EP0879416A1 - Im durchfluss beladbares trägermaterial für festphasenassays - Google Patents

Im durchfluss beladbares trägermaterial für festphasenassays

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EP0879416A1
EP0879416A1 EP97902265A EP97902265A EP0879416A1 EP 0879416 A1 EP0879416 A1 EP 0879416A1 EP 97902265 A EP97902265 A EP 97902265A EP 97902265 A EP97902265 A EP 97902265A EP 0879416 A1 EP0879416 A1 EP 0879416A1
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EP
European Patent Office
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sorption
affinity
materials
solid phase
assay
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP97902265A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Ursula Abion Bet.- und Verw.GmbH ERHARDT
Christoph Abion Bet.- und Verw.GmbH ERHARDT
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Abion Beteiligungs und Verwaltungs GmbH
Original Assignee
Abion Beteiligungs und Verwaltungs GmbH
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Publication date
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    • G01N30/02—Column chromatography

Definitions

  • the present invention relates to a sorption material according to the preamble of claim 1, a carrier material for carrying out a solid phase assay according to the preamble of claim 9, a device according to claim 14, a method for producing the sorption material according to the preamble of claim 17 and a method for producing it of the carrier material according to claim 19, a method for producing a device for carrying out an assay according to claim 20, a solid phase assay according to the preamble of claim 21 and a method for loading the sorption material according to claim 25, a composition according to claim 26 and a device according to claim 27.
  • the loading can be carried out in a short time in a defined manner without complex equipment, and at the same time not so large amounts of the expensive loading material are required. It is also advantageous for the user if the loading of sorption materials for carrying out assays can be carried out by the user, since the user has the possibility, on the one hand, of modifying the sorption material according to its circumstances. It is also advantageous that the durability of the corresponding materials is no longer critical if they are only prepared shortly before use. In this way, the loading materials required for carrying out assays can be stored separately from device parts or sorption materials.
  • a sorption material which has the features of patent claim 1.
  • This sorption material is suitable, after loading with affinity ligands, to provide a carrier material for solid phase assays.
  • the suitability of the sorbent material according to the invention is that it can be loaded quickly and easily.
  • the sorption material is standardized to the extent that when it is loaded with affinity materials, it has relatively little fluctuation. width binds, so that the sorbent material is the basis for a standardized carrier material for standardized solid phase assays.
  • An advantage of the sorption material according to the invention is the fact that even a low load with relatively expensive affinity material provides a standardized carrier material for solid phase assays.
  • the sorption material according to the invention can also be used as an intermediate for the production of a. Support material can be viewed according to the invention.
  • An advantage of the sorption material according to the invention is its ability to be reproducibly loadable with affinity materials which are used for carrying out solid phase assays.
  • the sorption material according to the invention is in the form of a shaped body, loose beds of particles, in the form of a gel or as a dispersion.
  • the sorption material according to the invention is able to bind non-specific affinity materials. It must be permeable to a fluid.
  • the sorption material has an average pore diameter of 0.1 to 100 ⁇ m. In the case of fillings, dispersions and sintered materials, these pores are the pores present between the particles and not the pores of the surface of a particle of the sorption material according to the invention. "
  • the sorbent material binds affinity materials non-specifically when flowing through the sorbent material.
  • the sorbent material according to the invention is standardized by the proviso that a certain unit volume of the sorbent material, the affinity material to be sorptively bound, with the single homogeneous flow of a certain one Amount of a solution of this affinity material in a certain concentration in such an amount that binds between several statistically relevant loading processes by an average loading value by at most + . 40%, in particular ⁇ 30%, preferably + 20%, particularly preferably not more than ⁇ 10%, fluctuates.
  • uniform weight or density and / or uniform flow rate can be considered as measurable parameters.
  • Weight and flow fluctuations in the molded bodies indicate corresponding fluctuations in the parameters pore diameter, total pore volume and inner surface, which, in addition to other parameters, determine the sorption behavior of the carrier material.
  • the bound amount remains essentially constant in a subsequent blocking step of the free sorption points and several further flow-through processes with other suitable liquids which occur on the sorption material.
  • Liquids that elute the sorbate e.g. alcohol, eluting pH
  • the bound amount does not change, for example, in steps for blocking the still free unspecific adsorption sites, washing the sorbent material loaded with affinity material and the like.
  • the fluctuation of the load value in the range from 4 to 40 ° C is essentially independent of temperature. This is advantageous because the loading process can then be carried out without further complex process steps even in non-temperature controlled laboratories without taking the ambient conditions into account, in particular also in cold laboratories in biochemical laboratories.
  • the sorption material according to the invention preferably consists of sintered organic or inorganic material.
  • Thermoplastic plastics, preferably in particle form, are particularly suitable as the sintered organic material. These include, for example, polyethylene and polystyrene.
  • the sorption material according to the invention can be particulate for loose fillings or gels, gel-like or as a self-supporting shaped body, e.g. B. as a frit.
  • this consists of foamed plastics, in particular those in reticulated form, hollow fibers, stretched foils, composite or multilayer materials with different properties for sorption, flow or strength and for avoidance consistently large pores, ceramic materials, zeolites, metals, metal oxides, alloys, glass or carbon modifications or combinations thereof in mixtures or layered layers.
  • affinity materials include, for example, the materials and membranes used in microfiltration, possibly also ultrafiltration and depth filtration.
  • the sorption material can be produced as a sintered shaped body, produced by sintering under heat and / or pressure with or without a binder and / or macro-pore former, in dense fillings (Gieselgur, sand, anthracite), foams, fibers and hollow fibers, as transverse or longitudinal fibers, nonwovens, Tangled nonwovens, microfilaments, fiberglass, etc. are present.
  • the homogeneous flow relevant according to the invention which the sorption materials and carrier materials according to the invention have to ensure, is correlated with a uniform pore structure, particularly with regard to the adsorbing inner surface, over the surface of the sorption or carrier materials, but also over their cross section, i.e. H. in the direction of flow.
  • a uniform pore structure particularly with regard to the adsorbing inner surface, over the surface of the sorption or carrier materials, but also over their cross section, i.e. H. in the direction of flow.
  • Such a symmetrical, homogeneous pore structure is advantageous.
  • membranes with low porosity up to 40%, possibly up to 60%
  • irregular pore structure with a very broad pore size distribution overall.
  • membranes with a high porosity of up to 90% and a relatively regular pore structure with a uniform pore size distribution are obtained, as can be seen, for example, from Ullmann cited above, page 216.
  • the membranes can be produced according to the prior art by means of processes known per se.
  • the sorption material according to the invention can be coated on the surface with biopolymers, such as proteins. Depending on the area of use, it can also be hydrophobized or hydrophilized on the surface.
  • the method according to the invention for producing the sorption material according to the invention assumes that certain sieve fractions of sinterable materials are sintered. The particles that are not integrated in the sintered structure during the sintering process are then removed from the sintered material.
  • the removal of interfering particles is desirable for standardization. This removal leads to materials which are standardized and have only slight variations in the loading quantity of the affinity material that is loaded onto the sorption material. This manifests itself e.g. B. in correspondingly small scatter of the measurement signals that are used for evaluation in solid phase assays.
  • the amount of the components complementary to the affinity materials is measured, for example as analyte components under otherwise uniform test conditions.
  • sorption materials such as foamed plastics, in particular those in reticulated form, hollow fibers, stretched films, composite or multilayer materials, ceramic materials, zeolites, metals, metal oxides, alloys, glass or carbon
  • Removal of unsuitable particle sizes is carried out and / or the size of the pores, in particular in the case of membrane-like materials, is controlled by process parameters known per se. The goal can be to achieve a relatively narrow size distribution of the pores.
  • Aftertreatment may be necessary to remove the abrasion caused by mechanical treatment of the materials. B. arises in the form cutting for the use of the sorption material. This abrasion has a disruptive effect on the sorption behavior and the associated load values.
  • washing liquid can be advantageous to reverse the flow direction of the washing liquid, to use different washing liquids, in particular with regard to hydrophobicity / hydrophilicity, in different sequences, and possibly to apply pressure, vacuum or ultrasound, in particular for degassing.
  • the affinity material is preferably dissolved and passed through the sorption material to be loaded in the flow, preferably in the vertical direction of flow, preferably under the action of gravity.
  • the sorption material is arranged in the lumen of the hollow body, and in fact as closely as possible to the walls. On the one hand, this can be done by making appropriately shaped molded bodies from sorption material and placing them in the lumen of the hollow body.
  • Another alternative is to arrange the sorption material between two frits, which should preferably have no interaction with the affinity material and with later flowing components, in particular complementary to the affinity material.
  • the solution with affinity material is then added to the hollow body, which has inlet and outlet openings, so that when affinity material flows through the solution, it is non-specifically adsorptively bound to the surface of the sorption material.
  • the loading method which is already relatively quick to carry out in the case of sorption materials with slow flow, can be accelerated further by applying a negative pressure at the outlet of the cylindrical hollow body or by the action of an excess pressure at the inlet end of the cylindrical hollow body. This may also have an advantageous effect on the uniformity of the loading.
  • certain devices for example frits, or suction or Back pressure of the flow through the cylindrical hollow body can be slowed down in order to homogenize the flow with appropriate materials, but in particular to achieve a sufficient loading, as well as a reduction in the fluctuation of the loading with a higher loading.
  • the same measures can also be used in the subsequent affinity reaction between the affinity component loaded on the sorbent and a flowing complementary component.
  • the sorption material according to the invention serves as the basis for the carrier material according to the invention.
  • the carrier material according to the invention for carrying out a solid phase assay can, like the sorption material, also be in the form of a shaped body, loose fillings, a sorption material in particle form, in the form of a gel or as a dispersion.
  • the carrier material carries at least one component for carrying out solid phase assays and is also permeable to a fluid.
  • the carrier material has an average pore diameter of 0.1 to 100 ⁇ m, whereby, as with the sorbent material according to the invention, the pore in the case of corresponding materials is understood here as the space between particle-shaped particles and not the porosity of the surface of the corresponding particle.
  • the carrier material has no or only very low non-specific sorption capacity for affinity materials. In contrast, it has a high affinity for certain components which are complementary to the affinity material arranged on the sorption material.
  • these first complementary components are the assay-specific components which, for example, specifically bind an analyte.
  • the components are only poorly unspecifically adsorbable and advantageously bound specifically on or in the carrier material by means of a first, well nonspecifically adsorbable other, complementary component. that will.
  • the carrier material carries at least one easily accessible, inexpensive, stable and / or well-preserved first component which is later, for example when preparing the assay or just before the assay is carried out, a more expensive, unstable, less durable and / or highly specific assay component binds.
  • the carrier material according to the invention can be understood as a quasi at least two-stage carrier material, namely in the first stage as a carrier material with the first, primary non-specifically adsorbed affinity component and further as an at least second stage, in which a second, secondary, complex to the first affinity component ⁇ mental affinity component is bound.
  • the second, secondary affinity component represents the actual affinity component currently to be used in the assay.
  • the carrier material according to the invention is standardized by the proviso that the component located on a specific unit volume of the carrier material for carrying out solid phase assays (affinity material) is its complementary component, with a single homogeneous flow of a specific amount of a specific solution of this complementary component in a specific Concentration of this complementary component, specifically in an amount such that it fluctuates between several statistically relevant loading processes around an average loading value by at most ⁇ 40%.
  • the fluctuation is in particular not more than ⁇ 30%, preferably + . 20% and in particular preferably not more than + .10%.
  • the bound amount remains constant in the mentioned area even in the case of several subsequent flow processes of suitable other liquids on the carrier material. Again, eluting liquids are not suitable.
  • Blocking steps of specific or non-specific adsorption sites in particular washes of the with the Component for carrying out a solid phase assay loaded carrier material, further affinity binding steps for labeling, and / or reinforcement or for binding the actual assay component (s) etc. into consideration.
  • the carrier material according to the invention is advantageous because it can be manufactured relatively easily, without great expenditure of time and equipment, and in particular easily for the user himself, from easily available components, namely, on the one hand, a sorbent, in particular a sorbent according to the invention , as well as the affinity material or materials required for carrying out a solid phase assay as well as a flow-through vessel.
  • buffer solutions can also be offered, which can be used to load the sorption material and carry out the assay.
  • the support material according to the invention can be obtained by loading the sorption material according to the invention in a single flow through a certain amount of at least one solution with a certain concentration of at least one component for carrying out solid phase assays.
  • the carrier material carries at least one component for carrying out the fixed phase assay significantly below the maximum sorption capacity of the sorption material and free unspecific sorption sites of the sorption material are blocked.
  • the carrier material according to the invention can also be converted into another carrier material according to the invention by a specific binding step.
  • the carrier material according to the invention carries in particular an affinity material made of molecules, groups of molecules or particles with affine properties for other substances.
  • the affinity material is particularly selected from the group of enzymes, substrates which interact with enzymes, antibodies, antigens, such as high molecular substances or pollen or other allergens, haptens, biotin or streptavidin, nucleic acids from RNA or DNA Type, in particular those which can be hybridized with other nucleic acids, receptor or ligands of a receptor, viruses, bacteria, cells, cell organelles, blood cells, particles, such as colloidal particles of metals, metal oxides, polymers or combinations of the affinity materials mentioned.
  • the carrier material according to the invention can also be produced from the sorption material according to the invention by bringing the analyte or analytes into contact with the sorption material without prior modification with non-specific material.
  • the analyte or analytes then serve in the next specific adsorption step, e.g. B. a detection step, as specific binding parameters for complementary partners, e.g. B. in detection solutions.
  • the device according to the invention is preferably a hollow body, in the lumen of which one or more of the sorption materials and / or carrier materials according to the invention are arranged. If one or more carrier materials with different components for solid phase assays are arranged in the device according to the invention, this is done in such a way that a homogeneous flow through the hollow body, in particular the areas with carrier material, is ensured. In particular, there should be no edge effects or other areas in which the flow is faster or slower than at other points. This property is essentially determined by the standardization of the carrier material.
  • an exact fit of the sorption or carrier material with the most exact geometric shape possible is important according to the invention.
  • the sorption and / or carrier materials can be fixed in the form of loose beds or gels by means of devices arranged in the lumen of the hollow body. These devices preferably instruct homogeneous flow behavior for a fluid, in particular solutions with analytes, furthermore the devices in particular have only a low own or preferably no unspecific sorption capacity for affinity materials.
  • a method for producing the carrier material according to the invention is based on the fact that the sorption material according to the invention is treated with one or more affinity materials, essentially in solution with a certain concentration in a certain amount of liquid. This can be done on the one hand in a batch process, on the other hand and preferably, however, in a homogeneous flow in a hollow body with an inlet and outlet opening in which the sorption material is arranged.
  • the latter procedure has the advantage that a standardized carrier material with a high, uniform loading in relation to the concentration used is obtained in a very short time and without any outlay on equipment.
  • a comparable loading in the batch process takes a very long time, since initially only outer areas of the sorbent are loaded, in contrast to the flow-through method in which the entire material, ie. H. also the inner surface that quickly comes into contact with the affinity material.
  • the latter procedure enables the carrier material to be produced directly by the user in a simple manner.
  • the corresponding carrier material can also be produced in larger batches and then placed in devices for carrying out a fixed phase assay.
  • free sorption points of the carrier material are blocked with corresponding substances which are inert in the solid phase assay to be carried out. If necessary, the carrier material is washed one or more times.
  • a method for producing a device for carrying out an assay for determining a plurality of analysis parameters, in which at least one sorption material according to the invention is arranged in the lumen of a hollow body is also described and claimed. In this case, a layer arranged in the hollow body has been loaded in the flow. Free unspecific adsorption sites have been blocked, whereupon the next layer is built up in an analogous manner. It is also possible to produce various loaded carrier materials in advance and then to arrange them accordingly in the form of a layer in the assay device.
  • the solid phase assay according to the invention using the sorption material according to the invention and / or the carrier material according to the invention is carried out by treating the sorption material with a component to be used in the solid phase assay, this component adhering to the sorption material and then the solid phase assay in a manner known per se is carried out.
  • the solid phase assay can be carried out on a sorbent material pretreated in a preliminary stage, in particular on a carrier material loaded with an affinity material.
  • Solid phase assays to be carried out with the particularly preferred affinity columns are already described in general form in DE 41 26 436 AI, 42 08 732 AI or DE 195 00 862 AI.
  • the solid phase assay in the sense of the invention is characterized by an optimization of the parameters loading behavior, pore size, flow time and amount of sorbent, possible additional means for flow correction (frits, pressure), amount of affinity material, amount of sample of the analyte solution and properties of the marker, in particular amplification and flow behavior , out.
  • the solid phase assay is standardized independently of temperature due to the sorption or carrier materials used according to the invention.
  • the solid phase assay is preferably carried out as an affinity assay, in particular as an immunoaffinity assay.
  • the sorption material according to the invention enables particularly simple test configurations which allow any user or assay developer to produce or develop their own assays, in particular affinity assays such as immunoaffinity assays. This basically requires only one device for setting up and / or carrying out an affinity assay with the following features:
  • the sample is then optionally treated with an eluent, so that any specifically bound material on the support material according to the invention is detached and / or the marker used is detached, the eluate,
  • a measurement is carried out in the vessel without elution, for which rectangular flow-through cross sections are preferably suitable in order to carry out the measurement through planar vessel walls.
  • a device is therefore also claimed which enables an affinity assay according to the invention to be set up and / or carried out.
  • a particular advantage of the device is that it can make it easier for the user to set up automatable assays.
  • the device has a device for gripping at least one hollow body which is at least partially filled or can be filled with the sorption material according to the invention, in particular in the form of a tube.
  • a device is provided for loading that which is located in the tube or filled in the tube Sorption material with components for carrying out solid phase assays, while maintaining the carrier material described according to the invention.
  • a device can also be provided with at least one hollow body which is filled with the carrier material according to the invention.
  • the device according to the invention has a device for treating the at least one at least partially filled tube with solutions for washing, binding or eluting components of the solid phase assay or the analyte. It can be advantageous to couple the device according to the invention with units for the detection of solid phase components or analytes.
  • the devices of the device are preferably adapted to known microtitration formats. It is then possible in an advantageous manner in biochemical analysis "and diagnostic equipment used that customarily, on the Mikrotitrationsformat parked are to adapt and use.
  • the standardization and the non-specific loading of the sorbent or the specific loading of a carrier material that carries a primary, not yet assay-specific affinity component, directly during the test with the affinity component used for this allow a sample-oriented Processing in the manual or automated test procedure, which is advantageous compared to the conventional test-oriented processing of an assay.
  • the device according to the invention is in particular a small column open at the top and bottom for single use, which contains an activated solid phase matrix for binding proteins.
  • the device according to the invention with the sorption materials and carrier materials according to the invention shows the advantages of an immunoassay (sensitivity, Selectivity) and the advantages of affinity chromatography (high surface and binding capacity, reagent flow) combined in an immunological test system.
  • the activated solid matrix adsorbs the primary immunological reaction partner via hydrophobic interaction when flowing through. After the free binding sites have subsequently been blocked, the test system can be used immediately or stored temporarily, depending on the stability of the immunological reaction partner.
  • the device according to the invention is particularly advantageous because only about 10 minutes are required for the preparation and the preparation and the subsequent test can also be carried out directly one after the other by hand or in an automatic machine.
  • This has the advantage that work can be carried out in a sample-oriented manner, ie devices according to the invention which have not yet been specified can only be correspondingly specified directly before the test or the tests without loss of time.
  • the test system is processed in accordance with the structure of the immunoassay. So sandwich assays and competitive assays can be carried out, as can the previous preparation of the solid phase in the independent flow of the reagents. The actual assay can therefore also be carried out in about 10 minutes.
  • the device according to the invention can be processed in automated workstations in the microtiter plate format and evaluated in particular in the microtiter plate reader at 510 nm, optionally also at 492 nm.
  • the complete sequence consisting of coating, test processing and evaluation no more than 30 minutes are required, rather less, for example in the range from 20 to 25 minutes.
  • the actual test procedure follows, which is set up in sample application, addition of secondary reagents, addition of the labeling substance, optionally washing steps and the elution step. The evaluation follows directly on the elution step.
  • the sorption material according to the invention can, in cooperation with the device according to the invention and an automated device, be used in a particularly advantageous manner for the development of assays.
  • the device according to the invention in which the sorbent material according to the invention is arranged, is treated with a coupling buffer with antigens and / or antibodies for equilibration and specific coating.
  • the coating is carried out with preferably 750 ⁇ l coupling buffer.
  • a sodium bicarbonate buffer is particularly suitable as the coupling buffer.
  • a rectangular cross section of the flow-through vessel in the region of the carrier bed of, for example, 5 mm ⁇ 1.6 mm at a height of 5 mm per carrier bed is advantageous because of the small cross-sectional area, which is suitable for vertical and horizontal flow.
  • the part of the flow-through vessel lying in front of it in the flow-through direction can have a different, in particular larger cross-section in order to allow larger application volumes.
  • the non-specific binding sites that are still free are blocked with immunologically inert protein in buffer. PBS with a proportion of nonionic surfactants has proven to be particularly advantageous for blocking.
  • the assay developer then still has the option of determining the sample dilution for the assay to be developed in simple experiments and creating a calibration curve once.
  • sufficient one-time calibration curve (or the one-off determination of the cut-off range for qualitative yes / no tests) is preferably carried out by carrying out a comparison test in the upper concentration range (clear positive test) for checking and / or compensating Fluctuations between different measuring devices added, in the case of yes / no tests as in example 7 as well through a negative test.
  • sample dilutions in the range from 1: 301 to 1: 1,001 have proven to be advantageous for infection-serological tests. Due to the size of the devices according to the invention, a suitable sample volume is 250 ⁇ l.
  • Suitable secondary antibodies or antigen conjugates are, in particular, biotinylated reagents with a degree of biotinylation of protein: biotin of about 1: 4.
  • biotinylation of different secondary reaction partners allows the use of a uniform marker-streptavidin conjugate.
  • the degree of biotinylation and the concentration of the secondary reagent used should be matched to one another.
  • concentration of the conjugates provided by the applicant is between 3 and 15 ⁇ g / ml.
  • the volume in which the secondary antibody is brought into the device according to the invention is preferably 250 ⁇ l.
  • Abion Red The color conjugate sold under the name Abion Red has proven to be particularly advantageous as a color marker.
  • Abion Red is a dye particle conjugate also developed for use with the devices according to the invention. It is particularly covalently cross-linked and extremely sensitive (approx. 3 orders of magnitude more sensitive than colloidal gold). If the dye conjugate contains streptavidin, Abion Red couples to biotinylated reagents. Abion Red is the subject of the German patent application 19543 556.7.
  • the dye conjugate can be eluted with 300 ⁇ l of ethanol after the reaction in a microtiter plate and then quantitatively measured in conventional photometers at 510 nm or 492 nm.
  • ABION RED is also particularly suitable for measurement in a flow-through vessel without elution, since it allows optical quantitative determination without additional color reaction.
  • the support materials according to the invention have the advantage that binding reactions carried out with them do not show any dependence on incubation times or temperatures (between 15 and 35 ° C.). Therefore, after the expiry of a Processing step follow the next steps immediately. If, however, highly specific reagents show kinetic effects in a range from 0 to 6 min, it is advisable to determine the influence of the reaction kinetics when developing a test.
  • the system already outlined above is available in the form of an automatic machine which can be used both for test development and for test processing, for example in an analytical laboratory.
  • the throughput of the machine is approximately 100 of the devices according to the invention per hour.
  • the advantage of the test system made available according to the invention is that sample-oriented processing can take place and one is largely independent of the test-oriented processing previously carried out in routine processes. It is therefore possible to work through the corresponding tests one after the other for an analysis to be carried out and to record the sample holistically and not, as in conventional analysis, to be bound to receive a holistic test result only when the respective tests involved those involved Machines are processed. Waiting times until a sufficient number of samples for a particular test are reached.
  • the machine can use the following cross-test reagents, namely buffer and system liquids, such as PBS with low surfactant and high surfactant concentration, water, ethanol and coupling buffer.
  • Color marker concentrate, blocking reagent, BSA, anti-human-IgG, anti-human-IgM, anti-human-IgA, preferably biotinylated, and the devices according to the invention in which the sorbent material is arranged uncoated are provided as reagents.
  • the machine itself provides microtiter plates, sample holders with barcode lasers for primary and secondary sample tubes, and microtiter plate photometers the necessary filters and a data processing system with the appropriate software. This machine then, as described above, works through the work steps also mentioned above. Instead of microtiter plates and microtiter plate photometers, the automat contains a corresponding reading device when evaluated in the flow-through vessel.
  • the sorption material according to the invention with the coated carrier material and the corresponding manufacturing method of the carrier material in connection with the automatable device for setting up and carrying out an affinity assay provides a completely new concept in order to give everyone the design without complicated and expensive machine configurations to enable affinity assays.
  • compositions in kit form containing carrier material or sorbent material according to the invention are also claimed according to the invention, cylindrical hollow bodies with inlet and outlet openings, carrier material or sorbent material preferably already being arranged in the hollow bodies, aqueous solutions for loading the sorbent material according to the invention which already contain dissolved affinity material, or separately from the affinity material in storable form and, if appropriate, non-aqueous solutions for loading the sorbent material according to the invention, which either already contain affinity material in solution or contain the affinity material in the composition separately in storable form and, if appropriate, aqueous solutions for carrying out a solid phase assay together with, if appropriate, further auxiliary reagents or devices for Carrying out solid phase assays.
  • a kit in a typical embodiment contains about 200 columns for immunoassay test developments. This also contains washing buffer, blocking reagent, eluent, a highly sensitive particle suspension dye, aids with a microtiter plate, a hanging frame for 96 devices according to the invention in microtiter format, plexiglass frame, waste tray, test-specific reagents for 24 assays including standard serum, as well as other aids, such as descriptions etc.
  • the kits are regularly unopened for a long time, quite up to 2 years, durable.
  • the sorption material or carrier material according to the invention can also be used in the form of the devices according to the invention for the routine checking of samples which may be contaminated with viruses or bacteria.
  • samples which may be contaminated with viruses or bacteria.
  • blood products in blood banks can be examined for HIV, hepatitis, syphilis, etc.
  • Other infectious components such as hepatitis B core antigen and CMV have not been tested to date. Since these are also not harmless to health, it is desirable to also test for these germs. However, this is not done for economic reasons.
  • the objects according to the invention form the basis for tests which, with a high degree of sensitivity, also make it possible to test several donor sera in the pool in the case of blood products.
  • the assays that can be carried out with the objects according to the invention are also able to examine a pool of several sera, for example up to 10 sera, for the presence of a specific antibody with the same sensitivity as a corresponding single test.
  • a so-called sandwich assay is preferably used, it being possible for the sample to be enriched in the flow through the sorption materials according to the invention.
  • the test is suitable for antigens in which a positive finding is relatively rare and also wherever a large number of sera must be examined. This makes it possible to significantly increase the virus safety of blood preparations in blood banks with an economically justifiable effort.
  • An automated blood group determination (automatic Coombs test) can also be carried out according to the invention can be achieved.
  • a blood group determination must be carried out with every blood donation and when a blood donation is administered. This examination is required by law internationally. The existing examination methods are reliable, but due to a centrifugation step in the assay, they are relatively time-consuming and cannot be automated.
  • the sorption materials or carrier materials according to the invention enable rapid and automatic blood group testing, in particular for blood banks and clinics. This variant of the method according to the invention can be expanded to differentiate special antibodies against blood group antigens.
  • the Heliobacter pylori bacterium can also be tested serologically for diagnosis of gastric ulcers accompanying therapy.
  • Round frit made of polyethylene, 5 mm in diameter, 5 mm in height, precise in shape for the cross section of a flow-through vessel, punched out of filter plates which were produced by sintering from polyethylene powder with a narrow particle size distribution by sieving (particle size below 250 ⁇ m); Nominal pore size 50 ⁇ m (bubble point),
  • Pore size distribution with Coulter porometer from 5.492 to 138.6 ⁇ m, average pore size 13.64 ⁇ m, 1.063% of the pore number over 27.5 ⁇ m, 15.45% over 15.92 ⁇ m (Abion GmbH, Irishlich, Germany), - 28448 PC 17EP97 / 00405
  • Coupling buffer 0.1 M sodium bicarbonate / sodium carbonate, pH 9.2;
  • Blocking buffer 0.1 M sodium phosphate, 0.1 M sodium chloride, 1% BSA (bovine serum albumin), 0.005% Tween 20, pH 7.2;
  • Wash and dilution buffers such as blocking buffers without BSA.
  • the frits are inserted individually, essentially unbent and exactly perpendicular to the flow direction, at the upper edge of the conical part of the flow vessels.
  • the loose particles contained in the frits of the manufacturing process, which disrupt the standardization, in particular unbound polyethylene powder particles, abrasion and dust were removed by intensive washing.
  • E ⁇ was washed at least twice with 750 ul ethanol and with 750 ul bidistilled water. If it was necessary to vent the frit, washing was carried out under slight pressure. In order to improve the washing effect and / or the ventilation, the flow direction could also be reversed in individual washing steps. A check after the production of the corresponding frit batches is recommended and is carried out using the uniformity of the Solution received measurement signal in the subsequent affinity assay. Finally, the frits were washed with 750 ⁇ l coupling buffer.
  • the diphtheria toxoid solution was diluted in a coupling buffer to a final concentration of 5 ⁇ g / ml.
  • 750 ⁇ l each of this solution with an absolute amount of 3.75 ⁇ g toxoid were added to each flow-through vessel with the frit inserted.
  • the frits In free flow under gravity (throughput time approx. 6 min), the frits nonspecifically adsorbed essentially uniform amounts of toxoid, which was particularly evident from the subsequently measured uniform binding of the complementary human anti-diphtheria IgG at a constant concentration. No useful signal could be obtained without intensive washing out of the free particles in the frit. Thereafter, any unspecific adsorption sites still present on the frits were each coated with 750 ⁇ l blocking buffer and washed with 750 ⁇ l washing buffer. The vessels produced in this way are called test vessels below.
  • the diphtheria serum is diluted to the concentrations 10, 7.5, 5, 2.5, 0.75, 0.5, 0, 25 and 0.1 mlU / ml with washing buffer.
  • the biotinylated secondary antibody to 6 ⁇ g / ml, the Abion RED conjugate in a ratio of 1:40.
  • 250 ⁇ l of the diluted samples were applied to the test vessels, then 250 ⁇ l of the solution of the biotinylated antibody and 250 ⁇ l of the Abion RED conjugate .
  • elution was carried out with 300 ⁇ l ethanol each.
  • the optical density of the eluate was determined in the ELISA reader at 492 nm against a zero value (ethanol 95% by volume).
  • the ⁇ o determined calibration curve for all further measurements with materials of the same batch is shown in Figure 1.
  • the calibration curve was created with at least 10 measurements per measuring point, with one for each measuring point The coefficient of variation was below 8% (standard deviation / mean x 100).
  • the marking with large dye particles such as Abion RED, with diameters of approx. 100 to 200 nm leads to a non-linear or at most in the lower concentration range even in the capacity range of the text vessel linear relationship between concentration and signal, which can be due to the measurement method for optical density as well as the behavior of large particles in the assay examined here.
  • the example relates to the temperature dependency at 4 ° C to 39 ° C of the determination of the tetanus antibody concentration in serum and thus the calibration curve with Abion RED marker.
  • the temperature-independent calibration and measurement within the measuring range in the capacity range of the test vessels within the measuring accuracy can be seen from FIG. 3.
  • This example relates to the antigen loading dependence of the determination of the tetanus antibody concentration in serum and thus the calibration curve with Abion RED marker or FITC marker.
  • Serum dilution to 7.5, 5.55, 3.75, 1.83, 0.75, 0.375 and 0.183 mlU / ml; Sample application 50 ⁇ l.
  • Figure 6 shows that there is no difference between the two loads when measured with a fluorescence marker. Nevertheless, it is advisable to work with the high loading volume in the test position in order to achieve a better distribution of the binding sites. This distribution is advantageous for accessibility for the large dye marker particles, since a better signal also results when the distribution is better.
  • This example relates to the dependence on the amount of the sample solution using the example of the tetanus and diphtheria antibody concentration in serum.
  • Coupling buffer solution equal absolute amounts of human anti-tetanus IgG in 750 ⁇ l, 250 ⁇ l, 50 ⁇ l and 10 ⁇ l wash buffer solution.
  • the strong dependence of the signal on the amount of the sample can be seen in Figure 7.
  • the measurement with 50 ⁇ l gives the strongest signal and was the most suitable sample quantity for the tests under investigation.
  • the range up to 100 ⁇ l also provides reliable signals, whereas the high signal values at 10 ⁇ l are not preferable due to the large scatter.
  • an assay can also be carried out with the carrier materials according to the invention even in a small amount.
  • This example relates to the pore size dependence of the determination of the diphtheria antibody concentration in serum with Abion RED markers.
  • Example 7 The experiment was carried out as described in Example 5 b). The sample amount was 250 ⁇ l with 3.08, 2 and 1 mlU / ml; Frits with nominal pore sizes of 100, 50, 35 and 3 ⁇ m were used. The dependence of the signal on the pore diameter is shown in Figure 9.
  • Example 7 The sample amount was 250 ⁇ l with 3.08, 2 and 1 mlU / ml; Frits with nominal pore sizes of 100, 50, 35 and 3 ⁇ m were used. The dependence of the signal on the pore diameter is shown in Figure 9. Example 7
  • IgG antibodies against viral antigens influenza A2, type H3N2.
  • This immunoassay is used for the qualitative detection of IgG antibodies in human serum.
  • the antibody sought in human serum forms an immune complex with the antigen immobilized on the solid matrix (influenza virus A2, type H3N2).
  • the anti-human-IgG-biotin conjugate combines with this complex.
  • Abion Red specifically binds to the biotin conjugate via streptavidin.
  • a deep red dye complex is formed (in the case of positive samples), which is eluted with 300 ⁇ l of ethanol in a microtiter plate and measured at 510 nm (possibly 492 nm) in the microtiter plate reader. Unbound reaction partners are removed beforehand by washing processes.
  • the devices according to the invention ethanol absolutely undenatured, coupling buffer, PBS with a high surfactant content, bidistilled water, Abion Red, anti-human-IgG (monoclonal), (influenza A2 virus antigen type H3N2), control serum influenza A2 negative, control serum influenza A2 positive, used.
  • the device according to the invention is suspended in the sample feed of the assay machine and positioned over a washing tub.
  • the devices according to the invention are deaerated by applying 500 .mu.l of ethanol directly with a sharp jet from the multipipette and the amount of liquid passes through the device according to the invention in flow (approx. 2 min). Then 500 ⁇ l, 50 vol .-% ethanol are applied with a multipipette.
  • the influenza A2 virus antigen is adjusted to a protein content of 2.5 ⁇ g / ml in the coupling buffer, and 750 ⁇ l of the solution are adjusted to an amount according to the invention Device abandoned.
  • the throughput time here is typically 4 min.
  • the device according to the invention is blocked with 750 ⁇ l PBS with a high tween content (approx. 3 min) and is now ready to carry out the influenza assay. If necessary, it can also be stored for up to 6 months. Storage should take place at 4 ° C. in a refrigerator and under a PBS buffer which contains, for example, sodium azide as bactericide. If several devices are to be prepared that are not used immediately, the prepared device can also be stored in the sealed bag at 4 ° C for approx. 14 days.
  • the required number of the prepared devices is suspended in a support frame and positioned over a washing tub.
  • the sera to be tested, negative and positive controls, are diluted 1: 101 in PBS with a high Tween content and 250 ⁇ l of each are applied to a device according to the invention.
  • the lead time is typically around 2 minutes. Since incubation times do not bring improved results, these can be dispensed with entirely.
  • the biotinylated, monoclonal secondary antibody (anti-human IgG) is diluted to 15 ⁇ g / ml in the same buffer, and 250 ⁇ l of each are applied to a device according to the invention.
  • the throughput time is approx. 2 min.
  • Abion Red is diluted 1:30 in the same buffer and 250 ⁇ l of each are placed on a device according to the invention.
  • the throughput time here is also about 2 minutes.
  • a washing step is then recommended. This is done with 750 ⁇ l bidest. -Water.
  • the throughput time is about 2 minutes.
  • the carrier frame with the "devices of the invention is a Mikro ⁇ titer plate po ⁇ itioniert.
  • the erfindung ⁇ iliaen devices are then incubated with 300 ul of ethanol in the microtiter plate eluted. Die ⁇ er step lasts for at least about 3.
  • the microtiter plate is al ⁇ bald in MTP Reader at 510 nm, if necessary, measure 492 nm against 300 ⁇ l ethanol as blank sample.
  • the cleavage product C 3 a is formed, which is also referred to as anaphylutoxin.
  • the test described can be used to quantify C 3 a.
  • This in Humanpla ⁇ ma Komplementpeptid C 3 a is bound in the first step from the immobilized on the solid matrix monoclonal antibody.
  • the second biotinylated monoclonal antibody against C 3 a combines with this complex.
  • the dye Abion Red binds specifically to the biotin conjugate via streptavidin.
  • a red dye complex is formed (in the case of positive samples), which is eluted with 300 ⁇ l of ethanol (96%) in a microtiter plate (MTP) and is measured at 510 nm (possibly 492 nm) in the MTP photometer.
  • Light-bound reaction partners are removed by washing processes.
  • the preparation and coating of the erfindung ⁇ nningen Vor ⁇ directions is carried out as described in the previous example with the difference that are used as antibody anti-C 3 a-antibodies.
  • the concentration of the anti-C 3 a antibody is 3 ⁇ g / ml.
  • the blocking is carried out with 750 ⁇ l of a PBS buffer which contains a higher proportion of tween.
  • the procedure is as described in the previous example.
  • the secondary antibody is diluted to 20 ⁇ g / ml in the buffer mentioned.

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Abstract

Sorptionsmaterial in Form eines Formköpers, loser Schüttungen des Sorptionsmaterials in Partikelform, in Form eines Gels, einer Membran oder in Membranen eingebettet oder als Dispersion, wobei das Sorptionsmaterial in der Lage ist, Affinitätsmaterialien unspezifisch zu binden und für ein Fluidum durchlässig ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Sorptionsmaterial einen mittleren Porendurchmesser von 0,1 bis 100 νm aufweist, das Sorptionsmaterial die Affinitätsmaterialien im Durchfluß durch das Sorptionsmaterial unspezifisch bindet, das Sorptionsmaterial standardisiert ist durch die Maßgabe, daß ein bestimmtes Einheitsvolumen gefüllt mit dem Sorptionsmaterial das sorptiv zu bindende Affinitätsmaterial beim einmaligen homogenen Durchfluß einer bestimmten Menge einer Lösung des Affinitätsmaterials in einer bestimmten Konzentration in einer solchen Menge bindet, die zwischen mehreren statistisch relevanten Beladungsvorgängen um einen mittleren Beladungswert um höchstens ± 40 % schwankt und daß die gebundene Menge bei der nachfolgenden Blockierung freier unspezifischer Sorptionsstellen sowie mehreren darauf folgenden geeigneten Durchströmungsvorgängen an dem Sorptionsmaterial, wie Waschungen des mit Affinitätsmaterial beladenen Sorptionsmaterials oder Zuführung von affinitätsreaktiven Materialien, in dem genannten Bereich konstant bleibt.

Description

Im Durchfluß beladbares Trägermaterial für Festphasenassays
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Sorptions- material gemäß Oberbegriff des Anspruchs 1, ein Träger¬ material zur Durchführung eines Festphasenassays gemäß Oberbegriff des Anspruchs 9, eine Vorrichtung gemäß Anspruch 14, ein Verfahren zur Herstellung des Sorptionsmaterials gemäß Oberbegriff des Anspruchs 17, Verfahren zur Herstellung des Trägermaterials gemäß Anspruch 19, ein Verfahren zur Her¬ stellung einer Vorrichtung zur Durchführung eines Assays gemäß Anspruch 20, ein Festphasenassay gemäß Oberbegriff des Anspruchs 21 sowie ein Verfahren zur Beladung des Sorptions- materials nach Anspruch 25, eine Zusammenstellung gemäß Anspruch 26 und eine Vorrichtung gemäß Anspruch 27.
Es sind aus der DE 41 26 436 AI und DE 42 08 732 AI Reaktionssäulen für Festphasenimmunanalytik und eine Methode zur Bestimmung von über Immunreaktionen nachweisbaren Komponenten bekannt. Diese Säulen sind einfach in der Hand¬ habung, arbeiten mit Durchflußverfahren, benötigen nur kurze Reaktionszeiten und bewirken quantitative Reaktionen. Nach einer grundsätzlichen Standardisierung der entsprechenden Charge der Säulen erfordern diese weder eine vorherige Kalibrierung oder Regenerierung noch eine Referenzstandard- messung. Mit solchen Systemen lassen sich die bekannten Affinitätsassays, wie ELISA-Platten oder Immun-Blotting- Reaktionen einfacher, schneller oder präziser durchführen und sind leichter automatisierbar. Zu verbessern ist aller¬ dings die relativ aufwendige Herstellung dieser Systeme,durch die relativ hohe Beladung der Sorptionsmaterialien, die in den Säulen abgefüllt sind. Die Beladung des Sorptions- materials dauert relativ lange. So sind schon bei Gelen, wie Agarose, bereits Stunden erforderlich, bis das Beladungs¬ material in die Poren eindringt. Es ist für die Herstellung von Vorteil, wenn die Beladung in kurzer Zeit ohne aufwendige Apparaturen definiert durchgeführt werden.kann und zugleich nicht so große Mengen des teuren Beladungsmaterials benötigt werden. Außerdem ist es für den Anwender von Vorteil, wenn die Beladung von Sorptionsmaterialien zur Durchführung von Assays anwenderseitig durchgeführt werden kann, da der Anwender zum einen die Möglichkeit hat, das Sorptionsmäterial nach seinen Gegebenheiten zu modifizieren. Vorteilhaft ist ebenfalls, daß die Haltbarkeit der entsprechenden Materialien nicht mehr kritisch ist, wenn diese erst kurz vor der An¬ wendung vorbereitet werden. So lassen sich die Beladungs- materialien, die zur Durchführung von Assays benötigt werden, getrennt von Vorrichtungsteilen oder Sorptionsmaterialien aufbewahren.
Das der Erfindung zugrundeliegende Problem besteht also darin, die genannten Nachteile zu vermeiden und besser geeignete Materialien zur Verfügung zu stellen. Über¬ raschenderweise wird dieses Problem gelöst durch ein Sorptionsmaterial, welches die Merkmale des Patentanspruchs 1 aufweist. Dieses Sorptionsmaterial ist geeignet, nach Beladung mit Affinitätsliganden, ein Trägermaterial für Festphasenassays zur Verfügung zu stellen. Vorteilhaft an dem erfindungsgemaßen Sorptionsmaterial ist seine Eignung schnell und einfach beladen zu werden. Das Sorptionsmaterial ist insofern standardisiert, als daß eε bei Beladung mit Affinitätsmaterialien diese mit relativ geringer Schwankungs- breite bindet, so daß das Sorptionsmaterial Grundlage für ein standardisiertes Trägermaterial für standardisierte Festphasenassays ist. Vorteilhaft am erfindungsgemäßen Sorptionsmaterial ist die Tatsache, daß auch eine niedrige Beladung mit relativ teurem Affinitätsmaterial ein standardi¬ siertes Trägermaterial für Festphasenassays liefert. Das Sorptionsmaterial gemäß der Erfindung kann auch als Zwischen¬ produkt zur Herstellung eines . Trägermaterials gemäß der Erfindung angesehen werden. Vorteilhaft am erfindungsgemäßen Sorptionsmaterial ist dessen Fähigkeit, im Durchfluß re¬ produzierbar mit Affinitätsmaterialien, die für die Durch¬ führung von Festphasenassays verwendet werden, beladbar zu sein.
Überraschend war insbesondere die Tatsache, daß das un¬ spezifisch an das Sorptionsmaterial bindende Affinitäts- materiäl im Durchfluß so gleichmäßig und reproduzierbar adsorbiert wird, daß eine Standardisierung dieses Materials und damit verbunden eines erfindungsgemäßen Trägermaterials möglich ist.
Das erfindungsgemäße Sorptionsmaterial liegt in Form eines Formkörpers, loser Schüttungen von Partikeln, in Form eines Gels oder als Dispersion vor. Das Sorptionsmaterial gemäß der Erfindung iεt in der Lage, Affinitätsmaterialien un¬ spezifisch zu binden. Es muß für ein Fluidum durchlässig sein. Das Sorptionsmaterial weist einen mittleren Porendurch- messer von 0,1 bis 100 μm auf. Bei Schüttungen, Dispersionen und gesinterten Materialien sind diese Poren die zwischen den Partikeln vorhandenen Poren und nicht die Poren der Ober¬ fläche eines Partikels des erfindungsgemäßen Sorptions¬ materials. "Das Sorptionsmaterial bindet Affinitätsmaterialien beim Fluß durch das Sorptionsmaterial unspezifisch. Das er¬ findungsgemäße Sorptionsmaterial ist standardisiert durch die Maßgabe, daß ein bestimmtes Einheitsvolumen deε Sorptionsmaterials, daε sorptiv zu bindende Affinitäts¬ material beim einmaligen homogenen Durchfluß einer bestimmten Menge einer Lösung dieses Affinitätsmaterials in einer bestimmten Konzentration in einer solchen Menge bindet, die zwischen mehreren statistisch relevanten Beladungsvorgängen um einen mittleren Beladungswert um höchstens +. 40%, ins¬ besondere ± 30%, bevorzugt + 20%, insbesondere bevorzugt nicht mehr als ± 10%, schwankt.
Für die Kontrolle der Einheitlichkeit des Formkörpers kommen als meßbare Parameter gleichmäßiges Gewicht oder Dichte und/oder gleichmäßige Durchflußgeschwindigkeit in Betracht. Gewichts- und Durchflußschwankungen deuten bei den Form¬ körpern auf entsprechende Schwankungen der Parameter Poren¬ durchmesser, gesamtes Porenvolumen und innere Oberfläche .hin, die neben anderen Parametern das Sorptionsverhalten des Trägermaterials bestimmen.
Die gebundene Menge bleibt bei einem nachfolgenden Blockie¬ rungsschritt der freien Sorptionsstellen und mehreren weiteren Durchströmungsvorgängen mit anderen geeigneten Flüssigkeiten, die sich an dem Sorptionsmäterial ereignen, im wesentlichen konstant. Nicht geeignet sind natürlich Flüssigkeiten, die das Sorbat eluieren (z. B. Alkohol, eluierender pH) . Insbesondere ändert sich die gebundene Menge beispielsweise bei Schritten zur Blockierung der noch freien unspezifischen Adsorptionsstellen, Waschungen des mit Affinitätsmaterial beladenen Sorptionsmaterials und ähnlichem nicht.
Die Schwankung des Beladungswertes im Bereich von 4 bis 40°C ist im wesentlichen temperaturunabhängig. Dies iεt vorteil¬ haft, weil das Beladungsverfahren dann ohne weiter aufwendige Verfahrensschritte auch in nicht temperierten Laboratorien ohne Berücksichtigung der Umgebungsbedingungen durchgeführt werden kann, insbesondere auch in Kältelaboratorien in biochemischen Laboratorien. Daε erfindungsgemäße Sorptionsmaterial besteht vorzugεweise aus gesintertem organischen oder anorganischen Material. Als gesintertes organisches Material kommen insbesondere thermo¬ plastische Kunststoffe, vorzugsweise in Partikelform, in Frage. Dazu gehören zum Beispiel Polyethylen und Polystyrol.
In einer weiteren Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Sorptionsmaterial partikelförmig für lose Schüttungen oder Gele, gelförmig oder als selbsttragender Formkörper, z. B. als Fritte, vorliegen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungs- gemäßen Sorptionsmaterials besteht dieses aus geschäumten Kunststoffen, insbesondere solchen in retikulierter Form, Hohlfasern, verstreckten Folien, Komposit- oder Mehr- schichtenmaterialien mit unterschiedlichen Eigenschaften für die Sorption, den Durchfluß oder die Festigkeit und zur Ver¬ meidung durchgängig großer Poren, keramischen Materialien, Zeolithen, Metallen, Metalloxiden, Legierungen, Glas oder Kohlenstoffmodifikationen oder Kombinationen davon in Mischungen oder geschichteten Lagen.
Im allgemeinen kommen homogene, poröse Materialien mit ausreichender nicht spezifischer Sorption affinitätsreaktiver Komponenten {Affinitätsmaterialien) in Frage. Dazu gehören zum Beispiel auch die in der Mikrofiltration, gegebenenfalls auch Ultrafiltration und Tiefenfiltration eingesetzten Materialien und Membranen. Das Sorptionsmaterial kann als gesinterter Formkörper, hergestellt durch Sinterung unter Wärme und/oder Druck mit oder ohne Bindemittel und/oder Makroporenbildner, in dichten Schüttungen (Gieselgur, Sand, Anthrazit) , Schaumstoffen, Fasern und Hohlfasern, als Quer¬ oder Längsfasern, Vliese, Wirrvliese, Mikrofilamenten, Fiberglas, etc. vorliegen. Neben den genannten organischen Materialien kommen grundsätzlich auch andere Materialien und Herstellprozesse in Frage, wie sie insbeεondere in Ulimann Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A16, ab Seite 224, in Eberhardt Staude, Membranen und Membranprozesse, Verlag Chemie Weinheim 1992, ab Seite 8, und in Siegfried Ripperger, Mikrofiltration mit Membranen, Verlag Chemie Weinheim 1992 ab Seite 15, genannt sind.
Der erfindungsgemäß relevante homogene Durchfluß, den die erfindungsgemäßen Sorptionsmaterialien und Trägermaterialien gewährleisten müssen, ist korreliert mit einer gleichförmigen Porenstruktur, besonders bezüglich der adsorbierenden inneren Oberfläche, über die Fläche der Sorptions- oder Träger¬ materialien, aber auch über deren Querschnitt, d. h. in Richtung des Durchflusses. Eine solche symmetrische, homogene Porenstruktur ist vorteilhaft. Es ist jedoch auch möglich, asymmetrische Porenstrukturen zu verwenden, mit in Durch¬ flußrichtung gesehen z. B. zuerst kleineren Poren, um eine größere innere Oberfläche zur Verfügung zu stellen, gefolgt von größeren Poren, damit die Durchflußgeschwindigkeit nicht zu klein wird.
Durch Sintern werden Membranen mit niedriger Porosität (bis 40%, eventuell bis 60%) und irregulärer Porenstruktur mit insgesamt sehr breiter Porengrößenverteilung erhältlich. Durch Verstrecken von Polymerfolien werden Membranen hoher Porosität bis 90% und relativ regulärer Porenstruktur mit einheitlicher Porengrößenverteilung erhalten, wie sich beispielsweise aus Ullmann a.a.O., Seite 216, ergibt. Die Membranen lassen sich nach dem Stand der Technik mittels an sich bekannter Verfahren herstellen.
Das Sorptionsmaterial gemäß der Erfindung kann in einer bevorzugten Ausführungsform an der Oberfläche mit Biopoly¬ meren, wie Proteinen, beschichtet sein. Es kann ebenfalls, je nach Einsatzbereich, an der Oberfläche hydrophobiert oder hydrophiliert sein.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung deε er¬ findungsgemäßen Sorptionsmaterials geht davon auε, daß bestimmte Siebfraktionen von sinterbaren Materialien ge¬ sintert werden. Die nicht während des Sinterprozesεes im Sinterverband eingebundenen Partikel werden danach aus dem gesinterten Material entfernt.
Für die Standardisierung ist die Entfernung störender Partikel wünschenswert. Diese Entfernung führt zu Materialien, die standardisiert sind und nur noch geringe Streuungen der Beladungsmenge des Affinitätsmaterials, daε auf das Sorptionsmaterial geladen wird, aufweisen. Dies äußert sich z. B. in entsprechend geringen Streuungen der Meßsignale, die zur Auswertung bei Festphasenassays heran¬ gezogen werden. Dabei wird die Menge der zu den Affinitäts- materialien komplementären Komponenten gemessen, beispiels¬ weise als Analytkomponenten bei sonst einheitlichen Testbe- dingungen.
Im Falle anderer Sorptionsmaterialien, wie geschäumten Kunst¬ stoffen, insbesondere solchen in retikulierter Form, Hohl- fasern, verstreckten Folien, Komposit- oder Mehrschicht¬ materialien, keramischen Materialien, Zeolithen, Metallen, Metalloxiden, Legierungen, Glas oder Kohlenstoff werden auch entweder Verfahrensschritte zur Entfernung von unpassenden Partikelgrößen durchgeführt und/oder die Größe der Poren, insbesondere bei membranartigen Materialien, durch an sich bekannte Verfahrensparameter gesteuert. Ziel kann es sein, eine relativ enge Größenverteilung der Poren zu erreichen. Gegebenenfalls ist eine Nachbehandlung erforderlich, um den durch mechanische Behandlung der Materialien entstehenden Abrieb zu entfernen, der z. B. bei der Formschneidung für die Verwendung des Sorptionsmaterials entsteht. Dieser Abrieb wirkt sich störend auf das Sorptionsverhalten und damit verbundene Beladungswerte aus. Außerdem müssen auch alle anderen fremden Substanzen wie Lösungsmittel und Monomere zur Standardisierung aus dem Material entfernt werden, um eine standardisierte Beladung zu ermöglichen. Es kann vorteilhaft sein, zur Entfernung störender Partikel, die Durchströmungsrichtung der Waschflüssigkeit umzukehren, unterschiedliche Waschflüssigkeiten, insbesondere bezüglich Hydrophobie/Hydrophilie, in unterschiedlicher Folge einzuset¬ zen und eventuell Druck, Vakuum oder Ultraschall anzuwenden, insbesondere zur Entgasung.
Vorzugsweise wird das Affinitätsmaterial gelöst und im Durch¬ fluß vorzugsweise bei vertikaler Fließrichtung vorzugsweise unter der Wirkung der Schwerkraft über das zu beladende Sorp¬ tionsmaterial gegeben. Insbesondere hat es sich dabei be¬ währt, die Beladung in Beladungsgefäßen, wie beispielsweise zylindrischen Hohlkörpern durchzuführen. Dabei ist das Sorp¬ tionsmäterial im Lumen des Hohlkörpers angeordnet, und zwar möglichst in exakter Anpassung an die Wandungen. Dies kann zum einen dadurch geschehen, daß entsprechend geformte Form¬ körper aus Sorptionsmaterial angefertigt werden und in das Lumen des Hohlkörpers hinein verbracht werden. Eine weitere Alternative besteht darin, daß das Sorptionsmaterial zwischen zwei Fritten, die vorzugsweise keine Wechselwirkung mit dem Affinitätsmaterial und mit später durchfließenden, insbeson¬ dere zum Affinitätsmaterial komplementären Komponenten auf¬ weisen sollten, anzuordnen. Danach wird die Lösung mit Affi¬ nitätsmaterial in den Hohlkörper, der Einlaß- und Auslaßöff¬ nung aufweist, gegeben, so daß im Durchfluß beim Durchströmen der Lösung mit Affinitätsmaterial dieses an der Oberfläche deε Sorptionsmaterials unspezifisch adsorptiv gebunden wird.
In Anordnungen mit vertikalem Durchfluß unter Schwerkraft kann die ohnehin schon relativ schnell durchzuführende Be¬ ladungsmethode bei Sorptionsmaterialien mit langsamem Durch¬ fluß noch beschleunigt werden durch Anlegen eines Unterdrucks am Auslaß des zylindrischen Hohlkörpers oder Einwirkung eines Überdrucks am Einlaßende des zylindrischen Hohlkörpers. Dies wirkt sich gegebenenfalls auch vorteilhaft auf die Gleich¬ mäßigkeit der Beladung aus. Ebenso kann durch Einbau be¬ stimmter Einrichtungen, beispielsweise Fritten, oder Sog bzw. Gegendruck der Durchfluß durch den zylindrischen Hohlkörper verlangsamt werden, um bei entsprechenden Materialien den Durchfluß zu homogenisieren, insbesondere aber eine aus¬ reichende Beladung zu erreichen εowie bei höherer Beladung auch eine Verringerung der Schwankung der Beladung. Dieselben Maßnahmen können auch bei der nachfolgenden Affinitäts- reaktion zwiεchen der auf das Sorptionεmittel geladenen Affinitätskomponente und einer durchfließenden komplementären Komponente zur Anwendung kommen.
Das erfindungsgemäße Sorptionsmaterial dient als Grundlage für das erfindungsgemäße Trägermaterial. Das erfindungsgemäße Trägermaterial zur Durchführung eines Festphasenassays kann wie das Sorptionsmaterial ebenfalls in Form eines Formkör¬ pers, loser Schüttungen, eines Sorptionsmaterials in Partikelform, in Form eines Gels oder als Dispersion vor¬ liegen. Das Trägermaterial trägt mindestens eine Komponente zur Durchführung von Festphasenassays und ist ebenfalls für ein Fluidum durchlässig. Das Trägermaterial weist einen mittleren Porendurchmesser von 0,1 bis 100 μm auf, wobei wie beim Sorptionsmaterial gemäß der Erfindung hier als Pore bei entsprechenden Materialien der Zwischenraum zwischen partikelförmigen Teilchen verstanden wird und nicht die Porosität der Oberfläche des entsprechenden Partikels. Das Trägermaterial weist keine oder nur sehr geringe un¬ spezifische Sorptionsfähigkeit für Affinitätsmaterialien auf. Hingegen weist es eine hohe Affinität für bestimmte zu dem auf dem Sorptionsmaterial angeordneten Affinitätsmaterial komplementäre Komponenten auf.
Eε iεt möglich, daß erεt diese ersten komplementären Kompo¬ nenten die assayspezifischen Komponenten sind, die beispiels¬ weise einen Analyten spezifisch binden. Das kann dann vor¬ teilhaft sein, wenn die Komponenten nur schlecht unspezifisch adsorbierbar sind und vorteilhafterweise mittels einer ersten, gut unspezifisch adsorbierbaren anderen, komplemen¬ tären Komponente spezifisch am oder im Trägermaterial gebun- den werden. Es kann auch von Vorteil sein, wenn das Trager¬ material mindestens eine leicht zugängliche, preiswerte, stabile und/oder gut haltbare erste Komponente trägt, die erst später, z.B. bei der Assayvorbereitung oder kurz vor der Assaydurchführung eine kostbarere, instabilere, weniger haltbare und/oder hochspezifische Assay-Komponente bindet. In diesem Falle ist das erfindungsgemäße Trägermaterial quasi als mindestens zweistufiges Trägermaterial auffaßbar, nämlich in der ersten Stufe als ein Trägermaterial mit der erεten, primären unspezifisch adsorbierten Affinitätskomponente und weiterhin als eine mindestens zweite Stufe, bei der eine zweite, sekundäre, zu der ersten Affinitätskomponente komple¬ mentäre Affinitätskomponente gebunden ist. Die zweite, sekundäre Affinitätskomponente stellt dabei die eigentliche, aktuell im Assay einzusetzende Affinitätskomponente dar.
Das Trägermaterial gemäß der Erfindung ist standardisiert durch die Maßgabe, daß die auf einem bestimmten Einheits- volumen des Trägermaterials befindliche Komponente zur Durchführung von Festphasenassays (Affinitätsmaterial) ihre komplementäre Komponente, bei einmaligem homogenen Durchfluß einer bestimmten Menge einer bestimmten Lösung dieser komplementären Komponente in einer bestimmten Konzentration dieser komplementären Komponente, spezifisch in einer solchen Menge bindet, daß diese zwischen mehreren statistisch rele¬ vanten Beladungsvorgängen um einen mittleren Beladungswert um höchstens ± 40% schwankt. Die Schwankung beträgt ins¬ beεondere nicht mehr als ± 30%, vorzugsweise +. 20% und insbeεondere bevorzugt nicht mehr als +.10%. Die gebundene Menge bleibt auch bei mehreren anschließenden Durchströmungs- vorgängen geeigneter anderer Flüssigkeiten an dem Träger¬ material in dem genannten Bereich konstant. Nicht geeignet sind wiederum eluierende Flüssigkeiten.
Als weitere Durchströmungsvorgänge kommen insbesondere Blockierungsschritte spezifischer oder unspezifischer Adsorptionsstellen, insbesondere Waschungen des mit der Komponente zur Durchführung von Feεtphaεenassayε beladenen Trägermaterials, weitere Affinitätsbindungsschritte zur Markierung, und/oder Verstärkung oder zur Bindung der eigentlichen Assay-Komponente(n) etc. in Betracht.
Das erfindungsgemäße Trägermaterial ist vorteilhaft, da es relativ einfach ohne großen Zeit- und apparativen Aufwand uns insbesondere auch leicht beim Anwender selbst hergestellt werden kann, aus leicht zur Verfügung zu stellenden Kom¬ ponenten, nämlich zum einen einem Sorptionsmittel, insbe¬ sondere einem erfindungsgemäßen Sorptionsmittel, sowie dem oder den Affinitätsmaterialien, die zur Durchführung eines Festphasenasεayε benötigt werden sowie einem Durchflußgefäß. Darüber hinaus können auch Pufferlösungen mit angeboten werden, die zur Beladung des Sorptionsmaterialε und Durch¬ führung deε Assayε verwendet werden können. Daε erfindungε- gemäße Trägermaterial ist erhältlich durch Beladen des erfindungsgemäßen Sorptionsmaterials im einmaligen Durchfluß einer bestimmten Menge von mindestens einer Lösung mit einer bestimmten Konzentration mindestens einer Komponente zur Durchführung von Festphasenassays. Weiterhin ist bevorzugt, daß das Trägermaterial mindeεtenε eine Komponente für die Durchführung von Feεtphaεenaεεayε deutlich unter der maxi¬ malen Sorptionskapazität des Sorptionsmaterialε trägt und freie unspezifische Sorptionsstellen des Sorptionsmaterials blockiert εind. Das erfindungsgemäße Trägermaterial kann auch durch einen spezifischen Bindungsschritt in ein anderes erfindungsgemäßes Trägermaterial umgewandelt werden.
Daε erfindungsgemäße Trägermaterial trägt insbesondere ein Affinitätsmaterial aus Molekülen, Molekülgruppen oder Teilchen mit affinen Eigenschaften zu anderen Substanzen. Das Affinitätsmaterial ist insbeεondere ausgewählt aus der Gruppe der Enzyme, mit Enzymen in Wechselwirkung tretenden Substraten, Antikörpern, Antigenen, wie hochmolekularen Substanzen oder Pollen oder anderen Allergenen, Haptenen, Biotin oder Streptavidin, Nucleinεäuren vom RNA- oder DNA- Typ, insbesondere solche, die hybridisierbar mit anderen Nucleinsäuren sind, Rezeptor oder Liganden eines Rezeptors, Viren, Bakterien, Zellen, Zellorganellen, Blutkörperchen, Teilchen, wie kolloidalen Teilchen von Metallen, Metall- oxiden, Polymeren oder Kombinationen der genannten Affini¬ tätsmaterialien. Das erfindungsgemäße Trägermaterial kann aus dem erfindungsgemäßen Sorptionsmaterial auch dadurch hergestellt werden, daß der oder die Analyten mit dem Sorptionsmaterial in Kontakt gebracht werden, ohne daß eine vorherige Modifikation mit nicht spezifischem Material erfolgt. Der oder die Analyte dienen dann im nächsten spezifischen Adsorptionsschritt, z. B. einem Nachweisschritt, als spezifische Bindungsparameter für komplementäre Partner, z. B. in Nachweislösungen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist vorzugsweise ein Hohl¬ körper, in dessen Lumen eines oder mehrere der erfindungε¬ gemäßen Sorptionsmaterialien und/oder Trägermaterialien angeordnet ist. Sind ein oder mehrere Trägermaterialien mit unterschiedlichen Komponenten für Festphaεenassays in der erfindungsgemäßen Vorrichtung angeordnet, so erfolgt dies in der Weise, daß ein homogenes Durchströmen des Hohlkörpers, insbesondere der Bereiche mit Trägermaterial, gewährleistet ist. Es sollen also insbesondere keine Randeffekte auftreten oder andere Bereiche gebildet werden, in denen der Durchfluß schneller oder langsamer ist, als an anderen Stellen. Diese Eigenschaft ist im wesentlichen durch die Standardisierung des Trägermaterials bestimmt. Außerdem ist ein exaktes Einpassen des Sorptions- bzw. Trägermaterialε mit möglichst exakter geometrischer Form (z.B. Zylinder mit Querschnitt entsprechend dem Querschnitt des Durchflußgefäßes bei zylin¬ drischen Durchflußgefäßen, z.B. Quader mit entsprechendem Querschnitt bei Durchflußgefäßen mit rechteckigem Quer¬ schnitt) erfindungεgemäß wichtig. Die Sorptions- und/oder Trägermaterialien können in Form loser Schüttungen oder Gele mittels im Lumen des Hohlkörperε angeordneten Einrichtungen fixiert sein. Diese Einrichtungen weiεen vorzugεweise ein homogenes Durchströmverhalten für ein Fluidum, inεbesondere Lösungen mit Analyten auf, desweiteren haben die Einrichtun¬ gen insbesondere ein nur geringes eigenes oder vorzugsweise kein unspezifisches Sorptionsvermögen für Affinitätsmateria¬ lien.
Ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Träger¬ materials geht davon aus, daß das erfindungsgemäße Sorptions¬ material mit einem oder mehreren Affinitätsmaterialien jeweils im wesentlichen in Lösung mit bestimmter Konzen¬ tration in einer bestimmten Flüssigkeitsmenge behandelt wird. Dies kann zum einen im Batch-Verfahren erfolgen, andererseits und bevorzugt jedoch im homogenen Durchfluß in einem Hohl¬ körper mit Ein- und Auslaßöffnung, in dem das Sorptions- material angeordnet ist. Letztere Vorgehensweise hat den Vorteil, daß in sehr kurzer Zeit und ohne apparativen Aufwand ein standardisiertes Trägermaterial mit im Verhältniε' zur eingesetzten Konzentration hoher, gleichmäßiger Beladung erhalten wird. Eine vergleichbare Beladung im Batch-Verfahren dauert sehr lange, da zunächst nur äußere Bereiche des Sorptionsmittels beladen werden im Unterschied zum Durchflu߬ verfahren, bei dem das gesamte Material, d. h. auch die innere Oberfläche, schnell mit dem Affinitätsmaterial in Berührung kommt. Außerdem ermöglicht letztere Vorgehensweiεe, daß die Herstellung des Trägermaterials in einfacher Weise beim Anwender direkt erfolgen kann. Ist dies jedoch nicht erwünscht, kann das entsprechende Trägermaterial auch in größeren Ansätzen hergestellt werden und dann in Vor¬ richtungen zur Durchführung von Feεtphaεenassays verbracht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens zur Herstellung des erfindungsgemäßen Träger¬ materials sind freie Sorptionsstellen des Trägermaterials mit entsprechenden Substanzen, die sich im durchzuführenden Festphasenaεsay inert verhalten, blockiert. Gegebenenfallε wird das Trägermaterial ein oder mehrmals gewaschen. Ein Verfahren zur Herεtellung einer Vorrichtung zur Durch¬ führung eines Assays zur Bestimmung mehrerer Analyse- parameter, in der im Lumen eines Hohlkörpers mindeεtenε ein erfindungsgemäßes Sorptionsmaterial angeordnet ist, wird ebenfalls beschrieben und beansprucht. Dabei ist jeweils eine in dem Hohlkörper angeordnete Schicht im Durchfluß beladen worden. Freie unspezifische Adsorptionsstellen sind blockiert worden, woraufhin sich der Aufbau der nächsten Schicht in analoger Weise anschließt. Es ist ebenfalls möglich, ver¬ schiedene, beladene Trägermaterialien vorab herzustellen und dann entsprechend in Form einer Schichtenlage in der Assay- vorrichtung anzuordnen.
Der Festphasenassay gemäß der Erfindung unter Verwendung deε erfindungsgemäßen Sorptionsmaterials und/oder des erfindungs- gemäßen Trägermaterials wird durchgeführt, indem das Sorptionsmaterial mit einer im Festphasenassay zu ver¬ wendenden Komponente behandelt wird, diese Komponente im Sorptionsmaterial haftet und danach der Festphasenassay in an sich bekannter Weise durchgeführt wird. Als Alternative kann der Festphasenassay an einem in einer Vorstufe vor¬ behandelten Sorptionsmaterial durchgeführt werden, insbe¬ sondere an einem mit einem Affinitätsmaterial beladenen Trägermaterial. Mit den insbesondere bevorzugten Affinitäts- säulen durchzuführende Festphasenassays sind bereits in allgemeiner Form in DE 41 26 436 AI, 42 08 732 AI oder DE 195 00 862 AI beschrieben. In der DE 195 00 862 AI ist als ein Vorteil dieser bevorzugten Affinitätssäulen beschrie¬ ben, daß sich in ihnen auch Vorreaktionen von Probelösungen in Zonen oberhalb der Festphasenassay-Zone(n) durchführen lassen wie Reinigung, Abfangen störender Komponenten oder Reaktionen, die z.B. den Analyten erst für die Affinitäts- reaktion zugänglich machen. Dieser Vorteil kann auch im Zusammenhang mit Festphasenassays mit dem erfindungsgemäßen Sorptions- und/oder Trägermaterial genutzt werden. Der erfindungsgemäße Festphaεenaεεay ist für die qualitative und insbesondere bei in engeren Bereichen standardisiertem Sorptions- und Trägermaterial, für die quantitative Analyse geeignet, wenn die Analyse mit einer vorherbestimmten Menge Analytlosung durchgeführt wird. Werden die Volumina der zu analysierenden Lösungen im Festphasenassay konstant gehalten, werden eventuelle Volumenabhängigkeiten im Binden der festen Phase eliminiert.
Der Festphasenassay im Sinne der Erfindung zeichnet sich durch eine Optimierung der Parameter Beladungsverhalten, Porengröße, Durchflußzeit und Menge des Sorptionsmittels, eventuelle zusätzliche Mittel zur Strömungεkorrektur (Fritten, Druck) , Menge des Affinitätsmaterials, Probenmenge der Analytlosung und Eigenschaften des Markers, insbesondere Verstärkung und Durchflußverhalten, aus.
Der Festphasenaεεay ist aufgrund der verwendeten erfindungs¬ gemaßen Sorptions- oder Trägermaterialien temperaturunab¬ hängig standardisiert. Der Festphaεenaεsay wird vorzugsweise als Affinitätsassay, insbesondere als Immunaffinitätsassay, ausgeführt.
Das erfindungsgemäße Sorptionsmaterial ermöglicht besonders einfache Testkonfigurationen, die es jedem Anwender oder Assayentwickler erlauben, eigene Assays, insbesondere Affinitätsassayε, wie Immunoaffinitätsaεεayε, herzustellen oder zu entwickeln. Dazu bedarf eε im Grunde nur einer Vor¬ richtung zur Einrichtung und/oder Durchführung eineε Affinitätsassayε mit folgenden Merkmalen:
Vorrichtung mit einer Einrichtung, die es ermöglicht, mit dem erfindungsgemäßen Sorptionsmaterial gefüllte Röhrchen zu fassen, diese Röhrchen zu beladen, so daß sich das in Röhrchen angeordnete erfindungsgemäße Trägermaterial ergibt, weitere oder dieselbe Einrichtung, um das so her¬ gestellte Röhrchen mit erfindungsgemäßem Trägermaterial mit einer Probe zu beladen;
weitere Bindungsreaktionen zum Nachweis und/oder für verstärkte Sensitivität erfolgen;
die Probe gegebenenfalls nach Waschungen dann mit einem Elutionsmittel behandelt wird, so daß sich an dem erfindungsgemäßen Trägermaterial befindliches, spezifisch gebundenes Material ablöst und/oder der verwendete Marker herausgelöst wird, .wobei das Eluat,
dann in einer Einrichtung aufgefangen wird, die es ermöglicht, spezifische Parameter der eluierten Probe beispielweise Fluoreszenz oder optische Dichte zu messen
oder alternativ eine Messung im Gefäß ohne Elution erfolgt, wofür sich vorzugsweise rechteckige Durchflu߬ gefäßquerschnitte eignen, um die Messung durch planare Gefäßwände durchzuführen.
oder alternativ eine Messung spezifischer Parameter in einer Flüssigkeit nach deren Durchlauf erfolgt.
Erfindungsgemäß wird mithin auch eine Vorrichtung bean¬ sprucht, die eine Einrichtung und/oder Durchführung eines erfindungsgemaßen Äffinitätsassays ermöglicht. Insbesondere vorteilhaft an der Vorrichtung ist, daß dieεe beim Anwender zu einer erleichterten Einrichtung von automatisierbaren Asεayε führen kann. Die Vorrichtung weist eine Vorrichtung zur Ergreifung von mindestens einem mit dem erfindungsgemäßen Sorptionsmaterial mindestens teilweise befüllten oder befüll- baren Hohlkörper, insbesondere in Form eines Röhrchenε, auf. Desweiteren ist eine Vorrichtung vorgesehen zur Beladung des in dem Röhrchen befindlichen oder in das Röhrchen gefüllten Sorptionsmaterials mit Komponenten zur Durchführung von Festphasenasεays, unter Erhalt des erfindungsgemäß be¬ schriebenen Trägermaterials. Es kann auch eine Vorrichtung vorgesehen εein mit mindeεtens einem Hohlkörper, der mit dem Trägermaterial gemäß der Erfindung befüllt wird. Die er¬ findungsgemäße Vorrichtung weist in einer bevorzugten Aus- führungsform eine Einrichtung zur Behandlung des mindestens einen mindestens teilweise befüllten Röhrchens mit Lösungen zum Waschen, Binden oder Eluieren von Komponenten deε Feεt¬ phaεenassayε oder des Analyten auf. Es kann vorteilhaft sein, die erfindungsgemäße Vorrichtung mit Einheiten zur Detektion von Festphasenaεεaykomponenten oder Analyten zu koppeln.
Vorzugsweise werden die Einrichtungen der Vorrichtung an an sich bekannte Mikrotitrationsformate angepaßt. Es ist dann in vorteilhafter Weise möglich, die in der biochemischen Analytik"und Diagnostik eingesetzten Geräte, die üblicher¬ weise auf das Mikrotitrationsformat abgestellt sind, zu adaptieren und zu benutzen. Für die Messung im Durchflußgefäß lassen sich die erfindungsgemäßen Einrichtungen, insbesondere solche mit mehreren Trägerbetten, auch an entsprechende Meßgeräte (Lesegeräte) anpasεen. Die Standardisierung und die unspezifiεche Beladung deε Sorptionsmittels oder die spezifische Beladung eines Trägermaterials, das eine primäre, noch nicht assayspezifische Affinitätskomponente trägt, direkt beim Test mit der dafür verwendeten Affinitäts- komponente, erlauben eine probenorientierte Abarbeitung im manuellen oder automatisierten Testverfahren, was vorteilhaft gegenüber der herkömmlichen testorientierten Abarbeitung eines Assayε ist.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist insbesondere eine kleine oben und unten offene Säule zum Einmalgebrauch, die eine aktivierte Festphasenmatrix zur Bindung von Proteinen ent¬ hält . Durch die erfindungsgemäße Vorrichtung mit den er¬ findungsgemäßen Sorptionsmaterialien und Trägermaterialien werden die Vorteile eines Immunoassays (Sensitivität, Selektivität) und die Vorteile der Affinitätschromatographie (hohe Oberflächen- und Bindungεkapazität, Reagenziendurch¬ fluß) in einem immunologischen Testεystem vereinigt. Die aktivierte Festkörpermatrix adsorbiert über hydrophobe Wechselwirkung beim Durchfluß den primären immunologischen Reaktionspartner. Nach anschließender Blockierung der freien Bindungsstellen ist eine sofortige Verwendung des Testεystemε oder eine Zwischenlagerung, je nach der Stabilität des immunologischen Reaktionspartners, möglich. Vorteilhaft ist die erfindungsgemäße Vorrichtung insbesondere, weil für die Präparation nur etwa 10 min benötigt werden und die Prä¬ paration und die anschließende Testdurchführung auch direkt hintereinander von Hand oder in einem Automaten erfolgen können. Das hat den Vorteil, daß probenorientiert gearbeitet werden kann, d. h. noch nicht spezifizierte erfindungsgemäße Vorrichtungen erst direkt vor dem Test oder den Teεts ohne Zeitverlust entsprechend spezifiziert- werden können. Die Abarbeitung des Testsystems erfolgt entsprechend dem Aufbau des Immunoassays. So sind Sandwich-Assays εowie kompetitive Assays durchführbar, ebenso wie die vorhergehende Präparation der Festphase im selbständigen Durchfluß der Reagenzien. Auch der eigentliche Assay ist somit in etwa 10 min durchführbar. Wie ausgeführt, kann die erfindungsgemäße Vorrichtung in automatiεierten Arbeitεstationen imMikrotiterplattenformat abgearbeitet und insbesondere im Mikrotiterplattenreader bei 510 nm, gegebenenfalls auch bei 492 nm, ausgewertet werden. Für den kompletten Ablauf bestehend aus Beschichten, Testbe¬ arbeitung und Auswertung sind nicht mehr als 30 min erforder¬ lich, eher weniger, etwa im Bereich von 20 bis 25 min. Nach der Entlüftung der Sorptionsmaterialien und Beladung der entlüfteten Sorptionsmaterialien schließt sich die eigent¬ liche Testdurchführung an, die in Probenaufgabe, Zugabe von Sekundärreagenzien, Zugabe der Markierungssubstanz, gege¬ benenfalls Waschεchritten und dem Elutionεεchritt aufgebaut iεt. An den Elutionsschritt schließt sich direkt die Aus¬ wertung an. Neben der Abarbeitung von Routine-Assayε kann jedoch das erfindungsgemäße Sorptionsmaterial im Zusammenwirken mit der erfindungsgemäßen Einrichtung und einer automatisierten Einrichtung in besonders vorteilhafter Weise zur Entwicklung von Assays eingesetzt werden. Dabei wird die erfindungsgemäße Vorrichtung, in der das erfindungsgemäße Sorptionsmaterial angeordnet ist, zur Äquilibrierung und spezifischem Coating mit einem Kopplungspuffer mit Antigenen und/oder Antikörpern behandelt. Das Coating erfolgt dabei mit vorzugsweise 750 μl Kopplungspuffer. Als Kopplungspuffer eignet sich insbesondere ein Natriumhydrogencarbonatpuffer. Je nach Beschaffenheit des Antigens oder Antikörpers können sich Variationen bei Salzgehalt und pH-Wert des Kopplungspuffers ergeben. Es.ist bereits hinreichend, Mengen von 0,2 bis 10 μg Antigen oder Antikörper auf das erfindungsgemäße Sorptionsmaterial pro erfindungsgemäßer Vorrichtung aufzubringen. Für niedrige Beladungen ist ein rechteckiger Querschnitt des Durchlfußge- fäßes im Bereich des Trägerbettes von beispielsweise 5 mm x 1,6 mm bei einer Höhe von 5 mm pro Trägerbett wegen der kleinen Querschnittsfläche vorteilhaft, der sich für ver¬ tikalen und horizontalen Durchfluß eignet. Der in Durchflu߬ richtung davor liegende Teil des Durchflußgefäßes kann einen anderen, insbeεondere größeren Querschnitt haben, um größere Auftragsvolumina zu erlauben. Eine Blockierung der noch freien unspezifischen Bindungsstellen erfolgt mit immunolo¬ gisch inertem Protein in Puffer. Zur Blockierung hat sich insbesondere PBS mit einem Anteil nichtionischen Tensidε alε vorteilhaft erwiesen. Dem Assayentwickler bleibt dann noch übrig, die Probenverdünnung für den zu entwickelnden Assay in einfachen Experimenten zu ermitteln und einmalig eine Eichkurve zu erstellen. Diese im Prinzip hinreichende ein¬ malige Eichkurve (bzw. die einmalige Festlegung des Cut off- Bereicheε für qualitative Ja/Nein-Tests) wird vorzugsweise durch Mitführen einer Vergleichεprobe im oberen Konzentra¬ tionsbereich (deutliche Positivprobe) zur Überprüfung und/ oder zum Ausgleich von Schwankungen zwischen verschiedenen Meßgeräten ergänzt, bei Ja/Nein-Testε wie im Beiεpiel 7 auch durch eine Negativprobe. So haben sich für infektionsserolo¬ gische Testε Probenverdünnungen im Bereich von 1 : 301 biε 1 : 1.001 als vorteilhaft erwiesen. Aufgrund der Größe der erfindungsgemäßen Vorrichtungen beträgt dabei ein geeignetes Probevolumen 250 μl. Alε Sekundärantikörper bzw. Antigenkon- jugate kommen insbesondere biotinylierte Reagenzien mit einem Biotinylierungsgrad von Protein : Biotin von etwa 1 : 4 in Betracht. Die Biotinylierung unterschiedlicher Sekundärreak- tionεpartner erlaubt die Verwendung eineε einheitlichen Marker-Streptavidin-Konjugateε. Für beεtimmte Tests sollten der Biotinylierungsgrad und die Konzentration des eingesetz¬ ten Sekundärreagenzes aufeinander abgestimmt werden. Erfah¬ rungsgemäß liegt die Konzentration der von der Anmelderin zur Verfügung gestellten Konjugate zwischen 3 und 15 μg/ml. Das Volumen, in dem der Sekundärantikörper in die erfindungs¬ gemäße Vorrichtung gebracht wird, liegt vorzugsweise bei 250 μl.
Als beεonderε vorteilhaft hat sich als Farbmarker das unter der Bezeichnung Abion Red vertriebene Farbkonjugat erwiesen. Abion Red ist ein auch für den Einsatz mit den erfindungε¬ gemäßen Vorrichtungen entwickelteε Farbεtoffpartikelkonjugat. Eε iεt insbesondere kovalent vernetzt und extrem empfindlich (ca. 3 Größenordnungen empfindlicher als kolloidales Gold) . Ist das Farbstoffkonjugat mit Streptavidin versehen, koppelt Abion Red an biotinylierte Reagenzien. Abion Red iεt Gegen- εtand der deutschen Patentanmeldung 19543 556.7. Das Farb¬ stoffkonjugat kann mit 300 μl Ethanol nach erfolgter Reaktion in eine Mikrotiterplatte eluiert werden und anschließend in konventionellen Photometern bei 510 nm oder 492 nm quanti¬ tativ vermessen werden. ABION RED ist besonders auch für die Mesεung im Durchflußgefäß ohne Elution geeignet, da es eine optische quantitative Bestimmung ohne zusätzliche Farbreak¬ tion erlaubt. Die erfindungsgemäßen Trägermaterialien weisen den Vorteil auf, daß damit durchgeführte Bindungsreaktionen keine Abhängigkeit von Inkubationszeiten oder Temperaturen (zwiεchen 15 und 35°C) zeigen. Daher können nach Ablauf eineε Bearbeitungεεchrittes die nächsten Schritte εofort folgen. Sofern hochεpezifiεche Reagenzien jedoch kinetiεche Effekte in einem Bereich von 0 biε 6 min zeigen, empfiehlt sich, bei der Entwicklung eines Tests, den Einfluß der Reaktionskinetik zu beεtimmen.
Für die Durchführung der Assayε mit den erfindungεgemäßen Vorrichtungen steht daε oben bereits skizzierte System in Form eines Automaten zur Verfügung, das sowohl für die Testentwicklung als auch für die Testbearbeitung, beispiels¬ weise bei einem analytischen Labor, eingesetzt werden kann. Der Durchsatz des Automaten liegt bei ca. 100 der erfindungs¬ gemäßen Vorrichtungen pro Stunde. Der Vorteil des erfindungs- gemäß zur Verfügung gestellten Testsystems besteht darin, daß eine probenorientierte Abarbeitung erfolgen kann und man weitestgehend unabhängig ist von den bislang in Routinever¬ fahren durchgeführten testorientierten Abarbeitungen. Es ist mithin möglich, für eine durchzuführende Analyse nacheinander die entsprechenden Tests abzuarbeiten und die Probe ganzheit- lich zu erfassen und nicht wie bei konventioneller Analytik daran gebunden zu sein, ein ganzheitliches Testergebnis erst dann zu erhalten, wenn die jeweiligen Tests an den be¬ teiligten Automaten abgearbeitet werden. Wartezeiten bis zum Erreichen einer hinreichenden Zahl von Proben für einen bestimmten Test entfallen somit.
Der Automat kann folgende testübergreifende genannte Reagen¬ zien verwenden, nämlich Puffer- und Systemflüssigkeiten, wie PBS mit niedriger Tensid- wie auch hoher Tensidkonzentration, Wasser, Ethanol und Kopplungspuffer. Als Reagenzien werden bereitgehalten Farbmarkerkonzentrat, Blockierungsreagenz, BSA, Anti-human-IgG, Anti-human-IgM, Anti-human-IgA, vor¬ zugsweise biotinyliert, sowie die erfindungsgemäßen Vorrich¬ tungen, in denen das Sorptionsmaterial unbeεchichtet ange¬ ordnet ist. Der Automat selbst stellt als Einrichtungen Mikrotiterplatten, Probenhalter mit Barcodelaser für Primär- und Sekundärprobenröhrchen, Mikrotiterplatten-Photometer mit den jeweils notwendigen Filtern sowie eine Datenverarbei¬ tungsanlage mit entsprechender Software zur Verfügung. Dieser Automat arbeitet dann, wie weiter oben beschrieben, die ebenfalls oben erwähnten Arbeitsschritte ab. Statt Mikroti¬ terplatten und Mikrotiterplatten-Photometer enthält der Automat bei Auswertung im Durchflußgefäß ein entsprechendes Lesegerät.
Somit wird durch das erfindungsgemäße Sorptionsmaterial mit dem beschichteten Trägermaterial und den entsprechenden Herstellungsverfahren des Trägermaterials in Verbindung mit der automatisierbaren Vorrichtung zur Einrichtung und Durch¬ führung eines Äffinitätε-Assays ein völlig neuartiges Konzept zur Verfügung gestellt, um Jedermann ohne komplizierte und teure Maschinenkonfigurationen, das Design von Affinitäts- Aεsays zu ermöglichen.
Erfindungsgemäß beansprucht werden auch Zusammenstellungen in Kitform enthaltend Trägermaterial oder Sorptionsmaterial gemäß der Erfindung, zylindrische Hohlkörper mit Einlaß- und Auslaßöffnung, wobei Trägermaterial oder Sorptionsmaterial vorzugsweise schon in den Hohlkörpern angeordnet sind, wäßrige Lösungen zur Beladung deε erfindungsgemäßen Sorptionsmaterialε, die bereits Affinitätsmaterial gelöst enthalten, oder gesondert von dem Affinitätsmaterial in lagerfähiger Form sowie gegebenenfalls nicht wäßrige Lösungen zur Beladung des erfindungsgemäßen Sorptionsmaterials, die entweder bereits Affinitätsmaterial gelöst enthalten oder das Affinitätsmaterial in der Zusammenstellung gesondert in lagerfähiger Form enthalten sowie gegebenenfalls wäßrigen Lösungen zur Durchführung eines Festphasenassayε nebst gegebenenfalls weiteren Hilfεreagenzien oder Vorrichtungen zur Durchführung von Festphasenassays.
Ein Kit in einer typischen Ausgestaltung enthält etwa 200 Säulen für Immunoassaytestentwicklungen. Darin enthalten sind weiterhin Waschpuffer, Blockierungsreagenz, Elutionsmittel, ein hochsensitiver Partikel-Suspenεoidfarbstoff, Hilfsmittel mit einer Mikrotiterplatte, einem Einhängerahmen für 96 erfindungsgemäße Vorrichtungen im Mikrotiterformat, Plexi¬ glasrahmen, Abfallwanne, testspezifische Reagenzien für 24 Assays inklusive Standardserum, sowie weitere Hilfsmittel, wie Beschreibungen etc. Die Kits sind ungeöffnet regelmäßig längere Zeit, durchaus bis zu 2 Jahren, haltbar.
Das erfindungsgemäße Sorptionsmaterial bzw. Trägermaterial kann auch in Form der erfindungsgemäßen Vorrichtungen zur routinemäßigen Überprüfung von Proben eingesetzt werden, die möglicherweise mit Viren oder Bakterien belastet sind. So können beiεpielεweiεe Blutprodukte in Blutbanken unterεucht werden auf HIV, Hepatitiε, Syphilis, etc. Dabei werden andere infektiöse Bestandteile, wie beispielsweise Hepatitis B core Antigen und CMV bislang nicht getestet. Da auch diese gesundheitlich nicht unbedenklich sind, ist es wünschenswert, auch auf diese Keime zu testen. Aus Wirtεchaftlichkeitsüber- legungen wird dieε jedoch biεlang nicht getan. Die er¬ findungsgemäßen Gegenstände formen aber die Basis für Tests, die bei hoher Sensibilität es auch erlauben, mehrere Spender- εeren im Falle von Blutprodukten, im Pool zu testen. Die mit den erfindungsgemaßen Gegenständen durchführbaren Asεayε sind in der Lage, auch einen Pool von mehreren Seren, beispiels¬ weise bis zu 10 Seren, auf die Präsenz eines bestimmten Anti¬ körpers mit der gleichen Sensitivitat wie ein entsprechender Einzelteεt zu unterεuchen. Dabei wird vorzugsweise ein sogenannter Sandwich-Assay eingesetzt, wobei eine An¬ reicherung der Probe im Durchfluß durch die erfindungsgemäßen Sorptionsmaterialien erreicht werden kann. Der Test eignet sich für Antigene, bei denen ein positiver Befund relativ selten zu erwarten ist und darüber hinaus auch überall dort, wo eine große Anzahl von Seren untersucht werden muß. Dadurch wird es ermöglicht, die Virussicherheit von Blutpräparaten in Blutbanken mit einem wirtschaftlich vertretbaren Aufwand deutlich zu erhöhen. Auch eine automatisierte Blutgruppen¬ bestimmung (automatischer Coombs-Test) kann erfindungsgemäß erreicht werden. Bei jeder Blutspende und bei Verabreichung einer Blutspende muß eine Blutgruppenbestimmung durchgeführt werden. Diese Untersuchung ist international gesetzlich vorgeschrieben. Die vorhandenen Untersuchungsmethoden sind zwar zuverlässig, jedoch durch einen Zentrifugationsschritt im Assay relativ zeitaufwendig und nicht automatisierbar. Die erfindungsgemäßen Sorptionsmaterialien bzw. Träger¬ materialien ermöglichen die schnelle und automatische Blut- gruppenteεtung, insbesondere für Blutbanken und Kliniken. Diese Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens ist erweiter¬ bar auf die Differenzierung von speziellen Antikörpern gegen Blutgruppenantigene.
Auch kann beispielsweise serologisch das Heliobacter pylori Bakterium zur therapiebegleitenden Diagnostik bei Magen¬ geschwüren getestet werden.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert:
Beispiel 1
Bestimmung der Diphtherie-Antikörperkonzentrationen in Serum und einmaliges Erstellen einer Kalibrierungskurve
Materialien:
Runde Fritte aus Polyethylen, 5 mm Durchmesser, 5 mm Höhe, formgenau für den Querschnitt eines Durchflußgefäßes, ge¬ stanzt aus Filterplatten, die durch Sintern aus Polyethylen- pulver mit enger Korngrößenverteilung durch Aussieben herge¬ stellt wurden (Korngröße unter 250 μm) ; Nenn-Porengröße 50 μm (Bubble Point) ,
Porengrößenverteilung mit Coulter Porometer von 5,492 bis 138,6 μm, mittlere Porengröße 13,64 μm, 1,063% der Porenzahl über 27,5 μm, 15,45% über 15,92 μm (Abion GmbH, Jülich, Deutschland) ,- 28448 PC 17EP97/00405
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runde im unteren Teil konisch verlaufende, leere Durchflußge¬ fäße gemäß DE 41 26 436 AI, Durchmesser 5 mm, Fassungsver¬ mögen für Probenlösungen über eine am oberen Ende deε konischen Teils angesetzte, 5 mm hohe Fritte, ca. 0,8 ml (Firma Abion GmbH, Jülich, Deutschland) ;
Diphtherie-Toxoid von SVM, NL-3723 BG Bilthoven, Niederlande,- Biotinylierter anti-human-IgG-Antikörper (Fa. Sigma, München, Nr. B-1140) ;
Abion RED-Streptavidin-Konjugat, Fa. Abion GmbH, Jülich; Diphtherie-Positivserum mit 1,7 IU/ml (IU = International Units) und Diphtherie-Negativserum (Abion GmbH, Jülich) ; Ethanol abs. 95 Vol.-%;
Kopplungspuffer 0,1 M Natriumhydrogencarbonat/Natrium- carbonat, pH 9,2;
Blockierungspuffer: 0,1 M Natriumphoεphat, 0,1 M Natrium¬ chlorid, 1% BSA (Rinderserumalbumin) , 0,005% Tween 20, pH 7,2;
Waεch- und Verdünnungspuffer, wie Blockierungspuffer ohne BSA.
Durchführung:
Die Fritten werden einzeln, im wesentlichen unverbogen und exakt senkrecht zur Durchflußrichtung, am oberen Rand des konischen Teils der Durchflußgefäße in selbige eingesetzt. In den Fritten vom Herstellungεprozeß enthaltene, die Standardiεierung εtörende, loεe Partikel, inεbeεondere ungebundene Polyethylenpulver-Teilchen, Abrieb und Staub wurden durch intensives Waschen entfernt . Eε wurde mindestens zweimal mit 750 μl Ethanol sowie mit 750 μl bidestilliertem Wasser gewaschen. Falls Entlüftung der Fritte erforderlich war, wurde das Waschen unter leichtem Druck durchgeführt. Zur Verbesεerung der Waεchwirkung und/oder der Entlüftung konnte außerdem die Fließrichtung bei einzelnen Waεch- schritten umgekehrt werden. Eine Kontrolle nach der Her¬ stellung der entsprechenden Frittenchargen wird empfohlen und erfolgt über die Einheitlichkeit des mit einer Probe- lösung erhaltenen Meßsignals im nachfolgenden Affinitäts- asεay. Abεchließend wurden die Fritten mit je 750 μl Kopplungspuffer gewaschen.
Antigen-Kopplung:
Die Diphtherie-Toxoid-Lösung wurde in einem Kopplungspuffer auf eine Endkonzentration von 5 μg/ml verdünnt. Je 750 μl dieser Lösung mit absoluter Menge von 3,75 μg Toxoid wurden auf jedes Durchflußgefäß mit eingesetzter Fritte gegeben. Im freien Durchfluß unter Schwerkraft (Durchlaufzeit ca. 6 min) adsorbierten die Fritten unspezifisch im wesentlichen einheitliche Toxoidmengen, was insbesondere durch die nach¬ folgend gemessene einheitliche Bindung des komplementären Human-anti-Diphtherie-IgG bei einer konstanten Konzentration erkennbar wurde. Ohne intensives Auswaschen der freien Partikel in der Fritte konnte kein brauchbares Signal erzielt werden. Danach wurden die gegebenenfalls noch vorhandenen unspezifischen Adsorptionsstellen der Fritten mit je 750 μl Blockierungspuffer belegt und mit 750 μl Waschpuffer ge¬ waschen. Im folgenden werden die so hergestellten Gefäße Testgefäße genannt.
Das Diphtherie-Serum wird mit Waεchpuffer auf die Kon¬ zentrationen 10, 7,5, 5, 2,5, 0,75, 0,5, 0, 25 und 0, 1 mlU/ml verdünnt. Der biotinylierte Sekundärantikörper auf 6 μg/ml, das Abion RED-Konjugat im Verhältnis 1 : 40. Auf die Test¬ gefäße wurden je 250 μl der verdünnten Proben aufgegeben, danach 250 μl der Lösung des biotinylierten Antikörpers und 250 μl des Abion RED-Konjugates . Nach dem Waschen mit 750 μl Waschpuffer wurde mit je 300 μl Ethanol eluiert. Die optische Dichte des Eluats wurde im ELISA-Reader bei 492 nm gegen einen Nullwert (Ethanol 95 Vol.-%) bestimmt. Die εo er¬ mittelte Kalibrierungskurve für alle weiteren Messungen mit Materialien derselben Charge ist in Abbildung 1 gezeigt . Die Kalibrierungskurve wurde mit mindestens 10 Messungen pro Meßpunkt erstellt, wobei sich für jeden Meßpunkt ein Variationskoeffizient unter 8% ergab (Standardabweichung/ Mittelwert x 100) .
Im Gegensatz zu den Ergebnissen, die mit kleinen Fluoreszenz- markermolekulen erhalten werden," führt die Markierung mit großen Farbstoffteilchen, wie Abion RED, mit Durchmessern von ca. 100 bis 200 nm zu einer auch im Kapazitätsbereich deε Textgefäßes nicht linearen oder höchstens im unteren Konzentrationsbereich linearen Beziehung zwischen Konzen¬ tration und Signal. Dies kann sowohl durch das Meßverfahren für optische Dichte, als auch das Verhalten großer Teilchen im hier untersuchten Assay begründet sein.
Beispiel 2
Vergleich zwischen den Bestimmungen der Tetanus-Antikörper- Konzentrationen in Serum und den Kalibrierungskurven mit Fluoreszenz- und mit Farbmarker.
Material :
Wie in Beispiel 1, ausgenommen:
Tetanustoxoid von SVM, NL - 3723 BG Bilthoven, Niederlande;
Tetanus-Positivserum mit 14,1 IU/ml (IU = International
Unitε) und
Tetanus-Negativεerum (Abion GmbH, Jülich) ,-
Verdünnung Abion RED-Konjugat 1 : 20;
FITC-Streptavidin-Konjugat von Dianova, Hamburg;
Kopplungspuffer mit pH 9,5.
Durchführung:
Wie in Beispiel 1 beschrieben, ausgenommen: Verdünnung des Tetanusεerumε mit Waschpuffer auf die Konzen¬ trationen 10, 7, 4, 5, 2,44, 2, 1,51, 1, 0,74, 0,5, 0,244 und 0,1 mlU/ml der FITC-Konjugat-Lösung im Verhältniε 1 : 251. Probenauftrag: 750 μl Probenlöεung. Die im Gegensatz zur gekrümmten Abhängigkeit mit Farbstoff- Marker lineare Beziehung zwischen Signal und Konzentration für den Fluoreszenz-Marker im Kapazitätsbereich des Testge- fäßes ist aus Abbildung 2 zu ersehen.
Beispiel 3
Das Beispiel betrifft die Temperaturabhängigkeit bei 4°C bis 39°C der Bestimmung der Tetanus-Antikörperkonzentration in Serum und damit der Kalibirierungskurve mit Abion RED-Marker. Versuchsdurchführung wie Beispiel 2 nur weniger Serumver¬ dünnungen; alle Materialien wurden gleich entweder mit 4°C, 18°C oder 39°C eingesetzt. Die in diesem Temperaturbereich im Kapazitätsbereich der Testgefäße innerhalb der Meßge¬ nauigkeit temperaturunabhängigen Kalibrierung und Meεεung ist aus der Abbildung 3 zu ersehen.
Beiεpiel 4
Dieses Beispiel betrifft die Antigenbeladungsabhängigkeit der Bestimmung der Tetanus-Antikörperkonzentration in Serum und damit der Kalibrierungskurve mit Abion RED-Marker oder FITC-Marker.
a) Oberer Konzentrationsbereich der Beladung, Abion RED- Marker
Durchführung wie Beiεpiel 2, nur weniger Serumverdün nungen; Verdünnung Abion RED-Konjugat 1 : 20, Antigen- Kopplung mit 5 μg/ml und mit 10 μg/ml Toxoid, (absolute Menge 3,75 μg bzw. 7,5 μg) .
Die Unabhängigkeit des Signals von der Beladung in diesem Beladungεbereich iεt aus Abbildung 4 zu ersehen.
Unterer Konzentrationsbereich der Beladung FITC-Marker Durchführung wie im Beispiel 2, Antigen-Kopplung mit
5 μg/ml, 2,5 μg/ml und 1,25 μg/ml (Absolutwerte 3,75 μg, 1,88 μg und 0,94 μg) .
Serumverdünnung auf 7,5, 5,55, 3,75, 1,83, 0,75, 0,375 und 0,183 mlU/ml; Probenauftrag 50 μl .
Die Abhängigkeit des Signals von der Belegung in diesem
Beladungsbereich ergibt εich auε Abbildung 5.
c) Menge der Beladungεlösung bei gleicher Absolutmenge. Die Versuchεdurchführung erfolgt wie im Beiεpiel 4 b) angegeben; Antigen-Kopplung mit 750 μl, mit 2,5 μg/ml mit 250 μl mit 7,5 μg/ml.
Abbildung 6 zeigt, daß zwischen beiden Beladungen bei Mesεung mit Fluoreεzenz-Marker kein Unterεchied be¬ steht. Trotzdem empfiehlt es sich, bei dee Testerstel- lung mit dem hohen Beladungεvolumen zu arbeiten, um eine beεεere Verteilung der Bindungsstellen zu er¬ reichen. Diese Verteilung iεt für die Zugänglichkeit für die großen Farbstoffmarkerteilchen vorteilhaft, da sich bei besserer Verteilung auch ein besseres Signal einstellt .
Beispiel 5
Dieses Beispiel betrifft die Abhängigkeit von der Menge der Probenlösung am Beispiel der Tetanus- und Diphtherie-Anti¬ körperkonzentration in Serum.
a) Mit FITC-Marker:
Die Versuchsdurchführung erfolgte wie in Beispiel 4 beschrieben;
Beladung mit 3,75 μg Tetanustoxoid abεolut in 750 μl
Kopplungεpufferlöεung; gleiche Abεolutmengen Human-anti-Tetanus-IgG in 750 μl, 250 μl, 50 μl und 10 μl Waschpufferlösung. Die starke Abhängigkeit des Signals von der Menge der Probe ist aus Abbildung 7 ersichtlich. In diesem Bereich ergibt die Messung mit 50 μl das stärkste Signal und war mit für die untersuchten Tests, die von der Signal- Optimierung her geeignetste Probenmenge. Der Bereich bis 100 μl liefert ebenfalls zuverlässige Signale, wohingegen die hohen Signalwerte bei 10 μl aufgrund starker Streuung nicht zu bevorzugen sind. Allerdings ist auch bei niedriger Menge mit den erfindungsgemäßen Trägermaterialien ein Assay durchführbar.
b) Abion RED-Marker
Die Durchführung erfolgte wie in Beispiel 1 be¬ εchrieben; Fritte 3,2 mm hoch, Nennporengröße 3 μm, Porengrößen im Coulter-Porometer von 3,156 biε 80,33 μm, mittlere Porengröße 6,046 μm, 1,304% der Porenzahl größer alε 11,25 μm, Serumproben mit 0,77, 0,5 und 0,25 μlU abεolut . Die εtarke Abhängigkeit des Signals von der Probenmenge ist in diesem Fall aus Abbildung 8 ersichtlich. Bei Verwendung dieses Markers zeigt sich, daß 750 μl ein für diesen Marker geeignetes Probenvolumen darstellt .
Beispiel 6
Dieseε Beiεpiel betrifft die Porengroßenabhängigkeit der Bestimmung der Diphtherie-Antikörperkonzentration in Serum mit Abion RED-Markern.
Die Versuchsdurchführung erfolgte wie in Beispiel 5 b) beschrieben. Die Probenmenge betrug 250 μl mit 3,08, 2 und 1 mlU/ml ; Fritten mit Nennporengröße von 100, 50, 35 und 3 μm wurden verwendet. Die Abhängigkeit des Signals vom Poren- durchmeεser ist auε Abbildung 9 erεichtlich. Beispiel 7
Nachweis von IgG-Antikörpern gegen virale Antigene (Influenza A2, Typ H3N2.
Dieser Immunoassay dient dem qualitativen Nachweis von IgG- Antikörpern im Humanserum. Der im Humanεerum geεuchte Anti¬ körper bildet mit dem auf der Feεtkörpermatrix immobili- εiertem Antigen (Influenza Virus A2, Typ H3N2) einen Immun¬ komplex. Mit diesem Komplex verbindet εich daε Anti-human- IgG-Biotinkonjugat .
Abion Red bindet εpezifisch über Streptavidin an das Biotin- konjugat. Es entsteht ein tiefroter Farbstoffkomplex (bei positiven Proben) , der mit 300 μl Ethanol in eine Mikrotiter¬ platte eluiert wird und bei 510 nm (ggf. 492 nm) im Mikro- titerplattenreader gemessen wird. Nicht gebundene Reaktions- partner werden vorher durch Waεchprozeεεe entfernt. In diesem Beispiel werden die erfindungsgemäßen Vorrichtungen, Ethanol absolut unvergällt, Kopplungspuffer, PBS mit hohem Tensid- gehalt, bidestilliertes Wasser, Abion Red, Anti-human-IgG (monoklonal) , (Influenza A2-Virus-Antigen Typ H3N2) , Kontrollserum Influenza A2 negativ, Kontrollserum Influenza A2 positiv, eingesetzt.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung wird in die Probenzuführung des Assay-Automaten eingehängt und über einer Waschwanne positioniert. Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen werden entlüftet, indem 500 μl Ethanol direkt mit scharfem Strahl aus der Multipipette aufgegeben werden und die Flüssigkeits- menge die erfindungsgemäße Vorrichtung in Durchfluß passiert (ca. 2 min) . Danach werden 500 μl, 50 Vol.-% Ethanol mit einer Multipipette aufgegeben.
Im Kopplungspuffer wird das Influenza A2-Virus-Antigen auf einen Proteingehalt von 2,5 μg/ml eingestellt, und von der Lösung werden jeweilε 750 μl auf eine erfindungεgemäße Vorrichtung aufgegeben. Die Durchlaufzeit beträgt hier typiεcherweise 4 min. Nach dem Coating wird die erfindungs¬ gemaße Vorrichtung mit 750 μl PBS mit hohem Tween-Gehalt blockiert (ca. 3 min) und ist nun zur Durchführung des Influenza-Assays bereit. Gegebenenfalls kann auch biε zu 6 Monaten gelagert werden. Die Lagerung sollte bei 4°C im Kühlschrank erfolgen und unter einem PBS-Puffer, der bei¬ spielsweise Natriumazid als Bakterizid enthält. Sollen mehrere Vorrichtungen präpariert werden, die nicht sofort eingesetzt werden, kann im eingeschweißten Beutel bei 4°C die fertig präparierte Vorrichtung auch ca. 14 Tage gelagert werden.
Zur Testdurchführung wird die benötigte Anzahl der präparier¬ ten Vorrichtungen in einen Trägerrahmen eingehängt und über einer Waschwanne positioniert. Die zu testenden Seren, Negativ- und Positivkontrollen, werden 1 : 101 in PBS mit hohem Tween-Gehalt verdünnt und davon jeweils 250 μl auf eine erfindungsgemäße Vorrichtung aufgegeben. Die Durchlaufzeit beträgt typischerweise etwa 2 min. Da Inkubationszeiten keine verbesεerten Ergebnisse bringen, kann auf diese vollständig verzichtet werden. Der biotinylierte, monoklonale Sekundär¬ antikörper (Anti-human-IgG) wird auf 15 μg/ml in dem gleichen Puffer verdünnt, und davon werden jeweils 250 μl auf eine erfindungsgemäße Vorrichtung aufgegeben. Die Durchlaufzeit beträgt ca. 2 min. Danach wird Abion Red im gleichen Puffer 1 : 30 verdünnt und davon jeweils 250 μl auf eine erfindungs¬ gemäße Vorrichtung gegeben. Die Durchlaufzeit beträgt auch hier etwa 2 min. Ein Waschschritt wird danach empfohlen. Dieser erfolgt mit 750 μl bidest . -Wasser. Auch hier beträgt die Durchlaufzeit etwa 2 min. Danach wird der Trägerrahmen mit den "erfindungsgemäßen Vorrichtungen über einer Mikro¬ titerplatte poεitioniert. Die erfindungεgemäßen Vorrichtungen werden dann mit 300 μl Ethanol in die Mikrotiterplatte eluiert. Dieεer Schritt dauert etwa 3 min. Danach wird die Mikrotiterplatte alεbald im MTP-Reader bei 510 nm, gegebenen- falls 492 nm, gegen 300 μl Ethanol alε Blindprobe vermessen. Beispiel 8
Sandwich-Immunoasεay zur quantitativen Bestimmung deε Kom- plementpeptidε C3a.
Bei der Aktivierung deε Komplementsystems wird unter anderem das Spaltprodukt C3a gebildet, das auch als Anaphylutoxin bezeichnet wird. Mit dem beschriebenen Test kann eine Quanti¬ fizierung von C3a vorgenommen werden. Das im Humanplaεma vorliegende Komplementpeptid C3a wird im ersten Schritt von dem auf der Festkörpermatrix immobilisierten monoklonalen Antikörper gebunden. Mit diesem Komplex verbindet sich der zweite biotinylierte monoklonale Antikörper gegen C3a.
Der Farbstoff Abion Red bindet spezifisch über Streptavidin an daε Biotinkonjugat. Eε entεteht einer roter Farbstoff- komplex (bei positiven Proben) , der mit 300 μl Ethanol (96%) in eine Mikrotiterplatte (MTP) eluiert wird und bei 510 nm (ggf. 492 nm) im MTP-Photometer gemessen wird. Lichtgebundene Reaktionspartner werden durch Waεchprozesse entfernt. Die Vorbereitung und Beschichtung der erfindungεgemäßen Vor¬ richtungen wird wie im vorhergehenden Beispiel beschrieben durchgeführt mit dem Unterschied, daß als Antikörper anti- C3a-Antikörper eingesetzt werden. Die Konzentration des anti- C3a-Antikörpers beträgt 3 μg/ml . Die Blockierung erfolgt mit 750 μl eines PBS-Puffers, der einen höheren Anteil an Tween enthält. Die Durchführung erfolgt wie im vorhergehenden Bei¬ spiel beschrieben. Der Sekundärantikörper wird auf 20 μg/ml im genannten Puffer verdünnt.

Claims

A n s p r ü c h e
Sorptionsmaterial in Form eines Formkörpers, loser Schüttungen des Sorptionsmaterials in Partikelform, in Form eines Gels, einer Membran oder in Membranen eingebettet oder als Dispersion, wobei das Sorptionsmaterial in der Lage ist, Affinitätsmateria¬ lien unspezifisch zu binden und für ein Fluidum durch¬ lässig ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Sorptionsmaterial einen mittleren Porendurchmesser von 0,1 bis 100 μm aufweist, das Sorptionsmaterial die Affinitätsmaterialien im Durchfluß durch das Sorptionsmaterial unspezifisch bindet, das Sorptionsmaterial standardisiert iεt durch die Maßgabe, daß ein bestimmtes Einheitsvolumen gefüllt mit dem Sorptionsmaterial das sorptiv zu bindende Affini¬ tätsmaterial beim einmaligen homogenen Durchfluß einer bestimmten Menge einer Lösung des Affinitätsmaterials in einer bestimmten Konzentration in einer solchen Menge bindet, die zwischen mehreren statiεtiεch rele¬ vanten Beladungεvorgängen um einen mittleren Beladungε- wert um höchstens ± 40% schwankt und, daß die gebundene Menge bei der nachfolgenden Blockie¬ rung freier unspezifischer Sorptionsstellen sowie mehreren darauf folgenden geeigneten Durchεtrömungε- vorgängen an dem Sorptionsmaterial, wie Waschungen des mit Affinitätsmaterial beladenen Sorptionsmaterials oder Zuführung von affinitätsreaktiven Materialien in dem genannten Bereich konstant bleibt.
Sorptionsmaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich¬ net, daß die Schwankung des Beladungεwerteε im Bereich von 4 - 40 °C im wesentlichen temperaturunabhängig ist. 3. Sorptionεmaterial nach einem der Anεprüche 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß daε Sorptionεmaterial eine im weεentlichen hydrophobe und/oder hydrophile Oberfläche aufweist.
4. Sorptionsmaterial nach Anεpruch 1 biε 3, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß das Sorptionsmaterial aus gesintertem organischen oder anorganiεchen Material beεteht.
5. Sorptionεmaterial nach mindeεtenε einem der Anεprüche 1 biε 4, dadurch gekennzeichnet, daß die gesinterten Materialien aus thermoplastischen Kunststoffpartikeln, wie Polyethylen oder Polystyrol beεtehen.
6. Sorptionsmaterial nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Sorptions¬ material partikelförmig für lose Schüttungen oder Gele, gelförmig, als Membranen oder in Membranen eingebettet, oder als selbsttragender Formkörper, z. B. als Fritte, vorliegt.
7. Sorptionsmaterial nach mindestenε einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß geschäumte Kunst- Stoffe, insbesondere solche in retikulierter Form, Hohlfasern, verstreckte Folien, Komposit- oder Mehr¬ schichtenmaterialien, keramische Materialien, Zeo¬ lithe, Metalle, Metalloxide, Legierungen, Glas oder Kohlenstoff oder Kombinationen davon in Mischungen oder geschichteten Lagen das Sorptionsmaterial bilden.
8. Sorptionsmaterial nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, erhältlich durch Modifizierung der Oberfläche durch Beschichtung mit Biopolymeren, wie Proteinen, Hydrophobierung und/oder Hydrophilierung der Oberfläche des Sorptionsmaterials. 9. Trägermaterial zur Durchführung eines Festphasenassays in Form eines Formkörpers, loser Schüttungen eines Sorptionsmaterials in Partikelform, in Form eines Gels, einer Membran oder in Membranen eingebettet, oder als Dispersion, wobei das Trägermaterial mindestens eine Komponenten zur Durchführung von Festphasenassays trägt und für ein Fluidum durchlässig iεt, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß daε Trägermaterial einen mittleren Porendurchmeεεer von 0,1 bis 100 μm aufweist, das Trägermaterial keine oder eine sehr niedrige un¬ spezifische Sorptionsfähigkeit für Affinitätsmateria lien hat, das Trägermaterial standardisiert ist durch die Ma߬ gabe, daß die auf einem bestimmten Einheitsvolumen des Trägermaterials befindliche Komponente zur Durchführung von Festphasenassays (Affinitätsmaterial) ihre kom¬ plementäre Komponente beim einmaligen homogenen Durch¬ fluß einer bestimmten Menge einer verdünnten Lösung der komplementären Komponente in einer bestimmten Konzen¬ tration dieser komplementären Komponente εpezifiεch in einer εolchen Menge bindet, die zwischen mehreren statistisch relevanten BeiadungsVorgängen um einen Beladungswert ± 40% schwankt und, daß die gebundene Menge auch bei mehreren anschließen¬ den Durchströmungsvorgängen geeigneter Flüssigkeiten an dem Trägermaterial, wie Blockierungen spezifischer oder unspezifischer Adsorptionsstellen, Waschungen des mit der Komponente zur Durchführung von Festphaεen- assays beladenen Trägermaterialε εowie Zuführung von affinitätsreaktiven Materialien, in dem genannten Be¬ reich konstant bleibt.
10. Trägermaterial nach Anspruch 9, erhältlich durch Be¬ ladung des Sorptionsmaterials nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 im Durchfluß einer bestimmten Menge von mindestenε einer Löεung mit einer beεtimmten Kon- zentration mindeεtens einer Komponente zur Durchführung von Festphasenasεays, wobei die mindestens eine Kom¬ ponente zur Durchführung von Festphasenasays entweder direkt an das Sorptionsmaterial unspezifiεch oder mit¬ telbar an mindestens eine an das Sorptionsmaterial gebundene Komponente seinerεeitε unεpezifisch oder spezifisch gebunden ist.
11. Trägermaterial nach Anspruch 8 und/oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial mindestens eine Komponente für die Durchführung von Festphasenassays unter der maximalen Sorptionskapazität des Sorptions¬ materials trägt und freie Sorptionsstellen - des Sorptionsmaterials blockiert sind.
12. Trägermaterial nach mindestenε einem der Anεprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Affinitäts- material aus Molekülen, Molekülgruppen oder Teilchen mit affinen Eigenschaften zu anderen Substanzen be¬ steht.
13. Trägermaterial nach Anspruch 12, dadurch gekennzeich net, daß das Affinitätsmaterial ausgewählt ist aus der Gruppe der Enzyme, mit Enzymen in Wechselwirkung tre¬ tende Substrate, Antikörper, Antigene, wie hochmoleku¬ lare Substanzen oder Pollen, Haptene, Biotin oder Streptavidin, Nucleinsäuren vom RNA- oder DNA-Typ, insbeεondere εolche, die hybridisierbar mit einer anderen Nucleinsäure sind, Rezeptor oder Ligand eines Rezeptorε, Viren, Bakterien, Zellen, Zellorganellen, Blutkörperchen, Teilchen, wie kolloidale Teilchen von Metallen, Metalloxiden, Polymeren oder Kombinationen der genannten Affinitätεmaterialien.
14. Vorrichtung mit einem Hohlkörper, in dessen Lumen ein oder mehrere Sorptionsmaterialien nach einem der An¬ sprüche 1 bis 8 und/oder mindestenε ein Trägermaterial nach einem der Ansprüche 9 bis 13 und/oder mehrere Trägermaterialien mit unterschiedlichen Komponenten für Feεtphaεenaεεays nach einem der Ansprüche 9 bis 13 angeordnet sind, so daß ein homogenes Durchströmen gewährleistet ist.
15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Sorptions- und/oder Trägermaterialien in Form loser Schüttungen, Membranen, Folien oder Gele mittels im Lumen des Hohlkörpers angeordneten Einrichtungen fixiert sind.
16. Vorrichtung nach Anspruch 14 und/oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß Einrichtungen vorgesehen εind, die ein homogenes Durchströmen und/oder eine bestimmte Durchflußgeschwindigkeit gewährleisten und kein oder nur geringes eigenes unspezifisches Sorptionsvermögen für das an dem Sorptions- oder Trägermaterial ad¬ sorbierte Affinitätsmaterialien aufweisen.
17. Verfahren zur Herstellung des Sorptionsmaterialε nach einem der Anεprüche 1 biε 8, dadurch gekennzeichnet, daß zur Standardisierung
im Falle sinterbarer Materialien beεtimmte Sieb¬ fraktionen dieser Materialien gesintert werden und im Falle anderer Sorptionsmaterialien die Porenbildung dieser Materialien gesteuert wird, um eine enge Grössenverteilung der Poren zu erreichen und ggf. eine Nachbehandlung erfolgt, und daß in jedem Fall εtörende lose Partikel und Substanzen aus Sorptionsmaterialien entfernt werden, insbeεondere auch nach formgebenden Bearbeitungen.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Standardisierung eines Ausgangsmaterialε zu einem 7/28448 PC17EP97/00405
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Sorptions- oder Trägermaterial in einer Vorrichtung mit einem Hohlkörper erfolgt .
19. Verfahren zur Herstellung des Trägermaterials nach einem der Ansprüche 9 biε. 13, wobei daε Sorptions- material nach einem der Ansprüche 1 biε 8 mit einem oder mehreren Affinitätεmaterialien jeweilε in Lösung mit bestimmter Konzentration in einer bestimmten Flüssigkeitsmenge behandelt wird, insbesondere im homogenen Durchfluß in einem Hohlkörper mit Ein- und Auslaßöffnung, in dem das Sorptionsmaterial angeordnet ist, gefolgt von einer Blockierung .der freien Sorp¬ tionsstellen und ggf. von Waschschritten, wobei ,das Affinitätεmaterial, daε am Sorptionsmaterial adsorbiert ist, gegebenenfalls zur Bindung des asεayεpezifiεchen Affinitätεmaterials dient.
20. Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung zur Durch¬ führung eines Asεayε zur Beεtimmung mehrerer Analyse- parameter, in der in einem Hohlkörper mindeεtenε ein Sorptionsmaterial nach mindestens einem der Ansprüche l bis 8 angeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, daß jeweils eine in dem Hohlkörper angeordnete Schicht im Durchfluß beladen und freie Stellen blockiert werden, gefolgt vom Aufbau der nächsten Schicht in analoger Weise.
21. Festphasenassay unter Verwendung des Sorptionsmaterials nach mindestens einem der Ansprüche 1 biε 8 und/oder deε Trägermaterialε nach mindestens einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Sorptions- material mit einer im Festphasenassay zu verwendenden Komponente behandelt wird, die Komponente am Sorptions¬ material haftet und danach der Festphaεenassay durch¬ geführt wird oder der Feεtphasenasεay an einem in einer Vorεtufe vorbehandelten Sorptionεmaterial durchgeführt wird. 22. Festphasenaεsay nach Anspruch 21, dadurch gekennzeich¬ net, daß dieser standardiεiert ist für die quantitative Analyεe bei Verwendung einer beεtimmten Menge der Analytlosung.
23. Festphasenassay nach Anspruch 22, gekennzeichnet durch eine temperaturunabhängige Standardisierung.
24. Festphasenassay nach mindestens einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß dieser alε Äffinitätsassay, insbesondere Immunaffinitätsassay, ausgebildet ist .
25. Verfahren zur Beladung des Sorptionsmaterials und/oder zur Durchführung der Affinitätsreaktion im Feεtphaεen- aεεay nach einem der Anεprüche 21 biε 24, unter An¬ wendung von Unter- oder Überdruck oder Verwendung vorr die Durchflußgeschwindigkeit des Fluidums beein- fluεεenden Bauteilen in dem Hohlkörper, wie ent- εprechender Fritten.
26. Zuεammenstellung in Form eines Kits enthaltend Träger¬ material gemäß Ansprüchen 9 biε 13 oder Sorptions- material gemäß Ansprüchen 1 - 8, zylindrische Hohl¬ körper mit Einlaß- und Auslaßöffnung, wobei Trägermate¬ rial oder Sorptionsmaterial vorzugεweise εchon in den Hohlkörpern angeordnet εind, wäßrige Lösungen zur Beladung des erfindungsgemäßen Sorptionsmaterials, die bereits Affinitätsmaterial gelöst enthalten, oder gesondert von dem Affinitätsmaterial in lagerfähiger Form sowie gegebenenfalls Lösungen zur Durchführung eines Feεtphasenassays nebst gegebenenfalls weiteren Hilfεreagenzien oder Vorrichtungen zur Durchführung von Feεtphaεenassayε.
27. Vorrichtung zur Einrichtung und/oder Durchführung eines Affinitätsaεεayε nach mindestens einem der Anεprüche 21 bis 24 mit einer Vorrichtung zur Ergreifung von mindeεtens einem mit den Sorptionsmaterial gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 mindestens teilweise befüllten oder befüllbaren Hohlkörpers, insbesondere Röhrchens, und zur Beladung des in dem Röhrchen befindlichen Sorptionsmaterials mit Komponen¬ ten zur Durchführung von Festphaεenassayε unter Erhalt eineε Trägermaterials gemäß mindestens einem der An¬ sprüche 9 bis 13 oder Vorrichtungen mit mindestens einem Hohlkörper, der mit dem Trägermaterial nach mindestenε einem der Anεprüche 9 biε 13 befüllt oder befüllbar ist.
28. Vorrichtung nach Anspruch 27 mit einer Einrichtung zur Beladung des mindestenε einen, mindeεtenε teilweise befüllten Röhrchens mit Lösungen zum Waschen, binden und/oder Eluieren von Komponenten des Festphaεenassays oder deε Analyten sowie gegebenenfalls Detektionεein- richtungen zur Detektion von Assaykomponenten oder Analyten im Hohlkörper, in einer Flüssigkeit nach deren Durchlauf und/oder im Eluat.
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