EP0865491A1 - Composes possedant des proprietes lectiniques, et leurs applications biologiques. - Google Patents

Composes possedant des proprietes lectiniques, et leurs applications biologiques.

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EP0865491A1
EP0865491A1 EP96941700A EP96941700A EP0865491A1 EP 0865491 A1 EP0865491 A1 EP 0865491A1 EP 96941700 A EP96941700 A EP 96941700A EP 96941700 A EP96941700 A EP 96941700A EP 0865491 A1 EP0865491 A1 EP 0865491A1
Authority
EP
European Patent Office
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seq
scl
cells
ala
sequence
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP96941700A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Pan Hong Jiang
Aboubacar Kaba
Françoise CHANY-FOURNIER
Italina Cerutti
Charles Chany
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Association Pour Le Developpement de la Biotherapie Experimentale Et Appliquee (adbea)
Original Assignee
Association Pour Le Developpement de la Biotherapie Experimentale Et Appliquee (adbea)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Association Pour Le Developpement de la Biotherapie Experimentale Et Appliquee (adbea) filed Critical Association Pour Le Developpement de la Biotherapie Experimentale Et Appliquee (adbea)
Publication of EP0865491A1 publication Critical patent/EP0865491A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4726—Lectins
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
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    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to compounds having lectin properties, and to their biological applications.
  • sarcolectins are also found in a wide variety of normal or tumor tissues in vertebrates (primates, rodents, gallinaceous).
  • Pronase R but also resistance to mild treatment, under certain conditions, with pepsin; resistance to thermal variations
  • interferon interferon
  • the SCLs inhibit the further synthesis of interferon-dependent proteins, for example the kmase protein and 2-5A synthetase.
  • the restoration of the initial state depends on the doses of SCL and can be more or less complete.
  • the invention is based on obtaining highly purified SCL preparations which have enabled to develop strategies leading to the isolation of cDNA clones coding for a 55 kD protein, the study of which has revealed unexpected biological properties.
  • the 65kD protein as a molecule comprising the biological properties of SCL.
  • the major band in the 65kD region was indeed retained as carrying all the biological properties: the 55kD band is not constantly observed and moreover appears minor in all cases.
  • the 65kD band corresponds to an artefact which results from the binding of a few molecules of SCL to albumin, but that the molecule having sarcolectm-like properties is actually the 55kD protein which contains all the genetic information responsible for the biological expression of the molecule.
  • the object of the invention is therefore to provide various products relating to the 55 kD SCL, namely in particular proteins, polypeptides or their fragments, DNA sequences coding for these proteins or polypeptides, or their fragments, or on the contrary. inhibiting their expression, and antibodies directed against these proteins, polypeptides, or their fragments.
  • sarcolectm or SCL, as used in the rest of the description, will denote either the proteins, polypeptides and fragments of these compounds, or their derivatives, as soon as they have lectin properties as defined according to the invention. It also relates to procedures for obtaining these various products.
  • the invention further relates to the biological applications of these products.
  • the nucleotide sequences according to the invention are sequences isolated from their natural environment and are characterized in that they comprise at least part of the sequence SEQ ID No. 1, one or more nucleotides being modified if necessary, it being understood that these sequences are capable of coding for sarcolectins, that is to say proteins, polypeptides, or fragments of these compounds, or alternatively derivatives, having lectinic properties.
  • sequence SEQ ID No. 1 is given at the end of the description, with the other sequences mentioned below, in the document called "List of sequences”.
  • lectinic properties is meant the capacity of SCLs to agglutinate normal or transformed cells, their stimulating effect on cell growth and their inhibitory effect on the anti-viral effect induced by interferon, under the conditions described in (8). .
  • sequences implemented according to conventional recombinant DNA techniques, are capable of coding for proteins or polypeptides, or their fragments, exhibiting lectmic activity, comprising at least one chain of animated acids as indicated on SEQ ID N ° 1, in which one or more amino acids are, if necessary, modified.
  • sequences are further characterized in that they are capable of hybridizing with at least one fragment of SEQ ID N ° 1 carrying at least part of the genetic information for a sarcolectm. This hybridization can be carried out under stringent conditions, but also under relaxed conditions as described in (10).
  • the invention relates in particular to the nucleotide sequence corresponding to the open reading frame going from position 62 to position 1469 in SEQ ID NO:
  • the domains of the 5 ′ ends and / or 3 ′ ends are especially preferred, since they contain the genetic information for the fragments possessing said lectinic properties.
  • the sequence of approximately 405 bp from position 62 to 467 in SEQ ID NO: 1, as shown in SEQ ID NO: 2, is most particularly preferred.
  • These 5 'and 3' domains are characterized in that they contain a high proportion of phosphorylatable amino acids, such as serine, threonme and tyrosme.
  • sequences mentioned in the above can be genomic or genomic-type sequences, certain sequences of nucleotides can be separated by mtrons which will be excised to lead to the expression of mature SCLs.
  • sequences derived from SEQ ID No. 1 are also targeted by the invention.
  • These derived sequences are obtained by modification, substitution, alteration, mutation or genetic and / or chemical deletion of one or more nucleotides of SEQ ID No 1 or of a fragment of SEQ ID No 1, it being understood that they have genetic information for coding for an SCL conserving at least in part the lectmic activity presented by the polypeptide coded by SEQ ID No. 1, this activity being if necessary increased.
  • the invention also relates to expression vectors containing at least one of the nucleotide sequences defined above, subjected to the control of an appropriate promoter. It targets in particular the vectors comprising all or part of SEQ ID N c 1 or SEQ ID No 2, or their antisense sequences.
  • Host cells transfected with these vectors which include the expressed recombinant proteins are also part of the invention.
  • the cells used for the transfections are, conventionally, eukaryotic or prokaryotic cells or even plant cells.
  • the invention also relates, as new chemicals, to SCLs exhibiting lectinic properties as defined above.
  • the invention thus relates to proteins or polypeptides, or their fragments, or their derivatives, characterized in that they have lectmic activity and comprise at least part of a sequence of amino acids in the sequence coded by l one of the nucleotide sequences defined above, one or more amino acids being modified if necessary, provided that this modification does not alter the lectinic properties of proteins, polypeptides, or their fragments, or their derivatives.
  • the invention relates in particular to SCLs having a chain of amino acids in SEQ ID No. 3 or in
  • the SCL corresponding to the open reading frame in the sequence SEQ ID No. 1 comprises 469 amino acids and has a molecular weight evaluated at 55 kD.
  • the sequences of the 5 'and / or 3' regions of SEQ ID No. 1 comprises 469 amino acids and has a molecular weight evaluated at 55 kD.
  • peptide sequences correspond to peptides having a structure corresponding to that of the sequence SEQ ID N ° 4, going from position 41 to 55 in SEQ ID N ° 1 or N ° 4.
  • peptides having the sequence SEQ ID No. 5 or peptides derived from this sequence are characterized in that they are recognized by monoclonal antibodies capable of reacting with SEQ ID No. 1, by their own antibodies, but that they do not react with antibodies directed against the peptide fragment 81 to 95 in SEQ ID No. 1.
  • Other preferred peptide sequences correspond to peptides of sequence SEQ ID No 6, having a structure corresponding to that of the sequence going from position 81 to 95 in SEQ ID No 1.
  • derived peptides the sequences differing by one or more amino acids (in particular by modification, substitution, deletion) but recognized, by the same antibodies as the native sequences.
  • the peptides SEQ ID N ° 5 and SEQ ID N ° 6, and their derivatives are capable, when fixed on a sensitive cell in vitro, of inhibiting the binding of the complete molecule and of hindering expression of its functions, the effects being less pronounced with the peptide SEQ ID No. 6 or its derivatives.
  • the SCLs of the invention are further characterized in that they are as obtained by expression, in an appropriate host cell, according to recombinant DNA techniques, of an expression vector containing a DNA sequence as defined above, recovery of the expressed SCL and purification.
  • SCLs of the invention are fragments or derivatives obtained by modification of the sequences SEQ
  • modification is understood to mean any mutation, deletion, substitution and / or addition of one or more amino acids, obtained directly at the level of the amino acid chain, or indirectly by modifying the coding nucleotide sequence.
  • Still other SCLs are as obtained by purification from tissue extracts.
  • the invention relates in particular to purified SCLs as obtained from tissue extracts, by operating as follows:
  • tissue extract containing lectins with pepsin in a gentle manner or at an acid pH, under conditions making it possible to eliminate at least the major part of the contaminating proteins, especially albumin, while retaining the activity lectmics,
  • Highly purified SCLs are characterized in that they appear to be almost totally devoid of albumin. They give a unique peak in HPLC and show, after chromatography on SDS gel and denaturation, three characteristic bands formed of proteins of size estimated at 65 kD, 55 kD and ⁇ 14 kD.
  • the invention relates especially to SCL characterized by a molecular weight of approximately 55 kD, as estimated in SDS-PAGE by comparison with polypeptides of defined molecular weight.
  • the invention makes it possible on the one hand to characterize the molecule, on the other hand to obtain antibodies which are sufficiently pure to characterize the antigenic structure of SCLs.
  • the invention also relates to methods for obtaining the nucleotide sequences and the SCLs defined above.
  • nucleotide sequences it is possible to operate, according to conventional techniques, synthetically.
  • a cDNA library is screened using specific probes, such as antibodies directed against the purified protein of 55 kD mentioned above and described in more detail in the examples, or of mRNA.
  • the sequences sought are isolated, if necessary modified as desired, according to the applications envisaged, and subjected to one or more purification treatments.
  • these sequences are advantageously introduced into an appropriate expression vector, under the control of a promoter, for the purpose of transfection of a host cell.
  • the synthesis of the latter is obtained, and, after lysis of the cells or simply after excretion, we it is recovered, in recombinant form, and it is subjected to at least one purification step.
  • prokaryotic systems such as bacteria, or eukaryotes, such as insect cells (Baculovirus system) or even yeasts, are advantageously used, as are commercially available.
  • Animal cells such as hamster CHO or primate transfected with the appropriate gene can also be used.
  • the SCLs of the invention can also be obtained by synthesis.
  • the methods described above allow the purification of SCL molecules while retaining their biological properties.
  • the invention relates in particular to a process for obtaining SCL of high degree of purity, from tissue extracts, characterized in that it comprises the steps of treatment of the tissue extract containing lectins with pepsin, gently, or at acidic pH, followed by chromatography under conditions making it possible to remove at least the majority of the contaminating proteins, in particular albumin, while retaining lectmic activity. These chromatography steps include - passing the pre-treated tissue extract over Sephacryl S-200,
  • This succession of steps provides a technical solution to the problem of the separation of the contaminating albumin and makes it possible to eliminate it in spite of the size close to that of SCL, of certain physicochemical properties close to those of SCL, as well as possible interactions between albumin and SCL.
  • the step of processing the tissue extract is carried out using pepsin, operating under controlled conditions.
  • the respective concentrations are of the order of 4 to 8 o, preferably approximately 6 ° for the tissue extract and 0.5 to 2 mg / ml, preferably approximately 1 mg / ml for a pepsin having an activity of the order of 2500 to 2700 units / mg.
  • Conditions for processing the tissue extract which have proved to be advantageous correspond to an incubation of the reactive mixture at approximately 37 ° C., pH 2, for approximately 1 h 30 to 2 h 30, in particular for 2 h.
  • the enzyme activity is then stopped by increasing the pH to a value close to neutrality.
  • this extract is previously centrifuged, and the supernatant is subjected to filtration. on a Sephacryl S-200 gel.
  • the active fractions are recovered, eluting with a buffer solution such as PBS, at a rate of 15 to 25 ml / h.
  • Elution is carried out with the buffer solution added with a salt with a molarity ranging from 0 to 0.5 M representing a linear gradient of pH 7.6 to 4.0.
  • a satisfactory elution rate is of the order of 20 ml / h.
  • the active fractions recovered are chromatographed on CM-Tnsacryl equilibrium in a buffer of pH 4.2, in particular a sodium acetate buffer 0.04 M.
  • the active fractions are dialyzed against the acetate buffer beforehand, then deposited on the CM-Trisacryl column, rinsed with this same buffer.
  • a first buffer of pH 5, 0.1 M is used, which can be carried out in 1 hour.
  • a second buffer, of pH 4.2, 1 M makes it possible to elute the majority of the SCLs. This operation can be carried out in about twenty minutes.
  • dialysis is advantageously carried out to remove the dialyzable molecules using a 0.01 M Na phosphate buffer, pH 7.2.
  • Sugar constitutes the ligand of an agarose gel affinity chromatography column, in particular of hexamethylene-polyacrylamide-agarose diameter.
  • the gel is first washed with a 0.5 M buffer, for example NaCl, then distilled water and finally centrifuged at low speed so as to get rid of the non-adsorbed substances.
  • a sugar solution, pH 4, for example 0.1 M N-acetyl neurammic acid is added to the gel, followed by that of an agent such as a carbodimide.
  • the pH is maintained at a value of the order of 4.5 and 5 at room temperature for approximately 1 hour, then is subjected to gentle stirring for 10 to 15 hours.
  • the gel is washed several times in order to remove the retained impurities.
  • the column filled with this preparation is balanced to pH 7.2.
  • the use of 0.01 M sodium phosphate buffer is appropriate.
  • the active sample from the previous step is deposited on the column and advantageously is equilibrated beforehand with the phosphate buffer.
  • the first buffer (I) advantageously consists of a 0.01 M sodium phosphate solution pH 7.2 containing 0.15 M NaCl. It leads to the production of a peak which contains the majority of the SCL.
  • the second buffer (II) also contains ethylene glycol, in particular at a rate of approximately 40 to 60%, preferably 50%. It leads to another peak which contains the majority of impurities.
  • the column is then rinsed with the sodium phosphate buffer.
  • the recovered SCL is analyzed by HPLC using a conventional water / acetonitrile / trifluoroacetic acid system and the fraction corresponding to the main peak is then analyzed by SDS-PAGE.
  • the invention thus provides the means to isolate products of very high purity, and to have a product that is almost completely free of albumin.
  • SCLs do not act directly on interferons, but inhibit the synthesis of secondary effector proteins induced by interferons.
  • the number of these induced effector proteins is variable from one interferon isoform to another. Furthermore, the same molecular form does not necessarily induce the same effector proteins from one cell to another.
  • SCLs restore to the cell its initial state. As a result, cells recover their ability to respond to growth stimuli, which would otherwise be inhibited by interferons. 2.
  • Direct growth stimulation is obtained in the absence of serum and involves a large number of cells, immunocompetent or not. This stimulation is obtained without retro-inhibition effect which results in the development of the refractory state of the cells to repeated inductions of this substance.
  • the SCLs of the invention can be administered repeatedly, if necessary in combination with specific growth factors, with which they can act in synergy.
  • An example is interleukin 2 (Il 2), which cannot stimulate the proliferation of T lymphocytes, unless these lymphocytes are activated beforehand by a lectin or another antigen. Sarcolectin could then act as a physiological activator of the Il 2 receptors.
  • sarcolectin will be associated with different interleukins or growth factors for a targeted amplification of growth, thanks to the resulting synergy. 3.
  • the mechanism of carcinogenesis seems to be at least partially clarified.
  • Proto-oncogenes are genes involved in the normal process of proliferation, either as a growth factor, either as a corresponding receptor, or by intervening in the metabolic chain involved in the growth process.
  • the SCLs of the invention especially the SCLs corresponding to SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 4, or the derived sequences, are involved in the initiation of the synthesis of cellular DNA preparing the action of the factors of specific growth.
  • the 55 kD SCL described above is a constitutive glycoprotein which is excreted in the extracellular medium, and stimulates growth in a non-specific manner.
  • sarcolectins and growth factors As the effect of sarcolectins and growth factors is additive, we can consider it as a co-oncogene, on the one hand by its own action on cell proliferation and its synergy with growth factors, on the other hand, by its inhibitory effect on the antiproliferative functions of interferons. As with all lectins, the biological functions of sarcolectin are inhibited by specific sugars. In view of the properties reported above, the invention relates more specifically to the following applications of SCLs.
  • the invention relates to their use as growth co-factors, to contribute to the growth of tissues, in particular to contribute to the regeneration of damaged tissues and to the acceleration of scarring.
  • they constitute highly effective therapeutic agents, of local or general application.
  • growth factors they can be used for cell cultures in vitro.
  • Particularly preferred products in this regard are constituted by human recombinant SCLs. Indeed, when cultivating lymphocytes freshly taken from a healthy individual, one can stimulate their proliferation in the presence of interleukin 2. After successive passages in Hl medium without serum, the cells replicate in the presence of only 112. But the only protein excreted in the medium is SCL, in a dimeric form.
  • Tests carried out by adding SCL in an appropriate amount show its favorable effect on cell growth.
  • the invention therefore also relates to the use of SCLs as therapeutic agents for stimulating the immune system, in particular as a stimulant of specific immunity, where appropriate SCLs in association with an antigen, for example with a growth factor such as 1 'interleukin.
  • SCLs can activate the synthesis of receptors for interleukins (They), in particular 112.
  • the continuous expression of SCLs in the cell appears to inhibit the refractory state cells with repeated interferon inductions, leading to continuous production of interferon at each induction with however an inability of the cells to express IFN functions.
  • SCLs or their inhibitors are thus advantageously used in protocols for repeated administration of IFN, for treating pathological conditions of infectious origin, for example during the final stages of AIDS infections or during auto-diseases.
  • immune systems such as lupus erythematosus.
  • the addition of recombinant SCL causes agglutination and the synthesis of type 1 or 2 interferon.
  • the SCLs of the invention can also be used as vaccination adjuvants, because of their ability to increase the proliferation of immunocompetent cells.
  • the invention relates to the use of the SCLs of the invention as tools for searching for compounds which inhibit natural sarcolectins.
  • the invention relates to the use of SCLs to select compounds that inhibit by competition of their lectmic activity, antibodies or sugars, or even antagonists such as butyric amino acids or other butyroids.
  • the SCLs are, where appropriate, fixed to albumin for stabilization purposes, to produce a retarded vehicle or to facilitate their diffusion in the tissues and the expression of their functions. .
  • Inhibiting sugars are specific sugars present on the cell membrane. These are simple or compound sugars, such as N-acetyl galactosamme, sodium galacturonate, acetylated sugars such as N-acetyl neurammic acid, lactose alpha or beta, galactose, neuramme-lactose.
  • simple or compound sugars such as N-acetyl galactosamme, sodium galacturonate, acetylated sugars such as N-acetyl neurammic acid, lactose alpha or beta, galactose, neuramme-lactose.
  • Amy butyric acids include alpha-ammo butyric acid, alpha-ammo isobutyric acid and gamma-ammo butyric acid (GABA). These compounds have a high affinity in particular for transformed cells and inhibit the grafting of Sarcomas TG180 cells (or other cells) in mice.
  • GABA gamma-ammo butyric acid
  • the inhibitor compounds make it possible to considerably increase the antiviral resistance induced by IFN and are used with advantage in protocols comprising treatments with IFNs. They can also be used in anti-cancer therapies.
  • the invention relates in particular to the use of these inhibitors in such treatments in combination with immunomodulators such as
  • the anti-SCL antibodies of the invention are particularly valuable agents for inhibiting the effects of SCL produced in excess in pathological conditions such as cancers, chronic viral or autoimmune diseases.
  • the drugs produced from these antibodies are characterized in that they contain an effective amount of these antibodies for the intended applications, in combination with an inert pharmaceutical vehicle.
  • these drugs are especially suitable for anti-tumor treatments.
  • these antibodies can be used for all immunological reactions, in particular ELISA and Western Blots, and make it possible to qualitatively and quantitatively determine the presence of SCL in a biological extract taken from a patient.
  • the invention thus relates to a method for detecting m SCL in vitro, and especially the 55 kD SCL as purified according to the methods described. above, or corresponding to the protein expressed by SEQ ID No. 1, or also obtained by synthesis.
  • This method includes: - bringing a biological sample to be analyzed from a patient or cells into contact with an anti-SCL antibody preparation or a Fab fragment immobilized on a solid support under conditions suitable for production of an antigen-antibody complex with the SCLs when they are present in the sample or the cells, then
  • This detection method makes it possible to reveal, with great sensitivity and quickly, the presence of SCL in the test sample, the revelation of the possible reaction of antigen-antibody type.
  • the invention also relates to a kit which can be used to carry out such detection.
  • This kit is characterized in that it comprises: an appropriate solid phase serving as a support
  • the detection relates to the presence of genes coding for the SCLs and comprises
  • the invention also relates to a kit which can be used in this method and comprises said probes as well as the buffer solutions and reagents useful for carrying out the hybridization reaction.
  • SCL inhibitors of the invention consist of the antisense nucleotide sequences defined above. These antisense blocks the expression of SCL, for example in the case of osteogenic sarcomas.
  • SCLs according to the invention are based on their capacity to agglutinate cells and their affinity for simple sugars. These properties are used in diagnosis or in therapy. Other characteristics and advantages of the invention will be given in the examples which follow.
  • FIGS. 1 to 5 represent respectively - FIG. 1, the elution profile of the SCL fractions chromatographed on DEAE-cellulose, obtained after chromatography on Sephacryl of tissue extracts treated beforehand,
  • FIGS. 2A and 2B the elution profiles of the fractions obtained by chromatography with a sugar ligand and the analysis in reverse HPLC of the active fraction
  • EXAMPLE 1 SARCOLECTIN PURIFICATION PROCEDURE The diagram of this procedure is as follows: Stage I - Preparation of biological material and freeze-drying.
  • Stage II Hydration of the material and pretreatment either with pepsin or at pH 5.
  • Stage III Chromatography on Sephacryl S-200.
  • Step V Affinity chromatography on sugar.
  • Step VI- Chromatography in reverse phase HPLC (for sequencing): column C18 gradient H 2 0 / acetonitrile column C4 gradient H 2 0 / acetonitrile
  • the supernatant which contains the sarcolectin is collected after filtration on sterile gauze and on a 1.2 ⁇ millipore filter, distributed in 2.5 ml pill boxes, then lyophilized before storage at -80 ° C.
  • the preparation is then subjected either to a treatment with pepsin, or to a treatment at pH 5 (isoelectric point of SCL).
  • the tissue extracts (concentration 6%) are treated with a solution of pepsin crystallized twice (2,675 units / mg) at the final concentration of 1 mg / ml.
  • the reactive mixture is adjusted to pH 2 (optimal pH of the activity pepsic) and incubated at 37 ° C for 2 h; a large precipitate is formed.
  • the enzymatic action is then stopped by adjusting the pH to 7.3 and addition of Iniprol (Choay) IO 5 units / mg protease overnight. at 4 ° C.
  • the sample is centrifuged and the supernatant removed is then filtered on Sephacryl S-200 gel.
  • a column (Pharmacia 2 x 30 cm) which contains the Sephacryl S-200 gel (Pharmacia) previously swollen in buffer.
  • the sample is introduced into the column in a volume of 2.5 ml, the flow rate of the eluent (PBS) is 20 ml per hour and the volume of each fraction is 1.35 ml.
  • the determination of the molecular weight of the filtered sample is calculated by reference to a range of proteins of known molecular weights.
  • the molecular weight estimate is based on the linear relationship between the effluent volume (Ve) and the logarithm of the molecular weight.
  • a column is filled with diethylammoethylcellulose (DEAE 52, Whatman, England) previously swollen and balanced in the following pH 7.6 buffer: NaCl
  • the sample (pool of biologically active fractions obtained after filtration on Sephacryl S-200) is introduced into the column which is then carefully rinsed with the same buffer.
  • the proteins are eluted for 4 h in the presence of buffer supplemented with NaCl of varying molarity from 0 to 0.5 M representing a linear gradient from pH 7.6 to 4.0.
  • the elution speed is 20 ml / hour.
  • the recorded profile is shown in Figure 1. Peak III contains albumin and traces of SCL, while peak IV (hatched) corresponds to biological activity and contains the majority of SCL. The latter is eluted with a 0.25 M sodium buffer.
  • This step can be replaced by chromatography on a Mono Q column in HPLC (L-histidme gradient 20 mM pH 5.5, 6.0--0.1 NaCl).
  • a Pharmacia column (1 x 15 cm) is filled with CM-T ⁇ sacryl-M (IBF, France) then equilibrated with 0.04 M sodium acetate buffer pH 4.2.
  • the sample containing the active fractions of sarcolectin is previously dialyzed against the 0.04 M acetate buffer pH 4.2 and then deposited on the column which is then rinsed with the same acetate buffer for 1 h.
  • the elution profile includes two buffers:
  • the first buffer 0.1 M sodium acetate, pH 5 which mainly eliminates albumin; the elution lasts about an hour; (see FIG. 1 A where peak 15 contains albumin and peak 50 (hatched peak) the SCL expressed in cytoagglutmating activity (CA).
  • CA cytoagglutmating activity
  • Fractions 40-50 contain sarcolectin and are dialyzed against the 0.01 M Na phosphate buffer pH 7.2 which will be used for the next step.
  • the conventional water / acetonitrile / trifluoroacetic acid 0.1 l system is used, with detection at 220-280 nm.
  • the gradient is programmed as follows:
  • the corresponding SDS-PAGE fraction is analyzed in SDS-PAGE gel.
  • the Western blot shows the three bands using the ant ⁇ -55kD serum: a 65 kD, 55 kD and ⁇ 14 kD.
  • the use of ant ⁇ -65kD serum is hampered by the fact that it is constantly contaminated with albumin.
  • the different stages of the purification are followed with respect to two characteristic functions of the SCLs, namely their capacity 1) to stimulate the synthesis of DNA in human T H9 cells, cultivated in a medium devoid of serum for 24 h and 2) to agglutinate cells.
  • the results for the last 3 purification stages are reported in table 1, indicating the count per minute (CPM) of thymidine 3 [H], the percentage of stimulation and the cellular agglutination (unit / 0.05 ml).
  • the purification is of the order of 16,500 times.
  • the purified protein obtained at the end of the procedure described above gives a unique peak after analysis by HPLC.
  • the ant ⁇ -65 kD serum Due to the proximity of their size and their close physicochemical properties, the ant ⁇ -65 kD serum also reacts with albumin. On the other hand, the ant ⁇ -55 kD serum appears to be completely homogeneous. Both the anti-65 kD serum and the anti-55 kD serum recognize the proteins of the other two molecular weights, after analysis by Western blots (FIG. 3B, where tracks 1 and 3 correspond to the use of anti-65 kD antibodies and lanes 2 and 4, to that of anti-55 kD antibodies).
  • Rapid purification can be obtained for certain biological extracts, for diagnostic purposes
  • the supernatant contains the proteins 65 and 55 kD recognizable by Western blots using specific antibodies.
  • the titer can be estimated by ELISA using the same antibodies.
  • FIG. 4B the Western blot using the same preparation intensely marks the minor band of 65 kD.
  • a commercial cDNA library from 34 week human placenta is used. These cDNAs were cloned into the EcoRI site of the galactosidase gene from phage lambda gt 11. The selection was made using in parallel anti-sarcolectm antibodies obtained separately against the 65 kD protein and the 55 k protein: as described in Example 1. In summary, the strips were isolated and excised, lyophilized, and crushed to then be used to immunize rabbits. The anti-65 kD serum recognizes the corresponding protein and also a little albumin. On the other hand, the anti-55 kD antibody appears specific. The two antibodies were used in parallel, in a well-defined order. Table 2 gives a summary of the methods followed to isolate 4 clones.
  • the library was amplified to obtain about IO 5-10 b clones.
  • Empty clones produce galactosidase -1. They are colored blue after IPTG + X-gal treatment.
  • the cloned genes are inserted into the EcoRI site of the galactosidase and the fusion protein thus obtained is colorless.
  • the colorless colonies are then treated with specific sera to which an anti-lapm antiserum paired with the peroxidase revealed by DAB is added, which allows their revelation.
  • the isolated cDNA is 1.8 kb long. It contains an open reading phase of 1,407 bp which contains the genetic information for 469 amino acids. Its structure is given on SEQ ID N ° l. The initiation ATG and termination TGA sequences are in position 62 and 1469 respectively.
  • the A domain corresponding to approximately 320 bp in DNA is variable; it is translated into a ⁇ sheet in the protein.
  • This region contains 12 blocks of 80 to 100% homologous to those found in the 14 kD lectme of the galactoside-binding protein (140/320 bp).
  • This domain contains the essential part for the lectmic function of the molecule. In total, at least 30 of these blocks are located mainly at the ends.
  • the domain B is formed by 4 ⁇ helices. It has the following homologies for DNA:
  • Human keratin 56 Kd 78% homologous over a length of 814 bp.
  • Human vimentme 52% homologous over a length of 625 bp
  • Human neurofilament homologous to 553 over a length of 589 bp.
  • Domain C contains short sequences translated into a ⁇ sheet which also has lectin sequences.
  • C. Glass et al. (9) have isolated a gene and have classified this molecule as an intermediate filament under the name of mesothelial cytokeratme. This identification is based on the sequence analogies cited above and which relate to the ⁇ -helix sequences stable to the molecule.
  • variable 5 ′ segment forming the ⁇ sheet contains the lectmic function of the molecule.
  • the stable domain of the four ⁇ helices which occupy the B domain seems to ensure the stability of the molecule.
  • the biological significance of this 55 kD molecule is fundamentally different from that taught by the previous authors for the molecule they have described.
  • the SCL of the invention is excreted in the medium. This property is unusual for the intermediate filaments, which are part of the cytoskeleton, have the essential role of contributing to the stability of the intracellular structure. SCLs are expressed in monomeric form, or in some cases dimé ⁇ que.
  • the intermediate filaments are, on the contrary, polymerized into multimeres.
  • a wide variety of cells from either rodents or primates have been tested. Agglutination is obtained by suspending the cells in MEM medium in the absence of serum.
  • the test can be carried out in two ways, either in the presence of a dilution range of sarcolectin in geometric progression based on 2, by seeking the concentration at which 50% of the cells are agglutinated, or by seeking the affinity of the different sugars. for cellular receptors.
  • the munne sarcolectm from liquid ascites of Swiss mice grafted with Crocker's TGI80 sarcoma contains 32 units agglutinating the H9 cells which originate from T lymphoma, fixed by 10% formalin.
  • the table below illustrates the affinity of the receptors for the various sugars in the presence of 2 agglutinative units.
  • the affinity is higher for ⁇ lactose than for a lactose, while the opposite is observed with SCLs originating from human placenta.
  • the highest affinity for human tissue is N.A.N.A.
  • Other inhibiting sugars include N-acetyl-glucosamine or even galacturonate (especially for hamsters), it being understood that this list is not exhaustive. The inhibiting sugars not only prevent the agglutination of cells, but also hinder the various biological effects of sarcolectins, in particular the stimulation of growth.
  • mice Male mice are injected (average weight:
  • the invention makes it possible to select those of sugars exhibiting the desired inhibitory effect and to develop medicaments containing them as active ingredients in the appropriate quantities with a view to highly effective antiviral therapy.
  • SCLs can act in synergy with growth factors and promote cell multiplication indirectly. Natural SCLs could therefore promote oncogenesis by blocking the effect of interferon. We will therefore measure the advantage of inhibiting the action of natural SCLs to promote the balance of tissue development in favor of growth inhibitors.
  • TG-180 tumor cells were grafted, originating from a tumor resistant to chemical metabolic inhibitors. At the concentration of 3 x 10 b cells injected by the IP route into Swiss mice of 20 gr, an ascites tumor is obtained which is detectable in 10 days and kills practically 100% of the animals in 21-25 days.
  • mice 200 ⁇ g / mice, or interferon, or both.
  • mice 4 groups of mice were used per experiment. The results obtained are given in table 4. They are estimated by the percentage of tumors which appeared on the 10th day, by the mean time of animal survival (MST) in days, and the final survival (in percentage). TABLE 4
  • gamma amino-butyric acid and alpha amino-isobutyric acid significantly inhibit tumorigenesis.
  • the onset of tumors is delayed, the increase in average survival is obtained in all groups.
  • a single injection of CP also allows a significant increase in the final survival of the animals, which is further amplified with the association of interferon.
  • the SCLs of the invention constitute particularly valuable models for the study of the anti-tumor effects of amino butyric acids and the development of a treatment protocol (Table 5).
  • H9 T lymphocytes and Daudi B lymphocytes H9 T lymphocytes and Daudi B lymphocytes, U937 monocytes, and studied in parallel, normal T and B lymphocytes of splenic origin, murine L929 cells and human HeLa cells.
  • the growth medium did not contain serum, only highly purified sarcolectin as obtained according to Example 1.
  • the antagonistic effect of sarcolectin on the action of mterferon can be estimated by treating the cells with interferon for 5 to 6 hours, then removing the medium and replacing it with sarcolectin for 18 hours.
  • the antagonistic effect of SCL appears from the 5th hour and can lead to the restoration of the cell to the initial state before treatment with interferon.
  • Sarcolectin can also 3D inhibit the action of IFNs induced either by poly (I) (C) or by Newcastle virus.
  • Diagnosis requires a rapid method of purification.
  • the level of sarcolectin in human or animal serum can be obtained for example as follows: dilution of the serum to 1/10;
  • the purified preparation contains only a 65 kD band. However, at high concentrations, a 55 kD band can be detected, using Western blot using monoclonal or mono-specific anti-sarcolectin antibodies.
  • H9 cells originating from human T lymphomas treated with formalin at 10 °.
  • the cells can be maintained in a phosphate buffer without special precautions.
  • the titer of sarcolectin can be estimated by a range of geometric dilutions, generally based on 2, in a microplate to which a suspension of fixed cells is added. Agglutination occurs at 4 ° C and the limit is estimated by the dilution at which approximately 50% of the cells are agglutinated.
  • the suspension of cells to be tested must be incubated with the quantity of tritiated thymidme arbitrarily chosen. It is important that the medium does not contain serum during the test period, which is generally 24 hours.
  • This application is based on the analysis of the development of tissues whose growth is normal and rapid like the fetus.
  • the placental blood contains on the one hand, growth factors and SCL, which stimulate DNA synthesis, and, on the other hand, interferons which, on the contrary, inhibit it by promoting cell differentiation. These three types of factors appear alternately, which results in discontinuous growth.
  • Recombinant interleukin 2 can also be combined under comparable conditions.
  • the target treatment includes IFNs, especially of the ⁇ or ⁇ group injected every 48 h by the parental route (at doses in general of 3-5 x IO 6 units per injection ) for a month.
  • This treatment provides cells generated in phase 1 with better differentiation.
  • the effect of IFNs can be considerably increased by the butyric amino acids (5g / kg) tested above.
  • interferons can be amplified by the combination of the sugars mentioned above, in particular lactoses ( ⁇ or ⁇ ), D galactose, N-acetyl neurammic acid (NANA) chosen as example.
  • lactoses ⁇ or ⁇
  • D galactose D galactose
  • NANA N-acetyl neurammic acid
  • Their nature can vary depending on the species or tissue. For example, in osteogenic sarcomas in children, local treatment based on these notions could usefully complement surgical treatment, by combining SCL -aspartate, followed by IFN, ⁇ lactose, NANA
  • the cloned molecule was introduced into a plasmid containing 2 promoters, one of them being a transcription promoter inducible by hexamethasone.
  • the choice of this system is justified by the fact that SCL is practically present in all the cells studied so far and could be at the origin of the functions present in the host cell.
  • Mouse L cells were transfected with the plasmid containing the cloned gene.
  • the anti-interferon function has been studied by the ability of interferon to inhibit the multiplication of a developer: the vesicular stomatitis virus.
  • the interferon function was then quantified in mouse cells (use of variable concentrations of interferon and search for the limit dilution at which the antiviral state is completely inhibited).
  • the vesicular stomatitis virus destroys the entire cell population in virgin cells.
  • the sensitive cells were treated with 200 IU of interferon for 5 hours. Decreasing amounts of SCL, diluted on a geometric scale based on 2, were then added. In the example chosen, the 1/32 dilution was the limit at which the action of interferon was completely blocked, viral multiplication is normally resumed.
  • the antibodies induced respectively by the peptides SEQ ID No 5 (oligopeptide 41-55 in SEQ ID No 1) and SEQ ID No 6 (oligopeptide 81-95 in SEQ ID No 1) are specific for each of the peptides.
  • the SCLs excreted by the osteogenic sarcoma ESS are strongly recognized by the anti-peptide antibodies 41-55.
  • the SCL is excreted in H-1 medium by PBMC in 24 h maintained without serum.
  • the results obtained are given in Table 8.
  • SCL is the only protein detected by electrophoresis after Coomassie blue staining and identified by known Western Blot monoclonal antibodies being SCL.
  • CAGCCACCAC CCACAATCAC AGCCATTGCC GAGGCTGAGG AGTGTGGGGA GCTGGCGCTC 1556
  • GAGATCGCCA CCTACCGCAA GCTGCTGGAG GGCGAGGAGA GCCGGTTGGC TGGAGATGGA 1736

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Abstract

L'invention concerne des séquences de nucléotides capables de coder pour des polypeptides possédant des propriétés lectiniques et les polypeptides correspondants du type des sarcolectines en leurs applications en thérapeutique. Elle vise notamment l'utilisation des polypeptides du type des sarcolectines pour stimuler l'immunité, le cas échéant en association avec l'interféron ou des butyroïdes. L'utilisation d'inhibiteurs spécifiques ou peptides antagonistes, permet de s'opposer aux productions constitutives de SCL. Les anticorps dirigés contre lesdits peptides sont utilisables en diagnostic et en thérapeutique.

Description

Composes possédant des propriétés lectiniques, et leurs applications biologiques.
L'invention concerne des composés possédant des propriétés lectiniques, et leurs applications biologiques.
Elle vise plus particulièrement des protéines ou des polypeptides du type des sarcolectines.
On sait que ce terme a été utilisé pour désigner les lectmes identifiées dans les sarcomes ostéogéniques humains ou ceux induits chez le hamster
(après inoculation du virus du sarcome de Moloney) , où elles sont présentes selon des teneurs élevées. Mais les sarcolectines se trouvent également dans une grande variété de tissus normaux ou tumoraux chez les Vertébrés (primates, rongeurs, gallinacés) .
Elles peuvent aussi être détectées à la surface des cellules normales ou transformées d'origine humaine ou animale.
Des préparations purifiées de sarcolectines ont dé]à été décrites et leurs propriétés rapportées.
Les propriétés physico-chimiques les plus régulièrement caractérisées sont : la sensibilité aux protéases (trypsine,
Pronase R ) , mais aussi la résistance aux traitements ménagés, dans certaines conditions, à la pepsine ; la résistance à des variations thermiques
(-20°C à + 100°C) ;
- la résistance aux variations de pH (2 à 8) ;
- la résistance aux détergents tels que SDS et dithiothréitol ;
- la migration en gel SDS-PAGE de la protéine dans la région-des PM de 65-55 kD. Leurs propriétés biologiques sont de trois ordres (voir les références (1) à (8) données en fin de description, avec les autres références citées ci-après, dans le document "Références bibliographiques") : - agglutination des cellules normales ou transformées (activité au niveau de la membrane cellulaire) . La cyto-agglutmation peut être inhibée grâce à l'affinité des sarcolectines pour des sucres simples . - stimulation de la croissance des lymphocytes humains T et B, des cellules lymphoides Daudi, et des cellules adhérentes au substrat, telles que des cellules munnes L929, des fibroblastes de rat transformés (Fr3T3) et des fibroblastes humains (FS4) . Ainsi, les sarcolectines se comportent comme des promoteurs de la croissance cellulaire, de spécificité non déterminée ;
- diminution ou abolition de l'état antiviral pré-établi par l' interferon (IFN) et restauration dans la cellule de la sensibilité initiale au virus. Après établissement de la résistance antivirale, les SCL inhibent la poursuite de la synthèse des protéines interféron-dépendantes, par exemple la protéine kmase et la 2-5A synthétase. La restauration de l'état initial est fonction des doses de SCL et peut être plus ou moins complète. Lorsque la cellule est restaurée, il est possible soit de stimuler la croissance par les SCL ou par d'autres facteurs de croissance, soit au contraire de retraiter les cellules par l'IFN pour développer à nouveau la résistance antivirale. L'invention repose sur l'obtention de préparations de SCL hautement purifiées qui ont permis d'élaborer des stratégies conduisant à l'isolement de clones d'ADNc codant pour une protéine de 55 kD dont l'étude a révélé des propriétés biologiques inattendues.
On soulignera que toutes les tentatives antérieures a l'invention ont retenu la protéine de 65kD comme molécule comportant les propriétés biologiques de la SCL. Au cours des identifications basées sur les electrophorèses en gel acrylamide suivis de Western Blot, la bande majeure dans la région 65kD a en effet été retenue comme portant toutes les propriétés biologiques: la bande de 55kD n'est pas constamment observée et de plus apparaît mineure dans tous les cas. Or, de manière surprenante, il apparaît que la bande 65kD correspond a un artefact qui resuite de la fixation de quelques molécules de SCL sur l'albumine, mais que la molécule possédant des propriétés de type sarcolectme est en réalité la protéine de 55kD qui contient toutes les informations génétiques responsables de l'expression biologique de la molécule. L'invention a donc pour but de fournir divers produits se rattachant a la SCL de 55 kD, à savoir notamment, protéines, polypeptides ou leurs fragments, séquences d'ADN codant pour ces protéines ou ces polypeptides, ou leurs fragments, ou au contraire inhibant leur expression, et anticorps diriges contre ces protéines, polypeptides, ou leurs fragments.
Le terme sarcolectme ou SCL, tel qu'utilisé dans la suite de la description, désignera indifféremment les protéines, polypeptides et fragments de ces composés, ou encore leurs dérivés, dès lors qu'ils possèdent des propriétés lectiniques comme défini selon l'invention. Elle vise également des procèdes d'obtention de ces différents produits.
Selon un autre aspect, l'invention vise en outre les applications biologiques de ces produits. Les séquences de nucleotides selon l'invention sont des séquences isolées de leur environnement naturel et sont caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une partie de la séquence SEQ ID N° 1, un ou plusieurs nucleotides étant le cas échéant modifies, étant entendu que ces séquences sont capables de coder pour des sarcolectines, c'est-a-dire des protéines, des polypeptides, ou des fragments de ces composes, ou encore des dérives, possédant des propriétés lectiniques.
La séquence SEQ ID N° 1 est donnée en fin de description, avec les autres séquences mentionnées ci- apres, dans le document appelé "Liste des séquences".
Par propriétés lectiniques, on entend la capacité des SCL a agglutiner des cellules normales ou transformées, leur effet stimulant sur la croissance cellulaire et leur effet inhibiteur de l'effet anti-viral induit par 1 ' interferon, dans les conditions décrites dans (8) .
De telles séquences, mises en oeuvre selon les techniques classiques de l'ADN recombinant sont capables de coder pour des protéines ou des polypeptides, ou encore leurs fragments, présentant une activité lectmique, comprenant au moins un enchaînement d'acides animes tel qu'indique sur SEQ ID N° 1, dans lequel un ou plusieurs acides aminés sont, le cas échéant, modifies. Ces séquences sont encore caractérisées en ce qu'elles sont capables de s'hybrider avec au moins un fragment de SEQ ID N° 1 portant au moins une partie de l'information génétique pour une sarcolectme. Cette hybridation peut être réalisée dans des conditions strmgentes, mais également dans des conditions relaxes telles que décrites dans (10) .
L'invention vise en particulier la séquence de nucleotides correspondant au cadre ouvert de lecture allant de la position 62 à la position 1469 dans SEQ ID
N° 1. Dans cette séquence, les domaines des extrémités 5' et/ou extrémités 3' sont spécialement préférés, étant donne qu'ils renferment l'information génétique pour les fragments possédant lesdites propriétés lectiniques. A cet égard, la séquence d'environ 405 pb allant de la position 62 à 467 dans SEQ ID N° 1, telle que représentée sur SEQ ID N° 2, est tout particulièrement préférée.
Ces domaines 5' et 3' sont caractérisés en ce qu'ils renferment une forte proportion d'acides aminés phosphorylables, comme les serine, thréonme et tyrosme.
Les différentes séquences mentionnées dans ce qui précède peuvent être des séquences génomiques ou de type génomique, certains enchaînements de nucleotides pouvant être séparés par des mtrons qui seront excisés pour conduire à l'expression des SCL matures.
Les séquences d'ARNm correspondantes, ou encore les séquences anti-sens correspondant aux séquences définies ci-dessus, ainsi que les séquences complémentaires de ces différentes séquences, entrent également dans le champ de l'invention. Ces différentes séquences de nucleotides sont encore caractérisées en ce qu'elles sont dépourvues d'ADN de mammifères, d'agents infectieux, de prions et d'autres matériaux des produits naturels. Comme indiqué ci-dessus, les séquences dérivées de SEQ ID N° 1 sont également visées par l'invention.
Ces séquences dérivées sont obtenues par modification, substitution, altération, mutation ou délétion génétique et/ou chimique d'un ou plusieurs nucleotides de SEQ ID N° 1 ou d'un fragment de SEQ ID N° 1, étant entendu qu'elles possèdent une information génétique pour coder pour une SCL conservant au moms en partie l'activité lectmique présentée par le polypeptide codé par SEQ ID N° 1, cette activité étant le cas échéant augmentée.
Ces modifications permettent, si on le souhaite, d'adapter les séquences définies ci-dessus à l'expression dans un type de vecteur ou d'hôte, ou encore de faciliter la pénétration cellulaire du polypeptide codé ou d'augmenter son activité.
L'invention vise également les vecteurs d'expression contenant au moins l'une des séquences de nucleotides définies ci-dessus, soumises au contrôle d'un promoteur approprié. Elle vise en particulier les vecteurs comprenant tout ou partie de SEQ ID Nc 1 ou de SEQ ID N° 2, ou leurs séquences anti-sens.
Les cellules hôtes transfectees par ces vecteurs, qui comprennent les protéines recombinantes exprimées font également partie de 1 'invention. Les cellules utilisées pour les transfections sont, de manière classique, des cellules eucaryotes ou procaryotes ou encore des cellules végétales.
L'invention vise également, en tant que produits chimiques nouveaux, des SCL présentant des propriétés lectiniques telles que définies ci-dessus.
L'invention vise ainsi des protéines ou des polypeptides, ou encore leurs fragments, ou leurs dérives, caractérisés en ce qu'ils possèdent une activité lectmique et comprennent au moms une partie d'un enchaînement d'acides aminés dans la séquence codée par l'une des séquences de nucleotides définies ci-dessus, un ou plusieurs acides aminés étant le cas échéant modifies, dès lors que cette modification n'altère pas les propriétés lectiniques des protéines, des polypeptides, ou de leurs fragments, ou de leurs dérivés.
Ces protéines ne comportent aucun élément susceptible d'être confondu avec l'albumine.
L'invention vise notamment les SCL présentant un enchaînement d'acides aminés dans SEQ ID N° 3 ou dans
SEQ ID N° 4.
La SCL correspondant au cadre ouvert de lecture dans la séquence SEQ ID N° 1 comprend 469 acides aminés et possède un poids moléculaire évalué à 55 kD. Les séquences des régions 5' et/ou 3' de SEQ ID
N° 3, en particulier celles de la région 5' correspondant à SEQ ID N° 4, sont essentiellement responsables de la fonction lectmique des SCL définies ci-dessus.
D'autres séquences peptidiques particulièrement préférées correspondent à des peptides présentant une structure correspondant à celle de la séquence SEQ ID N°4, allant de la position 41 à 55 dans SEQ ID N°l ou N°4.
Il s'agit de peptides présentant la séquence SEQ ID N°5 ou de peptides dérivés de cette séquence, et caractérisés en ce qu'ils sont reconnus par des anticorps monoclonaux capables de réagir avec SEQ ID N°l, par leurs propres anticorps, mais qu'ils ne réagissent pas avec des anticorps dirigés contre le fragment peptidique 81 à 95 dans SEQ ID N°l. D'autres séquences peptidiques préférées correspondent à des peptides de séquence SEQ ID N°6, présentant une structure correspondant à celle de la séquence allant de la position 81 à 95 dans SEQ ID N°l.
Il s'agit de peptides présentant la séquence SEQ ID N°6 ou de peptides dérivés de cette séquence, et caractérisés en ce que les anticorps dirigés contre ce fragment ne reconnaissent pas le fragment 41-55 ci- dessus .
On rappelle que par peptides dérivés, on entend les séquences différant par un ou plusieurs acides aminés (notamment par modification, substitution, délétion) mais reconnues, par les mêmes anticorps que les séquences natives .
Les peptides SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6, et leurs dérivés, sont capables, lorsqu'on les fixe sur une cellule sensible in vi tro, d'inhiber la fixation de la molécule complète et d'entraver l'expression de ses fonctions, les effets étant moins prononcés avec le peptide SEQ ID N°6 ou ses dérivés. Les SCL de l'invention sont encore caractérisées en ce qu'elles sont telles qu'obtenues par expression, dans une cellule hôte appropriée, selon les techniques de l'ADN recombinant, d'un vecteur d'expression contenant une séquence d'ADN telle que définie plus haut, récupération de la SCL exprimée et purification.
D'autres SCL de l'invention sont des fragments ou des dérives obtenus par modification des séquences SEQ
ID N° 3 ou SEQ ID N° 4, des lors qu'elles conservent au moins en partie les propriétés lectiniques définies ci- dessus.
Comme indique en rapport avec les séquences de nucleotides, on entend par modification, toute mutation, deletion, substitution et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, obtenue directement au niveau de l'enchaînement d'acides aminés, ou indirectement en modifiant la séquence de nucleotides codante.
D'autres SCL encore sont telles qu'obtenues par purification a partir d'extraits tissulaires.
L'invention vise en particulier les SCL purifiées telles qu'obtenues a partir d'extraits tissulaires, en opérant comme suit :
- traitement de l'extrait tissulaire contenant des lectines par de la pepsine de manière ménagée ou a pH acide, dans des conditions permettant d'éliminer au moins la majeure partie des protéines contaminantes, tout spécialement l'albumine, tout en conservant l'activité lectmique,
- chromatographie sur Sephacryl-S-200,
- chromatographie sur resme échangeuse d'ions telles que DEAE-cellulose ou CM-Tπsacryl, - chromatographie d' affinité en utilisant comme ligand un sucre, tel que l'acide N-acétyl neurammique, la pureté des SCL étant vérifiée par HPLC inverse.
Les SCL hautement purifiées sont caractérisées en ce qu'elles apparaissent pratiquement totalement dépourvues d'albumine. Elles donnent un pic unique en HPLC et montrent après chromatographie sur gel SDS et denaturation trois bandes caractéristiques formées de protéines de taille estimée a 65 kD, 55 kD et < 14 kD. L'invention vise tout spécialement la SCL caractérisée par un poids moléculaire de 55 kD environ, tel qu'estimé en SDS-PAGE par comparaison avec des polypeptides de poids moléculaire défini.
Elle possède des propriétés structurales et fonctionnelles qui la distinguent du groupe classique des filaments intermédiaires bien qu'elle soit reconnue par un anticorps monoclonal anti-cytokeratine mesotheliale de type 7.
En effet, elle se présente sous forme monomère, le cas échéant dimère, alors qu'en gênerai les filaments intermédiaires sont polymérises en tetrameres ou plus. Il s'agit d'une protéine extracellulaire, excrétée m vivo comme in vitro alors que les filaments intermédiaires sont intracellulaires ou participent au maintien de la structure.
Elle possède des propriétés lectmiquer à savoir une fonction inhibitrice des actions de l'IF" a capacité de stimuler la synthèse cellulaire et <__xle d'agglutiner des cellules. Ces propriétés sont essentiellement conférées par l'extrémité 5', comme en témoigne la digestion par la pepsine qui peut abolir la fonction stimulatπce de la synthèse de l'ADN, avec conservation de la taille et de la sédimentation en SDS- PAGE.
En fournissant une SCL hautement purifiée, l'invention permet d'une part de caractériser la molécule, d'autre part d'obtenir des anticorps suffisamment purs pour caractériser la structure antigenique des SCL.
L'invention vise également des procèdes d'obtention des séquences de nucleotides et des SCL définies ci-dessus.
Pour obtenir les séquences de nucleotides, on peut opérer, selon les techniques classiques, par voie de synthèse. En variante, en particulier pour obtenir au moms une partie des séquences du type SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N° 2, on procède au criblage d'une banque d'ADNc a l'aide de sondes spécifiques, telles que des anticorps diriges contre la protéine purifiée de 55 kD évoquée ci- dessus et décrite plus en détail dans les exemples, ou d'ARNm. Les séquences recherchées sont isolées, le cas échéant modifiées comme souhaité, selon les applications envisagées, et soumises à un ou plusieurs traitements de purification.
Pour obtenir les SCL de l'invention, ces séquences sont avantageusement introduites dans un vecteur d'expression approprie, sous le contrôle d'un promoteur, aux fins de transfection d'une cellule hôte.
En appliquant les conditions requises pour obtenir l'expression de la SCL recherchée a activité lectmique, on obtient la synthèse de cette dernière, et, après lyse des cellules ou simplement après excrétion, on la récupère, sous forme recombinante, et on la soumet à au moms une étape de purification.
Pour la production des SCL, on utilisera des systèmes procaryotes, comme les bactéries, ou eucaryotes comme les cellules d' insectes (système Baculovirus) ou encore les levures, avantageusement telles que disponibles dans le commerce. On peut également employer des cellules animales comme celles de hamster CHO ou de primates transfectees avec le gène approprié. Les SCL de l'invention peuvent être également obtenues par voie de synthèse.
Les procédés décrits ci-dessus permettent la purification des molécules de SCL tout en conservant leurs propriétés biologiques. L'invention vise en particulier un procédé d'obtention de SCL de degré de pureté élevé, à partir d'extraits tissulaires, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes de traitement de l'extrait tissulaire contenant des lectines par de la pepsine, de manière ménagée, ou a pH acide, suivi de chromatographies dans des conditions permettant d'éliminer au moins la majeure partie des protéines contaminantes, tout particulièrement l'albumine, tout en conservant l'activité lectmique. Ces étapes de chromatographies comprennent - le passage de l'extrait tissulaire pré-traité sur Séphacryl S-200,
- la récupération de la fraction renfermant l'essentiel de l'activité lectmique, telle que mesurée par le test d'agglutination cellulaire, - la passage de cette fraction sur des résines échangeuses d'ions, en particulier de la DEAE-cellulose et du CM-Trisacryl, le passage de la fraction renfermant l'essentiel de l'activité lectmique, sur une colonne renfermant comme ligand un sucre tel que l'acide N-acétyl neuraminique .
Cette succession d'étapes apporte une solution technique au problème de la séparation de l' albumine contaminante et permet de l'éliminer en dépit de la taille voisine de celle de SCL, de certaines propriétés physico-chimiques proches de celles de SCL, ainsi que des interactions possibles entre 1 ' albumine et SCL.
L'étape de traitement de l'extrait tissulaire est réalisée a l'aide de pepsine, en opérant dans des conditions ménagées. Les concentrations respectives sont de l'ordre de 4 à 8 o, de préférence d'environ 6 ° pour l'extrait tissulaire et de 0,5 à 2 mg/ml, de préférence d'environ 1 mg/ml pour une pepsine ayant une activité de l'ordre de 2500 à 2700 unités/mg.
Des conditions de traitement de l'extrait tissulaire qui se sont révélées avantageuses correspondent à une incubation du mélange reactif à 37°C environ, pH 2, durant environ 1 h 30 à 2 h 30, en particulier pendant 2 h.
On stoppe alors l'activité enzymatique en augmentant le pH à une valeur voisine de la neutralité.
L'extrait ainsi traité est soumis à une succession d'étapes de chromatographies. 1 - Chromatographie sur Séphacryl
De préférence, cet extrait est auparavant centrifugé, et le surnageant est soumis à une filtration sur un gel de Séphacryl S-200. Les fractions actives sont récupérées en éluant avec une solution tampon telle que PBS, a raison de 15 à 25 ml/h.
2- Chromatographie sur DEAE-cellulose Les fractions prélevées sont recueillies et les fractions présentant le maximum d'activité lectmique sont soumises à une chromatographie sur DEAE-cellulose préalablement gonfle et équilibre avec une solution tampon de pH voisin de la neutralité, en particulier de pH de l'ordre de 7,6.
L'élution est réalisée avec la solution tampon additionnée d'un sel avec une molarité allant de 0 a 0,5 M représentant un gradient linéaire de pH 7,6 a 4,0. Une vitesse d' élution satisfaisante est de l'ordre de 20 ml/h.
3- Chromatographie sur CM - Tπsacryl
Les fractions actives récupérées sont chromatographiees sur CM-Tnsacryl équilibre dans un tampon de pH 4,2, en particulier un tampon acétate de sodium 0, 04 M.
De préférence, les fractions actives sont au préalable dialysées contre le tampon acétate, puis déposées sur la colonne de CM-Trisacryl, rincée avec ce même tampon. Pour éliminer l'albumine, on utilise un premier tampon de pH 5, 0,1 M, ce qui peut être réalisé en 1 h. L'utilisation d'un deuxième tampon, de pH 4,2, 1 M, permet d' éluer la majorité des SCL. Cette opération peut être réalisée en une vingtaine de minute. Avant la mise en contact des fractions actives avec un sucre, on procède avantageusement à une dialyse pour éliminer les molécules dialysables en utilisant un tampon phosphate Na 0, 01 M, pH 7,2.
4- Chromatographie d'affinité utilisant comme ligand un sucre : Le sucre constitue le ligand d'une colonne de chromatographie d'affinité de gel d'agarose, notamment d'hexaméthylène-diamme polyacrylamide-agarose.
Le gel est tout d'abord lavé avec un tampon 0,5 M, par exemple de NaCl, puis de l'eau distillée et finalement centrifugé a basse vitesse de manière à se débarrasser des substances non adsorbees . Une solution de sucre, de pH 4, par exemple d'acide N-acétyl neurammique 0,1 M, est ajoutée au gel, suivie de celle d'un agent tel qu'un carbodimide. D'une manière avantageuse le pH est maintenu à une valeur de l'ordre de 4,5 et 5 à la température ambiante durant environ 1 h, puis est soumis à agitation douce de 10 à 15 heures.
Le gel est lavé plusieurs fois afin d'éliminer les impuretés non retenues.
On a recours par exemple à NaCl 1 M, puis à de l'acide acétique 0,1 M, et enfin a de l'eau bi-distillee .
La colonne remplie avec cette préparation est équilibrée à pH 7,2. L'utilisation d'un tampon de phosphate de sodium 0,01 M s'avère appropriée.
L'échantillon actif de l'étape précédente est déposé sur la colonne et avantageusement est équilibré au préalable avec le tampon phosphate.
Après rinçage de la colonne avec ce tampon, on réalise l'élution avec au moins deux tampons, l'un pour éluer la SCL, l'autre pour éliminer les autres protéines et régénérer la colonne. Le premier tampon (I) est avantageusement constitué par une solution de phosphate de sodium 0,01 M pH 7,2 contenant NaCl 0,15 M. Il conduit à l'obtention d'un pic qui contient la majorité de la SCL. Le deuxième tampon (II) renferme en outre de 1 'éthylène-glycol, notamment à raison de 40 à 60 % environ, de préférence de 50 % . Il conduit à un autre pic qui contient la majorité des impuretés.
La colonne est alors rincée avec le tampon de phosphate de sodium.
5 - Contrôle de pureté
La SCL récupérée est analysée en HPLC en utilisant un système classique eau/acétonitrile/acide trifluoroacétique et la fraction correspondant au pic principal est ensuite analysée en SDS-PAGE.
L'invention donne ainsi les moyens d'isoler des produits de très haute pureté, et de disposer d'un produit débarrassé pratiquement totalement d'albumine.
L'étude des SCL purifiées ainsi obtenues et des SCL correspondant aux produits d'expression des séquences de nucleotides définies plus haut montre qu'elles possèdent des propriétés lectiniques de grand intérêt.
1. Ces SCL n'agissent pas directement sur les interférons, mais inhibent la synthèse des protéines effectrices secondaires induites par les interférons.
Le nombre de ces protéines effectrices induites est variable d'une isoforme d' interferon à l'autre. Par ailleurs, la même forme moléculaire n'induit pas nécessairement les mêmes protéines effectrices d'une cellule à l'autre. En inhibant la synthèse de toutes les protéines secondaires IFN-dépendantes, les SCL restituent à la cellule son état initial. De ce fait, les cellules récupèrent leur capacité à répondre à des stimuli de croissance, qui autrement serait inhibée par les interférons . 2. La stimulation directe de la croissance est obtenue en l'absence de sérum et intéresse un grand nombre de cellules, immuno-compétentes ou non. Cette stimulation est obtenue sans effet de rétro-inhibition qui aboutit au développement de l'état réfractaire des cellules aux inductions répétées de cette substance.
De ce fait, contrairement aux immunostimulants habituels, les SCL de l'invention peuvent être administrées d'une façon répétée, le cas échéant en association avec des facteurs de croissance spécifiques, avec lesquels elles peuvent agir en synergie. Un exemple est 1 ' interleukine 2 (Il 2) , qui ne peut stimuler la prolifération des lymphocytes T, à moins que ces lymphocytes ne soient activés au préalable par une lectine ou un autre antigène. La sarcolectine pourrait alors jouer un rôle d'activateur physiologique des récepteurs de l'Il 2. Dans d'autres exemples, la sarcolectine sera associée à différentes interleukines ou facteurs de croissance en vue d'une amplification ciblée de la croissance, grâce à la synergie résultante. 3. Le mécanisme de la carcinogenèse semble être au moins en partie clarifié. On admet en général que la transformation maligne résulte d'un processus qui, par étapes successives, à partir de la prolifération bénigne, aboutirait à la sélection de cellules hautement cancérigènes. Les proto-oncogènes sont des gènes qui interviennent dans le processus normal de la prolifération, soit en tant que facteur de croissance, soit en tant que récepteur correspondant, ou alors en intervenant dans la chaîne métabolique impliquée dans le processus de croissance. Les SCL de l'invention, tout spécialement les SCL correspondant à SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 4, ou les séquences dérivées, interviennent dans l'initiation de la synthèse de l'ADN cellulaire préparant l'action des facteurs de croissance spécifiques. En particulier, la SCL de 55 kD décrite ci-dessus est une glycoproteine constitutive qui est excrétée dans le milieu extracellulaire, et stimule la croissance de façon non spécifique. Comme l'effet des sarcolectines et des facteurs de croissance est additif, on peut la considérer comme un co-oncogène, d'une part par son action propre sur la prolifération cellulaire et sa synergie avec les facteurs de croissance, d'autre part, par son effet inhibiteur des fonctions antiproliferatives des interférons. Comme pour toutes les lectines, les fonctions biologiques de la sarcolectine sont inhibées par des sucres spécifiques. Compte-tenu des propriétés rapportées ci- dessus, l'invention vise plus spécialement les applications suivantes des SCL.
Ainsi, l'invention vise leur utilisation comme co-facteurs de croissance, pour contribuer à la croissance des tissus, en particulier pour contribuer à la régénerescence des tissus lésés et à l'accélération des cicatrisations.
Ils constituent à cet égard des agents thérapeutiques de grande efficacité, d'application locale ou générale. En tant que facteurs de croissance, ils sont utilisables pour les cultures cellulaires m vitro.
Des produits particulièrement préfères a cet égard sont constitues par des SCL recombinantes humâmes. En effet, lorsqu'on cultive des lymphocytes fraîchement prélevés chez un individu sain, on peut stimuler leur prolifération en présence d' interleukine 2. Apres passages successifs dans le milieu Hl sans sérum, les cellules se répliquent en présence de seulement 112. Mais la seule protéine excrétée dans le milieu est la SCL, sous une forme dimerique.
Dans les lignées T continues H9, la multiplication cellulaire est assurée par la SCL fabriquée par les cellules et excrétée. En effet, dans les deux cas, c'est la seule protéine majeure détectée dans le milieu par SDS-PAGE et Western blot.
Des essais réalises en ajoutant la SCL en quantité appropriée montrent son effet favorable sur la croissance des cellules. L'invention vise donc également l'utilisation des SCL comme agents thérapeutiques de stimulation du système immunitaire, en particulier comme stimulant de 1' immunité spécifique, le cas échéant les SCL en association avec un antigène, par exemple avec un facteur de croissance comme 1 ' interleukine .
Ainsi, en tant qu' activateurs physiologiques de la prolifération des lymphocytes T, les SCLs peuvent activer la synthèse des récepteurs pour les interleukines (Ils) , en particulier les 112. L'expression continue des SCL dans la cellule apparaît inhiber l'état réfractaire des cellules aux inductions répétées d' interferon, conduisant a une production continue d' interferon a chaque induction avec toutefois une incapacité des cellules d'exprimer des fonctions IFN.
L'invention vise en particulier leur utilisation dans des traitements à l' interferon en mettant à profit leur effet inhibiteur de la synthèse des protéines effectrices secondaires de manière a restituer à la cellule son état initial et la sensibilité normale à
1 ' interferon.
Les SCL ou leurs inhibiteurs sont ainsi avantageusement mises en oeuvre dans des protocoles d'administrations répétées d'IFN, pour traiter des états pathologiques d'origine infectieuse, par exemple au cours des phases finales des infections du SIDA ou au cours des maladies auto-immunes, comme le lupus erythémateux. Dans certaines cellules compétentes, en particulier celles du PBL, l'addition de SCL recombinante provoque une agglutination et la synthèse d' interferon du type 1 ou 2.
Les SCL de l'invention peuvent être également utilisées comme adjuvants de vaccination, en raison de leur capacité a augmenter la prolifération des cellules immuno-compétentes .
Selon un autre aspect, l'invention vise l'utilisation des SCL de l'invention en tant qu'outils pour rechercher des composés inhibiteurs des sarcolectines naturelles.
En particulier, l'invention vise l'utilisation des SCL pour sélectionner des composes inhibiteurs par compétition de leur activité lectmique, les anticorps ou des sucres, ou encore les antagonistes tels que des ammo-acides butyriques ou autres butyroides . Dans les différentes applications thérapeutiques évoquées ci-dessus, les SCL sont, le cas échéant, fixées à de l'albumine à des fins de stabilisation, pour réaliser un véhicule retard ou pour faciliter leur diffusion dans les tissus et l'expression de leurs fonctions.
Les médicaments élaborés à partir des composés inhibiteurs évoqués ci-dessus, qui renferment des quantités efficaces de ces composés pour obtenir 1' inhibition recherchée, en association avec des excipients pharmaceutiques, entrent également dans le champ de l'invention.
Les sucres inhibiteurs sont des sucres spécifiques présents sur la membrane cellulaire. Il s'agit de sucres simples ou composés, tels la N-acétyl galactosamme, le galacturonate de sodium, des sucres acétylés comme l'acide N-acétyl neurammique, le lactose alpha ou bêta, le galactose, la neuramme-lactose.
Ces sucres, en se fixant sur la membrane cellulaire, interfèrent avec la fixation de la SCL. Sur la base de ces observations, on peut obtenir des dérivés butyriques complexes en fixant le galactose, le lactose, le NANA, la glucosamme, le galactosamme, l'acide N-acétyl galacturonique sur ces dérivés butyriques ou sur d'autres dérivés butyriques comme les esters contenant, par exemple, l'octal butyrate, ou le PEG butyrate. (PEG = polyéhylène glycol) .
Dans l'ensemble, la majorité de ces inhibiteurs augmente indirectement l'expression des interférons induite, augmente l'expression de l' interferon endogène au cours des différentes phases de la croissance normale ou le processus de tumoπgenèse. Les butyroides peuvent être utilises comme des inhibiteurs de la croissance ; ils donnent un effet mterféron-like, mais par des mécanismes différents. Leur effet n'est pas inhibe directement par les SCL, mais agit comme un effet antagoniste des SCL par des mécanismes différents.
Les dérivés butyriques formés d1 amino acides hydrophobes-hydrophiles comme le 1-valme t-butyl ester, de par leurs fonctions hydrophiles, se fixent aux cellules et par leurs fonctions hydrophobes, maintiennent les molécules au contact de la membrane.
Les ammo-acides butyriques comprennent l'acide alpha-ammo butyrique, l'acide alpha-ammo isobutyrique et l'acide gamma-ammo butyrique (GABA) . Ces composes possèdent une affinité élevée en particulier pour les cellules transformées et inhibent la prise de greffe des cellules de Sarcomes TG180 (ou d'autres cellules) chez la souris.
Grâce à ces inhibiteurs ou antagonistes, les productions antiphysiologiques excessives ou continues des interférons peuvent être ré-equιlιbrees (en inhibant l'action des SCL ou en s 'apposant à leurs effets a l'aide d'antagonistes) pour lutter contre les désordres immunitaires induits par certaines infections virales chroniques (HIV) , ou maladies immunitaires.
Les composés inhibiteurs permettent d'augmenter considérablement la résistance antivirale induite par l'IFN et sont utilisés avec avantage dans des protocoles comportant des traitements aux IFNs. Ils sont également utilisables dans des thérapies anti-cancereuses . L' invention vise en particulier l'utilisation de ces inhibiteurs dans de tels traitements en association avec des îmuno-modulateurs comme le
Corynebacterium parvum, que la SCL peut remplacer s'il n'y a pas production constitutive de SCL.
D'autres produits capables d' inhiber par compétition l'activité des SCL de l'invention sont constitues par des anticorps. Ces anticorps, polyclonaux ou monoclonaux diriges contre les SCL de l'invention, sont produits avantageusement selon les méthodes classiques. Ils sont également vises par 1 ' mvention en tant que produits nouveaux.
En thérapeutique, les anticorps anti-SCL de l'invention constituent des agents particulièrement précieux pour inhiber les effets des SCL produites en excès dans des états pathologiques comme les cancers, les maladies virales chroniques ou auto-immunes .
Les médicaments élabores a partir de ces anticorps sont caractérises en ce qu'ils contiennent une quantité efficace de ces anticorps pour les applications envisagées, en association avec un véhicule pharmaceutique inerte.
Ces médicaments sont spécialement appropries pour les traitements anti-tumoraux. En diagnostic, ces anticorps sont utilisables pour toutes les reactions immunologiques, en particulier les ELISA et Western Blots, et permettent de déterminer qualitativement et quantitativement la présence de SCL dans un extrait biologique prélevé cnez un patient. L'invention vise ainsi une méthode pour détecter m vitro les SCL, et tout spécialement la SCL de 55 kD telle que purifiée selon les méthodes décrites plus haut, ou correspondant a la protéine exprimée par SEQ ID N° 1, ou encore obtenue par voie de synthèse.
Cette méthode comprend : - la mise en contact d'un échantillon biologique a analyser provenant d'un patient ou de cellules avec une préparation d'anticorps anti-SCL ou d'un fragment Fab immobilisé sur un support solide dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe antigène-anticorps avec les SCL lorsqu'elles sont présentes dans l'échantillon ou les cellules, puis
- la mise en évidence de la formation d'un tel complexe de type antigène-anticorps, en opérant avantageusement selon les techniques habituelles. On a recours par exemple a des techniques de cytofluorométrie.
Cette méthode de détection permet de révéler ave une grande sensibilité et rapidement la présence de SCL dans l'échantillon testé, la révélation de la reaction éventuelle de type antigène-anticorps .
L'invention vise également un kit utilisable pour réaliser une telle détection. Ce kit est caractérisé en ce qu'il comprend : une phase solide appropriée servant de support
- une préparation d'anticorps anti-SCL ou de fragments Fab, libres ou immobilisés,
- des solutions tampons et réactifs appropriées pour les réactions immunologiques et pour les reactions de détection. Les anticorps utilisés dans ces méthodes et kits sont avantageusement des anticorps dirigés contre les peptides SEQ ID N°5 définis ci-dessus ou leurs dérivés . En variante, la détection porte sur la présence de gènes codant pour les SCL et comprend
- la réalisation de l'étape de mise en contact de l'échantillon biologique à analyser ou de cellules provenant d'un patient avec une sonde comme défini plus haut, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe d'hybridation, lorsque les gènes codant pour les SCL sont présents dans l'échantillon ou les cellules,
- la mise en évidence du complexe d'hybridation et la quantification de l'expression des SCL par ces gènes .
L'invention vise également un kit utilisable dans cette méthode et comprend lesdites sondes ainsi que les solutions tampons et réactifs utiles pour réaliser la réaction d'hybridation.
D'autres inhibiteurs encore des SCL de l'invention sont constitués par les séquences de nucleotides anti-sens définies ci-dessus. Ces anti-sens permettent de bloquer l'expression de SCL, par exemple dans le cas de sarcomes ostéogéniques .
D'autres applications encore des SCL selon l'invention sont basées sur leur capacité à agglutiner les cellules et leur affinité pour les sucres simples. Ces propriétés sont mises à profit en diagnostic ou en thérapeutique. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront donnés dans les exemples qui suivent.
Il y est fait référence aux figures 1 à 5 qui représentent respectivement - la figure 1, le profil d' élution des fractions de SCL chromatographiées sur DEAE-cellulose, obtenues après chromatographie sur Séphacryl d'extraits tissulaires traités au préalable,
- les figures IA et IB, les profils d' élution sur CM-Trisacryl des fractions biologiquement actives de
SCL recueillies sur DEAE-cellulose,
- les figures 2A et 2B, les profils d' élution des fractions obtenues par chromatographie avec comme ligand un sucre et l'analyse en HPLC inverse de la fraction active,
- les figures 3A et B, le contrôle par un gel SDS-PAGE des différentes étapes de la purification et le Western blot utilisant des anticorps antι-65kD et anti- 55kD. - les figures 4A et 4B, une photo de
1 'électrophorèse SDS-PAGE d'une préparation de SCL avant et après traitement ménagé par la pepsine et d'un Western blot montrant la réaction d'anticorps monoclonaux anti- 65kD respectivement avec la protéine de l'invention et l' albumine, et la figure 5, la photo d'un Western blot utilisant l'anticorps anti-55kD pour étudier différents échantillons .
EXEMPLE 1 : PROCEDURE DE PURIFICATION DE SARCOLECTINE Le schéma de cette procédure est le suivant : Etape I - Préparation du matériel biologique et lyophilisation.
Etape II - Hydratation du matériel et prétraitement soit à la pepsine, soit à pH 5. Etape III - Chromatographie sur Séphacryl S-200.
Etape IV - Chromatographie sur résine échangeuse d'ions : DEAE-cellulose ou CM-Trisacryl
Etape V - Chromatographie d'affinité sur sucre.
Etape VI- Chromatographie en HPLC phase inverse (pour séquençage) : colonne C18 gradient H20/acétonιtπle colonne C4 gradient H20/acétonιtrile
I) Préparation du matériel biologique et lyophilisation Les tissus prélevés sont lavés soigneusement dans du milieu minimal de Eagle jusqu'à l'élimination de toute trace de sang, puis sont lyophilisés et conservés à l'état sec à -20°C. Le tissu sec est ensuite coupé finement jusqu'à l'obtention d'une poudre qui est pesée, hydratée dans du milieu MEM (additionné d'antibiotiques) à la concentration de 6 % (poids sec en g) . La suspension est agitée à +4°C pendant 20 h, centrifugée à basse vitesse 4000 rpm pendant 20 min pour clarification, puis centrifugée à 27 000 rpm pendant 2 h à 90 000 g (on utilise avantageusement une ultracentrifugeuse Spinco L3) .
Le surnageant qui renferme la sarcolectine est récolté après filtration sur gaze stérile et sur filtre millipore 1,2 μ, distribué en piluliers de 2,5 ml, puis lyophilisé avant stockage à -80°C.
II) Hydratation du matériel et prétraitement Au moment de l'utilisation, le produit lyophilise est hydraté dans 2,5 ml d'eau bidistillée, puis bien dissous.
La préparation est alors soumise soit a un traitement par la pepsine, soit a un traitement à pH 5 (point isoélectrique de la SCL) .
A) Trai tement par la pepsine
Il a été constate qu'un traitement ménage par la pepsine permet de conserver les caractéristiques physico-chimiques (migrations dans le gel), et ne détruit pas l'activité biologique des extraits tissulaires, mais détruit d'autres protéines contaminant les préparations.
Les extraits tissulaires (concentration 6 % } sont traités par une solution de pepsine cristallisée 2 fois (2 675 unités/mg) a la concentration finale de 1 mg/ml. Le mélange réactif est ajusté à pH 2 (pH optimal de l'activité pepsique) et incubé a 37°C pendant 2 h ; un précipité important se forme. L'action enzymatique est alors stoppée par ajustement du pH à 7,3 et addition d'Iniprol (Choay) IO5 unités/mg protease, une nuit a 4°C. L'échantillon est centrifuge et le surnageant prélevé est alors filtre sur gel Séphacryl S-200.
B) Trai tement a pH 5 La préparation d'extrait tissulaire est ajustée à pH 5 par addition de HCl IN, puis laissée à la température de la pièce pendant 15 mm. Un précipité important apparaît qui est centrifugé a 4 000 rpm pendant 15 mm. Le surnageant une fois décanté représente l'échantillon pour l'étape de filtration sur gel Séphacryl S-200. III ) Chromatographie sur Séphacryl S-200
On utilise une colonne (Pharmacia 2 x 30 cm) qui contient le gel Séphacryl S-200 (Pharmacia) préalablement gonflé dans du tampon . L'échantillon est introduit dans la colonne sous un volume de 2,5 ml, la vitesse d'écoulement de l' éluant (PBS) est de 20 ml par heure et le volume de chaque fraction est de 1,35 ml. La détermination du poids moléculaire de l'échantillon filtré est calculé par référence à une gamme de protéines de poids moléculaires connus.
L'estimation du poids moléculaire est basée sur la relation linéaire existant entre le volume effluent (Ve) et le logarithme du poids moléculaire.
L'activité biologique (capacité d'agglutination des cellules) de chaque fraction est ensuite testée. Le volume effluent de la fraction, qui présente le maximum d'activité biologique, permet, après report sur la courbe d'étalonnage, de déterminer le poids moléculaire qui se situe entre 190 et 200 kDa. IV) Chromatographie sur résine échangeuse
. DEAE cellulose
Une colonne est remplie de diéthylammoéthyl- cellulose (DEAE 52, Whatman, England) préalablement gonflé et équilibré dans le tampon pH 7,6 suivant : NaCl
20 mM, EDTA 0,1 mM, β-mercapto-éthanol 15 mM, tris-acide acétique 20 mM. L'échantillon (pool des fractions biologiquement actives obtenues après filtration sur Séphacryl S-200) est introduit dans la colonne qui est alors soigneusement rincée avec le même tampon.
Les protéines sont éluées pendant 4 h en présence de tampon additionné de NaCl de molarité variant de 0 à 0,5 M représentant un gradient linéaire de pH 7,6 a 4,0. La vitesse d'élution est de 20 ml/heure. Le profil enregistre est représenté sur la figure 1. Le pic III contient de 1 ' albumine et des traces de SCL, alors que le pic IV (hachuré) correspond à l'activité biologique et contient la majorité de la SCL. Cette dernière est eluée avec un tampon sodique 0,25 M.
Cette étape peut être remplacée par une chromatographie sur colonne Mono Q en HPLC (gradient L- histidme 20 mM pH 5, 5 - 6, 0 / NaCl IM) .
. CM-Trisacryl
Une colonne Pharmacia (1 x 15 cm) est remplie de CM-Tπsacryl-M (IBF, France) puis équilibrée αans du tampon acétate de sodium 0,04 M pH 4,2. L'échantillon contenant les fractions actives de sarcolectine est préalablement dialyse contre le tampon acétate 0,04 M pH 4,2 puis déposé sur la colonne qui est alors rincée avec le même tampon acétate pendant 1 h. Le profil d'élution comprend deux tampons :
— le premier tampon : acétate de sodium 0,1 M, pH 5 qui élimine en majorité l'albumine ; l'élution dure environ une heure ; (voir figure 1 A où le pic 15 contient de l'albumine et le pic 50 (pic hachuré) la SCL exprimées en activité cytoagglutmante (CA) .
— le deuxième tampon : acétate de sodium 1 M pH 4,2 qui élue en majorité la sarcolectine ; l'élution dure 20 minutes (4 mm./fraction) (voir figure IB)
Les fractions 40-50 contiennent la sarcolectine et sont dialysées contre le tampon phosphate Na 0,01 M pH 7,2 qui servira pour l'étape suivante. V) Chromatographie d' affinité, utilisant comme ligand l'acide N-acetyl-neurammique (N.A.N.A. en abrège) .
9 ml d'Ultragel-HMD-Aca 34, IBF code 2461 61 (hexamethylene-diamme polyacrylamide-agarose) sont laves
3 a 4 fois dans 25 ml de tampon NaCl 0,5 M, puis 2 fois au moins avec de l'eau bi-distillee et finalement centrifuges a basse vitesse.
4 ml d'une solution d'acide N-acetyl- neurammique (type IV, Sigma) 0,08 M ajustée a pH 4,7 sont ajoutes au gel.
On ajoute alors 5 ml EDCL 0, 1 M pH 6 (1-ethyl- 3-3-dιmethyl-ammo-propyl-carbodιamιαe, Sigma) et on maintient le pH entre 4,5 et 5 pendant 1 h a la température du laboratoire. On laisse ensuite sous agitation douce pendant une nuit. Le gel est lave plusieurs fois avec NaCl 1 M, puis avec 2 volumes d'acide acétique 0,1 M, et rince avec de l'eau bi- distillee. On remplit une colonne Pharmacia (1 x 15 cm) avec cette préparation et on équilibre avec le tampon phosphate Na 0,01 M pH 7,2. On introduit l'échantillon de sarcolectme préalablement équilibre contre le tampon phosphate Na, et on le recycle trois fois. Apres rinçage de la colonne avec le même tampon pendant 1 h, on élimine les impuretés non retenues puis on réalise l'élution avec deux tampons :
— le tampon E]_ = phosphate de sodium 0, 01 M pH 7,2 + NaCl 0,15 M qui élue la sarcolectine (pic hachure sur la figure 2A) comme l'indique l'enregistrement en D.O. et le titrage de l'activité biologique (agglutination des cellules en opérant comme décrit dans - le tampon E2 = phosphate de sodium 0,01 M pH 7,2 + NaCl 0,15 M + 50 % éthylene-glycol pour éliminer les autres protéines (pic entre 15 et 20) et régénérer la colonne . La colonne est alors rincée avec le tampon phosphate de sodium 0,01 M pH 7,2. (Fig. 2A)
VI) Chromatographie en HPLC phase inverse L'appareil utilisé est un "HPLC Controller 2152" de marque LKB et la séparation sur phase inversée est réalisée avec une colonne C18 (Waters) .
On a recours au système classique eau/acetonitrile/acide trifluoro-acetique 0,1 l , avec détection a 220-280 nm.
Le gradient est programme comme suit :
Temps Débi t % acétoni tril e
0 1 ml 0
40 1 ml 50
60 1 ml 80
70 1 ml 80
80 1 ml 0
Un pic majeur situe a 75 % du gradient d'acétonitrile est enregistré (figure 2B)
La fraction SDS-PAGE correspondante est analysée en gel SDS-PAGE. Le Western blot montre les trois bandes en utilisant le sérum antι-55kD : a 65 kD, 55 kD et ≤ 14 kD. L'utilisation du sérum antι-65kD est entravée par le fait qu'elle est constamment contaminée par l'albumine. RESULTATS OBTENUS
Les différentes étapes de la purification sont suivies par rapport à deux fonction caractéristiques des SCL, à savoir leur capacité 1) de stimuler la synthèse de l'ADN dans des cellules T H9 humaines, cultivées dans un milieu dépourvu de sérum pendant 24h et 2) d'agglutiner des cellules. On rapporte dans le tableau 1 les résultats pour les 3 dernières étapes de purification en indiquant le comptage par minute (CPM) de thymidine 3[H] le pourcentage de stimulation et l'agglutination cellulaire (unité / 0, 05 ml) .
TABLEAU 1
L'examen de ces résultats montre que les trois dernières étapes de la purification aboutissent a l'obtention d'une protéine pratiquement pure.
Rapporte au taux de protéine initial, la purification est de l'ordre de 16 500 fois. La protéine purifiée obtenue a l'issue de la procédure décrite ci- dessus donne un pic unique après analyse en HPLC.
Quant à la capacité d'agglutiner ces mêmes cellules, on constate qu'elle reste inchangée. Apres chromatographie en gel SDS-PAGE colore par le nitrate d'argent et denaturation, on observe trois bandes caractéristiques dont la taille a ete estimée successivement a 65 kD, 55 kD et < 14 kD. (Voir piste 7 sur la figure 3A, où les autres pistes correspondent aux différentes étapes de la purification contrôlées par SDS- PAGE, a savoir les chromatographies 1) sur Séphacryl S200, 2) sur DEAE-cellulose, 3) sur CM-Tπsacryl (le pic 1 de l'albumine), 4) correspond à un repère de taille, 5) à la chromatographie sur CM-Trisacryl, (le pic 2 de SCL), 6) à la chromatographie d' affinité NANA et 7) a la HPLC) .
Ces bandes ont été découpées, lyophilisées, broyées et injectées a des lapins pour immunisation.
En raison de la proximité de leur taille et de leurs propriétés physico-chimiques proches, le sérum antι-65 kD réagit également avec l' albumine. Par contre, le sérum antι-55 kD parait être complètement homogène. Aussi bien le sérum antι-65 kD que celui antι-55 kD reconnaissent les protéines des deux autres poids moléculaires, après analyse par les Western blots (figure 3B, où les pistes 1 et 3 correspondent a l'utilisation d'anticorps antι-65 kD et les pistes 2 et 4, à celle d'anticorps antι-55 kD) .
EXEMPLE 2 : METHODE DE PURIFICATION RAPIDE
Une purification rapide peut être obtenue pour certains extraits biologiques, à des fins diagnostiques
(par exemple, sérum dilué au dixième) en procédant comme
- Abaissement du pH du milieu à pH 5 pendant 30 minutes ; - On note alors un précipite important, qui sera éliminé par centrifugation;
Réajustement à pH 7,4 ; le surnageant contient les protéines 65 et 55 kD reconnaissables par les Western blots à l'aide d'anticorps spécifiques. Le titre peut être estimé par ELISA en utilisant les mêmes anticorps .
In vivo on trouve des SCLs pour une part fortement liées à l'albumine, notion qui a été ignorée jusqu'à présent. En utilisant des anticorps monoclonaux, des bandes clairement détectables de cette protéine peuvent être retrouvées par Western blot (voir figure 4A:
SDS-PAGE électrophorèse colorée par le bleu de Comassie
- Sous la bande majeure de 67 kD contenant l'albumine, on trouve une bande mineure de 65 kD. Le traitement ménagé de la préparation par la pepsine digère l'albumine, mais conserve la bande mineure, figure 4B : le Western blot utilisant la même préparation marque intensément la bande mineure de 65 kD. On note la diffusion du marqueur sur
1'albumine qui n'est qu'indirectement marquée par la protéine de 55 kD.
Ces résultats ont été fondamentaux pour aller à
1' encontre de l'interprétation qui prévalait sur l' identité de la bande de 65kD. L'invention a ainsi permis de mettre en évidence que cette molécule est en fait un artefact lié à la fixation de quelques molécules de SCL de 55kD sur l' albumine. Dans les Figures 4a et 4b jointes à ce texte, cette constatation est clairement illustrée. Elle est également étayée par l'article de FU YUE ZENG et al. (12) dans lequel la séquence 5' de la protéine SCL est considérée comme contenant des analogies poussées avec l' albumine. De même en utilisant des milieux de cultures qui permettent la croissance des cellules sans sérum, une bande de protéine unique identifiée comme étant la SCL est détectée, excrétée des cellules : simiennes Vero, des sarcomes ostéogéniques humains, des lymphocytes T du PBL ou des cellules H9 en culture continue. Dans ces cultures pauvres en protéines, la SCL doit jouer un rôle important dans la régulation de la croissance.
EXEMPLE 3 : CLONAGE ET IDENTIFICATION DU GENE DES SARCOLECTINES HUMAINES
On utilise une banque de d'ADNc d' origine commerciale provenant de placenta humain de 34 semaines. Ces ADNc ont été clones dans le site EcoRI du gène galactosidase du phage lambda gt 11. La sélection a été faite en utilisant en parallèle des anticorps anti-sarcolectme obtenus séparément contre la protéine 65 kD et la protéine 55 k: comme décrit dans l'exemple 1. En résumé, les bandes ont été isolées et excisées, lyophilisées, et concassées pour être ensuite utilisées pour immuniser des lapins. Le sérum anti-65 kD reconnaît la protéine correspondante et également un peu l'albumine. Par contre, l'anticorps antι-55 kD apparaît spécifique. Les deux anticorps ont été utilisés en paralèlle, dans un ordre bien déterminé. Le tableau 2 donne un résumé des méthodes suivies pour isoler 4 clones.
. Identification des clones
La banque a été amplifiée pour obtenir environ IO5 à 10b clones. Les clones vides produisent la galactosidase -1. Ils sont colorés en bleu après traitement IPTG + X-gal. Les gènes clones sont insérés dans le site EcoRI de la galactosidase et la protéine de fusion ainsi obtenue est incolore. Les colonies incolores sont ensuite traitées par les sérums spécifiques auxquels on ajoute un anti-sérum anti-lapm couple à la peroxydase révélée par le DAB, qui permet leur révélation.
Comme indiqué dans le tableau 2, 10 clones ont été isolés au cours du premier passage grâce à l'anticorps spécifique (a) . Au cours du deuxième passage, la moitié des descendants de chaque clone isolé a été sous-cloné par l'anticorps antι-65kd (a) et l'autre par l'anticorps antι-55 kd (b)
Cette procédure a permis d'isoler au cours du troisième clonage un clone appelé 5, grâce à l'anticorps b, un clone nommé 6 avec l'anticorps b, un clone 9 avec l'anticorps b et enfin, un clone 10 avec l'anticorps a. Cette procédure a donc conduit à l'isolement au total de 4 clones. Au quatrième clonage, seuls les anticorps anti-55kd (b) ont été utilisés, et tous les clones obtenus, qu'ils soient isolés par les anticorps (a) ou
(b) ont été reconnus par l'anticorps b qui est beaucoup plus spécifique comme indiqué précédemment. L'analyse des séquences montre qu'en réalité 3 clones différents sont isolés, désignés clones 5 et clone β, car après séquençage les clones 9 et 10, se sont révélés absolument identiques.
On observera ainsi que ces trois clones ont été isolés avec les deux anticorps différents (a/ et (b) : leur identité suggère des rapports antigéniques entre les deux sérums, correspondant a des epitopes partagés par les protéines. Ces protéines peuvent donc représenter des membres d'une famille.
. Résultats obtenus avec le clone 5 Structure et caractérisation du clone
L'ADNc isolé a une longueur de 1,8 kb. Il contient une phase de lecture ouverte de 1 407 pb qui contient l'information génétique pour 469 acides aminés. Sa structure est donnée sur SEQ ID N°l. Les séquences ATG d'initiation et TGA de terminaison sont respectivement en position 62 et 1469.
EXEMPLE 4 : ETUDE DE LA PROTEINE de 55kD
1) Deux sortes de lignées cellulaires provenant de sarcomes osteogéniques humains de référence (MG 63) ou HOS ont été cultivées. La culture de ces cellules a ete réalisée en présence de 1% de sérum fétal de veau et de milieu RPMI . Les protéines excrétées dans le milieu après purification selon le procédé de l'exemple 1 ont été analysées. Après Western blot, une bande de 65 kD et une bande de 55 kD ont été obtenues. Les deux protéines ont été excrétées dans le milieu de culture.
2) Dans une deuxième série d'expériences, ces mêmes cellules ont été cultivées dans un milieu synthétique de Whittaker (Ultra Doma MDCK) sans sérum, pendant deux passages successifs, de façon a éliminer tout albumine résiduelle. Au total, ces milieux ne contiennent que très peu de protéines (2-5 ng/ml) . Les cellules excrètent des lectmes capables d'agglutiner les cellules H9 (lymphocytes T en lignée continue traités par 10o de formol) . Après Western blot, (utilisant aussi bien des anticorps monospecifîques contre la protéine 55 kD que l'antisérum monoclonal du commerce contre la cytokeratme de type 7), une bande unique a été obtenue dans la région 55 kD. C'est la seule bande détectable après SDS-PAGE et coloration par le bleu de Coomassie, reconnue aussi bien par les serums antι-55 kD, que par les anticorps monoclonaux anti-cytokératme mésothéliale du commerce. Il est possible, donc, que la protéine de 55 kD, peut-être à l'aide de ses fonctions lectiniques, soit capable de se fixer sur l' albumine, donnant ainsi à la SCL une fausse apparence de P.M. plus élevé que réellement.
Cette hypothèse est également étayée par le fait que, dans 1 ' albumine bovine commerciale hautement purifiée (99%), à l'aide de l'antisérum monoclonal du commerce, une deuxième bande d'un P.M. un peu plus faible est détectée. Apres traitement de la préparation d' albumine par la pepsine, cette bande persiste, alors que l'albumine est digérée (voir figures 4A et 4B) . La relation entre l'albumine et la SCL pourrait être purement fortuite, ou au contraire importante pour la diffusion de SCL dans l'organisme, et pour le maintien de sa stabilité.
3) Dans tous les essais réalisés, la majorité des SCL se retrouvent excrétées dans le milieu de culture, contrairement aux filaments intermédiaires qui sont généralement intracellulaires. 4) Dans l'ensemble, les séquences protéiniques obtenues peuvent être schématisées comme suit:
*•)
B C
uillet β hélix α reuillet β
Le domaine A correspondant à environ 320 pb dans l'ADN est variable ; il est traduit en feuillet β dans la protéine. Cette région contient 12 blocs de 80 à 100 % homologues à ceux retrouvés dans la lectme de 14 kD de la protéine liant le galactoside (140/320 pb) . Ce domaine contient la partie essentielle à la fonction lectmique de la molécule. Au total, au moms 30 de ces blocs sont localisés principalement aux extrémités.
Le domaine B est formé de 4 hélices α. Il possède les homologies suivantes pour l'ADN:
Kératine humaine 56 Kd : homologue a 78 % sur une longueur de 814 pb.
Vimentme humaine : homologue a 52 % sur une longueur de 625 pb Neurofîlament humain : homologue a 553 sur une longueur de 589 pb.
Le domaine C contient des séquences courtes traduites en feuillet β qui possède également des séquences lectiniques.
5) C. Glass et al. (9) ont isole un gène et ont classe cette molécule comme un filament intermédiaire sous le nom de cytokératme mesotheliale . Cette identification est basée sur les analogies de séquence citées ci-dessus et qui concernent les séquences hélice α stables αe la molécule.
Au contraire, 1 ' invention établit que le segment 5' variable formant le feuillet β contient la fonction lectmique de la molécule. Le domaine stable des quatre hélices α qui occupent le domaine B semble assurer la stabilité de la molécule. La signification biologique de cette molécule de 55 kD est fondamentalement différente de celle enseignée par les auteurs précédents pour la molécule qu'ils ont décrite. De plus, la SCL de 1 'invention, comme indiqué plus haut, est excrétée dans le milieu. Cette propriété est inhabituelle pour les filaments intermédiaires, qui faisant partie du cytosquelette, ont comme rôle essentiel de contribuer à la stabilité de la structure intracellulaire. Les SCL sont exprimées sous la forme monomérique, ou dans certains cas diméπque. Les filaments intermédiaires sont au contraire polymérisés en multimeres.
6) Le traitement ménage par la pepsine a pH 2 de la SCL purifiée détruit la fonction stimulatπce de la SCL, sans modifier ni la migration, ni la taille de la molécule dans le gel SDS-PAGE. De même le pouvoir agglutinant des cellules est conserve. Il est connu en effet que la pepsine détruit d'abord des sites localises au niveau de l'extrémité 5' de la molécule (au niveau des ammo-acides aromatiques threonme et tyrosme) expliquant la perte des fonctions biologiques.
EXEMPLE 5 : ETUDE DE L'ACTIVITE BIOLOGIQUE
I - Etude des effets inhibiteurs de sucres vis-
Action des sucres simples sur l r aggl utina tion des cell ules .
Une grande variété de cellules provenant soit de rongeurs, soit de primates, a été testée. L'agglutination est obtenue en suspendant les cellules dans un milieu MEM en l'absence de sérum. Le test peut être exécuté de deux façons, soit en présence d'une gamme de dilution de sarcolectine en progression géométrique a base de 2 , en recherchant la concentration à laquelle 50% des cellules sont agglutinées, soit en recherchant 1' affinité des différents sucres pour les récepteurs cellulaires .
Dans l'exemple présenté, la sarcolectme munne provenant d'ascite liquide de souris suisses greffées par le sarcome TGI80 de Crocker contient 32 unités agglutinant les cellules H9 qui proviennent d'un lymphome T, fixées par le formol 10%. Le tableau ci-dessous illustre l'affinité des récepteurs pour les différents sucres en présence de 2 unités agglutinantes.
D galactose : affini té 0,28 mM β lactose : 0, 25 mM α lactose : 0, 125 mM
N. A. N. A : 0, 0075 mM
Dans le cas de la sarcolectine murme, l'affinité est plus élevée pour le β lactose que pour l'a lactose, alors que l'inverse est observé avec des SCL provenant de placenta humain. L'affinité la plus élevée pour les tissus humains est le N.A.N.A. D'autres sucres inhibiteurs comprennent la N-acétyl-glucosamine ou encore le galacturonate (surtout pour les hamsters) , étant entendu que cette énumération ne présente aucun caractère exhaustif. Les sucres inhibiteurs empêchent non seulement l'agglutination des cellules, mais entravent également les différents effets biologiques des sarcolectines, en particulier la stimulation de la croissance.
Cet effet sera d'autant plus prononcé que l'affinité pour les récepteurs de SCL s'avère plus grande.
On mesurera donc l'intérêt des SCL de 1 ' mvention qui permettent de sélectionner des sucres à effet inhibiteur très élevé et dont on pourra mettre à profit l'effet indirect sur la croissance. Comme déjà souligné, cet effet inhibiteur des sucres vis-à-vis des SCL permet d'augmenter les fonctions antivirales et antiproliferatives des IFN.
Effets anti -viraux indirects des sucres inhibi teurs
On utilise comme modèle le virus de 1 ' encéphalomyocardite (EMC), qui tue les souris dans pratiquement tous les cas, après des périodes d'incubation assez variées, mais relativement courtes. On injecte à des souris mâles (poids moyen :
2,5 g, âgées de 8 à 10 semaines), par voie I P du galacturonate de sodium, de la glucosamine et de l'acide N-acétyl-neuraminique (solutions de 5 à 10 % renfermant 100 mM de sucre) . 24 h après, cent doses létales (50%) de virus EMC sont injectées par la même voie. Après une heure, 1 ' interferon murin est injecté (à la dose de 20 000 unités dans 0,5 ml) . On donne dans le tableau 3 les nombres d'animaux survivants sur le total testé, pourcentage et signifiance statistique.
Protection de l'IFN contre l'effet pathogène du virus vO -J
Encéphalomyocardite chez la souris Swiss O vβ
(Nombre d'animaux survivants sur nombre total testé, N> pourcentage et signifiance statistique [*])
4> ~-J
"S fi
H ev
-α
L'examen de ces résultats montre que l'utilisation des sucres inhibiteurs de SCL permet de diminuer l'effet antagoniste des sarcolectines naturelles dont le taux augmente en raison de la stimulation immunitaire due au virus, entraînant une synthèse accrue des macrophages avec des lymphocytes T.
Dans les souris traitées seulement avec
1 ' interferon, six animaux seulement sur 120 survivent, alors que l'augmentation de la survie totale est très nette lorsqu'on associe à l' interferon le N.A.N.A., la glucosamine ou le galacturonate.
En fournissant des SCL constituant des modèles pour des études in vitro, 1 ' invention permet de sélectionner ceux des sucres présentant l'effet inhibiteur recherché et d'élaborer des médicaments les renfermant en tant qu'ingrédients actifs selon les quantités appropriées en vue d'un traitement antiviral de grande efficacité.
Acti on anti tumoral e des sucres inhibi teurs de la SCL
La capacité des sucres inhibiteurs d'entraver l'effet stimulant de la croissance induite par la sarcolectine peut retentir indirectement sur le développement tumoral m vivo. Comme démontré in vitro selon l'invention, les SCL peuvent agir en synergie avec les facteurs de croissance et promouvoir la multiplication cellulaire indirectement. Les SCL naturelles pourraient donc favoriser l'oncogenèse en bloquant l'effet de 1 'interferon. On mesurera donc l'intérêt d'inhiber l'action des SCL naturelles pour favoriser l'équilibre du développement tissulaire en faveur des inhibiteurs de la croissance. Pour tester le pouvoir antitumoral des sucres inhibiteurs de SCL, on a greffé des cellules tumorales TG-180, provenant d'une tumeur résistant aux inhibiteurs métaboliques chimiques. A la concentration de 3 x 10b cellules injectées par la voie IP à des souris Swiss de 20 gr, on obtient une tumeur ascitique qui est détectable en 10 jours et tue pratiquement 100o des animaux en 21-25 jours.
Dans des séries parallèles, les différents groupes d'animaux ont été traités 3 jours après l'inoculation, soit avec un sucre spécifique
(glucosamine, lactose, galacturonate, N.A.N.A, neuramine- lactose) , en solution de 5 à 10 %, la concentration en sucre étant de 100 mM, soit par le même traitement auquel on a associé une injection d' immuno-stimulant (extrait de Corynebacterium parvum, Mérieux, France) à la dose de
200μg/sourιs, ou d' interferon, ou les deux.
4 groupes de souris ont été utilisés par expérience. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau 4. Ils sont estimés par le pourcentage de tumeurs apparues le lOème jour, par le temps moyen de survie des animaux (MST) en jours, et la survie finale (en pourcentage) . TABLEAU 4
Au dixième jour après la greffe, le traitement par tous les sucres testes, soit isolement, soit en association avec Corynebacterium parvum (CP) ou IFN, diminue considérablement l'incidence des tumeurs. La survie moyenne est particulièrement augmentée par la glucosamine et le galacturonate. En cas d' immunostimulation unique par le CP, la survie totale est considérablement augmentée par la glucosamine (53°) et le lactose (43°) . L'association avec I ' IFN augmente la survie moyenne surtout pour le lactose.
II- Etude des effets inhibiteurs des amino- acides butyriques vis-a-vis des SCL
Effets anti tumoraux indirects des ammo-acides butyriques On met en oeuvre la même procédure expérimentale que pour le tableau précèdent, mais en utilisant des sels butyriques : gamma ammo-butyrique
(GABA) , alpha ammo-butyrique, alpha-ammo-isobutyrique, et du milieu témoin. Les résultats obtenus sont rassembles dans le tableau 5 :
TABLEAU 5
Acide aminé Nombre Tumeurs MST Survie de au 10e jour jours Nombre Finale souris Nombre (%) (%)
GABA 30 14 (46) 35 + 9 4 (13)
+ IFN 45 19 (42) 43 + 10 11 (24)
+ CP 45 25 (55) 68 + 11 24 (53)
+ CP+IFN 30 7 (23) 70 +_ 13 17 (56)
alpha amino but. 30 19 (63) 26 +_ 1 0 (0)
+ IFN 30 9 (30) 25 + 2 0 (0)
+ CP 30 18 (60) 55 + 14 7 (23)
+ CP+IFN 30 7 (23) 62 + 14 14 (47)
alpha amino-iso. 30 6 (20) 31 + 7 2 (7)
+ IFN 30 15 (50) 31 + 10 4 (13)
+ CP 30 14 (46) 66 + 13 13 (43)
+ CP+IFN 30 12 (40) 64 +_ 13 14 (47)
Milieu 105 94 (89) 19 + 1 0 (0)
+ IFN 105 65 (68) 25 + 4 7 (7)
+ CP 105 85 (89) 32 + 5 10 (10)
+CP+IFN 105 43 (41) 60 + 7 45 (42)
Dans les mêmes conditions que les sucres inhibiteurs de la sarcolectine dans la série précédente, l'acide gamma amino-butyrique et l'alpha amino- isobutyrique inhibent de façon significative la tumorigénèse . L'apparition des tumeurs est retardée, l'augmentation de la survie moyenne est obtenue dans tous les groupes. Une injection unique de CP permet en outre une augmentation significative de la survie finale des animaux encore amplifiée avec l'association de 1' interferon.
Comme dans le cas des sucres inhibiteurs, les SCL de l'invention constituent des modèles particulièrement précieux pour l'étude des effets anti- tumoraux des amino-acides butyriques et la mise au point d'un protocole de traitement (tableau 5) .
III- Effets directs de la sarcolectine sur la stimulation de la synthèse de l'ADN cellulaire
On a vérifié l'effet de la sarcolectine sur la synthèse de l'ADN de différentes cellules immuno- compétentes : H9 T lymphocytes et Daudi B lymphocytes, U937 monocytes, et étudié en parallèle, des lymphocytes T et B normaux d'origine splénique, des cellules L929 murines et des cellules HeLa humaines. Dans tous les cas, le milieu de croissance ne contenait pas de sérum, seulement de la sarcolectine hautement purifiée telle qu'obtenue selon l'exemple 1.
Au bout de 24 heures, la synthèse de l'ADN des différentes populations cellulaires a été analysée en comparant les cellules témoins traitées par le même milieu et sans sarcolectine. On constate une augmentation significative de la synthèse de l'ADN, en particulier pour les cellules H9, Daudi et U937, un peu moindre pour les lymphocytes T et B normaux et les cellules HeLa, alors qu'elle est restée au même niveau élevé que les lignées non ancrées pour les cellules de souris. Ces résultats montrent clairement que la sarcolectine a un effet stimulant propre sur la croissance, qui est indépendant des facteurs de croissance plus spécifiques auxquels elle doit s'ajouter.
Dans les biopsies prélevées au cours des exérèses de sarcomes ostéogéniques chez l'enfant, le fragment excrète dans un milieu sans sérum des quantités considérables de SCL identifiée par des tests de Western blot en utilisant de l'antisérum antι-55 kD.
Cette même lectine se retrouve également dans l'ascite prélevée au cours des greffes de sarcomes TG 180 de la souris (piste 4, sur la figure 5) , les pistes 1 à 3 correspondant à des malades non cancéreux, et les pistes 5 à 8 à des sérums de sarcomes ostéogéniques humains.
IV- Effet inhibiteur de la sarcolectine sur la synthèse des protéines effectrices secondaires de 1' interferon
L'effet antagoniste de la sarcolectine sur l'action de 1 ' mterféron peut être estimée en traitant les cellules par l' interferon pendant 5 à 6 heures, puis en enlevant le milieu et en le remplaçant par la sarcolectine pendant 18 heures. L'effet antagoniste de la SCL apparaît à partir de la 5ème heure et peut aboutir à la restauration de la cellule à l'état initial avant le traitement par 1 ' interferon. La sarcolectine peut aussi 3D inhiber l'action des IFN induits, soit par la poly(I) (C) , soit par le virus de Newcastle. Ces données suggèrent que, sans affecter sa production, l'action de 1' interferon (induit par le poly(I) (C) ) , peut être inhibée par la SCL, ce qui aboutit a la diminution ou la disparition totale de la retromhibition.
Dans ces conditions, l'effet propre du poly(I) (C) sur la croissance apparaît clairement. L'IFN et la SCL sont en équilibre et agissent également sur le poly(I) (C) en modifiant son expression, l'ensemble aboutissant a un équilibre triangulaire.
V- Utilisation de la sarcolectine pour le diagnostic
Comme la sarcolectine stimule la synthèse de l'ADN et inhibe les protéines secondaires effectrices de
1 ' interferon, sa présence peut être recherchée aussi bien dans les tumeurs que dans différentes sécrétions biologiques, sérum, liquides d'ascites, placenta, etc.
Le diagnostic nécessite une méthode rapide de purification.
Le taux de sarcolectine dans le sérum humain ou animal peut être obtenu par exemple de la façon suivante: dilution du sérum au 1/10;
- abaissement du pH du milieu a pH 5 pendant 30 mm a la température du laboratoire;
- re-ajustement a pH 7,4 ; on note alors une précipitation importante qui doit être éliminée par centrifugation a 10 000 tours/mm. pendant 30 mm. ;
- re-ajustement du pH du surnageant obtenu a pH 7,4.
La préparation purifiée ne contient qu'une bande de 65 kD. Toutefois, a forte concentration, une bande à 55 kD peut être détectée, en utilisant le Western blot à l'aide d'anticorps monoclonaux ou mono-spécifiques anti-sarcolectine.
VI- Recherche de sarcolectine par agglutination des cellules
A titre d'exemple, on peut utiliser des cellules H9 provenant de lymphomes T humains, traitées par le formol à 10°. Les cellules peuvent être maintenues dans un tampon phosphate sans précaution particulière. Le titre de la sarcolectine peut être estimé par une gamme de dilutions géométriques, en général à base de 2, dans une microplaque à laquelle on ajoute une suspension de cellules fixées. L'agglutination se produit à 4°C et la limite est estimée par la dilution à laquelle environ 50% des cellules sont agglutinées.
VII- Analyse de la sarcolectine par l'augmentation de la synthèse d'ADN cellulaire
La suspension de cellules à tester doit être incubée avec la quantité de thymidme tritiée arbitrairement choisie. Il est important que le milieu ne contienne pas de sérum pendant la période d'essai, qui est en général de 24 heures.
VIII - Utilisation des SCL en thérapie anti¬ tumorale En thérapie antitumorale, on peut envisager, comme décrit ci-dessous, l'utilisation de SCL, à condition qu'il n'y ait pas au préalable production constitutive de SCL.
Cette application est basée sur l'analyse du développement de tissus dont la croissance est normale et rapide comme le foetus. Le sang placentaire contient d'une part des facteurs de croissance et les SCL, qui stimulent la synthèse du DNA, et d'autre part des interférons qui, au contraire, l' inhibent en favorisant la différenciation cellulaire. Ces trois types de facteurs apparaissent en alternance, ce qui entraîne une croissance discontinue.
D'après Lampl et al. (11) les poussées de croissance sont courtes et brutales de 24 heures, suivies de période d'arrêt de 30 a 60 jours. Sur ces bases le traitement propose est le suivant :
1. Stimulation unique de la croissance par la SCL employée par la voie parentale à des doses suffisantes pour augmenter d'une façon significative la prolifération des leucocytes dans le sang. Cette fonction peut être amplifiée par des sels d'aspartate (24 mM/kg.) administrés en parallèle pendant les 3 premiers jours. Elle peut être remplacée par la cimétidme.
On peut également associer 1 ' interleukine 2 recombinante dans des conditions comparables.
2. Apres un arrêt de 4-5 jours, le traitement de cibles comporte des IFN, surtout du groupe α ou β injectés toutes les 48 h par la voie parentale (a des doses en général de 3-5 x IO6 unités par injection) pendant un mois. Ce traitement assure aux cellules générées en phase 1, une meilleure différenciation. L'effet des IFN peut être considérablement augmenté par les amino-acides butyriques (5g/kg) testés ci-dessus.
3. L'effet des interferons peut être amplifié par l'association des sucres précédemment cites, en particulier des lactoses (α ou β) , le D galactose, l'acide N-acétyl neurammique (N.A.N.A.) choisis comme exemple. Leur nature peut varier en fonction des espèces ou des tissus. Par exemple dans les sarcomes ostéogéniques de l'enfant, le traitement local basé sur ces notions, pourrait utilement compléter le traitement chirurgical, en associant SCL -aspartate, suivi par IFN, α lactose, N.A.N.A.
IX Reproduction des fonctions biologiques essentielles avec la SCL recombinante
La molécule clonée a été introduite dans un plasmide contenant 2 promoteurs, l'un d'eux étant un promoteur de transcription inductible par 1 ' hexamethasone. Le choix de ce système est justifié par le fait que la SCL est pratiquement présente dans toutes les cellules étudiées jusqu'ici et pourrait être à l'origine des fonctions présentes dans la cellule hôte.
Les cellules L de souris ont été transfectees avec le plasmide contenant le gène clone. La fonction anti-interféron a été étudiée par la capacité de 1 ' interferon d'inhiber la multiplication d'un révélateur: le virus de la stomatite vésiculeuse. La fonction interferon a été ensuite quantifiée dans les cellules de souris (utilisation de concentrations variables d' interferon et recherche de la dilution limite à laquelle l'état antiviral est complètement inhibé) . Le virus de la stomatite vésiculeuse détruit la totalité de la population cellulaire dans les cellules vierges.
Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau 6.
On constate qu'en présence de cellules incubées avec l' interferon pendant 5 heures, la fonction antivirale s'exprime. A partir de la cinquième heure, on remplace l' interferon par de la SCL pendant 18 heures suivantes, en prenant somt de remplacer la SCL par le milieu dans la cellule témoin ; la SCL recombinante bloque l'état de l'effet antiviral alors que dans les témoins traités par le milieu, l' interferon déjà fixé sur les récepteurs exprime toutes ses fonctions normalement.
Dans une deuxième série d'expériences, les cellules sensibles ont été traitées par 200 Ul d' interferon pendant 5 heures. Des quantités décroissantes de SCL, diluées suivant une échelle géométrique à base de 2 ont été ensuite ajoutées. Dans l'exemple choisi, la dilution 1/32 était la limite à laquelle l'action de l' interferon était complètement bloquée, la multiplication virale est normalement reprise.
TABLEAU 6
INHIBITION DE L'ACTION DE L'INTERFERON (IFN) PAR LA SCL RECOMBINANTE.
A. IFN TITRE 32 U
concentration de SCL qui inhibe à 100% l'état antiviral IX Induction d'anticorps contre les oligopeptides SEQ ID N°5 ou SEQ ID N°6
En opérant selon les techniques classiques, on induit la formation d'anticorps contre les peptides SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6. Les caractères spécifiques de ces anticorps sont rapportes dans le tableau 7.
Les anticorps induits respectivement par les peptides SEQ ID N°5 (oligopeptide 41-55 dans SEQ ID N°l) et SEQ ID N°6 (oligopeptide 81-95 dans SEQ ID N°l) sont spécifiques pour chacun des peptides.
Les SCL excrétées par le sarcome ostéogénique ESS sont reconnues fortement par les anticorps anti- peptide 41-55. XI Stimulation en 24 h. de la synthèse d'ADN dans les cellules (lympho) T
Le SCL est excrétée dans le milieu H-l par PBMC en 24 h maintenue sans sérum. Les résultats obtenus sont donnes dans le tableau 8.
La SCL est la seule protéine détectée en électrophorèse après coloration au bleu de Coomassie et identifiée par les anticorps monoclonaux en Western Blot connue étant de la SCL.
L'examen des résultats du tableau 8 montre que la SCL excrétée des cellules stimule la synthèse de l'ADN en 24 h.
Cette stimulation est inhibée par N.A.N.A. ou par l'oligopeptide 41-55 (SEQ ID N°5) . REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
1/ Fournier F., et al, (1969) , Proc. Soc. Exp.
Biol. Med. 132, 943
2/ Chany C, et al, (1971), Nature, Biol. 230, 11
3/ Fournier F. et al (1972) Nature New Biol., 274, 1757.
4/ Chany, C. et al, (1969), CR. Acad. Sci . Paris 269, 1236
5/ Duc-Goiran P. et al. (1985) , Proc. Nat . Acad. Sci USA, 82,5010 6/ Chany C. et al (1969) , 269,2628
7/ Jiang P.H. et al (1988) Biol., Chemistry, 263, 19154
8/ Chany-Fournier F. et al (1990) . I of Cellular Physiology, 145, 173 9/ Glass C. et al, (1985) J. Cell Biol. 101,
236
10/ Sambrook J. et al, (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press
11/ Lampl M et al (1992) Science 258 ; 801 12/ Fu-Yue Zeng et al (1994) Bio Chem 375, 393-
399.
LISTE DE SEQUENCES
11) INFORMATIONS GENERALES:
(l) DEPOSANT:
(A) NOM: A.D.B.E.A
ASSOCIATION POUR LE DEVELOPPEMENT DE LA BIOTHERAPIE EXPERIMENTALE ET APPLIQUEE HOPITAL SAINT VINCENT DE PAUL
(B) RUE: 74-82 AVENUE DENFERT ROCHEREAU
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75674
(il) TITRE DE L' INVENTION: PROTEINES DE TYPE LECTINE ET LEURS APPLICATIONS BIOLOGIQUES
(m) NOMBRE DE SEQUENCES: 6
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1831 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (111) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(îx) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 62..1469
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
GAATTCCGGC GAGTGCGCGC TCCTCCTCGC CCGCCGCTAG GTCCATCCCG GCCCAGCCAC 60
C ATG TCC ATC CAC TTC AGC TCC CCG GTA TTC ACC TCG CGC TCA GCC 106
Met Ser Ile His Phe Ser Ser Pro Val Phe Thr Ser Arg Ser Ala 1 5 10 15
GCC TTC TCG GGC CGC GGC GCC CAG GTG CGC CTG AGC TCC GCT CGC CCC 154 Ala Phe Ser Gly Arg Gly Ala Gin Val Arg Leu Ser Ser Ala Arg Pro 20 25 30
GGC GGC CTT GGC AGC AGC AGC CTC TAC GGC CTC GGC GCC TCG CGG CCG 202 Gly Gly Leu Gly Ser Ser Ser Leu Tyr Gly Leu Gly Ala Ser Arg Pro 35 40 45
CGC GTG GCC GTG CGC TCT GCC TAT GGG GGC CCG GTG GGC GCC GGC ATC 250 Arg Val Ala Val Arg Ser Ala Tvr Gly Gly Pro Val Gly Ala Gly Ile 50 55 60 CGC GAG GTC ACC ATT AAC CAG AGC CTG CTG GCC CCG CTG CGG CTG GGC 298 Arg Glu Val Thr Ile Asn Gin Ser Leu Leu Ala Pro Leu Arg Leu Gly 65 70 75
GCC GAC CCC TTC TCC CAG CGG GTG CGC CAG GAG GAG AGC GAG CAG ATC 346 Ala Asp Pro Phe Ser Gin Arg Val Arg Gin Glu Glu Ser Glu Gin Ile 80 85 90 95
AAG ACC CTC AAC AAC AAG TTT GCC TCC TTC ATC GAC AAG GTG CGG TTT 394 Lys Thr Leu Asn Asn Lys Phe Ala Ser Phe Ile Asp Lys Val Arg Phe 100 105 110
CTG GAG CAG CAG AAC AAG CTG CTG GAG ACC AAG TGG ACG CTG CTG CAG 442 Leu Glu Gin Gin Asn Lys Leu Leu Glu Thr Lys Trp Thr Leu Leu Gin 115 120 125
GAG CAG AAG TCG GCC AAG AGC AGC CGC CTC CCA GAC ATC TTT GAG GCC 490 Glu Gin Lys Ser Ala Lys Ser Ser Arg Leu Pro Asp Ile Phe Glu Ala 130 135 140
CAG ATT GCT GGC CTT CGG GGT CAG CTT GAG GCA ATG CAG GTG GAT GGG 538 Gin Ile Ala Gly Leu Arg Gly Gin Leu Glu Ala Met Gin Val ASD Gly 145 150 155
GGC CGC CTG GAG CAG GGG CTG CGG ACG ATG CAG GAT GTG GTG GAG GAC 586 Gly Arg Leu Glu Gin Gly Leu Arg Thr Met Gin Asp Val Val Glu Asp 160 165 170 175
TTC AAG AAT AAG TAC GAA GAT GAA ATT AAC CGC CGC ACA GCT GCT GAG 634 Phe Lys Asn Lys Tyr Glu Asp Glu Ile Asn Arg Arg Thr Ala Ala Glu 180 185 190
AAT GAG TTT GTG GTC CTG AAG AAG GAT GTG GAT GCT GCC TAC ATG AGC 682 Asn Glu Phe Val Val Leu Lys Lys Asp Val Asp Ala Ala Tyr Met Ser 195 200 205
AAG GTG GAG CTG GAG GCC AAG GTG GAT GCC CTG AAT GAT GAG ATC AAC 730 Lys Val Glu Leu Glu Ala Lys Val Asp Ala Leu Asn Asp Glu Ile Asn 210 215 220
TTC CTC AGG ACC CTC AAT GAG ACG GAG TTG ACA GAG CTT CAG TCC CAG 778 Phe Leu Arg Thr Leu Asn Glu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Gin Ser Gin 225 230 235
ATC TCC GAC ACA TCT GTG GTG CTG TCC ATG GAC AAC AGT CGC TCC CTG 826 Ile Ser Asp Thr Ser Val Val Leu Ser Met Asp Asn Ser Arg Ser Leu 240 245 250 255
GAC CTG GAC GGC ATC ATC GCT GAG GTC AAG GCG CAG TAT GAG GAG ATG 874 Asp Leu Asp Gly Ile Ile Ala Glu Val Lys Ala Gin Tyr Glu Glu Met 260 265 270
GCC AAA TGC AGC CGG GCT GAG GCT GAA GCC TGG TAC CAG ACC AAG TTT 922 Ala Lys Cys Ser Arg Ala Glu Ala Glu Ala Trp Tyr Gin Thr Lys Phe 275 280 285
GAG ACC CTC CAG GCC CAG GCT GGG AAG CAT GGG GAC GAC CTC CGG AAT 970 Glu Thr Leu Gin Ala Gin Ala Gly Lys His Gly Asp Asp Leu Arg Asn 290 295 300
ACC CGG AAT GAG ATT TCA GAG ATG AAC CGG GCC ATC CAG AGG CTG CAG 1018 Thr Arg Asn Glu Ile Ser Glu Met Asn Arg Ala Ile Gin Arg Leu Gin 305 310 315
GCT GAG ATC GAC AAC ATC AAG AAC CAG CGT GCC AAG TTG GAG GCC GCC 1066 Ala Glu Ile Asp Asn Ile Lys Asn Gin Arg Ala Lys Leu Glu Ala Ala 320 325 330 335 ATT GCC GAG GCT GAG GAG CGT GGG GAG CTG GCG CTC AAG GAT GCT CGT 1114 Ile Ala Glu Ala Glu Glu Arg Gly Glu Leu Ala Leu Lys Asp Ala Arg 340 345 350
GCC AAG CAG GAG GAG CTT GAA GCC GCC CTG CAG CGG GCC AAG CAG GAT 1162 Ala Lys Gin Glu Glu Leu Glu Ala Ala Leu Gin Arg Ala Lys Gin Asp 355 360 365
ATG GCA CGG CAG CTG CGT GAG TAC CAG GAA CTC ATG AGC GTG AAG CTG 1210 Met Ala Arg Gin Leu Arg Glu Tyr Gin Glu Leu Met Ser Val Lys Leu 370 375 380
GCC CTG GAC ATC GAG ATC GCC ACC TAC CGC AAG CTG CTG GAG GGC GAG 1258 Ala Leu Asp Ile Glu Ile Ala Thr Tyr Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu 385 390 395
GAG AGC CGG TTG GCT GGA GAT GGA GTG GGA GCC GCC AAT ATC TCT GTG 1306 Glu Ser Arg Leu Ala Gly Asp Gly Val Gly Ala Ala Asn Ile Ser Val 400 405 410 415
ATG AAT TCC ACT GGT GGC AGC AGC AGT GGC GGT GGC ATT GGG CTG ACC 1354 Met Asn Ser Thr Gly Gly Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ile Gly Leu Thr 420 425 430
CTC GGG GGA ACC ATG GGC AGC AAT GCC CTG AGC TTC TCC AGC AGT GCG 1402 Leu Gly Gly Thr Met Gly Ser Asn Ala Leu Ser Phe Ser Ser Ser Ala 435 440 445
GGT CCT GGG CTC CTG AAG GCT TAT TCC ATC CGG ACC GCA TCC GCC AGT 1450 Gly Pro Gly Leu Leu Lys Ala Tyr Ser Ile Arg Thr Ala Ser Ala Ser 450 455 460
CGC AGG AGT ACC CGC GAC TGAGTCGC CTCCCACCAC TCCACTCCTC 1496
Arg Arg Ser Thr Arg Asp 465
CAGCCACCAC CCACAATCAC AGCCATTGCC GAGGCTGAGG AGTGTGGGGA GCTGGCGCTC 1556
AAGGATGCTC GTGCCAAGCA GGAGGAGCTG GAAGCCGCCC TGCAGCGGGC CAAGCAGGAT 1616
ATGGCACGGC AGCTGCGTGA GTACCAGGAA CTCATGAGCG TGAAGCTGGC CCTGGACATC 1676
GAGATCGCCA CCTACCGCAA GCTGCTGGAG GGCGAGGAGA GCCGGTTGGC TGGAGATGGA 1736
GTGGGAGCCG TGAATATCTC TGTGATGAAT TCCACTGGTG GCAGTAGCAG TGGCGGTGGC 1796
ATTGGGCTAG CCCTCGGGGG AACCATGGGC AGCAA 1831
(3) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 405 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(îx) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:!..405
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: ATG TCC ATC CAC TTC AGC TCC CCG GTA TTC ACC TCG CGC TCA GCC GCC Met Ser Ile His Phe Ser Ser Pro Val Phe Thr Ser Arg Ser Ala Ala 1 5 10 15
TTC TCG GGC CGC GGC GCC CAG GTG CGC CTG AGC TCC GCT CGC CCC GGC 96 Phe Ser Glv Arg Gly Ala Gin Val Arg Leu Ser Ser Ala Arg Pro Gly 20 25 30
GGC CTT GGC AGC AGC AGC CTC TAC GGC CTC GGC GCC TCG CGG CCG CGC 144 Gly Leu Glv Ser Ser Ser Leu Tyr Gly Leu Gly Ala Ser Arg Pro Arg 35 40 45
GTG GCC GTG CGC TCT GCC TAT GGG GGC CCG GTG GGC GCC GGC ATC CGC 192 Val Ala Val Arg Ser Ala Tyr Gly Gly Pro Val Gly Ala Gly Ile Arg 50 55 60
GAG GTC ACC ATT AAC CAG AGC CTG CTG GCC CCG CTG CGG CTG GGC GCC 240 Glu Val Thr Ile Asn Gin Ser Leu Leu Ala Pro Leu Arg Leu Gly Ala 65 70 75 80
GAC CCC TTC TCC CAG CGG GTG CGC CAG GAG GAG AGC GAG CAG ATC AAG 288 Asp Pro Phe Ser Gin Arg Val Arg Gin Glu Glu Ser Glu Gin Ile Lys 85 90 95
ACC CTC AAC AAC AAG TTT GCC TCC TTC ATC GAC AAG GTG CGG TTT CTG 336 Thr Leu Asn Asn Lys Phe Ala Ser Phe Ile Asp Lys Val Arg Phe Leu 100 105 110
GAG CAG CAG AAC AAG CTG CTG GAG ACC AAG TGG ACG CTG CTG CAG GAG 384 Glu Gin Gin Asn Lys Leu Leu Glu Thr Lys Trp Thr Leu Leu Gin Glu 115 120 125
CAG AAG TCG GCC AAG AGC AGC 405
Gin Lys Ser Ala Lys Ser Ser 130 135
(4) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 469 acides aminés
(B) TYPE: acide amine
(D) CONFIGURATION: linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Met Ser Ile His Phe Ser Ser Pro Val Phe Thr Ser Arg Ser Ala Ala 1 5 10 15
Phe Ser Gly Arg Gly Ala Gin Val Arg Leu Ser Ser Ala Arg Pro Gly 20 25 30
Gly Leu Gly Ser Ser Ser Leu Tyr Gly Leu Gly Ala Ser Arg Pro Arg 35 40 45
Val Ala Val Arg Ser Ala Tyr Gly Gly Pro Val Gly Ala Gly Ile Arg 50 55 60
Glu Val Thr Ile Asn Gin Ser Leu Leu Ala Pro Leu Arg Leu Gly Ala 65 70 75 80
Asp Pro Phe Ser Gin Arg Val Arg Gin Glu Glu Ser Glu Gin Ile Lys 85 90 95
Thr Leu Asn Asn Lys Phe Ala Ser Phe Ile Asp Lys Val Arg Phe Leu 100 105 110
Glu Gin Gin Asn Lys Leu Leu Glu Thr Lys Trp Thr Leu Leu Gin Glu 115 120 125 Gin Lys Ser Ala Lys Ser Ser Arg Leu Pro Asp Ile Phe Glu Ala Gin 130 135 140
Ile Ala Gly Leu Arg Gly Gin Leu Glu Ala Met Gin Val Asp Gly Gly 145 150 155 160
Arg Leu Glu Gin Gly Leu Arg Thr Met Gin Asp Val Val Glu Asp Phe 165 170 175
Lys Asn Lys Tyr Glu Asp Glu Ile Asn Arg Arg Thr Ala Ala Glu Asn 180 185 190
Glu Phe Val Val Leu Lys Lys Asp Val Asp Ala Ala Tyr Met Ser Lys 195 200 205
Val Glu Leu Glu Ala Lys Val Asp Ala Leu Asn Asp Glu Ile Asn Phe 210 215 220
Leu Arg Thr Leu Asn Glu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Gin Ser Gin Ile 225 230 235 240
Ser Asp Thr Ser Val Val Leu Ser Met Asp Asn Ser Arg Ser Leu Asp 245 250 255
Leu Asp Gly Ile Ile Ala Glu Val Lys Ala Gin Tyr Glu Glu Met Ala 260 265 270
Lys Cys Ser Arg Ala Glu Ala Glu Ala Trp Tyr Gin Thr Lys Phe Glu 275 280 285
Thr Leu Gin Ala Gin Ala Gly Lys His Gly Asp Asp Leu Arg Asn Thr 290 295 300
Arg Asn Glu Ile Ser Glu Met Asn Arg Ala Ile Gin Arg Leu Gin Ala 305 310 315 320
Glu Ile Asp Asn Ile Lys Asn Gin Arg Ala Lys Leu Glu Ala Ala Ile 325 330 335
Ala Glu Ala Glu Glu Arg Gly Glu Leu Ala Leu Lys Asp Ala Arg Ala 340 345 350
Lys Gin Glu Glu Leu Glu Ala Ala Leu Gin Arg Ala Lys Gin Asp Met 355 360 365
Ala Arg Gin Leu Arg Glu Tyr Gin Glu Leu Met Ser Val Lys Leu Ala 370 375 380
Leu Asp Ile Glu Ile Ala Thr Tyr Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu Glu 385 390 395 400
Ser Arg Leu Ala Gly Asp Gly Val Gly Ala Ala Asn Ile Ser Val Met 405 410 415
Asn Ser Thr Gly Gly Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ile Gly Leu Thr Leu 420 425 430
Gly Gly Thr Met Gly Ser Asn Ala Leu Ser Phe Ser Ser Ser Ala Gly 435 440 445
Pro Gly Leu Leu Lys Ala Tyr Ser Ile Arg Thr Ala Ser Ala Ser Arg 450 455 460
Arg Ser Thr Arg Asp 465 (5) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 135 acides aminés
(B) TYPE: acide amine
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Met Ser Ile His Phe Ser Ser Pro Val Phe Thr Ser Arg Ser Ala Ala
1 5 10 15
Phe Ser Gly Arg Gly Ala Gin Val Arg Leu Ser Ser Ala Arg Pro Gly 20 25 30
Gly Leu Gly Ser Ser Ser Leu Tyr Gly Leu Gly Ala Ser Arg Pro Arg 35 40 45
Val Ala Val Arg Ser Ala Tyr Gly Gly Pro Val Gly Ala Gly Ile Arg 50 55 60
Glu Val Thr Ile Asn Gin Ser Leu Leu Ala Pro Leu Arg Leu Gly Ala
65 70 75 80
Asp Pro Phe Ser Gin Arg Val Arg Gin Glu Glu Ser Glu Gin Ile Lys 85 90 95
Thr Leu Asn Asn Lys Phe Ala Ser Phe Ile Asp Lys Val Arg Phe Leu 100 105 110
Glu Gin Gin Asn Lys Leu Leu Glu Thr Lys Trp Thr Leu Leu Gin Glu 115 120 125
Gin Lys Ser Ala Lys Ser Ser 130 135
(6) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acide amine
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: peptide (m) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: Gly Leu Gly Ala Ser Arg Pro Arg Val Ala Val Arg Ser Ala Tyr 1 5 10 15 (7) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: Asp Pro Phe Ser Gin Arg Val Arg Gin Glu Glu Ser Glu Gin Ile
1 5 10 15

Claims

REVENDICATIONS
1/ Séquences de nucleotides, caractérisées en ce qu'elles sont isolées de leur environnement naturel et qu'elles comprennent au moins une partie de la séquence SEQ ID N°l, un ou plusieurs nucleotides étant le cas échéant modifiés, étant entendu que ces séquences sont capables de coder pour des polypeptides possédant des propriétés lectiniques. 2/ Séquences de nucleotides, caractérisées en ce qu'elles sont isolées de leur environnement naturel et qu'elles sont capables de coder, mises en oeuvre selon les techniques classiques de l'ADN recombinant, pour des sarcolectines comprenant au moins un enchaînement d'acides aminés tel qu'indiqué sur SEQ ID N°l, dans lequel un ou plusieurs acides aminés sont le cas échéant, modifiés .
3/ Séquences de nucleotides, caractérisées en ce qu'elles sont isolées de leur environnement naturel et qu'elles sont capables de s'hybrider avec au moins un fragment de SEQ ID N°l portant au moins une partie de l'information génétique pour une sarcolectine.
4/ Séquences de nucleotides selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle correspond au cadre ouvert de lecture de 1407 pb allant de la position 62, dans SEQ ID N°l, à la position 1469.
5/ Séquences de nucleotides selon l'une des revendications l à 4, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une partie de la région 5' de SEQ ID N°l et/ou de la région 3' .
6/ Séquences de nucleotides selon la revendication 5, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une partie de la séquence SEQ ID N°2, un ou plusieurs nucleotides étant le cas échéant modifies.
7/ Les séquences d'ARN-m correspondant aux séquences selon l'une des revendications 1 a 6. 8/ Les séquences anti-sens correspondant aux séquences selon l'une des revendications précédentes.
9/ Les ADNc correspondant aux séquences selon l'une des revendications 1 a 8.
10/ Vecteurs d'expression contenant au moins l'une des séquences de nucleotides selon l'une des revendications précédentes, soumises au contrôle d'un promoteur approprie.
11/ Cellules hôtes transfectees par les vecteurs selon la revendication 10, comprenant les protéines recombinantes exprimées.
12/ Nouveaux composes, caractérises en ce qu'ils possèdent une activité lectmique et comprennent au moins une partie d'un enchaînement d'acides ammes dans la séquence codée par l'une des séquences de nucleotides définies dans l'une des revendications 1 a 6, un ou plusieurs acides ammes étant le cas échéant modifies, des lors que cette modification n'altère pas les propriétés lectiniques des sarcolectines.
13/ Nouveaux composes, caractérisés en ce qu'ils présentent un enchaînement d'acides ammes dans SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4.
14/ Nouveaux composes, caractérises en ce qu'ils correspondent a la séquence codée par le cadre ouvert de lecture de SEQ ID N°l et comprennent 469 acides ammes, leur poids moléculaire étant évalue a 55kD environ. 15/ Nouveaux composés, caractérisés en ce qu'ils sont tels qu'obtenus par expression, dans une cellule hôte appropriée, selon les techniques de l'ADN recombinant, d'un vecteur d'expression contenant une séquence d'ADN telle que définie dans l'une des revendications 1 à 6, récupération du composé exprimé et purification.
16/ Nouveaux composes, caractérisés en ce qu'il s'agit de fragments ou dérivés des composés selon l'une des revendications 12 à 15, dès lors qu'ils conservent au moms en partie des propriétés lectiniques.
17/ Nouveaux composés selon la revendication
16, caractérises en qu'il s'agit des peptides SEQ ID N°5.
18/ Nouveaux composés selon la revendication 17, caractérisés en ce qu'il s'agit de peptides présentant la séquence du fragment 41 à 55 dans SEQ ID N°l, ou de peptides dérivés de cette séquence et caractérises en ce qu'ils sont reconnus par des anticorps monoclonaux capables de réagir avec SEQ ID N°l, par leurs propres anticorps, mais qu'ils ne réagissent pas avec des anticorps dirigés contre le fragment peptidique 81 à 95 dans SEQ ID N°l.
19/ Nouveaux composés selon la revendication 16, caractérisés en qu'il s'agit des peptides SEQ ID N°6. 20/ Nouveaux composés selon la revendication 17, caractérisés en ce qu'il s'agit de peptides présentant la séquence du fragment 81 à 95 dans SEQ ID N°l, ou de peptides dérivés de cette séquence et caractérisés en ce qu'ils sont reconnus par des anticorps monoclonaux capables de réagir avec SEQ ID N°l, par leurs propres anticorps mais qu'ils ne réagissent pas avec des anticorps dirigés contre le fragment peptidique 41 à 55 dans SEQ ID N°l.
21/ Composés selon la revendication 12, tels qu'obtenus par purification à partir d'extraits tissulaires, par un procédé comprenant: le traitement de l'extrait tissulaire contenant des lectines, dans des conditions ménagées par de la pepsine ou à pH acide, dans des conditions permettant d'éliminer au moins la majeure partie des protéines contaminantes tout en conservant l'activité lectinique,
- de chromatographies sur Séphacryl-S-200 et, le cas échéant, DEAE cellulose
- une chromatographie sur CM-Trisacryl-M - une chromatographie d'affinité en utilisant comme ligand un sucre tel que l'acide N-acétyl neuraminique, et
- une séparation en HPLC inverse,
22/ Composés, selon la revendication 21, caractérisés en ce que la fraction séparée en HPLC inverse est soumise à une électrophorèse sur gel SDS-PAGE et dénaturation et qu'on récupère les bandes correspondant à 55kD et £ 14kD.
23/ Les anticorps dirigés contre les composés selon l'une des revendications 12 à 22.
24/ Anticorps selon la revendication 23, caractérisés en ce qu'il s'agit d'anticorps dirigés contre la protéine de 55 kD selon la revendication 22 et qu'ils reconnaissent, outre la protéine 55 kD, également la protéine de 65 kD. 25/ Procédé d'obtention de composés selon la revendication 12 ou 21, a degré de pureté élevé comprenant le traitement d'un extrait tissulaire contenant de la sarcolectine par de la pepsine ou à pH acide de manière a éliminer au moins la ma eure partie des protéines contaminantes de l'extrait tout en conservant l'activité biologique lectmique, et
1' élimination d'impuretés par chromatographie sur
Séphacryl-S -200 et DEAE cellulose, caractérise en ce- qu'il comporte en outre une étape de chromatographie sur CM-Trisacryl-M, puis de chromatographie d' affinité utilisant comme ligand l'acide N-acetyl-neurammique, la pureté des SCL étant vérifiée par HPLC si on le souhaite. 26/ Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que l'étape de chromatographie sur CM- Tnsacryl-M est réalisée a l'aide d'un premier tampon afin d'éliminer au moins la majorité de l'albumine contaminante, puis d'un deuxième tampon pour éluer les SCL retenues sur la colonne.
27/ Procédé selon la revendication 25 ou 26, caractérise en ce que l'étape de chromatographie d' affinité réalisée avec un sucre comme ligand comprend l'utilisation d'une colonne de gel d'agarose sur lequel est fixé le sucre et d'au moms deux tampons, de manière à éluer tout d'abord les SCL, puis à éliminer les protéines contaminantes.
28/ Procédé selon l'une des revendications 25 à 27, caractérisé en ce que la séparation en HPLC est réalisée à l'aide d'un système eau/acétonitπle/acide trifluoroacétique.
29/ Procédé selon la revendication 28, caractérise en ce que la fraction correspondant au pic principal dans l'étape de HPLC est soumise à une électrophorèse sur gel SDS-PAGE et dénaturation et qu'on récupère les bandes de 65kD, 55 kD et £ 14 kD respectivement. 30/ Procédé d'obtention de sarcolectines à degré de pureté élevé, caractérisé en ce qu'il comprend:
- l'abaissement du pH du milieu à pH 5 pendant 30 minutes ;
- l'abaissement à pH 5 ce qui conduit à un précipité important, qui sera éliminé par centrifugation;
- le réajustement à pH 7,4 et la récupération du surnageant qui contient les protéines 65 et 55 kD reconnaissables par les Western blots à l'aide d'anticorps spécifiques.
31/ Facteurs de croissance, utilisables plus spécialement pour contribuer à la régénérescence des tissus lésés et à l'amélioration de processus de cicatrisation, caractérisés en ce qu'il s'agit de SCL selon l'une des revendications 12 à 22.
32/ Agents thérapeutiques de stimulation du système immunitaire, en particulier de l'immunité spécifique, caractérisés en ce qu'il s'agit de SCL selon l'une des revendications 12 à 22, le cas échéant en association avec des facteurs de croissance spécifiques, comme l' interleukine 2.
33/ Utilisation des SCL selon l'une des revendications 12 à 22, pour sélectionner des inhibiteurs de leur activité lectmique, tels que les sucres, les acides aminobutyriques et éventuellement les interférons à haute dose. 34/ Agents capables de bloquer l'action des
SCL produites en excès dans des états pathologiques, comme les cancers, les maladies virales chroniques ou auto-immunes, caractérisés en ce qu'il s'agit des anticorps selon l'une des revendications 23 ou 24.
35/ Méthode in vitro de dosage biologique de
SCL, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en contact d'un échantillon biologique à analyser ou de cellules avec une préparation d'anticorps anti-SCL selon la revendication
21, ou d'un fragment d'anticorps, l'anticorps utilisé étant immobilisé sur un support solide, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe antigène-anticorps, avec les SCL lorsqu'elles sont présentes dans l'échantillon ou les cellules,
- la mise en évidence de la formation d'un tel complexe de type antigène-anticorps.
36/ Kit pour le diagnostic de la présence de SCL dans un échantillon biologique ou des cellules, caractérisé en ce qu'il comprend une phase solide appropriée servant de support,
- une préparation d'anticorps anti-SCL selon la revendication 24 ou de fragments, libres ou immobilisés, dirigés contre les peptides 41-55.
- des solutions tampons et réactifs appropriés pour les réactions immunologiques et pour les réactions de détection.
37/ Méthode pour détecter in vitro des SCL, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en contact d'un échantillon biologique à analyser ou de cellules avec une sonde élaborée à partir d'un fragment de nucleotides selon l'une des revendications 1 à 7 ou 9, dans des conditions appropriées pour la production d'un complexe d'hybridation avec les ADN codant pour des SCL lorsqu'ils sont présents dans l'échantillon ou les cellules, et
- la mise en évidence de la formation du complexe d'hybridation lorsque les SCL sont présentes dans l'échantillon ou les cellules.
38/ Kit pour détecter in-vitro la présence de gènes codant pour des SCL, caractérisé en ce qu'il comprend :
- des sondes de nucleotides élaborées à partir des séquences définies dans l'une des revendications 1 à 7 ou 9, et - des solutions tampons et réactifs pour la réaction d'hybridation.
39/ Utilisation des séquences anti-sens selon la revendication 8, pour bloquer l'expression de SCL selon l'une des revendications 12 à 22. 40/ Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 12 à 20 fixé à de l'albumine pour réaliser un véhicule retard.
41/ Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 12 à 22, en particulier de produits recombinants humains, comme facteur de croissance des cellules in vi tro .
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2782168B1 (fr) * 1998-08-10 2000-11-03 Ass Pour Le Dev De La Biothera Nouvelles applications des sarcolectines et de leurs derives en diagnostic et therapeutique
WO2001014553A1 (fr) * 1999-08-23 2001-03-01 Genesis Research And Development Corporation Limited Compositions isolees dans la glande mammaire bovine et utilisations de ces compositions
KR100488131B1 (ko) * 2001-07-07 2005-05-06 (주)푸드바이오테크 알레르기 진단용 단백질 칩과 알레르기 유발원의 검출방법 및 알레르기 유발 항체의 검출 방법
WO2009081369A2 (fr) * 2007-12-20 2009-07-02 Association Pour Le Développement De La Biothérapie Expérimentale Et Appliquée (Adbea) Procédé de traitement des troubles de la croissance fœtale

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2618439B1 (fr) * 1987-07-21 1990-05-25 Strosberg Arthur Sequences d'amino-acides reproduisant au moins en partie la sequence des lectines animales et humaines, leurs procedes d'obtention, leurs applications diagnostiques et therapeutiques
CA1338878C (fr) * 1988-04-14 1997-01-28 Glenn E. Nedwin Lectines 14-beta-gal de mammiferes
JPH0373852A (ja) * 1989-05-24 1991-03-28 Eiji Ishikawa 特異的糖鎖を有する物質の測定法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
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