CA2306445A1 - Moyens de documentation de repertoires en immunorecepteurs nkr et/ou en immunorecepteurs contreparties activatrices ou non inhibitrices d'immunorecepteurs nkr - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne une méthode in vitro de documentation d'un répertoire en immunorécepteur(s) NKR et/ou contreparties de NKR, comprenant (i) l'utilisation d'au moins une paire d'oligonucléotides 3' et 5' capable de s'hybrider à un récepteur cible NKR, ou contrepartie de NKR, et de ne pas s'hybrider à un récepteur contrepartie fonctionnelle de ce récepteur cible; (ii) la mise en contact de cette paire d'oligonucléotides 3' et 5' avec l'ADN ou ADNc d'un échantillon à étudier; et (iii) la détection des hybrides éventuellement formés. L'invention vise également les applications biologiques de cette méthode, notamment criblage de banque d'organes, tissus, cellules en vue de greffes, et à des kits pour sa mise en oeuvre.
Description
Moyens de documentation de répertoires en immunorécepteurs NKR et/ou en immunorécepteurs contreparties activatrices ou non inhibitrices d~immunorécepteurs NKR
La présente invention concerne des moyens permettant de documenter les répertoires d'un individu humain ou animal en immunorécepteurs NKR (Natural Killer Receptor) du type des immunoglobulines ou du type des lectines, et en immunorécepteurs contreparties activatrices, ou à tout le moins non inhibitrices, d'immunorécepteurs NKR. Elle vise également letu-s applications biologiques.
Les fonctions immunitaires d'un homme ou d'un animal sont définies par plusieurs catégories de molécules hautement diversifiées, telles que notamment le systéme des groupes sanguins ABO, la famille des molécules du CMH
(Complexe Majeur d'Histocompatibilité, appelé chez l'homme, système HLA -Human Leaikocyte Antigen-), la famille des récepteurs pour l'antigène des lymphocytes T (TCR) et des lymphocytes B (BCR). L' ensemble des molécules qu'un individu adulte exprime, ou est capable d'exprimer, pour chacune de ces différentes familles constitue, exception faite des vrais jumeaux, un répertoire évolutif qui lui est propre et qui intervient dans la reconnaissance du soi ou du non-soi.
D'autres grands répertoires ont été plus récemment identifiés. Il s'agit du répertoire en récepteurs NKR de type immunoglobuline et du répertoire en récepteurs NKR de type lectine. Les récepteurs NKR de type immunoglobuline comprennent les récepteurs KIR (Killer tell Inhibitory Receptor) tels que notamment les récepteurs p58.1, p58.2, p70.INH, p140.INH. Les récepteurs NKR de type lectine comprennent les récepteurs inhibiteurs NKG2 tels que notamment les récepteurs NKG2A et NKG2B. L'ensemble de ces récepteurs NKR sont à fonction inhibitrice. Des récepteurs qui leur sont hautement homologues, en particulier au niveau extracytoplasmique, assurent toutefois des fonctions activatrices, ou à tout le moins non inhibitrices : il s'agit des récepteurs KAR (Killer tell Activatory Receptor) homologues aux réceptetus KIR, et des récepteurs NKG2C, NKG2D, NKG2E et NKG2F homologues aux récepteurs NKG2A et NKG2B. Les réceptel~rs contreparties activatrices, ou à tout le moins non inhibitrices, de récepteurs inhibiteurs NKR sont ci-après désignés, par souci de fluidité, contreparties de NKR.
Les récepteurs NKR et les récepteurs contreparties de NKR sont naturellement exprimés par les cellules NK et par des sous-populations de cellules T. Plusieurs de ces récepteurs peuvent être exprllnés par une même cellule. Tous ces réceptemrs, qu'ils soient inhibiteiu-s (i. e. NKR) ou qu'ils soient activateurs ou non inhibiteurs (i. e. contreparties de NKR), ont en commun d'avoir pour ligand des molécules qui ne sont pas dérivées d'antigène : les ligands des récepteurs NKR et des récepteurs contreparties de NKR sont des molécules du CMH de classe I.
La reconnaissance de son ligand par im récepteur NKR déclenche la transduction à la cellule d'un message visant à inhiber son activité, e.g.
diminution ou arrêt de la cytolyse, de la sécrétion de cytokines, alors que la reconnaissance de son ligand par un récepteur contrepartie de NKR y induit un message activateur, ou à tout le moins non inhibiteur. A la résultante entre récepteurs NKR
et récepteurs contreparties de NKR ainsi activés par leurs ligands, correspond un signal, globalement négatif ou positif, d'activation des cellules NK et/ou T
qui les expriment.
Les récepteurs NKR et leurs contreparties participent ainsi au contrôle, positif ou négatif, des réactions allogéniques d'un système immunitaire donné
vis-à-vis de ce qu'il considère alors comme non-soi par exemple, des cellules cancéreuses ou infectées, ou bien encore des cellules de greffe ou transplantation WO 99!20794 PCT/FR98/02244 allo- ou xéno-génique.
Les récepteurs NKR et leurs contreparties participent en effet aux réactions entre hôte et greffon lors d'Lme greffe (ou transplantation) de cellules, tissu ou organe qui présentent) un certain degré d'incompatibilité antigénique avec (hôte.
L'implication de récepteurs NKR et de Ieurs contreparties dans la tolérance envers des greffes incompatibles, et dans l'effet sélectif de lyse de cellules malignes parfois observé après greffe de moelle osseuse, ou effet GVL (Graft Versus Leackemia), a en effet été démontrée in vivo (cf. Cambiaggi et al.
1997, Froc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 94, p. 8088-8092 ; Albi et al. 1996, Blood, vol.
8 î, n°9, p. 3993-4000).
Or, les moyens pouvant actuellement être mis en oeuvre dans un contexte médical ne permettent pas de documenter I' ensemble des répertoires d'un patient, d'un organe, d'un tissu ou de cellules.
C'est ainsi qu'actuellement, seule la compatibilité des molécules HLA-A, HLA-B
et HLA-DR du donneur et du receveur est vérifiée préalablement à une greffe ou transplantation allo- ou xéno-génique. Ces critères de compatibilité
n'apparaissent toutefois pas comme suffisants. Des traitements immunosuppresseurs (par exemple, à base de cyclosporine) doivent compléter ces procédures de greffe ou transplantation de manière à inhiber le système immunitaire du patient. De tels traitements sont à hauts risques pour le patient qui est alors susceptible de développer des infections opportunistes.Ces traitements immunosuppresseurs doivent de plus être maintenus à un certain niveau pendant plusieurs années, et le patient doit alors résister aux effets délétères des médicaments. Finalement, Ia réussite de telles procédures de greffe ou transplantation reste incertaine.
En effet, des rejets de greffe de la part du receveur, ou bien encore, dans le cas de greffes comprenant des cellules immuno-compétentes, des réactions du greffon contre l'hôte (effet GVH, Graft Versus Host} sont malgré tout observés. De telles réactions de rejet ou de GVH conduisent généralement à de très sévères lésions;
WO 99/20794 PCT/FR9$/02244 actuellement, elles ne peuvent toutefois être totalement écartées, et donc prévenues.
Des effets bénéfiques inattendus de greffes allogéniques ont par ailleurs parfois été observés : des greffes allogéniques de moelle osseuse sur des patients leucémiques aplasiques ont parfois condut à m effet thérapeutique anti-ttunoral par lyse des cellules malignes du recevew et préservation de ses cellules saines.
Cet effet thérapeutique sélectif, dans lequel sont impliquées les cellules NK
et T, est désigné par GVL (Graft versus Leukemia). Potentiellement, ime greffe (ou une transplantation) de tissu hématopoïétique en général, et de moelle osseuse en particulier, peut conduire à Lm effet thérapeutique dans le cadre de malignités hématologiques telles qu'une leucémie, par lyse sélective de celles des cellules du receveur qui ne présentent plus les antigènes d'histocompatibilité présentés par les cellules saines. Les moyens actuellement disponibles pour le milieu médical ne permettent toutefois pas de prédire si l'organe ou le tissu considéré exercera un effet sélectif GVL pour le receveur considéré. Bien que connu, (effet sélectif GVL ne peut donc actuellement être mis à profit dans le cadre d'une thérapie anti-cancëreuse.
Les moyens actuellement développés dans le cadre de recherches expérimentales afin de documenter les différents répertoires de cellules humaines ou animales ne permettent par ailleurs pas de documenter précisément le répertoire en récepteurs NKR et en récepteurs contreparties de NKR : (identité
précise de chaque récepteur NKR ou contrepartie de NKR ne peut être déterminée. Du fait de la forte homologie, en particulier au niveau extracytoplasmique, entre un récepteiu NKR et un récepteur contrepartie de ce NKR (e.g. jusqu'à 96% d'homologie entre KIR et KAR), (utilisation d'anticorps ne permet en effet souvent pas de discriminer entre des NKR qui sont inhibiteurs et leurs contreparties à fonctions activatrices, ou à tout le moins non inhibitrices.
Les amorces oligonucléotidiques actuellement disponibles ne permettent quant à
elles pas la mise en oeuvre d'une amplification en chaîne par polymérase capable de discriminer entre par exemple un NKR p58.1 et un NKR p58.2, ou entre un NKR p70.INH et un NKR p 140.INH. Finalement, pour documenter précisément le répertoire en immunorécepteurs NKR et en leurs contreparties, iI faut actuellement avoir recours après une étape de purification des récepteurs visés {e.g. par FACScan), à une étape de séquençage nucléotidique. La documentation du répertoire NKR /contreparties de NKR n'est donc actuellement pas réalisable en routine dans un contexte de type médical. Le niveau de stimulation et d'inhibition des programmes d'activation des cellules NK et T, et donc le potentiel de résistance d'un individu vis-à-vis du développement d'infections microbiennes ou parasitaires; de maladies auto-immunes, ou bien encore de cellules malignes, ne peut donc être mesuré. Il résulte également de cette absence de moyens adaptés pour la documentation des répertoires NKR/contreparties de NKR que les effets sélectifs de type GVL ne peuvent être utilisés en thérapie, et que les réacrions GVH ou de rejets lors de greffes ou de transplantations allo-ou xéno-géniques ne peuvent être complètement écartées.
La présente invention propose donc des moyens permettant de documenter, pour un échantillon biologique donné, les répertoires en immunorécepteurs NKR
et en immunorécepteurs contreparties activatrices ou à tout le moins non inhibitrices de récepteurs NKR. Ces moyens permettent notamment de distinguer aisément entre un récepteur NKR et sa contrepartie activatrice ou non inhibitrice, ainsi que de distinguer entre différents récepteurs NKR, ou entre différentes contreparties de NKR. Elle vise également les applications biologiques, et en particulier médicales et vétérinaires, de ces moyens. L'un des aspects essentiels selon l'invention consiste à considérer l'ensemble des immunorécepteurs NKR et contreparties de NKR comme un répertoire, c'est-à-due comme un ensemble cohérent, formant une unité par rapport à un type d'activité, en foccurence, de manière particulièrement avantageuse, le contrôle de l'activation lymphocytaire de l'homme ou l'animal dont est issu ledit échantillon biologique (contrôle négatif pour ie répertoire des récepteurs NKR, contrôle positif pour le répertoire des contreparties de NKR). L'invention fournit, pom la première fois, des moyens permettant de documenter, en routine dans un contexte médical ou vétérinaire, des répertoires NKR etlou contreparties de NKR, de manière à pouvoir analyser rapidement et efficacement des sihiations physiologiques et pathologiques liées à
ces répertoires.
Les moyens selon l'invention présentent notamment (avantage d'être aisément utilisables dans un contexte médical ou vétérinaire, par exemple en hôpital ou clinique.
La présente invention a pour objet ime méthode in vitro de documentation d'un répertoire en immunoréceptewr(s) NKR comprenant notamment les récepteurs KIR p58.1, p58.2, p70.INH, p140.INH, et les récepteurs NKG2A et NKG2B, et/ou d'un répertoire en immunorécepteur(s) contreparties) de NKR, comprenant notamment les récepteurs KAR p50.1, p50.2, p70.ACT, p140.ACT, et les récepteurs NKG2C, NKG2D, NKG2E, NKG2F, ces immunorécepteurs étant ci-après désignés) récepteurs) cible(s), caractérisée en ce qu'elle comprend i. l'utilisation d'au moins une paire d'oligonucléotides, l'un étant désigné
oligonucléotide 3' et l'autre oligonucléotide 5', les oligonucléotides 3' et 5' d'une même dite paire étant tous deux capables, dans des conditions d'hybridation correspondant à une incubation pendant I min dans un tampon [Tris-HCl 20mM
pH8,4; KCI 50mM; MgCl2 2,5mM] à Lute température comprise entre 50°C et 65°C environ, de s'hybrider à l'ADN ou à l'ADNc d'un récepteur cible NKR, ou contrepartie de NKR, mais ne s'hybridant pas, dans les mêmes conditions d'hybridation, avec l'ADN ou l'ADNc d'un récepteur contrepartie de NKR, ou respectivement d'un récepteur NKR, contrepartie fonctionnelle dudit récepteur cible, ü. la mise en contact de populations ADN ou ADNc d'un échantillon biologique d'origine humaine ou animale pour lequel on souhaite documenter le répertoire en immunorécepteur(s) cible(s), avec un excès d'au moins une paire d'oligonucléotides 3' et 5' selon i. dans des conditions favorables à
l'hybridation de cette paire oligonucléotides 3' et 5' sur les ADN ou sur les ADNc de l'échantillon biologique, et iü.la détection des hybrides éventuellement formés entre ces ADN ou ADNc et la ou les paires) d'oligonucléotides 3' et S'.
Par contrepartie fonctionnelle d'w réceptetu, nous entendons dans la présente demande un récepteur à structure homologue, en particulier au niveau extracytoplasmique, mais à fonction différente : par exemple, une contrepartie fonctionnelle du récepteur NKR p58.1 est le récepteur contrepartie de NKR
pSO.l, et réciproquement; de même le réceptetu NKR p58.2 et le récepteur contrepartie de NKR p50.2 sont fiuz pour l'autre des contreparties fonctionnelles.
La présente méthode permet donc notamment de distinguer un récepteur NKR (ou contrepartie de NKR) d'un récepteur contrepartie fonctionnelle de ce récepteur.
La (ou les) paires) d'oligonucléotides 3' et 5' est (sont) en particulier capables de borner, sur fADN ou l'ADNc d'iui récepteur cible qui leur correspond, une séquence d'oligonucléotides {bornes incluses) qui est absente de la séquence ADN ou ADNc d'un récepteur avec lequel elles) est (sont) capables) de ne pas s'hybrider dans les conditions d'hybridation données sous i) ci-dessus.
De manière avantageuse, ladite ou au moins une desdites paires) d' oligonucléotides 3' et S' utilisées) est en outre capable, dans les mêmes conditions d'hybridation que celles définies sous i., de ne pas s'hybrider à
l'ADN
ou ADNc d'un récepteur, indifféremment NKR ou contrepartie de NKR, autre que ledit récepteur cible.
Selon une disposition particulière de cette manière avantageuse, ladite (ou au moins une desdites) paires) d'oligonucléotides 3' et 5' capable, dans les conditions d'hybridation définies sous i. ci-dessus, de s'hybrider à l'ADN ou l'ADNc d'un récepteur p58.1 (ou p50.1 ), et de ne pas s'hybrider à l'ADN ou l'ADNc d'un récepteur p50.1 (ou respectivement p58.1) est en outre capable de ne pas s'hybrider dans les mêmes conditions d'hybridation à l'ADN ou l'ADNc d'un récepteur p58.2 ou p50.2.
Selon une deuxième disposition particl~lière de cette manière avantageuse, ladite, ou au moins une desdites, paires) d'oligonucléotides 3' et 5' capable, dans les conditions d'hybridation définies sous i. ci-dessus, de s'hybrider à l'ADN
ou l'ADNc d'un récepteur p58.2 (ou p50.2), et de ne pas s'hybrider â l'ADN ou I'ADNc d'un récepteur p50.2 (ou respectivement p58.2) est en outre capable de ne pas s'hybrider dans les mêmes conditions d'hybridation à l'ADN ou l'ADNc d'un récepteur p58.1 ou p50.1.
Selon une troisième disposition particulière de cette manière avantageuse, ladite (ou au moins une desdites) paires) d'oligonuclëotides 3' et 5' capable, dans Ies conditions d'hybridation définies sous i. ci-dessus, de s'hybrider à l'ADN
ou I'ADNc d'un récepteur p70.INH (ou p70.ACT), et de ne pas s'hybrider à l'ADN
ou l'ADNc d'un récepteur p70.ACT {ou respectivement p70.II~ est en outre capable de ne pas s'hybrider dans les mêmes conditions d'hybridation à I'ADN
ou l'ADNc d'un récepteur p140.INH ou p140.ACT.
Selon une quatrième disposition particulière de cette manière avantageuse, ladite, ou au moins une desdites, paires) d'oligonucléotides 3' et 5' capable, dans les conditions d'hybridation définies sous i. ci-dessus, de s'hybrider à l'ADN
ou l'ADNc d'un récepteur p140.INH (ou p140.ACT), et de ne pas s'hybrider à l'ADN
ou l'ADNc d'un récepteur p 140.ACT (ou respectivement p 140.IN~ est en outre capable de ne pas s'hybrider dans les mêmes conditions d'hybridation à l'ADN
ou l'ADNc d'un récepteur p70.1NH ou p70.ACT.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'oligonucléotide S' d'une dite paire d'oligonucléotides 3' et 5' utilisée pour un récepteur cible NKR
(ou contrepartie de NKR) est capable, dans les conditions d'hybridation dëfinies sous i. ci-dessus, de s'hybrider à l'ADN ou à l'ADNc d'un récepteur contrepartie de NKR {ou respectivement NKR), contrepartie fonctionnelle dudit récepteur cible NKR (ou respectivement contrepartie de NKR). Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, la séquence de l'oligonucléotide 5' d'une dite paire d'oligonuclëotides 3' et 5' utilisée poL~r un récepteur cible NKR
(ou contrepartie de NKR) comprend la séquence de I'oligonucléotide 5' d'une autre dite paire d'oligonucléotides 3' et 5' ayant poLU récepteur cible tm récepteur contrepartie de NKR (ou respectivement NKR), contrepartie fonctionnelle dudit récepteur cible NKR (ou respectivement contrepartie de NKR).
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, I'oligonucléotide 3' d'une dite paire d'oligonucléotides 3' et 5', utilisée pour un récepteur cible KAR, est capable, dans les mêmes dites conditions d'hybridation, de s'hybrider à l'ADN ou ADNc dudit récepteur cible KAR au niveau d'un enchaînement nucléotidique qui comprend une séquence correspondant, selon le code génétique universel, et en tenant compte de la dégénérescence dudit code, à
la séquence d' acides aminés Lys Ile Pro Phe Thr IIe (K I P F T I) ou Lys Leu Pro Phe Thr Ile (K L P F T I) (SEQ ID n°26 ou 27).
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, ladite (ou au moins une desdites) paires) d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur KIR est choisie parmi le groupe de paires d'oligonucléotides 3' et 5' constitué par un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ü7 n°1, ou une séquence en dérivant, et au moins un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID
n°5, n°2, n°6 ou n°7, ou une séquence en dérivant, un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°4, ou Lme séquence en dérivant, et au moins un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID
n°5, n°2, n°6 ou n°7, ou une séquence en dérivant, un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ m n°9, ou une séquence en dérivant, et au moins un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ m n°5, n°2, n°6 ou n°7, ou une séquence en dérivant, au moins un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ m n° 10, n° 11, n° 12, ou n° 13, ou une séquence en dérivant, et wz oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ 1D n°14, ou une séquence en dérivant.
Par séquence dérivant d'une premiëre séquence, nous entendons dans la présente demande une séquence dérivée de la premiére notamment par inversion, délétion, addition, ou substitution de nucléotide(s), et présentant les propriétés d'hybridation que l'acide nucléique correspondant à la première séquence présente dans Ies conditions i. ci-avant définies.
Selon une disposition de ce mode de réalisarion particulièrement avantageux, ladite paire d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur p58.1 correspond à un oligonucléotide 5' comprenant la SEQ m n°1, ou une séquence en dérivant, et Lui équimélange de quatre oligonucléotides 3', chacun d'eux comprenant la SEQ 1D n°5, n°2, n°6 ou n°7, ou une séquence en dérivant.
Selon une autre disposition de ce mode de réalisation particuliérement avantageux, ladite paire d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur p58.2 correspond à un oligonucléotide 5' comprenant la SEQ m n°4, ou une séquence en dérivant, et un équimélange de quatre oligonucléotides 3', chacun d'eux comprenant la SEQ 117 n°5, n°2, n°6 ou n°7, ou une séquence en dérivant.
Selon encore une autre disposition de ce mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite paire d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur p70.INH correspond à un oligonucléotide S' comprenant la SEQ m n°9, ou Lme séquence en dérivant, et un équimélange de WO 99IZ0794 PCTIE'R98/02244 quatre oligonucléotides 3', chacun d'ei~~ comprenant la SEQ ID n°5, n°2, n°6 ou n°7, ou une séquence en dérivant.
Selon encore une autre disposition de ce mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite paire d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur p 140.INH correspond â un équimélange de quatre oligonucléotides ~', chacun d'eux comprenant la SEQ )D n° 10, n°
11, n° I 2 ou n° 13, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la SEQ
m n° 14, ou une séquence en dérivant.
Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, ladite (ou au moins une desdites) paires) d'oligonucléotides 3' et 5' avant pour récepteLU cible un réceptetu- KAR est choisie parmi le groupe de paires d'oligonucléotides 3' et 5' constitué par - un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°1, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ 1D n°3, ou une séquence en dérivant, - un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°8, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ B7 n°3, ou une séquence en dérivant, - un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ m n°9, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ m n°3, ou une séquence en dérivant, - un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ m n° 15, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ IL7 n°3, ou une séquence en dérivant.
Selon une disposition de cet autre mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite paire d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur p50.1 correspond à un oligonucléotide 5' comprenant la SEQ )17 n°1, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la SEQ >I7 n°3, ou une séquence en dérivant.
Selon une autre disposition de cet autre mode de réalisation particuliërement avantageux, ladite paire d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur p50.2 correspond à tui oligonucléotide 5' comprenant la SEQ ID n°8, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la SEQ ID n°3, ou une séquence en dérivant.
Selon encore une autre disposition de cet autre mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite paire d' oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur p70.ACT correspond à un oligonucléotide 5' comprenant la SEQ ID n°9, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la SEQ ID n°3, ou une séquence en dérivant.
Selon encore une autre disposition de cet autre mode de réalisation particuliërement avantageux, ladite paire d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur p140.ACT correspond à un oligonucléotide 5' comprenant la SEQ ID n°15, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la SEQ m n°3, ou une séquence en dérivant.
Selon encore un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, ladite (ou au moins une desdites) paires) d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteLU NKG2 est choisie parmi le groupe de paires d'oligonucléotides 3' et 5' constitué par - un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ m n° 16, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ m n°17, ou une séquence en dérivant, - un oligonucléotide S' comprenant la séquence SEQ >D n° 18, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant Ia séquence SEQ 1T7 n° I 7, ou une séquence en dérivant, - un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ m n° 19, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID
n° 17, ou une séquence en dérivant, - un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°20, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID
n°21, ou une séquence en dérivant.
Selon une première disposition de cet encore autre mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite paire d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur NKG2A (inhibiteur) correspond à un oligonucléotide 5' comprenant la SEQ ID n° 16, ou une séquence en dérivant, et m oligonucléotide 3' comprenant la SEQ m n°17, ou une séquence en dérivant.
Selon une deuxième disposition de cet encore autre mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite paire d' oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur NKG2B (inhibiteur) correspond à un oligonucléotide 5' comprenant la SEQ 1D n° 18, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la SEQ m n° 17, ou une séquence en dérivant.
Selon une troisième disposition de cet encore autre mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite paire d' oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur NKG2C (activateur) correspond à un oligonucléotide 5' comprenant la SEQ ID n° 19, ou une séquence en dérivant, et zm oligonucléotide 3' comprenant la SEQ m n°17, ou une séquence en dérivant.
Selon une quatrième disposition de cet encore autre mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite paire d' oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur NKG2D (activateur) correspond à un oligonucléotide 5' comprenant la SEQ m n°20, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la SEQ ID n°21, ou une séquence en dérivant.
Lesdites conditions favorables à l'hybridation de la ou des paires d'oligonucléotides 3' et 5' mises en contact avec l'ADN ou l'ADNc de l'échantillon biologique correspondent avantageusement à une incubation pendant 1 min dans un tampon [Tris-HCI 20mM pH8,4; KCl SOmM; MgCl2 2,SmM] à une température comprise entre 50°C et 65°C environ. De telles conditions sont en particulier présentées dans les exemples.
De manière avantageuse, les deux oligonucléotides 3' ou 5' d'une même dite paire sont chacun couplés à un marqueur, notamment couplée à un marqueur fluorescent ou radioactif, tel que du 32P, permettant la révélation des hybrides qu'ils forment éventuellement avec lesdites populations ADN ou ADNc dudit échantillon biologique.
De manière également avantageuse, ladite (ou lesdites) paires) d'oligonucléotide(s) 3' et 5' sert (servent) d'amorces respectivement 3' et 5' pour une extension par ADN polvmérase, telle qu'une Taq polymérase. Des conditions favorables à une telle extension comprennent, outre l'ajout d'ADN polymérase, (ajout des 4 dNTP (désoxyribonucléoside-triphosphate) en présence d'un tampon de type Tris-HCI.
Lesdits hybrides éventuellement formés sont alors, préalablement à leur détection, amplifiés par au moins une PCR (amplification en chaîne par polymérase; cf. les brevets EP 201 184 et EP 200 362) ou RT-PCR dans le cas d'ADNc rétrotranscrit à partir d'ARNm. Le cas échéant, lesdits hybrides éventuellement formés sont amplifiés par "Nested PCR" (double PCR emboîtée).
Des exemples de conditions favorables à (amplification par PCR sont donnés dans les exemples.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de (invention, ladite détection des hybrides éventuellement formés comprend en outre la résolution sur gel de polyacrylamide du mélange réactionnel issu de la mise en contact, ainsi que la révélation de la présence ou de l'absence de bandes électrophorétiques contenant lesdits hybrides éventuellement formés.
Selon un autre mode de réalisation de (invention, le répertoire en immunorécepteurs documenté est quantifié par référence aux quantités de b-actine mesurées sur le même échantillon biologique, ou par référence aux quantités d'une molécule spécifique d'un type cellulaire présentes dans ledit échantillon biologique, tel que notamment les molécules CD56 pour les cellules NK.
La méthode selon l'invention peut être appliquée à Ia documentation d'un répertoire génotypique en immunorécepteurs NKR et/ou en immLmorëcepteurs contreparties de NKR : l'étape ü. de mise en contact définie ci-dessus est alors réalisée avec les populations ADN génomique de l'échantillon biologique.
La méthode selon l'invention peut également étre appliquée à la documentation d'un répertoire d'expression en immunorécepteurs NKR et/ou en immimorécepteurs contreparties de NKR : l'étape ü. de mise en contact définie ci-dessus est alors réalisée avec les populations ADNc, rétro-transcrites des populations ARI~Im de l'échantillon biologique.
Des échantillons biologiques d'origine humaine ou animale particulièrement appropriés à la mise en oeuvre de Ia méthode selon l'invention comprennent du sang périphérique, de la moelle osseuse, des lymphocytes, des cellules NK
et/ou T, des cellules transgéniques exprimant des immunorécepteurs, une fraction isolée à partir de ces échantillons.
La méthode selon l'invention peut être notamment appliquée au criblage d'une banque d'organes, de tissus ou de cellules.
Elle permet ainsi une meilleure prévision - de l'acceptation ou de rejet, par un homme ou un animal, de cellules, d'un tissu ou d'un organe génétiquement di~férent(es), - de l' inocuité ou de la pathogénicité (effet GVH), pour un homme ou un animal, d'une greffe ou transplantation, en particulier de cellules, tissu, ou organe génétiquement différent(es), - d'un effet potentiel de type GVL que des cellules, un tissu ou un organe génétiquement différentes) pourraient exercer sur un homme ou animal.
La méthode selon l'invention permet également le suivi de l'éventuelle apparition de telles réactions après greffe ou transplantation allo- ou xénogénique.
La méthode selon l'invention peut également être appliquée à la détermination de I' état d' activation de celh~les NK et/ou T à un instant donné
chez un animal ou un homme. Elle permet alors la prévision ou le suivi de l'état de résistance d'un animal ou d'un homme vis-à-vis d'une infection virale, telle qu'une infection par un V»-I, d'une infection parasitaire, telle que la malaria, d'une infection bactérienne, vis-à-vis d'une maladie auto-immune, telle que la polyarthrite rhumatoïde, ou bien encore vis-à-vis du développement de cellules malignes telles que des cellules leucémiques. L'utilisation prévisionnelle de la méthode selon l'invention est d'un intérêt particulier dans le cadre d'épidémies.
La méthode selon l'invention peut également être avantageusement appliquée au criblage de médicaments actifs vis-à-vis de maladies infectieuses, de maladies auto-immunes, ou de maladies tumorales.
La présente invention a également pour objet un kit pour Ia mise en oeuvre de ladite méthode comprenant dans un récipient, au moins une dite paire d' oligonucléotides, les réactifs pour la réalisation de ladite ou lesdites méthodes) tels que tampon, marqueur (éventuellement couplé aux oligonucléotides de la dite paire), ainsi qu'un mode d'emploi.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront encore à travers les exemples de réalisation suivants, donnés à titre indicatif et non limitatifs.
Lesdits exemples font référence aux Figures 1 et 2 La Figure 1 représente les produits issus d'une amplification par PCR
(amplification en chaîne par polymérase après RT transcription enzymatique inverse à l'aide de paires d'oligonucléoüdes selon l'invention servant d'amorces), des séquences codantes pour p50.2 (Fig. lA) et p58.2 (Fig.IB) dans des cellules NK humaines;
La Figure 2 représente les produits issus d'une amplification par PCR de la WO 99/20794 1,~ PCT/FR98/02244 séquence codante pour p50.2 à partir du DNA génomique de souris transgéniques p50.2~.
Exemple 1 : Documentation du répertoire NKR/contreparties de NKR exprimé
par une population de cellules NK hlunaines (RT-PCR).
1. Préparation des ARN
Des préparations ARN ont été réalisées à partir de cellules NK humaines clonées et phénotypées p50.2+ et/ou p58.2+. La technique immunologique ne permet pas de documenter précisément un tel répertoire : l'anticorps GL183 (Immunotech) reconnaît à la fois le récepteur NKR inhibiteur p58.2 et sa contrepartie activatrice p50.2. Des cellules NK hiunaines clonées et phénotypées p~0.2- et p58.2- à l'aide de l'anticorps GL183 servent de témoins négatifs.
Les préparations ARN sont réalisées comme suit.
Extraction 100 ~.1 de Trizol (Gibco BRL catégorie n°15596-026) ont été ajoutés à
cellules. On mélange en pipetant plusieurs fois, sans utiliser de mélangeur à
vortex. On laisse la solution 5 minutes à température ambiante puis on ajoute 20 ~.l de chloroforme sans alcool isoamylique. On mélange à nouveau sans utiliser de mélangeur à vortex et on laisse la solution se reposer 5 minutes à
température ambiante. On centrifuge alors à 4°C pendant 15 minutes de manière à
bien séparer la phase organique inférieure, qui contient (ADN, de la phase aqueuse supérieure qui contient l'ARN. On récupère la phase aqueuse sans perturber (interface entre phase aqueuse et phase organique.
Précipitation 50 ~1 d'isopropanol sont ajoutés à la phase aqueuse et on laisse TARN
précipiter pendant 15 minutes à température ambiante. On centrifuge alors pendant 10 minutes à 4°C. Le surnageant est éliminé, et le culot est lavé avec I00 ~1 d'éthanol à 70%. Après centrifugation pendant 5 minutes à 4°C (7500 g), on laisse sécher à Pair libre (sans sécher sous vide). Le culot d'ARN est remis en WO 99/20794 1 g PCT/FR98102244 suspension dans 20 ml d'H2(J.
La présente invention concerne des moyens permettant de documenter les répertoires d'un individu humain ou animal en immunorécepteurs NKR (Natural Killer Receptor) du type des immunoglobulines ou du type des lectines, et en immunorécepteurs contreparties activatrices, ou à tout le moins non inhibitrices, d'immunorécepteurs NKR. Elle vise également letu-s applications biologiques.
Les fonctions immunitaires d'un homme ou d'un animal sont définies par plusieurs catégories de molécules hautement diversifiées, telles que notamment le systéme des groupes sanguins ABO, la famille des molécules du CMH
(Complexe Majeur d'Histocompatibilité, appelé chez l'homme, système HLA -Human Leaikocyte Antigen-), la famille des récepteurs pour l'antigène des lymphocytes T (TCR) et des lymphocytes B (BCR). L' ensemble des molécules qu'un individu adulte exprime, ou est capable d'exprimer, pour chacune de ces différentes familles constitue, exception faite des vrais jumeaux, un répertoire évolutif qui lui est propre et qui intervient dans la reconnaissance du soi ou du non-soi.
D'autres grands répertoires ont été plus récemment identifiés. Il s'agit du répertoire en récepteurs NKR de type immunoglobuline et du répertoire en récepteurs NKR de type lectine. Les récepteurs NKR de type immunoglobuline comprennent les récepteurs KIR (Killer tell Inhibitory Receptor) tels que notamment les récepteurs p58.1, p58.2, p70.INH, p140.INH. Les récepteurs NKR de type lectine comprennent les récepteurs inhibiteurs NKG2 tels que notamment les récepteurs NKG2A et NKG2B. L'ensemble de ces récepteurs NKR sont à fonction inhibitrice. Des récepteurs qui leur sont hautement homologues, en particulier au niveau extracytoplasmique, assurent toutefois des fonctions activatrices, ou à tout le moins non inhibitrices : il s'agit des récepteurs KAR (Killer tell Activatory Receptor) homologues aux réceptetus KIR, et des récepteurs NKG2C, NKG2D, NKG2E et NKG2F homologues aux récepteurs NKG2A et NKG2B. Les réceptel~rs contreparties activatrices, ou à tout le moins non inhibitrices, de récepteurs inhibiteurs NKR sont ci-après désignés, par souci de fluidité, contreparties de NKR.
Les récepteurs NKR et les récepteurs contreparties de NKR sont naturellement exprimés par les cellules NK et par des sous-populations de cellules T. Plusieurs de ces récepteurs peuvent être exprllnés par une même cellule. Tous ces réceptemrs, qu'ils soient inhibiteiu-s (i. e. NKR) ou qu'ils soient activateurs ou non inhibiteurs (i. e. contreparties de NKR), ont en commun d'avoir pour ligand des molécules qui ne sont pas dérivées d'antigène : les ligands des récepteurs NKR et des récepteurs contreparties de NKR sont des molécules du CMH de classe I.
La reconnaissance de son ligand par im récepteur NKR déclenche la transduction à la cellule d'un message visant à inhiber son activité, e.g.
diminution ou arrêt de la cytolyse, de la sécrétion de cytokines, alors que la reconnaissance de son ligand par un récepteur contrepartie de NKR y induit un message activateur, ou à tout le moins non inhibiteur. A la résultante entre récepteurs NKR
et récepteurs contreparties de NKR ainsi activés par leurs ligands, correspond un signal, globalement négatif ou positif, d'activation des cellules NK et/ou T
qui les expriment.
Les récepteurs NKR et leurs contreparties participent ainsi au contrôle, positif ou négatif, des réactions allogéniques d'un système immunitaire donné
vis-à-vis de ce qu'il considère alors comme non-soi par exemple, des cellules cancéreuses ou infectées, ou bien encore des cellules de greffe ou transplantation WO 99!20794 PCT/FR98/02244 allo- ou xéno-génique.
Les récepteurs NKR et leurs contreparties participent en effet aux réactions entre hôte et greffon lors d'Lme greffe (ou transplantation) de cellules, tissu ou organe qui présentent) un certain degré d'incompatibilité antigénique avec (hôte.
L'implication de récepteurs NKR et de Ieurs contreparties dans la tolérance envers des greffes incompatibles, et dans l'effet sélectif de lyse de cellules malignes parfois observé après greffe de moelle osseuse, ou effet GVL (Graft Versus Leackemia), a en effet été démontrée in vivo (cf. Cambiaggi et al.
1997, Froc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 94, p. 8088-8092 ; Albi et al. 1996, Blood, vol.
8 î, n°9, p. 3993-4000).
Or, les moyens pouvant actuellement être mis en oeuvre dans un contexte médical ne permettent pas de documenter I' ensemble des répertoires d'un patient, d'un organe, d'un tissu ou de cellules.
C'est ainsi qu'actuellement, seule la compatibilité des molécules HLA-A, HLA-B
et HLA-DR du donneur et du receveur est vérifiée préalablement à une greffe ou transplantation allo- ou xéno-génique. Ces critères de compatibilité
n'apparaissent toutefois pas comme suffisants. Des traitements immunosuppresseurs (par exemple, à base de cyclosporine) doivent compléter ces procédures de greffe ou transplantation de manière à inhiber le système immunitaire du patient. De tels traitements sont à hauts risques pour le patient qui est alors susceptible de développer des infections opportunistes.Ces traitements immunosuppresseurs doivent de plus être maintenus à un certain niveau pendant plusieurs années, et le patient doit alors résister aux effets délétères des médicaments. Finalement, Ia réussite de telles procédures de greffe ou transplantation reste incertaine.
En effet, des rejets de greffe de la part du receveur, ou bien encore, dans le cas de greffes comprenant des cellules immuno-compétentes, des réactions du greffon contre l'hôte (effet GVH, Graft Versus Host} sont malgré tout observés. De telles réactions de rejet ou de GVH conduisent généralement à de très sévères lésions;
WO 99/20794 PCT/FR9$/02244 actuellement, elles ne peuvent toutefois être totalement écartées, et donc prévenues.
Des effets bénéfiques inattendus de greffes allogéniques ont par ailleurs parfois été observés : des greffes allogéniques de moelle osseuse sur des patients leucémiques aplasiques ont parfois condut à m effet thérapeutique anti-ttunoral par lyse des cellules malignes du recevew et préservation de ses cellules saines.
Cet effet thérapeutique sélectif, dans lequel sont impliquées les cellules NK
et T, est désigné par GVL (Graft versus Leukemia). Potentiellement, ime greffe (ou une transplantation) de tissu hématopoïétique en général, et de moelle osseuse en particulier, peut conduire à Lm effet thérapeutique dans le cadre de malignités hématologiques telles qu'une leucémie, par lyse sélective de celles des cellules du receveur qui ne présentent plus les antigènes d'histocompatibilité présentés par les cellules saines. Les moyens actuellement disponibles pour le milieu médical ne permettent toutefois pas de prédire si l'organe ou le tissu considéré exercera un effet sélectif GVL pour le receveur considéré. Bien que connu, (effet sélectif GVL ne peut donc actuellement être mis à profit dans le cadre d'une thérapie anti-cancëreuse.
Les moyens actuellement développés dans le cadre de recherches expérimentales afin de documenter les différents répertoires de cellules humaines ou animales ne permettent par ailleurs pas de documenter précisément le répertoire en récepteurs NKR et en récepteurs contreparties de NKR : (identité
précise de chaque récepteur NKR ou contrepartie de NKR ne peut être déterminée. Du fait de la forte homologie, en particulier au niveau extracytoplasmique, entre un récepteiu NKR et un récepteur contrepartie de ce NKR (e.g. jusqu'à 96% d'homologie entre KIR et KAR), (utilisation d'anticorps ne permet en effet souvent pas de discriminer entre des NKR qui sont inhibiteurs et leurs contreparties à fonctions activatrices, ou à tout le moins non inhibitrices.
Les amorces oligonucléotidiques actuellement disponibles ne permettent quant à
elles pas la mise en oeuvre d'une amplification en chaîne par polymérase capable de discriminer entre par exemple un NKR p58.1 et un NKR p58.2, ou entre un NKR p70.INH et un NKR p 140.INH. Finalement, pour documenter précisément le répertoire en immunorécepteurs NKR et en leurs contreparties, iI faut actuellement avoir recours après une étape de purification des récepteurs visés {e.g. par FACScan), à une étape de séquençage nucléotidique. La documentation du répertoire NKR /contreparties de NKR n'est donc actuellement pas réalisable en routine dans un contexte de type médical. Le niveau de stimulation et d'inhibition des programmes d'activation des cellules NK et T, et donc le potentiel de résistance d'un individu vis-à-vis du développement d'infections microbiennes ou parasitaires; de maladies auto-immunes, ou bien encore de cellules malignes, ne peut donc être mesuré. Il résulte également de cette absence de moyens adaptés pour la documentation des répertoires NKR/contreparties de NKR que les effets sélectifs de type GVL ne peuvent être utilisés en thérapie, et que les réacrions GVH ou de rejets lors de greffes ou de transplantations allo-ou xéno-géniques ne peuvent être complètement écartées.
La présente invention propose donc des moyens permettant de documenter, pour un échantillon biologique donné, les répertoires en immunorécepteurs NKR
et en immunorécepteurs contreparties activatrices ou à tout le moins non inhibitrices de récepteurs NKR. Ces moyens permettent notamment de distinguer aisément entre un récepteur NKR et sa contrepartie activatrice ou non inhibitrice, ainsi que de distinguer entre différents récepteurs NKR, ou entre différentes contreparties de NKR. Elle vise également les applications biologiques, et en particulier médicales et vétérinaires, de ces moyens. L'un des aspects essentiels selon l'invention consiste à considérer l'ensemble des immunorécepteurs NKR et contreparties de NKR comme un répertoire, c'est-à-due comme un ensemble cohérent, formant une unité par rapport à un type d'activité, en foccurence, de manière particulièrement avantageuse, le contrôle de l'activation lymphocytaire de l'homme ou l'animal dont est issu ledit échantillon biologique (contrôle négatif pour ie répertoire des récepteurs NKR, contrôle positif pour le répertoire des contreparties de NKR). L'invention fournit, pom la première fois, des moyens permettant de documenter, en routine dans un contexte médical ou vétérinaire, des répertoires NKR etlou contreparties de NKR, de manière à pouvoir analyser rapidement et efficacement des sihiations physiologiques et pathologiques liées à
ces répertoires.
Les moyens selon l'invention présentent notamment (avantage d'être aisément utilisables dans un contexte médical ou vétérinaire, par exemple en hôpital ou clinique.
La présente invention a pour objet ime méthode in vitro de documentation d'un répertoire en immunoréceptewr(s) NKR comprenant notamment les récepteurs KIR p58.1, p58.2, p70.INH, p140.INH, et les récepteurs NKG2A et NKG2B, et/ou d'un répertoire en immunorécepteur(s) contreparties) de NKR, comprenant notamment les récepteurs KAR p50.1, p50.2, p70.ACT, p140.ACT, et les récepteurs NKG2C, NKG2D, NKG2E, NKG2F, ces immunorécepteurs étant ci-après désignés) récepteurs) cible(s), caractérisée en ce qu'elle comprend i. l'utilisation d'au moins une paire d'oligonucléotides, l'un étant désigné
oligonucléotide 3' et l'autre oligonucléotide 5', les oligonucléotides 3' et 5' d'une même dite paire étant tous deux capables, dans des conditions d'hybridation correspondant à une incubation pendant I min dans un tampon [Tris-HCl 20mM
pH8,4; KCI 50mM; MgCl2 2,5mM] à Lute température comprise entre 50°C et 65°C environ, de s'hybrider à l'ADN ou à l'ADNc d'un récepteur cible NKR, ou contrepartie de NKR, mais ne s'hybridant pas, dans les mêmes conditions d'hybridation, avec l'ADN ou l'ADNc d'un récepteur contrepartie de NKR, ou respectivement d'un récepteur NKR, contrepartie fonctionnelle dudit récepteur cible, ü. la mise en contact de populations ADN ou ADNc d'un échantillon biologique d'origine humaine ou animale pour lequel on souhaite documenter le répertoire en immunorécepteur(s) cible(s), avec un excès d'au moins une paire d'oligonucléotides 3' et 5' selon i. dans des conditions favorables à
l'hybridation de cette paire oligonucléotides 3' et 5' sur les ADN ou sur les ADNc de l'échantillon biologique, et iü.la détection des hybrides éventuellement formés entre ces ADN ou ADNc et la ou les paires) d'oligonucléotides 3' et S'.
Par contrepartie fonctionnelle d'w réceptetu, nous entendons dans la présente demande un récepteur à structure homologue, en particulier au niveau extracytoplasmique, mais à fonction différente : par exemple, une contrepartie fonctionnelle du récepteur NKR p58.1 est le récepteur contrepartie de NKR
pSO.l, et réciproquement; de même le réceptetu NKR p58.2 et le récepteur contrepartie de NKR p50.2 sont fiuz pour l'autre des contreparties fonctionnelles.
La présente méthode permet donc notamment de distinguer un récepteur NKR (ou contrepartie de NKR) d'un récepteur contrepartie fonctionnelle de ce récepteur.
La (ou les) paires) d'oligonucléotides 3' et 5' est (sont) en particulier capables de borner, sur fADN ou l'ADNc d'iui récepteur cible qui leur correspond, une séquence d'oligonucléotides {bornes incluses) qui est absente de la séquence ADN ou ADNc d'un récepteur avec lequel elles) est (sont) capables) de ne pas s'hybrider dans les conditions d'hybridation données sous i) ci-dessus.
De manière avantageuse, ladite ou au moins une desdites paires) d' oligonucléotides 3' et S' utilisées) est en outre capable, dans les mêmes conditions d'hybridation que celles définies sous i., de ne pas s'hybrider à
l'ADN
ou ADNc d'un récepteur, indifféremment NKR ou contrepartie de NKR, autre que ledit récepteur cible.
Selon une disposition particulière de cette manière avantageuse, ladite (ou au moins une desdites) paires) d'oligonucléotides 3' et 5' capable, dans les conditions d'hybridation définies sous i. ci-dessus, de s'hybrider à l'ADN ou l'ADNc d'un récepteur p58.1 (ou p50.1 ), et de ne pas s'hybrider à l'ADN ou l'ADNc d'un récepteur p50.1 (ou respectivement p58.1) est en outre capable de ne pas s'hybrider dans les mêmes conditions d'hybridation à l'ADN ou l'ADNc d'un récepteur p58.2 ou p50.2.
Selon une deuxième disposition particl~lière de cette manière avantageuse, ladite, ou au moins une desdites, paires) d'oligonucléotides 3' et 5' capable, dans les conditions d'hybridation définies sous i. ci-dessus, de s'hybrider à l'ADN
ou l'ADNc d'un récepteur p58.2 (ou p50.2), et de ne pas s'hybrider â l'ADN ou I'ADNc d'un récepteur p50.2 (ou respectivement p58.2) est en outre capable de ne pas s'hybrider dans les mêmes conditions d'hybridation à l'ADN ou l'ADNc d'un récepteur p58.1 ou p50.1.
Selon une troisième disposition particulière de cette manière avantageuse, ladite (ou au moins une desdites) paires) d'oligonuclëotides 3' et 5' capable, dans Ies conditions d'hybridation définies sous i. ci-dessus, de s'hybrider à l'ADN
ou I'ADNc d'un récepteur p70.INH (ou p70.ACT), et de ne pas s'hybrider à l'ADN
ou l'ADNc d'un récepteur p70.ACT {ou respectivement p70.II~ est en outre capable de ne pas s'hybrider dans les mêmes conditions d'hybridation à I'ADN
ou l'ADNc d'un récepteur p140.INH ou p140.ACT.
Selon une quatrième disposition particulière de cette manière avantageuse, ladite, ou au moins une desdites, paires) d'oligonucléotides 3' et 5' capable, dans les conditions d'hybridation définies sous i. ci-dessus, de s'hybrider à l'ADN
ou l'ADNc d'un récepteur p140.INH (ou p140.ACT), et de ne pas s'hybrider à l'ADN
ou l'ADNc d'un récepteur p 140.ACT (ou respectivement p 140.IN~ est en outre capable de ne pas s'hybrider dans les mêmes conditions d'hybridation à l'ADN
ou l'ADNc d'un récepteur p70.1NH ou p70.ACT.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'oligonucléotide S' d'une dite paire d'oligonucléotides 3' et 5' utilisée pour un récepteur cible NKR
(ou contrepartie de NKR) est capable, dans les conditions d'hybridation dëfinies sous i. ci-dessus, de s'hybrider à l'ADN ou à l'ADNc d'un récepteur contrepartie de NKR {ou respectivement NKR), contrepartie fonctionnelle dudit récepteur cible NKR (ou respectivement contrepartie de NKR). Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, la séquence de l'oligonucléotide 5' d'une dite paire d'oligonuclëotides 3' et 5' utilisée poL~r un récepteur cible NKR
(ou contrepartie de NKR) comprend la séquence de I'oligonucléotide 5' d'une autre dite paire d'oligonucléotides 3' et 5' ayant poLU récepteur cible tm récepteur contrepartie de NKR (ou respectivement NKR), contrepartie fonctionnelle dudit récepteur cible NKR (ou respectivement contrepartie de NKR).
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, I'oligonucléotide 3' d'une dite paire d'oligonucléotides 3' et 5', utilisée pour un récepteur cible KAR, est capable, dans les mêmes dites conditions d'hybridation, de s'hybrider à l'ADN ou ADNc dudit récepteur cible KAR au niveau d'un enchaînement nucléotidique qui comprend une séquence correspondant, selon le code génétique universel, et en tenant compte de la dégénérescence dudit code, à
la séquence d' acides aminés Lys Ile Pro Phe Thr IIe (K I P F T I) ou Lys Leu Pro Phe Thr Ile (K L P F T I) (SEQ ID n°26 ou 27).
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, ladite (ou au moins une desdites) paires) d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur KIR est choisie parmi le groupe de paires d'oligonucléotides 3' et 5' constitué par un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ü7 n°1, ou une séquence en dérivant, et au moins un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID
n°5, n°2, n°6 ou n°7, ou une séquence en dérivant, un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°4, ou Lme séquence en dérivant, et au moins un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID
n°5, n°2, n°6 ou n°7, ou une séquence en dérivant, un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ m n°9, ou une séquence en dérivant, et au moins un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ m n°5, n°2, n°6 ou n°7, ou une séquence en dérivant, au moins un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ m n° 10, n° 11, n° 12, ou n° 13, ou une séquence en dérivant, et wz oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ 1D n°14, ou une séquence en dérivant.
Par séquence dérivant d'une premiëre séquence, nous entendons dans la présente demande une séquence dérivée de la premiére notamment par inversion, délétion, addition, ou substitution de nucléotide(s), et présentant les propriétés d'hybridation que l'acide nucléique correspondant à la première séquence présente dans Ies conditions i. ci-avant définies.
Selon une disposition de ce mode de réalisarion particulièrement avantageux, ladite paire d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur p58.1 correspond à un oligonucléotide 5' comprenant la SEQ m n°1, ou une séquence en dérivant, et Lui équimélange de quatre oligonucléotides 3', chacun d'eux comprenant la SEQ 1D n°5, n°2, n°6 ou n°7, ou une séquence en dérivant.
Selon une autre disposition de ce mode de réalisation particuliérement avantageux, ladite paire d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur p58.2 correspond à un oligonucléotide 5' comprenant la SEQ m n°4, ou une séquence en dérivant, et un équimélange de quatre oligonucléotides 3', chacun d'eux comprenant la SEQ 117 n°5, n°2, n°6 ou n°7, ou une séquence en dérivant.
Selon encore une autre disposition de ce mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite paire d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur p70.INH correspond à un oligonucléotide S' comprenant la SEQ m n°9, ou Lme séquence en dérivant, et un équimélange de WO 99IZ0794 PCTIE'R98/02244 quatre oligonucléotides 3', chacun d'ei~~ comprenant la SEQ ID n°5, n°2, n°6 ou n°7, ou une séquence en dérivant.
Selon encore une autre disposition de ce mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite paire d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur p 140.INH correspond â un équimélange de quatre oligonucléotides ~', chacun d'eux comprenant la SEQ )D n° 10, n°
11, n° I 2 ou n° 13, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la SEQ
m n° 14, ou une séquence en dérivant.
Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, ladite (ou au moins une desdites) paires) d'oligonucléotides 3' et 5' avant pour récepteLU cible un réceptetu- KAR est choisie parmi le groupe de paires d'oligonucléotides 3' et 5' constitué par - un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°1, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ 1D n°3, ou une séquence en dérivant, - un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°8, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ B7 n°3, ou une séquence en dérivant, - un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ m n°9, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ m n°3, ou une séquence en dérivant, - un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ m n° 15, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ IL7 n°3, ou une séquence en dérivant.
Selon une disposition de cet autre mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite paire d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur p50.1 correspond à un oligonucléotide 5' comprenant la SEQ )17 n°1, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la SEQ >I7 n°3, ou une séquence en dérivant.
Selon une autre disposition de cet autre mode de réalisation particuliërement avantageux, ladite paire d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur p50.2 correspond à tui oligonucléotide 5' comprenant la SEQ ID n°8, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la SEQ ID n°3, ou une séquence en dérivant.
Selon encore une autre disposition de cet autre mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite paire d' oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur p70.ACT correspond à un oligonucléotide 5' comprenant la SEQ ID n°9, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la SEQ ID n°3, ou une séquence en dérivant.
Selon encore une autre disposition de cet autre mode de réalisation particuliërement avantageux, ladite paire d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur p140.ACT correspond à un oligonucléotide 5' comprenant la SEQ ID n°15, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la SEQ m n°3, ou une séquence en dérivant.
Selon encore un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, ladite (ou au moins une desdites) paires) d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteLU NKG2 est choisie parmi le groupe de paires d'oligonucléotides 3' et 5' constitué par - un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ m n° 16, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ m n°17, ou une séquence en dérivant, - un oligonucléotide S' comprenant la séquence SEQ >D n° 18, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant Ia séquence SEQ 1T7 n° I 7, ou une séquence en dérivant, - un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ m n° 19, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID
n° 17, ou une séquence en dérivant, - un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°20, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID
n°21, ou une séquence en dérivant.
Selon une première disposition de cet encore autre mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite paire d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur NKG2A (inhibiteur) correspond à un oligonucléotide 5' comprenant la SEQ ID n° 16, ou une séquence en dérivant, et m oligonucléotide 3' comprenant la SEQ m n°17, ou une séquence en dérivant.
Selon une deuxième disposition de cet encore autre mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite paire d' oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur NKG2B (inhibiteur) correspond à un oligonucléotide 5' comprenant la SEQ 1D n° 18, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la SEQ m n° 17, ou une séquence en dérivant.
Selon une troisième disposition de cet encore autre mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite paire d' oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur NKG2C (activateur) correspond à un oligonucléotide 5' comprenant la SEQ ID n° 19, ou une séquence en dérivant, et zm oligonucléotide 3' comprenant la SEQ m n°17, ou une séquence en dérivant.
Selon une quatrième disposition de cet encore autre mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite paire d' oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur NKG2D (activateur) correspond à un oligonucléotide 5' comprenant la SEQ m n°20, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la SEQ ID n°21, ou une séquence en dérivant.
Lesdites conditions favorables à l'hybridation de la ou des paires d'oligonucléotides 3' et 5' mises en contact avec l'ADN ou l'ADNc de l'échantillon biologique correspondent avantageusement à une incubation pendant 1 min dans un tampon [Tris-HCI 20mM pH8,4; KCl SOmM; MgCl2 2,SmM] à une température comprise entre 50°C et 65°C environ. De telles conditions sont en particulier présentées dans les exemples.
De manière avantageuse, les deux oligonucléotides 3' ou 5' d'une même dite paire sont chacun couplés à un marqueur, notamment couplée à un marqueur fluorescent ou radioactif, tel que du 32P, permettant la révélation des hybrides qu'ils forment éventuellement avec lesdites populations ADN ou ADNc dudit échantillon biologique.
De manière également avantageuse, ladite (ou lesdites) paires) d'oligonucléotide(s) 3' et 5' sert (servent) d'amorces respectivement 3' et 5' pour une extension par ADN polvmérase, telle qu'une Taq polymérase. Des conditions favorables à une telle extension comprennent, outre l'ajout d'ADN polymérase, (ajout des 4 dNTP (désoxyribonucléoside-triphosphate) en présence d'un tampon de type Tris-HCI.
Lesdits hybrides éventuellement formés sont alors, préalablement à leur détection, amplifiés par au moins une PCR (amplification en chaîne par polymérase; cf. les brevets EP 201 184 et EP 200 362) ou RT-PCR dans le cas d'ADNc rétrotranscrit à partir d'ARNm. Le cas échéant, lesdits hybrides éventuellement formés sont amplifiés par "Nested PCR" (double PCR emboîtée).
Des exemples de conditions favorables à (amplification par PCR sont donnés dans les exemples.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de (invention, ladite détection des hybrides éventuellement formés comprend en outre la résolution sur gel de polyacrylamide du mélange réactionnel issu de la mise en contact, ainsi que la révélation de la présence ou de l'absence de bandes électrophorétiques contenant lesdits hybrides éventuellement formés.
Selon un autre mode de réalisation de (invention, le répertoire en immunorécepteurs documenté est quantifié par référence aux quantités de b-actine mesurées sur le même échantillon biologique, ou par référence aux quantités d'une molécule spécifique d'un type cellulaire présentes dans ledit échantillon biologique, tel que notamment les molécules CD56 pour les cellules NK.
La méthode selon l'invention peut être appliquée à Ia documentation d'un répertoire génotypique en immunorécepteurs NKR et/ou en immLmorëcepteurs contreparties de NKR : l'étape ü. de mise en contact définie ci-dessus est alors réalisée avec les populations ADN génomique de l'échantillon biologique.
La méthode selon l'invention peut également étre appliquée à la documentation d'un répertoire d'expression en immunorécepteurs NKR et/ou en immimorécepteurs contreparties de NKR : l'étape ü. de mise en contact définie ci-dessus est alors réalisée avec les populations ADNc, rétro-transcrites des populations ARI~Im de l'échantillon biologique.
Des échantillons biologiques d'origine humaine ou animale particulièrement appropriés à la mise en oeuvre de Ia méthode selon l'invention comprennent du sang périphérique, de la moelle osseuse, des lymphocytes, des cellules NK
et/ou T, des cellules transgéniques exprimant des immunorécepteurs, une fraction isolée à partir de ces échantillons.
La méthode selon l'invention peut être notamment appliquée au criblage d'une banque d'organes, de tissus ou de cellules.
Elle permet ainsi une meilleure prévision - de l'acceptation ou de rejet, par un homme ou un animal, de cellules, d'un tissu ou d'un organe génétiquement di~férent(es), - de l' inocuité ou de la pathogénicité (effet GVH), pour un homme ou un animal, d'une greffe ou transplantation, en particulier de cellules, tissu, ou organe génétiquement différent(es), - d'un effet potentiel de type GVL que des cellules, un tissu ou un organe génétiquement différentes) pourraient exercer sur un homme ou animal.
La méthode selon l'invention permet également le suivi de l'éventuelle apparition de telles réactions après greffe ou transplantation allo- ou xénogénique.
La méthode selon l'invention peut également être appliquée à la détermination de I' état d' activation de celh~les NK et/ou T à un instant donné
chez un animal ou un homme. Elle permet alors la prévision ou le suivi de l'état de résistance d'un animal ou d'un homme vis-à-vis d'une infection virale, telle qu'une infection par un V»-I, d'une infection parasitaire, telle que la malaria, d'une infection bactérienne, vis-à-vis d'une maladie auto-immune, telle que la polyarthrite rhumatoïde, ou bien encore vis-à-vis du développement de cellules malignes telles que des cellules leucémiques. L'utilisation prévisionnelle de la méthode selon l'invention est d'un intérêt particulier dans le cadre d'épidémies.
La méthode selon l'invention peut également être avantageusement appliquée au criblage de médicaments actifs vis-à-vis de maladies infectieuses, de maladies auto-immunes, ou de maladies tumorales.
La présente invention a également pour objet un kit pour Ia mise en oeuvre de ladite méthode comprenant dans un récipient, au moins une dite paire d' oligonucléotides, les réactifs pour la réalisation de ladite ou lesdites méthodes) tels que tampon, marqueur (éventuellement couplé aux oligonucléotides de la dite paire), ainsi qu'un mode d'emploi.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront encore à travers les exemples de réalisation suivants, donnés à titre indicatif et non limitatifs.
Lesdits exemples font référence aux Figures 1 et 2 La Figure 1 représente les produits issus d'une amplification par PCR
(amplification en chaîne par polymérase après RT transcription enzymatique inverse à l'aide de paires d'oligonucléoüdes selon l'invention servant d'amorces), des séquences codantes pour p50.2 (Fig. lA) et p58.2 (Fig.IB) dans des cellules NK humaines;
La Figure 2 représente les produits issus d'une amplification par PCR de la WO 99/20794 1,~ PCT/FR98/02244 séquence codante pour p50.2 à partir du DNA génomique de souris transgéniques p50.2~.
Exemple 1 : Documentation du répertoire NKR/contreparties de NKR exprimé
par une population de cellules NK hlunaines (RT-PCR).
1. Préparation des ARN
Des préparations ARN ont été réalisées à partir de cellules NK humaines clonées et phénotypées p50.2+ et/ou p58.2+. La technique immunologique ne permet pas de documenter précisément un tel répertoire : l'anticorps GL183 (Immunotech) reconnaît à la fois le récepteur NKR inhibiteur p58.2 et sa contrepartie activatrice p50.2. Des cellules NK hiunaines clonées et phénotypées p~0.2- et p58.2- à l'aide de l'anticorps GL183 servent de témoins négatifs.
Les préparations ARN sont réalisées comme suit.
Extraction 100 ~.1 de Trizol (Gibco BRL catégorie n°15596-026) ont été ajoutés à
cellules. On mélange en pipetant plusieurs fois, sans utiliser de mélangeur à
vortex. On laisse la solution 5 minutes à température ambiante puis on ajoute 20 ~.l de chloroforme sans alcool isoamylique. On mélange à nouveau sans utiliser de mélangeur à vortex et on laisse la solution se reposer 5 minutes à
température ambiante. On centrifuge alors à 4°C pendant 15 minutes de manière à
bien séparer la phase organique inférieure, qui contient (ADN, de la phase aqueuse supérieure qui contient l'ARN. On récupère la phase aqueuse sans perturber (interface entre phase aqueuse et phase organique.
Précipitation 50 ~1 d'isopropanol sont ajoutés à la phase aqueuse et on laisse TARN
précipiter pendant 15 minutes à température ambiante. On centrifuge alors pendant 10 minutes à 4°C. Le surnageant est éliminé, et le culot est lavé avec I00 ~1 d'éthanol à 70%. Après centrifugation pendant 5 minutes à 4°C (7500 g), on laisse sécher à Pair libre (sans sécher sous vide). Le culot d'ARN est remis en WO 99/20794 1 g PCT/FR98102244 suspension dans 20 ml d'H2(J.
2. Préparation des paires d'oli~onucléotides Le tableau 1 ci-dessous présente les paires d'oligonucléotides utilisées. Sont ici rapportés les résntats relatifs à l'utilisation des paires d'oligonucléotides C (SEQ
ID n°4 eu tant qu'oligonucléotide 5' et lm équünélange de SEQ ID
n°5, n°2, n°6 et n°? en tant qu'oligonucléotide 3') et D (SEQ ID n°$ en tant qu'oligonucléotide 5' et SEQ II7~ n°3 en tant qu'oligonucléotide 3') présentées dans le tableau 1. Les séquences ADNc, sur la base desquelles ces paires d'oligonucléotides ont été
mises au point, sont présentées dans le tableau 2 ci-dessous (nom des clones ADNc et numéro d'accès sm- Genbank). Pour chaque paire d'oligonucléotides, ont ainsi été pris en compte les variants alléliques et Ies variants d'excision-épissage (épissage alternatif connus d'un même récepteur.
Chaque paire d'oligonucléotides est construite, après alignement des séquences ADNc connues des différents variants d'un même récepteur cible (e.g.
le KIR p~8.2), de manière à ce que cette paire puisse déterminer, sur (ensemble de ces variants, les bornes d'un fragment consensus, sans pour autant pouvoir faire de même sur un quelconque variant du récepteur contrepartie du récepteur cible (e.g. le KAR p50.2). La séquence de chaque oligonucléotide d'une même paire est ensuite optimisée de manière à ce que la température d'annelage (annealing en anglais) de chacune d'elles soit proche (e.g. ~T < 5°C).
Chaque oligonucléotide présente en effet me température d'annelage (ou d'hybridation) qui lui est propre. Cette température d'annelage est fonction du rapport R = G + ~ x100 et de la longueur de foligonucléotide nombre total de bases (A+T+G+C) considéré, selon la formule : Température d'annelage (ou d'hybridation) d'un oligonucléotide =
Tm = 69,3 + 0,41{R) - longueur~en pb (en °C) Or, dans une réaction de type amplification en chaûie par polymérase les oligonucléotides d'une même paire doivent pouvoir tous deux s'anneler au récepteur cible dans des conditions de réaction communes, ceci afin de servir d'amorces à l'amplification du fragment consensus. Si les oligonucléotides d'une même paire présentent des températtues propres d'annelage proches (e.g.
54°C et 56°C), ils pourront s'hybrider au récepteur cible, sans pour autant s'hybrider au rëcepteur contrepartie correspondant, à une température de 54°C ou 55°C.
Si les oligonucléotides d'une même paire présentent par contre des températures propres d'annelage très distantes (e.g. 49°C et 56°C), la réaction d'hybridation au récepteur cible est préférentiellement conduite à la plus basse des deux températures (e.g. 49°C ou 50°C), ce qui permet de maintenir la reconnaissance de sa cible nucléotidique par foligonucléotide dont la température propre d'annelage est la plus basse. Dans cette situation, une diminution de spécificité peut toutefois intervenir : il peut être observé que certaines paires d'oligonucléotides parviennent, dans de telles conditions de température, à
s'hybrider au récepteur-contrepartie du récepteur cible. Une manière de remédier à cette perte de spécificité consiste à augmenter la longueur de foligonucléotide dont la température propre d'annelage est la plus basse, sans faire perdre à
la paire d'oligonucléotides considérée sa spécificité.
ID n°4 eu tant qu'oligonucléotide 5' et lm équünélange de SEQ ID
n°5, n°2, n°6 et n°? en tant qu'oligonucléotide 3') et D (SEQ ID n°$ en tant qu'oligonucléotide 5' et SEQ II7~ n°3 en tant qu'oligonucléotide 3') présentées dans le tableau 1. Les séquences ADNc, sur la base desquelles ces paires d'oligonucléotides ont été
mises au point, sont présentées dans le tableau 2 ci-dessous (nom des clones ADNc et numéro d'accès sm- Genbank). Pour chaque paire d'oligonucléotides, ont ainsi été pris en compte les variants alléliques et Ies variants d'excision-épissage (épissage alternatif connus d'un même récepteur.
Chaque paire d'oligonucléotides est construite, après alignement des séquences ADNc connues des différents variants d'un même récepteur cible (e.g.
le KIR p~8.2), de manière à ce que cette paire puisse déterminer, sur (ensemble de ces variants, les bornes d'un fragment consensus, sans pour autant pouvoir faire de même sur un quelconque variant du récepteur contrepartie du récepteur cible (e.g. le KAR p50.2). La séquence de chaque oligonucléotide d'une même paire est ensuite optimisée de manière à ce que la température d'annelage (annealing en anglais) de chacune d'elles soit proche (e.g. ~T < 5°C).
Chaque oligonucléotide présente en effet me température d'annelage (ou d'hybridation) qui lui est propre. Cette température d'annelage est fonction du rapport R = G + ~ x100 et de la longueur de foligonucléotide nombre total de bases (A+T+G+C) considéré, selon la formule : Température d'annelage (ou d'hybridation) d'un oligonucléotide =
Tm = 69,3 + 0,41{R) - longueur~en pb (en °C) Or, dans une réaction de type amplification en chaûie par polymérase les oligonucléotides d'une même paire doivent pouvoir tous deux s'anneler au récepteur cible dans des conditions de réaction communes, ceci afin de servir d'amorces à l'amplification du fragment consensus. Si les oligonucléotides d'une même paire présentent des températtues propres d'annelage proches (e.g.
54°C et 56°C), ils pourront s'hybrider au récepteur cible, sans pour autant s'hybrider au rëcepteur contrepartie correspondant, à une température de 54°C ou 55°C.
Si les oligonucléotides d'une même paire présentent par contre des températures propres d'annelage très distantes (e.g. 49°C et 56°C), la réaction d'hybridation au récepteur cible est préférentiellement conduite à la plus basse des deux températures (e.g. 49°C ou 50°C), ce qui permet de maintenir la reconnaissance de sa cible nucléotidique par foligonucléotide dont la température propre d'annelage est la plus basse. Dans cette situation, une diminution de spécificité peut toutefois intervenir : il peut être observé que certaines paires d'oligonucléotides parviennent, dans de telles conditions de température, à
s'hybrider au récepteur-contrepartie du récepteur cible. Une manière de remédier à cette perte de spécificité consiste à augmenter la longueur de foligonucléotide dont la température propre d'annelage est la plus basse, sans faire perdre à
la paire d'oligonucléotides considérée sa spécificité.
3.Amplification en chaîne par polymérase après transcription enzymatigue inverse (RT-PCR~
p.g d'ARN totaux sont transcrits en ADNc par incubation avec une transcriptase inverse (RT) à (aide du kit First Strand DNA-Ready to go (Pharmacia). 10 ~.l d'ADNc sur les 33 ~l obtenus sont mis en contact avec les paires d'oligonucléotides C et D qui servent alors d'amorces (c~ tableau 1):
10 p,l de produit issu de RT; Tampon PCR lOX : lOpl; MgCl2 SOmM; dXTP 10 mM;
Oligonucléotides 3' à 10 pM : 5 Vil; Oligonucléotide 5' 10 ~,M : 5 p,I; Taq polymérase : 0,5 Vil; H20 : qsp 100 p.l. L'amplification par PCR (DNA engine
p.g d'ARN totaux sont transcrits en ADNc par incubation avec une transcriptase inverse (RT) à (aide du kit First Strand DNA-Ready to go (Pharmacia). 10 ~.l d'ADNc sur les 33 ~l obtenus sont mis en contact avec les paires d'oligonucléotides C et D qui servent alors d'amorces (c~ tableau 1):
10 p,l de produit issu de RT; Tampon PCR lOX : lOpl; MgCl2 SOmM; dXTP 10 mM;
Oligonucléotides 3' à 10 pM : 5 Vil; Oligonucléotide 5' 10 ~,M : 5 p,I; Taq polymérase : 0,5 Vil; H20 : qsp 100 p.l. L'amplification par PCR (DNA engine
4 PCT/FR98/02244 PTC 200, MJ Research, Massachussets) est réalisée en suivant les étapes suivantes - étape n° 1 (dénaturation initiale) : 5 min à 94°C, - étape n°2 : 35 cycles comprenant a) dénaturation 1 min à 94°C
b) annelage 1 min à 55°C pour la paire C et 50°C poiu- la paire D d'oligonucléotides, c) extension 1 min à 72°C, - étape n°3 : (extension finale) 1 min à 72°C.
La durée de l'extension 2c peut ëtre augmentée si le fragment à amplifier a une grande taille (e.g. supérieure à 1000-I400pb environ).
La température de l'étape d'annelage 2b dépend de la paire d'oligonucléotides utilisés comme amorces (cf. point 2. ci-avant). EIIe correspond à une température consensus entre les températures propres d'annelage de chacun des deux oligonucléotides faisant paire (température moyenne ou température la plus basse des deux). Cette température est généralement comprise entre 45°C et 70°C, préférentiellement entre 50°C et 65°C.
IO ~1 des produits issus de l'amplification par RT-PCR sont résolus par electrophorèse sur gel d'agarose à 2% en parallèle avec des marqueurs de poids moléculaires (1V~.
Les résultats sont illustrés sur les figures lA et 1B.
La figure 1 illustre l'amplification par PCR après RT (transcription enzymatique inverse) des séquences codantes pour p58.2 et p50.2 de cellules NK humaines.
En figure lA est illustrée le résultat de la résolution électrophorétique des produits issus de l'amplification par RT-PCR après mise en contact de la paire d'amorces D selon L'invention (cf. tableau 1) avec les populations ADNc de cellules NK humaines phénotypées p50.2+ et p58.2+ (piste +) à l'aide de l'anticorps GL 183, ou avec les populations ADNc de cellules NK humaines phénotypées p50.2- et p58.2- (piste -) à l'aide de ce même anticorps GL183. En piste M, sont résolus des marqueurs de poids moléculaire.
En figure 1 B, est illustrée le résultat de la résolution électrophorétique des produits issus de l'amplification par RT-PCR après mise en contact de la paire d'amorces C selon l'invention (cf. tableau 1 ) avec les populations ADNc de cellules NK humaines phénotypées p50.2+ et p58.2+ (piste +) à l'aide de l'anticorps GL183, ou avec les populations ADNc de cellules NK humaines phénotypées p50.2- et p~8.2- (piste -) à l'aide de ce même anticorps GL183. En piste M, sont résolus des marqueurs de poids moléculaire.
iI peut observé que les paires d'oligonucléotides C et D selon l'invention permettent de reconnaître respectivement un phénotype, respectivement, p58.2+
et p50.2+, en reconnaissant un fragment de, respectivement, 653 pb et 533pb.
La méthode selon l'invention permet donc de discriminer entre un phénotype p58.2+
(récepteur KIR, à fonction inhibitrice) et iul phénotype p50.2+ (récepteur KAR
contrepartie de p58.2, à fonction activatrice), ce qui n'était jusqu'à présent pas réalisable sous séquençage.
Exemple 2 . ~ Documentation du répertoire génétique (potentiel) NKR/contreparties de NKR d'une population de splénocytes de souris transgéniques p50.2+ (PCR).
1 - Préparation des ADN
Des préparations ADN ont été réalisées à partir de splénocytes de souris transgéniques p50.2+. La technique immunologique ne permet pas de déterminer si de tels splénocytes sont p50.2+ (récepteur KAR, activateur) ou p58.2+
(récepteur KIR, inhibiteur, ou bien encore p50.2+ et p58.2+). Des splénocytes de souris non transgéniques (p50.2-) servent de témoins négatifs.
Extraction Cette étape est réalisée comme décrit en exemple 1. Les ADN étant contenus dans la phase organique inférieure, c'est ici cette phase qiû est récupérée après avoir éliminé la phase aqueuse et iui peu d'interface.
Préci~ftation On ajoute 30 ~.l d'éthanol à 100% et on laisse reposer 5 minutes à température ambiante. Après centrifugation pendant 5 minutes à 4°C (2 OOOg), on jette le surnageant et on lave le culot avec 100 ~1 de citrate de sodium 0, i M dans de l'éthanol à IO%. On laisse 30 minutes à température ambiante en mélangeant de temps en temps. On centrifuge pendant 5 minutes à 4°C (2 OOOg). On répète ce lavage une seconde fois.
Le culot d'ADN obtenu est remis en suspension dans 200 ~.l d'éthanol à 70%. On laisse 15 minutes à température ambiante en mélangeant de temps en temps et on centrifuge pendant S minutes à 4°C (2 OOOg).
Le culot est mis à sécher brièvement sous vide (1 à 2 pg d'ADN environ sont obtenus) et est remis en suspension dans 10 ~1 de NaOH 8mM. En cas de présence de matériel insoluble, on microcentrifuge 10 minutes à température ambiante. On transfere Ie stunageant dans un nouveau tube. Le pH est neutralisé
en ajoutant 1,25 pl d'Hepes 0,1 M pour 10 Ixl.
2 - Préparation des paires d'oligonucléotides Les paires d'oligonucléotides sont préparées comme décrit en exemple 1. Sont ici rapportés les résultats relatifs à la paire D d'oligonucléotides {SEQ m n°8 en tant qu'oligonucléotide 5' et SEQ ID n°3 en tant qu'oligonucléotide 3') selon (invention {cf. tableau 1 ci-dessous).
3 - Amplification en chaîne par polymérase (PCR~
L'amplification en chaîne par polymérase est réalisée comme décrit en exemple en mettant en contact les préparations d'ADN génomiques obtenues avec des paires d'oligonucléotides D servant alors d'amorces.
Les produits issus de l'amplification sont résolus sur gel d'agarose à 2% en parallèle avec des marqueurs de poids moléculaires (M).
Les résultats de résolution électrophorétique sur gel d'agarose à 2% des produits issus de la PCR sont ïllustrés par la figure 2.
La figure 2 illustre l'amplification par PCR de la séquence codante pour p50.2 à
partir du DNA génomique de splénocytes de soLU is transgéniques p50.2+ : y est illustrée le résultat de la résolution électrophorétique des produits issus de l'amplification par PCR après mise en contact de la paire d'amorces D selon l'invention (cf tableau 1) avec les populations ADN de splénocytes de souris transgéniques p50.2+ (pistes +) ou de souris non transgéniques p~0.2- (pistes -).
En piste M, sont résolus des marqueurs de poids moléculaires.
Les amorces D selon l'invention permettent de reconnaître un fragment de 533 pb présent sur l'ADN de splénocytes miu-ins p50.2+ et absent sur l'ADN de splénocytes marins p50.2-.
Des résultats comparables ont été obtenus avec les paires d'oligonucléotides A, B et E à L présentées dans le tableau 1 ci-après et ont également permis de documenter les récepteurs visés (cf. colonne "molécule" du tableau 1 ).
Les répertoires NKR etlou contreparties de NKR. ainsi documentés peuvent être, notamment à l'aide d'études biostatiques classiques, corrélés à des situations physiologiques ou pathologiques données, liées à ces répertoires, et au contrôle de l'activation des cellules les exprimant en général.
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I~'KAT-3DA L76664 D cl-49 U24079 cl-39 U24077 cl-1.1 X94373 cl-11 U30274 cl-2 U30273 NKAT-4 H~ L76666 cl-5 U30272 WO 99/20794 2~ PCT/FR98/02244 Tableau 2 {suite)
b) annelage 1 min à 55°C pour la paire C et 50°C poiu- la paire D d'oligonucléotides, c) extension 1 min à 72°C, - étape n°3 : (extension finale) 1 min à 72°C.
La durée de l'extension 2c peut ëtre augmentée si le fragment à amplifier a une grande taille (e.g. supérieure à 1000-I400pb environ).
La température de l'étape d'annelage 2b dépend de la paire d'oligonucléotides utilisés comme amorces (cf. point 2. ci-avant). EIIe correspond à une température consensus entre les températures propres d'annelage de chacun des deux oligonucléotides faisant paire (température moyenne ou température la plus basse des deux). Cette température est généralement comprise entre 45°C et 70°C, préférentiellement entre 50°C et 65°C.
IO ~1 des produits issus de l'amplification par RT-PCR sont résolus par electrophorèse sur gel d'agarose à 2% en parallèle avec des marqueurs de poids moléculaires (1V~.
Les résultats sont illustrés sur les figures lA et 1B.
La figure 1 illustre l'amplification par PCR après RT (transcription enzymatique inverse) des séquences codantes pour p58.2 et p50.2 de cellules NK humaines.
En figure lA est illustrée le résultat de la résolution électrophorétique des produits issus de l'amplification par RT-PCR après mise en contact de la paire d'amorces D selon L'invention (cf. tableau 1) avec les populations ADNc de cellules NK humaines phénotypées p50.2+ et p58.2+ (piste +) à l'aide de l'anticorps GL 183, ou avec les populations ADNc de cellules NK humaines phénotypées p50.2- et p58.2- (piste -) à l'aide de ce même anticorps GL183. En piste M, sont résolus des marqueurs de poids moléculaire.
En figure 1 B, est illustrée le résultat de la résolution électrophorétique des produits issus de l'amplification par RT-PCR après mise en contact de la paire d'amorces C selon l'invention (cf. tableau 1 ) avec les populations ADNc de cellules NK humaines phénotypées p50.2+ et p58.2+ (piste +) à l'aide de l'anticorps GL183, ou avec les populations ADNc de cellules NK humaines phénotypées p50.2- et p~8.2- (piste -) à l'aide de ce même anticorps GL183. En piste M, sont résolus des marqueurs de poids moléculaire.
iI peut observé que les paires d'oligonucléotides C et D selon l'invention permettent de reconnaître respectivement un phénotype, respectivement, p58.2+
et p50.2+, en reconnaissant un fragment de, respectivement, 653 pb et 533pb.
La méthode selon l'invention permet donc de discriminer entre un phénotype p58.2+
(récepteur KIR, à fonction inhibitrice) et iul phénotype p50.2+ (récepteur KAR
contrepartie de p58.2, à fonction activatrice), ce qui n'était jusqu'à présent pas réalisable sous séquençage.
Exemple 2 . ~ Documentation du répertoire génétique (potentiel) NKR/contreparties de NKR d'une population de splénocytes de souris transgéniques p50.2+ (PCR).
1 - Préparation des ADN
Des préparations ADN ont été réalisées à partir de splénocytes de souris transgéniques p50.2+. La technique immunologique ne permet pas de déterminer si de tels splénocytes sont p50.2+ (récepteur KAR, activateur) ou p58.2+
(récepteur KIR, inhibiteur, ou bien encore p50.2+ et p58.2+). Des splénocytes de souris non transgéniques (p50.2-) servent de témoins négatifs.
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Le culot d'ADN obtenu est remis en suspension dans 200 ~.l d'éthanol à 70%. On laisse 15 minutes à température ambiante en mélangeant de temps en temps et on centrifuge pendant S minutes à 4°C (2 OOOg).
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2 - Préparation des paires d'oligonucléotides Les paires d'oligonucléotides sont préparées comme décrit en exemple 1. Sont ici rapportés les résultats relatifs à la paire D d'oligonucléotides {SEQ m n°8 en tant qu'oligonucléotide 5' et SEQ ID n°3 en tant qu'oligonucléotide 3') selon (invention {cf. tableau 1 ci-dessous).
3 - Amplification en chaîne par polymérase (PCR~
L'amplification en chaîne par polymérase est réalisée comme décrit en exemple en mettant en contact les préparations d'ADN génomiques obtenues avec des paires d'oligonucléotides D servant alors d'amorces.
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La figure 2 illustre l'amplification par PCR de la séquence codante pour p50.2 à
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Des résultats comparables ont été obtenus avec les paires d'oligonucléotides A, B et E à L présentées dans le tableau 1 ci-après et ont également permis de documenter les récepteurs visés (cf. colonne "molécule" du tableau 1 ).
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Claims (23)
1.Méthode in vitro de documentation d'un répertoire en immunorécepteur(s) NKR comprenant notamment les récepteurs KIR p58.1, p58.2, p70.INH, p140.INH, et les récepteurs NKG2A et NKG2B, et/ou d'un répertoire en immunorécepteur(s) contrepartie(s) de NKR, comprenant notammanent les récepteurs KAR p50.1, p50.2, p70.ACT, p140.ACT, et les récepteurs NKG2C, NKG2D, NKG2E, NICG2F, ces immunorécepteurs étant ci-après désigné(s) récepteur(s) cible(s), caractérisée en ce qu'elle comprend i. l'utilisation d'au moins une paire d'oligonucléotides, l'un étant désigné
oligonucléotide 3' et l'autre oligonucléotide 5', les oligonucléotides 3' et 5' d'une même dite paire étant tous deux capables, dans des conditions d'hybridation correspondant à une incubation pendant 1 min dans un tampon [Tris-HCl 20mM pH8,4; KCl 50mM; MgCl2 2,5mM] à une température comprise entre 50°C et 65°C environ, de s'hybrider à l'ADN ou à
l'ADNc d'un récepteur cible NKR, ou contrepartie de NKR, mais ne s'hybridant pas, dans les mêmes conditions d'hybridation, avec l'ADN ou l'ADNc d'un récepteur contrepartie de NKR, ou respectivement d'un récepteur NKR, contrepartie fonctionnelle dudit récepteur cible, ii. la mise en contact de populations ADN ou ADNc d'un échantillon biologique d'origine humaine ou animale pour lequel on souhaite documenter le répertoire en immunorécepteur(s) cible(s), avec un excès d'au moins une paire d'oligonucléotides 3' et 5' selon i. dans des conditions favorables à
l'hybridation de cette paire oligonucléotides 3' et 5' sur les ADN ou sur les ADNc de l'échantillon biologique, et iii.la détection des hybrides éventuellement formés entre ces ADN ou ADNc et la ou les paire(s) d'oligonucléotides 3' et 5'.
oligonucléotide 3' et l'autre oligonucléotide 5', les oligonucléotides 3' et 5' d'une même dite paire étant tous deux capables, dans des conditions d'hybridation correspondant à une incubation pendant 1 min dans un tampon [Tris-HCl 20mM pH8,4; KCl 50mM; MgCl2 2,5mM] à une température comprise entre 50°C et 65°C environ, de s'hybrider à l'ADN ou à
l'ADNc d'un récepteur cible NKR, ou contrepartie de NKR, mais ne s'hybridant pas, dans les mêmes conditions d'hybridation, avec l'ADN ou l'ADNc d'un récepteur contrepartie de NKR, ou respectivement d'un récepteur NKR, contrepartie fonctionnelle dudit récepteur cible, ii. la mise en contact de populations ADN ou ADNc d'un échantillon biologique d'origine humaine ou animale pour lequel on souhaite documenter le répertoire en immunorécepteur(s) cible(s), avec un excès d'au moins une paire d'oligonucléotides 3' et 5' selon i. dans des conditions favorables à
l'hybridation de cette paire oligonucléotides 3' et 5' sur les ADN ou sur les ADNc de l'échantillon biologique, et iii.la détection des hybrides éventuellement formés entre ces ADN ou ADNc et la ou les paire(s) d'oligonucléotides 3' et 5'.
2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite ou au moins une desdites paire(s) d'oligonucléotides 3' et 5' utilisée(s) est en outre capable, dans les mêmes conditions d'hybridation que celles définies sous i., de ne pas s'hybrider à l'ADN ou ADNc d'un récepteur, indifféremment NKR
ou contrepartie de NKR, autre que ledit récepteur cible.
ou contrepartie de NKR, autre que ledit récepteur cible.
3. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'oligonucléotide 5' d'une dite paire d'oligonucléotides 3' et 5' utilisée pour un récepteur cible NKR (ou contrepartie de NKR) est capable dans les mêmes dites conditions d'hybridation de s'hybrider à l'ADN
ou à l'ADNc d'un récepteur contrepartie de NKR (ou respectivement NKR), contrepartie fonctionnelle dudit récepteur cible NKR (ou respectivement contrepartie de NKR).
ou à l'ADNc d'un récepteur contrepartie de NKR (ou respectivement NKR), contrepartie fonctionnelle dudit récepteur cible NKR (ou respectivement contrepartie de NKR).
4. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'oligonucléotide 3' d'une dite paire d'oligonucléotides 3'et 5', utilisée pour un récepteur cible KAR, est capable, dans les mêmes dites conditions d'hybridation, de s'hybrider à l'ADN ou ADNc dudit récepteur cible KAR au niveau d'un enchantement nucléotidique qui comprend me séquence correspondant, selon le code génétique universel, et en tenant compte de la dégénérescence dudit code, à la séquence d'acides aminés Lys Ile Pro Phe Thr Ile (K I P F T I) ou Lys Leu Pro Phe Thr Ile (K L
P F T I) (SEQ ID n°26 ou 27).
P F T I) (SEQ ID n°26 ou 27).
5. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite (ou au moins une desdites) paire(s) d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur KIR est choisie parmi le groupe de paires d'oligonucléotides 3' et 5' constitué par un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n° 1, ou une séquence en dérivant, et au moins un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ
ID n°5, n°2, n°6 ou n°7, ou une séquence en dérivant, un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°4, ou une séquence en dérivant, et au moins un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ
ID n°5, n°2, n°6 ou n°7, ou une séquence en dérivant, un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°9, ou une séquence en dérivant, et au moins un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ
ID n°5, n°2, n°6 ou n°7, ou une séquence en dérivant, au moins un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°10, n°11, n°12, ou n°13, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID n°14, ou une séquence en dérivant.
ID n°5, n°2, n°6 ou n°7, ou une séquence en dérivant, un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°4, ou une séquence en dérivant, et au moins un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ
ID n°5, n°2, n°6 ou n°7, ou une séquence en dérivant, un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°9, ou une séquence en dérivant, et au moins un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ
ID n°5, n°2, n°6 ou n°7, ou une séquence en dérivant, au moins un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°10, n°11, n°12, ou n°13, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID n°14, ou une séquence en dérivant.
6. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite (ou au moins une desdites) paire(s) d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur KAR est choisie parmi le groupe de paires d'oligonucléotides 3' et 5' constitué par:
- un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°1, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID
n°3, ou une séquence en dérivent, - un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°8, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID
n°3, ou une séquence en dérivant, - un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°9, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID
n°3, ou une séquence en dérivant, - un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°15, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ
ID n°3, ou une séquence en dérivant.
- un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°1, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID
n°3, ou une séquence en dérivent, - un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°8, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID
n°3, ou une séquence en dérivant, - un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°9, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID
n°3, ou une séquence en dérivant, - un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID n°15, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ
ID n°3, ou une séquence en dérivant.
7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite (ou au moins une desdites) paire(s) d'oligonucléotides 3' et 5' ayant pour récepteur cible un récepteur NKG2 est choisie parmi le groupe de paires d'oligonucléotides 3' et 5' constitué par:
un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID no16, ou une séquence en dérivant, et m oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID no17, ou une séquence en dérivant, un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID no 18, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID no17, ou une séquence en dérivant, un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID no 19, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID no17, ou une séquence en dérivant, - un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID no20, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ
ID no21, ou une séquence en dérivant.
un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID no16, ou une séquence en dérivant, et m oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID no17, ou une séquence en dérivant, un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID no 18, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID no17, ou une séquence en dérivant, un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID no 19, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ ID no17, ou une séquence en dérivant, - un oligonucléotide 5' comprenant la séquence SEQ ID no20, ou une séquence en dérivant, et un oligonucléotide 3' comprenant la séquence SEQ
ID no21, ou une séquence en dérivant.
08. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les deux oligonucléotides 3' ou 5' d'une même dite paire sont chacun couplés à un marqueur, notamment couplée à m marqueur fluorescent ou radioactif, tel que du 32P, permettant la révélation des hybrides qu'ils forment évenhiellement avec lesdites populations ADN ou ADNc dudit échantillon biologique.
9. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite (ou lesdites) paire(s) d'oligonucléotide(s) 3' et 5' sert (servent) d'amorces respectivement 3' et 5' pour me extension par ADN
polymérase.
polymérase.
10. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que lesdits hybrides éventuellement formés sont amplifiés par au moisis une PCR préalablement à leur détection.
11. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que lesdits hybrides éventuellement formés sont amplifiés par "Nested PCR" (double PCR emboîtée).
12. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite détection des hybrides éventuellement formés comprend en outre la résolution sur gel de polyacrylamide du mélange réactionnel issu de la mise en contact, ainsi que la révélation de la présence ou de l'absence de bandes électrophorétiques contenant lesdits hybrides éventuellement formés.
13. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est appliquée à la documentation d'un répertoire génotypique en immunorécepteurs NKR et/ou en immunorécepteurs contreparties de NKR.
14. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est appliquée à la documentation d'un répertoire d'expression en immunorécepteurs NKR et/ou en immunorécepteurs contreparties de NKR.
15. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit échantillon biologique d'origine humaine ou animale est du sang périphérique, de la moelle osseuse, des lymphocytes, des cellules NK et/ou T, des cellules transgéniques exprimant des immunorécepteurs, une fraction isolée à partir de ces échantillons.
16. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est appliquée au criblage d'une banque d'organes, de tissus ou de cellules.
17. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est appliquée à la prévision ou au suivi de l'acceptation ou du rejet, par un homme ou un animal, de cellules, tissu ou organe génétiquement différent(es).
18. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est appliquée à la prévision ou au suivir de l'inocuité ou de la pathogénicité (GVH) d'une greffe ou transplantation, par m homme ou un animal, de cellules, tissu ou organe génétiquement différent(es).
19. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est appliquée à la prévision ou au suivi, pour un homme ou un animal, d'un effet de type GVL de la part de cellules, tissu ou organe génétiquement différent(es).
20. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est appliquée à la détermination de l'état d'activation de cellules NK et/ou T à un instant donné chez un animal ou un homme.
21. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est appliquée à la prévision ou au suivi de l'état de résistance d'un animal ou d'un homme vis-à-vis d'une infection virale, telle qu'une infection par un VIH, d'une infection parasitaire, telle que la malaria, d'une infection bactérienne, vis-à-vis d'une maladie auto-immune, telle que la polyarthrite rhumatoïde, ou bien encore vis-à-vis du développement de cellules malignes telles que des cellules leucémiques.
22. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est appliquée au criblage de médicaments actifs vis-à-vis de maladies infectieuses, de maladies auto-immunes, ou de maladies tumorales.
23. Kit pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 22, caractérisé en ce qu'il comprend, dans un récipient, au moins une dite paire d'oligonucléotides 3' et 5', les réactifs pour la réalisation de ladite ou lesdites méthode(s) tels que tampon, marqueur (éventuellement couplé aux oligonucléotides de la dite paire), ainsi qu'un mode d'emploi.
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