EP1057020A2 - Fluoreszenz-energie-transfer für die aufklärung der 3d-struktur von biomakromolekülen - Google Patents

Fluoreszenz-energie-transfer für die aufklärung der 3d-struktur von biomakromolekülen

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EP1057020A2
EP1057020A2 EP99911675A EP99911675A EP1057020A2 EP 1057020 A2 EP1057020 A2 EP 1057020A2 EP 99911675 A EP99911675 A EP 99911675A EP 99911675 A EP99911675 A EP 99911675A EP 1057020 A2 EP1057020 A2 EP 1057020A2
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EP
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macromolecule
cross
photoactivatable
groups
frequency
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Withdrawn
Application number
EP99911675A
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Daniel Hoffmann
Ralf Dr. Zimmer
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Original Assignee
GMD Forschungszentrum Informationstechnik GmbH
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Publication date
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Definitions

  • FLUORESCENCE ENERGY TRANSFER OF MEDIATED CHEMICAL ACTIVATION (FETMA) FOR THE ENLARGEMENT OF THE 3D STRUCTURE OF
  • the invention relates to a method for the targeted chemical activation of photo-activatable cross-linker molecules around ligand binding pockets and fluorescent groups in macromolecules, in particular biological macromolecules, by using fluorescent ligands of the macromolecule and by selecting photo-activatable cross-linker molecules with specific activation energies. so that radiation-free energy transfer (Förster transfer) from the fluorescent ligands to the crosslinker molecules activated thereby takes place.
  • radiation-free energy transfer Förster transfer
  • the method according to the invention is preferably used to focus a bioanalytical method known per se for obtaining information about the SD structure of biomacromolecules on functionally relevant parts of biomacromolecules such as ligand binding pockets.
  • This bioanalytical method is followed by the execution of the method according to the invention: a specific digestion of the biomacromolecule, a separation of the components by chromatography and mass spectrometry, and a computer simulation to obtain SD structure models with the experimentally obtained information as a boundary condition.
  • the entire process can be carried out in several iterations to refine the structure.
  • Biomacromolecules such as proteins, ribonucleic acids or macromolecular complexes from various biopolymers such as ribosomes are the carriers of essential biochemical functions for almost all life processes in biological organisms. In general, these functions are linked to the precisely defined 3D structures of the biomacromolecules. If a 3D structure is known, the functional mechanism can be concluded. This makes 3D biological structures an important source of information for molecular medicine and pharmacology. Information about the 3D structure of the binding pockets of biological macromolecules is particularly valuable because they are the actually functionally important parts of the macromolecules, because they interact with other bound molecules such as ligands or substrates.
  • inventive method should be applicable in cases that are particularly difficult with conventional. Methods to be treated. These include, for example, membrane proteins as well as large, difficult to clean and difficult to crystallize globular proteins and complexes.
  • the method according to the invention for 3D structure elucidation of macromolecules is characterized in that a fluorescent ligand (F) with a fluorescence frequency in the range from v to v 2 is introduced into the macromolecule (M) or its spatial position determined to the macromolecule (M) by methods known per se, one or more photoactivatable bifunctional cross-linkers C, C ⁇ C "with a respective excitation frequency in the range from v to v 2 covalently between the non-photoactivatable end S of the cross-linker C, C ⁇ C "and suitable functional groups m of the macromolecule M binds with the exclusion of light, the macromolecule M is irradiated above the frequency interval v to v 2 at a frequency v Q , with radiation-free transmission (Förster transfer) to adjacent cross-linkers C and / or C "the photoactivatable end A and / or A 'of the cross-linker C and / or C" for reaction with the surface
  • F fluorescent ligand
  • FIG. 1 b B and F are linked via the flexible connection L. F can orient himself freely. There is no blanking as in FIG. 1a.
  • the lytic reagent specifically cut between monomers of the type R1 or R4 (circles) and monomers of the type of R3 or R6 (squares).
  • the cross-linker molecule C binds specifically to residues of the type of monomer R2 (triangles) and after photoactivation unspecifically to spatially adjacent groups, such as here to monomer R5.
  • FIG. 2b shows, instead of the fragment in FIG. 2a, two separate fragments which occur in the digestion of the macromolecule without a cross-linker.
  • the absorption frequency v Q of the fluorophores F must lie in a frequency interval in which there is no significant excitation of the photoactivatable groups.
  • the emission frequency of the fluorophores F must lie in a frequency interval v to v 2 in which a significant part of the photoactivatable groups A, A ', A "is activated on the cross-linker molecules.
  • the first step of the method according to the invention is preferably followed by a bioanalytical method step known per se in order to convert the result of the method according to the invention into information about the 3D structure of the macromolecule.
  • the main idea of the method according to the invention is that only those groups on the accessible surface of the macromolecule M are linked by cross-linker molecules C which are less distant from one another than the maximum length of the cross-linker molecule. If you can identify the groups linked in pairs by cross-linker molecules C, their maximum possible spatial distance is known, and information about the 3D structure has been obtained.
  • the process step known per se which is preferably connected to the first process step, comprises the following elements:
  • the cross-linking according to the invention is preferably combined with the direct photoactivation of cross-linkers C, as well as with the known method for cross-linking with bifunctional cross-linker molecules C.
  • the method according to the invention it is advisable to use the method according to the invention repeatedly in combination with the methods known per se which preferably follow it, as explained above.
  • Different parameters can be set in each cycle so that new, independent structural information is obtained.
  • different cross-linker molecules and digestive reagents can be selected in each cycle.
  • a fluorophore F specifically bound to the macromolecule M is the first important component of the method according to the invention.
  • the method according to the invention provides information about the 3D structure of the macromolecule M in the spatial environment of this fluorophore F. If, for example, the 3D structure in and around the substrate binding pocket of an enzyme is to be examined, fluorescent inhibitors come into consideration as carriers of the fluorophore F. or substrate analogs, as well as the substrate itself in the case of very slow-working enzymes, if it fluoresces.
  • fluorescent cofactors for example flavin in cholesterol oxidase
  • fluorescent effectors for example YC-1 as an effector of soluble guanylyl cyclase
  • fluorescent groups covalently linked to the macromolecule such as tryptophans in proteins. It is important in all cases that the position of the fluorophore F relative to the macromolecule M is determined as precisely as possible, which naturally results in the examples mentioned.
  • the fluorophore F is rigidly connected to part B of the molecule, which is responsible for the specific binding to the macromolecule M (Fig. 1a).
  • the fluorophore F is flexibly connected (for example via an alkyl chain) to part B, which is responsible for the specific binding to the macromolecule M. is ( Figure 1 b). Because of the flexible connection L, the fluorophore F can rotate freely relative to B and M.
  • both options provide different, complementary types of information about the 3D structure of the macromolecule.
  • the first step of the method according to the invention is the specific binding of the fluorophore-bearing ligand F to the macromolecule M, unless a fluorophore F already present in the macromolecule M is used.
  • the fluorescent ligand YC-1 can be used as a probe. YC-1 is placed in an aqueous solution of sGC and binds with high affinity in a specific binding pocket of sGC.
  • the second step of the method according to the invention is the chemically specific covalent bond between the non-photoactivatable end A and / or A 'of the cross linker (S in FIG. 1) on the one hand and suitable functional groups (m in FIG. 1) on the surface of the protein on the other hand .
  • the selected cross-linker C to the above solution in which the complexes between the macromolecule M and the fluorescent ligand F are already located.
  • C 4- [p-azido-salicylamidojbutylamine (ASBA) can be used as a cross-linker. With its amine end, ASBA reacts specifically with carbonyl and carboxyl groups on the surface of the macromolecule M.
  • the third step of the method according to the invention is the excitation of the fluorophore F by irradiation with light, the frequency of which corresponds to the absorption frequency of the fluorophore F.
  • the photo-activatable end A, A ', A "of the cross-linker C must not be directly activated at this frequency, which can generally be ensured by selecting suitable cross-linkers C.
  • the photo-activatable part of absorbs ASBA between 250 nm and 320 nm and can thus be excited with the emission wavelength of YC-1, which is in the same range.
  • the absorption and emission spectrum of the ligand F fluorescent in the binding pocket or of the fluorescent group can be shifted depending on the environment compared to the spectra of the free fluorophores F in aqueous or other solution (solvatochromism). This can be the case in particular (FIG. 1a) if the binding and the fluorescent part of the ligand F are rigidly connected.
  • the solvatochromic shift must be taken into account when selecting the cross-linker molecule C, since the fluorescent energy is to be transferred from the fluorophore F to the photo-activatable group of the cross-linker C, and therefore the photo-activatable group must absorb significantly at the emission frequency of the fluorophore F.
  • the absorption and emission frequencies of the fluorophore F are not known, they can be determined by fluorescence spectroscopy; the cross-linker C is then selected on the basis of the spectra measured in this way.
  • the cross-linker C can be used in parallel, which absorb at different frequency intervals, but not at the frequency of the light incident from outside (v Q ) to excite the fluorophore F. Is the solvatochromic shift of the fluorophore F depending on the Polarity of the surrounding medium is known, so it can be seen from the solvatochrome shift to the character that actually occurred of the binding pocket (polar or non-polar) are closed, whereby a first structural information about the binding pocket is already obtained.
  • the next step of the method according to the invention is the chemical activation of those photoactivatable groups A and / or A 'of the cross-linker molecules C and / or C "which are in spatial proximity to the fluorophore F.
  • the energy required for the activation is transferred via the forester -Transfer radiation-free transfer from the excited fluorophore F to the photoactivatable groups A and / or A '.
  • the transfer rate decreases in proportion to the sixth power of the reciprocal distance from F to A, A', A ".
  • the transmission rate depends not only on the distance between fluorophore F and photoactivatable group A, A ', A "but also on the spatial angle between the emission transition dipole moment of F and the absorption transition dipole moment of A, A', A". Highest rates are reached when both dipole moments are parallel, vanishing rates when they are orthogonal.
  • This effect is of importance in the process according to the invention when the fluorophore F is completely fixed relative to the macromolecule M (FIG. 1a). Then only those photoactivatable groups A are activated which are spatially adjacent to F and also have a suitable orientation relative to F. This effect generally does not occur since the photoactivatable groups usually have no preferred orientation before activation. Should the effect occur (Fig.
  • the radiation-free Förster transfer transfers the excitation energy from F to A and / or A 'much more efficiently than fluorescence emission from F and re-absorption by A and / or A'.
  • the latter process does not lead to a significant activation of A and / or A ⁇ , which simplifies the interpretation of the experiments.
  • the next step of the method according to the invention is the chemical reaction of the activated photoactivatable groups A and / or A 'of the crosslinker molecules C and / or C "with groups on the surface of the macromolecule M.
  • These reactions are chemically relatively unspecific, that is to say Activated groups A react with M to those groups that are immediately spatially adjacent to the activated groups A and / or A ', largely regardless of their chemical nature.
  • the cross-linker molecules C and / or C "form covalent bridges between Part of the surface of the macromolecule M.
  • the maximum length of these bridges can be influenced by the length and rigidity of the cross-linker C. At ASBA, this length is 1.6 nm.
  • the identification of the reacted groups of the macromolecule M thus provides further information about the 3D structure of the macromolecule M, namely an upper bound for the spatial distances between the fluorophore F and the groups on the surface of the macromolecule M that with the photoactivated groups A and / or A 'of the cross-linker molecules C and / or C "have reacted.
  • the method according to the invention is preferably used in combination with known bioanalytical and computational methods, which are explained in the following.
  • the macromolecule M is, for example, a protein
  • proteases such as trypsin can be used for this purpose. Trypsin cuts polypeptide chains specifically for lysines or arginines.
  • the same macromolecules M are digested in a further assay without cross-linkers C, C, C ". Mixtures of parts of the macromolecule M with or without attached cross-linkers C, C, C "are obtained from both digestion assays.
  • the mass spectrum of the digested macromolecule M without cross-linker C, C, C is compared with the mass spectrum of the digested macromolecule M with cross-linker C, C ⁇ C".
  • masses appear which correspond to the sum of the masses of the fragments linked via cross-linker C and / or C "and the mass of the cross-linker C.
  • These fragments are identified on the basis of the masses. It is thus known that these fragments are closer in the native structure of the macromolecule M than the maximum length of the cross-linker C.
  • the two linked parts and the space between them must be accessible to the cross-linker molecule C and / or C ". Both are important information about the 3D structure of the macromolecule.
  • the structural information obtained above is now being converted into an SD structural model.
  • the experimental results obtained by the method according to the invention are taken into account as geometrical boundary conditions in known methods for computer simulation (D. Hoffmann, E. W. Knapp; J. Phys. Chem. B 101: 6734-6740, 1997) of the macromolecule M.
  • these boundary conditions can also be used in distance-geometric methods and in threading methods for protein structure prediction.
  • the result of this computational step is an SD structural model or several 3D structural models of the macromolecule M.
  • the respective process steps can be carried out with other reagents.
  • cross linkers C different lengths or chemical specificity are used, as well as other digestive reagents are used. It is iterated until further refinement is no longer desired or possible.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur gezielten chemischen Aktivierung von photoaktivierbaren Cross-Linker-Molekülen um Ligand-Bindetaschen und fluoreszierende Gruppen in Makromolekülen, insbesondere biologischen Makromolekülen, durch Verwendung fluoreszierender Liganden oder fluoreszierende Gruppen des Makromoleküls und durch Wahl von photoaktivierbaren Cross-Linker-Molekülen mit spezifischen Aktivierungsenergien, so dass ein strahlungsloser Energietransfer (Förster-Transfer) von den fluoreszierenden Liganden oder Gruppen zu den dadurch aktivierten Cross-Linker-Molekülen stattfindet. Verfahren zur 3D-Strukturaufklärung von Makromolekülen (M), dadurch gekennzeichnet, dass man einen fluoreszenzfähigen Liganden (F) mit einer Fluoreszenzfrequenz im Bereich von (1 bis (2 in das Makromolekül (M) einführt oder dessen räumliche Position zum Makromolekül (M) nach an sich bekannten Verfahren bestimmt, einen oder mehrere photoaktivierbare bifunktionelle Cross-Linker (C) mit einer jeweilligen Anregungsfrequenz im Bereich von (1 bis (2 kovalent zwischen dem nicht-photoaktivierbaren Ende (S) des Cross-Linkers (C, C', C'') und geeigneten funktionellen Gruppen (m) des Makromoleküls (M) unter Lichtausschluss bindet, das Makromolekül (M) oberhalb des Frequenzintervalls (1 bis (2 mit einer Frequenz (Q) bestrahlt, wobei mittels strahlungsloser Übertragung (Förster-Transfer) auf benachbarte Cross-Linker (C und/oder C") das photoaktivierbare Ende (A und/oder A') des Cross-Linkers (C und/oder C") zur Reaktion mit der Oberfläche des Makromoleküls (M) aktiviert und mit der Oberfläche des Makromoleküls (M) in Abhängigkeit des Abstandes des fluoreszenzfähigen Liganden (F) reagiert und die paarweise verknüpften Gruppen durch bioanalytische Verfahren identifiziert, insbesondere spezifischen Verdau des Makromoleküls (M), die Verdaubruchstücke insbesondere nach Masse auftrennt und räumliche Nachbarschaften rechnerisch bestimmt.

Description

FLUORESZENZ-ENERGIE-TRANSFER VERMITTELTER CHEMISCHER AKTIVIERUNG (FETMA) FÜR DIE AUFKLÄRUNG DER 3D-STRUKTUR VON
BIOMAKROMOLEKÜLEN
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur gezielten chemischen Aktivierung von photoaktivierbaren Cross-Linker-Molekülen um Ligand-Bindetaschen und fluoreszierende Gruppen in Makromolekülen, insbesondere biologischen Makromolekülen, durch Verwendung fluoreszierender Liganden des Makromoleküls und durch Wahl von photoaktivierbaren Cross-Linker-Molekülen mit spezifischen Aktivierungsenergien, so daß ein strahlungsloser Energietransfer (Förster- Transfer) von den fluoreszierenden Liganden zu den dadurch aktivierten Cross- Linker-Molekülen stattfindet.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugt eingesetzt um ein an sich bekanntes bioanalytisches Verfahren zur Gewinnung von Information über die SD- Struktur von Biomakromolekülen auf funktioneil relevante Teile von Biomakromolekülen wie Ligand-Bindetaschen zu fokussieren. In diesem bioanalytischen Verfahren schließt sich an die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens an: ein spezifischer Verdau des Biomakromoleküls, eine Auftrennung der Bestandteile durch Chromatographie und Massenspek- trometrie, sowie eine Computersimulation zur Gewinnung von SD-Strukturmodellen mit der experimentell gewonnenen Information als Randbedingung. Zur Strukturverfeinerung kann das gesamte Verfahren in mehreren Iterationen durchlaufen werden.
Biologische Makromoleküle wie Proteine, Ribonukleinsäuren oder makromolekulare Komplexe aus verschiedenen Biopolymeren wie zum Beispiel Ribosomen sind die Träger der essentiellen biochemischen Funktionen für fast alle Lebensprozesse in biologischen Organismen. Im allgemeinen sind diese Funktionen gebunden an die genau definierten 3D-Strukturen der Biomakromoleküle. Bei Kenntnis einer 3D-Struktur kann auf den funktioneilen Mechanismus geschlossen werden. Das macht 3D-Strukturen biologischer zu einer wichtigen Informationsquelle für molekulare Medizin und Pharmakologie. Besonders wertvoll sind Informationen über die 3D-Struktur der Bindetaschen biologischer Makromoleküle, da sie die eigentlich funktionell wichtigen Teile der Makromoleküle sind, weil dort Wechselwirkungen mit anderen gebundenen Molekülen wie Liganden oder Substraten stattfinden. Eines von vielen medizinisch relevanten Beispielen dafür, wie die Kenntnis der 3D-Struktur von Bindetaschen genutzt wird, ist das sogenannte rationale Design von Inhibitoren viraler oder bakterieller Enzyme. Diese Inhibitoren werden so entworfen, daß sie in die Bindetaschen der Enzyme passen wie Schlüssel in Schlösser. Dadurch werden die Enzyme blockiert und die Vermehrung der Viren oder Bakterien gestoppt. Ein solches Schlüssel-Schloß-Design ist nur dann gezielt möglich, wenn die SD- Struktur der Bindetasche bekannt ist.
Im Stand der Technik ist die Bestimmung der 3D-Strukturen biologischer Makromoleküle mit Hilfe konventioneller Verfahren wie Röntgen- Kristallstrukturanalyse oder kernmagnetischer Resonanz im allgemeinen schwierig und zeitaufwendig. Die Gründe dafür sind vielfältig. Insbesondere werden in diesen Verfahren große (typischerweise millimolare) Mengen an aufgereinigtem Makromolekül in spezieller Form benötigt, entweder kristallin oder als konzentrierte Lösung. Darüber hinaus müssen zur Entschlüsselung der 3D- Struktur weitere schwierige Hürden überwunden werden, wie zum Beispiel in der
Kristallographie die Lösung des sogenannten Phasenproblems. Insgesamt kann so die Aufklärung einer 3D-Struktur eines Biomakromoleküls mehrere
Personenjahre beanspruchen.
Es ist Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zur 3D-Strukturaufklärung bereitzustellen, das geringe Mengen an reinem Makromolekül erfordert und auf funktionell relevante Bindetaschen fokussierbar ist. Darüber hinaus soll das erfindungsgemäße Verfahren in Fällen anwendbar sein, die besonders schwer mit konventionellen . Methoden zu behandeln sind. Dazu gehören beispielsweise Membranproteine sowie große, schwer zu reinigende und schwer zu kristallisierende globuläre Proteine und Komplexe. Das erfindungsgemäße Verfahren zur 3D-Strukturaufklärung von Makromolekülen (M) ist in einer ersten Ausführungsform dadurch gekennzeichnet, daß man einen fiuoreszenzfähigen Liganden (F) mit einer Fluoreszenzfrequenz im Bereich von v, bis v2 in das Makromolekül (M) einführt oder dessen räumliche Position zum Makromolekül (M) nach an sich bekannten Verfahren bestimmt, einen oder mehrere photoaktivierbare bifunktionelle Cross-Linker C, C\ C" mit einer jeweiligen Anregungsfrequenz im Bereich von v, bis v2 kovalent zwischen dem nicht-photoaktivierbaren Ende S des Cross-Linkers C, C\ C" und geeigneten funktioneilen Gruppen m des Makromoleküls M unter Lichtausschluß bindet, das Makromolekül M oberhalb des Frequenzintervalls v bis v2 mit einer Frequenz vQ bestrahlt, wobei mittels strahlungsloser Übertragung (Förster-Transfer) auf benachbarte Cross-Linker C und/oder C" das photoaktivierbare Ende A und/oder A' des Cross-Linkers C und/oder C" zur Reaktion mit der Oberfläche des Makromoleküls M aktiviert und mit der Oberfläche des Makromoleküls M in Abhängigkeit des Abstandes des fluoreszenzfähigen Liganden F reagiert und die paarweise verknüpften Gruppen durch bioanalytische Verfahren identifiziert, insbesondere spezifischen Verdau des Makromolküls M, die Verdaubruchstücke insbesondere nach Masse auftrennt und räumliche Nachbarschaften rechnerisch bestimmt.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich insbesondere aus den abhängigen Patentansprüchen.
Fig. 1a und Fig. 1 b beschreiben die chemische Aktivierung durch Förster- Transfer. Die Energie wird vom angeregten Fluorophor F auf benachbarte photoaktivierbare Gruppen A und/oder A' übertragen. Es findet keine nennenswerte Übertragung auf weiter entfernte photoaktivierbare Gruppen A" statt. M steht für Makromolekül; B steht für bindenden Teil des fluoreszierenden Liganden; F steht für Fluorophor; m steht für spezifische chemische Gruppen auf M; S steht für Gruppen auf Cross-Linker, die spezifisch kovalent an m-Gruppen binden; L steht für flexible Verbindung zwischen B und F, zum Beispiel eine Alkylkette. In Fig. 1 a sind B und F fest verbunden; es kann zum richtungsabhängigen Ausblenden von A-Gruppen kommen (A' wird im Gegensatz zu A nicht aktiviert, obwohl Abstand FA gleich dem Abstand FA' ist).
In Fig. 1 b sind B und F über die flexible Verbindung L verknüpft. F kann sich frei orientieren. Es tritt keine Ausblendung wie in Fig. 1a auf.
Fig. 2 beschreibt die Zusammensetzung des Gemisches der makromolekularen Bruchstücke nach dem Verdau des Makromoleküls (schematisch). Das lytische Reagenz hat spezifisch geschnitten zwischen Monomeren des Typs von Monomer R1 oder R4 (Kreise) und Monomeren des Typs von Monomer R3 oder R6 (Quadrate). Das Cross-Linker Molekül C bindet spezifisch an Residuen vom Typ von Monomer R2 (Dreiecke) und nach Photoaktivierung unspezifisch an räumlich benachbarte Gruppen, wie hier an Monomer R5.
Fig. 2a zeigt dieses Bruchstück als Bestandteil des Verdaus des Makromoleküls nach Cross-Linking.
Fig. 2b zeigt statt des Bruchstücks in Fig. 2a zwei getrennte Bruchstücke, die im Verdau des Makromoleküls ohne Cross-Linker auftreten.
Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt folgende physikalische Eigenschaften und Effekte:
- Die spezifische räumlich definierte Bindung des fluoreszierenden Liganden (mit Fluorophor F in Fig. 1a und Fig. 1 b) an das Makromolekül. Statt eines Liganden kann auch eine natürlicherweise im Makromolekül vorhandene fluoreszierende Gruppe (zum Beispiel Indol-Gruppen von Tryptophan in Proteinen) genutzt werden, wenn die 3D-Struktur von dessen Umgebung untersucht werden soll.
- Die spezifische kovalente Bindung von Cross-Linker Molekül mit bestimmten zugänglichen Teilen des Makromoleküls über spezifische funktioneilen Gruppen (S in Fig. 1 a und Fig. 1 b) an einem Ende S der Cross-Linker Moleküle C, C, C". Am anderen Ende A, A', A" der Cross-Linker Moleküle befinden sich photoaktivierbare Gruppen (Akzeptoren A in Fig. 1a und Fig. 1 b).
- Die Anregung des Fluorophors des Liganden F oder geeignet modifizierter Liganden oder fluoreszierenden Gruppen.
- Die strahlungslose, effiziente Übertragung (Förster-Transfer) der Fluoreszenzenergie von den gebundenen oder natürlicherweise im Makromolekül M vorhandenen Fluorophoren auf Akzeptoren A und/oder A' von Cross-Linker Molekülen C die zu den Fluorophoren räumlich benachbart sind.
- Die chemische Aktivierung der Akzeptoren A und/oder A' durch die Fluoreszenzenergie.
- Die unspezifische kovalente Bindung der aktivierten Akzeptoren A und/oder A' an unmittelbar benachbarte Gruppen des Makromoleküls M (Cross-Linking).
Es ist für das erfindungsgemäße Verfahren von Bedeutung, daß folgende Bedingungen erfüllt sein sollten.
- Die Absorptionsfrequenz vQ der Fluorophore F muß in einem Frequenzintervall liegen, in dem keine signifikante Anregung der photoaktivierbaren Gruppen stattfindet.
- Die Emissionsfrequenz der Fluorophore F muß in einem Frequenzintervall v, bis v2 liegen in dem ein signifikanter Teil der photoaktivierbaren Gruppen A, A', A" auf den Cross-Linker Molekülen aktiviert wird.
Diese beiden Bedingungen können durch geeignete Wahl des Liganden F und des Cross-Linker Moleküls C erreicht werden. Ein wesentlicher Unterschied des erfindungsgemäßen Verfahrens zu an sich bekannten Verfahren des Cross- Linkens mit photoaktivierbaren Molekülen, ist dessen indirekte Aktivierung über Anregung des Fluorophors, gefolgt von Förster-Transfer auf die photoaktivierbaren Gruppen A und/oder A'. Dadurch wird eine ortsaufgelöste Aktivierung rund um das spezifisch gebundene Fluorophor F möglich, mit anderen Worten eine Fokussierung der Aktivierung auf die Umgebung funktionell relevanter Bindetaschen oder Gruppen. Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird also eine neue Qualität in der biologischen Strukturforschung erreicht.
An den ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens schließt sich bevorzugt ein an sich bekannter bioanalytischer Verfahrensschritt an, um das Ergebnis des erfindungsgemäßen Verfahren in Information über die 3D-Struktur des Makromoleküls umzusetzen. Der Kerngedanke des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß nur solche Gruppen auf der zugänglichen Oberfläche des Makromoleküls M durch Cross-Linker Moleküle C verknüpft werden, die eine geringere räumliche Entfernung voneinander haben, als die maximale Länge des Cross-Linker Moleküls. Kann man also die paarweise durch Cross-Linker Moleküle C verknüpften Gruppen identifizieren, so ist deren maximal mögliche räumliche Entfernung bekannt, und man hat eine Information über die 3D-Struktur gewonnen. Der an sich bekannte Verfahrensschritt, der bevorzugt an den ersten Verfahrensschritt angeschlossen wird, umfaßt folgende Elemente:
- Spezifischer Verdau (Proteolyse, Nucleolyse) des Makromoleküls.
- Auftrennung der Bruchstücke aus dem Verdau insbesondere nach Masse (HPLC, MALDI-TOF Massenspektrometrie).
- Rechnerische Bestimmung räumlicher Nachbarschaften aufgrund der experimentellen Resultate und Computersimulation des Makromoleküls mit den experimentell bestimmten Nachbarschaften als Randbedingungen. Aus diesem Schritt erhält man eines oder mehrere 3D-Strukturmodelle.
Um die globale 3D-Struktur von Makromolekülen M zu bestimmen wird das erfindungsgemäße Cross-Linking bevorzugt kombiniert mit der direkten Photoaktiverung von Cross-Linkern C, sowie mit dem an sich bekannten Verfahren zum Cross-Linking mit bifunktionalen Cross-Linker Molekülen C. Zum Erreichen einer schrittweisen Verfeinerung des 3D-Strukturmodelles empfiehlt sich eine wiederholte Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in Kombination mit den bevorzugt daran sich anschließenden an sich bekannten Verfahren wie oben erläutert. In jedem Zyklus können unterschiedliche Parameter eingestellt werden, so daß neue unabhängige Strukturinformation gewonnen wird. Insbesondere können in jedem Zyklus andere Cross-Linker Moleküle und Verdauungs-Reagenzien gewählt werden.
1. Spezifische räumlich definierte Bindung von Ligand an Makromolekül
Ein spezifisch an das Makromolekül M gebundenes Fluorophor F ist die erste wichtige Komponente des erfindungsgemäßen Verfahrens. Das erfindungsgemäße Verfahren liefert Information über die 3D-Struktur des Makromoleküls M in der räumlichen Umgebung dieses Fluorophors F. Soll zum Beispiel die 3D-Struktur in und um die Substrat-Bindetasche eines Enzyms untersucht werden, kommen als Träger des Fluorophors F in Betracht fluoreszierende Inhibitoren oder Substratanaloge, sowie bei sehr langsam arbeitenden Enzymen auch das Substrat selbst, falls es fluoresziert. Daneben können fluoreszierende Kofaktoren (zum Beispiel Flavin in Cholesterol Oxidase) oder fluoreszierende Effektoren genutzt werden (zum Beispiel YC-1 als Effektor der löslichen Guanylylcyclase), sowie kovalent mit dem Makromolekül verbundene fluoreszierende Gruppen wie Tryptophane in Proteinen. Wichtig ist in allen Fällen, daß die Position des Fluorophors F relativ zum Makromolekül M möglichst genau bestimmt ist, was sich in den genannten Beispielen natürlicherweise ergibt.
Zu unterscheiden im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens sind zwei Arten der Verknüpfung des Fluorophors mit dem der Rest der Gruppe die spezifisch an das Makromolekül gebunden ist (Fig. 1 ):
- Das Fluorophor F ist starr mit dem Teil B des Moleküls verbunden, der für die spezifische Bindung an das Makromolekül M verantwortlich ist (Fig. 1a).
- Das Fluorophor F ist flexibel (zum Beispiel über eine Alkylkette) mit dem Teil B verbunden, der für die spezifische Bindung an das Makromolekül M verantwortlich ist (Figur 1 b). Wegen der flexiblen Verbindung L kann das Fluorophor F frei rotieren relativ zu B und M.
Wie unten in Punkt 4 ausgeführt liefern beide Möglichkeiten unterschiedliche, sich ergänzende Arten von Information über die 3D-Struktur des Makromoleküls.
Zusammenfassend ist also der erste Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens die spezifische Bindung des Fluorophor-tragenden Liganden F an das Makromolekül M, falls nicht ein bereits im Makromolekül M vorhandenes Fluorophor F genutzt wird. Soll zum Beispiel die Umgebung der Effektorbindetasche der löslichen Guanylylcyclase (sGC) untersucht werden, so kann der fluoreszierende Ligand YC-1 als Sonde verwendet werden. YC-1 wird in eine wäßrige Lösung von sGC gegeben und bindet mit hoher Affinität in einer spezifischen Bindetasche von sGC.
2. Spezifische chemische Bindung der Cross-Linkers C
Der zweite Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die chemischspezifische kovalente Bindung zwischen dem nicht-photoaktivierbaren Ende A und/oder A' des Cross-Linkers (S in Figur 1 ) einerseits und passenden funktioneilen Gruppen (m in Figur 1 ) auf der Oberfläche des Proteins andererseits. Dazu gibt man den ausgewählten Cross-Linker C in die obige Lösung in der sich bereits die Komplexe zwischen dem Makromolekül M und dem fluoreszierenden Liganden F befinden. Zum Beispiel kann als Cross-Linker C 4-[p-Azido- salicylamidojbutylamin (ASBA) verwendet werden. ASBA reagiert mit seinem Amin-Ende spezifisch mit Carbonyl- und Carboxyl-Gruppen auf der Oberfläche des Makromoleküls M. Es ist wichtig die Reaktion in der Dunkelheit stattfinden zu lassen um eine vorzeitige Photoaktivierung von ASBA zu verhindern. Außerdem muß die Lösung so eingestellt werden, daß es zwar zu einer Reaktion von ASBA mit dem Makromolekül M kommt, nicht aber zu einer Denaturierung des Makromoleküls M. 3. Anregung des Fluorophors F
Der dritte Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Anregung des Fluorophors F durch Einstrahlung von Licht, dessen Frequenz der Absorptionsfrequenz des Fluorophors F entspricht. Wie bereits oben beschrieben, darf bei dieser Frequenz keine direkt Aktivierung des photoaktivierbaren Endes A, A', A" des Cross-Linkers C erfolgen, was im allgemeinen durch Wahl geeigneter Cross- Linker C gewährleistet werden kann. Zum Beispiel absorbiert der photoaktivierbare Teil von ASBA zwischen 250 nm und 320 nm und läßt sich damit bei der Emissionsweilenlänge von YC-1 anregen, die im selben Bereich liegt.
Es ist zu beachten, daß Absorbtions- und Emissions-Spektrum des in der Bindetasche fluoreszierenden Liganden F oder der fluoreszierenden Gruppe abhängig von der Umgebung verschoben sein kann gegenüber den Spektren der freien Fluorophore F in wäßriger oder anderer Lösung (Solvatochromie). Das kann insbesondere dann der Fall sein (Figur 1a), wenn der bindende und der fluoreszierende Teil des Liganden F starr verbunden sind. Die solvatochrome Verschiebung muß bei der Auswahl des Cross-Linker Moleküls C berücksichtigt werden, da die Fluoreszenzenergie vom Fluorophor F auf die photoaktivierbare Gruppe des Cross-Linkers C übertragen werden soll, und daher die photoaktiverbare Gruppe bei der Emissionsfrequenz des Fluorophors F signifikant absorbieren muß. Sind die Absorptions- und Emissionsfrequenzen des Fluorophors F nicht bekannt, können sie fluoreszenzspektroskopisch bestimmt werden; anhand der so gemessenen Spektren wird dann der Cross-Linker C ausgewählt. Alternativ können parallel mehrere Typen von Cross-Linkern C verwendet werden, die in unterschiedlichen Frequenzintervallen absorbieren, nicht aber bei der Frequenz des von außen eingestrahlten Lichtes (vQ) zur Anregung des Fluorophors F. Ist die solvatochrome Verschiebung des Fluorophors F in Abhängigkeit von der Polarität des umgebenden Mediums bekannt, so kann aus der tatsächlich aufgetretenen solvatochromen Verschiebung auf den Charakter der Bindungstasche (polar oder nicht-polar) geschlossen werden, womit bereits eine erste Strukturinformation über die Bindetasche gewonnen ist.
4. Chemische Aktivierung durch strahlungslose Übertragung der Fluoreszenzenergie auf räumlich benachbarte spezifische Akzeptoren
Der nächste Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die chemische Aktivierung jener photoaktivierbaren Gruppen A und/oder A' der Cross-Linker Moleküle C und/oder C", die sich in räumlicher Nähe zum Fluorophor F befinden. Die zur Aktivierung notwendige Energie wird über den Förster-Transfer strahlungsios vom angeregten Fluorophor F auf die photoaktivierbaren Gruppen A und/oder A' übertragen. Die Übertragungsrate sinkt proportional zur sechsten Potenz des reziproken Abstandes von F zu A, A', A" ab. Hohe Übertragungsraten gibt es typischerweise wenn die Entfernung zwischen F und A, A', A" in der Größenordnung von 1 nm liegt. Zu größeren Entfernungen hin nimmt die Übertragungsrate rapide ab.
Die Übertragungsrate hängt nicht nur ab von der Entfernung zwischen Fluorophor F und photoaktivierbarer Gruppe A, A', A" sondern auch vom räumlichen Winkel zwischen dem Emissions-Übergangsdipolmoment von F und dem Absorbtions- Übergangsdipolmoment von A, A', A". Höchste Raten werden erreicht, wenn beide Dipolmomente parallel sind, verschwindende Raten wenn sie orthogonal stehen. Dieser Effekt ist im erfindungsgemäßen Verfahren dann von Bedeutung, wenn das Fluorophor F ist relativ zum Makromolekül M völlig fixiert (Fig. 1a). Dann werden nur solche photoaktivierbaren Gruppen A aktiviert, die sowohl räumlich benachbart zu F sind, als auch eine geeignete Orientierung relativ zu F aufweisen. Dieser Effekt tritt im allgemeinen nicht auf, da die photoaktivierbaren Gruppen vor der Aktivierung meist keine Vorzugsorientierung aufweisen. Sollte der Effekt doch auftreten (Fig. 1 a, nur A wird aktiviert, A' dagegen nicht, obwohl beide Gruppen gleiche Entfernung zu F haben), so empfiehlt sich die Verwendung eines Liganden mit flexibler Verbindung L zwischen dem bindenden Teil des Liganden B und dem Fluorophor F (Fig. 1 b). Da F dann frei orientieren kann, wird eine Ausblendung photoaktivierbarer Gruppen aufgrund der Orientierungsabhängigkeit vermieden, das heißt allein der Abstand zwischen F und A bestimmt die Aktivierung.
Der strahlungslose Förster-Transfer überträgt die Anregungsenergie von F sehr viel effizienter auf A und/oder A' als Fluoreszenz-Emission von F und ReAbsorption durch A und/oder A'. Damit führt der letztere Prozeß nicht zu einer signifikanten Aktivierung von A und/oder A\ was die Deutung der Experimente vereinfacht.
5. Chemisch unspezifische Reaktion der photoaktivierbaren Gruppen der Cross- Linker Moleküle C und/oder C"
Der nächste Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die chemische Reaktion der aktivierten photoaktivierbaren Gruppen A und/oder A' der Cross- Linker Molküle C und/oder C" mit Gruppen auf der Oberfläche des Makromoleküls M. Diese Reaktionen sind chemisch relativ unspezifisch, das heißt die aktivierten Gruppen A reagieren mit solchen Gruppen auf M, die unmittelbar räumlich benachbart zu den aktivierten Gruppen A und/oder A' sind, weitgehend ungeachtet deren chemischer Natur. Nach der Reaktion bilden die Cross-Linker Moleküle C und/oder C" kovalente Brücken zwischen Teilen der Oberfläche des Makromoleküls M. Die maximale Länge dieser Brücken läßt sich durch die Länge und Steifigkeit des Cross-Linkers C beeinflussen. Bei ASBA liegt diese Länge bei 1.6 nm.
Im allgemeinen werden nur solche Cross-Linker C mit dem Makromolekül M reaktiv, deren Abstand zum Fluorophor F gering ist. Die Identifizierung der reagierten Gruppen des Makromoleküls M liefert damit eine weitere Information über die 3D-Struktur des Makromoleküls M, nämlich eine obere Schranke für die räumliche Entfernungen zwischen dem Fluorophor F und den Gruppen auf der Oberfläche des Makromoleküls M die mit den photoaktivierten Gruppen A und/oder A' der Cross-Linker Moleküle C und/oder C" reagiert haben. Um die Resultate der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in SD- Strukturinformation umzusetzen, wird das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt in Kombination mit an sich bekannten bioanalytischen und rechnerischen Verfahren eingesetzt, die im folgenden erläutert werden.
6. Spezifischer Verdau
Die Makromoleküle M mit assoziierten Fluorophoren F und Cross-Linkern C, C, C" werden spezifisch verdaut, das heißt mit lytischen Reagenzien zerschnitten, die an spezifischen Motiven auf den Makromolekülen M reagieren. Handelt es sich bei dem Makromolekül M zum Beispiel um ein Protein, so kann man zu diesen Zweck Proteasen wie Trypsin einsetzen. Trypsin schneidet Polypeptid- ketten spezifisch nach Lysinen oder Argininen. Zu Vergieichszwecken werden in einem weiteren Assay die gleichen Makromoleküle M ohne Cross-Linker C, C, C" verdaut. Aus beiden Verdauungs-Assays erhält man jeweils Gemische von Teilen des Makromoleküls M mit beziehungsweise ohne angeheftete Cross-Linker C, C, C". Wichtig sind solche Teile, die im Makromolekül M ohne Cross-Linker C, C, C" nach dem Verdau in zwei getrennte Bruchstücke zerfallen (Fig. 2b), während sie nach Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens durch Cross-Linker C und/oder C" zusammengehalten werden (Fig. 2a). Solche Teile haben in der nativen Konformation des Makromoleküls M einen räumlichen Abstand, der durch die Länge des Cross-Linker Moleküls C gegeben ist.
7. Trennung und Identifizierung der makromolekularen Bruchstücke
Zum Aufbau eines 3D-Strukturmodelles wird noch die Information benötigt, welche Teile des Makromoleküls M durch Cross-Linker C verknüpft wurden. Die Gemische der obigen Bruchstücke müssen also aufgetrennt und die einzelnen Teile identifiziert werden, das heißt Sequenzstücken des makromolekularen Polymers zugeordnet werden (die Kenntnis der Sequenz des Polymers, zum Beispiel im Falle eines Proteins die Sequenz der Aminosäuren, ist hier vorausgesetzt). Zur Auftrennung und Identifizierung werden im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt an sich bekannten Verfahren wie HPLC und MALDI-TOF Massenspektrometrie eingesetzt. Anhand der Massen der Bruchstücke können diese im allgemeinen identifiziert werden.
Das Massenspektrum des verdauten Makromoleküls M ohne Cross-Linker C, C, C" wird verglichen mit dem Massenspektrum des verdauten Makromoleküls M mit Cross-Linker C, C\ C". In letzterem tauchen Massen auf, die der Summe der Massen der über Cross-Linker C und/oder C" verknüpften Bruchstücke und der Masse des Cross-Linkers C entsprechen. Anhand der Massen werden diese Bruchstücke identifiziert. Es ist damit bekannt, daß diese Bruchstücke sich in der nativen Struktur des Makromoleküls M näher sind als die maximale Länge des Cross-Linkers C. Außerdem ist damit bekannt, daß die beiden verknüpften Teile und der Raum dazwischen dem Cross-Linker Molekül C und/oder C" zugänglich sein muß. Beides sind wichtige Informationen zur 3D-Struktur des Makromoleküls.
8. Rechnerische Vorhersage der 3D-Struktur des Makromoleküls mit den experimentell bestimmten Informationen als Randbedingungen
Die oben gewonnene Strukturinformation wird nun noch umgesetzt in ein SD- Strukturmodell. Dazu werden die durch das erfindungsgemäße Verfahren gewonnenen experimentellen Resultate als geometrische Randbedingungen in an sich bekannten Verfahren zur Computersimulation (D. Hoffmann, E. W. Knapp; J. Phys. Chem. B 101 :6734-6740, 1997) des Makromoleküls M berücksichtigt. Alternativ können diese Randbedinungen auch in distanzgeometrischen Verfahren, sowie in Threading-Verfahren zur Proteinstrukturvorhersage eingesetzt werden. Resultat dieses rechnerischen Schrittes ist in jedem Fall ein SD- Strukturmodell oder mehrere 3D-Strukturmodelle des Makromoleküls M.
9. Weitere Durchläufe mit anderen Cross-Linkern und lyrischen Reagenzien
Falls eine Verfeinerung des 3D-Strukturmodells gewünscht ist, oder die Anzahl der mit den experimentellen Randbedingungen vereinbaren 3D-Strukturmodelle verringert werden soll, so können die jeweiligen Verfahrensschritte mit anderen Reagenzien durchlaufen werden. Insbesondere können Cross-Linker C verschiedener Länge oder chemischer Spezifität verwendet werden, sowie andere Verdauungsreagenzien eingesetzt werden. Es wird solange iteriert, bis eine weitere Verfeinerung nicht mehr gewünscht oder möglich ist.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur 3D-Strukturaufklärung von Makromolekülen (M), dadurch gekennzeichnet, daß man einen fluoreszenzfähigen Liganden (F) mit einer Fluoreszenzfrequenz im Bereich von v1 bis v2 in das Makromolekül (M) einführt oder dessen räumliche Position zum Makromolekül (M) nach an sich bekannten Verfahren bestimmt, einen oder mehrere photoaktivierbare bifunktionelle Cross-Linker (C) mit einer jeweiligen Anregungsfrequenz im Bereich von v., bis v2 kovalent zwischen dem nicht-photoaktivierbaren Ende (S) des Cross-Linkers (C, C, C") und geeigneten funktionellen Gruppen (m) des Makromoleküls (M) unter Lichtausschluß bindet, das Makromolekül (M) oberhalb des Frequenzintervalls v., bis v2 mit einer Frequenz vQ bestrahlt, wobei mittels strahlungsloser Übertragung (Förster- Transfer) auf benachbarte Cross-Linker (C und/oder C") das photoaktivierbare Ende (A und/oder A') des Cross-Linkers (C und/oder C") zur Reaktion mit der Oberfläche des Makromoleküls (M) aktiviert und mit der Oberfläche des Makromoleküls (M) in Abhängigkeit des Abstandes des fluoreszenzfähigen Liganden (F) reagiert und die paarweise verknüpften Gruppen durch bioanalytische Verfahren identifiziert, insbesondere spezifischen Verdau des Makromolküls (M), die Verdaubruchstücke insbesondere nach Masse auftrennt und räumliche Nachbarschaften rechnerisch bestimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß man die Makromoleküle (M) auswählt aus Proteinen, Ribonukleinsäuren oder makromolekularen Komplexen verschiedener Biopolymeren.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß man gleichzeitig die direkte Photoaktivierung von Cross-Linkern (C) sowie auch bifunktionelle chemisch spezifisch bindende Cross-Linker einsetzt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß man als Cross- Linker 4-[p-Azidosalicylamido]butylamin (ASBA) einsetzt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß man die Verdaubruchstücke nach Masse auftrennt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, , dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren mehrfach wiederholt, gegebenenfalls verschiedene fluores- zenzfähige Liganden (F), Cross-Linker (C) und /oder Verdauungs-Reagenzien einsetzt.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19854196C2 (de) * 1998-11-24 2001-03-15 Xerion Pharmaceuticals Gmbh Verfahren zur Modifikation und Identifikation funktioneller Stellen in Proteinen
DE10036342C2 (de) * 2000-07-26 2002-09-19 Caesar Stiftung Verfahren zur Bestimmung räumlicher Abstände in Polymeren oder Komplexen von Polymeren mit Hilfe von Gemischen von Cross-Linker Molekülen
US7368290B2 (en) * 2003-05-12 2008-05-06 Sandia National Laboratories Structural determination of intact proteins using mass spectrometry

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1273552A (en) * 1985-12-23 1990-09-04 Michael J. Heller Fluorescent stokes shift probes for polynucleotide hybridization assays
US5254477A (en) * 1986-06-25 1993-10-19 Trustees Of Tufts College Flourescence intramolecular energy transfer conjugate compositions and detection methods
US6054266A (en) * 1987-12-21 2000-04-25 Applied Biosystems, Inc. Nucleic acid detection with separation
US5252743A (en) * 1989-11-13 1993-10-12 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of anti-ligands on surfaces
US5326692B1 (en) * 1992-05-13 1996-04-30 Molecular Probes Inc Fluorescent microparticles with controllable enhanced stokes shift
WO1992014845A1 (en) * 1991-02-26 1992-09-03 Worcester Foundation For Experimental Biology Diagnosing cystic fibrosis and other genetic diseases using fluorescence resonance energy transfer (fret)
EP0649532B1 (de) * 1992-07-06 1997-11-12 Biomira, Inc. Photoaktivierung von proteinen zu konjugationszwecken
US5654419A (en) * 1994-02-01 1997-08-05 The Regents Of The University Of California Fluorescent labels and their use in separations
US5622821A (en) * 1994-06-29 1997-04-22 The Regents Of The University Of California Luminescent lanthanide chelates and methods of use
US5612894A (en) * 1995-02-08 1997-03-18 Wertz; David H. System and method for molecular modeling utilizing a sensitivity factor
US6008373A (en) * 1995-06-07 1999-12-28 Carnegie Mellon University Fluorescent labeling complexes with large stokes shift formed by coupling together cyanine and other fluorochromes capable of resonance energy transfer
US5665966A (en) * 1995-09-29 1997-09-09 Lockheed Martin Idaho Technologies Company Current measuring system
US5900228A (en) * 1996-07-31 1999-05-04 California Institute Of Technology Bifunctional detection agents having a polymer covalently linked to an MRI agent and an optical dye
US6284544B1 (en) * 1997-05-01 2001-09-04 University Of Pennsylvania Determination of metal ions in solution by photoluminescence anisotropy
GB9707996D0 (en) * 1997-04-21 1997-06-11 Univ Cambridge Tech Screening

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO9941607A3 *

Also Published As

Publication number Publication date
US6713256B1 (en) 2004-03-30
WO1999041607A3 (de) 1999-12-09
JP2002503810A (ja) 2002-02-05
WO1999041607A2 (de) 1999-08-19

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