EP1121469A2 - Verfahren und kit zum direkten nachweis von nukleotidsequenzen, aminosäuresequenzen oder antigenen - Google Patents

Verfahren und kit zum direkten nachweis von nukleotidsequenzen, aminosäuresequenzen oder antigenen

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Publication number
EP1121469A2
EP1121469A2 EP99952563A EP99952563A EP1121469A2 EP 1121469 A2 EP1121469 A2 EP 1121469A2 EP 99952563 A EP99952563 A EP 99952563A EP 99952563 A EP99952563 A EP 99952563A EP 1121469 A2 EP1121469 A2 EP 1121469A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleotide sequence
sequence
detector
kit
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP99952563A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Werner Lehmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Attomol Molekulare Diagnostika GmbH
Original Assignee
Attomol Molekulare Diagnostika GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Attomol Molekulare Diagnostika GmbH filed Critical Attomol Molekulare Diagnostika GmbH
Publication of EP1121469A2 publication Critical patent/EP1121469A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates

Definitions

  • the invention relates to a method known as a restrictase chain reaction (RCR) and a kit for the direct detection of target nucleotide sequences, target amino acid sequences or target antigens by amplification of a DNA using a DNA polymerase, a restriction enzyme and a matrix. DNA to which this primer is amplified by binding an initial primer.
  • RCR restrictase chain reaction
  • the invention also relates to the use of this kit in medical diagnostics and criminalistic trace analysis as well as for environmental, food and pharmaceutical analyzes.
  • the high amplification rate of more than 10 9 makes this prepare in larger quantities for later analyzes such as sequencing, cloning etc.
  • the high amplification rate of more than 10 9 also makes this method interesting for medical diagnostics and criminal trace analysis. Specifically, sections of the genome of pathogenic microorganisms can be reproduced in patient samples until they are present in sufficient concentration so that they can then be detected or quantified using conventional DNA detection methods.
  • the PCR can be coupled in a variety of ways with other methods, such as a reverse transcription of messenger ribonucleic acid (mRNA) to determine gene expression or in combination with immunoassays for sensitive antigen detection.
  • mRNA messenger ribonucleic acid
  • the PCR is based on the cyclic primer extension of two primers (oligonucleotides), each of which hybridizes on the complementary strand.
  • the distance between the two primers can be a few nucleotides up to approx. 40 kB.
  • the cycle of the amplification is controlled by a gradual temperature control. The following stages are run through in succession: strand denaturation (95 ° C), primer hybridization (50-70 ° C) and finally the primer extension (74 ° C), in which a polymerase in the presence of dNTPs at the free 3 "ends of the primers synthesized a second strand, the first strand serving as a template. Usually 30 cycles are sufficient for a PCR reaction (approx. 1 h). Each cycle doubles the amount of the target sequence, which is one exponential increase in the reaction product between the primers.
  • LCR Ligase Chain Reaction
  • SDA strand displacement amplification
  • a polymerase and a restriction endonuclease reaction are combined.
  • the properties of a DNA polymerase without exonuclease function eg KlenowExo "
  • Restriction endonuclease only cuts the newly synthesized strand in the area of the primer, creating a new starting point for the polymerase.
  • the process can thus begin again with the replacement of the existing strand. This process takes place at a constant temperature between 37 and 65 ° C and leads to the amplification of the analyte DNA between the four different primers.
  • the disadvantage of this method is the complex course of the reaction.
  • PDA primer digestion amplification
  • the region of the non-hybridized primer which is complementary to the 3 'end of the target is degraded by means of exonuclease III homologous region is phosphorothioated at the 3 "end and thus protected against degradation by exonuclease.
  • the resulting primer (digested primer), which only consists of the region homologous to the 5 "end of the target, hybridizes to the 3" end of the newly synthesized, previously denatured second strand and is extended. After denaturation the digested primer can hybridize the resulting product with both strands. Then the two strands, and thus the target DNA, are amplified thermocyclically.
  • the disadvantage of this method is the thermocyclic temperature regime that must be observed.
  • the invention was therefore based on the object of developing a method for the detection of a wide variety of biomolecules which can be used in routine operation and in which all process steps can be carried out in the same reaction batch, preferably in the same reaction cavity of a microtiter plate.
  • the process should be able to be carried out isothermally.
  • the invention is implemented according to the claims.
  • the method according to the invention for the direct detection of target nucleotide sequences, target amino acid sequences or target antigens by amplification of a nucleotide sequence is carried out using a DNA polymerase and a restriction enzyme and consists in that the target molecule is either brought into solution or immobilized on a solid phase via a capture nucleotide sequence or a detector nucleotide sequence.
  • a matrix DNA is then added to the target nucleotide sequence, which itself serves as an initial primer and is in solution, or to the target molecule, to which a nucleotide sequence serving as an initial primer is coupled via a probe.
  • the term target molecule encompasses nucleotide sequences, amino acid sequences or antigens to be detected.
  • the structure of the matrix DNA is shown schematically in Fig. 1A and 1B.
  • the matrix DNA has a primer hybridization sequence complementary to the 3 "end of the target nucleotide sequence, which serves as an initial primer, or the primer hybridization sequence of the matrix DNA is completely complementary to the initial primer.
  • the primer hybridization Sequence In the 5" direction from the primer hybridization Sequence is followed by an extension sequence, a restriction enzyme recognition sequence and a primer coding sequence.
  • the primer coding sequence is completely or essentially homologous to the primer hybridization sequence. If the detection of the target molecule is carried out indirectly via the probe-mediated binding of a primer, ie the target nucleotide sequence itself is not an initial primer, a washing step is now carried out in order to remove initial primer which is not coupled to the target molecule from the mixture.
  • the DNA polymerase without exonuclease function and the four different dNTPs added.
  • the DNA polymerase synthesizes a second strand complementary to the matrix DNA.
  • a restriction enzyme either by using a correspondingly modified matrix DNA or by Nickenzyme (no modified matrix DNA required) cut only the newly synthesized second strand at the restriction enzyme recognition site.
  • the matrix DNA is largely preserved.
  • the region of the second strand lying in the 3 "direction from the interface, which is completely or essentially homologous to the initial primer is (amplified primer), is then released from the hybrid molecule.
  • This release takes place either by itself via the reaction temperature, since the amplified primer is shorter than the part of the second strand lying in the 5 "direction from the interface. Otherwise, the release takes place by the DNA polymerase attached to the free 3rd "End of the interface and again synthesized the region complementary to the primer-coding sequence of the matrix DNA, ie amplified primer.
  • the released primer can now also hybridize to an unoccupied matrix DNA and be extended. In this way, the initial primer is amplified, and very high amplification rates can be achieved. Subsequently the amplificate is detected and thus the target molecule is detected.
  • Either part of the target nucleotide sequence itself or an initial primer coupled to the target molecule is therefore amplified, the amplification in the latter case - due to the washing step - only being possible if the initial primer is first coupled to the target molecule has been.
  • the target nucleotide sequence is understood to be a single-stranded or double-stranded DNA or an RNA.
  • Target amino acid sequences include, for example, enzymes, peptides, hormones, hormone receptors, allergens, tumor markers, cell surface receptors, transcription factors, recombinant proteins, proteins translated in vitro.
  • the target antigen can also be an amino acid sequence or nucleotide sequence or a polysaccharide, an antibody, a virus, a bacterium, a cell of a eukaryote or any other substance - also synthetically produced - that can be recognized by an antibody.
  • the solid phase preferably consists of a polymer or semiconductor material.
  • a microtiter plate or a porous is particularly preferred as the solid phase Membrane, eg consisting of nylon, nitrocellulose or PVDF, is used.
  • restriction enzyme includes both restriction endonucleases which produce double-strand breaks, such as Eco RI, Hind III, Sac II, BsoB I, Ava I and Hae III, preferably BsoB I, Ava I and Hae III, as well as single strand breaking nick enzymes, e.g. N.BstNB I, N.CviQX I, N.CviP II, V.B ⁇ h I, V.EcoDcm. Roger that.
  • a nick enzyme is preferably used.
  • the nick enzyme N.BstNB I has proven to be very suitable for the process according to the invention.
  • Matrix DNA modified so that it can not be cut by the restriction endonuclease.
  • the modification can be carried out, for example, by introducing methyl groups (methyl matrix DNA, cf.
  • the amplification reaction is isothermal, that is to say at a constant temperature in the range from 15-75 ° C., preferably from 37 to 55 ° C., since the denaturation of the DNA to be amplified, which is required for PCR, LCR and PDA, can be omitted. That means it won't be expensive Equipment needed to control a thermal temperature regime.
  • the required temperatures can be set by incubation in relatively simple devices (e.g. a thermomixer or an oven) that are accessible to any routine laboratory.
  • a sequence is used as matrix DNA whose primer hybridization sequence is preferably at least 10 nucleotides and whose extension sequence is preferably 0-20 nucleotides long.
  • its 3 "OH group is chemically modified, for example by an aminohexyl group, or its 3" terminal deoxynucleotide is replaced by the corresponding dideoxynucleotide.
  • Sequences 1 and 2 can serve as the preferred matrix DNA according to the invention:
  • Sequence 1 carries a recognition site for the nick enzyme N.BsfcNB I (italic).
  • Sequence 2 contains a recognition site for the restriction endonuclease Hae III (italic). Sequence 2 must therefore be chemically modified according to the invention before use at the recognition site, as already described.
  • the matrix DNA can have, for example, the following sequence (SEQ ID NO 3) in the event that part of the target nucleotide sequence itself serves as an initial primer:
  • this matrix DNA must also be chemically modified at the recognition site before use in the method according to the invention.
  • a nucleotide sequence is used as the probe for the detection of a target nucleotide sequence. Either the 3 'end of this probe corresponds to the sequence of the initial primer or on the probe is bound to the initial primer via one or more biomolecules.
  • An antibody is used as a probe to detect a target antigen.
  • the initial primer is coupled to this covalently or via one or more biomolecules.
  • a molecule that binds specifically to the target amino acid sequence is used as the probe, to which the initial primer is coupled covalently or via one or more biomolecules.
  • the ligands used are e.g. Antibodies, receptors, amino acid sequences, nucleotide sequences, carbohydrates, lipids.
  • Target molecules can be bound to the probe in the direct, indirect or competitive process and in the sandwich process.
  • Biotin and avidin or streptavidin or antibodies or haptens and hapten-specific antibodies or avidin or streptavidin can be used, for example, as biomolecules for binding the probe to the primer.
  • the 5 'end of this probe must be modified so that coupling to the initial primer is possible directly or via one or more biomolecules. If necessary, an amplification contamination protection can be carried out according to methods known to the person skilled in the art before carrying out the amplification reaction. This also applies to all other sequences and embodiments of the invention mentioned in this application.
  • the initial primer can be coupled to the target single-stranded or hybridized with its complementary counter-strand.
  • the latter has the advantage that the initial primer cannot hybridize non-specifically with the primer hybridization sequence of the detector nucleotide sequence used for detection.
  • the structure and function of the detector nucleotide sequence are set out below in the description.
  • the initial primer and its counter-strand can be dehybridized in a customary manner, for example by heating.
  • SEQ ID NO 5 The following nucleotide sequence (SEQ ID NO 5) can be used as the initial primer when using SEQ ID NO 2 as matrix DNA: 5 " -GTG TGG TGT GGG G- 3 "
  • SEQ ID NO 6 The following nucleotide sequence (SEQ ID NO 6) can be considered as an initial primer for the use of SEQ ID NO 1 as matrix DNA:
  • a capture nucleotide sequence can be used in one embodiment of the invention.
  • the use of such a capture nucleotide sequence is particularly necessary if the expression of a gene, i.e. an RNS or a cDNA is to be detected (see also example 3).
  • the 5 "-terminal region of the capture nucleotide sequence is complementary to a region of the target nucleotide sequence or the nucleotide sequence coupled to the target molecule as a probe. The target nucleotide sequence is thereby immobilized.
  • the detection of the amplificate can be carried out in solution or on the solid phase. If the detection is carried out in solution, the charge, size and hybridization properties of the amplificate are used, for example, and customary analysis methods are used. The detection of the charge can be carried out by ion exchange topography using HPLC. When detecting by size, the amplificate is separated electrophoretically or analyzed in the MALDI-TOF. When the amplification is detected via the hybridization properties, e.g. B.
  • a quencher spatially separated from a fluorophore, whereby the fluorescence of the fluorophore can be measured.
  • the detection of the amplificate on the solid phase is carried out by means of a detector nucleotide sequence (see Fig. 2).
  • its 3 "end is immobilized on the solid phase. It contains a primer hybridization sequence which is homologous to that of the matrix DNA. This primer hybridization sequence is used to hybridize the amplified primer, which is then carried out by the DNA polymerase is extended in the 3 'direction.
  • a nucleotide sequence is used as the detector nucleotide sequence, which at its 5 'end is complementary to a region of the target nucleotide sequence or the nucleotide sequence coupled to the target molecule as a probe and thus simultaneously serves as a capture nucleotide sequence. This means that an independent capture nucleotide sequence can be dispensed with.
  • the detector nucleotide sequence contains in the 5 'direction from Primer hybridization sequence at least one labeling site.
  • a nucleotide of the detector nucleotide sequence preferably at the 5 'end, can be connected to a biomolecule, preferably to biotin, via which coupling with the probe can take place.
  • a nucleotide is preferably used as the marking site in the detector nucleotide sequence, with in principle any of the four dNTPs being suitable, via which a labeled nucleotide is incorporated when the amplified primer is extended.
  • the label can be a radioactive label, an enzyme, dye, fluorescent or hapten label.
  • Particularly preferred as nucleotide of the detector nucleotide sequence, which serves as the labeling site, is at least one adenosine, via which, for example, digoxigenin, fluorescein or biotin-labeled dUTP is incorporated in the counter-strand synthesis by means of DNA polymerase. The detection of the amplificate then takes place via this labeled nucleotide.
  • the detector nucleotide sequence can have the following sequence (SEQ ID NO 7), for example:
  • the marker sites are in bold, the primer hybridization sequence is shown in italics. Is used as matrix DNA SEQ ID NO 2 (cf.
  • the detector nucleotide sequence preferably has the following sequence (SEQ ID NO 8):
  • the marker sites are in bold, the primer hybridization sequence is shown in italics. This sequence can be connected 5'-terminally to a biomolecule, preferably to biotin.
  • a sequence is used as the labeling site of the detector nucleotide sequence, which together with this strand, after the counter strand synthesis, represents a recognition sequence for a restriction endonuclease which, after cutting through the corresponding restriction endonuclease, has a 5 'or 3' overhang.
  • this restriction endonuclease can be identical to the restriction endonuclease which is optionally used to cut the counter strand of the matrix DNA.
  • the detector nucleotide sequence is therefore first immobilized on the solid phase, then incubated with the solution of the target molecule and, together with the DNA polymerase and the dNTPs, the restriction endonuclease which contains the recognition sequence of the detector and recognizes nucleotide sequence and the matrix DNA, and added ligase and detector monomers.
  • the detector monomers are double-stranded DNA sequences with labeled nucleotides and with 3 "or 5" overhangs, the overhangs being complementary to one another and to the 5 "or 3" overhang of the cut detector nucleotide sequence hybrid.
  • ligase Using ligase, this leads to the ligation of a detector monomer with the detector nucleotide sequence hybrid at its cut interface.
  • the sequences of the detector monomer overhangs are selected so that the restriction enzyme recognition site is not restored during the ligation (see FIG. 3). The restriction endonuclease can no longer cut after ligation.
  • ligation it is also possible for a plurality of detector monomers to ligate one after the other to the detector nucleotide sequence hybrid, since the detector monomers can also ligate with one another.
  • the detection then takes place via the labeled nucleotides of the detector monomers.
  • a washing step is carried out beforehand in order to remove unbound detector monomers from the reaction mixture.
  • the detector nucleotide sequence preferably has the following sequence (SEQ ID NO 9): 5 "-CAA GAA GCC CAG ACG GAA ACT GGC CTC GCT GGC TGA TTG TGT GTG GTG TGG GGT TGT TGT -3"
  • extension sequence which also serves as a capture nucleotide sequence in this application example, is underlined, the recognition sequence for the restriction endonuclease Bgl I is shown in bold, and the primer hybridization sequence is shown in italics.
  • Possible detector monomers for the invention are those which can ligate with the interface of the detector nucleotide sequence hybrid and which have the markings, e.g. possess in the form of labeled nucleotides.
  • the detector monomer preferably has the following sequence (SEQ ID NO 10):
  • the labels of the detector monomers are dATP, dCTP, dGTP, dTTP or dUTP, the labels of the dNTPs being radioactive substances, for example 32 P or 35 S, fluorogenic substances such as, for example, FITC, TAMRA, TET, Texas Red or biomolecules, such as can be, for example, digoxogenin or biotin.
  • the labeled nucleotides can be detected autoradiographically, enzymatically or fluorometrically.
  • the detection is carried out, for example, via an anti-digoxigenin-peroxidase conjugate, avidin / sreptavidin-peroxidase conjugate, anti-digoxigenin-alkaline phosphatase conjugate, avidin / sreptavidin-alkaline phosphatase conjugate, with tetramethylbenzidine, diaminobenzidine, amino for visualization or chloronaphtol, also X-phosphate or tetrazolium blue can be used.
  • the invention also relates to a kit for carrying out the method described above.
  • this kit must contain at least matrix DNA which serves to amplify the target molecule to be detected. This is constructed as described above and includes the design variants described above.
  • the kit additionally contains detector nucleotide sequence, as described above. This enables the detection of the amplificate on the solid phase, which in some cases. is easier and faster than detection in the liquid phase using e.g. Charge, size or hybridization properties of the amplificate.
  • the kit can in addition to the matrix DNA and optionally contain for the detector nucleotide sequence initial primer as described above, which is amplified and detected and thus serves the indirect detection of the target molecule.
  • the kit contains, in addition to the matrix DNA, the initial primer and, if appropriate, the detector nucleotide sequence as a probe nucleotide sequence as described above, or a probe antibody or a ligand, depending on which Target molecule to be detected.
  • the probe and primer can also be included in the kit in coupled form.
  • the kit can be used in addition to the matrix DNA and optionally the detector nucleotide sequence of the coupling of the probe to the initial primer serving biomolecules, preferably either biotin and avidin or streptavidin or antibodies or haptens and hapten-specific antibodies or avidin or contain streptavidin.
  • the kit in addition to the matrix DNA, the detector nucleotide sequence and possibly the initial primer, the probe and the biomolecules, can also already contain the solid phase which serves to immobilize the detector nucleotide sequence.
  • the detector nucleotide sequence is bound with its 3 "end.
  • the capture nucleotide sequence which serves to immobilize the target nucleotide sequence, can be bound with its 3" end to the solid phase, depending on whether the detection with a Fang nucleotide sequence is to be performed.
  • Detector nucleotide sequence and / or capture nucleotide sequence can of course also be unbound components of the kit.
  • the kit in addition to the matrix DNA, the detector nucleotide sequence and optionally the initial primer, the probe, the biomolecules and the solid phase, can additionally contain detector monomers, ligase and optionally restriction endonuclease if the detector nucleotide sequence contains such a labeling site which after synthesis of the counter strand together with this forms a recognition site for the added restriction endonuclease.
  • the kit also already comprises the DNA polymerase (s), the dNTPs, the restriction enzyme which recognizes the recognition site of the matrix DNA, suitable enzyme, reaction and washing buffers and optionally the labeled dNTP.
  • s DNA polymerase
  • dNTPs the restriction enzyme which recognizes the recognition site of the matrix DNA
  • suitable enzyme suitable enzyme
  • reaction and washing buffers optionally the labeled dNTP.
  • the kit can also contain the reagents used to detect the labeled nucleotides, for example the enzymes and reagents for enzymatic or fluorometric detection.
  • kits according to the invention can be used to detect the expression of a gene, e.g. shown in Fig. 5.
  • the kit is particularly useful for diagnosing viral and bacterial infections and prions, but it can also be used to demonstrate the presence of certain genes or of single nucleotide polymorphisms / mutations in certain genes.
  • Fig. 2 schematic representation of the detector nucleotide sequence according to the invention with hybridized primer and with extended primer as well as with modified 5 'terminus for binding a target molecule
  • Fig.3 schematic representation of the detector nucleotide sequence according to the invention with hybridized primer, with extended primer and with detector monomers ligated to the detector nucleotide sequence hybrid
  • Fig. 4 schematic representation of the detection of a target DNA (A) and an antigen (B) according to the invention
  • Fig. 5 schematic representation of the expression detection of a gene according to the invention.
  • EBV Epstein-Barr virus
  • the direct detection of the EBV genome is carried out by hybridizing the 3 "end of the target DNA with the 3 'end of the matrix DNA (SEQ ID NO 3), which is modified with PTO (sequence see end of the example.)
  • SEQ ID NO 3 3 'end of the matrix DNA
  • PTO sequence see end of the example.
  • the 3 'end of the target DNA acts as an initial primer after hybridization has taken place.
  • a restriction digest is carried out before hybridization with the matrix DNA (see also Fig. 4a).
  • NucleoLink TM plates (Nunc) are coated with the detector nucleotide sequence (for the sequence see the end of the example): the 3 'phosphorylated detector nucleotide sequence is dissolved in 1-methylimidazole, pH 7.4 (Sigma) and 1-ethyl 3- (3-diethylamino-propyl) carbodiimide (Sigma) incubated overnight. Repeated rinsing with NaOH and then with distilled water. according to the working instructions of the Nunc company; Drying of the NucleoLink TM strips and storage 2.
  • PTO matrix DNA oligonucleotide synthesis, MWG Biotech
  • PTO matrix DNS (SEQ ID NO: 3)
  • Detector nucleotide sequence SEQ ID NO: 7
  • the melting temperature of the primer extended at the detector nucleotide sequence is approx.
  • Example 2 Detection of human choline acetyl transferase by means of RCR in a competitive ELISA using the matrix DNA SEQ ID NO 2 according to the invention, which is methylated and using the sequences SEQ ID NOs 5 and 8 according to the invention
  • a competitive ELISA was developed using the monoclonal anti-choline acetyl transferase antibody 28C4 and the biotinylated peptide 168-189 of choline acetyl transferase (P3) (see also Fig 4b).
  • the initial primer is present as double-stranded DNA during the immune binding of the DNA-antibody conjugate. This prevents the non-specific binding of the DNA-antibody conjugate to the primer hybridization sequence of the detector nucleotide sequence.
  • Negative control human serum without choline acetyl transferase
  • Detector nucleotide sequence SEQ ID NO: 8
  • Biotin-5'-ATG AAA TGA GAG ATG TGT GTG GTG TGG GGT GTG TGT GTG-3 '-P>
  • Goat anti-mouse IgG (Sigma) is in 10 mM 1-methylimidazole, (Sigma) with the addition of 10 mM 1-ethyl-3- (3-demethylaminopropyl) carbodiimide (Sigma) with 5 "- phosphorylated primer (see above).
  • the reaction products are purified by means of anion exchange chromatography.
  • Example 3 Detection of the expression of the human p53 gene using the unmodified matrix DNA SEQ ID NO 1 according to the invention and using the sequences SEQ ID NOs 4, 6, 9 and 10 according to the invention
  • copy-DNA is produced using a reverse transcriptase reaction using standard methods and used in the RCR test.
  • the cDNA is immobilized from the sample liquid to the solid phase of the NucleoLink TM plates via the 5 "end of the detector DNA (sequence see end of the example), which serves as a capture probe, and simultaneously with the probe (sequence see end of Hybridized (see also Fig. 5).
  • Detector nucleotide sequence SEQ ID NO: 9
  • Biotin-5 "-GGC GGG GGT GTG GAA TCA AC-3 '

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein als Restrictase Chain Reaction (RCR) bezeichnetes Verfahren zum direkten Nachweis von Target-Nukleotid- oder Target-Aminosäuresequenzen oder von Target-Antigenen durch Amplifikation einer Nukleotidsequenz mittels einer DNS-Polymerase, eines Restriktionsenzyms und einer Matrix-DNS, an der durch Bindung eines initialen Primers dieser Primer amplifiziert wird. Desweiteren betrifft die Erfindung einen diese Matrix-DNS beinhaltenden Kit und die Verwendung dieses Kits in der medizinischen Diagnostik und kriminalistischen Spurenanalytik sowie für Umwelt-, Lebens- und Arzneimittelanalysen.

Description

Verfahren und Kit zum direkten Nachweis von Nukleotidsequenzen, Aminosäuresequenzen oder
Antigenen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein, als Restrictase Chain Reaction (RCR) bezeichnetes Verfahren und einen Kit zum direkten Nachweis von Target-Nukleotidsequenzen, Target-Aminosäuresequenzen oder von Target-Antigenen durch Amplifikation einer DNS unter Einsatz einer DNS- Polymerase, eines Restriktionsenzyms und einer Matrix- DNS, an der durch Bindung eines initialen Primers dieser Primer amplifiziert wird.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung dieses Kits in der medizinischen Diagnostik und kriminalistischen Spurenanalyse sowie für Umwelt-, Lebensmittel- und Arzneimittelanalysen.
Es ist bekannt, daß sich Spuren von DNS durch die
Polymerase Chain Reaction (PCR) (US Patente: 4.683.195;
4.683.202) identisch vervielfältigen lassen, um diese in größeren Mengen für spätere Analysen wie Sequenzierungen, Klonierungen etc. aufzubereiten. Die hohe Amplifikationsrate von mehr als 109 macht diese in größeren Mengen für spätere Analysen wie Sequenzierungen, Klonierungen etc. aufzubereiten. Die hohe Amplifikationsrate von mehr als 109 macht diese Methode ebenfalls für die medizinische Diagnostik und die kriminalistische Spurenanalytik interessant. So können spezifisch Abschnitte des Genoms von pathogenen Mikroorganismen in Patientenproben vervielfältigt werden, bis diese in ausreichender Konzentration vorliegen, um sie danach mit konventionellen DNS- Nachweisverfahren zu detektieren oder zu quantifi- zieren. Die PCR läßt sich in vielfältiger Weise mit anderen Verfahren koppeln, wie z.B. einer reversen Transkription von Boten-Ribonukleinsäure (mRNS) zur Bestimmung der Genexpression oder in Kombination mit Immunoassays zum sensitiven Antigennachweis .
Die PCR basiert auf der zyklischen Primerverlängerung zweier Primer (Oligonukleotide) , die jeweils am komplementären Strang hybridisieren. Die Entfernung zwischen beiden Primern kann wenige Nukleotide bis ca. 40 kB betragen. Der Zyklus der Amplifikation wird durch eine stufenweise Temperaturführung gesteuert. Folgende Stufen werden nacheinander durchlaufen: Strangdenatu- rierung (95°C) , Primerhybridisierung (50-70°C) und letztlich die Primerverlängerung (74°C), bei der eine Polymerase in Gegenwart von dNTPs an die freien 3 " - Enden der Primer einen Zweitstrang synthetisiert, wobei der Erststräng als Matrize dient. Meist sind 30 Zyklen für eine PCR-Reaktion ausreichend (ca. lh) . Jeder Zyklus verdoppelt die Menge der Zielsequenz, was eine exponentielle Zunahme des Reaktionsproduktes zwischen den Primern bewirkt .
Neben der PCR wurden weitere Amplifikationsmethoden entwickelt, die aber bei weitem nicht die Bedeutung erlangten, wie die PCR. Hier ist zum Einen die Ligase Chain Reaction (LCR) (Barany. F. [1991] PCR Methods and Applications 1: 5-16) zu nennen, bei der durch Kombination einer Polymerasereaktion mit einer Ligasereaktion jeweils an den komplementären DNS- Strängen Primerpaare miteinander verknüpft werden. Über eine stufenweise Temperaturregulation, ähnlich wie bei der PCR, kann dieser Prozeß zyklisch wiederholt werden, wobei die miteinander ligierten Primer eines DNS- Strangs die Targets für die nächste Runde bilden und es somit zu einer exponentiellen Amplifikation des gewünschten DNS-Bereichs kommt. Der Nachteil dieser Methode besteht, ebenso wie bei der PCR, in dem komplizierten Temperaturregime.
Eine weitere Methode zur Amplifikation von Target-DNS ist die Strand Displacement Amplification (SDA) (Walker, G. [1993] PCR Methods and Applications 3: 1- 6) . Hierbei werden eine Polymerase- und eine Restriktionsendonukleasereaktion miteinander kombi- niert . Bei dieser Methode werden die Eigenschaften einer DNS-Polymerase ohne Exonukleasefunktion (z.B. KlenowExo") genutzt, einen DNS-Strang vom komplementären Strang während der DNS-Synthese zu verdrängen, bis er schließlich vollständig abgelöst ist. Eine Restriktionsendonuklease schneidet nun im Bereich des Primers nur den neusynthetisierten Strang, wobei ein neuer Ansatzpunkt für die Polymerase geschaffen wird. Damit kann der Prozeß von neuem mit der Ablösung des vorhandenen Stranges beginnen. Dieser Prozeß läuft bei einer konstanten Temperatur zwischen 37 und 65°C ab und führt zur Vervielfältigung der Analyt-DNS zwischen den vier verschiedenen Primern. Der Nachteil dieser Methode besteht in dem komplexen Reaktionsablauf.
Eine weitere bekannte Methode zur Amplifikation von DNS ist die Primer Digestion Amplification (PDA) (Takarada, Y. [1994] Nucleic Acids Research 22(11): 2170-2172). Hierbei werden eine DNS-Polymerase und eine 3"->5"- Exonuklease miteinander kombiniert . Dabei kommt nur ein spezifischer Primer zum Einsatz der aus zwei Bereichen besteht: Eine zum 3 "-Ende des Targets komplementäre und eine zum 5 "-Ende des Targets homologe Sequenz. Der Primer hybridisiert an das 3 "-Ende des Targets und wird verlängert, wobei ein zur Target-Sequenz komplementärer Zweitstrang entsteht . Nach der Verlängerung wird der zum 3 '-Ende des Targets komplementäre Bereich des nicht-hybridisierten Primers mittels Exonuklease III abgebaut. Der homologe Bereich ist am 3 "-Ende phosphorthioatisiert und somit vor einem Abbau durch Exonuklease geschützt. Der entstehende, nur noch aus dem zum 5 "-Ende des Targets homologen Bereich bestehende Primer (verdauter Primer) , hybridisiert an das 3 "-Ende des neusynthetisierten, zuvor denaturierten Zweitstrangs und wird verlängert . Nach Denaturierung des entstandenen Produkts kann der verdaute Primer mit beiden Strängen hybridisieren. Anschließend werden die beiden Stränge, und damit die Target-DNS, thermo- zyklisch amplifiziert . Der Nachteil dieser Methode besteht auch in dem einzuhaltenden thermozyklischen Temperaturregime .
Die Nachteile des genannten Standes der Technik, die auf alle Amplifikationsmethoden zutreffen, bestehen darin, daß Amplifikation und Detektion in verschiedenen Reaktionsansätzen durchgeführt werden, was zeitaufwendig und kostenintensiv ist. Auch machen das komplizierte Temperaturregime der PCR, der LCR und der PDA sowie der komplexe Reaktionsablauf der SDA die Adaption der Verfahren auf Routineanwendungen schwierig.
Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Nachweis der verschiedensten Biomoleküle zu entwickeln, das im Routinebetrieb anwendbar ist und bei dem alle Verfahrensschritte im gleichen Reaktions- ansatz, vorzugsweise in derselben Reaktionskavität einer Mikrotiterplatte, durchführbar sind. In einer bevorzugten Ausführungsform soll das Verfahren isothermisch durchführbar sein.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert. Das erfindungsgemäße Verfahren zum direkten Nachweis von Target-Nukleotidsequenzen, Target-Aminosäuresequenzen oder Target-Antigenen durch Amplifikation einer Nukleo- tidsequenz wird unter Verwendung einer DNS-Polymerase und eines Restriktionsenzyms durchgeführt und besteht darin, daß das Target-Molekül entweder in Lösung gebracht oder über eine Fangnukleotidsequenz oder eine Detektornukleotidsequenz an einer festen Phase immobilisiert wird. Danach wird zur Target-Nukleotidsequenz, die selbst als initialer Primer dient und in Lösung vorliegt, oder zum Target-Molekül, an das eine als initialer Primer dienende Nukleotidsequenz über eine Sonde gekoppelt ist, eine Matrix-DNS zugegeben. Der Begriff Target-Molekül umfaßt im Sinne der Erfindung nachzuweisende Nukleotidsequenzen, Aminosäuresequenzen oder Antigene.
Der Aufbau der Matrix-DNS ist in Abb. 1A und 1B schematisch dargestellt. Die Matrix-DNS weist eine zum 3 "-Ende der Target-Nukleotidsequenz, die als intitialer Primer dient, komplementäre Primerhybridisierungs- sequenz auf oder die Primerhybridisierungssequenz der Matrix-DNS ist vollständig komplementär zum initialen Primer. In 5"-Richtung von der Primerhybridisierungs- sequenz folgen eine Verlängerungssequenz, eine Restrik- tionsenzymerkennungssequenz und eine primerkodierende Sequenz . Die primerkodierende Sequenz ist vollständig oder im Wesentlichen homolog zur Primerhybridisierungssequenz. Erfolgt der Nachweis des Target-Moleküls indirekt über die sondenvermittelte Bindung eines Primers, d.h., die Target-Nukleotidsequenz selbst ist nicht initialer Primer, erfolgt nun ein Waschschritt , um nicht an das Target-Molekül gekoppelten initialen Primer aus dem Ansatz zu entfernen. Anschließend werden DNS-Polymerase ohne Exonukleasefunktion und die vier verschiedenen dNTPs zugegeben. Ausgehend vom freien 3"- Ende des an die Primerhybridisierungssequenz der Matrix-DNS hybridisierten initialen Primers synthetisiert die DNS-Polymerase einen zur Matrix-DNS komple- mentären Zweitstrang. Durch Zugabe eines Restriktionsenzyms wird entweder durch die Verwendung einer entsprechend modifizierten Matrix-DNS oder eines Nickenzyms (keine modifizierte Matrix-DNS erforderlich) ausschließlich der neusynthetisierte Zweitstrang an der Restriktionsenzymerkennungsstelle geschnitten. Die Matrix-DNS bleibt weitgehend erhalten. Der in 3"- Richtung von der Schnittstelle liegende Bereich des Zweitstranges, der zu dem initialen Primer vollständig oder im Wesentlichen homolog ist (amplifizierter Primer) , wird anschließend aus dem Hybridmolekül freigesetzt. Diese Freisetzung erfolgt entweder von allein über die Reaktionstemperatur, da der amplifi- zierte Primer kürzer ist als der in 5 "-Richtung von der Schnittstelle liegende Teil des Zweitstranges. Andern- falls erfolgt die Freisetzung durch die DNS-Polymerase, die an das freie 3 "-Ende der Schnittstelle ansetzt und erneut den zur primerkodierenden Sequenz der Matrix-DNS komplementären Bereich synthetisiert, d.h. Primer amplifiziert . Der freigesetzte Primer kann nun eben- falls an eine noch unbesetzte Matrix-DNS hybridisieren und verlängert werden. Auf diese Weise wird der initiale Primer amplifiziert , wobei sehr hohe Amplifi- kationsraten erzielt werden können. Anschließend erfolgt die Detektion des Amplifikats und damit der Nachweis des Target-Moleküls.
Es wird also entweder ein Teil der Target-Nukleotidsequenz selbst, oder ein an das Target-Molekül gekoppelter initialer Primer amplifiziert , wobei die Amplifikation im letzteren Fall - aufgrund des Waschschritts - nur erfolgen kann, wenn zunächst der initiale Primer an das Target-Molekül gekoppelt wurde.
Erfindungsgemäß wird als Target-Nukleotidsequenz eine einzel- oder doppelsträngige DNS oder eine RNS verstanden.
Als Target-Aminosäuresequenzen kommen beispielsweise Enzyme, Peptide, Hormone, Hormonrezeptoren, Allergene, Tumormarker, Zelloberflächenrezeptoren, Transkriptions- faktoren, rekombinante Proteine, in vitro translatierte Proteine in Frage .
Das Target-Antigen kann auch eine Aminosäuresequenz oder Nukleotidsequenz sein oder ein Polysaccharid, ein Antikörper, ein Virus, ein Bakterium, eine Zelle eines Eukaryonten oder jede andere - auch synthetisch hergestellte - Substanz, die von einem Antikörper erkannt werden kann.
Die feste Phase besteht bevorzugt aus einem Polymeroder Halbleitermaterial. Besonders bevorzugt wird als feste Phase eine Mikrotiterplatte oder eine poröse Membran, z.B. bestehend aus Nylon, Nitrozellulose oder PVDF, eingesetzt.
Unter Restriktionsenzym werden im Sinne der Erfindung sowohl Restriktionsendonukleasen, die Doppelstrang- brüche erzeugen, wie z.B. Eco RI, Hind III, Sac II, BsoB I, Ava I und Hae III, bevorzugt BsoB I, Ava I und Hae III, als auch Einzelstrangbruch erzeugende Nickenzyme, wie z.B. N.BstNB I, N.CviQX I, N.CviP II, V.Bαh I, V.EcoDcm. verstanden. Bevorzugt wird ein Nickenzym eingesetzt. Insbesondere hat sich das Nickenzym N.BstNB I für das erfindungsgemäße Verfahren als gut geeignet erwiesen.
Soll eine Restriktionsendonuklease verwendet werden, die doppelsträngige DNS schneidet, also keinen Nick erzeugt, muß die Restriktionsenzymerkennungsstelle der
Matrix-DNS so modifiziert werden, daß sie nicht durch die Restriktionsendonuklease geschnitten werden kann.
Die Modifizierung kann zum Beispiel durch Einführung von Methylgruppen erfolgen (Methyl-Matrix-DNS, vgl.
Abb. 1A) oder durch Einführung von Phosphorthioaten
(PTO-Matrix-DNS, vgl. Abb. 1A) .
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Amplifikationsreaktion isothermisch, also bei einer konstanten Temperatur im Bereich von 15-75°C, vorzugsweise von 37 bis 55°C, da die bei PCR, LCR und PDA benötigte Denaturierung der zu amplifizierenden DNS entfallen kann. Das bedeutet, es werden keine teuren Apparaturen zur Kontrolle eines thermischen Temperaturregimes benötigt. Die benötigten Temperaturen können durch Inkubation in relativ einfachen Geräten (z.B. einem Thermomixer oder einem Wärmeschrank) eingestellt werden, die jedem Routinelabor zugänglich sind.
Es ist aber auch möglich, die Reaktion unter Kontrolle eines zyklischen Temperaturregimes, wie bei der PCR, durchzuführen, wenn die jeweils verwendete Restriktase und DNS-Polymerase hitzestabil ist (z.B. Vent®(exo") oder Deep Vent® (exo") DNS-Polymerase von New England Biolabs, USA) . Die Möglichkeit der isothermischen Durchführung ist jedoch ein entscheidender Vorteil der vorliegenden Erfindung.
Als Matrix-DNS wird erfindungsgemäß eine Sequenz verwendet, deren Primerhybridisierunssequenz vorzugsweise mindestens 10 Nukleotide und deren Verlänge- rungssequenz bevorzugt 0-20 Nukleotide lang ist. Um ein Selbstprimen der Matrix-DNS zu verhindern, ist deren 3"-OH-Gruppe chemisch modifiziert, z.B. durch eine Aminohexylgruppe, oder deren 3 "-terminales Desoxynu- kleotid ist durch das entsprechende Didesoxynukleotid ersetzt. Als erfindungsgemäß bevorzugte Matrix-DNS können die Sequenzen 1 und 2 dienen:
SEQ ID NO 1:
5"-GTG TGG TGT GGG GTG TGG ACT CTG GTT GTT GTG TGG TGT GGG G-3" SEQ ID NO 2 :
5" -GTG TGG TGT GGG GCC TTG TTG GTT GGT TGT GTG GTG TGG GG-3"
Sequenz 1 trägt eine Erkennungsstelle für das Nickenzym N.BsfcNB I (kursiv) . In Sequenz 2 ist eine Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuklease Hae III (kursiv) enthalten. Sequenz 2 muß daher erfindungsgemäß vor Verwendung an der Erkennungsstelle chemisch modifiziert werden, wie bereits beschrieben.
Für den Nachweis des EBV (Epstein-Barr-Virus) -Genoms kann die Matrix-DNS für den Fall, daß ein Teil der Target-Nukleotidsequenz selbst als initialer Primer dient, beispielsweise folgende Sequenz (SEQ ID NO 3) aufweisen:
5"-TGC TCA TCG CCA ACC GCT CCC GAG TAG TTC CTG CTC ATC GCC AAC CGC TCC CGA-3"
Diese trägt eine Erkennungsstelle für die Restriktions- endonukleasen BsoB I und Ava I (kursiv) . Daher muß auch diese Matrix-DNS vor Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren an der Erkennungsstelle chemisch modifiziert werden.
Als Sonde wird erfindungsgemäß für den Fall des Nachweises einer Target-Nukleotidsequenz eine Nukleotidsequenz verwendet. Entweder das 3 '-Ende dieser Sonde entspricht der Sequenz des initialen Primers oder an die Sonde ist über ein oder mehrere Biomoleküle der initiale Primer gebunden.
Zum Nachweis eines Target-Antigens wird als Sonde ein Antikörper verwendet . An diesen ist kovalent oder über ein oder mehrere Biomoleküle der initiale Primer gekoppelt .
Zum Nachweis einer Target-Aminosäuresequenz wird als Sonde ein spezifisch an die Target-Aminosäuresequenz bindendes Molekül (Ligand) verwendet, an das kovalent oder über ein oder mehrere Biomoleküle der initiale Primer gekoppelt ist. Als Liganden dienen im Sinne der Erfindung z.B. Antikörper, Rezeptoren, Aminosäuresequenzen, Nukleotidsequenzen, Kohlenhydrate, Lipide.
Die Bindung von Target-Molekülen an die Sonde kann im direkten, indirekten oder kompetetiven Verfahren sowie im Sandwich-Verfahren erfolgen.
Als Biomoleküle zum Binden der Sonde an den Primer können beispielsweise Biotin und Avidin oder Strepta- vidin oder Antikörper oder Haptene und haptenspe- zifische Antikörper oder Avidin oder Streptavidin verwendet werden.
Soll z.B. die Expression des humanen p53-Gens nachgewiesen werden (vgl. auch Beispiel 3, vgl. Abb. 5), so daß das Target die cDNS dieses Gens ist, so kann als Sonde folgende Nukleotidsequenz (SEQ ID NO 4) verwendet werden :
5"-GGC GGG GGT GTG GAA TCA AC-3"
Das 5 '-Ende dieser Sonde muß so modifiziert sein, daß eine Kopplung an den initialen Primer direkt oder über ein oder mehrere Biomoleküle möglich ist. Falls notwendig, kann vor Durchführung der Amplifikations- reaktion ein Amplifikatkontaminationssschutz nach dem Fachmann bekannten Methoden durchgeführt werden. Dies gilt auch für alle anderen in dieser Anmeldung genannten Sequenzen und Ausführungsformen der Erfindung.
Der initiale Primer kann einzelsträngig oder mit seinem komplementären Gegenstrang hybridisiert an das Target gekoppelt werden. Letzteres hat den Vorteil, daß der initiale Primer nicht unspezifisch mit der Primerhybridisierungssequenz der der Detektion dienenden Detektor- nukleotidsequenz hybridisieren kann. Der Aufbau und die Funktion der Detektornukleotidsequenz werden weiter unten in der Beschreibung dargelegt. Für den Fall, daß der Primer mit seinem Gegenstrang gepaart ist, kann die Dehybridisierung des initialen Primers und seines Gegenstrangs auf übliche Art und Weise erfolgen, beispielsweise durch Erhitzen.
Als initialer Primer kommt beim Einsatz von SEQ ID NO 2 als Matrix-DNS beispielsweise folgende Nukleotidsequenz (SEQ ID NO 5) in Frage: 5 " -GTG TGG TGT GGG G- 3 "
3"-CAC ACC ACA CCC C- 5 ' -Phosphat <- initialer Primer
Für den Einsatz von SEQ ID NO 1 als Matrix-DNS kann als initialer Primer folgende Nukleotidsequenz (SEQ ID NO 6) in Frage kommen:
3"-CAC ACC ACA CCC C-5" <- initialer Primer Biotin-5"-GTG TGG TGT GGG G-3"
Ist das Target eine Nukleotidsequenz, so kann in einer Ausführungsform der Erfindung mit einer Fangnukleotid- sequenz gearbeitet werden. Der Einsatz einer solchen Fangnukleotidsequenz ist insbesondere dann notwendig, wenn die Expression eines Gens, d.h. also eine RNS bzw. eine cDNS nachgewiesen werden soll (vgl . auch Beispiel 3) . Der 5"-terminale Bereich der Fangnukleotidsequenz ist komplementär zu einem Bereich der Target- Nukleotidsequenz oder der an das Target-Molekül als Sonde gekoppelten Nukleotidsequenz . Dadurch wird die Target-Nukleotidsequenz immobilisiert .
Die Detektion des Amplifikats kann je nach Ausführungsform der Amplifikation in Lösung oder an der festen Phase durchgeführt werden. Wird die Detektion in Lösung durchgeführt, so werden z.B. Ladung, Größe und Hybridisierungseigenschaften des Amplifikats ausgenutzt und übliche Analyseverfahren angewendet. Die Detektion über die Ladung kann u.a. durch Ionenaustauschchroma- tographie mittels HPLC erfolgen. Bei der Detektion über die Größe wird das Amplifikat elektrophoretisch aufgetrennt oder im MALDI-TOF analysiert. Bei der Detektion des Amplifikats über die Hybridisie- rungseigenschaften wird z. B. durch die Hybridisierung des Amplifikats an eine in Lösung vorliegende Detektor- Nukleotidsequenz ein Quencher von einem Fluorophor räumlich getrennt, wordurch die Fluoreszenz des Fluorophors meßbar wird. Die Detektion des Amplifikats an der festen Phase wird mittels einer Detektornukleotidsequenz durchgeführt (s. Abb. 2) . Diese wird vor Durchführung der Amplifikation mit ihrem 3 "-Ende an der festen Phase immobilisiert. Sie enthält eine Primerhybridisierungssequenz, die zu derjenigen der Matrix-DNS homolog ist. Über diese Primerhybridisierungssequenz erfolgt die Hybridisierung des amplifizierten Primers, der danach durch die DNS- Polymerase in 3 '-Richtung verlängert wird.
In einer Ausführungsvariante der Erfindung wird als Detektornukleotidsequenz eine Nukleotidsequenz eingesetzt, die an ihrem 5 '-Ende komplementär zu einem Bereich der Target-Nukleotidsequenz oder der an das Target-Molekül als Sonde gekoppelten Nukleotidsequenz ist und somit gleichzeitig als Fangnukleotidsequenz dient. Damit kann auf den Einsatz einer eigenständigen Fangnukleotidsequenz verzichtet werden.
In einer Ausführungsvariante der Erfindung enthält die Detektornukleotidsequenz in 5 '-Richtung von der Primerhybridisierungssequenz mindestens eine Markierungsstelle. Außerdem kann ein Nukleotid der Detektornukleotidsequenz, bevorzugt am 5 '-Ende, mit einem Biomolekül verbunden sein, vorzugsweise mit Biotin, über das eine Kopplung mit der Sonde erfolgen kann.
Als Markierungsstelle in der Detektornukleotidsequenz dient bevorzugt ein Nukleotid, wobei prinzipiell jedes der vier dNTPs in Frage kommt, über das bei der Verlängerung des amplifizierten Primers ein markiertes Nukleotid eingebaut wird. Die Markierung kann eine radioaktive Markierung, eine Enzym-, Farbstoff-, Fluoreszenz- oder Haptenmarkierung sein. Besonders bevorzugt ist als Nukleotid der Detektornukleotidsequenz, das als Markierungsstelle dient, mindestens ein Adenosin, über das bei der Gegenstrang-Synthese mittels DNS-Polymerase beispielsweise Digoxigenin- , Fluorescein- oder Biotin-markiertes dUTP eingebaut wird. Über dieses markierte Nukleotid erfolgt dann die Detektion des Amplifikats.
Zum Nachweis des EBV-Genoms (vgl. Beispiel 1) kann die Detektornukleotidsequenz beispielsweise folgende Sequenz (SEQ ID NO 7) aufweisen:
5" -ACA CCA TAC ACC TCT GCT CAT CGC CAA CCG CTC CCT CTC TCT CTC T-3'
Die Markierungsstellen sind in Fettdruck, die Primerhybridisierungssequenz ist kursiv dargestellt. Wird als Matrix-DNS SEQ ID NO 2 verwendet (vgl.
Beispiel 2), so weist die Detektornukleotidsequenz bevorzugt folgende Sequenz (SEQ ID NO 8) auf:
5"-ATG AAA TGA GAG ATG TGT GTG GTG TGG GG GTG TGT GTG-
-3'
Die Markierungsstellen sind in Fettdruck, die Primerhybridisierungssequenz ist kursiv dargestellt. 5'-terminal kann diese Sequenz mit einem Biomolekül verbunden sein, bevorzugt mit Biotin.
In einer zweiten Variante wird als Markierungsstelle der Detektornukleotidsequenz eine Sequenz verwendet, die nach der Gegenstrang-Synthese zusammen mit diesem Strang eine Erkennungssequenz für eine Restriktions- endonuklease darstellt, die nach Schneiden durch die entsprechende Restriktionsendonuklease einen 5'- oder 3 '-Überhang aufweist. Diese Restriktionsendonuklease kann in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mit der Restriktionsendonuklease, die gegebenenfalls zum Schneiden des Gegenstrangs der Matrix-DNS verwendet wird, identisch sein. Bei dieser Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird also zunächst die Detektornukleotidsequenz an der festen Phase immobilisiert, dann mit der Lösung des Target-Moleküls inkubiert und dem Ansatz zusammen mit der DNS-Polymerase und den dNTPs die Restriktionsendonuklease, die die Erkennungssequenz der Detektor- nukleotidsequenz und der Matrix-DNS erkennt, sowie Ligase und Detektormonomere zugegeben.
Bei den Detektormonomeren handelt es sich um doppelsträngige DNS-Sequenzen mit markierten Nukleo- tiden und mit 3"- oder 5 "-Überhängen, wobei die Überhänge zueinander und zum 5"- oder 3 "-Überhang des geschnittenen Detektornukleotidsequenz-Hybrides komplementär sind. Mittels Ligase kommt es dadurch zur Ligation eines Detektormonomers mit dem Detektornu- kleotidsequenz-Hybrid an dessen geschnittener Schnittstelle. Die Sequenzen der Detektormonomer-Überhänge sind so gewählt, daß es bei der Ligation nicht zur Wiederherstellung der Restriktionsenzymerkennungsstelle kommt (s. Abb. 3) . Die Restriktionsendonuklease kann also nach erfolgter Ligation nicht mehr schneiden. Bei der Ligation ist es auch möglich, daß mehrere Detektormonomere hintereinander an das Detektornukleotidsequenz-Hybrid ligieren, da die Detektormonomere auch miteinander ligieren können. Über die markierten Nukleotide der Detketormonomere erfolgt dann die Detektion. Vorher wird ein Waschschritt durchgeführt, um nicht gebundene Detektormonomere aus dem Reaktionsansatz zu entfernen.
Wird als Matrix-DNS SEQ ID NO 1 verwendet (vgl . Beispiel 3) und soll die Detektion mittels Detektormonomere erfolgen, so weist die Detektornukleotidsequenz bevorzugt folgende Sequenz (SEQ ID NO 9) auf: 5"-CAA GAA GCC CAG ACG GAA ACT GGC CTC GCT GGC TGA TTG TGT GTG GTG TGG GGT TGT TGT TGT -3"
Die Verlängerungssequenz, die in diesem Anwendungsbeispiel auch als Fangnukleotidsequenz dient, ist unterstrichen, die Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease Bgl I ist in Fettdruck, die Primerhybridisierungssequenz kursiv dargestellt.
Als Detektormonomere kommen für die Erfindung solche in Frage, die mit der Schnittstelle des Detektornukleotidsequenz-Hybrides ligieren können und die Markierungen, z.B. in Form von markierten Nukleotiden besitzen.
Wird als Detektornukleotidsequenz SEQ ID NO 9 verwendet (vgl. Beispiel 3), so weist das Detektormonomer bevorzugt folgende Sequenz (SEQ ID NO 10) auf:
5"-TCC GCC TCA TCT GCT CTT CCC GC-3'
-GCG AGG CGG AGT AGA CGA GAA GG-5'
Als Markierungen der Detektormonomere kommen dATP, dCTP, dGTP, dTTP oder dUTP, in Frage, wobei die Markierungen der dNTPs radioaktive Substanzen, z.B. 32P oder 35S, fluorogene Substanzen, wie beispielsweise FITC, TAMRA, TET, Texas Red oder Biomoleküle, wie z.B. Digoxogenin oder Biotin sein können. Die Detektion der markierten Nukleotide kann, je nach Markierung, autoradiographisch, enzymatisch oder fluorometrisch erfolgen. Entsprechend erfolgt die Detektion beispielsweise über ein Anti-Digoxigenin- Peroxidase-Ko jugat , Avidin/Sreptavidin-Peroxidase- Konjugat, Anti-Digoxigenin-Alkalische Phosphatase- Konjugat, Avidin/Sreptavidin-Alkalische Phosphatase- Konjugat, wobei zur Visualisierung Tetramethylbenzidin, Diaminobenzidin, Aminoethylcarbazol oder Chlornaphtol, ferner X-Phosphat oder Tetrazoliumblau verwendet werden.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Kit zur Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens . Dieser Kit muß erfindungsgemäß mindestens der Amplifikation des nachzuweisenden Target-Moleküls dienende Matrix-DNS enthalten. Diese ist wie oben beschrieben aufgebaut und umfaßt die vorstehend beschriebenen Ausführungs- varianten.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung beinhaltet der Kit zusätzlich Detektornukleotidsequenz, wie oben beschrieben. Diese ermöglicht die Detektion des Amplifikats an der festen Phase, was z.T. einfacher und schneller geht als die Detektion in der flüssigen Phase unter Ausnutzung von z.B. Ladung, Größe oder Hybridisierungseigenschaften des Amplifikats.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann der Kit zusätzlich zur Matrix-DNS und gegebenenfalls zur Detektornukleotidsequenz initialen Primer wie oben beschrieben enthalten, der amplifiziert und detektiert wird und damit dem indirekten Nachweis des Target- Moleküls dient .
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung enthält der Kit zusätzlich zur Matrix-DNS, zum initialen Primer und gegebenenfalls zur Detektornukleotidsequenz als Sonde dienende Nukleotidsequenz, wie sie vorstehend beschrieben wurde, oder einen als Sonde dienenden Antikörper oder einen als Sonde dienenden Liganden, je nachdem, welches Target-Molekül nachgewiesen werden soll . Sonde und Primer können auch bereits in gekoppelter Form im Kit enthalten sein.
Wenn Sonde und initialer Primer getrennt im Kit vorgelegt werden, kann der Kit zusätzlich zur Matrix- DNS und gegebenenfalls zur Detektornukleotidsequenz der Kopplung der Sonde an den initialen Primer dienende Biomoleküle, vorzugsweise entweder Biotin und Avidin oder Streptavidin oder Antikörper oder Haptene und haptenspezifische Antikörper oder Avidin oder Streptavidin enthalten.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann der Kit zusätzlich zur Matrix-DNS, zur Detektornukleotidsequenz und ggf. zum initialen Primer, zur Sonde und zu den Biomolekülen auch bereits die feste Phase beinhalten, die der Immobilisierung der Detektornukleotidsequenz dient. An die feste Phase ist gegebenenfalls die Detektornukleotidsequenz mit ihrem 3 "-Ende gebunden. Ergänzend oder alternativ dazu kann auch die Fangnukleotidsequenz, die der Immobilisierung der Target-Nukleotidsequenz dient, mit ihrem 3 "-Ende an die feste Phase gebunden sein, je nachdem, ob der Nachweis mit einer Fangnukleotidsequenz durchgeführt werden soll . Detektornukleotidsequenz und/oder Fangnukleotidsequenz können natürlich auch ungebunden Bestandteile des Kits sein.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann der Kit neben der Matrix-DNS, der Detektornukleotidsequenz und gegebenenfalls dem initialen Primer, der Sonde, den Biomolekülen und der festen Phase zusätzlich Detektormonomere, Ligase und gegebenenfalls Restriktionsendonuklease beinhalten, wenn die Detektornukleotidsequenz eine solche Markierungsstelle enthält, die nach der Synthese des Gegenstrangs zusammen mit diesem eine Erkennungsstelle für die zugegebene Restriktionsendonuklease bildet.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfaßt der Kit auch bereits die DNS-Polymerase (n) , die dNTPs, das Restriktionsenzym, das die Erkennungsstelle der Matrix-DNS erkennt, geeignete Enzym-, Reaktions- und Waschpuffer sowie gegebenenfalls das markierte dNTP .
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann der Kit die zur Detektion der markierten Nukleotide dienende Reagenzien auch enthalten, also beispielsweise die Enzyme und Reagenzien zum enzymatischen oder fluorometrischen Nachweis.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Kits in der medizinischen Diagnostik, in der kriminalistischen Spurenanalyse sowie für Umwelt-, Lebens- und Arzneimittelanalysen. So kann der Kit beispielsweise zum Nachweis der Expression eines Gens verwendet werden, wie z.B. in Abb. 5 dargestellt. In der medizinischen Diagnostik bietet sich der Kit insbesondere zur Diagnose viraler und bakterieller Infektionen und von Prionen an, aber auch der Nachweis des Vorhandenseins bestimmter Gene oder von Einzelnukleotidpolymorphis- men/Mutationen in bestimmten Genen kann mit dem Kit erbracht werden.
Mit der erfindungsgemäßen Lösung steht damit ein Verfahren zur Verfügung, das im Routinebetrieb hervorragend einsetzbar ist. Die Möglichkeit der isothermischen Reaktionsführung und die Durchführung aller Reaktionsschritte im gleichen Reaktionsansatz stellen eine äußerst vorteilhafte Nachweismethode dar. Das Verfahren benötigt nur einen Primer, der erfindungsgemäß amplifiziert wird, wobei der Primer entweder die nachzuweisende Nukleotidsequenz selbst ist oder an das nachzuweisende Molekül (Nukleotidsequenz, Aminosäuresequenz oder Antigen) gekoppelt wird. Abbildungen;
Abb. 1:
schematische Darstellung erfindungsgemäßer PTO-Matrix- und Methyl-Matrix-DNS (A) sowie unmodifizierter Matrix- DNS (B)
Abb. 2: schematische Darstellung erfindungsgemäßer Detektor- nukleotidsequenz mit hybridisiertem Primer und mit verlängertem Primer sowie mit modifiziertem 5 '-Terminus zur Bindung eines Target-Moleküls
Abb.3: schematische Darstellung erfindungsgemäßer Detektornukleotidsequenz mit hybridisiertem Primer, mit verlängertem Primer und mit an das Detektornukleotidsequenz-Hybrid ligierten Detektormonomeren
Abb. 4: schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Nachweises einer Target-DNS (A) und eines Antigens (B)
Abb. 5: schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Expressionsnachweises eines Gens Ausführungsbeispiele
Beispiel 1 :
Nachweis des EBV (Epstein-Barr-Virus) -Genoms in einer Patientenprobe unter Verwendung der erfindungsgemäßen Matrix-DNS SEQ ID NO 3 , die phosphorthioatisiert ist und unter Verwendung der erfindungsgemäßen Sequenz SEQ ID NO 7
Der direkte Nachweis des EBV-Genoms (Sequenzausschnitt siehe Ende des Beispiels) erfolgt durch Hybridisierung des 3 "-Endes der Target-DNS mit dem 3 '-Ende der Matrix- DNS (SEQ ID NO 3) , die mit PTO modifiziert ist (Sequenz siehe Ende des Beispiels). Das 3'-Ende der Target-DNS fungiert nach erfolgter Hybridisierung als initialer Primer. Um ein spezifisches 3 '-Ende in der Target-DNS zu erhalten, wird vor der Hybridisierung mit der Matrix-DNS ein Restriktionsverdau durchgeführt (s. auch Abb. 4a) .
1. Zur Vorbereitung der Reaktionsgefäße werden NucleoLink™-Platten (Nunc) mit der Detektornukleotidsequenz (Sequenz siehe Ende des Beispiels) beschichtet: die 3 '-phosphorylierte Detektornukleotidsequenz wird in 1-Methylimidazol, pH 7,4 (Sigma) und l-Ethyl-3- (3-diethylamino- propyl) carbodiimid (Sigma) über Nacht inkubiert. Mehrmaliges Spülen mit NaOH und nachfolgend mit Aqua dest . laut Arbeitsvorschrift der Firma Nunc; Trocknen der NucleoLink™-Streifen und Aufbewahrung 2. Präparation der Gesamt-DNS aus Patientenseren unter Verwendung eines InViSorb®-Kits der Firma InViTek nach Arbeitsvorschriften des Herstellers (Aufbewahrung der DNS bei -20 °C möglich) 3. Zur Vorbereitung des Restriktionsverdaus der Target -DNS und der RCR wird ein Mastermix folgender Zusammensetzung in die Kavitaten der unter „1." präparierten NucleoLink™-Platten pipettiert:
Tris-HCl- Puffer
NaCl MgCl2
Bsp 1286 I (New England Biolabs [NEB] ) dATP, dCTP, dGTP, dTTP (alle Promega) dUTP-Digoxigenin (Röche Diagnostics GmbH)
PTO-Matrix-DNS (Oligonukleotidsynthese, MWG Biotech) (Sequenz siehe Ende des Beispiels)
4. Pipettieren von Proben- (enthält Gesamt-DNS aus Patientenproben) bzw. Kontrollδsung in die entsprechenden Kavitaten (siehe unten)
5. Verdau der Target-DNS mit Bsp 1286 I und Denaturierung, initiale Hybridisierung der Target- DNS mit der Matrix-DNS 6. Zugabe von BsoB I (NEB) und Klenow-Fragment (3"→5' exo", NEB)
7. RCR-Reaktion
8. Spülen der Kavitaten mit Waschpuffer
9. Inkubation der Kavitaten mit peroxidasekonju- giertem Ziege—Anti-Digoxigenin-IgG (Röche Diagnostics GmbH)
10. Spülen mit Waschpuffer
11. Inkubation mit Tetramethylbenzidin-Fertiglösung (Sigma) 12. Messung des Farbumschlages bei 655 nm
Folgende Reaktionsansätze mit folgenden DNS- Präparationen sind für Proben und Kontrollen im Rahmen eines diagnostischen Tests notwendig (Proben- und Kontrollösungen werden zu Mastermix gegeben) :
1. DNS
2. humane DNS mit Zusatz von Kopien des EBV-Genoms
(Positivkontrolle) 3. humane DNS ohne Zusatz von EBV-Genom (Negati- kontrolle) 4. H20 (Reagenzienkontrolle)
PTO-Matrix-DNS (SEQ ID NO: 3)
BsoB I, Ava I
< >
5" -TGC TCA TCG CCA ACC GSCT SCSCSC GAG TAG TTC CTG CTC ATC GCC AAC CGC TCC CGA- 3 "-Aminohexyl
< > < >< primerkodierende Sequenz Verlängerungs- Primerhybridisierungssequenz sequenz
(s=Phosphorthioatdiesterbindung)
Hybridisierung der Matrix-DNS an EBV-DNS (EBV-cDNS-Sequenz: 140353-140440):
5' -ATC GGG CGA CAG GTG CCC AAG CTG GGC AAT GCC CCC GCC GCG 3 '-TAG CCC GCT GTC CAC GGG TTC GAC CCG TTA CGG GGG CGG CGC
iBsp 1286 I, BsiHKA I £
CAG GTC AGC AAC GTG CT I C ATC GCC AAC CGC TCC CAC AAC TCT CTA-3'
GTC CAG TCG TTG C | AC GAG TAG CGG TTG GCG AGG GTG TTG AGA GAT-5'
TG CTC ATC GCC AAC CGC TCC C r<— — >ι
5 ' - AGT TCC Primerhybridisierungssequenz der GA- 3 ' -Aminohexyl
Matrix-DNS
Detektor-Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 7) :
5' -ACA CCA TAC ACC TCT GCT CAT CGC CAA CCG CTC CCT CTC TCT CTC T-3 ' -Phosphat-feste Phase
< >
Markierungsstellen Primerhybridisierungssequenz
Die Schmelztemperatur des an der Detektor-Nukleotidsequenz verlängerten Primers beträgt ca.
100 °C.
Beispiel 2: Nachweis von humaner Cholin-Acetyl- Transferase mittels RCR im kompetitiven ELISA unter Verwendung der erfindungsgemäßen Matrix-DNS SEQ ID NO 2, die methyliert ist und unter Verwendung der erfindungsgemäßen Sequenzen SEQ ID NOs 5 und 8
Zum immunologischen Nachweis von humaner Cholin-Acetyl- Transferase wurde ein kompetitiver ELISA unter Verwendung des monoklonalen Anti-Cholin-Acetyl- Transferase-Antikörpers 28C4 und des biotinylierten Peptids 168-189 der Cholin-Acetyl-Transferase (P3) entwickelt (s. auch Abb. 4b) . Der initiale Primer liegt während der Immunbindung des DNS-Antikörperkonjugats als doppelsträngige DNS vor. Damit wird die unspezifische Bindung des DNS-Antikörperkonjugats an die Primerhybridisierungssequenz der Detektor-Nukleotidsequenz verhindert.
1. Die Beschichtung von NucleoLink™- Platten (Nunc) mit biotinylierter Detektor-Nukleotidsequenz (Sequenz siehe Ende des Beispiels) erfolgt analog zu Beispiel 1.
2. Inkubation aller Kavitaten der Mikrotestplatte mit Streptavidin in Puffer
3. Spülen mit Waschpuffer 4. Inkubation mit P3-(Peptid 168-189 der Acetyl- Cholin-Transferase) Biotin in Puffer
5. Spülen in Waschpuffer
6. Patientenproben sowie die entsprechenden Kontrollproben werden mit der Primärantikörperlösung (28C4) versetzt und in den Kavitaten der mit
Detektornukleotidsequenz und Peptid P3 beschichteten Mikrotestplatte inkubiert
7. Spülen mit Waschpuffer
8. Inkubation des Ziege-Anti-Maus-Antikörper-DNS- Konjugats (Herstellung siehe Ende des Beispiels) in TBS-T unter Zusatz von acetyliertem BSA (NEB) , Heparin, Magermilchpulver
9. Spülen mit Waschpuffer 10. Pipettieren von Mastermix folgender Zusammensetzung in die Kavitaten der unter „1.-9." präparierten NucleoLink™-Platte :
Tris-HCl-Puffer NaCl
MgCl2 dATP, dCTP, dGTP, dTTP (alle Promega) dUTP-Digoxigenin (Röche Diagnostics GmbH) Methyl-Matrix-DNS (Oligonukleotidsynthese, MWG Biotech) (Sequenz siehe Ende des
Beispiels)
11. Denaturierung des initialen Primers und initiale Hybridisierung 12. Zugabe von Hae III (NEB) und Klenow-Fragment (3'- 5' exo", NEB)
13. RCR-Reaktion
14. Spülen der Kavitaten mit Waschpuffer
15. Inkubation der Kavitaten mit peroxidasekonju- giertem Ziege-Anti-Digoxigenin— IgG (Röche Diagnostics GmbH)
16. Spülen mit Waschpuffer
17. Inkubation mit Tetramethylbenzidin-Fertiglösung (Sigma) 18. Messung des Farbumschlags bei 655 um
Folgende Reaktionsansätze sind für Proben und Kontrollen im Rahmen eines Tests notwendig:
1. Patientenprobe (Serum)
2. Negativkontrolle (humanes Serum ohne Cholin- Acetyl-Transferase)
3. Positivkontrolle (humanes Serum mit Zusatz von P3) Methyl -Matrix-DNS (SEQ ID NO : 2 )
Hae III Verlangerungs-
< >
5' -GTG TGG TGT GGG GmCC TTG TTG GTT GGT TGT GTG GTG TGG GG-3 'Aminoh
primerkodierende Sequenz sequenz Primerhybridisierungssequenz
(mC=5-Methylcytosin)
Detektor-Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 8) :
Biotin-5'-ATG AAA TGA GAG ATG TGT GTG GTG TGG GGT GTG TGT GTG-3 ' -P >
Markierungsstellen Primerhybridisierungssequenz
Initialer Primer (SEQ ID NO : 5) :
5" -GTG TGG TGT GGG G-3 3" -CAC ACC ACA CCC C- 5 " -Phosphat initialer Primer
Herstellung des DNS-Antikörper-Konjugates:
Ziege-Anti-Maus- IgG (Sigma) wird in 10 mM 1- Methylimidazol , (Sigma) unter Zusatz von 10 mM 1-Ethyl- 3- (3-demethylaminopropyl) carbodiimid (Sigma) mit 5"- phosphoryliertem Primer (siehe oben) inkubiert. Mittels Anionenaustauschchromatographie werden die Reaktionsprodukte gereinigt.
Beispiel 3: Nachweis der Expression des humanen p53- Gens unter Verwendung der erfindungsgemäßen unmodi- fizierten Matrix-DNS SEQ ID NO 1 und unter Verwendung der erfindungsgemäßen Sequenzen SEQ ID NOs 4,6,9 und 10
Zum Nachweis der Expression des humanen p53-Gens wird nach Standardverfahren über eine reverse Trans- kriptasereaktion copy-DNS (cDNS) hergestellt und im RCR-Test eingesetzt. Die cDNS wird über das 5 "-Ende der Detektor-DNS (Sequenz siehe Ende des Beispiels) , das hier als Fangsonde dient, aus der Probenflüssigkeit an die feste Phase der NucleoLink™-Platten immobilisiert und gleichzeitig mit der Sonde (Sequenz siehe Ende des Beispiels) hybridisiert (s. auch Abb.5) .
1. Beschichtung von NucleoLink™-Platten (Nunc) mit Detektor-Nukleotidsequenz (Sequenz siehe Ende des
Beispiels) analog zu Beispiel 1
2. Pipettieren der cDNS -Lösung und des Hybridi- sierungspuffers unter Zusatz von biotinylierter Sonde (Sequenz siehe Ende des Beispiels) in die vorbereiteten Mikrotestplatten
3. Denaturierung der cDNS durch Erhitzen und anschließende Hybridisierung der Target -DNS (p53 458-593) (Sequenz siehe Ende des Beispiels) mit dem 5 '-Ende der Detektor-Nukleotidsequenz und mit der biotinylierten Sonde (p53-Sequenz 574-593)
4. Spülen mit Waschpuffer 5. Inkubation mit Streptavidin (Sigma) 6. Spülen mit Waschpuffer
7. Inkubation mit biotinyliertem, doppelsträngigem initialen Primer (Sequenz siehe Ende des Beispiels) 8. Spülen der Kavitaten mit Waschpuffer
9. Pipettieren von Mastermix folgender Zusammensetzung in die unter 1.-8. präparierten Kavitaten und nachfolgend Inkubation:
Tris-HCl-Puffer NaCl
MgCl2 dATP, dCTP, dGTP, dTTP (alle Promega) Matrix-DNS
10. Denaturierung des initialen Primers und initiale Hybridisierung mit der Matrix-DNS
11. Zugabe von N.BstNB I (NEB) und Bst DNS-Polymerase, Large Fragment (NEB)
12. RCR-Reaktion
13. Spülen der Kavitaten mit Waschpuffer 14. Pipettieren der biotinmarkierten Detektormonomere (Sequenz siehe Ende des Beispiels) , Bgl I (NEB) und Ligase (NEB) in Reaktionspuffer in die Kavitaten, Inkubation 15. Spülen der Kavitaten mit Waschpuffer 16. Inkubation der Kavitaten mit Extravidin-POD (Sigma)
17. Spülen der Kavitaten mit Waschpuffer
18. Inkubation mit TMB-Fertiglösung (Sigma)
19. Messung des Farbumschlages bei 655 nm Folgende Reaktionsansätze sind für Proben und Kontrollen im Rahmen eines Tests notwendig:
1. cDNS-Lösung der Probe
2. Positivkontrolle bekannter p53-cDNS-Konzentration
3. H20 (Reagenzienkontrolle) Matrix-DNS (SEQ ID NO: 1) :
5" -GTG TGG TGT GGG GTG TGG ACT CTG GTT GTT GTG TGG TGT GGG G-3 ' -Aminohexyl
< > < >< > < > primerkodierende Sequenz N.BstNB I Verlangerungs- Primerhybridisierungssequenz sequenz
initialer Primer (SEQ ID NO: 6) :
3" -CAC ACC ACA CCC C-5' <-Primer w
Biotin-5'-GTG TGG TGT GGG G-3'
Detektor-Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 9) :
5"-CAA GAA GCC CAG ACG GAA ACT GGC CTC GCT GGC TGA TTG TGT GTG GTG TGG GGT TGT TGT TGT -3"-
< > <_ > < > Phosphat-
Verlängerungssequenz Bgl I-Erkennungssequenz Primerhybridisierungssequenz feste Phase
(komplementär zu p53-cDNS 458-477) (=Fangnucleotidsequenz)
Sonde p53 574-593 (SEQ ID NO: 4)
Biotin-5"-GGC GGG GGT GTG GAA TCA AC-3'
Detektormono er (SEQ ID NO: 10) :
5' -TCC GCC TCA TCT* GCT CTT CCC GC-3'
3' -GCG AGG CGG AGT* AGA CGA GAA GG-5'
*=biotinyliertes dTMP
p53 -cDNS-Sequenz 404-600:
5'- CCT GGC CCC TGT CAT CTT CTG TCC CTT CCC AGA AAA CCT ACC AGG GCA GCT ACG GTT TCC GTC TGG GCT
<
P53-458-477, komplementär zur Verlängerungssequenz der Detektor-Nukleotidsequenz
TCT TGC ATT CTG GGA CAG CCA AGT CTG TGA CTT GCA CGT ACT CCC CTG CCC TCA ACA AGA TGT TTT GCC AAC >
TGG CCA AGA CCT GCC CTG TGC AGC TGT GGG TTG ATT CCA CAC CCC CGC CCG GCA CC-3'
< > komplementär zur Sonde p53 574-593

Claims

Patentansprüche
Verfahren zum direkten Nacnweis von Target - Nukleotidsequenzen, Targe -Aminosäuresequenzen oder Targe -Antigenen durch Amplifikation einer DNS unter Verwendung einer DNS-Polymerase und eines Restriktionsenzyms, dadurch gekennzeichnet, daß das Targe -Molekül in Lösung gebracht wird oder über eine Fangnukleotidsequenz oder eine Detektornukleotidsequenz an einer festen Phase immobilisiert wird, zur Target -NuKleotidsequen , die selbst als initialer Pnmer dient, oder zum Target -Molekül, an das e ne Nukleotidsequenz, die als initialer Primer dient, über eine Sonde gekoppelt ist, eine Matrix-DNS zugegeben wird, die eine zum initialen Primer Komplementäre Primerhybridisierungssequenz aufweist sowie in 5'- Richtung eine Verlängerungssequenz, eine Restπk- tionsenzymerkennungssequenz und eine primerkodierende Sequenz besitzt, wobei die primerkodierende Sequenz vollständig oder im Wesentlichen homolog zur Primerhybridisierungssequenz ist, danach eine DNS-Polymerase und dNTPs zur Synthese eines zur Matrix-DNS komplementären Zweitstranges und ein Restriktionsenzym zugegeben werden und anschließend durch die Detektion des Amplifikats in Lösung oder mittels Deteκtornukleotιasequenz an der festen Phase der Nacnweis αes Targets erfolgt
Ver ahren nach Anspruch 1 , dadurch αekennzeichnet , daß die Amplifikation des initialen Primers isother- isch erfolgt .
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Restriktionsenzym entweder eine Restriktionsendonuklease oder ein Nickenzym verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß für den Fall der Verwendung einer Restriktionsendonuklease als Restriktionsenzym, die Restrik- tionsenzymerkennungsstelle der Matrix-DNS chemisch so modifiziert ist, daß sie nicht oder nur in geringem Maße durch die Restriktionsendonuklease geschnitten wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß als Matrix-DNS eine Sequenz verwendet wird, deren 3 '-Terminus chemisch modifiziert ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß als DNS-Polymerase eine solche verwendet wird, die Strangverdrängung ermöglicht, vorzugsweise eine DNS- Polymerase ohne Exonukleasefunktion.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß für den Nachweis von Targe -Nukleotidsequenzen das 3 '-Ende der Target -Nukleotidsequenz selbst als initialer Primer dient oder als Sonde eine Nukleotidsequenz eingesetzt wird, deren 3 '-Ende der Sequenz des initialen Primers entspricht oder an die gegebenenfalls über ein cdεr mehrere Biomoleküle der initiale Primer gebunden ist, zum Nachweis von einem Target -Antigen als Sonde ein antigenspezifischer Antikörper eingesetzt wird, an den kovalent oder über e n oder mehrere Biomoleküle der initiale Pr mer gekoppelt ist oder zum Nachweis einer Targe -A-r. r.osäuresequenz als Sonde ein Ligand eingesetzt w rd, an dem kovalent oder über ein oder mehrere Biomoleküle der initiale Primer gekoppelt st.
Verfahren nach einem der Ar-sprύcne 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß als Biomoleküle entweder Ξ ctm und Avidin oder Streptavidin oder Haptene ur.c haptenspezifische Antikörper oder Avidin oder Streptavidin eingesetzt werden.
Verfahren nach einem der Anspr che 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß als Fangnukleotidsequenz eine Sequenz verwendet wird, die mit ihrem 3 " - Ende an die feste Phase gebunden ist und an ihrem S'-Er.ae komplementär zu einem Bereich der Target - Nukleotidsequenz oder der an das Target-Molekül als Sonde gekoppelten Nukleotidsequenz ist . Verfahren r.acr. einem der Ansprüche 1 9, dadurch geκennzeιchnet , daß die Detektion des Amplifikats in Lösung durchgeführt wird, indem Ladung, Größe oder Hybπ- disierungseigenschaften des Amplifikats ausgenutzt werden.
Verfahren nacr. einem der Ansprücne 1-9, dadurch geκεnnzeιchnet , daß die Detektion des Amplifikats an der festen Phase mit einer Detektornukleotidsequenz durchgeführt */ιrd, die mit ihrem 3 '-Ende an der festen Phase immobilisiert ist und eine Primerhybridisierungssequenz enthält, die homolog ist zu der Primer- nybridisierungssequenz der Matrix-DNS und eine Markierungssteile enthält, über die die Detektion erfolgt .
Verfahren nach Ansprucn 11, dadurch geκennzeιchnet , daß als Detektornukleotidsequenz eine solche verwendet wird, die 5'-termιnal mit einem Biomolekül verbunden st, über das das Target-Molekül an die Detektornukleotidsequenz koppelt .
Verfahren nacr Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Detektc: - Nuk eotiαsequenz eine Nukleotid sequenz eingesetzt w rd, die an ihrem 5 '-Ende komplementär tu einem Bereich αer Target Nukleotidsequenz oder der an das Target -Molekül als Sonde gekoppelten Nukleotidsequenz ist und gleichzeitig als Fangnukleotidsequenz dient.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11-13, dadurch gekennzeichnet, daß als Detektornukleotidseuqenz eine solche verwendet wird, die ein Nukleotid aufweist, über das bei der Synthese des Gegenstranges der Einbau eines markierten Nukleotides erfolgt und über diese Markierung die Detektion durchgeführt wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11-13, dadurch gekennzeichnet, daß als Detektornukleotidsequenz eine solche verwendet wird, die als Markierungsstelle eine Sequenz aufweist, die nach der Gegenstrang-Synthese eine Erkennungssequenz für eine Restriktionsendonuklease darstellt und dem Ansatz dieses Restriktionsenzym, Ligase und Detektormonomere zugegeben werden, wobei die Detektormonomere DNS- Sequenzen mit markierten Nukleotiden und mit 3'- oder 5~ -Überhängen darstellen und die Überhänge zueinander und zum 5'- oder 3 '-Überhang des geschnittenen Detektor-Nukleotidsequenz -Hybrides komplementär sind und die Detektion des Amplifikats über die markierten Nukleotide der Detektormonomere durchgeführt wird.
lό. Kit zur Durchführung des Verfahrens gemäß aer Ansprüche 1-15, dadurch gekennzeichnet, daß der Kit mindestens der Amplifikation der nachzuweisenden Target -Nukleotidsequenz oder des nachzuweisenden Target-Moleküls dienende Matrix- DNS enthält.
17. Kit nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Kit zusätzlich initialen Primer und/oder Sonde sowie gegebenenfalls ein oder mehrere Biomolekule zur Kopplung der Sonde an den initialen Primer enthält, wobei initialer Pimer und Sonde, gegebenenfalls über ein oder mehrere Biomoleküle, gekoppelt in dem Kit enthalten sein können oder der initiale Primer und die Sonde sowie gegebenenfalls das Biomolekül oder die Biomoleküle einzeln in dem Kit enthalten sein können.
18. Kit nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Kit zusätzlich Detektornukleotidsequenz enthalten ist, wobei die Detektornukleotidsequenz entweder an einer festen Phase immobilisiert vorliegt oder feste Phase und Detektornukleotidsequenz getrennt in dem Kit enthalten sind.
19. Kit nach einem der Ansprüche 16-18, dadurch gekennzeichnet, daß der Kit zusätzlich eine Fangnukleotidsequenz enthält, wobei die Fangnuklectidsequenz entweder an der festen Phase immobilisiert vorliegen kann oder feste Phase und Fangnukleotidsequenz getrennt in dem Kit enthalten sind.
20. Kit nach einem der Ansprüche 16-19, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Kit zusätzlich Detektormonomere, die markierte Nukleotide enthalten, und Ligase sowie gegebenenfalls ein Restriktionsenzym, das die Erkennungssequenz des Detektornukleotidsequenz- Zweitstrang-Hybrids erkennt, enthalten sind.
21. Kit nach einem der Ansprüche 16-20, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Kit zusätzlich DNS -Polymerase und/oder dNTPs, wobei eines der dNTPs markiert sein kann und/oder ein Restriktionsenzym zum Schneiden der Matrix-DNS und/oder geeignete Enzym- und Reaktionspuffer enthalten sind.
22. Kit nach einem der Ansprüche 16-21, dadurch gekennzeichnet, daß der Kit zusätzlich der Detektion der markierten Nukleotide dienende Reagenzien enthält.
23. Verwendung des Kits nach einem der Ansprüche 16-22 in der medizinischen Diagnostik und kriminologischen Spurenanalytik sowie für Umwelt-, Lebensund Arzneimittelanalysen.
24. Verwendung des Kits nach Anspruch 23 zum Nachweis der Expression eines Gens.
5. Verwendung des Kits nach Anspruch 23 zur Diagnose von Infektionen.
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