EP1066519A2 - Verfahren zur automatisierten, erythrozytenseitigen blutgruppen-bestimmung - Google Patents

Verfahren zur automatisierten, erythrozytenseitigen blutgruppen-bestimmung

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Publication number
EP1066519A2
EP1066519A2 EP99923401A EP99923401A EP1066519A2 EP 1066519 A2 EP1066519 A2 EP 1066519A2 EP 99923401 A EP99923401 A EP 99923401A EP 99923401 A EP99923401 A EP 99923401A EP 1066519 A2 EP1066519 A2 EP 1066519A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
blood group
albumin
sera
reaction
profile
Prior art date
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Ceased
Application number
EP99923401A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jörg Spindler
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
DRK Blutspendedienst Baden Wuerttermberg Hessen gGmbH
Original Assignee
Deutsches Rotes Kreuz Blutspendendienst Baden-Wurt Gemeinnu GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19815943A external-priority patent/DE19815943C2/de
Application filed by Deutsches Rotes Kreuz Blutspendendienst Baden-Wurt Gemeinnu GmbH filed Critical Deutsches Rotes Kreuz Blutspendendienst Baden-Wurt Gemeinnu GmbH
Publication of EP1066519A2 publication Critical patent/EP1066519A2/de
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Rigid containers without fluid transport within
    • B01L3/5085—Rigid containers without fluid transport within for multiple samples, e.g. microtitration plates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/80—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood groups or blood types or red blood cells

Definitions

  • the invention relates to a method for automated erythrocyte-side blood group determination according to the preamble of claim 1.
  • Erythrocyte properties which are characterized by the presence of specific antigens (blood group substances) on the erythrocyte membrane and can be detected with serological laboratory methods.
  • Blood group determination is essential in transfusion treatment to prevent and clarify transfusion incidents, in transplantation, in prenatal care, in forensic medicine and much more.
  • the blood group system that has been known for the longest and is used as standard in blood group determination is the ABO system with the blood groups ( Phenotypes) A, B, AB and 0.
  • the blood group of a sample is determined by detection of the blood group substances by specific antigen-antibody reactions when a serum containing the respective antibodies, here referred to as blood group serum, is supplied.
  • hemagglutination By analyzing the hemagglutination reaction of an erythrocyte sample with different antisera, the pattern of the antigens present in the erythrocyte sample and thus ultimately the blood group can be determined.
  • a serum cross-test is also carried out, in which antibodies contained in the blood serum of the same sample are detected by specific reactions.
  • Hemagglutination can be visualized in various ways.
  • a previously known method for blood group determination uses round-bottom microtiter plates, a series of different antisera, in particular anti-A, anti-B, anti-D and rhesus control serum for determining the blood group in the ABO system, being pipetted into the wells of the plate and with the erythrocytes to be tested in diluted form.
  • the plate is centrifuged and then carefully shaken.
  • the erythrocytes have agglutinated into a lump which is collected in the middle of the well by the centrifugation step and, if possible, is not destroyed by shaking.
  • a positive reaction can therefore be optically detected as a point or button-shaped accumulation of erythrocytes in the middle of a well.
  • the erythrocytes accumulated in the middle of the well after the centrifugation step are thus distributed by shaking over a large part of the U-shaped well bottom.
  • a negative reaction can thus be optically detected by a flat erythrocyte stain extending over the bottom of the depression.
  • Such a method with additional heating, washing and two centrifugations is, for example, from the reference Parker JL, Maroux DA, Hafleigh EB, Germet FC: Modified microtiter tray method for blood typing, Transfusion (Philadelphia) 1978, 18 (4), 417- 22 [Reference in: 15-Immunochemistry, Vol. 89, 1879, Page 425].
  • Another method uses specially prepared microtiter plates for the detection of antibody-antigen reactions, in which a step-like structure is milled into the V-bottom of the individual wells.
  • the width of the individual stairs is of the order of a few micrometers.
  • the wells of the plate are reacted in a known manner with antisera with erythrocyte and blood serum samples and evaluated after an incubation period. If there is no antibody-antigen reaction in a well, the erythrocytes collect in the middle of the V-shaped well and can be detected as point or button-shaped sediment. If the reaction is positive, however, the erythrocytes cross-link and form a flat, agglutinated structure that is held by the stepped structure.
  • This method can be automated as a classic sedimentation method, in which no additional mechanical interventions are necessary; Evaluation is also possible automatically, photometrically or with a video camera, based on clear sedimentation images that are relatively stable to mechanical disturbances.
  • the high expenditure for producing the microtiter plates in question by milling the stair structure is problematic. Therefore, the prices of the microtiter plates are so high that a single use is not economically viable.
  • complex cleaning and sterilization steps of the plates are necessary in order not to get falsified results.
  • the service life of the microtiter plates is limited to around 60 uses.
  • bovine albumin in the detection of antibodies is known per se.
  • the serum of each blood donor is tested with test erythrocytes in a three-step test for the presence of antibodies before each donation.
  • the saline phase a 5% test erythrocyte suspension is mixed with serum from the blood donor and centrifuged. If the erythrocytes clump, the serum contains complete antibodies of the IgM type.
  • the supplement phase the serum test erythrocyte mixture is supplemented.
  • Supplement is the generic term for protein-containing solutions such as AB serum and bovine albumin as well as macromolecular solutions such as dextran, gelatin and low ionic strength solutions (R.
  • DE 195 49 049 discloses a test plate for an agglutination test with a large number of recesses formed therein, each of which has Protein A and / or Protein G adhering to a surface; however, these are only able to detect Igg antibodies.
  • a test plate made of polycarbonate with V-shaped depressions, which are rounded at the lowest point, is known, which is designed for several heating cycles, which is why the test plate is heat-resistant up to 125 degrees Celsius.
  • the invention has for its object to provide a method for erythrocyte-side blood group determination, which can be easily and inexpensively automated both in the preparation and in the evaluation of the samples, both semi and fully automated, and which allows the use of disposable microtiter plates .
  • the object is achieved by a method for erythrocyte-side blood group determination according to claim 1 by using pointed bottom microtiter plates; Pipetting in a predetermined volume of one or more blood group sera diluted with physiological saline one well each of the microtiter plates, the dilution ratios of the serum or sera being determined in a known manner by pre-titration; Adding a predetermined volume of physiological saline diluted erythrocytes of the blood to be typed to the respective reagents; Incubation of at least 30 minutes at temperatures from about 15 degrees Celsius to 35 degrees Celsius; optical evaluation of the sedimentation image to detect erythrocyte agglutination by antigen-antibody reaction, whether an antibody-antigen reaction has taken place in a well of the microtiter plate, steps 1.1. until 1.5. be carried out automatically using a pipetting machine by means of a control program for controlling the machine, the optical evaluation of step 1.5. is carried out photometrically or video-controlled.
  • the absorption of the erythrocyte-reagent mixture contained in the well of the microtiter plate is measured and recorded along a predetermined line and the local absorption profile determined in this way is evaluated.
  • the profile length is determined for a fixed profile width and a positive or negative reaction is diagnosed if the profile length is below or above a predeterminable value.
  • a predetermined volume of one or more reagents with all the antigen properties of the erytrocytes is pipetted into a well of the microtiter plate, the dilution ratios of the sera being determined in a known manner by pre-titration and as sera monoclonal or pol clonal antibodies Sera are used, preferably monoclonal antibody sera. Monoclonal or polyclonal antibody sera are used as sera.
  • a predetermined volume of one or more of the following reagents is preferably pipetted into a well of the microtiter plate: a) anti-A serum diluted with physiological saline solution, b) anti-B serum diluted with physiological saline solution, c ) anti-D serum diluted with physiological saline, d) rhesus control serum diluted with physiological saline, wherein the dilution ratios of the sera were determined in a known manner by pre-titration and albumin is added to the solution in such a way that the albumin concentration is 0.05 mg / ml to 2.2 g / ml and at room temperature from approx. 18 to 28 Degrees Celsius is worked and monoclonal or polyclonal antibody sera are used as sera.
  • the procedure is a classic sedimentation procedure without a centrifugation phase or shaking the samples and without the use of a (37 degree C) incubator.
  • the method can be automated with regard to the preparation and evaluation of the samples, in particular it can be carried out with pipetting machines of a known type.
  • the method can be carried out either semiautomatically or fully automatically, semiautomatic being understood as a method in which the microtiter plate is moved by hand in any step.
  • Fully automated means the automatic pipetting, the mechanical movements or manipulations of the plates, the time management and the automatic evaluation.
  • antisera / blood group sera are used to detect the individual blood group substances and thus to determine the blood group by evaluating the reactions of a sample with a series of antisera.
  • one or a combination of the following blood group sera is used to determine the blood group in the ABO system: anti-A, anti-B, anti-D and rhesus control serum.
  • any other blood group sera can also be used to determine further blood group characteristics in the context of the method according to the invention, e.g. Ag, C, c, E, e, K.
  • the commercially available antisera are diluted with physiological saline, the optimal dilution ratios to obtain a reliable reaction due to possible concentration and / or effectiveness fluctuations between sera from different manufacturers or between different batches in a known manner by pre-titration, e.g. using a geometric dilution series.
  • albumin preferably bovine albumin
  • albumin Concentration of the reagent thus formed is 0.05 mg / ml to 2.2 g / ml.
  • the albumin concentration for all reagents is 0.1 mg / ml to 1.0 g / ml, in a further embodiment 0.2 mg / ml to 1.0 mg / ml.
  • Reliable reaction results were also achieved with an albumin concentration of 0.3 mg / ml to 0.4 mg / ml for all reagents.
  • the reactions can also be achieved without adding albumin due to the use of monoclonal antibody sera.
  • pre-titration to determine the optimal dilution ratios is also carried out with the addition of albumin in the concentration used in the blood group determination.
  • sodium acid or another preservative is preferably added to the reagents in a concentration of 0.01 to 0.02 mg / ml, preferably 0.016 to 0.02 mg / ml, in the total solution.
  • a predetermined volume, usually 25 ⁇ l, of one or more of the previously applied reagents is pipetted into a V-shaped well of the microtiter plate by means of an automatic pipetting device, which is program-controlled.
  • an automatic pipetting device which is program-controlled.
  • the four serums mentioned, anti-A, anti-B, anti-D and rhesus control serum are sufficient on the erythrocyte side. If further blood group characteristics are to be determined, further wells of the microtiter plate must be filled with the appropriate reagent for each erythrocyte sample to be examined.
  • the blood groups of a plurality of samples can be typed on a microtiter plate.
  • the automatic pipetting device is correspondingly programmed in a simple manner by means of a control program, preferably using software.
  • a predetermined volume, usually likewise 25 ⁇ l, of an erythrocyte suspension diluted with physiological saline solution is added to the reagent pipetted into a V-shaped well.
  • the dilution ratio of the erythrocyte suspension is approximately 1:60 to 1:20, preferably 1:81.
  • Each blood sample is combined with each of the sera used in a well of the microtiter plate.
  • the automatic pipetting device can be programmed accordingly in a simple manner.
  • the microtiter plate filled completely or partially is incubated at temperatures of approximately 15 ° C. to 30 ° C. for approximately 50 to 70 minutes, preferably 60 minutes.
  • the erythrocytes agglutinate in the event of a positive antibody-antigen reaction and form a “lawn” or “carpet” which is already visible to the naked eye and which largely covers the pointed bottom of the wells of the microtiter plate.
  • This lawn formation is preferably achieved by adding albumin and is largely stable after the incubation against mechanical disturbances and also over several hours, possibly even days, reactions being obtainable even without adding albumin.
  • the erythrocytes sediment in the middle of the depression at the deepest point of the soil and are optically detectable as erythrocyte clumps. Negative and positive reactions are always clearly distinguishable when carrying out the method according to the invention due to a clear punctiform or flat sedimentation. Reliable results were observed with an incubation time of about 60 minutes at room temperature.
  • the sedimentation images are preferably, also automatically, optically evaluated to detect erythrocyte agglutination by means of an antigen-antibody reaction.
  • the optical evaluation can be done manually, i.e. by eye, by an operator who does not have to be specially trained because of the clear sedimentation images that can be achieved.
  • the microtiter plates are automatically evaluated, the plates being inserted into and removed from the photometer using a gripping robot.
  • An automatic evaluation e.g. photometrically or by evaluating images from a video camera is reliably possible because of the clear sedimentation images that can be achieved by the invention. This leads to considerable time and cost savings as well as increased confusion of the samples.
  • a particularly advantageous development of the method with regard to the automatic evaluation of the sedimentation images for analyzing whether an antibody-antigen reaction has taken place in a well of the microtiter plate is the evaluation of the sedimentation images by means of a photometer.
  • the absorption or transmission of the erythrocyte-reagent mixture contained in a well is checked along a agreed line measured and recorded. This line preferably runs through the center of the depression and extends from one edge of the depression to the next.
  • the evaluation is preferably carried out using the curve length method.
  • the length L of the profile or a measure therefor e.g. by summing the distances of all or individual points of the measured profile in the two-dimensional data space.
  • a positive or negative reaction is diagnosed if the profile length L of the absorption curve is below or above a predeterminable value. If the transmission was measured, the situation is reversed. In the case of a positive reaction, increased absorption or reduced transmission can be observed over the majority of the width of the depression. This leads to a flat profile with a shortened curve length. In the event of a negative reaction, the absorbent material concentrates on a narrow spatial area, which leads to a strongly pronounced absorption maximum or transmission minimum and thus to an extended curve length.
  • the "lawn formation" effect according to the invention in the case of a positive antigen-antibody reaction can also be achieved instead of albumin with ovalbumin, thyroglobulin, fibrinogen, tissue antigens or a mixture of these substances, including albumin.
  • one or both of the enzymes bromelin or papain for example in a ratio of 0.05V% to 2V%, can also be added to the blood group sera, whereby a reaction can still be achieved for weak antigens.
  • Antigen-antibody reaction Figure 3 shows an agglutination measurement of a cavity with a positive
  • FIG. 4 an agglutination measurement of another cavity with a negative result.
  • FIG. 1 shows the top view of a pointed-bottom microtiter plate 1 with 96 wells 2, which are arranged in 12 rows 1 to 12 of 8 pieces A to H each.
  • fields 1A and 1E is anti-A serum
  • fields 1B and 1F anti-B serum in fields 1B and 1F anti-B serum
  • fields IC and IG anti-D serum and in fields 1D and 1H rhesus control serum of the composition described above and pipetted amount.
  • Erythrocyte suspension of a first blood sample was added to fields 1A to 1D and a second blood sample to fields 1E to 1H.
  • FIG. 1 After an incubation period of approximately one hour, the image shown in FIG. 1 is obtained.
  • fields 1A, 1B, IC, 1E and IG a "turf" has formed due to a positive antigen-antibody reaction, which covers the sloping floor practically completely.
  • the erythrocytes are sedimented in the middle of the well and are visible as a "button.
  • the result for the first sample is as follows: anti-A positive, anti-B positive, anti-D positive, rhesus control negative, i.e. the blood group was determined to be "AB positive”.
  • the result for the second sample is as follows: anti-A positive, anti-B negative, anti-D positive, rhesus control negative, i.e. the blood type was determined to be "A positive”.
  • FIGS. 2a and 2b each show a recess 2 of a microtiter plate 1 with a V-shaped, pointed bottom 3 in cross section. Furthermore, a negative (FIG. 2a) or a positive (FIG. 2b) antigen-antibody reaction is shown schematically.
  • FIG. 2a the erythrocytes have slipped into the center of the well due to gravity and due to a lack of bridging due to a specific antigen-antibody reaction and form a button 4.
  • FIG 2b the erythrocytes have been crosslinked on account of the specific antigen-antibody reaction and form a lawn 5 which covers the inclined floor area 3. Albumin can serve to stabilize the crosslinking.
  • FIG. 3 shows an agglutination measurement of a cavity, in which the points from 10-30 have been taken into account. The result is a lawn and therefore a positive result. The curve length is zero.
  • FIG. 4 shows another agglution measurement again taking points 10 to 30 into account. The result is a button and thus negative. The calculated curve length is 3.06.
  • microtiter plates whose V-shaped depressions have a rounded bottom.
  • the automated process is commercially applicable in all areas in which blood is routinely examined and typed, in particular in the large blood donation services and in hospitals.
  • the usefulness of the sedimentation process is that it takes place without an centrifugation phase or without shaking the samples or without a 37 degree C incubator in an automatic process.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur erythrozytenseitigen Blutgruppen-Bestimmung, bei welchem in vorteilhafter Weise handelsübliche Einweg-Spitzboden-Mikrotiterplatten Verwendung finden. Den Antiseren wird jeweils Albumin derart zugesetzt, dass die Albumin-Konzentration 0,05 mg/ml bis 2,2 g/ml, vorzugsweise 0,2 mg/ml bis 1,0 mg/ml, beträgt. Bei dem Verfahren handelt es sich um ein klassisches Sedimentationsverfahren ohne Zentrifugationsphase oder Aufschütteln der Proben. Es ist somit hinsichtlich der Präparation der Proben leicht automatisierbar, insbesondere mit Pipettierautomaten bekannter Bauart durchführbar. Die Sedimentationsbilder lassen eine eindeutige Unterscheidung zwischen positiven und negativen Reaktionen zu. Das Verfahren ist auswertungstechnisch leicht und zuverlässig automatisiert, insbesondere mit photometrischer optischer Auswertung der Sedimentationsbilder. Dadurch wird ein hoher Probendurchsatz bei minimalen Materialkosten und erhöhter Verwechslungssicherheit erzielt.

Description

Verfahren zur automatisierten, erythrozvtenseitigen Blutgruppen-Bestimmung
Technisches Gebiet:
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur automatisierten erythrozvtenseitigen Blutgruppen-Bestimmung gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
Stand der Technik:
Unter Blutgruppen im engeren Sinne versteht man alle genetisch determinierten
Erythrozyteneigenschaften, die durch das Vorhandensein spezifischer Antigene (Blutgruppensubstanzen) an der Erythrozytenmembran charakterisiert und mit serologischen Labormethoden nachweisbar sind. Die Blutgruppenbestimmung hat wesentliche Bedeutung bei der Transfusionsbehandlung zur Vermeidung und Klärung von Transfusionszwischenfällen, bei Transplantationen, in der Schwan- gerenvorsorge, in der Gerichtsmedizin u.v.m... Das am längsten bekannte und bei der Blutgruppenbestimmung standardmäßig verwendete Blutgruppensystem ist das ABO-System mit den Blutgruppen (Phänotypen) A, B, AB und 0. Die Blutgruppe einer Probe wird durch Nachweis der Blutgruppensubstanzen durch spezifische Antigen-Antikörper-Reaktionen bei Zufuhr eines die jeweiligen Antikörper enthaltenden Serums, hier als Blutgruppenserum bezeichnet, bestimmt.
Die durch spezifische Antikörper ausgelöste Reaktion der an die Erythrozytenmembran gebundenen Blutgruppensubstanzen mit den zugeführten Antikörpern äußert sich in einem Vernetzen und Verklumpen der Erythrozyten, was makroskopisch sichtbar gemacht werden kann und als Hämagglutination bezeichnet wird. Durch Analyse der Hämagglutinationsreaktion einer Erythro- zytenprobe mit verschiedenen Antiseren kann das Muster der in der Erythrozy- tenprobe vorhandenen Antigene und damit schließlich die Blutgruppe bestimmt werden. Zur Sicherheit der Blutgruppenbestimmung wird weiterhin eine Serum- gegenprobe vorgenommen, bei welcher im Blutserum derselben Probe enthaltene Antikörper durch spezifische Reaktionen nachgewiesen werden.
Die Hämagglutination kann auf verschiedene Weise sichtbar gemacht werden. Ein bisher bekanntes Verfahren zur Blutgruppenbestimmung verwendet Rundboden-Mikrotiterplatten, wobei in die Vertiefungen der Platte eine Serie von verschiedenen Antiseren, insbesondere Anti-A, Anti-B, Anti-D und Rhesus- kontrollserum zur Bestimmung der Blutgruppe im ABO-System, einpipettiert und mit den zu testenden Erythrozyten in verdünnter Form versetzt wird. Nach einer Inkubationszeit wird die Platte anzentrifugiert und anschließend vorsichtig aufgeschüttelt. Bei einer positiven Antigen-Antikörper-Reaktion haben sich die Erythrozyten zu einem Klumpen agglutiniert, der sich durch den Zentrifugier- schritt in der Mitte der Vertiefung ansammelt und durch das Aufschütteln möglichst nicht zerstört wird. Eine positive Reaktion ist demnach als eine punkt- oder knopfförmige Erythrozytenansammlung in der Mitte einer Vertiefung optisch zu detektieren. Demgegenüber besteht bei einer negativen Antigen- Antikörper-Reaktion, d.h. nicht erfolgter Agglutination, keine Verbindung zwischen den Erythrozyten. Die nach dem Zentrifugierschritt in der Vertiefungsmitte angesammelten Erythrozyten veteilen sich demnach durch das Aufschütteln über einen Großteil des U-förmigen Vertiefungsbodens. Eine negative Reaktion ist somit durch einen flächigen, über den Boden der Vertiefung ausgedehnten Erythrozytenfleck optisch detektierbar.
Dieses Verfahren ist jedoch nicht bzw. nur höchst aufwendig automatisierbar. Zum einen ist ein Zentrifugier- und ein Aufschüttelungsschritt notwendig und technisch sehr aufwendig zu realisieren. Zum anderen hängt die Zuverlässigkeit der Detektion einer positiven Reaktion von der Stärke der Antikörper-Antigen- Bindung ab: Bei schwachen Bindungen kann der agglutinierte Erythrozyten- klumpen durch äußere Störungen, insbesondere durch das Aufschütteln, wieder getrennt und somit fälschlich als negative Reaktion diagnostiziert werden. Das Verfahren liefert keine Eindeutigkeit. Aus diesem Grunde ist wegen des eventuell fehlenden klaren Sedimentationsbildes auch die automatische Unterscheidung zwischen positiver und negativer Reaktion, z.B. mittels automatischer photometrischer Auswertung, praktisch nicht möglich, sondern muß von einer erfahrenen Bedienperson vorgenommen oder zumindest visuell überprüft werden und ist deshalb sehr zeitaufwendig.
Ein solches Verfahren mit zusätzlicher Erwärmung, Waschen und zweimaligem Zentrifugieren ist zum Beispiel aus der Literaturstelle Parker J.L., Maroux D.A., Hafleigh E.B., Germet F.C.: Modified microtiter tray method for blood typing, Transfusion (Philadelphia) 1978, 18(4), 417-22 [Verweis hierauf in: 15-Immuno- chemistry, Vol. 89, 1879, Page 425] bekannt geworden.
Ein weiteres Verfahren verwendet zur Detektion von Antikörper- Antigen- Reaktionen speziell präparierte Mikrotiterplatten, bei denen in den V-Boden der einzelnen Vertiefungen eine treppenförmige Struktur eingefräst ist. Die Breite der einzelnen Treppen liegt in der Größenordnung von einigen Mikrometern. In den Vertiefungen der Platte werden in bekannter Weise Antiseren mit Erythrozyten- und Blutserumsproben zur Reaktion gebracht und nach einer Inkubationszeit ausgewertet. Findet in einer Vertiefung keine Antikörper- Antigen-Reaktion statt, so sammeln sich die Erythrozyten in der Mitte der V- förmigen Vertiefung und sind als punkt- oder knopffόrmiges Sediment detektierbar. Bei positiver Reaktion vernetzen jedoch die Erythrozyten und bilden ein flächig agglutiniertes Gebilde, das durch die treppenförmige Struktur gehalten wird. Dieselbe Reaktion in einer V-Boden-Mikrotiterplatte ohne Treppenstruktur würde zu einem Erythrozytenklumpen in der Vertiefungsmitte führen und wäre somit nicht von einer negativen Reaktion unterscheidbar. In diesem Fall ist eine positive Reaktion aufgrund der treppenförmigen Struktur jedoch als flächiger, über den Boden der Vertiefung ausgedehnter "Teppich" aus agglutinierten Erythrozyten optisch detektierbar.
Dieses Verfahren ist als klassische Sedimentationsmethode, bei welcher keine zusätzlichen mechanischen Eingriffe notwendig sind, automatisierbar; auch die Auswertung ist aufgrund klarer Sedimentationsbilder, die gegenüber mechanischen Störungen relativ stabil sind, automatisiert photometrisch oder mit einer Videokamera möglich. Problematisch ist hingegen der hohe Aufwand zur Herstellung der betreffenden Mikrotiterplatten durch Einfräsen der Treppenstruktur. Deshalb liegen die Preise der Mikrotiterplatten so hoch, daß eine einmalige Verwendung wirtschaftlich nicht tragbar ist. Zum Mehrwegbetrieb hingegen sind aufwendige Reinigungs- und Sterilisationsschritte der Platten notwendig, um keine verfälschten Ergebnisse zu erhalten. Weiterhin ist die Lebensdauer der Mikrotiterplatten erfahrungsgemäß auf etwa 60 Einsätze begrenzt.
Die Verwendung von Rinderalbumin beim Antikörpernachweis ist an sich bekannt. Das Serum eines jeden Blutspenders wird vor jeder Spende mit Test- erythrozyten in einem Dreistufentest auf das Vorliegen von Antikörpern unter- sucht. In der ersten Stufe, der Kochsalzphase, wird eine 5%ige Testerythro- zytensuspension mit Serum des Blutspenders vermengt und zentrifugiert. Verklumpen die Erythrozyten, enthält das Serum komplette Antikörper vom IgM-Typ. In der zweiten Stufe, der Supplementphase, wird das Serum-Test- erythrozytengemisch mit Supplement versetzt. Supplement ist der Oberbegriff für eiweißhaltige Lösungen wie AB-Serum und Rinderalbumin sowie makromolekulare Lösungen wie Dextran, Gelatine und Lösungen niedriger Ionenstärke (R. Eckstein: Immunhämatologie und Transfusionsmedizin, Gustav Fischer Verlag 1993, Seiten 10-11). Aus der Firmendruckschrift: DADE IgM Anti-D (MS-201), 09.96, der Firma DADE Diagnostika GmbH, München, ist die Verwendung einer Verdünnungslösung von 4,5-6,5 Gew/Vol.% Rinderalbumin und 0,1 Gew/Vol.% Natriumazid als Konservierungsmittel in Zusammenhang mit dem Einsatz von D-Antigen (RH1) bekannt geworden. Das monoklonale D-Antigen ist gentechnischer Herkunft, die polyklonalen D-Antigene sind humanen oder tierischen Ursprungs und werden aus dem Serum gewonnen. Die Verdünnungslösung wird hier als Reagenz verwendet, jedoch gelangen vorbehandelte Mikrotiterplatten zum Einsatz. Ebenso sind ein Waschschritt, ein Zentrifugierschritt und ein Aufschüt- telungsschritt notwendig.
Durch die DE 195 49 049 ist eine Testplatte für einen Agglutinationstest mit einer Vielzahl von darin ausgebildeten Vertiefungen bekannt geworden, die jede an einer Oberfläche anhaftendes Protein A und/oder Protein G aufweisen; diese sind aber nur in der Lage, IggAntikörper nachzuweisen. Durch die EP 0 408 280 A2 ist eine Testplatte aus Polycarbonat mit V-förmigen Vertiefungen, die am tiefsten Punkt gerundet sind, bekannt geworden, welche für mehrere Erhitzungszyklen ausgelegt ist, weshalb die Testplatte bis 125Grad Celsius hitzebeständig ist.
Durch die Literaturstelle J.H. Spindler, M.Kerowgan, H.Eichler, S.F.Goldmann: Photometric Evaluation of the Solid-Phase Antiglobulin Test Using Length Measurement of the Absorption Curve, Vox Sang 1998; 74, 36-41 ist ein photometrisches Auswerteverfahren über die Vermessung der Kurvenlänge des Sedimentationsbildes in Mikrotiterplatten vorgeschlagen worden.
Technische Aufgabe:
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur erythrozvtenseitigen Blutgruppen-Bestimmung anzugeben, welches sowohl in der Präparation als auch in der Auswertung der Proben einfach und kostengünstig automatisierbar, sowohl semi- wie auch vollautomatisierbar, ist und welches die Verwendung von Einweg-Mikrotiterplatten erlaubt.
Offenbarung der Erfindung und deren Vorteile: Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur erythrozvtenseitigen Blutgruppen-Bestimmung gemäß Anspruch 1 durch die Verwendung von Spitzboden- Mikrotiterplatten; Einpipettieren eines vorbestimmten Volumens eines oder mehrerer mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnter Blutgruppenseren in jeweils eine Vertiefung der Mikrotiterplatte, wobei die Verdünnungsverhältnisse des Serums bzw. der Seren jeweils in bekannter Weise durch Vortitrierung ermittelt wurden; Hinzufügen eines vorbestimmten Volumens mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnter Erythrozyten des zu typisierenden Bluts zu den jeweiligen Reagenzien; Inkubation von wenigstens 30 Minuten bei Temperaturen von etwa 15Grad Celsius bis 35Grad Celsius; optische Auswertung des Sedimentationsbildes zur Erfassung einer Erythrozyten- agglutination durch Antigen-Antikörper-Reaktion, ob in einer Vertiefung der Mikrotiterplatte eine Antikörper-Antigen-Reaktion stattgefunden hat, wobei die Schritte 1.1. bis 1.5. automatisch unter Verwendung eines Pipettierautomaten mittels eines Steuerungsprogramms zur Steuerung des Automaten durchgeführt werden, wobei die optische Auswertung des Schrittes 1.5. auf photometrischem Weg oder videogesteuert vorgenommen wird.
Zur automatischen optisch- photometrischen Auswertung wird die Absorption des in der Vertiefung der Mikrotiterplatte enthaltenen Erythrozyten-Reagenz- Gemischs entlang einer vorbestimmten Linie gemessen und aufgezeichnet und das so ermittelte örtliche Absorptionsprofil ausgewertet. Dazu wird für eine feste Profilbreite die Profillänge ermittelt und eine positive bzw. negative Reaktion diagnostiziert, wenn die Profillänge unterhalb bzw. oberhalb eines vorbestimmbaren Wertes liegt.
Zur Blutgruppenbestimmung im ABO-System wird ein vorbestimmtes Volumen einer oder mehrerer Reagenzien mit sämtlichen Antigen-Eigenschaften der Erytrozyten in jeweils eine Vertiefung der Mikrotiterplatte einpipettiert, wobei die Verdünnungsverhältnisse der Seren jeweils in bekannter Weise durch Vortitrierung ermittelt wurden und als Seren monoklonale oder pol klonale Antikörper-Seren verwendet werden, vorzugsweise monoklonale Antikörper-Seren. Als Seren werden monoklonale oder polyklonale Antikörper-Seren verwendet.
Vorzugsweise wird zur Blutgruppenbestimmung im ABO-System ein vorbestimmtes Volumen eines oder mehrerer der folgenden Reagenzien in jeweils eine Vertiefung der Mikrotiterplatte einpipettiert: a) Mit physiologischer Kochsalzlösung verdünntes Anti-A-Serum, b) mit physiologischer Kochsalzlösung verdünntes Anti-B-Serum, c) mit physiologischer Kochsalzlösung verdünntes Anti-D-Serum, d) mit physiologischer Kochsalzlösung verdünntes Rhesuskontroll-Serum, wobei die Verdünnungsverhältnisse der Seren jeweils in bekannter Weise durch Vortitrierung ermittelt wurden und der Lösung jeweils Albumin derart zugesetzt wird, daß die Albumin-Konzentration 0,05 mg/ml bis 2,2 g/ml beträgt und bei Raumtemperatur von ca. 18 bis 28 Grad Celsius gearbeitet wird und wobei als Seren monoklonale oder polyklonale Antikörper-Seren verwendet werden.
Vorteilhaft werden handelsübliche und damit kostengünstige Einweg-Spitzboden- Mikrotiterplatten verwendet. Bei dem Verfahren handelt es sich um ein klassisches Sedimentationsverfahren ohne eine Zentrifugationsphase oder ein Auf- schütteln der Proben und ohne den Einsatz eines (37Grad C-) Inkubators. Insbesondere ist das Verfahren hinsichtlich der Präparation und Auswertung der Proben automatisierbar, insbesondere kann es mit Pipettierautomaten bekannter Bauart durchgeführt werden. Dabei kann das Verfahren entweder semiautomatisch oder vollautomatisch durchgeführt werden, wobei unter semiautoma- tisch ein Verfahren verstanden wird, bei dem die Mikrotiterplatte bei irgend einem Schritt von Hand bewegt wird. Unter Vollautomatisation wird die automatische Pipettierung, die mechanischen Bewegungen bzw. Manipulationen der Platten, das Zeitmanagement sowie die automatische Auswertung verstanden.
In bekannter Weise werden handelsübliche Antiseren/Blutgruppenseren zur Detektion der einzelnen Blutgruppensubstanzen und damit zur Bestimmung der Blutgruppe durch Auswertung der Reaktionen einer Probe mit einer Serie von Antiseren herangezogen. In einer Ausprägung der Erfindung wird zur Bestimmung der Blutgruppe im ABO-System eines oder eine Kombination der folgenden Blutgruppenseren verwendet: Anti-A-, Anti-B-, Anti-D- und Rhesuskontroll- Serum. Es liegt jedoch auf der Hand, daß beliebige andere Blutgruppenseren ebenso zur Bestimmung weiterer Blutgruppenmerkmale im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens herangezogen werden können, z.B. Ag, C, c, E, e, K.
Die handelsüblichen Antiseren werden mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, wobei die zum Erhalt einer zuverlässigen Reaktion optimalen Verdünnungsverhältnisse wegen möglicher Konzentrations- und/oder Wirksamkeitsschwankungen zwischen Seren verschiedener Hersteller oder zwischen verschiedenen Chargen jeweils in bekannter Weise durch Vortitrierung, z.B. mittels einer geometrischen Verdünnungsserie, ermittelt wurden.
Erfindungsgemäß ist den verdünnten Blutgruppenseren jeweils Albumin, vorzugsweise Bovines Albumin, derart zugesetzt ist, daß die Albumin- Konzentration des somit entstandenen Reagenzes jeweils 0,05 mg/ml bis 2,2 g/ml beträgt. In einer vorteilhaften Ausführung der Erfindung beträgt die Albumin- Konzentration für alle Reagenzien 0,1 mg/ml bis 1,0 g/ml, in einer weiteren Ausführung 0,2 mg/ml bis 1,0 mg/ml. Zuverlässige Reaktionsergebnisse wurden weiterhin mit einer Albumin-Konzentration von 0,3 mg/ml bis 0,4 mg/ml für alle Reagenzien erzielt. Allerdings lassen sich die Reaktionen auch ohne Zusetzen von Albumin aufgrund der Verwendung von monoklonalen Antikörper-Seren erzielen.
Die obengenannte Vortitrierung zur Ermittlung der optimalen Verdün- nungsverhältnisse wird ebenfalls unter Zusatz von Albumin in der bei der Blutgruppenbestimmung verwendeten Konzentration durchgeführt. Zur Konservierung wird den Reagenzien vorzugsweis Natrium-Acid oder ein anderes Konservierungsmittel in einer Konzentration von 0,01 bis 0,02 mg/ml, vorzugsweise 0,016 bis 0,02 mg/ml, in der Gesamtlösung zugefügt.
Mittels eines Pipettierautomaten, der programmgesteuert ist, wird ein vorbestimmtes Volumen, in der Regel 25 μl, eines oder mehrerer der zuvor angesetzten Reagenzien in jeweils eine V-förmige Vertiefung der Mikrotiterplatte einpipettiert. Zur vollständigen Zuordnung einer Blutprobe zu einer Blutgruppe des ABO-Systems mit Rhesusfaktoren sind erythrozytenseitig die vier genannten Seren, Anti-A-, Anti-B-, Anti-D- und Rhesuskontroll-Serum, ausreichend. Sollen weitere Blutgruppenmerkmale bestimmt werden, müssen je zu untersuchender Erythrozytenprobe weitere Vertiefungen der Mikrotiterplatte mit dem entsprechenden Reagenz befüllt werden. Auf einer Mikrotiterplatte können je nach Anzahl der zu bestimmenden Blutgruppenmerkmalen die Blutgruppen einer Mehrzahl von Proben typisiert werden. Bei der automatischen Pipettierung wird der Pipettierautomat in einfacher Weise mittels eines Steuerprogramms, vorzugsweise softwaremäßig, entsprechend programmiert.
Zu dem in eine V-förmige Vertiefung pipettierten Reagenz wird jeweils ein vorbestimmtes Volumen, in der Regel ebenfalls 25 μl, einer mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnten Erythrozytensuspension hinzugefügt. Das Verdünnungsverhältnis der Erythrozytensuspension beträgt etwa 1: 60 bis 1: 120, vorzugsweise 1: 81. Jede Blutprobe wird mit jedem der verwendeten Seren in einer Vertiefung der Mikrotiterplatte zusammengeführt. Im Falle einer automatischen Pipettierung kann der Pipettierautomat in einfacher Weise entsprechend programmiert werden. Die je nach Anzahl zu typisierende Blutproben und Anzahl zu bestimmender Blutgruppenmerkmale ganz oder teilweise befüllte Mikrotiterplatte wird bei Temperaturen von etwa 15 °C bis 30 °C für etwa 50 bis 70 Minuten, vorzugsweise 60 Minuten, inkubiert. Dabei agglutinieren die Erythrozyten bei einer positiven Antikörper-Antigen-Reaktion und bilden einen schon mit bloßen Auge sichtbaren "Rasen" bzw. "Teppich", der den Spitzboden der Vertiefungen der Mikrotiterplatte flächig weitgehend bedeckt. Diese Rasenbildung wird bevorzugt durch das Zufügen von Albumin erzielt und ist nach der Inkubation gegenüber mechanischen Störungen und auch über mehrere Stunden, ggfs. sogar Tage, weitgehend stabil, wobei Reaktionen auch ohne Zusetzung von Albumin erhältlich sind. Bei einer negativen Antikörper-Antigen-Reaktion sedimentieren die Erythrozyten in der Mitte der Vertiefung am tiefsten Punkt des Bodens und sind als Erythrozytenklumpen optisch detektierbar. Negative und positive Reaktionen sind bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens aufgrund einer deutlichen punktfόrmigen bzw. flächigen Sedimentation stets klar unterscheidbar. Bei einer Inkubationszeit von etwa 60 Minuten bei Zimmertemperatur wurden zuverlässige Ergebnisse beobachtet.
An die Inkubationsphase direkt anschließend oder auch einige Stunden bis sogar Tage später erfolgt die, vorzugsweise ebenfalls automatische, optische Auswertung der Sedimentationsbilder zur Erfassung einer Erythrozytenagglutination durch Antigen-Antikörper-Reaktion. Die optische Auswertung kann manuell, d.h. schon nach Augenmaß, durch eine Bedienperson erfolgen, die wegen der erzielbaren klaren Sedimentationsbilder nicht gesondert geschult sein muß. Erfindungsgemäß werden die Mikrotiterplatten automatisch ausgewertet, wobei die Platten mittels eines Greifroboters in den Photometer eingeführt und herausgenommen werden. Eine automatische Auswertung, z.B. photometrisch oder durch Auswertung von Bildern einer Videokamera, ist wegen der durch die Erfindung erzielbaren klaren Sedimentationsbilder zuverlässig möglich. Dies führt zu erheblichen Zeit- und Kosteneinsparungen sowie zu erhöhter Verwechslungssicherheit der Proben.
Eine hinsichtlich der automatischen Auswertung der Sedimentationsbilder zur Analyse, ob in einer Vertiefung der Mikrotiterplatte eine Antikörper- An tigen- Reaktion stattgefunden hat, besonders vorteilhafte Weiterbildung des Verfahrens ist die Auswertung der Sedimentationsbilder mittels eines Photometers. Dabei wird die Absorption oder Transmission des in einer Vertiefung enthaltenen Erythrozyten-Reagenz-Gemischs entlang einer vorbe- stimmten Linie gemessen und aufgezeichnet. Diese Linie verläuft vorzugsweise durch den Mittelpunkt der Vertiefung und reicht von einem Rand der Vertiefung bis zum nächsten.
Vorzugsweise wird die Auswertung nach der Kurvenlängenmethode vorgenommen. Dabei wird für eine feste Profilbreite, d.h. für ein vorbestimmtes Intervall Δx, die Länge L des Profils bzw. ein Maß dafür ermittelt, z.B. durch Summation der Abstände aller oder einzelner Punkte des gemessenen Profils im zweidimensionalen Datenraum. Eine positive bzw. negative Reaktion wird diagnostiziert, wenn die Profillänge L der Absorptionskurve unterhalb bzw. oberhalb eines vorbestimmbaren Wertes liegt. Falls die Transmission gemessen wurde, sind die Verhältnisse umgekehrt. Denn bei einer positiven Reaktion ist über den Großteil der Breite der Vertiefung eine erhöhte Absorption bzw. verminderte Transmission zu beobachten. Dies führt zu einem flachen Profil mit verkürzter Kurvenlänge. Bei einer negativen Reaktion konzentriert sich das absorbierende Material auf einen engen räumlichen Bereich, was zu einem stark ausgeprägten Absorptionsmaximum bzw. Transmissionsminimum und damit zu einer verlängerten Kurvenlänge führt.
Die erfindungsgemäße Wirkung der "Rasenbildung" im Falle einer positiven Antigen-Antikörper-Reaktion kann anstelle von Albumin auch mit Ovalbumin, Thyreoglobulin, Fibrinogen, Gewebsantigenen oder eine Mischung dieser Substanzen einschließlich Albumin erzielt werden.
In besonderen Anwendungsfällen können den Blutgruppenseren auch eines oder beide der Enzyme Bromelin oder Papain, zum Beispiel in einem Verhältnis von 0,05V% bis 2V%, zugesetzt werden, wodurch für schwache Antigene noch eine Reaktion erzielt werden kann.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren lassen sich in vorteilhafter Weise handelsübliche Einmal-Mikrotiterplatten zur erythrozvtenseitigen Blutgruppenbestimmung in einem einfachen klassischen Sedimentationsverfahren einsetzen. Die Sedimentationsbilder lassen eine eindeutige Unterscheidung zwischen positiven und negativen Reaktionen zu. Das Verfahren ist in einfacher Weise automatisiert, insbesondere unter Einsatz eines Pipettierautomaten und einer automatisierten optischen Auswertung der Sedimentationsbilder mit mechanisiertem Handling der Platten und einem Zeitmanagement sowie Softwareprogramm. Dadurch wird ein hoher Probendurchsatz bei minimalen Materialkosten und erhöhter Verwechslungssicherheit erzielt.
Im folgenden ist ein Beispiel für die erfindungsgemäßen Mischungsverhältnisse zur Bestimmung von Blutgruppen im ABO-System und die Durchführung des Verfahrens beschrieben: a) 500 μl handelsübliches Anti-A-Serum wird mit 32 ml physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, entsprechend einer Verdünnung von 1:65. Der Lösung wird 50 μl 10%ige Natrium-Acid-Lösung und 50 μl 22%iges Rinderalbumin zugefügt. Dies entspricht einer Albumin-Konzentration von 0,337 mg/ml bzw. einer Albumin- Verdünnung von 1:652. b) 2 ml handelsübliches Anti-B-Serum wird mit 30 ml physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, entsprechend einer Verdünnung von 1:16. Der Lösung wird ebenfalls 50 μl 10%ige Natrium-Acid-Lösung und 50 μl 22%iges Rinderalbumin zugefügt. Dies entspricht einer Albumin-Konzentration von 0,343 mg/ml bzw. einer Albumin-Verdünnung von 1:642. c) Anti-D-Serum und Rhesus-Kontrollserum wird wie im Fall b) angesetzt und verdünnt. Schon dieses Herstellen der Mischungsverhältnisse der Blutgruppenseren kann automatisch durchgeführt werden.
Mittels eines Pipettierroboters werden je 25 μl der unter a), b) und c) genannten Reagenzien zur Anti-A-, Anti-B-, Anti-D-Bestimmung und Rhesuskontrolle in die Vertiefungen einer V-Boden-Mikrotiterplatte einpipettiert. Anschließend werden je 25 μl der zu untersuchenden Spender-Erythrozyten, die im Verhältnis 1:81 mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt sind, mittels des Pipettierroboters zugefügt. Nach cirka einer Stunde Sedimentation, Inkubation bei Raumtemperatur, werden die Reaktionen photometrisch ausgewertet. Bei einer positiven Reaktion hat über die spezifischen Antikörper eine Vernetzung der Erythrozyten stattgefunden. Es bildet sich ein kompletter Rasen über die gesamte Bodenfläche. Die Rasen- und Knopfbildung wird durch Albumin gefördert und stabilisiert. Bei einer negativen Reaktion sind die Erythrozyten in der Spitze des V-Bodens sedimentiert. Zur Auswertung der Reaktionen eignet sich besonders die Kurvenlängen-Methode.
Statt Spitzboden-Mikrotiterplatten können auch solche Platten zum Einsatz gelangen, deren Boden mit kleinem Radius leicht gerundet ist. Kurzbeschreibung der Zeichnung, in der zeigen:
Figur 1 die Aufsicht auf eine Spitzboden-Mikrotiterplatte
Figur 2a und 2b im Querschnitt eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit V- förmigen Boden sowie einer negativen bzw. einer positiven
Antigen-Antikörper-Reaktion Figur 3 eine Agglutinationsmessung einer Kavität mit positivem
Ergebnis und Figur 4 eine Agglutinationsmessung einer anderen Kavität mit negativem Ergebnis.
Bevorzugte Ausführungsform der Erfindung:
Figur 1 zeigt die Aufsicht auf eine Spitzboden-Mikrotiterplatte 1 mit 96 Vertiefungen 2, die in 12 Reihen 1 bis 12 zu je 8 Stück A bis H angeordnet sind. In die Felder 1A und 1E ist Anti-A-Serum, in die Felder 1B und 1F Anti-B-Serum, in die Felder IC und IG Anti-D-Serum und in die Felder 1D und 1H Rhesus- Kontrollserum der oben beschriebenen Zusammensetzung und Menge pipettiert. In die Felder 1A bis 1D wurde Erythrozytensuspension einer ersten Blutprobe, in die Felder 1E bis 1H einer zweitem Blutprobe zugefügt.
Nach einer Inkubationszeit von etwa einer Stunde ergibt sich das in Figur 1 dargestellte Bild. In den Feldern 1A, 1B, IC, 1E und IG hat sich aufgrund einer positiven Antigen-Antikörper-Reaktion ein "Rasen" ausgebildet, der die schräge Bodenfläche praktisch vollständig bedeckt. In den übrigen Feldern sind die Erythrozyten in der Mitte der Vertiefung sedimentiert und sind als "Knopf sichtbar.
Für die erste Probe (Felder 1A bis 1D) ergibt sich folgendes Ergebnis: Anti-A positiv, Anti-B positiv, Anti-D positiv, Rhesuskontrolle negativ, d.h. die Blutgruppe wurde zu "AB positiv" bestimmt. Für die zweite Probe (Felder 1E bis 1H) ergibt sich folgendes Ergebnis: Anti-A positiv, Anti-B negativ, Anti-D positiv, Rhesuskontrolle negativ, d.h. die Blutgruppe wurde zu "A positiv" bestimmt.
Die Figuren 2a und 2b zeigen je eine Vertiefung 2 einer Mikrotiterplatte 1 mit V- förmigen, spitzen Boden 3 im Querschnitt. Weiterhin ist schematisch eine negative (Fig. 2a) bzw. eine positive (Fig. 2b) Antigen-Antikörper-Reaktion dargestellt. In Figur 2a sind die Erythrozyten aufgrund der Schwerkraft und aufgrund einer fehlenden Brückenbildung durch spezifische Antigen-Antikörper- Reaktion in die Mitte der Vertiefung gerutscht und bilden einen Knopf 4. In Figur 2b wurden die Erythrozyten aufgrund der spezifischen Antigen-Antikörper- Reaktion vernetzt und bilden einen Rasen 5, der die schräge Bodenfläche 3 bedeckt. Albumin kann dabei zur Stabilisierung der Vernetzung dienen.
Figur 3 zeigt eine Agglutinationsmessung einer Kavität, bei der die Punkte von 10-30 berücksichtigt worden sind. Als Ergebnis zeigt sich ein Rasen und somit ein positives Ergebnis. Es ergibt sich eine Kurvenlänge von Null. Figur 4 zeigt eine weitere Agglutionationsmessung wiederum unter Berücksichtigung der Punkte 10 bis 30. Das Ergebnis ist ein Knopf und somit negativ. Es ergibt sich rechnerisch eine Kurvenlänge von 3,06.
Statt Spitzboden-Mikrotiterplatten können auch solche Mikrotiterplatten verwendet werden, deren V-förmige Vertiefungen einen gerundeten Boden aufweist.
Gewerbliche Anwendbarkeit:
Das automatisierte Verfahren ist in allen Bereichen, in denen routinemäßig Blut untersucht und typisiert wird, gewerblich anwendbar, insbesondere bei den großen Blutspendediensten und in Krankenhäusern. Die Nützlichkeit des Sedimentationsverfahrens liegt darin, daß es ohne Zentrifugationsphase oder ohne Aufschütteln der Proben oder ohne 37GradC-Inkubator bei einem automatischen Ablauf erfolgt.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur erythrozvtenseitigen Blutgruppen-Bestimmung, gekennzeichnet durch 1.1. die Verwendung von Spitzboden-Mikrotiterplatten (1);
1.2. Einpipettieren eines vorbestimmten Volumens eines oder mehrerer mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnter Blutgruppenseren in jeweils eine Vertiefung (2) der Mikrotiterplatte, wobei die Verdünnungsverhältnisse des Serums bzw. der Seren jeweils in bekannter Weise durch Vortitrierung ermittelt wurden
1.3. Hinzufügen eines vorbestimmten Volumens mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnter Erythrozyten des zu typisierenden Bluts zu den jeweiligen Reagenzien;
1.4. Inkubation von wenigstens 30 Minuten bei Temperaturen von etwa 15Grad Celsius bis 35Grad Celsius;
1.5. optische Auswertung des Sedimentationsbildes (4,5) zur Erfassung einer Erythrozytenagglutination durch Antigen-Antikörper-Reaktion, ob in einer Vertiefung (2) der Mikrotiterplatte (1) eine Antikörper-Antigen-Reaktion stattgefunden hat, 1.6 wobei die Schritte 1.1. bis 1.5. automatisch unter Verwendung eines Pipettierautomaten mittels eines Steuerungsprogramms zur Steuerung des Automaten durchgeführt werden und die optische Auswertung des Schrittes 1.5. auf photometrischem Weg oder videogesteuert vorgenommen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur automatischen optisch-photometrischen Auswertung die Absorption des in der Vertiefung (2) der Mikrotiterplatte (1) enthaltenen Erythrozyten-Reagenz- Gemischs entlang einer vorbestimmten Linie gemessen und aufgezeichnet und das so ermittelte örtliche Absorptionsprofil ausgewertet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß für eine feste Profilbreite die Profillänge ermittelt wird und eine positive bzw. negative Reaktion diagnostiziert wird, wenn die Profillänge unterhalb bzw. oberhalb eines vorbestimmbaren Wertes liegt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Linie durch den Mittelpunkt der Vertiefung (2) der Mikrotiterplatte (1) verläuft und von einem Rand der Vertiefung (2) bis zum nächsten reicht und die Aufzeichnung des Absorptions- bzw. Transmissionsprofils für alle Vertiefungen (2) wiederholt wird und die so ermittelten örtlichen Profile ausgewertet werden.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Auswertung nach der Kurvenlängenmethode vorgenommen wird und für eine feste Profilbreite, das ist für ein vorbestimmtes Intervall Δx, die Länge L des Profils bzw. ein Maß dafür ermittelt wird, z.B. durch Summation der Abstände aller oder einzelner Punkte des gemessenen Profils im zweidimensionalen Datenraum, wobei eine positive bzw. negative Reaktion diagnostiziert wird, wenn die Profillänge L der Absorptionskurve unterhalb bzw. oberhalb eines vorbestimmbaren Wertes liegt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt 1.2. zur Blutgruppenbestimmung im ABO-System ein vorbe- stimmtes Volumen einer oder mehrerer Reagenzien mit sämtlichen Antigen- Eigenschaften der Erytrozyten in jeweils eine Vertiefung der Mikrotiterplatte einpipettiert wird, wobei die Verdünnungs Verhältnisse der Seren jeweils in bekannter Weise durch Vortitrierung ermittelt wurden und als Seren monoklonale oder polyklonale Antikörper-Seren verwendet werden, vorzugsweise monoklonale Antikörper-Seren.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die folgenden Reagenzien verwendet werden: a) mit physiologischer Kochsalzlösung verdünntes Anti-A-Serum, b) mit physiologischer Kochsalzlösung verdünntes Anti-B-Serum, c) mit physiologischer Kochsalzlösung verdünntes Anti-D-Serum, d) mit physiologischer Kochsalzlösung verdünntes Rhesuskontroll-Serum, und Erythrozyten einer Probe jeweils mit allen der Reagenzien a) bis d) zur Reaktion gebracht werden und die Blutgruppe durch Kombination der jeweiligen Reak- tionsergebnisse (positive bzw. negative Antikörper-Antigen-Reaktion) bestimmt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Lösung jeweils Albumin derart zugesetzt wird, daß die Albumin-Kon- zentration 0,05 mg/ml bis 2,2 g/ml, vorzugsweise 0,1 mg/ml bis 1,0 g/ml, insbesondere 0,2 mg/ml bis 1,0 mg/ml, beträgt und bei Raumtemperatur von ca. 18 bis 28 Grad Celsius gearbeitet wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6, 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Albumin-Konzentration für alle Reagenzien 0,3 mg/ml bis 0,4 mg/ml beträgt.
10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß zum Ansetzen der Reagenzien a) bis d) Rinderalbumin verwendet wird.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die im Schritt 1.3. hinzugefügten Erythrozyten im Verhältnis 1: 60 bis 1: 120 mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt sind.
12. Verfahren nach einem der vorangegangenene Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt 1.4. bei Zimmertemperatur für wenigstens 60 Minuten durchgeführt wird.
13. Verfahren nach einem der vorangegangenene Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien a) bis d) zur Konservierung Natrium- Acid in einer Konzentration von 0,01 bis 0,02 mg/ml enthalten.
14. Verfahren nach einem der vorangegangenene Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle von Albumin Ovalbumin, Thyreoglobulin, Fibrinogen, Gewebsantigene oder eine Mischung dieser Substanzen einschließlich Albumin verwendet wird.
15. Verfahren nach einem der vorangegangenene Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das im Schritt 1.2. und 1.3. genannte vorbestimmte Volumen 15 bis 50 μl, vorzugsweise 25 μl beträgt.
16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß eines oder beide der Enzyme Bromelin oder Papain den Blutgruppenseren zugesetzt wird bzw. werden.
17. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß statt Spitzboden-Mikrotiterplatten solche Mikrotiterplatten verwendet werden, deren V-förmige Vertiefungen einen gerundeten Boden aufweisen.
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