JP2000507347A - 固相アッセイ用の流動充填可能な支持体材料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 形状物の形態、粒子状の収着材料の緩いパッキング、ゲルの形態、膜または膜に埋め込まれた状態または懸濁液としての収着材料であって、上記収着材料は親和性材料に非特異的に結合でき、かつ流動体に透過性であり、− 上記収着材料は0.1から100μmの平均孔半径を持ち、− 上記収着材料は収着材料を通って流れる上記親和性材料に非特異的に結合し、− 上記収着材料は、±40%より以上でない平均充填値付近の幾つかの統計的に適切な充填の間で変化する分量において、一定濃度を持つ上記親和性材料溶液の一定分量が均一に一度流れ通った時、収着材料で満たされた一定単位体積が収着される親和性材料を結合するという規定によって標準化され；及び− フリー非特異的収着サイトの後続ブロッキングにおいて、及び幾つかの収着材料での後続の適当な流動工程、例えば、親和性材料により充填された収着材料の洗浄、または親和ー反応性材料の提供において、上記範囲内で定量的結合が一定に保たれることを特徴とする収着材料。

Description

【発明の詳細な説明】 固相アッセイ用の流動充填可能な支持体材料 本発明は、請求項１のプレアンブルに記載の収着材料(sorption material)、 請求項９のプレアンブルに記載の固相アッセイを行なうための支持体材料、請求 項１４のプレアンブルに記載の装置、請求項１７のプレアンブルに記載の収着材 料の調製方法、請求項１９に記載の支持体材料の調製方法、請求項２０に記載の アッセイを行なうための装置の調製方法、請求項２１のプレアンブルに記載の固 相アッセイ、さらに、請求項２５に記載の収着材料の充填方法、請求項２６に記 載のキット及び請求項２７に記載の機器に関する。 固相免疫分析法のための反応カラム及び免疫反応により検出可能な組成物の検 出方法は、DE 41 26 436 A1及びDE 42 08 732 A1により公知である。これらのカ ラムは、操作が単純であり、継続的なフローモードで行なわれ、反応時間が短く 、定量的な反応によるものである。カラムの各グルーをの基本的標準化した後は 、カラムは前処理としてのカリブレイションまたは再生、参照計測を必要としな い。このような方法により、ELISAプレート、またはイムノブロッティング反応 等のアフィニティーアッセイをより単純に、より早く及びより精密に及びより簡 単に自動化することができる。しかし、カラムに満たされる収着材料の充填量が 比較的高いため、このような系の比較的に退屈な調製には改善の余地がある。収 着剤の充填は比較的に長時間を要する。従って、アガロースのようなゲルであっ ても、充填材料が孔に浸透するまでに数時間を要する。充填が短時間で行なわれ 、明確な方法で複雑な機器なしに、高価な充填剤を少量しか必要としないで行な うことができれば調製において利点となる。加えて、アッセイを行なうための収 着材料の充填を使用者が行なうことができれば、例えば、使用者が状況に応じて 収着材料を変更することができるため使用者にとって利点となる。使用する直前 に調製するのであれば対応する物質の耐久性は致命傷にはならないことも利点と なる。従って、アッセイを行なうための充填物質は、機器の一部分または 収着材料から分離して保存することができる。 従って、本発明の目的は上記の障害をなくし、より便利な物質を提供すること にある。驚くべきことに、この目的は、請求項１に記載の特徴を有する収着材料 を使用することにより達成された。親和性リガンドとともに充填した後、この収 着材料は、固相アッセイのための支持体材料として使用するのに適している。本 発明の収着材料の利点は、迅速に単純に充填することができる容量にある。収着 材料は、親和性材料と共に充填される時、比較的低い変化でそれらと結合するの で標準化することができ、そのため収着材料は標準化固相アッセイのための基礎 となることができる。本発明の収着材料の利点は、比較的高価な物質が少ししか 充填されなくても、固相アッセイのための標準化支持体材料を得られるというこ とにある。本発明の収着材料は更に本発明の支持体材料調製の中間生成物として も考えられる。本発明の収着材料の利点は、固相アッセイを行なうために使用さ れる親和性材料と共に継続的な流れの中で再生しながら充填することができる点 である。 特に、驚くべきことに、収着材料に非特異的に結合する親和性材料は、継続的 な流れの中で一定に増殖しながら吸着され、この材料の標準化及び本発明の支持 体材料の標準化を可能にする。 本発明の収着材料は、形状物（shaped body）で、粒子を緩く（loose）パッキ ングし、ゲル状または懸濁状の形態をしている。本発明の収着材料は、親和性材 料の非特異的な結合力を有する。それは流動体に浸透可能でなければならない。 収着材料は、孔の直径が0.1〜100μmであるという利点がある。被覆、懸濁液及 び焼結物質の場合、上記孔は粒子の間にある孔であって、本発明の収着材料の個 々の粒子の表面にある孔ではない。収着材料は、収着材料を通って流れる親和性 材料に非特異的に結合する。本発明の収着材料は、±40%より以上ではなく、特 に±30%、好ましくは±20%、特に好ましくは±10%より以上でない平均充填値付 近の幾つかの統計的に適切な充填の間で変化する分量において、一定濃度を持 つ下記親和性材料溶液の一定分量が均一に一度流れ通った時、収着材料で満たさ れた一定単位体積が収着される親和性材料を結合するという規定によって標準化 される。 形状物の均一性を制御するための測定可能パラメーターは、均一な重量または 密度及び／または均一な流速である。形状物の重量及び流動変化は、他のパラメ ーターと共に支持体材料の収着作用を測定するパラメーターである孔半径、孔合 計体積及び内側の表面領域の対応する変化により示唆される。 定量的結合は、続くフリー収着サイトのブロッキングの段階及び収着材料にお いて生じる他の適当なリガンドを用いて更なる流動工程(flowing steps)におい て基本的に一定である。勿論、収着物を溶出するリガンド（例えば、アルコール 、溶出pH）は適当ではない。特に、定量的結合は、例えば、残っているフリーの 非特異的収着サイトのブロッキングの段階、親和性材料による収着材料の充填の 洗浄等では変化しない。 充填値の変化は、基本的に４から４０℃の範囲において温度非依存性である。 これは、更なる単調な工程段階なしに、特に、生物化学実験室等の環境的な条件 を考慮することなしに、温度管理がない実験室で充填工程を行なうことができる ため有利である。 本発明の収着材料は、好ましくは焼結された有機または無機物質から成る。使 用することができる焼結された有機物質としては、特にサーモプラスチック(the rmoplastic)、好ましくは微粒子状のものを使用することができる。これらは、 例えば、ポリエチレン及びポリスチレンを含む。 更なる態様として、本発明の収着材料は、ゲル様形態の緩いパッキングまたは のゲルのための粒子形態、または、例えばフリットのような自己−支持形状物で あることができる。 他の好ましい態様としては、本発明の収着材料は、特に網状の発泡プラスチッ ク、中空繊維、配向シート、成分物質が収着、流動または強度に関する成分材料 の異なる特性を有する複合または多層材料、及び大きな通り抜け孔を避けるため の、セラミック材料、金属、酸化金属、合金、ガラス、炭素変性物、またはそれ らの組合せの混合物または層状シートからなる。 一般的に、親和性−反応成分（親和性材料）への適当な非特異的収着を有する 、均一な多孔性物質を使用することができる。これらは、例えば、ミクロ濾過、 場合によっては限外濾過及びディープ−ベッド(deep-bed)濾過でも使用される物 質及び膜を含む。収着材料は、バインダー及び／または高網状体(macroreticula nt)、密度の高いパッキング（珪藻土、砂、無煙炭）、泡、繊維及び中空繊維、 例えば横または縦繊維、織り込んでいないもの、不規則な網、ミクロフィラメン ト、ガラス繊維等と共にまたはそれらなしに、熱及び／または圧力下での焼結に より調製される焼結形状物の形態とすることができる。有機物質に加えて、他の 物質及び調製工程は、特に、ウルマン（Ullmann）工業化学辞典、vol．A16、ペ ージ224から、Eberhardt Staude、Membranen und Membranprozesse、Verlag Che mie、Weinheim 1992、ページ８から及びSiegfried Ripperger、Mikrofltration mit Membranen、Verlag Chemie、Weinheim 1992、ページ15からに報告されてい る理論によれば、使用することが可能である。 本発明に関連し、本発明の収着材料及び支持体材料により確かなものとされる 均一で継続的な流動は、収着または支持体材料の表面間またさらに、例えば流動 方向についての断面間における均一な孔構造と、特に吸着内表面に関して相互に 関連している。そのような対称均一孔構造は利点である。しかし、流動方向に見 て、例えば、大きな内側の表面を提供するために初めは小さい孔を持ち、流速が 低くなり過ぎない為に大きな孔が続く非対称的孔構造使用することも可能である 。 収着によって、低い特性を持つ膜（40%まで、また可能性として60%まで）及び 比較的広い孔サイズ分布を持つ不規則な孔構造を得ることができる。ポリマーシ ートを設置することにより、例えば、Ullmann，loc，cit.，ページ216に見られ る比較的規則正しい孔構造及び均一な孔サイズ分布を持つ90％までの高い特性の 膜を得ることができる。膜は、従来技術にある方法により調製することができる 。 好ましい態様では、本発明の収着材料をタンパク質等のバイオポリマーにより 被覆することもできる。適用する技術分野によって、その表面は親和性または疎 水性にすることができる。 本発明の収着材料の本発明の調製方法は、収着化可能な特定のスクーニング分 画を焼結することから始める。焼結工程中、収着集合体に結合していない粒子は 収着材料から除去される。 標準化の為には、突き出ている粒子の除去が必要である。この除去は標準化さ れた物質について行い、収着材料の上に載せられた親和性材料の担持量について の変化量は小さい。これは、例えば、固相アッセイを評価するために使用される 測定シグナルの対応する小さな変化により証明されている。これは、例えば、等 しいアッセイ条件下で、分析成分としての親和性材料に相補である成分の定量を 含んでいる。 例えば、成形されたプラスチック、特に、中空繊維、配向シート複合または多 層物質、セラミック物質、ゼオライト、金属、酸化金属、合金、ガラス、または 炭素等の他の収着材料の場合も、適さない粒子サイズを除去するためのいずれか の工程段階が行なわれ、及び／または特に膜様物質の孔のサイズは工程パラメー ターを変化させることにより公知の方法で制御されている。比較的狭い孔サイズ 分布に達することが好ましい。後処理は、例えば使用するために収着材料を形態 化する間に生成された物質の機能的な処理により形成された研磨塵を除去す るために必要である。この研磨塵は、収着効果及び関連の充填価にはっきりとし た影響を及ぼす。更に、他の全ての外部からの物質、例えば、溶媒またはモノマ ーは標準充填を得るための標準化用物質から除去されなければならない。 異なる洗浄液、特に親和性／疎水性に関しては、様々な順位、及び特に気体除 去のための可能性として与えられた圧力、真空、または超音波を使用することに より洗浄液の流動方向を逆にすることは、妨害粒子の除去のために有利である。 好ましくは親和性材料は溶解され、充填する収着材料を継続的に通る流れの中 に好ましくは垂直な方向で、好ましくは重力下で流す。特に、例えば、シリンダ ー型の中空体のような充填容器に充填を行なうためには有利であることが証明さ れている。この場合、収着材料は、可能ならば完全に壁に密着している中空体の 内腔に配置される。これは、一方では収着材料の形状物により調製し、中空体の 内腔にそれらを入れることにより達成することができる。他の方法は、親和性材 料及び後者を通り抜ける成分、特に親和性材料と相補生分解性粒子と相互作用を 好ましくは起さない２つの溶解物の間に収着材料を配置することである。そして 、親和性材料溶液は入口と出口を持つ空胴体に充填され、それによって親和性材 料の溶液が通って流れる時に後者が収着材料の表面に非特異的に吸着される。 重力下の垂直流のデザインにおいて、いずれにしても既に比較的に早く行なう ことができる充填工程は、シリンダー型の中空体末端の出口で圧力を低減させる か、シリンダー型の中空体末端の入口で圧力を増加させることによる流れが遅い 収着材料の場合、更に加速することができる。これは、充填の均一性に有効な効 果も持つ。同じように、シリンダー型中空体を通る流れは、対応する物質のため の流れを均一化するための、特に適当な充填及び高充填のための充填の変化の低 減を達成するために特定の手段、例えばフリットを伴うことによりまたは吸引ま たは反対圧力により遅くすることができる。同じ測定値は、続く収着材料の上の 親和性成分及び流れている相補的成分の間でおこる親和性反応によって利用する ことができる。 本発明の収着材料は、本発明の支持体材料の基礎となる。収着材料と共に、固 相アッセイを行なうための本発明の支持体材料は、模どり体、粒子状の収着材料 の緩いパッキング、ゲル状、または懸濁液状の形態をしている。支持体材料は固 相アッセイを行なうための少なくとも１つの成分を支え、流動体に浸透すること できる。支持体材料は本発明の収着材料で記載されているとおり、対応する物質 の粒子の表面の多孔性というよりは粒子間の空間である孔においてその平均孔径 が０．１から１００μｍである。支持体材料は親和性材料に対して、全くないか とても低い非特異的収着を示す。それとは逆に、収着材料上に提供された親和性 材料に相補的な特定の成分に対しては高い親和性を示す。 これらの第一相補的成分のみが、例えば、特異的にアナライトに結合するアッ セイ特定成分であることも可能である。これは、成分が非特異的に吸着されにく く、第一に簡単に非特異的吸着相補的成分に関して有利な支持体材料にまたはそ の中に特異的に結合する場合有利である。例えば、アッセイの準備中またはアッ セイを行なう直前のすぐ後で、より高価に、より不安定に、低い耐性及び／また は高い特異性のアッセイ成分を結合する、少なくとも１つの簡単に接触できる、 安価で、安定な及び／または耐性の第一成分を持つことは支持体材料にとって有 利である。この場合、本発明の支持体材料は、いわば少なくとも２段階の支持体 材料、即ち、第一の段階において、第一の一次的な非特異的に吸着される親和性 成分を有する支持体材料として更に少なくとも１つの第二段階として第一親和性 成分に相補的な第二の二次的な親和性成分が結合する材料と考えることができる 。この第二の、二次的親和性成分はアッセイに実際使用することができる適切な 親和性成分である。 本発明の支持体材料は、平均充填値が±40％を超えない範囲で幾つかの統計的 に適切な充填の間で変化量において、一定濃度相補的成分を持つこの一定相補的 成分溶液の一定分量が均一に流れる時、一定の単位体積の支持体材料中に存在す る固相アッセイを行うための成分（親和性材料）が特異的に対応する相補的成 分に結合する規定により標準化することができる。特に、変化は±30％を超えず 、好ましくは±20％を超えず、更に好ましくは、±10％を超えない。結合量は、 支持体における他の適する液体を使用した幾つかの継続流動の工程においても記 述された範囲内で一定である。 このような更なる流動工程としては、特に特異的または非特異的吸着サイトの ブロッキング段階、特に固相アッセイを行うための成分により充填された支持体 材料の洗浄、更にはまたは正しいアッセイ成分の結合のための標識化及び／また は増幅のための親和性結合の段階等を挙げることができる。 本発明の支持体材料は時間及び使用機器を多く消費することなく、比較的単純 な方法で使用者自身が、簡単に入手することができる一方で収着材料と呼ばれる 成分特に本発明の支持体材料、親和性材料またはフロー容器（flow vessel）と 同様に固相アッセイを行うのに必要とされる物質から調製することができるとい う利点がある。加えて、収着材料の充填及びアッセイを行うために使用すること ができる緩衝溶液を提供することができる。本発明の支持体材料は、固相アッセ イを行うための少なくとも１成分の特定濃度を持つ少なくとも１つの溶液の特定 量による１つの流動において、本発明の収着材料を充填することにより得ること ができる。支持体材料は少なくとも１つの成分が明らかに収着材料の最大収着容 量を下回り、収着材料のフリーの非特異的収着サイトがブロックされていること が更に好ましい。本発明の支持体材料は特異的な結合段階により他の本発明の支 持体材料に添加することもできる。 本発明の支持体材料は、特に、分子、分子群、または他の物質に親和性である 粒子からなる親和性材料を有する。特に、親和性材料は、酵素、酵素と相互作用 する基質、抗体、抗原、例えば、高分子物質または花粉または他のアレルギー源 、ハプテン、ビオチンまたはストレプトアビジン、ＲＮＡまたはＤＮＡ型の核酸 、特に他の核酸に結合することができる核酸、レセプターまたはレセプターのリ ガンド、ウイルス、バクテリア、細胞、細胞小器官、血液細胞、粒子、例えば 金属のコロイド状の粒子、酸化金属、ポリマー、または上記親和性材料の組み合 せからなる群から選ばれる。本発明の支持体材料は、非特異的物質が予め変性さ れずに分析物または収着材料を持つ分析物と結合することにより、本発明の収着 材料から調製することができる。 本発明の装置は、好ましくは、１以上の収着材料及び／または本発明の支持体 材料が配置されたルーメン内の中空体である。固相アッセイのための異なる成分 を持つ１以上の支持体材料が本発明の装置に配置されているなら、中空体を通る 均一な流れを、特に支持体材料の領域で確実にする方法で行われる。特に、副反 応を起こしてはならず、流れがより早いまたは遅い他の場所で他の領域が形成さ れないようにするべきである。この性質は支持体材料の標準化により基本的に決 定される。また、本発明では可能な限り正確な幾何学的な形（断面がフロー容器 の断面、つまり、フロー容器がシリンダー状、または対応する断面、つまり、フ ロー容器が長方形断面を持つ立方体に対応しているシリンダー）を持った収着ま たは支持体材料を正確に適合させることが重要である。収着及び／または支持体 材料は、緩いパッキングまたは中空体のルーメンに配置されたゲル状のものに固 定される。好ましくは、そのような手段は、流動体、特に分析物を含有する溶液 の均一な流れを有する。更に、特にその手段は、低いかまたは好ましくはまった く親和性材料に固有の非特異的収着性を持たない。 本発明の支持体材料の調製の方法は、本発明の収着材料をそれぞれ基本的に特 定量の液体中に特定濃度を持つ溶液中に存在する１以上の親和性材料で処理する ことからはじまる。これは一方では一群（batch）モードで行うことができ、好 ましくは、一方では収着材料が配置された入り口及び出口を持つ中空体中の均一 な継続流動において行う。後者の方法は、使用された濃度について高い支持体材 料の標準化及び均質な充填を非常に短い時間で機器の過度の消費なしに行なうこ とができるという利点がある。一群モードの比較充填では、収着材料の出口領域 がはじめに充填されるため非常に長時間を要し、継続流動モードに比べると内側 の表面も含むすべての物質が親和性材料と急激に結合する。加えて、後者の方 法では支持体材料を直接使用者が簡単な方法により調製することができる。しか し、これが好ましくない場合は、対応する支持体材料を大量調製し固相アッセイ を行う装置に充填することもできる。 本発明の支持体材料の本発明の調製方法の好ましい態様は、支持体材料のフリ ー収着サイトを行う固相アッセイ内の適当な物質でブロックしたものである。付 属的には支持体材料は１回または数回洗浄される。 少なくとも１つの本発明の収着材料が中空体のルーメンに配置された、多くの 分析パラメーター測定用のアッセイ用装置の調製方法も記載され、請求されてい る。中空体に配置されたそれぞれの層は、それぞれ継続流動において充填される 。フリーの非特異的吸着サイトはブロックされ、続いて類似した方法により次の 層が調製される。異なる充填支持体材料を予備的に調製し、それらをアッセイ装 置の層に適切に配置することも可能である。 本発明の収着材料及び／または本発明の支持体材料を用いた本発明の固相アッ セイは、成分が収着材料に吸着する固相アッセイ成分を持つ収着材料を処理し、 公知の方法で固相アッセイを行うことにより行われる。代わりに、固相アッセイ は準備段階、特に親和性材料で支持体材料を充填する段階で前処理された収着材 料で行うことができる。特に好ましい親和性カラムを用いて行われる固相アッセ イはDE 41 26 436 A1、42 08 732 A1、DE 195 00 862 A1において既に一般的に 記載されている。DE 195 00 862 A1は、精製、妨害成分または例えば親和性反応 に接近可能なアナライト（analyte）を唯一提供する反応の捕獲等の、固相アッ セイ領域の上の領域で行なうことができる検体溶液の第一反応を、これらの好ま しい親和性カラムの利点として記載している。この利点は、本発明の収着及び／ または支持体材料の固相アッセイとの関連においても利用することができる。 本発明の固相アッセイは、定量的分析が特に予め測定された分量の分析物溶液 中で行われる時、狭い範囲に標準化された収着及び定量的分析のための支持体 材料を用いた分析に適している。分析される溶液の体積が固相アッセイにおいて 一定に保たれるのならば、固相結合における可能な体積依存は除去される。 本発明の固相アッセイはパラメーターの効果、充填活動、孔サイズ、流す時間 及び収着材料の分量、流動修正のための付属的付加的手段（フリット、圧力）、 親和性材料の分量、分析溶液の件体定量、特に増幅及び流れの活動により特徴付 けられる。 固相アッセイは、本発明に使用される収着または支持体材料により温度に関係 なく標準化される。好ましくは、固相アッセイは親和性アッセイ、特にイムノア フィニティーアッセイとして行われる。 本発明の収着材料は、特に各使用者またはアッセイ研究者が彼らのアッセイ、 特にアフィニティーアッセイ、例えばイムノアッセイを調製または発展すること を可能にする、特に単純なアッセイの構成を可能にする。理論的に唯一必要なの は以下に示される、アフィニティーアッセイを調製及び／または行うための装置 である； − 本発明の収着材料により満たされたチューブを、チューブに満たされた本 発明の支持体材料を得るために捕らえて充填することを可能にする手段を 含有する装置 − 本発明の支持体材料によりチューブを充填するための他のまたは同じ手段 であって、検体とともに調製されるもの − 検出及び／または感度を高めるために行われる更なる結合反応 − 場合によっては洗浄の後に検体が溶出物により処理されて、本発明の支持 体材料にある特異的に結合した物質が分離し、及び／または使用したマー カーが溶解され、その溶出物が、 − 溶出検体，例えば、傾向または光学密度の特異的なパラメーターを検出可 能にする手段となるように収集され； − または、代わりに、測定が溶出物なしに、器の中で行われ、好ましくは、 平面的な容器の壁を通して測定が行える長方形のフロー容器の断面が適し ており、； − または代わりに、特定のパラメーターの測定が、流れ通した後に液体中で 行われる装置。 従って、本発明によれば、本発明のアフィニティーアッセイを調製及び／また は行うことを可能にする装置も請求している。使用者による自動アッセイ調製機 能を得られることがこの装置の利点である。装置は、特にチューブの形をした本 発明の収着材料により少なくとも部分的に満たされたまたは満たすことができる 少なくとも１つの中空体を捕らえるための手段を含有する。加えて、チューブま たは、本発明により記載された収着材料を得るために行う固相アッセイのための 成分により満たされたチューブ内に存在する収着材料の充填のための手段を提供 する。本発明の収着材料により満たされた少なくとも１つの中空体による手段も 提供される。好ましい態様では、本発明の装置は、固相アッセイの成分または分 析物を洗浄、結合または溶出するための溶液により少なくとも部分的に満たされ たチューブの少なくとも１つを処理する手段を持つ。本発明の装置を固相アッセ イの成分または分析物の検出のための単位と組み合せることは利点となる。 好ましくは、装置の手段は既に公知であるミクロタイトレーションフォーマッ トに適合する。従って、従来のミクロタイトレーションフォーマットに適合する 生物学的分析及び診察に使用される装置と適合及び使用することが有効であり、 可能である。フロー容器中の測定のために、本発明の手段、特に幾つかの支 持ベッドを有するものを適当な測定装置（読み取り装置）に適合させることも可 能である。第一に、親和性成分を有するアッセイ中に直接はアッセイ特異的親和 性材料をまだ有さない収着材料の標準化及び非特異的充填または支持体材料の特 異的充填は、従来のアッセイ配向操作に関して有用である手動のまたは自動のア ッセイ工程における検体配向操作を可能にする。 本発明の装置は、特に、タンパク質の結合用活性化固相マトリックスを含有す る、上底と下底が開いた小さい使い捨てカラムである。本発明の収着材料及び支 持体材料を有する本発明の装置は、１つの免疫学的アッセイ機器においてイムノ アッセイの利点（感度、選択性）、及びアフィニティークロマトグラフィーの利 点（高表面及び結合容量、試薬の流れ）が組み合わされている。活性化固相マト リックスは、流れている時に疎水性相互作用を介して主要な免疫学的反応パート ナーを吸着する。続いて、フリー結合サイトをブロックした後、免疫学的反応パ ートナーの安定性によって、すぐにアッセイ系に使用することまたは使用するま で保存することが可能である。本発明の装置は調製に10分しかかからず、調製及 び続くアッセイの操作が手動または自動での直後の捕獲により影響を受けるため 特に有利である。これは、操作が検体配向、例えばまだ特定されていない本発明 の装置がアッセイの直前またはアッセイ中のロスタイムなしに対応して特定する ことができるという利点を持つ。アッセイ系の操作は、イムノアッセイのデザイ ンと適合している。従って、独立した試薬流動中の固相の前調製に適用すること ができる、競合アッセイ、同様にサンドイッチアッセイを行うことができる。従 って、正確なアッセイは約10分以内で行うことができる。上記のように、本発明 の装置はミクロタイトレイション フォーマットの自動化実験台において操作す ることができ、特に、ミクロタイトレイションプレート検出器を用いて510nm、 場合によりは492nmで評価することができる。被覆、アッセイ操作及び評価から なる全体の工程は30分より以上に時間がかからず、より少ない時間、例えば、20 から25分の範囲で行われる。収着材料の脱気及び脱気された収着材料の充填は、 検体の充填、第二試薬の添加、標識物質の添加、付加的な洗浄段階、及び溶出段 階からなる正確なアッセイの工程を経る。 しかし、慣例の（ｒｏｕｔｉｎｅ）アッセイの工程に加えて、本発明の収着材 料は、本発明の装置及び自動化装置とともにアッセイを発展させるための特に有 利な方法に使用することもできる。従って、本発明の収着材料が提供された本発 明の装置は標準化及び特異的な被覆のために、抗原及び／抗体のカップリング緩 衝液により処理される。被覆は、好ましくは750μｌのカップリング緩衝液によ り行われる。特に適切なカップリング緩衝液は炭酸水素ナトリウム緩衝液である 。抗原及び抗体の種類により、カップリング緩衝液の含有塩及びpH値の変化が必 要となる。本発明の装置ごとの本発明の収着材料としての抗原または抗体の適用 量は、0.2から10μgであることが適当である。少ない充填のためには、垂直及び 水平の流れのどちらにも適するその断面積が小さいことから、例えば、支持ベッ ドごとが5mm x 16mmで高さ5mmである支持ベッド領域を持つフロー容器長方形断 面が有効である。フロー容器の上流は、異なる、特に大きい、広い充填体積を得 られる断面を持つことができる。残りのフリー非特異的結合サイトのブロッキン グは緩衝液中の免疫学的に挿入されたタンパク質により行われる。ブロッキング には、適度の非イオン化界面活性剤を含有するPBSが特に有効である。アッセイ 研究者は、簡単な実験によりアッセイのための検体の希釈を確立し、独自のカリ ブレイション曲線を確立するだけである。適切であり理論的なこの独自のカリブ レイション曲線（または、はい−またはいいえ試験（yes-or-no test）のための 境界領域の独自の確立）は、確認のための濃度（陽性検体と呼ばれる）の上の領 域で競合検体を運搬すること及び／または実施例７のはい−またはいいえ試験と 同様に陰性検体を用いて、異なる装置間での変化を平均化することにより好まし くは補足される。従って、感染−血清学アッセイのためには、１：301から１：1 001の範囲の検体希釈が有効であることが証明されている。本発明の装置の大き さから、適する検体体積は250μlである。第二抗体または抗原結合体としては、 特にビオチン化の程度が1:4＝タンパク質：ビオチンであるビオチン化試薬を使 用することができる。異なる第二反応パートナーのビオチン化は、均一な標識− ストレプトアビジン結合体の使用を可能にする。正確なアッセイのために、ビオ チン化の度合い及び使用する第二試薬の濃度はお互いに適合していな ければならない。前の実験では、使用者により提供された結合体の濃度は、３か ら15μg／mlの間であることが示された。本発明の装置において第二抗体が添加 された体積は好ましくは250μｌである。 染料標識としては、商品名アビオンレッド（Abion Red）で市販されている染 料結合体が特に有効であることが証明されている。アビオンレッドは、本発明の 装置に使用するためにも研究された染色−粒子結合体である。特に、それは、共 役連結し、非常に感度が高い(コロイダルゴールド（colloidal gold）よりも３ 倍の感度を持つ)。染色結合体はストレプトアビジンと共に提供された場合、ア ビオンレッドはビオチン化された試薬にカップリングする。アビオンレッドは独 国特許195 43 556．７．の目的物である。反応が完了した後、染色結合体は、ミ クロタイトレイションプレートへ300μlのエタノールにより溶出することができ 、その後、従来の光学測定器で510nmまたは492nmにおいて定量的に測定すること ができる。アビオンレッドは、付加的な色素反応なしに工学的な定量的測定を可 能にすることから、溶出なしにフロー容器での測定に特に適している。本発明の 支持体材料は、それを用いて行う結合反応がインキュベーションの時間及び温度 （15から35℃の間）に依存しないという利点を持つ。従って、１つの操作工程は が完了した後、次の段階をすぐに行うことができる。しかし、０から６分の間に 高特異的試薬が物理的効果を示した場合、アッセイを研究するにあったって反応 物理の影響を測定することが望ましい。 本発明の装置を用いてアッセイを行うために上記で既に概説された装置は、例 えば、分析実験室のようなアッセイの発展及び操作のどちらも使用できる自動化 機械の形で得ることができる。機械の生産量は、１時間ごとに本発明の装置が約 100である。 本発明により提供されるアッセイの利点は操作が検体側にあり、最近の慣例の 手順で行われるアッセイでの操作の基本的な依存を提供する。従って、分析のた めの対応するアッセイを正しく行うために操作すること、及び、従来の分析の ように対応する自動化された機械でそれぞれのアッセイが行われた後にのみアッ セイの全体結果を得ることができるように制限されたものよりも、全体を通して 検体を変性させることが可能である。従って、十分な数の検体を与えられたアッ セイが達成するまでの待機時間は不要である。 自動化機器は、緩衝液及びシステム液体等の異なるアッセイのための以下の試 薬としては、例えば、低または高界面活性剤濃度のPBS、水、エタノール及びカ ップリング緩衝液を使用することができる。試薬としては、染料−標識濃縮物、 ブロッキング試薬、BSA、抗ヒトIgG、抗ヒトIgM、抗ヒトIgA、好ましくはビオチ ン化されたものが提供され、被覆されていない収着材料が本発明の装置において 提供される。自動化機器自体に装備された手段は、ミクロタイトレイションプレ ート、第一及び第二検体チューブのためのバーコードレーザー（bar code laser ）を持つ検体ホルダー、それぞれに必要なフィルターを有するミクロタイトレイ ションプレートフォトメーター、及び対応するソフトを有するデーター解析機器 である。この自動化機器は上記の方法上記の段階により行われる。フロー容器で 評価が行われる時、自動化機器はミクロタイトレイションプレート及びミクロタ イトレイションプレートフォトメーターの代わりに対応する検出装置を含有する 。 従って、被覆された支持体材料を有する本発明の収着材料及びアフィニティー アッセイの調製及び操作のための自動化装置と関連した支持体材料の対応する調 製方法は、誰もが複雑な及び高価な機械構造なしにアフィニティーアッセイを作 ることができる完全に新規な概念を提供する。 本発明によれば、本発明の支持体材料または収着材料を含有するキットであっ て、シリンダー状の中空体が入り口及び出口を持ち、その中の支持体材料または 収着材料が好ましくは中空体に既に配置されており、本発明の収着材料の充填の ための水溶液が既に親和性材料を溶解または保存可能な状態で親和性材料を分離 した形をしており、及び付加的に本発明の収着材料の充填のためのが既に親和 性材料をその中に溶解している非水溶性溶液かまたは親和性材料が保存可能な状 態でキットの中に別にあるか、同様に付加的に固相アッセイを行うための水溶液 も、更なる付加的な補助試薬または固相アッセイを行うための装置を除いた装置 も請求している。 キットの通常の態様は、イムノアッセイ研究のために約200カラム含有してい る。更に、それは洗浄緩衝液、ブロッキング試薬、溶出液、高感度粒子懸濁染料 、ミクロタイトレイションプレートの補助試薬、ミクロタイトレイションプレー トフォーマットを有する96個の本発明の装置のための懸濁用ラック、プレキシガ ラス(Plexigalss)ラック、廃物タンク、標準血清を含む24アッセイのためのアッ セイ特異的試薬、及び更なる補足物、例えば方向指示器等を含有している。規則 的には、キットは２年までの長期間において未開封ならば保存可能である。 本発明の収着材料または支持体材料は、本発明の装置という形で、ウイルスや バクテリアとも共に充填されていないか慣例の確認のために使用することもでき る。従って、例えば、血液バンクの血液製剤についてHIV、肝炎、梅毒素等の試 験をすることができる。他の感染成分例えばＢ型肝炎各抗原及びCMVは、現時点 においてはまだ試験されていない。後者は衛生的危険性はないが、これらの病原 菌と同様にアッセイされることが望ましい。しかし、今日までそれが行われなか ったのは経済的な観点のためであった。しかし、本発明の目的としていることは 、高感度で血液製剤の場合において数人の提供者からの集合体（ｐｏｏｌｅｄ血 清）の試験を可能にする試験の基礎を形成する。本発明の目的のために行うこと ができるアッセイは、対応する独自の試験と同じ感度を持つ特異的な抗体の存在 により、幾つかの血清の集合、例えば10つの血清までを試験することができる。 好ましくは、通称サンドイッチアッセイは、検体の強化が本発明の収着材料を用 いて継続的流動中で達成できるため使用することができる。アッセイは比較的ま れに陽性の結果が起こると考えられる抗原に、また多くの血清が試験される場合 にはいつでも適当である。これは、血液バンクの血液製剤のウイルスについての 安全性を明らかに高めることを経済的に考慮可能な消費で可能にする。自動 化された血液群の試験（自動化コンブス（Coombs）試験）は、本発明により達成 することができる。血液の提供があるごとに、また提供された血液が投与される 時に、血液群の試験は行われなければならない。この試験は、国際的に法的に処 方されている。入手可能な試験方法は信頼できるが、自動化されていないアッセ イの遠心段階による時間的な比較的に高い消費を含んでいる。本発明の収着材料 または支持体材料は、特に血液バンクの及び病院の早い及び自動化された血液群 の試験を可能にする。本発明の工程の改定版は血液群抗原に対する特異的な抗体 の分類に応用することができる。 更に、例えば、バクテリアヘリオバクターピロリ （Heliobacter pylori）は 胃潰瘍の治療が組み合わさった診察のために血清学的に試験することができる。 本発明は更に以下の実施例において説明される。実施例１ 血清中のジフテリア抗体レベルの測定及びカリブレイション曲線の独自の確立 材料： 円形ポリエチレンフリット、半径5mm、高さ5mm、流動溶液の断面に正確に適合 するもの、スクリーニングによる狭い範囲の粒サイズ分布を有するポリエチレン 粉末からの焼結により調製される濾過シートからパンチされるもの（粒の大きさ が250μm未満）；標準粒サイズ50μm(泡点)、5.492から138.6μmのコウラターポ ロメーター（Coulter Porometer）により測定された孔サイズ分布、平均孔サイ ズ13.64μm、27.5μmより以上の孔が1.063%；15.92μmより以上のものが15.45% （アビオン（Abion）GmbH、ジューリック(Julich)、独国）； DE 41 26 436 A1の円錐先細低サイトを有する空の円形フロー容器、半径５mm、 円錐サイトの上先端に適合した高さ5mmのフリットを通る検体溶液の容量、約0.8 ml(アビオンGmbH、ジューリック、独国) SVMのジフテリア毒素、NL-3723 BGビルソーベン(Bilthoven)、オランダ； ビオチン化抗−ヒトIgG抗体(シグマ(Sigama)、ムニック(Munich)、No．B-1140) ； アビオンレッド／ストレプトアビジン結合体、アビオンGmbHジューリック； ジフテリア陽性血清1.7IU/ml(IU=国際単位)及びジフテリア陰性血清(アビオンGm bHジューリック)； 完全エタノール95体積%; カップリング緩衝液:0.1M炭酸水素ナトリウム/炭酸ナトリウム、pH9.2; ブロッキング緩衝液:0.1Mリン酸ナトリウム、0.1M塩化ナトリウム、1%BSA(ウシ 血清アルブミン)、0.005%トウイーン（Tween）20、pH7.25; 洗浄及び希釈緩衝液:ブロッキング緩衝液と同様、しがしBSAなし。 手順: 基本的に折れ曲がっていないフリットは、及びフロー容器の円錐部分の上先端で の流動方向に対して正確に垂直である配向に個々に挿入される。標準化を妨害す る、調製工程から得られたフリットに含有されたフリー粒子、特に結合していな いポリエチレン粉末粒子、研磨剤及び他の粉末は、過度の洗浄により除去される 。 洗浄は少なくとも２回、エタノール750μl及び２回蒸留された水750μlを用いて 行われる。フリットの脱気が必要な場合は、洗浄は微量の圧力下で行われる。加 えて、洗浄及び／または脱気作業を改善するためには、幾つかの洗浄段階におい て流動方向を逆にすることができる。それぞれのフリット群の調製後の確認は望 ましく、後続のアフィニティーアッセイでの検体溶液により得られる測定信号の 均一性を介して行われる。最後に、フリットはカップリング緩衝液750μlでそれ ぞれ洗浄される。 抗原のカップリング: ジフテリア毒素の溶液は、最終濃度が５μl/mlになるようにカップリング緩衝液 で希釈される。完全な分量で毒素を3.75μg含有するこの溶液のそれぞれ750μl をそれぞれのフロー容器に挿入フリットを用いて充填する。自由重力による流動 （流す時間は約６分）において、特に均一な結合から見られる、基本的に一定の 分量の毒素を非特異的に吸着したフリットは、後で、一定濃度の相補的なヒト抗 −ジフテリアIgGを測定に使用される。フリットの自由粒子の大まかな洗浄なし では、 有用な信号は得ることができない。その後、残ったフリットの非特異的吸着サイ トはそれぞれブロッキング緩衝液750μlで充填され、その後洗浄緩衝液750μlに より洗浄する。このようにして調製された容器を、以下試験容器と呼ぶ。 ジフテリア血清は濃度が、10、7.5、5、2.5、0.75、0.5、0.25、及び0.1mIU/m lになるように洗浄緩衝液で希釈される。ビオチン化された第二抗体は6μg/mlに なるように希釈され、アビオンレッド結合体は1:40の比率で希釈される。試験容 器はそれぞれの希釈検体250μlで、次にビオチン化抗体の溶液250μlで、そして アビオンレッド結合体250μlで充填される。洗浄緩衝液750μlで洗浄した後、そ れぞれエタノール300μlで溶出が行われた。参照（エタノール95体積%）に対し て溶出物の光学密度がＥＬＩＳＡ検出器492nmで測定された。この時点における 全ての同じ群の材料の測定により設定されたカリブレイション曲 線を図１に示す。測定点ごとに少なくとも10の測定によりカリブレイション曲線 は設定され、変分定数（variation coefficient）が8%(標準偏差／平均値x100) であった。 小蛍光標識分子を用いて得られた結果と比較して、半径が約100から200nmである 大染料粒子、例えばアビオンレッド標識は、濃度及び信号間の関係が正比例でな く、試験容器の充填範囲が低濃度領域においてのみ直線的であるという結果を得 た。これは、光学密度及びここで試験されたアッセイの大きい粒子の活動につい ての測定方法の両方から言うことができる。実施例２ 血清中の破傷風抗体の測定及びカリブレイション曲線における蛍光及び染料標 識の比較 材料: 以下の点を除き実施例１と同様: 破傷風毒素SVM、NL-3723 BGビルソーベン、オランダ; 破傷風陽性血清14.1IU/ml(IU=国際単位);及び 破傷風陰性血清(アビオンGmbHジューリック); 1:20希釈のアビオンレッド結合体; FITCストレプトアビジン結合体、製造デアノバ(Disnova)、ハンブルグ; カップリング緩衝液pH9.5. 手順: 以下を除き実施例１と同様である: 破傷風血清の洗浄緩衝液での希釈濃度は、10、7、4、2.44、2、1.51、1、0.74、 0.5、0.244、及び0.1mIU/ml、及びFITC結合体溶液中の比率は1:251。 検体充填:検体溶液750μl 染料標識の場合の曲線関係と比較して直線的な、試験容器の充填領域での蛍光標 識の信号及び濃度の関係を図２に示す。実施例３ この実施例は、破傷風抗体血清レベルの測定及びそのアビオンレッド標識のカリ ブレイション曲線の4℃がら39℃までの温度依存性を含む。実験は、少ない血清 希釈物を使用する以外は、実施例２と同様に行われる；全ての材料は４℃、18℃ または39℃ですぐに使用される。図３より、カリブレイション及び測定は、試験 容器の容量領域の温度範囲において、正確な測定内で温度に依存していないこと がしめされた。実施例４ この実施例は、破傷風抗体血清レベルの測定における抗原充填依存性及びアビオ ンレッド標識またはFITC標識のカリブレイション曲線を含む。 a) 充填の上の濃度範囲、アビオンレッド 工程は少ない血清希釈が使用される以外は、実施例２と同じである；アビオ ンレッドの希釈は1:20、毒素５μg/ml及び10μg/mlを用いた抗原カップリングは (それぞれ完全分量は3.75μg及び7.5μg)。 図４より、この充填範囲における充填には信号が依存していないことが示さ れた。 b) 充填の低い濃度範囲、FITCレベル 工程は実施例２と同じである;抗原カップリング5μg/m、2.5μg/ml、及び1. 25μg/ml(完全値3.75μg、1.88μg、及び0.94μg)。 血清希釈は7.5、5.55、3.75、1.83、0.75、0.375、及び0.183mIU/ml；検体 の充填：50μl。 図５より、信号が好ましくは充填領域の充填に依存していることが示された 。 c) 同完全分量での充填領域の定量 実験は実施例４に記載の方法と同じ方法で行なわれたb)；抗原カップリング 2.5μg/mlでは750μｌ及び7.5μg/mlでは250μl。 図６は、蛍光標識では２つの充填の間に違いはないことを示している。しか し、アッセイの調製は、結合サイトのより良い分布を達成するために、高充填体 積で行なうことが望ましい。そのような分布は、より良い分布はではより良い信 号が得られるため、大きい染料標識粒子による接近には有利である。実施例５ この実施例は破傷風及びジフテリア抗体血清レベルにより試験される検体溶液の 分量にたいする依存性を含む。 a) FITC標識では: 実験は実施例４と同様に行なわれた; カップリング緩衝液750μｌ中の破傷風毒素3.75μg（完全）により充填; 洗浄緩衝液750μl、250μl、50μl及び10μl中、同量の完全分量ヒト−破傷 風IgG。検体定量への高信号依存性が図７に示されている。この範囲では、50μl の測定では最強信号を得、この分量は信号光学活性について実験したアッセイに はこれらの中で最も適するものであった。100μlまでの範囲においても信頼でき る信号を得たが、10μlでの高信号値は高懸濁液であるため好ましくない。しか し、本発明の支持体材料を用いたアッセイも低分量で行なうことができる。 b) アビオンレッド標識 工程は実施例１と同様である;フリット:高さ3.2mm、標準孔サイズ3μm、コウラ ターポロメーターでの孔サイズ測定3.156から80.33μm、平均孔サイズ6.046μm 、11.25μmより以上の孔の数0.304%、血清検体0.77、0.5及び0.25μIU(完全)。 検体分量への信号の高依存性はこの場合の図８で見ることができ、750μｌがこ の標識の適する検体体積であることが分かった。実施例６ この実施例は、アビオンレッド標識によるジフテリア抗体血清レベルの測定の孔 サイズ依存性を含む。 実験は実施例５b)と同様に行なわれる。検体定量は，3.08、２及び1mIU/mlで250 μl;標準孔サイズが100、50、35及び３μmであるフリットが使用された。信号の 孔半径依存性は図９に見ることができる。実施例７ ウイルス性抗原（インフルエンザA2、H3N2型）に対するIgG抗体の測定 このイムノアッセイはヒト血清中のIgG抗体の定量的測定のために行なわれる。 ヒト血清中の抗体は、固体マトリックスに不動化された抗原と免疫複合体(イン フルエンザ ウイルスA2、H3N2型)を形成する。この複合体に対して抗−ヒトIgG ／ビオチン結合体が結合する。 アビオンレッドは特にストレプトアビジンを介してビオチン結合体に結合する。 エタノール300μlによりミクロタイトレーションプレートへ溶出される、深紅染 料複合体が（陽性検体と共に）形成され、ミクロタイトレーションプレート測定 器で510nm（場合によりは92nm）で測定される。結合していない反応パートナー は、洗浄工程により第一に除去される。この実施例では、本発明の装置、エタノ ール(完全、未−変性)、カップリング緩衝液、高界面活性剤含有PBS、蒸留水、 アビオンレッド、抗体−ヒトIgG(モノクローナル)、(インフルエンザA2ウイルス 抗原H2N2型)、インフルエンザA2陰性参照血清及びインフルエンザA2陽性血清が 使用される。 本発明の装置はアッセイ自動化機器の検体サプライ(supply)で懸濁され、洗浄タ ンクの上に配置される。本発明の装置はシャープジェットの多ピペット（multip ipette）から直接エタノール500μlを充填すること、及び、本発明の装置の継続 流動（約２分間）中に通過した液体の量により脱気される。そして、 50体積%エタノール500μlが多ピペットで充填される。 カップリング緩衝液中に、インフルエンザA2ウイルス抗原はタンパク質量が2.5 μg/mlになるように調製され、この溶液750μlが本発明の装置に適用された。流 す時間は典型的な場合４分とする。被覆の後、本発明の装置は高トイーン（Twee n）含量PBS 750μlでブロック（約３分間）し、インフルエンザアッセイの準備 が完了する。場合によりは、６カ月まで保存可能である。保存は冷蔵庫中で4℃ で、例えば、バクテリサイド（bacterizide）としてアジ化ナトリウムを含有す るPBS緩衝液中で行なう。直ぐに使用しない幾つかの装置が調製された場合、既 に調製された装置は約14日間密封プラスチック袋で保存することもできる。 アッセイを行なうために、調製された必要な量の装置は担体ラックに懸濁され、 洗浄タンクを上に配置される。試験する血清、陰性及び陽性参照は、高トイーン 含量PBSで1:101に希釈し、その250μlを本発明の装置に適用する。流す時間は典 型的な場合約２分である。インキュベイション時間は結果を改善しないので、そ れらは完全に分配する。ビオチン化モノクローナル第二抗体（抗−ヒトIgG９は 同じ緩衝液で15μg/mlに希釈し、その250μlを本発明の装置に適用する。流す時 間は約２分である。その後アビオンレッドは同じ緩衝液で1:30に希釈され、その 250μlが本発明の装置に適用された。この場合も流す時間は約２分である。蒸留 水750μlでの洗浄段階が望ましい。流す時間はこの場合も約２分である。その後 、本発明の装置を置いたキャリア（carrier）ラックはミクロタイトレイション プレート上に配置される。本発明の装置はエタノール300μlでミクロタイトレイ ションプレートへ溶出される。この段階は約３分かかる。その後、ミクロタイト レイションプレートは遅延なしにMTP測定器で510nmで、場合によりは492nmで、 ブランク用エタノール300μlに対して測定される。実施例８ 相補的ペプチドC₃aの定量的測定のためのサンドイッチイムノアッセイ 凝固系の活性化ではインターアリア(inter alia)、アナフィラトキシンとも呼 ばれる分裂生成物C3aが形成される。記載のアッセイによって、C3aの定量的測定 を行なうことができる。第一段階では、ヒト血漿に存在する凝固ペプチドは固体 マトリックスに不動化されたモノクローナル抗体に結合する。この複合体に第二 ビオチン化モノクローナル抗体がC3aに結合する。 染料アビオンレッド端特異的にストレプトアビジンを介してビオチン結合体に 結合する。エタノール（96％）300μlでミクロタイトレイションプレートへ溶出 された赤色染料複合体が（陽性検体から）形成され、MTP光測定器で510nmで、（ 場合により492nmで）測定された。結合していない反応パートナーは洗浄操作に より除去される。本発明の装置の調製及び被覆は、抗体としてC3a抗体が使用さ れる以外は、先の実施例と同様に行なわれる。抗−C3a抗体の濃度は３g/mlであ る。ブロッキングは高比率のトイーンを含有するPBS緩衝液750μlにより行なわ れる。工程は先の実施例に記載されている。第二抗体は上記の緩衝液で20μg/ml に希釈する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９８年１月１５日（１９９８．１．１５） 【補正内容】 請求の範囲 １． ポリスチレンビーズ及びデキストリンを除く、形状物の形態、ゲルの形態 、膜または膜に埋め込まれた状態または懸濁液状の収着材料であって、上記収着 材料は親和性材料に非特異的に結合でき、かつ流動体に透過性であり、 − 上記収着材料は0.1から100μmの平均孔半径を持ち、 − 上記収着材料は親和性材料に対して非特異的収着性がないかまたはとて も低い非特異的収着性を持ち、 − 上記収着材料は、±40%より以上でない平均充填値付近の幾つかの統計 的に適切な充填の間で変化する分量において、一定濃度を持つ上記親和 性材料溶液の一定分量が均一に一度流れ通った時、収着材料で満たされ た一定単位体積が収着される親和性材料を結合するという規定によって 標準化され；及び − フリー非特異的収着サイトの後続ブロッキングにおいて、及び幾つかの収 着材料での後続の適当な流動工程、例えば、親和性材料により充填された 収着材料の洗浄、または親和−反応性材料の提供において、上記範囲内で 定量的結合が一定に保たれる ことを特徴とする収着材料。 ２． 充填値の上記変化が４から40℃の範囲で基本的に温度非依存性であること を特徴とする請求項１に記載の収着材料。 ３． 上記収着材料が基本的に疎水性及び／または親和性表面を持つことを特 徴とする請求項１及び／または２のいずれかに記載の収着材料。 ４． 上記収着材料が焼結有機または無機材料からなることを特徴とする請求項 １から３に記載の収着材料。 ５． 上記焼結材料がサーモプラスチック粒子、例えばポリエチレンまたはポリ スチレンからなることを特徴とする請求項１から４の少なくとも１項に記載の収 着材料。 ６． 上記収着材料が、ゲルの形態、ゲルの形態、膜または膜に埋め込まれた状 態、または、例えば、フリットのような自己支持形状物であることを特徴とする 請求項１から５の少なくとも１項に記載の収着材料。 ７． 特に網目状の泡状プラスチック、中空繊維、配向シート、複合または多層 材料、セラミック材料、ゼオライト、金属、酸化金属、アロイ、ガラスまたは炭 素、またはそれらの組合せの混合物または層状シートが上記収着材料を形成する ことを特徴とする請求項１から３の少なくとも１項に記載の収着材料。 ８． タンパク質のような生体高分子による被覆、疎水性化及び／または親水性 化によりその表面を変性させることにより得ることができる請求項１から７の少 なくとも１項に記載の収着材料。 ９． 形状物の形態、粒子状収着材料の緩いパッキング、ゲルの形態、膜または 膜に埋め込まれたもの、または懸濁液としての固相アッセイを行なうための支持 体材料であって、上記支持体材料は固相アッセイを行なうための少なくとも１つ の成分を持ち、流動体に透過性があり、 − 上記支持体材料は0.1から100μmの平均孔半径を有し; − 上記支持体材料は親和性材料に対する非特異的収着性が無いか、又はとて も低い、 − 上記支持体材料は、±40%より以上でない平均充填値付近の幾つかの統計 的に適切な充填の間で変化する分量において、一定濃度を持つ上記相捕的 成分を有する上記相捕的成分希釈溶液の一定量が均一に一度流れ通った時 、 支持体材料の一定単位体積に存在する固相アッセイを行なうための成分 （親和性材料）がその相補的成分に特異的に結合するという規定によって 標準化され；及び − 定量結合は、支持体材料に適する液体による幾つかの後続の流す工程、例 えば特異的または非特異的収着サイトのブロッキング、固相アッセイを行 なうための成分により充填された支持体材料の洗浄、及び親和−反応性材 料の提供においても提示される範囲内で一定に保たれる ことを特徴とするもの。 １０．固相アッセイを行なうための少なくとも１つの成分について特定濃度を有 する少なくとも１つの溶液について特定量の継続的な流れ中で、請求項１から８ の少なくとも１項に記載の粒子状の緩いパッキングの形態をしたものでもある収 着材料を充填することにより得ることができる収着材料であって、固相アッセイ を行なうための少なくとも１つの上記成分が、非特異的に収着材料に直接結合す るか、または非特異的または特異的に間接的に少なくとも１つの収着材料に結合 した成分に結合する、請求項９に記載の支持体材料。 １１．上記支持体材料が、収着材料の最大収着容量より少ない、固相アッセイを 行なうための少なくとも１つの成分を有し、収着材料のフリー収着サ イトがブロックされていることを特徴とする請求項８及び／または９に記載の収 着材料。 １２．上記親和性材料が、分子、分子群または他の物質に対して親和性を有する 粒子からなることを特徴とする請求項９から１１の少なくとも１項に記載の支持 体材料。 １３． 上記親和性材料が、酵素、酵素と相互作用する基質、抗体、抗原、例え ば高分子物質または花粉、ハプテン、ビオチンまたはストレプトアビジン、ＲＮ ＡまたはＤＮＡ型の核酸、特に他の核酸に結合することができる核酸、レセプタ ーまたはレセプターのリガンド、ウイルス、バクテリア、細胞、細胞小器官、血 液細胞、粒子、例えば金属のコロイド状の粒子、酸化金属、ポリマー、または上 記親和性材料の組み合せからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１２に 記載の支持体材料。 １４． １以上の請求項１から８のいずれかに記載の収着材料及び／または少な くとも１つの粒子状の緩いパッキング形態の収着材料及び／または少なくとも１ つの請求項９から１３のいずれかに記載の支持体材料及び／または請求項９から １３のいずれかに記載の固相アッセイのための異なる成分を有する幾つかの支持 体材料が均−な流れを確立するために配置されているルーメン内の中空体を持つ 装置。 １５． 上記収着及び／または支持体材料が、中空体のルーメン中に配置されて いる緩いパッキング、膜、シートまたはゲルの形態で固定されていることを特徴 とする請求項１４に記載の装置。 １６． 均一な流れ及び／または特定流速を確実にし、かつ上記収着または支持 体材料に吸着された上記親和性材料のための固有の非特異的収着性 が無いかまたは低い手段が提供されていることを特徴とする請求項１４及び／ま たは１５に記載の装置。 １７． 請求項１から８のいずれかに記載の収着材料の調製方法であって、標準 化に； − 焼結可能材料の場合、上記材料の特定スクリーニング分画が焼結され、 及び − 他の収着材料の場合、上記材料の孔形成が狭い孔サイズ分布を達成する ために制御され、後処理が場合によって行なわれ；どちらの場合も、 − 突き出した緩い粒子及び物質が収着材料から除去され、特に形状形成段 階においても行なわれる ことを特徴とする方法。 １８． 収着または支持体材料を得るための出発材料の上記標準化が、中空体を 有する装置で行なわれることを特徴とする請求項１７に記載の方法。 １９． フリー収着サイトのブロッキング及び場合によっては洗浄段階が続く、 それぞれ特定の濃度を特定量の液体中で有する溶液中で、特に収着材料が配置さ れた入口及び出口を有する中空体中の均一流動内で１以上の親和性材料によって 請求項１から８のいずれかに記載の緩いパッキング形態においても収着材料が処 理される、但し、上記収着材料に吸収される親和性材料がアッセイ特異的親和性 材料を結合させるために、場合により使用される請求項９から１３に記載の支持 体材料の調製方法。 ２０． 請求項１から８の少なくとも１項に記載の少なくとも１つの収着材料が 、緩いパッキング形態であっても中空体に配置される、分析パラメーターの数の 測定のためのアッセイを行なうための装置の調製方法であって、中空体に配置さ れたそれぞれの層がそれぞれ継続的流動において充填され、フリーサイトがブロ ックされ、続いて次の層が類似方法で調製されることを特徴とする方法。 ２１． 請求項１から８の少なくとも１項に記載の収着材料、加えて緩いパッキ ング形態の収着材料及び／または請求項９から１３の少なくとも１項に記載の支 持体材料の固相アッセイにおける使用であって、収着材料が固相アッセイで使用 される成分により処理され、及び上記成分が収着材料に付着し、または、その後 、固相アッセイが行なわれるかまたは予備的な段階で処理された収着材料上で固 相アッセイが行なわれることを特徴とする使用。 ２２． 一定量の分析溶液が使用される時に、定量的分析のために標準化される ことを特徴とする請求項２１に記載の固相アッセイ。 ２３． 温度非依存性標準化を特徴とする請求項２２に記載の固相アッセイ。 ２４． 親和性アッセイ、特にイムノアフィニティーアッセイとしてデザインさ れたことを特徴とする請求項２１から２３の少なくとも１項に記載の固相アッセ イ。 ２５． 低減または増加された圧力をかけること、または流動体の流速に影響を 及ぼす中空体内の部分、例えば適切なフリットを利用することにより、収着材料 の、充填、及び／または、請求項２１から２４のいずれかに記載の固相アッセイ の親和反応を行なうための方法。 ２６． 固相アッセイを行なうための更なる付加的な補足試薬または装置を除く 、請求項９から１３に記載の支持体材料または請求項１から８に記載の収着材料 、加えて緩いパッキング形態の収着材料、上記支持体材料または収着材料が好ま しくは既に中空体に配置されいる入口及び出口を有するシリンダー状中空体、既 に親和性材料をその中に溶解して含有または保存可能な状態で親和性材料から分 離され本発明の収着材料の充填のための水溶液、及び場合によっては固相アッセ イを行なうための溶液を含むキット。 ２７． 請求項１から８の少なくとも１項に記載の収着材料、加えて緩いパッキ ング形態の収着材料により少なくとも部分的に満たされるか、または満たすこと が可能な少なくとも１つの中空体、特にチューブを捕らえるための手段、及び請 求項９から１３の少なくとも１項に記載の支持体材料を得るための固相アッセイ を行なうための成分を持つチューブ内に存在する収着材料の充填のための手段、 または請求項９から１３の少なくとも１項に記載の支持体材料により満たされた または満たされることが可能な少なくとも１つの中空体を含む手段を含む請求項 ２１から２４の少なくとも１項に記載のアフィニティーアッセイを調製及び／ま たは行なうための装置。 ２８． 上記少なくとも１つが洗浄、結合及び／または固相アッセイ成分の溶出 のための溶液または分析物により少なくとも部分的に満たされる充填野ための手 段、及び場合によっては、流れでたもの及び／または溶出物を得た後の、液体中 の中空体内のアッセイ成分または分析物の測定のための手段を含む請求項２７に 記載の装置。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＥＥ，ＧＥ， ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 エルハルト ウルスラ ドイツ連邦共和国、ユーリッヒ Ｄ― 52428、カール―ハインツ―ベッカルツ― シュトラーセ 13、アヴィオン ベタイリ グンクス― ウント フェルヴァルトゥン クス―ゲゼルシャフト ミットベシュレン クテルハフツング (72)発明者 エルハルト クリストフ ドイツ連邦共和国、ユーリッヒ Ｄ― 52428、カール―ハインツ―ベッカルツ― シュトラーセ 13、アヴィオン ベタイリ グンクス― ウント フェルヴァルトゥン クス―ゲゼルシャフト ミットベシュレン クテルハフツング

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 形状物の形態、粒子状の収着材料の緩いパッキング、ゲルの形態、膜また は膜に埋め込まれた状態または懸濁液としての収着材料であって、上記収着材料 は親和性材料に非特異的に結合でき、かつ流動体に透過性であり、 − 上記収着材料は0.1から100μmの平均孔半径を持ち、 − 上記収着材料は収着材料を通って流れる上記親和性材料に非特異的に結 合し、 − 上記収着材料は、±40%より以上でない平均充填値付近の幾つかの統計 的に適切な充填の間で変化する分量において、一定濃度を持つ上記親和 性材料溶液の一定分量が均一に一度流れ通った時、収着材料で満たされ た一定単位体積が収着される親和性材料を結合するという規定によって 標準化され；及び − フリー非特異的収着サイトの後続ブロッキングにおいて、及び幾つかの 収着材料での後続の適当な流動工程、例えば、親和性材料により充填さ れた収着材料の洗浄、または親和−反応性材料の提供において、上記範 囲内で定量的結合が一定に保たれる ことを特徴とする収着材料。 ２． 上記充填値の変化が４から40℃の範囲で基本的に温度非依存性であること を特徴とする請求項１に記載の収着材料。 ３． 上記収着材料が基本的に疎水性及び／または親和性の表面を有すること を特徴とする請求項１及び／または２のいずれかに記載の収着材料。 ４． 上記収着材料が焼結有機または無機材料からなることを特徴とする請求項 １から３に記載の収着材料。 ５． 上記焼結材料がサーモプラスチック粒子、例えばポリエチレンまたはポリ スチレンからなることを特徴とする請求項１から４の少なくとも１項に記載の収 着材料。 ６． 上記収着材料が、緩いパッキングまたはゲルのための粒子形態、ゲル様形 態、膜または膜に埋め込まれたもの、または例えば、フリットなどの自己支持形 状物であることを特徴とする請求項１から５の少なくとも１項に記載の収着材料 。 ７． 特に網目状の発泡プラスチック、中空繊維、配向シート、複合または多層 材料、セラミック材料、ゼオライト、金属、酸化金属、合金、ガラスまたは炭素 、またはそれらの組合せの混合物または層状シートが上記収着材料を形成するこ とを特徴とする請求項１から３の少なくとも１項に記載の収着材料。 ８． タンパク質のような生体高分子による被覆、疎水性化及び／または親水性 化によりその表面を変性させることにより得ることができる請求項１から７の少 なくとも１項に記載の収着材料。 ９． 形状物の形態、粒子状の収着材料の緩いパッキング、ゲルの形態、膜また は膜に埋め込まれたもの、または懸濁液としての固相アッセイを行なうための支 持体材料であって、上記支持体材料は固相アッセイを行なうための少なくとも１ つの成分を持ち、流動体に透過性があり、 − 上記支持体材料は0.1から100μmの平均孔半径を有し； − 上記支持体材料は親和性材料に対する非特異的収着性が無いか又はとても 低く、 − 上記支持体材料は、±40％より以上でない平均充填値付近の幾つかの統計 的に適切な充填の間で変化する分量において、一定濃度を持つ上記相捕的 成分を有する上記相捕的成分希釈溶液の一定量が均一に一度流れ通った時 、 支持体材料の一定単位体積に存在する固相アッセイを行なうための成分 （親和性材料）がその相補的成分に特異的に結合するという規定によって 標準化され；及び − 定量結合は、支持体材料に適する液体による幾つかの後続の流動工程、例 えば特異的または非特異的収着サイトのブロッキング、固相アッセイを行 なうための成分により充填された支持体材料の洗浄、及び親和−反応性材 料の提供においても提示される範囲内で一定に保たれる ことを特徴とするもの。 １０．固相アッセイを行なうための少なくとも１つの成分について特定の濃度を 有する少なくとも１つの溶液について特定の分量の継続的流動中で、請求項１か ら８の少なくとも１項に記載の収着材料を充填することにより得ることができる 収着材料であって、固相アッセイを行なうための少なくとも１つの上記成分が、 非特異的に収着材料に直接、または非特異的または特異的に間接的に少なくとも １つの収着材料に結合した成分に結合している、請求項９に記載の収着材料。 １１．上記支持体材料が、収着材料の最大収着容量より少ない、固相アッセイを 行なうための少なくとも１つの成分を有し、収着材料のフリー収着サ イトがブロックされていることを特徴とする請求項８及び／または９に記載の収 着材料。 １２．上記親和性材料が分子、分子群または他の物質に親和性を有する粒子から なることを特徴とする請求項９から１１の少なくとも１項に記載の収着材料。 １３．上記親和性材料が酵素、酵素と相互作用する基質、抗体、抗原、例えば高 分子物質または花粉、ハプテン、ビオチンまたはストレプトアビジン、ＲＮＡま たはＤＮＡ型の核酸、特に他の核酸に結合することができる核酸、レセプターま たはレセプターのリガンド、ウイルス、バクテリア、細胞、細胞小器官、血液細 胞、粒子、例えば金属のコロイド状の粒子、酸化金属、ポリマー、または上記親 和性材料の組み合せからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１２に記載 の支持体材料。 １４．請求項１から８のいずれかに記載の収着材料及び／または請求項９から１ ３のいずれかに記載の、少なくとも１つの支持体材料及び／または請求項９から １３に記載の固相アッセイのための異なる成分を持つ、幾つかの支持体材料が均 一な流れを確立するために配置されているのルーメン内に中空体を持つ装置。 １５．上記収着及び／または支持体材料が緩いパッキング、膜、シートまたはゲ ルの形態で固定され、それによって中空体のルーメン中に配置されていることを 特徴とする請求項１４に記載の装置。 １６．均一な流れ及び／または特定の流速を確実にし、かつ上記収着または支持 体材料に吸着された上記親和性材料のための固有の非特異的収着性が無いかまた は低い手段が提供されていることを特徴とする請求項１４及び／または１５に記 載の装置。 １７．請求項１から８のいずれかに記載の収着材料の調製方法であって、標準化 に； − 焼結可能材料の場合、上記材料の特異的スクリーニング分画が焼結され、 及び − 他の収着材料の場合、上記材料の孔形成が狭い孔サイズ分布を達成するた めに制御され、後処理が場合によって行なわれ；どちらの場合も、 − 突き出した緩い粒子及び物質が収着材料から除去され、特に形態形成段階 においても行なわれる ことを特徴とする方法。 １８．収着または支持体材料を得るための出発材料の上記標準化が、中空体を有 する装置で行なわれることを特徴とする請求項１７に記載の方法。 １９． フリー収着サイトのブロッキング及び場合によっては洗浄段階が続く、 それぞれ特定の濃度を特定量の液体中で有する溶液中で、特に収着材料が配置さ れた入口及び出口を有する中空体中の均一流動内で１以上の親和性材料によって 請求項１から８のいずれかに記載の収着材料が処理される、但し、上記収着材料 に吸収される親和性材料がアッセイ特異的親和性材料を結合させるために場合に よって使用される請求項９から１３に記載の支持体材料の調製方法。 ２０．少なくとも１つの請求項１から８の少なくとも１項に記載の収着材料が中 空体に配置される分析パラメーターの数の測定のためのアッセイを行なうための 装置の調製方法であって、中空体に配置されたそれぞれの層 がそれぞれ継続的流動において、充填され、フリーなサイトがブロックされ、続 いて次の層が類似方法で調製されることを特徴とする方法。 ２１．請求項１から８の少なくとも１項に記載の収着材料及び／または請求項９ から１３の少なくとも１項に記載の支持体材料を使用した固相アッセイであって 、収着材料が固相アッセイで使用される成分により処理され、上記成分が収着材 料に付着し、その後、固相アッせイが行なわれるかまたは予備的段階で処理され た収着材料上で固相アッセイが行なわれることを特徴とする方法。 ２２．一定量の分析溶液が使用される時、定量的分析のために標準化されること を特徴とする請求項２１に記載の固相アッセイ。 ２３．温度非依存性標準化を特徴とする請求項２２に記載の固相アッセイ。 ２４．親和性アッセイ、特にイムノアフィニティーアッセイとしてデザインされ たことを特徴とする請求項２１から２３の少なくとも１項に記載の固相アッセイ 。 ２５．低減または増加された圧力をかけること、または流動体の流速に影響して いる中空体内のサイト、例えば適切なフリットを利用することにより、収着材料 の、充填、及び／または、請求項２１から２４のいずれか記載の固相アッセイで の親和反応を行なうための方法。 ２６．固相アッセイを行なうための更なる付加的な補足試薬または装置を除く、 請求項９から１３に記載の支持体材料または請求項１から８に記載の収着材料、 上記支持体材料または収着材料が好ましくは既に中空体に配置されいる入口及び 出口を有するシリンダー状中空体、既に親和性材料をその中に溶解して含有また は保存可能な状態で親和性材料から分離され 本発明の収着材料の充填のための水溶液、及び場合によっては固相アッセイを行 なうための溶液を含むキット。 ２７．請求項１から８の少なくとも１項に記載の収着材料により少なくとも部分 的に満たされるか、または満たすことが可能な少なくとも１つの中空体、特にチ ューブを捕らえるための手段、及び請求項９から１３の少なくとも１項に記載の 支持体材料を得るための固相アッセイを行なうための成分を持つチューブ内に存 在する収着材料の充填のための手段、または請求項９から１３の少なくとも１項 に記載の支持体材料により満たされたまたは満たされることが可能な少なくとも １つの中空体を含む手段を含む請求項２１から２４の少なくとも１項に記載のア フィニティーアッセイを調製及び／または行なうための装置。 ２８．上記少なくとも１つ少なくとも部分的に固相アッセイ成分または分析物の 洗浄、結合及び／または溶出のための溶液で満たされたチューブの充填のための 手段、及び場合によって流れでたもの及び／または溶出物を得た後の液体中の中 空体内にあるアッセイ成分または分析物の測定のための測定付加的手段を含む請 求項２７に記載の装置。