à la pipette.
Aliquoter 50 μl d'huile minérale par micro-tube de 500 μl (on peut utiliser la même pointe) .
Aliquoter 40 μl de mix par tube, en versant sur le côté du tube (on peut utiliser la même pointe) . Centrifuger quelques secondes pour faire passer le mix sous l'huile.
Additionner les 10 μl d'ADN, d'eau ou de solution de lyse sous l'huile. Centrifuger quelques secondes pour éliminer d'éventuelles bulles.
Placer dans 1'appareil à PCR et démarrer les cycles. Avant la réaction de PCR, les échantillons ont été dénaturés à 95°C pendant 3 minutes, l'amplification est constituée de 35 cycles. Chaque cycle consiste en une étape de dénaturâtion à 94°C pendant 1 minute, une étape d'hybridation des amorces (primers) à 55°C pendant 1 minute et une étape d'allongement à partir de l'amorce et de la matrice à 72"C pendant 2 minutes et 30 secondes.
Les aliquots (17 μl) de chaque échantillon amplifié ont été analysés sur un gel de polyacrylamide à 8% dans un tampon lx Tris-acétate-EDTA. Les gels ont été colorés avec du bromure d'ethydiu et l'ADN a été visualisé par fluorescence en UV.
L'observation d'un ensemble de protocoles stricts, incluant l'aliquotage des réactifs, l'utilisation de pipettes à déplacement positif, l'isolement physique pour les étapes de préparation des réactifs de PCR et de produits de PCR , la séparation du local d'extraction d'ADN et du local de cultures de mycoplasmes, le choix judicieux des contrôles positif et négatif, permet d'éviter complètement tout résultat faux positif avec la PCR.
ANALYSE EN HYBRIDATION SOUTHERN
L'ADN (17 μl de la réaction de PCR) a été analysé par electrophorèse sur un gel d'agarose à 1,5% et transféré sur une membrane de nylon (Hybond N+ Amersham International pic) , selon la technique de transfert alcalin (Reed et al, 1985, Nucleic Acids Res. 3,2:7207-7221). Après le transfert, les filtres ont été séchés à l'air pendant 1 heure et la fixation de l'ADN a été réalisée par irradiation UV pendant 3 minutes. La préhybridation a été effectuée dans une solution contenant 5 x SSC, 5 x de solution Denhardt, 0,1% de SDS et 200 μg ou (10 mg/ml d'ADN) de sperme de saumon dénaturé, à 42°C pendant 2 heures. L'hybridation a été réalisée pendant la nuit à la même température dans le même mélange, mais en ajoutant une des deux sondes oligonucléotidiques MYCPIRS1 et MYCPIRS2, marquée en 5' avec (7 "32P)ATP et la kinase polynucléotide T4 (United States Biochemical Corp.) et purifiée par chromatographie sur une colonne sephadex (Pharmacia LKB Biotechnology) . Après hybridation, les membranes ont été lavées 2 fois pendant 15 minutes à température ambiante dans 2 x SSC, 1% SDS, 2 fois pendant 10 minutes à 55"C dans 0,2 SSC, 0,1% SDS, puis rincées rapidement dans 2 x SSC à température ambiante. Les signaux d'hybridation ont été visualisés par autoradiographie sur film photographique.
RESULTATS
Définition des amorces et des sondes oligonucléo¬ tidiques
Les amorces MYCPIRP et MYCPRIN ont été élaborées à partir de la séquence d'ADNr (ADN ribosomal) 16S de M. pirum) (Weisburg et al, 1989, J. Bacteriol. 171:6455-6467) . L'une des principales propriétés des molécules d'ARN ribosomal, en dehors de leurs fonctions hautement conservées, réside dans la présence de séquences hautement conservées, alternant avec des régions plus variables (Woese et al, 1983, Microbiol. Rev. ^7_:621-669) . Les séquences conservées peuvent être utilisées pour détecter un groupe d'organismes (Lane et al, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. .82:6955-6959 ; Weisburg et al, 1991, J. Bacteriol. 173:697-703 ; Blanchard et al, 1991, FEMS Microbiol. Lett. 81:37-42 ; Deng et al, 1992, PCR Methods and Applications 1^:202-204) . Au contraire les régions variables peuvent être utilisées pour détecter de façon spécifique un organisme donné. Pour examiner la spécificité d'amorces éventuelles on a analysé les séquences d'ADNr de différents mollicutes (Weisburg et al, 1989) la séquence d'ADN ribosomal de bactéries gram-positives phylogénétiquement apparentées aux mollicutes (C. innocuum, C. ramosum et B. subtilis) ainsi que la séquence de E.coli. La figure 1 présente l'alignement d'une partie des ADNr des sous-unités 16S (correspondant aux nucléotides 49 à 233, en s'appuyant sur la numérotation de l'ADNr de la sous-unité 16S de E.coli (Brosius et al, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7_5:4801-4805) ) , de tous les mollicutes appartenant au même groupe phylogénétique que M. pirum et désigné par Weisburg comme étant le "groupe M. pneumoniae" (Weisburg et al, 1989 précités) (c'est-à-dire M. pneumoniae, M. pirum, M. mûris, M. qallisepticum, M. iowae et U. urealyticum) . On a également étudié sur la même base l'ADNr de mollicutes contaminant l'homme ou des cultures cellulaires, appartenant au groupe désigné par Weisburg par l'expression "groupe M. hominis" (c'est-à-dire M. hominis, M. hyorhinis, M. fermentans, M. orale et M. argini) , ainsi que deux mollicutes appartenant au "groupe des spiroplasmes" selon Weisburg (c'est-à-dire S. citri et M. mycoides) , de A. laidllawii, mollicute appartenant au "groupe des acholeplasmes" et de C. innocuum, C. ramosum, B. subtilis et E.coli.
L'objectif étant la détection spécifique de M. pirum dans des tissus animaux ou humains, ce qui signifie la détection d'un événement rare dans un environnement d'ADN animal ou humain, les amorces ont été définies pour parvenir à la meilleure sensibilité dans un tel environnement. Ceci est notamment nécessaire lorsqu'il s'agit de détecter M. pirum dans le sang, tissu connu pour contenir des inhibiteurs de la réaction de PCR tels que l'hémoglobine. La meilleure sensibilité est obtenue lorsque l'ADN humain n'est pas amplifié avec les amorces utilisées, c'est-à-dire lorsqu'aucune bande additionnelle (due à l'amplification non spécifique de l'ADN humain) apparaît sur le gel après coloration avec le bromure d'ethydium. Par conséquent on a recherché des amorces dont la séquence correspond à des enchaînements nucleotidiques présents avec une fréquence faible dans le génome humain. De telles amorces ont été déterminées à partir d'octamères constituées par un nucléotide choisi initialement et les 7 nucléotides le précédant dans la séquence de M. pirum.
Deux amorces MYCPIRP et MYCPIRN répondant respectivement aux séquences suivantes : MYCPIRP :
5'TACATGCAAGTCGATCGGAT3 ' MYCPIRN :
5»CATCCTATAGCGGTCCAAAC3 ' ont été choisies dans les régions de l'ADN ribosomal de la sous-unité 16S contenant les régions variables V6 pour la première amorce et Vil' pour la dernière amorce (Neefs et al, 1991, Nucleic ACid Res. 19:1987-1999). Le premier nucléotide de MYCPIRP correspond à la position 52 de l'ARNr de la sous-unité 16S de E.coli ; le premier nucléotide de MYCPIRN correspond à la position 207 de ce même ARN (Brosius et ai, 1983) .
L'extrémité 3' de ces amorces est spécifique de M. pirum.
Deux oligonucléotides MYCPIRS1 et MYCPIRS2, situés à l'intérieur du fragment amplifié ont été choisis pour réaliser des analyses en Southern. MYCPIRS1 (5»CAAATGTACTATCGCATGAGAAACATTT3 ' , position 182) correspond aux régions variables VIO et VIO' et est spécifique de M. pirum. MYCPIRS2 (5'GGGTGAGTAACACG TATCCAATCTACC3 * , position 110) correspond aux régions conservées 7 et 8 et n'est pas une séquence spécifique de M. pirum (figure l) .
Evaluation de la spécificité du test
Un excès d'ADN génomique (10 ng, c'est-à-dire approximativement 10 millions de génomes) de chaque mollicute appartenant au même groupe phylogénétique que M. pirum (M. pneumoniae, M. génitaliu , M. mûris, M. iovae, M. qallisepticum et U. urealyticum) a été testé avec les amorces MYCPIRP and MYCPIRN et les sondes internes MYCPIRS1 et MYCPIRS2. Aucun signal d'amplification de la taille attendue c'est-à-dire environ 173 nucléotides n'a été détecté soit sur les gels d'agarose colorés avec le bromure d'ethydium, soit après Southern et hybridation avec l'une ou l'autre des sondes (figure 2). Le fait qu'aucun signal d'amplification n'a été obtenu avec MYCPIRS2 montre qu'aucun ADNr de 16S entre les positions 52 et 227 n'est amplifié dans les mollicutes ou dans d'autres bactéries, différents de M. pirum et par conséquent que le couple d'amorces est totalement spécifique. En effet si le couple d'amorces n'avait pas été spécifique l'ADN amplifié de façon non spécifique aurait été détecté par MYCPIRS2 puisque cette sonde correspond à une région hautement conservée. Dans le cas de M. qallisepticum, un signal correspondant à un fragment supérieur à 600 nucléotides en longueur (qui ne peut pas être confondu avec le signal spécifique de 173 nucléotides) a été obtenu avec un excès d'ADN (10 ng) de ce mycoplasme (figure 2) . Le signal obtenu était comparable en intensité avec le signal correspondant à l'amplification de 100 fg (c'est-à-dire 103 génomes) d'ADN de M. pirum. Ce signal peut être expliqué par le fait que l'une des deux amorces est homologue à l'ADNr de la sous-unité 16S de M. qallisepticum. 10 ng d'ADN de mollicutes appartenant à d'autres groupes phylogenetiques ont été testées également, à nouveau sans obtenir de signal d'amplification. Aucun signal d'amplification n'a été obtenu avec 10 ng d'ADN de deux bactéries gram-positives à faible pourcentage en bases G + C, phylogénétiquement très proches des mollicutes, comme par exemple C. innocuum et C. ramosum, ni d'une autre bactérie grain-positive B. subtilis. Les ADN de E.coli et de cellules mononucléées ont également été testées, conduisant à des résultats négatifs (figures 2 et 3 ) .
Evaluation de la sensibilité des tests
Des dilutions de 10 en 10 de l'ADN de M. pirum à des concentrations de 1 ng (c'est-à-dire 106 génomes) à 10 fg (c'est-à-dire 10 génomes) ont donné des signaux positifs après migration sur gel de polyacrylamide ou l'hybridation avec MYCPIRS1 ou MYCPIRS2. La même expérience a été réalisée en présence de 1 μg d'ADN de PBMCs et le même résultat a été obtenu c'est-à-dire que l'on n'a pas constaté de perte de sensibilité (figures 4 et 5) . Cette absence de perte de sensibilité en présence d'ADN de PBMCs résulte du fait que les amorces n'amplifient pas ou très peu l'ADN humain. L'amplification d'ADN humain entrerait en compétition avec l'amplification de l'ADN de mycoplasme, conduisant à une détection moins sensible de M. pirum. Détection de M. pirum dans le sang de macaques infectés expérimentalement
Les moyens décrits ci-dessus permettent d'amplifier et de détecter l'ADN de M. pirum dans les PBMCs de macaques infectés.
Quatre macaques ont été inoculés par voie intraveineuse avec M. pirum. Deux d'entre eux étaient inoculés avec SIV (Simian Immunodeficiency Virus) . Quatre macaques n'étaient pas inoculés avec M. pirum. Deux de ces macaques ont été inoculés avec SIV. On a pu détecter M. pirum chez trois des quatre macaques inoculés avec ce mycoplasme. M. pirum a été détecté chez les deux macaques inoculés avec à la fois M. pirum et SIV et a été détecté chez l'un des deux macaques inoculés avec M. pirum seulement. Comme on l'attendait aucun signal n1 a été produit en réalisant l'expérience sur des macaques qui n'ont pas été inoculés avec M. pirum.
DISCUSSION
La détection des agents pathogènes par la PCR est un outil de diagnostic puissant, à condition d'utiliser des moyens techniques appropriés pour éviter l'obtention de faux positif. La détection de mycoplasmes qu'on utilise dans ces techniques est particulièrement indiquée leur culture étant fastidieuse. L'invention permet pour la première fois d'utiliser des séquences d'ADNr 16S de mollicutes pour la détection spécifique par PCR d'une espèce donnée de mollicutes, montrant ainsi que les séquences ribosomales constituent un outil puissant pour la détection de microorganismes. Un couple d'amorces et deux sondes internes ont été développés pour détecter spécifiquement et avec une forte sensibilité M. pirum par PCR dans des tissus humains. M. pirum a également été détecté dans le sang de macaques expérimentalement infectés avec ce mycoplasme. La détection de M. pirum chez les macaques a réussi malgré le fait que le couple d'amorces a amplifié de l'ADN non spécifique de macaques, donnant des bandes d'amplification sur le gel d'agarose après coloration avec le bromure d'éthidium. Ces produits d'amplification ne sont pas détectés après hybridation avec MYCPIRS1 ou MYCPIRS2 et par conséquent n'affectent pas la spécificité du test mais auraient pu affecter l'efficacité de la réaction spécifique de PCR et ont un peu réduit la sensibilité de la technique. Le fait que M. pirum a malgré tout pu être détecté chez trois des quatre macaques infectés expérimentalement, indique que le système est très sensible même lorsque le test est effectué en présence d'ADN non humain.
Exemple 2 : Amorces pour le diagnostic de M. penetrans, M. pneumoniae et M. hominis.
Des amorces et des sondes oligonucléotidiques pour la détection spécifique par PCR de Mycoplasma penetrans, M. pneumoniae et M. hominis, ont été déterminées à partir des séquences des ADN ribosomiques 16S de ces mycoplasmes (Weisburg et al., 1989, A phylogenetic analysis of the mycoplasmas: basis for their classification. J. Bacteriol. 171:6455-6467).
Pour la détermination d'amorces spécifiques de M. penetrans et de M. pneumoniae, qui appartiennent au même groupe phylogénétique, les ADN ribosomiques 16S suivants ont été alignés (Weisburg et al., 1989): - Groupe phylogénétique de M. pneumoniae: M. penetrans, M. pneumoniae, M. pirum, M. qallisepticum, M. mûris, M. iowae et Ureaplasma urealyticum.
- Groupe phylogénétique de M. hominis: M. hominis et M. hyorhinis.
- Groupe phylogénétique des spiroplasmes: Spiroplasma citri et M. mycoides.
- Groupe phylogénétique des anaéroplasmes: Acholeplasma laidlawii.
- Bactéries à Gram positif phylogénétiquement reliées aux mycoplasmes: Clostridium innocuum, C. ramosum et Bacillus subtilis.
- Bactérie à Gram négatif: Escherichia coli.
Pour la détermination des amorces spécifiques de M. hominis, les ADN ribosomiques 16S suivants ont été alignés:
- Groupe phylogénétique de M. hominis: M. hominis, M. orale, M. salivarium, M. arthritidis, M. arginini, M. lipophilum, M. bovigenitalium, M. californicum, M. fermentans, M. agalactiae, M. pulmonis, M. sualvi, M. mobile, M. neurolyticum, M. hyopneumoniae et M. hyorhinis.
Groupe phylogénétique de M. pneumoniae: M. pneumoniae, M. pirum et U. urealyticum.
- Groupe phylogénétique des spiroplasmes: S. citri et M. mycoides.
Groupe phylogénétique des anaéroplasmes: A. laidlawii.
- Bactérie à Gram positif phylogénétiquement reliée aux mycoplasmes: C. innocuum, C. ramosum et B. subtilis.
- Bactérie à Gram négatif: E. coli.
Pour la détermination de ces amorces, une démarche semblable à celle utilisée pour déterminer les amorces spécifiques de M. pirum a été suivie. Les régions variables des gènes ribosomiques 16S ont été utilisées et des séquences spécifiques du mycoplasme ont été repérées. Parmi ces séquences ont été choisis comme amorces, des oligonucléotides dont l'extrémité 3*OH est rare dans le génome humain, de façon à éviter l'amplification non spécifique de l'ADN génomique humain, et ainsi à augmenter la sensibilité des amorces (Griffais et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19:3887-3891)
Ces amorces étaient les suivantes:
1) M. penetrans:
- amorce positive PENETP: 5' CATGCAAGTCGGACGAAGCA 3'
- amorce négative PENETN: 5' AGCATTTCCTCTTCTTACAA 3 '
- sonde interne au fragment amplifié PENETS: 5' CATGAGAAAATGTTTAAAGTCTGTTTG 3 '
Evaluation de la sensibilité du test:
A partir d'ADN génomique de M. penetrans, un signal d'amplification de la taille attendue (407 paires de bases) a été obtenu après electrophorèse des produits d'amplification et coloration au bromure d'ethydium, ainsi qu'après transfert et hybridation avec la sonde interne PENETS, marquée radioactivement au 32P. Après hybridation, la sensibilité descendait de façon reproductible jusqu'à 10 fg d'ADN (c'est-à-dire 10 génomes) de M. penetrans. La même sensibilité était obtenue en présence de 1 μg d'ADN génomique humain extrait de PBMCs (cellules mononucléées du sang périphérique) (Fig 7) . Evaluation de la spécificité du test:
Aucun signal d'amplification (ni après coloration au bromure d'ethydium ni après hybridation avec PENETS) n'a été obtenu avec un excès d'ADN (10 ng, ie 107 génomes) des mycoplasmes suivants: M. pirum, M. pneumoniae, M. génitalium, M. gallisepticum, M. iowae, M. mûris, U. urealyticum, M. hyorhinis, M. arginini, M. orale, M. hominis, M. fermentans, M. mycoides, M. capricolum, S. citri, A. laidlawii, C. innocuum, C. ramosum, B. subtilis et E. coli (Fig 8) . De plus, aucune amplification a été obtenue (ni après coloration au bromure d'ethydium, ni après hybridation) , à partir de 1 μg de PBMCs humains (Fig 7) .
2) M. pneumoniae:
- amorce positive PNEUP: 5' CCTGCAAGGGTTCGTTATTT 3«
- amorce négative PNEUN:
5' ATGGTACAGTCAAACTCTAG 3'
- sonde interne PNEUS:
5' GAAGAATGACTTTAGCAGGTAATGG 3'
Evaluation de la sensibilité du test:
Un signal d'amplification de 286 paires de bases est obtenu de façon reproductible jusqu'à 10 fg (ie 10 génomes) d'ADN de M. pneumoniae, après transfert et hybridation avec PNEUS et ceci même en présence de 1 μg d'ADN génomique humain extrait de PBMCs (F:' i 9) .
Evaluation de la spécificité du test:
Aucune amplification n'est obtenue (ni après coloration au bromure d'ethydium, ni après hybridation) , à partir de 1 μg de PBMCs humains (Fig 9). Il existe cependant une réaction croisée avec M. qenitalium, ce qui n'est pas étonnant puisqu'il existe 92% d'homologie entre les rDNA16S de M. pneumoniae et M. qenitalium sur la base de résultats publiés par Sasaki et al, 1992, Microbiol. Immunol. vol 36 (1), p21-27) . Ces auteurs n'ont pas publié la portion (80%) du rDNA16S de M. qenitalium qu'ils ont séquence. Celui-ci n'étant pas disponible dans les banques de données, l'alignement de la séquence du rDNA 16S de M. qenitalium n'a pas été possible. Il n'a pas été possible de déterminer des amorces n'amplifiant pas ce gène. 3) M. hominis:
- amorce positive HOMIP: 5' ATACATGCATGTCGAGCGAG 3'
- amorce négative HOMIN:
5' CATCTTTTAGTGGCGCCTTAC 3 •
- sonde interne HOMINIS:
5' CGCATGGAACCGCATGGTTCCGTTG 3 '
Evaluation de la sensibilité:
Un signal d'amplification de 170 pb du fragment du rDNA16S est obtenu jusqu'à 10 fg d'ADN (ie 10 génomes), après transfert et hybridation avec HOMIS. Ceci est vérifié même lorsque la PCR est effectuée en présence de 1 μg d'ADN génomique humain extrait de PBMCs (Fig 10) .
Evaluation de la spécificité du test:
Aucun signal d'amplification (après coloration au bromure d'ethydium ou bien après hybridation avec la sonde HOMIS) n'est obtenu avec un excès d'ADN (10 ng, ie 107 génomes) des mycoplasmes suivant: M. penetrans, M. pirum, M. pneumoniae, M. qenitalium, M. gallisepticum, M. iowae, M. mûris, U. urealyticum, M. hyorhinis, M. arginini, M. orale, M. fermentans, M. mycoides, M. capricolum, S. citri, A. laidlawii, C. innocuum, C. ramosum, B. subtilis et E. coli (non illustré) . De plus, aucune amplification n'est obtenue (ni après coloration au bromure d'ethydium, ni après hybridation) , à partir de 1 μg de PBMCs humains (Fig 10) .
Exemple 3 : Détection par PCR de Mycoplasma hominis et Ureaplasma urealyticum.
I Composition du test :
1- On a mis en oeuvre :
- un test pour la détection spécifique par PCR de Mycoplasma hominis.
Ce test a été effectué à 1'aide : d'un couple d'amorces spécifiques de M. hominis (MYCHOMP et MYCHOMN) , déterminées à partir de la séquence du rRNA 16S.
- d'une sonde oligonucléotidique, MYCHOMS, pour la détection des produits d'amplification obtenus avec MYCHOMP et MYCHOMN (Tableau 1) .
Tableau Amorces et sonde pour la détection spécifique par PCR de M. hominis.
Amorce positive MYCHOMP 5'-ATACATGCATGTCGAGCGAG-3'
Amorce négative MYCHOMP 5'-CATCTTTTAGTGGCGCCTTAC-3 '
Sonde oligonucléotidique 5'-CGCATGGAACCGCATGGTTCCGTTG-3' MYCHOMS
Longueur du fragment 170 paires de bases amplifié
Gène amplifié Fragment du rDNA 16S
2- Un test pour la détection spécifique par PCR d'Ureaplasma urealyticum.
Ce test a été effectué à l'aide : d'un couple d'amorces spécifiques d'Ureaplasma urealyticum. UREUREP et UREUREN) , déterminées à partir de la séquence de l'uréase.
- d'une sonde oliqonucléotidique, UREURES, pour la détection des produits d'amplification obtenus avec UREUREP et UREUREN) (Tableau 2) .
Tableau 2 : Amorces et sonde pour la détection spécifique par urealyticum.
Amorce positive UREUREP 5'-CGTAAAGTTGCTTATGGACGTCGTT-3'
Amorce négative UREUREN 5'-TTGTGTCTCCTAATCTAACGCTATC-3 '
Sonde oligonucléotidique 5'-CCATCAGGTACTGCTATTCGTTTTGAACC-3 UREURES
Longueur du fragment 224 paires de bases amplifié
Gène amplifié Fragment du gène de 1'uréase Les constituants de ce test peuvent être réunis sous la forme d'un kit.
II Conditions expérimentales pour la PCR
a) Composition du mélange (mix) :
Tris-HCl 10 mM
KC1 50 mM
MgCl2 1,5 mM gélatine 100 μg ml*1
Amorce positive : 400 nM
Amorce négative : 400 nM dATP, dTTP, dGTP, dCTP 200 μM chacun
1,5 unités de Taq polymérase (Amersham)
Volume réactionnel : 50 μl.
Le mélange a été recouvert de 50 μl d'huile minérale.
b) Description des cycles :
Les cycles ont été effectués dans un appareil Perkin Elmer Cetus, modèle 480 :
Au départ, 3 min à 95°C
Puis 35 cycles constitués de :
- 1 min à 94°C
- 1 min à 55°C
- 1 min à 72°C
EF fin, 10 min à 72°C
Durée des cycles : 3 heures 15 min environ.
c) analyse des produits de PCR : Un tiers du mélange réactionnel, soit 17 μl, a été déposé sur un gel d'agarose à 1 % et soumis à une electrophorèse.
Le gel a ensuite été transféré sur membrane de nylon (Genescreen+, Du Pont, NEN) selon le protocole de transfert alcalin préconisé par les fournisseurs. La membrane a été pré-hybridée durant 3 h à 37 °C dans la solution suivante :
5XSSC (1XSSC= 0,15 M NaCl, 0,015M citrate de sodium) solution de denhardt 5X (solution de Denhardt 50X=polyvinylpyrrolidone 1%, ficoll 1 %, BSA 1%) SDS 0.1 % ADN de sperme de saumon dénaturé : 200 μg/ml.
Puis la sonde marquée a été ajoutée à la solution de préhybridation et l'hybridation conduite durant 16 h.
Marquage de la sonde :
- oligonucléotide 10 pmoles (picomoles)
- ATP 20 pmoles.
- tampon 10X remis avec la T4 polynucléotide kinase de chez USB
- T4 polynucléotide kinase: 3 u
Le mélange a été laissé à 37°C pendant 30 min, puis à 65°C pendant 10 min.
L'oligonucléotide marqué a été purifié par chromatographie sur colonne de Séphadex (Pharmacia LKB) , puis ajouté à la solution de pré-hybridation.
La membrane a ensuite été lavée à 55°C dans :
- 4 X 5 min dans du 2XSSC, 1%SDS
- 4 X 5 min dans du 0,2XSSC, 0,1%SDS, puis séchée à température ambiante et autoradiographiée. III Extraction de l 'ADN
L'ADN des mollicutes a été extrait selon les techniques classiques. Par exemple, lyse à l'aide d'un détergent (triton X100 ou SDS) et de proteinase K, phénol, chloroforme, RNase A, phénol, chloroforme, précipitation à l'éthanol en présence de NaCl 0,1M et de glycogène qui agissait comme entraineur, lavage à l'éthanol 70 %, séchage et resuspension dans de l'eau stérile. On a utilisé par exemple 10 μl de la suspension obtenue dans la réaction de PCR.
IV Résultats
1- M. hominis
a) Spécificité du test :
Les souches de M. hominis testées étaient les suivantes :
PG25
LBD-4
MY13428
PG21
BS urine
MY13408.
Toutes ont donné un fort signal positif dans le test, de la même intensité, à partir de 1 pg d'ADN. En revanche, aucun signal n'a été obtenu avec un excès d'ADN (10 ng, soit environ 106-107 organismes) avec les mollicutes et autres bactéries suivants : M. orale, M. arginini, M. fermentans, M. hyorhinis, M. pneumoniae, M. pirum, M. penetrans, M. génitalium, M. iowae, M. mûris, M. capricolum, M. mycoides, M. mûris, M. salivarium, M. pulmonis, M. agalactiae, M. californicum, U. urealyticum, Spiroplasma citri, Clostridium innocuum, C. ramosum et Bacillus subtilis. Aucun singal n'était obtenu avec 1 μg d'ADN génomique humain.
b) Sensibilité du test :
On a obtenu un résultat reproductible jusqu'à 10 fg d'ADN, soit environ 10 organismes (ou 1 CFU) , et ceci même en présence de 1 μg d'ADN génomique humain.
2- U. urealyticum
Les souches d'U. urealyticum testées étaient les suivantes :
- 960 (sérotype 8 ; biovar T960)
- 7 (sérotype 1 ; biovar parvo)
- 23 (sérotype 6 ; biovar T960)
- PI (sérotype 6 ; biovar parvo)
Toutes donnaient un fort signal positif dans le test. En revanche, aucun signal n'a été obtenu avec un excès d'ADN (10 ng, soit environ 106-107 organismes) des mollicutes et autres bactéries suivants : M. hominis, M. orale, M. arginini, M. fermentans, M. hyorhinis, M. pneumoniae, M. pirum, M. penetrans, M. qenitalium, M. iowae, M. mûris, M. capricolum, M. mycoides, M. mûris, M. salivarium, M. pulmonis, M. agalactiae, M. californicum, S. citri, C. innocuum, C. ramosum et B. subtilis.
Aucun signal n'était obtenu avec 1 μg d'ADN génomique humain.
b) Sensibilité du test : Des résultats reproductibles ont été obtenus jusqu'à 10 fg d'ADN, soit environ 10 organismes (ou 1 CFU) , et ceci même en présence de 1 μg d'ADN génomique humain.
Exemple 4 : Kit de détection par PCR des cinq mycoplasmes contaminants principaux des cultures cellulaires.
I Composition du test pour l'identification du mycoplasme contaminant :
Ce test est effectué à 1 *aide :
a) de couples d'amorces spécifiques de chacun des cinq mollicutes les plus fréquemment contaminants des cultures cellulaires : M. arginini (MYCARGP et MYCARGN) , M. orale (MYCORAP et MYCORAN) , M. hyorhinis (MYCHYOP et MYCHYON) , M. fermentans (MYCFERP et MYCFERN) et Acholeplas a laidlawii (ALAIDLP et ALAIDLN) (Cf Tableaux 3 à 7) . b) de sondes oligonucléotidiques, MYCARGS, MYCORAS, MYCHYOS , MYCFERS, et ALA JLS, pour la détection des produits d'amplification obtenus à partir de MYCARGP et MYCARGN, MYCORAP et MYCORAN, MYCHYOP et MYCHYON, MYCFERP et MYCFERN, ALADILP et ALAIDLN respectivement (Cf Tableaux 3 à 7) . Les constituants de ces tests peuvent être regroupés dans un kit. Tableau 3 : Amorces spécifiques de M. arginini,
Tableau 4 : Amorces spécifiques de M. orale.
Tableau 5 : Amorces spécifiques de M. hyorhinis.
Tableau 6 : Amorces spécifiques de M. fermentans.
Tableau 7: Amorces spécifiques d'A. laidlawii.
II Conditions expérimentales pour la PCR
a) Composition du mélange (mix) :
Tris-HCl 10 mM
KC1 50 mM
MgCl2 1,5 mM gélatine 100 μg ml"1
Amorce positive 400 nM
Amorce négative 400 nM dATP, dTTP, dGTP, dCTP 200 μM chacun
1,5 unités de Taq polymérase (Amersham)
Volume réactionnel: 50 μl.
Le mélange a été recouvert de 50 μl d'huile minérale.
b) Description des cycles :
Les cycles ont été effectués dans un appareil Perkin Elmer Cetus, modèle 480 :
Au départ, 3 min à 95°C
Puis 35 cycles constitués de - 1 min à 94°C - 1 min à 55"C
- 1 min à 72°C
Enfin, 10 min à 72"C
Durée des cycles : 3 heures 15 min environ.
3) Analyse des produits de PCR :
Un tiers du mélange réactionnel, soit 17 μl, a été déposé sur un gel d'agarose à 1% et soumis à une electrophorèse.
Le gel a ensuite été transféré sur membrane de nylon (Genescreen+, Du Pont, NEN) selon le protocole de transfert alcalin préconisé par les fournisseurs.
La membrane a été pré-hybridée durant 3 h à 37°C dans la solution suivante :
5XSSC (1XSSC= 0,15 M NaCl, 0.015 M citrate de sodium) solution de denhardt 5X (solution de Denhardt 50X=polyvinylpyrolidone 1%, ficoll 1 %, BSA 1%) SDS 0.1 % ADN de sperme de saumon dénaturé : 10 μg/ml.
Puis la sonde marquée a été ajoutée à la solution de prethybridation et l'hybridation conduite durant 16 h.
Marquage de la sonde :
- oligonucléotide 10 pmoles (picomoles)
- ATP 32P 20 pmoles
- tampon 10X remis avec la T4 polynucléotide kinase de chez USB
- T4 polynucléotide kinase : 3u
Le mélange a été laissé à 37"C pendant 30 min, puis à 65"C pendant 10 min. L'oligonucléotide marqué a été purifié par chromatographie sur colonne de Séphadex (Pharmacia LKB) , puis ajouté à la solution de pré-hybridation.
La membrane a ensuite été lavée à 55°C : (4 X 5 min dans du 2XSSC, 1%SDS 4 X 5 min dans du 0,2XSSC, 0,1%SDS) puis séchée à température ambiante et autoradiogréphiée.
III Extraction de l'ADN
Pour détecter les mycoplasmes contaminants des cultures cellulaires, l'un ou l'autre des deux protocoles suivants est conseillé ;
1- Protocole 1 :
les cellules fraîchement récoltées ont été centrifugées à basse vitesse (1500 tours/min)
- 1,5 ml de surnageant a été récupéré dans un tube eppendorf et centrifugé à 20000 g durant 30 min
- l'ADN a été extrait selon les techniques classiques (par exemple, lyse à l'aide d'un détergent (triton X100 ou SDS) et de proteinase K, phénol, chloroforme, RNase A, phénol, chloroforme, précipitation à l'éthanol en présence de NaCl 0,1M et de glycogène qui agit comme entraineur, lavage à l'éthanol 70 % séchage et resuspension dans quelques dizaines de μl d'eau stérile. On a par exemple utilisé 10 μl de la suspension obtenue dans la réaction de PCR.
2- Protocole 2 :
les cellules fraîchement récoltées ont été centrifugées à basse vitesse (1500 tours/min)
- 1,2 ml de surnageant a été récupéré - 300 μl de Triton X100 à 5% dans du tampon phosphate (KH2POA 0,17 M, K2HPOA 0,72M) ont été ajoutés
Le mélange a été laissé au repos 30 min à température ambiante
- 10 μl du mélange ont été testés par PCR.
IV Résultats
a) Spécificité des tests
Pour chacun des couples d'amorces, aucun signal n'était obtenu avec les autres mollicutes ni avec les autres bactéries testées.
Longueur des fragments amplifiés :
- test spécifique de M. arginini : 791 paires de bases
- test spécifique de M. orale : 178 paires de bases
- test spécifique de M. hyorhinis : 265 paires de bases
- test spécifique de M. fermentans
- test spécifique d'A. laidlawii : 132 paires de bases
b) sensibilité des tests
Les résultats étaient reproductibles jusqu'à 10 fg d'ADN, soit environ 10 organismes (ou 1 CFU) , et ceci même en présence de 1 μg d'ADN génomique humain.
L'invention a aussi pour objet les amorces contenues dans les couples d'amorces définis dans les pages ci-dessus.

Claims

R E V E N D I C A T I O N S
1. Couple d'amorces pour l'amplification d'une séquence d'ADN d'un mollicute déterminé, à partir d'un échantillon bioloqique, caractérisé en ce qu'il comprend : a) une première amorce et une deuxième amorce ayant chacune les propriétés suivantes :
1) chaque amorce comprend n nucléotides, n ayant une valeur égale ou supérieure à 10, de préférence n étant compris entre 18 et 25,
2) chaque amorce présente une homologie globale égale ou supérieure à 50% avec un enchaînement nucleotidique dit "enchaînement correspondant", d'un gène conservé déterminé d'un mollicute dit "mollicute de référence", ledit "enchaînement correspondant" appartenant à une région variable du gène conservé, cette homologie étant répartie au sein de l'amorce de façon telle que :
o les 2 derniers nucléotides de l'amorce, situés à 1 •extrémité 3 * , sont identiques aux nucléotides de 1 'enchaînement correspondant du gène conservé,
o l'homologie des nucléotides de la partie 5' de 1 'amorce correspondant à environ un tiers des n nucléotides de l'amorce, est d'au moins 55% de préférence d'au moins 60% avec le fragment correspondant de 1'enchaînement correspondant du gène conservé du mollicute de référence et ;
b) la première amorce étant en outre telle que :
o l'homologie de la partie 3' de l'amorce correspondant à environ un tiers des n nucléotides de l'amorce est, après exclusion des 2 derniers nucléotides de l'extrémité 3' d'au moins 60% avec le fragment correspondant de 1'enchaînement correspondant du gène conservé du mollicute de référence et,
o 1'un au moins des 2 nucléotides de son extrémité 3 ' est différent du nucléotide correspondant de la séquence nucleotidique alignée du gène conservé présent chez un autre mollicute susceptible d'être détecté chez l'homme ;
c) la deuxième amorce étant en outre telle que :
o l'homologie de la partie 3* de l'amorce correspondant à environ un tiers des n nucléotides de l'amorce est d'au moins 50% avec le fragment correspondant du gène conservé du mollicute de référence.
2. Couple d'amorces selon la revendication 1, caractérisé en ce que les amorces vérifient en outre l'une des propriétés suivantes: la première amorce est en outre caractérisée en ce que au moins le dernier nucléotide de son extrémité 3 ' , de préférence les deux derniers nucléotides de son extrémité 3* est (sont) différent(s) du nucléotide correspondant de la séquence nucleotidique alignée du gène conservé présent chez un autre mollicute (une autre espèce) susceptible d'être détecté chez l'homme ou,
- la première et la deuxième amorces sont en o tre caractérisées en ce que au moins le dernier nucléotide de l'extrémité 3' de l'une des première ou deuxième amorces est différent du nucléotide correspondant de la séquence nucleotidique aliqnée du gène conservé présent chez un autre mollicute (une autre espèce) susceptible d'être détecté chez l'homme, et deux nucléotides supplémentaires répartis parmi les trois derniers nucléotides de l'extrémité 3' de l'une des amorces ou des deux amorces, sont également différents du nucléotide correspondant de la séquence nucleotidique alignée du gène conservé présent chez un autre mollicute (une autre espèce) susceptible d'être détecté chez l'homme.
3. Couple d'amorces selon la revendication 1 ou la revendication 2 caractérisé en ce que 1'homologie des nucléotides de la partie centrale d'au moins l'une des amorces correspondant à environ un tiers des n nucléotides de l'amorce, est d'au moins 15% avec le fragment correspondant du gène conservé du mollicute de référence.
4. Couple d'amorces selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les amorces sont dérivées d'une région variable du gène de l'ARN ribosomique 16S d'un mollicute déterminé.
5. Couple d'amorces selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les amorces sont dérivées d'une région variable d'un gène conservé d'un mollicute déterminé, choisi parmi le groupe de M. pneumoniae, le groupe de M. hominis, le groupe de Spiroplasma ou le groupe des anaéroplasmes.
6. Couple d'amorces selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les amorces sont dérivées d'un gène conservé d'un mycoplasme susceptible d'être détecté chez l'homme, en particulier en ce qu'il s'agit de M. pirum.
7. Couple d'amorces selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les amorces sont dérivées d'un gène conservé d'un mollicute de référence choisi parmi M. fermentans, M. hominis, U. urealyticum, M. pneumoniae ou A. laidlawii.
8. Couple d'amorces selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les amorces répondent aux séquences MYCPIRP et MYCPIRN
MYCPIRP : 5'TACATGCAAGTCGATCGGAT3 '
MYCPIRN : 5'CATCCTATAGCGGTCCAAAC3'
9. Couple d'amorces selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend les séquences MYCPIRP de M. pirum constituant 1'amorce 5' et MYCPIRN constituant 1'amorce 3 ' pour la réaction d'amplificatio .
10. Couple d'amorces selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les couples suivants :
PENETP: 5' CATGCAAGTCGGACGAAGCA 3' PENETN: 5' AGCATTTCCTCTTCTTACAA 3'
PNEUP: 5' CCTGCAAGGGTTCGTTATTT 3 ' PNEUN: 5' ATGGTACAGTCAAACTCTAG 3 '
HOMIP: 5' ATACATGCATGTCGAGCGAG 3' HOMIN: 5' CATCTTTTAGTGGCGCCTTAC 3'
UREUREP: 5 -CGTAAAGTTGCTTATGGACGTCGTT -3' UREUREN: 5 -TTGTGTCTCCTAATCTAACGCTATC-3 '
MYCARGP: 5 - ATGCATGTCGAGCGAGGTTC -3' MYCARGN: 5 - TTAGCTGCGTCAGTGAACTC 3 '
MYCORAP: 5 - CGTTGTGAAAGGAGCGTTTC -3' MYCORAN: 5 - GAAGCATTTCCTCAACTAAC -3'
MYCHYOP: 5 - TAAATTCTAAAAAAGATCGACTAAC -3 ' MYCHYON: 5 - TTCAGTAATTGCTTCTAAATTAACG 3'
ALAIDLP: 5»-GCTAATACTGGATAGGATGT-3 ' ALAIDLN: 5'-TGGTACCGTCAATTTTTAATTTTTC -3'
11. Couple d'amorces selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'une au moins des amorces est allongée à son extrémité 5' et/ou à son extrémité 3' , notamment par les nucléotides adjacents à l'enchaînement correspondant du gène conservé du mollicute de référence.
12. Couple d'amorces, caractérisé en ce qu'il comprend l'une des amorces du couple selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 et une amorce capable d'hybrider dans des conditions de stringence forte avec un fragment d'ADN ou d'ADNc obtenu à partir d'un gène conservé du mollicute de référence dit "mollicute de référence".
13. Couple d'amorces selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que ces amorces sont distantes d'environ 150 à environ 300 nucléotides au niveau de l'ADN transcrit en ARN ribosomique 16S du mollicute de référence.
14. Séquence nucleotidique, caractérisée par les propriétés suivantes : elle comprend au moins 18 nucléotides, de préférence de 25 à 30 nucléotides, elle hybride de façon spécifique dans des conditions déterminées avec la séquence d'ADN amplifiée à partir du gène conservé d'un mollicute de référence, lorsque 1'amplificaton est réalisée au moyen de 2 amorces choisies selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 pour un mollicute de référence.
15. Séquence nucleotidique selon la revendication 14 telle qu'obtenue à partir d'une région variable du gène conservé d'un mollicute de référence.
16. Séquence nucleotidique selon la revendication 14 telle qu'obtenue à partir d'une région constante du gène conservé d'un mollicute de référence.
17. Séquence nucleotidique selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisée en ce qu'il s'agit de l'une des séquences répondant aux formules suivantes :
MYCPIRS1 5•CAAATGTACTATCGCATGAGAAACATTT3 • ou MYCPIRS2 5'GGGTGAGTAACACGTATCCAATCTACC3 ' .
18. Séquence nucleotidique selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisée en ce qu'il s'agit de l'une des séquences répondant aux formules suivantes :
PENETS: 5' CATGAGAAAATGTTTAAAGTCTGTTTG 3 ' PNEUS: 5« GAAGAATGACTTTAGCAGGTAATGG 3'
HOMINIS: 5 CGCATGGAACCGCATGGTTCCGTTG 3 '
UREURES: 5 -CCATCAGGTACTGCTATTCGTTTTGAACC- 3 '
MYCARGS: 5 -TTTTGAACCTAGCGGCGAATGGGTGAGT -3 '
MYCORAS: 5 -GTCCGCTAAGAGATGAGGGTGCGGAACA -3 '
MYCHYOS: 5 -AAATTTAATTAGTGAGCAAG-3 '
ALAIDLS: 5 -TGACCGAGCAACGCCGCGTGAACGACGA -3 '
19. Séquence nucleotidique, caractérisée en ce qu'il s'agit de l'ADN inverse et complémentaire d'une séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 18.
20. Séquence nucleotidique, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un fragment ARN inverse et complémentaire d'une séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 18.
21. Fragment d'ADN tel qu'obtenu par amplification d'un ADN d'un gène conservé d'un mollicute déterminé dit "mollicute de référence" ou d'un ADNc correspondant, l'amplification étant réalisée au moyen d'un couple d'amorces selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, le fragment d'ADN amplifié hybridant de façon spécifique avec une sonde constituée par une séquence spécifique d'une région variable du gène conservé du mollicute de référence, interne par rapport aux positions des 2 amorces.
22. ARN inverse et complémentaire de l'ADN selon la revendication 21.
23. Kit pour la détection d'un mollicute déterminé dit "mollicute de référence" dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend : au moins un couple d'amorces dérivées d'un gène conservé d'un mollicute de référence, capables d'hybrider dans des conditions de forte stringence aux extrémités 5' et 3' d'un fragment d'ADN du mollicute de référence, ces amorces étant telles que a) la première amorce et la deuxième amorce ont chacune les propriétés suivantes :
1) chaque amorce comprend n nucléotides, n ayant une valeur égale ou supérieure à 10, de préférence n étant compris entre 18 et 25,
2) chaque amorce présente une homologie globale égale ou supérieure à 50% avec un enchaînement nucleotidique dit "enchaînement correspondant", d'un gène conservé déterminé d'un mollicute dit "mollicute de référence", ledit "enchaînement correspondant" appartenant à une région variable du gène conservé, cette homologie étant répartie au sein de l'amorce de façon telle que :
o les 2 derniers nucléotides de l'amorce, situés à 1'extrémité 3 ' , sont identiques aux nucléotides de 1'enchaînement correspondant du gène conservé, o 1'homologie des nucléotides de la partie 5' de 1'amorce correspondant à environ un tiers des n nucléotides de l'amorce, est d'au moins 55% de préférence d'au moins 60% avec le fragment correspondant de 1'enchaînement correspondant du gène conservé du mollicute de référence et ;
b) là"première amorce étant en outre telle que :
o 1'homologie de la partie 3' de l'amorce correspondant à environ un tiers des n nucléotides de l'amorce est, après exclusion des 2 derniers nucléotides de l'extrémité 3' d'au moins 60% avec le fragment correspondant de 1'enchaînement correspondant du gène conservé du mollicute de référence et,
o l'un au moins des 2 nucléotides de son extrémité 3 ' est différent du nucléotide correspondant de la séquence nucleotidique alignée du gène conservé présent chez un autre mollicute susceptible d'être détecté chez l'homme ;
c) la deuxième amorce étant en outre telle que :
o l'homologie de la partie 3' de l'amorce correspondant à environ un tiers des n nucléotides de l'amorce est d'au moins 50% avec le fragment correspondant du gène conservé du mollicute de référence.
24. Kit selon la revendication 23 caractérisé en ce les amorces vérifient en outre l'une des propriétés suivantes: la première amorce est en outre caractérisée en ce que au moins le dernier nucléotide de son extrémité 3' , de préférence les deux derniers nucléotides de son extrémité 3' est (sont) différent(s) du nucléotide correspondant de la séquence nucleotidique alignée du gène conservé présent chez un autre mollicute (une autre espèce) susceptible d'être détecté chez l'homme ou,
- la première et la deuxième amorces sont en outre caractérisées en ce que au moins le dernier nucléotide de l'extrémité 3' de l'une des première ou deuxième amorces est différent du nucléotide correspondant de la séquence nucleotidique alignée du gène conservé présent chez un autre mollicute (une autre espèce) susceptible d'être détecté chez l'homme, et deux nucléotides supplémentaires répartis parmi les trois derniers nucléotides de l'extrémité 3' de l'une des amorces ou des deux amorces, sont également différents du nucléotide correspondant de la séquence nucleotidique alignée du gène conservé présent chez un autre mollicute (une autre espèce) susceptible d'être détecté chez l'homme.
25. Kit selon la revendication 26, caractérisé en ce les couples d'amorces sont MYCPIRP et MYCPIRN OU,
PENETP: 5' CATGCAAGTCGGACGAAGCA 3' PENETN: 5' AGCATTTCCTCTTCTTACAA 3*
PNEUP: 5' CCTGCAAGGGTTCGTTATTT 3' PNEUN: 5' ATGGTACAGTCAAACTCTAG 3'
HOMIP: 5' ATACATGCATGTCGAGCGAG 3' HOMIN: 5' CATCTTTTAGTGGCGCCTTAC 3 '
UREUREP: 5'-CGTAAAGTTGCTTATGGACGTCGTT -3' UREUREN: 5'-TTGTGTCTCCTAATCTAACGCTATC-3'
MYCARGP: 5'- ATGCATGTCGAGCGAGGTTC -3' MYCARGN : 5 - TTAGCTGCGTCAGTGAACTC 3'
MYCORAP: 5 - CGTTGTGAAAGGAGCGTTTC -3' MYCORAN: 5 - GAAGCATTTCCTCAACTAAC -3 '
MYCHYOP: 5 - TAAATTCTAAAAAAGATCGACTAAC -3 ' MYCHYON: 5 - TTCAGTAATTGCTTCTAAATTAACG 3'
ALAIDLP: 5 -GCTAATACTGGATAGGATGT-3' ALAIDLN: 5 -TGGTACCGTCAATTTTTAATTTTTC -3'
26. Kit selon l'une quelconque des revendications 23 à 25, caractérisé en ce que la sonde est dérivée d'une région conservée au sein de plusieurs mollicutes.
27. Kit selon l'une quelconque des revendications 23 à 25, caractérisé en ce que la sonde est dérivée d'une région variable du mollicute de référence, et en ce qu'elle hybride spécifiquement dans des conditions déterminées, avec l'ADN du gène conservé du mollicute de référence.
28. Kit selon l'une quelconque des revendications 23 à 27, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un ou plusieurs couples d'amorces, pour la détection de mollicutes différents de M. pirum, en particulier pour la détection de M. pneumoniae, U. urealyticum, M. hominis, M. fermentans, A. laidlawii et M. arginini, ces couples d'amorces étant dérivés des séquences de chacun de ces mollicutes, situées entre les positions 52 et 71 pour l'amorce 5* d'une part et 207 et 226 pour 1'amorce 3 • d'autre part pour chaque séquence du gène de l'ARN ribosomique 16S de ces mollicutes.
29. Kit selon l'une quelconque des revendications 23 à 27, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une réverse-transcriptase pour obtenir de l'ADNc à partir de l'ARN ribosomique 16S présent dans l'échantillon bioloqique testé. 30. Kit selon l'une quelconque des revendications 23 à 29, caractérisé en ce qu'il comprend en outre : un contrôle interne de la réaction d'amplification, constitué par un fragment d'ADN susceptible d'être aisément détecté, par exemple un fragment contenant un gène de résistance à un antibiotique, ce fragment étant différent de l'ADN du mollicute de référence susceptible d'être amplifié à partir de l'échantillon, ce fragment étant en outre muni à chacune de ses extrémités d'une amorce d'amplification selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ;
- • des moyens pour la détection de l'amplification du contrôle interne, par exemple une sonde capable d'hybrider de façon spécifique avec l'ADN contenu dans le contrôle interne.
21. Procédé pour la détection spécifique in vitro d'une infection par un mollicute déterminé en particulier du genre M. pirum ou plusieurs mollicutes déterminés, sur un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : a) mise en contact de l'acide nucléique de l'échantillon biologique testé, si nécessaire dans des conditions permettant l'accessibilité sous forme d'ADN simple brin, avec au moins un couple d'amorces nucleotidiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, lesdites amorces pouvant hybrider avec l'acide nucléique des mollicutes spécifiques recherchés s'ils sont présents, et initier la synthèse du produit d'élongation desdites amorces, chaque brin d'ADN de mollicutes servant de matrice lorsqu'il est apparié avec les amorces ; b) séparation des brins d'ADN synthétisés, de leur matrice ; c) répétition de la synthèse de produit d'élongation, à partir de chaque brin d'ADN présent à l'issue de l'étape b) et susceptible d'hybrider avec les amorces, jusqu'à obtention d'une amplification de l'ADN recherché, suffisante pour être détectée, d) mise en contact du produit de l'étape c) avec une sonde nucleotidique dans des conditions permettant de détecter spécifiquement la présence du fragment d'ADN amplifié recherché ; e) détection des produits de l'hybridation éventuellement formés et comparaison de la taille de ces produits avec la taille du fragment d'ADN du mollicute de référence, situé entre les 2 amorces.
32. Procédé selon la revendication 31, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est un échantillon prélevé chez l'homme ou chez l'animal.
33. Kit selon la revendication 31, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est une lignée cellulaire.
34. Kit selon l'une quelconque des revendications 31 à 33, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est testé sans culture préalable.
35. Procédé selon l'une quelconque des revendications 31 à 34, caractérisé en ce que la mise en contact de l'échantillon biologique testé est précédée d'une étape de traitement de l'échantillon de façon à en extraire l'acide nucléique.
35. Procédé selon l'une quelconque des revendications 30 à 34, caractérisé en ce que préalablement à la mise en contact avec les amorces, on traite l'acide nucléique de l'échantillon avec une réverse- transcriptase, pour obtenir la synthèse d'ADNc à partir de l'ARN éventuellement présent dans l'échantillon testé.
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