EP1292707A2 - Oligonukleotide oder pna-oligomere und verfahren zur parallelen detektion des methylierungszustandes genomischer dna - Google Patents
Oligonukleotide oder pna-oligomere und verfahren zur parallelen detektion des methylierungszustandes genomischer dnaInfo
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- EP1292707A2 EP1292707A2 EP01927582A EP01927582A EP1292707A2 EP 1292707 A2 EP1292707 A2 EP 1292707A2 EP 01927582 A EP01927582 A EP 01927582A EP 01927582 A EP01927582 A EP 01927582A EP 1292707 A2 EP1292707 A2 EP 1292707A2
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Definitions
- the second variant is based on partial chemical cleavage of total DNA, modeled on a Maxam-Gilbert sequencing reaction, ligation of adapters to the ends thus generated, amplification with generic primers and separation on a gel electrophoresis.
- This method defined areas up to the size of less than a thousand base pairs can be examined.
- the process is so complicated and unreliable that it is practically no longer used (Ward, C. et al., J. Biol. Chem. 265, 3030-3033).
- the present invention describes a method and a set of oligonucleotides or PNA oligomers for the parallel detection of the methylation state : ⁇ ( ⁇ ) 90ivi99i ⁇ ( ⁇ ): ⁇ ( ⁇ ) 90ivi990 ⁇ ( ⁇ ) * ⁇ ( ⁇ ) 9 ⁇ vi99i ⁇ ( ⁇ )
- a genomic DNA sample is chemically treated in such a way that at the 5'-position unmethylated cytosine bases are converted into uracil, thymine or another base which is unlike cytosine in terms of hybridization behavior.
- the treatment of genomic DNA with bisulfite (bisulfite, disulfite) and subsequent alkaline hydrolysis, which leads to a conversion of unmethylated cytosine nucleobases into uracil, is preferably used for this purpose.
- more than 26 different oligonucleotides are used simultaneously to produce a complex amplificate.
- the products obtained after the amplification are separated by gel electrophoresis and the fragments which are smaller than 2000 base pairs or smaller than any limit below
- the CpG dinucleotides contained in the amplified fragments are also examined completely or partially by hybridization of the fragments already provided with a detectable label in the amplification to a set of PNA oligomers which comprises at least two of the following sequences:
- W one of the bases adenine (A) or thymine (T)
- the first step is a genomic sequence using bisulfite
- Figure 1 Here a high-density DNA chip is shown after hybridization.
- the false color image is shown as it is generated after scanning. Contrary to the black and white illustration shown here, the scanner turns a colored one
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Abstract
Beschrieben wird ein Verfahren und ein Satz von Oligonukleotiden oder PNA-Oligomeren zur parallelen Detektion des Methylierungszustandes von genomischer DNA. Zuerst wird die DNA mit Bisulfit behandelt und diese chemisch modifizierte DNA anschliessend fragmentiert. Man amplifiziert im nächsten Schritt unterschiedliche Fragmente mit synthetischen Primern. Die Amplifikate werden mit Oligonukleotiden bekannter Sequenz hybridisiert und abschliessend detektiert.
Description
Oligonukleotide oder PNA-Oligomere und Verfahren zur parallelen Detektion des Methylierungszustandes genomischer DNA
Die vorliegende Erfindung betrifft Oligonukleotide oder PNA-Oligomere und ein Verfahren zur parallelen Detektion des Methylierungszustandes von genomischer DNA.
Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebenen sind die Gene selbst, die Übersetzung die- ser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung der Gene bzw. des Genoms korrelier- bar. Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem veränderten Methylie- rungsmuster einzelner Gene oder des Genoms.
Stand der Technik sind Verfahren, welche das Studium von Methylierungsmustern einzelner Gene gestatten. Jüngere Fortentwicklungen dieser Methode erlauben auch die Analyse kleinster Mengen an Ausgangsmaterial. Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur parallelen Detektion des Methylierungszustandes genomischer DNA Proben, wobei ausgehend von einer Probe gleichzeitig zahlreiche verschiedenene Fragmente aus an der Genregulation beteiligten oder/und transkribierten und/oder translatierten Sequenzen amplifiziert werden und anschließend der Sequenzkontext in den amplifizierten Fragmenten enthaltenen CpG Dinukleotide untersucht wird.
5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryoti- scher Zellen. Sie spielt beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, genomischem Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5- Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem
Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR-Amplifikation die epigenetische Information, welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.
Die Modifikation der genomischen Base Cytosin zu 5'-Methylcytosin stellt den bis heute wichtigsten und bestuntersuchten epigenetischen Parameter dar. Trotzdem gibt es bis heute zwar Methoden, umfassende Genotypen von Zellen und Individuen zu ermitteln, aber noch keine vergleichbaren Ansätze auch in großem Maße epige- notypische Information zu generieren und auszuwerten.
Es sind im Prinzip drei verschiedene Methoden bekannt, den 5-Methyl-Status eines Cytosins im Sequenzkontext zu bestimmen.
Die erste prinzipielle Methode beruht auf der Verwendung von Restriktionsendo- nukleasen (RE), welche „methylierungssensitiv" sind. REs zeichnen sich dadurch aus, daß sie an einer bestimmten DNA-Sequenz, meist zwischen 4 und 8 Basen lang, einen Schnitt in die DNA einführen. Die Position solcher Schnitte kann dann durch Gelektrophorese, Transfer auf eine Membran und Hybridisierung nachgewiesen werden. Methylierungssensitiv bedeutet, daß bestimmte Basen innerhalb der Erkennungssequenz unmethyliert vorliegen müssen, damit der Schnitt erfolgen kann. Das Bandenmuster nach einem Restriktionsschnitt und Gelektrophorese ändert sich also je nach Methylierungsmuster der DNA. Allerdings befinden sich die wenigsten methylierbaren CpG innerhalb von Erkennungssequenzen von REs, können also nach dieser Methode nicht untersucht werden.
Die Empfindlichkeit dieser Methoden ist extrem niedrig (Bird, A.P., and Southern, E.M., J.Mol. Biol. 118, 27-47). Eine Variante kombiniert PCR mit dieser Methode, eine Amplifikation durch zwei auf beiden Seiten der Erkennungssequenz liegende
Primer erfolgt nach einem Schnitt nur dann, wenn die Erkennungssequenz methy- liert vorliegt. Die Empfindlichkeit steigt in diesem Fall auf theoretisch ein einziges Molekül der Zielsequenz, allerdings können mit hohem Aufwand nur einzelne Positionen untersucht werden (Shemer, R. et al., PNAS 93, 6371-6376). Wiederum ist Voraussetzung, daß sich die methylierbare Position innerhalb der Erkennungssequenz einer RE befindet.
Die zweite Variante beruht auf partieller chemischer Spaltung von Gesamt-DNA, nach dem Vorbild einer Maxam-Gilbert Sequenzierreaktion, Ligation von Adaptoren
an die so generierten Enden, Amplifikation mit generischen Primern und Auftrennung auf einer Gelektrophorese. Mit diesem Verfahren können definierte Bereiche bis zur Größe von weniger als tausend Basenpaaren untersucht werden. Das Verfahren ist allerdings so kompliziert und unzuverlässig, daß es praktisch nicht mehr verwendet wird (Ward, C. et al., J. Biol. Chem. 265, 3030-3033).
Eine relativ neue und die mittlerweile am häufigsten angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulphit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil um- gewandelt wird, welches in seinem Basen-Paarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewandelt, daß Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden kann, jetzt durch „normale" molekularbiologische Techniken als einzig ver- bliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt werden kann.
Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulphit reagiert nur an ein- zelsträngiger DNA) verhindert und alle Fäliungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek, A. et al., Nucl. Acids. Res. 24, 5064-5066). Mit dieser Methode können einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Me- thode veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen bis etwa
3000 Basenpaare Länge untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausende von möglichen Methylierungsereignissen ist nicht möglich.
Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten, 5-Methylcytosine nach- zuweisen, kann auch dem folgenden Übersichtsartikel entnommen werden: Rein,
T., DePamphilis, M. L, Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 26, 2255 (1998).
Die Bisulphit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z.B. Zeschnigk, M. et al., Eur. J. Hum. Gen. 5, 94-98; ubota T. et al., Nat. Genet. 16, 16-17) nur in der
Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulphit-Behandlung amplifiziert und entweder komplett sequenziert (Olek, A. and Walter, J., Nat. Genet. 17, 275-276) oder einzelne Cyto- sin-Positionen durch eine „Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo, M. L. and Jones, P.A., Nucl. Acids. Res. 25, 2529-2531) oder Enzymschnitt (Xiong, Z. and Laird,
P.W., Nucl. Acids. Res. 25, 2532-2534) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al, WO 99/28498 A1).
Für die Korrelation zwischen Genaktivität und Methylierungsgrad ist vor allem die Methylierungsanalyse in Promotoren von Bedeutung.
Gemeinsamkeiten zwischen Promotoren bestehen nicht nur im Vorkommen von TATA- oder GC-Boxen sondern auch darin, für welche Transkriptionsfaktoren sie Bindestellen besitzen und in welchem Abstand diese sich zueinander befinden. Die existierenden Bindestellen für ein bestimmtes Protein stimmen in ihrer Sequenz nicht vollständig überein, es finden sich aber konservierte Folgen von mindestens 4 Basen, die durch das Einfügen von „Wobbles,,, d. h. Positionen, an denen sich jeweils unterschiedliche Basen befinden, noch verlängert werden können. Des weiteren liegen diese Bindestellen in bestimmten Abständen zueinander vor.
Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer Array Herstellung läßt sich aus einer im Januar 1999 erschienen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21 , January 1999), der dort zitierten Literatur und dem US-Patent 5994065 über Methoden zur Herstellung von festen Trägern für Zielmoleküle wie Oligonukleotide bei vermindertem nichtspezifischem Hintergrundsignal entnehmen.
Als Sonden, die in einem Oiigomer-Array auf einer Oberfläche fixiert werden, kommen Oligonukleotide in Frage, jedoch bietet sich auch jede Modifikation von Nuk- ieinsäuren an, z.B. Peptide Nucleic Acids (PNA), (Nielsen, P.E., Buchardt, O., Eg- holm, M. and Berg, R.H. 1993. Peptide nucleic acids. US Patent. 5,539,082; Buchardt, O., Egholm, M., Berg, R.H. and Nielsen, P.E. 1993. Peptide nucleic acids and their potential applications in biotechnology. Trends in Biotechnology, 11 : 384- 386), Phosphorothioatoligonukleotide oder Methylphosphonatoligonukleotide.
Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) ist eine neue, sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Ka- ras, M. and Hillenkamp, F. 1988. Laser desorption ionization of proteins with mo- lecular masses exceeding 10.000 daltons. Anal. Chem. 60: 2299-2301). Ein Ana- lytmolekül wird in eine im UV absorbierende Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix ins Vakuum verdampft und das Analyt so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden Ionen unter- schiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere und die Flugzeit wird in die Masse der Ionen umgerechnet.
Genomische DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von Zeil-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen. Diese Standardmethodik findet sich in Refe- renzen wie Fritsch und Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
1989.
Für die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind vielfach fluoreszent markierte Sonden verwendet worden. Besonders geeignet sind für die Fluoreszenzmar- kierung ist das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'OH der jeweiligen Probe. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Proben erfolgt beispielsweise über ein Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen anderen, kommerziell erhältlich.
Die vorliegende Erfindung soll ein Verfahren und einen Satz von Oligonukleotiden oder PNA-Oligomeren bereitstellen, welche sich zur parallelen Detektion des Methylierungszustandes von genomischer DNA eignen. Es sollen bevorzugt genomweit repräsentative CpG-Positionen auf Methylierung hin abgetastet werden unter Verwendung bestimmter, besonders geeigneter Oligomersonden. Zudem sollen unter- schiedliche Fragmente gleichzeitig aus einer genomischen DNA-Probe amplifiziert werden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren und einen Satz von Oligonukleotiden oder PNA-Oligomeren zur parallelen Detektion des Methylierungszustandes
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H)3CATTAACA(H)3; (H)3CATTAACG(H)3; (H)3CGTTAACA(H)3;
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D)4GACGT(D)5; (D)5GACGT(D)4; (D)4GATGT(D)5; (D)5GATGT(D)4;
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(D)2TGATTG(D)2; (D)2TGATCG(D)2; (D)2CGATTG(D)2; (D)2CGATCG(D)2;
(H)2CAATCA(H)2; (H)2CGATCA(H)2; (H)2CAATCG(H)2; (H)2CGATCG(H)2;
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(H)2CGTACAC(H)1 ;
(D)2GATTG(D)3; (D)3GATTG(D)2; (D)2GATCG(D)3; (D)3GATCG(D)2;
(H)2CAATC(H)3; (H)3CAATC(H)2; (H)2CTAGC(H)3; (H)3CTAGC(H)2;
(D)1TGTATATG(D)1; (D)1TGTATACG(D)1; (D)1CGTATATG(D)1;
(D)1CGTATACG(D)1 ;
(H)1CATATACA(H)1 ; (H)1CGTATACA(H)1 ; (H)1CATATACG(H)1 ;
(H)1CGTATACG(H)1;
(D)1TGAGTTTG(D)1 ; (D)1TGAGTTCG(D)1 ; (D)1CGAGTTTG(D)1 ;
(D)1CGAGTTCG(D)1 ;
(H)1CAAACTCA(H)1; (H)1CGAACTCA(H)1; (H)1CAAACTCG(H)1 ;
(HJ^GAACTCG^)^
(D)1TGTTAATG(D)1 ; (D)1CGTTAATG(D)1 ; (D)1TGTTAACG(D)1 ;
(D)1CGTTAACG(D)1;
(H)1CATTAACA(H)1 ; (H)1CATTAACG(H)1; (H)1CGTTAACA(H)1 ;
(H^CGTTAACGOH)., ;
(D)2TGTATG(D)2; (D)2TGTACG(D)2; (D)2CGTATG(D)2; (D)2CGTACG(D)2;
(H)2CATACA(H)2; (H)2CGTACA(H)2; (H)2CATACG(H)2; (H)2CGTACG(H)2;
(D^GGTCGGTT )., ; (D^GGTTGGTT )., ; (H^AACCGACC ".)., ;
(H)1AACCAACC(H)1 ;
(D)2GACGT(D)3; (D)3GACGT(D)2; (D)2GATGT(D)3; (D)3GATGT(D)2;
(H)2ACGTC(H)3; (H)3ACGTC(H)2; (H)2ACATC(H)3; (H)3ACATC(H)2; (D)2GGCGTT(D)2; (D)2GGTGTT(D)2; (H)2AACGCC(H)2; (H)2AACACC(H)2; (D)2GTCGGT(D)2; (D)2GTTGGT(D)2; (H)2ACCGAC(H)2; (H)2ACCAAC(H)2; (D)2TGCGG(D)2; (D)2TTGTGG(D)2; (H)2CCGCGA(H)2; (H)2CCACAA(H)2; (D)2TTCGGG(D)2; (D)2TTTGGG(D)2; (H)2CCCGAA(H)2; (H)2CCCAAA(H)2;
(D)2TTCGAG(D)2; (D)2TTTGAG(D)2; (H)2CTCGAA(H)2; (H)2CTCAAA(H)2; (D)2CGGTCG(D)2; (D)2TGGTTG(D)2; (D)2CGGTTG(D)2; (D)2TGGTCG(D)2; (H)2CGACCG(H)2; (H)2CAACCA(H)2; (H)2CAACCG(H)2; (H)2CGACCA(H)2*
worin
H eine der Basen Adenin (A), Cytosin (C) oder Thymin (T)
D eine der Basen Adenin (A), Guanin (G) oder Thymin (T)
W eine der Basen Adenin (A) oder Thymin (T)
S eine der Basen Cytosin (C) oder Guanin (G) ist.
Dabei sollen mehrere Cytosin-Methylierungen in einer DNA-Probe und bevorzugt der obere und untere DNA-Strang gleichzeitig analysiert werden. Dazu werden die folgenden Verfahrensschritte nacheinander ausgeführt:
Die zu analysierende genomische DNA wird bevorzugt aus üblichen Quellen für DNA erhalten, wie z. B. Zelllinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks- Flüssigkeit, in Paraffin einbettetes Gewebe, histologische Objektträger und alle möglichen Kombinationen hiervon.
Bevorzugt erzeugt man die Fragmente der DNA durch Verdau mit einer oder mehrerer Exo- oder Endonukleasen.
Im ersten Verfahrensschritt wird eine genomische DNA Probe derart chemisch be- handelt, dass an der 5'-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil, Thymin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base verwandelt werden.
Bevorzugt wird dazu die oben beschriebene Behandlung genomischer DNA mit Bi- sulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) und anschließender alkalischer Hydrolyse verwendet, die zu einer Umwandlung nicht methylierter Cytosin-Nukleobasen in Uracil führt.
In einem zweiten Verfahrensschritt werden aus der vorbehandelten genomischen
DNA mehr als zehn unterschiedliche Fragmente gleichzeitig durch Verwendung von synthetischen Ohgonukleotiden als Primer amplifiziert.
Diese Fragmente umfassen bevorzugt Sequenzen aus an der Genregulation betei- ligten und/oder transkribierten und/oder translatierten genomischen Sequenzen, wie sie nach einer chemischen Behandlung wie oben beschrieben vorliegen würden.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens führt man die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durch, wobei eine thermostabile DNA-Polymerase verwendet wird.
In einer weiteren bevorzugten Variante des Verfahrens wird die thermostabile DNA Poiymerase aus folgender Gruppe auswählt: Taq DNA Polymerase, AmpliTaq FS DNA Polymerase, Deep Vent (exo.sup.-) DNA Polymerase, Vent DNA Polymerase, Vent (exo.sup.-) DNA Polymerase und Deep Vent DNA Polymerase, Thermo Se- quenase, exo(-) Pseudococcus furiosus (Pfu) DNA Polymerase, AmpliTaq, Ultman, 9 degree Nm, Tth, Hot Tub, Pyrococcus furiosus (Pfu) und Pyrococcus woesei (Pwo) DNA Polymerase.
In einer wiederum bevorzugten Variante wird die Größe der amplifizierten Fragmente in der PCR auf weniger als 30 s verkürzte Kettenverlängerungsschritte begrenzt.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens enthält mindestens eines der für die Amplifikation verwendeten Oligonukleotide weniger Nukleobasen als es für eine sequenzspezifische Hybridisierung an die chemisch behandelte genomische DNA Probe erforderlich wäre.
In einer weiteren, besonders bevorzugten Variante des Verfahrens ist mindestens ein Oligonukleotid kürzer als 18 Nukleobasen. In einer wiederum besonders bevor-
zugten Variante des Verfahrens ist mindestens ein Oligonukleotid kürzer als 15 Nukleobasen.
In einer wiederum bevorzugten Variante des Verfahrens werden für die Amplifikati- on mehr als 4 Oligonukleotide mit unterschiedlicher Sequenz gleichzeitig in einem
Reaktionsgefäß verwendet.
In einer besonders bevorzugten Varianten werden zur Herstellung eines komplexen Amplifikates mehr als 26 verschiedene Oligonukleotide gleichzeitig verwendet.
In einer weiteren, besonders bevorzugten Variante des Verfahrens werden zur Amplifikation der beschriebenen Fragmente zwei Oligonukleotide oder zwei Klassen von Oligonukleotiden verwendet, von denen eines oder eine der Klassen außer im Kontext CpG die Basen C, A und T enthalten kann, nicht aber die Base G und von denen das andere oder die andere Klasse außer im Kontext CpG die Basen G, A und T, nicht aber die Base C enthalten kann.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens werden die nach der Amplifikation erhaltenen Produkte durch Gelektrophorese aufgetrennt und die Fragmente, die kleiner als 2000 Basenpaare oder kleiner als ein beliebiger Grenzwert unterhalb von
2000 Basenpaaren sind, durch Ausschneiden von den anderen Produkten der Amplifikation vor der Auswertung abgetrennt. Besonders bevorzugt werden diese Amplifikate bestimmter Größe vor der Durchführung der Hybridisierung nochmals amplifiziert.
in einem dritten Verfahrensschritt werden nun die in den amplifizierten Fragmenten enthaltenen CpG Dinukleotide vollständig oder teilweise durch Hybridisierung der bereits in der Amplifikation mit einer nachweisbaren Markierung versehenen Fragmente an einen Satz von Oligonukleotiden untersucht, der mindestens zwei der folgenden Sequenzen umfasst:
(D)4GATGTT(D)4; (D)4GACGTT(D)4; (H)4AACATC(H)4; (H)4AACGTC(H)4; (D)4TTGTGA(D)4; (D)4TTGCGA(D)4; (H)4TCACAA(H)4; (H)4TCGCAA(H)4; (D)4TTTGAA(D)4; (H)4TTCAAA(H)4; (D)4TTCGAA(D)4; (H)4TTCGAA(H)4;
D)4ATTGAT(D)4; (H)4ATCAAT(H)4; (D)4ATCGAT(D)4; (H)4ATCGAT(H)4;
D)3TGGWTTG(D)4; (D)4TGGWTTG(D)3; (D)3CGGWTTG(D)4;
D)4CGGWTTG(D)3;
D)3TGGWTCG(D)4; (D)4TGGWTCG(D)3; (D)3CGGWTCG(D)4;
D)4CGGWTCG(D)3;
H)3CAASCCA(H)4; (H)4CAASCCA(H)3; (H)3CAASCCG(H)4;
H)4CAASCCG(H)3;
H)3CGASCCA(H)4; (H)4CGASCCA(H)3; (H)3CGASCCG(H)4;
H)4CGASCCG(H)3; (D)4AGTGTT(D)4; (D)4AGCGTT(D)4; (H)4AACACT(H)4; (H)4AACGCT(H)4;
D)4TATGTG(D)4; (D)4TACGTG(D)4; (H)4CACATA(H)4; (H)4CACGTA(H)4;
D)4TATGTA(D)4; (H)4TACATA(H)4; (D)4TACGTA(D)4; (H)4TACGTA(H)4;
D)4TTTGGA(D)4; (D)4TTCGGA(D)4; (H)4TCCAAA(H)4; (H)4TCCGAA(H)4;
D)4ATGTGT(D)4; (H)4ACACAT(H)4; (D)4ATGTGT(D)4; (H)4ACGCGT(H)4; (D)3GTGGTTGT(D)3; (D)3GCGGTTGT(D)3; (D)3GCGGTCGT(D)3;
D)3GTGGTCGT(D)3;
H)3ACAACCAC(H)3; (H)3ACAACCGC(H)3; (H)3ACGACCGC(H)3;
H)3ACGACCAC(H)3;
D)4TGTGTA(D)4; (D)4TGCGTA(D)4; (H)4TACACA(H)4; (H)4TACGCA(H)4; (D)4GTGTGT(D)4; (H)4ACACAC(H)4; (D)4GCGCGT(D)4; (H)4ACGCGC(H)4;
D)4TGTATG(D)4; (D)4CGTATG(D)4; (D)4TGTACG(D)4; (D)4CGTACG(D)4;
H)4CATACA(H)4; (H)4CATACG(H)4; (H)4CGTACA(H)4; (H)4CGTACG(H)4;
D)4AATGTT(D)4; (H)4AACATT(H)4; (D)4AACGTT(D)4; (H)4AACGTT(H)4;
D)4TGATTG(D)4; (D)4TGATCG(D)4; (D)4CGATTG(D)4; (D)4CGATCG(D)4; (H)4CAATCA(H)4; (H)4CGATCA(H)4; (H)4CAATCG(H)4; (H)4CGATCG(H)4;
D)4GTTGAT(D)4; (D)4GTCGAT(D)4; (H)4ATCAAC(H)4; (H)4ATCGAC(H)4;
D)3TGGTATTG(D)3; (D)3CGGTATCG(D)3; (D)3TGGTATCG(D)3;
D)3CGGTATTG(D)3;
H)3CAATACCA(H)3; (H)3CGATACCG(H)3; (H)3CGATACCA(H)3; (H)3CAATACCG(H)3;
D)4TGTTTT(D)4; (D)4CGTTTT(D)4; (H)4AAAACA(H)4; (H)4AAAACG(H)4;
D)3GTGTATG(D)4; (D)4GTGTATG(D)3; (D)3GTGTACG(D)4;
D)4GTGTACG(D)3;
(H)3CATACAC(H)4; (H)4CATACAC(H)3; (H)3CGTACAC(H)4;
(H)4CGTACAC(H)3;
(D)4GATTG(D)5; (D)5GATTG(D)4; (D)4GATCG(D)5; (D)5GATCG(D)4;
(H)4CAATC(H)5; (H)5CAATC(H)4; (H)4CTAGC(H)5; (H)5CTAGC(H)4; (D)3TGTATATG(D)3; (D)3TGTATACG(D)3; (D)3CGTATATG(D)3;
(D)3CGTATACG(D)3;
(H)3CATATACA(H)3; (H)3CGTATACA(H)3; (H)3CATATACG(H)3;
(H)3CGTATACG(H)3;
(D)3TGAGTTTG(D)3; (D)3TGAGTTCG(D)3; (D)3CGAGTTTG(D)3; (D)3CGAGTTCG(D)3;
(H)3CAAACTCA(H)3; (H)3CGAACTCA(H)3; (H)3CAAACTCG(H)3;
(H)3CGAACTCG(H)3;
(D)3TGTTAATG(D)3; (D)3CGTTAATG(D)3; (D)3TGTTAACG(D)3;
(D)3CGTTAACG(D)3; (H)3CATTAACA(H)3; (H)3CATTAACG(H)3; (H)3CGTTAACA(H)3;
(H)3CGTTAACG(H)3;
(D)4TGTATG(D)4; (D)4TGTACG(D)4; (D)4CGTATG(D)4; (D)4CGTACG(D)4;
(H)4CATACA(H)4; (H)4CGTACA(H)4; (H)4CATACG(H)4; (H)4CGTACG(H)4;
(D)3GGTCGGTT(D)3; (D)3GGTTGGTT(D)3; (H)3AACCGACC(H)3; (H)3AACCAACC(H)3;
(D)4GACGT(D)5; (D)5GACGT(D)4; (D)4GATGT(D)5; (D)5GATGT(D)4;
(H)4ACGTC(H)5; (H)5ACGTC(H)4; (H)4ACATC(H)5; (H)5ACATC(H)4;
(D)4GGCGTT(D)4; (D)4GGTGTT(D)4; (H)4AACGCC(H)4; (H)4AACACC(H)4;
(D)4GTCGGT(D)4; (D)4GTTGGT(D)4; (H)4ACCGAC(H)4; (H)4ACCAAC(H)4; (D)4TGCGG(D)4; (D)4TTGTGG(D)4; (H)4CCGCGA(H)4; (H)4CCACAA(H)4;
(D)4TTCGGG(D)4; (D)4TTTGGG(D)4; (H)4CCCGAA(H)4; (H)4CCCAAA(H)4;
(D)4TTCGAG(D)4; (D)4TTTGAG(D)4; (H)4CTCGAA(H)4; (H)4CTCAAA(H)4;
(D)4CGGTCG(D)4; (D)4TGGTTG(D)4; (D)4CGGTTG(D)4; (D)4TGGTCG(D)4;
(H)4CGACCG(H)4; (H)4CAACCA(H)4; (H)4CAACCG(H)4; (H)4CGACCA(H)4.
worin
H eine der Basen Adenin (A), Cytosin (C) oder Thymin (T)
D eine der Basen Adenin (A), Guanin (G) oder Thymin (T)
W eine der Basen Adenin (A) oder Thymin (T)
S eine der Basen Cytosin (C) oder Guanin (G) ist.
Nach dem dritten Verfahrensschritt werden ferner die in den amplifizierten Fragmenten enthaltenen CpG Dinukleotide vollständig oder teilweise durch Hybridisierung der bereits in der Amplifikation mit einer nachweisbaren Markierung versehenen Fragmente an einen Satz von PNA-Oligomeren untersucht, der mindestens zwei der folgenden Sequenzen umfasst:
(D)2GATGTT(D)2; (D)2GACGTT(D)2; (H)2AACATC(H)2; (H)2AACGTC(H)2;
(D)2TTGTGA(D)2; (D)2TTGCGA(D)2; (H)2TCACAA(H)2; (H)2TCGCAA(H)2;
(D)2TTTGAA(D)2; (H)2TTCAAA(H)2; (D)2TTCGAA(D)2; (H)2TTCGAA(H)2;
(D)2ATTGAT(D)2; (H)2ATCAAT(H)2; (D)2ATCGAT(D)2; (H)2ATCGAT(H)2;
(D)1TGGWTTG(D)2; (D)2TGGWTTG(D)1 ; (D)1CGGWTTG(D)2;
(D)2CGGWTTG(D)1 ;
(D)1TGGWTCG(D)2; (D)2TGGWTCG(D)1 ; (D)1CGGWTCG(D)2;
(D)2CGGWTCG(D)1 ;
(H)1CAASCCA(H)2; (H)2CAASCCA(H)1 ; (H)1CAASCCG(H)2;
(H)2CAASCCG(H)1;
(H)1CGASCCA(H)2; (H)2CGASCCA(H)1; (H)1CGASCCG(H)2;
(H)2CGASCCG(H)1 ;
(D)2AGTGTT(D)2; (D)2AGCGTT(D)2; (H)2AACACT(H)2; (H)2AACGCT(H)2;
(D)2TATGTG(D)2; (D)2TACGTG(D)2; (H)2CACATA(H)2; (H)2CACGTA(H)2;
(D)2TATGTA(D)2; (H)2TACATA(H)2; (D)2TACGTA(D)2; (H)2TACGTA(H)2;
(D)2TTTGGA(D)2; (D)2TTCGGA(D)2; (H)2TCCAAA(H)2; (H)2TCCGAA(H)2;
(D)2ATGTGT(D)2; (H)2ACACAT(H)2; (D)2ATGTGT(D)2; (H)2ACGCGT(H)2;
(D^GTGGTTGTfD)., ; (D)1GCGGTTGT(D)1 ; (D)1GCGGTCGT(D)1;
(D)1GTGGTCGT(D)1;
(HJ^CAACCAC^)^ (H^ACAACCGCO-I)., ; (H^ACGACCGCOH)., ;
(H)1ACGACCAC(H)1 ;
(D)2TGTGTA(D)2; (D)2TGCGTA(D)2; (H)2TACACA(H)2; (H)2TACGCA(H)2;
(D)2GTGTGT(D)2; (H)2ACACAC(H)2; (D)2GCGCGT(D)2; (H)2ACGCGC(H)2;
(D)2TGTATG(D)2; (D)2CGTATG(D)2; (D)2TGTACG(D)2; (D)2CGTACG(D)2;
)2CATACA(H)2; (H)2CATACG(H)2; (H)2CGTACA(H)2; (H)2CGTACG(H)2;
)2AATGTT(D)2; (H)2AACATT(H)2; (D)2AACGTT(D)2; (H)2AACGTT(H)2;
)2TGATTG(D)2; (D)2TGATCG(D)2; (D)2CGATTG(D)2; (D)2CGATCG(D)2;
)2CAATCA(H)2; (H)2CGATCA(H)2; (H)2CAATCG(H)2; (H)2CGATCG(H)2;
)2GTTGAT(D)2; (D)2GTCGAT(D)2; (H)2ATCAAC(H)2; (H)2ATCGAC(H)2;
)1TGGTATTG(D)1; (D)1CGGTATCG(D)1; (D)1TGGTATCG(D)1;
)1CGGTATTG(D)1;
)1CAATACCA(H)1; (H)1CGATACCG(H)1; (H)1CGATACCA(H)1;
)1CAATACCG(H)1;
)2TGTTTT(D)2; (D)2CGTTTT(D)2; (H)2AAAACA(H)2; (H)2AAAACG(H)2;
)1GTGTATG(D)2; (D)2GTGTATG(D)1; (D)1GTGTACG(D)2;
)2GTGTACG(D)1;
)3CATACAC(H)2; (H)2CATACAC(H)1; (H)1CGTACAC(H)2;
)2CGTACAC(H)1;
)2GATTG(D)3; (D)3GATTG(D)2; (D)2GATCG(D)3; (D)3GATCG(D)2;
)2CAATC(H)3; (H)3CAATC(H)2; (H)2CTAGC(H)3; (H)3CTAGC(H)2;
)1TGTATATG(D)1 ; (D)1TGTATACG(D)1 ; (D)1CGTATATG(D)1 ;
)1CGTATACG(D)1;
)1 CATATACA(H)1 ; (H)1 CGTATACA(H)1 ; (H)1 CATATACG(H)1 ;
)1CGTATACG(H)1 ;
)1TGAGTTTG(D)1 ; (D)1TGAGTTCG(D)1 ; (D)1CGAGTTTG(D)1 ;
)1CGAGTTCG(D)1;
)1CAAACTCA(H)1 ; (H)1CGAACTCA(H)1; (H)1CAAACTCG(H)1;
)1CGAACTCG(H)1;
)1TGTTAATG(D)1 ; (D)1CGTTAATG(D)1 ; (D)1TGTTAACG(D)1 ;
)1CGTTAACG(D)1;
)1CATTAACA(H)1 ; (H)1CATTAACG(H)1 ; (H)1CGTTAACA(H)1 ;
)1CGTTAACG(H)1;
)2TGTATG(D)2; (D)2TGTACG(D)2; (D)2CGTATG(D)2; (D)2CGTACG(D)2;
)2CATACA(H)2; (H)2CGTACA(H)2; (H)2CATACG(H)2; (H)2CGTACG(H)2;
^GGTCGGT^D)., ; (D)1GGTTGGTT(D)1 ; (H^AACCGACCOH).. ;
^AACCAACC H)., ;
)2GACGT(D)3; (D)3GACGT(D)2; (D)2GATGT(D)3; (D)3GATGT(D)2;
)2ACGTC(H)3; (H)3ACGTC(H)2; (H)2ACATC(H)3; (H)3ACATC(H)2;
(D)2GGCGTT(D)2; (D)2GGTGTT(D)2; (H)2AACGCC(H)2; (H)2AACACC(H)2; (D)2GTCGGT(D)2; (D)2GTTGGT(D)2; (H)2ACCGAC(H)2; (H)2ACCAAC(H)2; (D)2TGCGG(D)2; (D)2TTGTGG(D)2; (H)2CCGCGA(H)2; (H)2CCACAA(H)2; (D)2TTCGGG(D)2; (D)2TTTGGG(D)2; (H)2CCCGAA(H)2; (H)2CCCAAA(H)2; (D)2TTCGAG(D)2; (D)2TTTGAG(D)2; (H)2CTCGAA(H)2; (H)2CTCAAA(H)2;
(D)2CGGTCG(D)2; (D)2TGGTTG(D)2; (D)2CGGTTG(D)2; (D)2TGGTCG(D)2; (H)2CGACCG(H)2; (H)2CAACCA(H)2; (H)2CAACCG(H)2; (H)2CGACCA(H)2-
worin H eine der Basen Adenin (A), Cytosin (C) oder Thymin (T)
D eine der Basen Adenin (A), Guanin (G) oder Thymin (T)
W eine der Basen Adenin (A) oder Thymin (T)
S eine der Basen Cytosin (C) oder Guanin (G) ist.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens werden die besagten Fragmente an einem Oligonukleotid-Array (DNA Chip) untersucht. Die Trägermaterialen werden vorzugsweise aus einer Gruppe ausgewählt, die aus folgenden Komponenten besteht: Beads, Kapillaren, ebene Trägermaterialen, Membranen, Wafers, Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens werden die Markierungen aus einer Gruppe ausgewählt, bestehend aus Fluoreszenzmarkierungen, Radionukliden und ablösbaren Massenmarkierungen.
In einer weiteren bevorzugten Variante des Verfahrens werden die amplifizierten Fragmente auf einer Oberfläche immobilisiert und anschließend eine Hybridisierung mit einer kombinatorischen Bibiliothek von unterscheidbaren Oligonukleotid- oder PNA-Oligomer-Sonden durchgeführt. Sonden können beliebige Nukleinsäurese- quenzen sein. Diese Sonden oder die oben erwähnten, ablösbaren Massenmarkierungen werden vorzugsweise mittels Matrix-assistierter Laser- Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (Maldi-MS) anhand ihrer eindeutigen Masse nachgewiesen. Die besagten Sonden oder Massenmarkierungen tragen bevorzugt jeweils eine einzelne positive oder negative Nettoladung.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Kit, der mindestens zwei Primerpaare, Reagenzien und Hilfsstoffe für die Amplifikation und/oder Reagenzien und Hilfsmittel für die chemische Behandlung und/oder eine kombinatorische Sondenbibliothek und/oder einen Oligonukleotid-Array (DNA-Chip) enthält, soweit er für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlich oder dienlich ist.
Verzeichnis der Abkürzungen
H eine der Basen Adenin (A), Cytosin (C) oder Thymin (T)
D eine der Basen Adenin (A), Guanin (G) oder Thymin (T)
W eine der Basen Adenin (A) oder Thymin (T)
S eine der Basen Cytosin (C) oder Guanin (G)
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung:
Beispiel 1 : Durchführung der Methylierungsanalyse des Gens P-cadherin
Das folgende Beispiel bezieht sich auf ein Fragment des Gens P-cadherin, in dem eine bestimmte CG-Position auf Methylierung zu untersuchen ist.
Im ersten Schritt wird eine genomische Sequenz unter Verwendung von Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) derart behandelt, dass alle nicht an der 5-Position der Base methylierten Cytosine so verändert werden, dass eine hinsichtlich dem Basenpaa- rungsverhalten unterschiedliche Base entsteht, während die in 5-Position methylierten Cytosine unverändert bleiben. Wird für die Reaktion Bisulfit verwendet, so findet an den nicht methylierten Cytosinbasen eine Addition statt. Zudem müssen ein denaturierendes Reagenz oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zugegen sein. Eine anschließende alkalische Hydrolyse führt dann zur Umwandlung von nicht me- thylierten Cytosin-Nukleobasen in Uracil. Diese umgewandelte DNA dient dazu, methylierte Cytosine nachzuweisen. Im zweiten Verfahrensschritt verdünnt man die behandelte DNA-Probe mit Wasser oder einer wässrigen Lösung. Es wird an- schliessend eine Desulfonierung der DNA (10-30 min, 90-100 °C) bei alkalischem pH-Wert durchgeführt. Im dritten Schritt des Verfahrens amplifiziert man die DNA-
Probe in einer Polymerasekettenreaktion mit einer hitzebeständigen DNA- Polymerase. Im vorliegenden Fall werden Cytosine des Gens P-cadherin untersucht. Dazu wird mit den spezifischen Primeroligonukleotiden GTTTAGAAGTTTAAGATTAG und CAAAAACTCAACCTCTATCT ein definiertes Fragment der Länge 609 bp amplifiziert. Dieses Amplifikat dient als Probe, die an ein vorher an einer Festphase gebundenes Oligonukleotid unter Ausbildung einer Duplexstruktur hybridisiert, beispielsweise I I I 1 lAGTCGA l I I lAGA für den methylierten und M M lAGTTGA i I I lAGA für den nicht-methylierten Zustand, wobei sich das nachzuweisende Cytosin an Position 186 des Amplifikats befindet. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts beruht auf Cy3 und Cy5 fluoreszenzmarkierten Primeroligonukleotiden, die für die Amplifikation verwendet wurden (Figur 1). Nur wenn in der Bisulfit behandelten DNA an dieser Stelle ein methyiiertes Cytosin vorgelegen hat, kommt es zu einer Hybridisierungsreaktion der amplifizierten DNA mit dem Oligonukleotid. Somit entscheidet der Methylierungsstatus des jeweiligen zu untersuchenden Cytosins über das Hybridisierungsprodukt.
Beispiel 2: Durchführung der Methylierungsanalyse des Gens DBCCR1
Das folgende Beispiel bezieht sich auf ein Fragment des Gens DBCCR1, in dem eine bestimmte CG-Position auf Methylierung zu untersuchen ist.
Im ersten Schritt wird eine genomische Sequenz unter Verwendung von Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) derart behandelt, dass alle nicht an der 5-Position der Base methylierten Cytosine so verändert werden, dass eine hinsichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschiedliche Base entsteht, während die in 5-Position methylier- ten Cytosine unverändert bleiben. Wird für die Reaktion Bisulfit verwendet, so findet an den nicht methylierten Cytosinbasen eine Addition statt. Zudem müssen ein denaturierendes Reagenz oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zugegen sein. Eine anschließende alkalische Hydrolyse führt dann zur Umwandlung von nicht methylierten Cytosin-Nukleobasen in Uracil. Diese umgewandelte DNA dient dazu, methylierte Cytosine nachzuweisen. Im zweiten Verfahrensschritt verdünnt man die behandelte DNA-Probe mit Wasser oder einer wässrigen Lösung. Es wird an- schliessend eine Desulfonierung der DNA (10-30 min, 90-100 °C) bei alkalischem pH-Wert durchgeführt. Im dritten Schritt des Verfahrens amplifiziert man die DNA- Probe in einer Polymerasekettenreaktion mit einer hitzebeständigen DNA-
Polymerase. Im vorliegenden Fall werden Cytosine des Gens DBCCR1 untersucht. Dazu wird mit den spezifischen Primeroligonukleotiden
ATTTGGAGTTGAAGTATTTG und AACTATACCCAAACACCTAC ein definiertes Fragment der Länge 531 bp amplifiziert. Dieses Amplifikat dient als Probe, die an ein vorher an einer Festphase gebundenes Oligonukleotid unter Ausbildung einer
Duplexstruktur hybridisiert, hier TGTTTATGCGTATTTGTT für den methylierten und TGTTTATGTGTATTTGTT für den nicht-methylierten Zustand, wobei sich das nachzuweisende Cytosin an Position 444 des Amplifikats befindet. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts beruht auf Cy3 und Cy5 fluoreszenzmarkierten Prime- roligonukleotiden, die für die Amplifikation verwendet wurden (Figur 1). Nur wenn in der Bisulfit behandelten DNA an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt es zu einer Hybridisierungsreaktion der amplifizierten DNA mit dem Oligonukleotid. Somit entscheidet der Methylierungsstatus des jeweiligen zu untersuchenden Cytosins über das Hybridisierungsprodukt.
Beispiel 3: Durchführung der Methylierungsanalyse des Gens Faktor VIII
Das folgende Beispiel bezieht sich auf ein Fragment des Gens Faktor VIII, in dem eine bestimmte CG-Position auf Methylierung zu untersuchen ist.
Im ersten Schritt wird eine genomische Sequenz unter Verwendung von Bisulfit
(Hydrogensulfit, Disulfit) derart behandelt, dass alle nicht an der 5-Position der Base methylierten Cytosine so verändert werden, dass eine hinsichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschiedliche Base entsteht, während die in 5-Position methylierten Cytosine unverändert bleiben. Wird für die Reaktion Bisulfit verwendet, so findet an den nicht methylierten Cytosinbasen eine Addition statt. Zudem müssen ein denaturierendes Reagenz oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zugegen sein. Eine anschließende alkalische Hydrolyse führt dann zur Umwandlung von nicht methylierten Cytosin-Nukleobasen in Uracil. Diese umgewandelte DNA dient dazu, methylierte Cytosine nachzuweisen. Im zweiten Verfahrensschritt verdünnt man die behandelte DNA-Probe mit Wasser oder einer wässrigen Lösung. Es wird an- schliessend eine Desulfonierung der DNA (10-30 min, 90-100 °C) bei alkalischem pH-Wert durchgeführt. Im dritten Schritt des Verfahrens amplifiziert man die DNA- Probe in einer Polymerasekettenreaktion mit einer hitzebeständigen DNA- Polymerase. Im vorliegenden Fall werden Cytosine des Gens Faktor VIII unter-
sucht. Dazu wird mit den spezifischen Primeroligonukleotiden AGGGAG I I I I I I I TAGGGAATAGAGGGA und
TAATCCCAAAACCTCTCCACTACAACAA ein definiertes DNA-Fragment der Länge 561 bp amplifiziert. Dieses DNA-Amplifikat dient als Probe, die an ein vorher an einer Festphase gebundenes PNA-Oligonukleotid unter Ausbildung einer
Duplexstruktur hybridisiert, beispielsweise CAAACGTTCAA für den methylierten bzw. CAAACATTCAA für den nicht-methylierten Zustand, wobei sich das nachzuweisende Cytosin an Position 241 des Amplifikats befindet. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts beruht auf Cy3 und Cy5 fluoreszenzmarkierten Primeroli- gonukleotiden, die für die Amplifikation verwendet wurden (Fig. 2A, 2B). Nur wenn in der Bisulfit behandelten DNA an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt es zu einer Hybridisierungsreaktion der amplifizierten DNA mit dem Oligonukleotid. Somit entscheidet der Methylierungsstatus des jeweiligen zu untersuchenden Cytosins über das Hybridisierungsprodukt.
Die Figuren zeigen:
Figur 1 : Hier ist ein Hoch-Dichte DNA Chip nach Hybridisierung dargestellt. Dargestellt ist das Falschfarben-Bild wie es nach dem Scannen erzeugt wird. Entgegen der hier dargestellten schwarz-weiß Abbildung wird von dem Scanner ein farbiges
Bild erzeugt. Die Intensität der verschiedenen Farben repräsentiert den Grad der Hybridisierung, wobei der Hybridisierungsgrad von rot (in Figur 1 als helle Spots zu erkennen) nach blau (in Figur 1 als dunkle Spots zu erkennen) abnimmt. Die Oligo- nukeotide sind derart gespottet, daß sich jeweils links die den nicht-methylierten Zustand nachweisenden Oligonukeotide (hier oben links jeweils
M M l AGTTGATTT und TGTTTATGTGTATTTGTT) und rechts daneben die den methylierten Zustand nachweisenden Oligonukeotide (ebenfalls jeweils oben links TTTTTAGTCGATTT bzw. TGTTTATGCGTATTTGTT) befinden. Es ist zu erkennen, dass durch die Oligonukeotide I I I I lAGTTGATTT und TGTTTATGTGTATTTGTT jeweils ein nicht-methylierter Zustand nachgewiesen werden kann.
Figur 2: Hier ist ein PNA Chip nach Hybridisierung dargestellt. Dargestellt ist das Falschfarben-Bild wie es nach dem Scannen erzeugt wird. Entgegen der hier dar-
gestellten schwarz-weiß Abbildung wird von dem Scanner ein farbiges Bild erzeugt. Die Intensität der verschiedenen Farben repräsentiert den Grad der Hybridisierung, wobei der Hybridisierungsgrad von rot (in Figur 2 als helle Spots zu erkennen) nach blau (in Figur 2A und B als dunkle Spots zu erkennen) abnimmt. Figur 2A repräsen- tiert das Bild wie es nach dem Scannen mit der Wellenlänge 532 nm auftritt, die spezifisch für den Fluoreszenzfarbstoff Cy3 ist. In der oberen linken Ecke befindet sich ein 4-fach gespottetes PNA-Oligomer (CAAACGTTCAA) welches einen methylierten Zustand nachweisen kann. Nach Hybridisierung mit einer Sonde, welche spezifisch diesen Zustand repräsentiert, sind nur an solchen spezifischen Positio- nen positive Signale zu erkennen (exemplarisch durch einen weißen quadratischen
Rahmen gekennzeichnet). In Figur 2B dagegen wird ein Bild gezeigt, wie es nach dem Scannen mit den Wellenlänge 635 nm auftritt, die spezifisch für den Fluoreszenzfarbstoff Cy5 ist. Hier sind an den Positionen, an denen mit PNA-Oligomere ein nicht methyiierter Zustand nachgewiesen werden kann (CAAACATTCAA), nach Hybridisierung mit einer diesen Methylierungszustand repräsentierenden Sonde, positive Signale zu erkennen (wiederum durch einen weißen quadratischen Rahmen für einen 4er-Block gekennzeichnet).
SEQUENZPROTOKOLL
<110> Epigenomics AG <120> Oligonukleotide oder PNA-Oligomere und Verfahren zur parallelen Detektion des Methylierungszustandes genomischer DNA
<130> E01-1186-WO
<140> <141>
<160> 396
<170> Patentin Ver. 2.1
<210> 1 <211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 1 ddddgatgtt dddd 14 <210> 2 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 2 ddddgacgtt dddd 14
<210> 3 <211> 14 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 3 hhhhaacatc hhhh 14
<210> 4 <211> 14 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400 > 4 hhhhaacgtc hhhh 14
<210> 5 <211> 14
<212> DNA
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<400> 5 ddddttgtga dddd 14
<210> 6 <211> 14 <212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 6 ddddttgcga dddd 14
<210> 7 <211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
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<400> 7 hhhhtcacaa hhhh 14 <210> 8 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 8 hhhhtcgcaa hhhh 14
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 9 ddddtttgaa dddd 14
<210> 10
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<400> 10 hhhhttcaaa hhhh 14
<210> 11 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
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<400> 11 ddddttcgaa dddd 14
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<213> Künstliche Sequenz
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 12 hhhhttcgaa hhhh 14
<210> 13 <211> 14 <212> DNA
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<400> 13 ddddattgat dddd 14 <210> 14 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 14 hhhhatcaat hhhh 14
<210> 15
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<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz <220>
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<400> 15 ddddatcgat dddd 14
<210> 16
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<400> 16 hhhhatcgat hhhh 14
<210> 17 <211> 14 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 17 dddtgg ttg dddd 14
<210> 18
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<212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 18 ddddtggwtt gddd 14
<210> 19 <211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
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<400> 19 dddcggwttg dddd 14 <210> 20 <211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
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<400> 20 ddddcgg tt gddd 14
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<213> Künstliche Sequenz
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<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz :01ιgonukleotιd <400> 21 dddtggwtcg dddd 14
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<213> Künstliche Sequenz
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 22 ddddtggwtc gddd 14 <210> 23 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 23 dddcggwtcg dddd 14
<210> 24
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<212> DNA <213> Künstliche Sequenz
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 24 ddddcggwtc gddd 14
<210> 25 <211> 14 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 25 hhhcaascca hhhh 14
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<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 26 hhhhcaascc ahhh 14
<210> 27
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<213> Künstliche Sequenz
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 27 hhhcaasccg hhhh 14
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<213> Künstliche Sequenz
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 28 hhhhcaascc ghhh 14 <210> 29 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 29 hhhcgascca hhhh 14
<210> 30 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 30 hhhhcgascc ahhh 14
<210> 31
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<212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 31 hhhcgasccg hhhh 14
<210> 32 <211> 14 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 32 hhhhcgascc ghhh 14
<210> 33
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<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
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<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 33 ddddagtgtt dddd 14
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<213> Kunstliche Sequenz
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 34 ddddagcgtt dddd 14 <210> 35 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 35 hhhhaacact hhhh 14 <210> 36 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 37 ddddtatgtg dddd 14
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<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
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<213> Künstliche Sequenz
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 39 hhhhcacata hhhh 14
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz :01ιgonukleotιd
<400> 40
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<210> 41 <211> 14 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz :01ιgonukleotιd
<400> 41 ddddtatgta dddd 14
<210> 42
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 42 hhhhtacata hhhh 14
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 43 ddddtacgta dddd 14 <210> 44 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
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<400> 44 hhhhtacgta hhhh 14
<210> 45 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 45 ddddtttgga dddd 14
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<213> Künstliche Sequenz
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<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 46 ddddttcgga dddd 14
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<213> Kunstliche Sequenz
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 48 hhhhtccgaa hhhh 14
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<213> Künstliche Sequenz
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:01ιgonukleotιd
<400> 49 ddddatgtgt dddd 14 <210> 50 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 50 hhhhacacat hhhh 14
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<213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 51 ddddatgtgt dddd 14
<210> 52 <211> 14 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
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<210> 53 <211> 14 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 53 dddgtggttg tddd 14
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<213> Künstliche Sequenz
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 54 dddgcggttg tddd 14
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<400> 55 dddgcggtcg tddd 14 <210> 56 <211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 56 dddgtggtcg tddd 14 <210> 57 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
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<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 58 hhhacaaccg chhh 14
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<400> 59 hhhacgaccg chhh 14
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<213> Künstliche Sequenz
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 60 hhhacgacca chhh
<210> 61 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
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<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
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<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 62 ddddtgcgta dddd 14
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<212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 63 hhhhtacaca hhhh 14
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<213> Künstliche Sequenz
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 64 hhhhtacgca hhhh 14 <210> 65 <211> 14 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
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<210> 66 <211> 14 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz :01ιgonukleotιd
<400> 66 hhhhacacac hhhh 14
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<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 69 ddddtgtatg dddd 14
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<213> Kunstliche Sequenz
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 70 ddddcgtatg dddd 14 <210> 71 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 71 ddddtgtacg dddd 14 <210> 72 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 72 ddddcgtacg dddd 14
<210> 73 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 73 hhhhcataca hhhh 14
<210> 74 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 74 hhhhcatacg hhhh 14
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<212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 75 hhhhcgtaca hhhh 14
<210> 76 <211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 76
hhhhcgtacg hhhh 14
<210> 77 <211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 77 ddddaatgtt dddd 14 <210> 78 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 78 hhhhaacatt hhhh 14
<210> 79 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 79 ddddaacgtt dddd 14
<210> 80 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 80 hhhhaacgtt hhhh 14
<210> 81
<211> 14
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 81 ddddtgattg dddd 14
<210> 82
<211 > 14
<212 > DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 82 ddddtgatcg dddd 14
<210> 83 <211> 14 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 83 ddddcgattg dddd 14
<210> 84
<211> 14
<212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 84 ddddcgatcg dddd 14
<210> 85 <211> 14 <212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz :01igonukleotid
<400> 85 hhhhcaatca hhhh 14 <210> 86 <211> 14 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 86 hhhhcgatca hhhh 14
<210> 87
<211 > 14
<212 > DNA
<213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 87 hhhhcaatcg hhhh 14
<210> 88
<211> 14
<212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 88 hhhhcgatcg hhhh 14
<210> 89 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 89 ddddgttgat dddd 14
<210> 90
<211> 14
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 90 ddddgtcgat dddd 14
<210> 91 <211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 91 hhhhatcaac hhhh 14 <210> 92 <211> 14 <212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 92 hhhhatcgac hhhh 14 <210> 93
<211> 14
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 93 dddtggtatt gddd 14
<210> 94
<211> 14
<212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 94 dddcggtatc gddd 14
<210> 95 <211> 14 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 95 dddtggtatc gddd 14
<210> 96
<211> 14
<212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 96 dddcggtatt gddd 14
<210> 97 <211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 97 hhhcaatacc ahhh 14
<210> 98 <211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 98 hhhcgatacc ghhh 14 <210> 99 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 99 hhhcgatacc ahhh 14
<210> 100 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 100 hhhcaatacc ghhh 14
<210> 101 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 101 ddddtgtttt dddd 14
<210> 102 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 102 ddddcgtttt dddd 14
<210> 103 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 103 hhhhaaaaca hhhh 14
<210> 104 <211> 14 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 104 hhhhaaaacg hhhh 14
<210> 105
<211> 14
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 105 dddgtgtatg dddd 14
<210> 106 <211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz :01ιgonukleotιd
<400> 106 ddddgtgtat gddd 14 <210> 107 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 107 dddgtgtacg dddd 14 <210> 108 <211> 14 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 108 ddddgtgtac gddd 14
<210> 109 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 109 hhhcatacac hhhh 14
<210> 110 <211> 14 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 110 hhhhcataca chhh 14
<210> 111
<211> 14
<212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 111 hhhcgtacac hhhh 14
<210> 112 <211> 14 <212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz :01ιgonukleotid
<400> 112
hhhhcgtaca chhh 14
<210> 113 <211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 113 ddddgattgd dddd 14 <210> 114 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 114 dddddgattg dddd 14
<210> 115 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 115 ddddgatcgd dddd 14
<210> 116 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 116 dddddgatcg dddd 14
<210> 117
<211> 14
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 117 hhhhcaatch hhhh 14
<210> 118 <211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 118 hhhhhcaatc hhhh 14
<210> 119 <211> 14 <212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 119 hhhhctagch hhhh 14 <210> 120 <211> 14 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 120 hhhhhctagc hhhh 14
<210> 121 <211> 14 <212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 121 dddtgtatat gddd 14 <210> 122
<211> 14
<212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 122 dddtgtatac gddd 14
<210> 123
<211> 14
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 123 dddcgtatat gddd 14
<210> 124 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 124 dddcgtatac gddd 14
<210> 125 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 125 hhhcatatac ahhh 14
<210> 126
<211> 14
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 126 hhhcgtatac ahhh 14
<210> 127
<211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 127 hhhcatatac ghhh 14 <210> 128 <211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 128 hhhcgtatac ghhh 14 <210> 129 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz :Oligonukleotid
<400> 129 dddtgagttt gddd 14
<210> 130 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 130 dddtgagttc gddd 14
<210> 131 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 131 dddcgagttt gddd 14
<210> 132
<211> 14
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz :01ιgonukleotιd <400> 132 dddcgagttc gddd
<210> 133 <211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 133 hhhcaaactc ahhh 14
<210> 134 <211> 14 <212> DNA
<213> K nstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 134 hhhcgaactc ahhh 14 <210> 135 <211> 14 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 135 hhhcaaactc ghhh 14
<210> 136 <211> 14 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 136 hhhcgaactc ghhh 14
<210> 137 <211> 14 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 137 dddtgttaat gddd 14
<210> 138
<211> 14
<212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen
Sequenz : Oligonukleotid
<400> 138 dddcgttaat gddd 14
<210> 139
<211> 14
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 139 dddtgttaac gddd 14
<210> 140 <211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz :01ιgonukleotιd
<400> 140 dddcgttaac gddd 14
<210> 141
<211> 14
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 141 hhhcattaac ahhh 14
<210> 142 <211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 142 hhhcattaac ghhh 14 <210> 143 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 143 hhhcgttaac ahhh 14 <210> 144 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 144 hhhcgttaac ghhh 14
<210> 145 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 145 ddddtgtatg dddd 14
<210> 146 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 146 ddddtgtacg dddd 14
<210> 147
<211> 14
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 147 ddddcgtatg dddd 14
<210> 148 <211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 148
ddddcgtacg dddd 14
<210> 149 <211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 149 hhhhcataca hhhh 14 <210> 150 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 150 hhhhcgtaca hhhh 14
<210> 151 <211> 14 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 151 hhhhcatacg hhhh 14
<210> 152 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 152 hhhhcgtacg hhhh 14
<210> 153
<211> 14
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 153 dddggtcggt tddd 14
<210> 154 <211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 154 dddggttggt tddd 14
<210> 155 <211> 14 <212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 155 hhhaaccgac chhh 14 <210> 156 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 156 hhhaaccaac chhh 14
<210> 157 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 157 ddddgacgtd dddd 14
<210> 158 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 158 dddddgacgt dddd 14
<210> 159 <211> 14
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 159 ddddgatgtd dddd 14
<210> 160
<211> 14
<212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 160 dddddgatgt dddd 14
<210> 161 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 161 hhhhacgtch hhhh 14
<210> 162
<211> 14
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 162 hhhhhacgtc hhhh 14
<210> 163 <211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz :01ιgonukleotιd
<400> 163 hhhhacatch hhhh 14 <210> 164
<211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 164 hhhhhacatc hhhh 14 <210> 165 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 165 ddddggcgtt dddd 14
<210> 166 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 166 ddddggtgtt dddd 14
<210> 167 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 167 hhhhaacgcc hhhh 14
<210> 168
<211> 14
<212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 168 hhhhaacacc hhhh 14
<210> 169 <211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 169 ddddgtcggt dddd 14
<210> 170 <211> 14 <212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 170 ddddgttggt dddd 14 <210> 171 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 171 hhhhaccgac hhhh 14
<210> 172 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 172 hhhhaccaac hhhh 14
<210> 173 <211> 13 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 173 ddddtgcggd ddd 13
<210> 174
<211> 14
<212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen
Sequenz : Oligonukleotid
<400> 174 ddddttgtgg dddd 14
<210> 175
<211> 14
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 175 hhhhccgcga hhhh 14
<210> 176 <211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz :01ιgonukleotιd
<400> 176 hhhhccacaa hhhh 14 <210> 177 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 177 ddddttcggg dddd 14
<210> 178
<211> 14
<212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz :01ιgonukleotιd
<400> 178 ddddtttggg dddd 14
<210> 179 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 179 hhhhcccgaa hhhh 14
<210> 180
<211> 14
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 180 hhhhcccaaa hhhh 14
<210> 181 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 181 ddddttcgag dddd 14
<210> 182 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 182 ddddtttgag dddd 14
<210> 183
<211> 14
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 183 hhhhctcgaa hhhh 14
<210> 184 <211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 184
hhhhctcaaa hhhh 14
<210> 185 <211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 185 ddddcggtcg dddd 14 <210> 186 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 186 ddddtggttg dddd 14
<210> 187 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 187 ddddcggttg dddd 14
<210> 188 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 188 ddddtggtcg dddd 14
<210> 189
<211> 14
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 189 hhhhcgaccg hhhh 14
<210> 190 <211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 190 hhhhcaacca hhhh 14
<210> 191 <211> 14 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 191 hhhhcaaccg hhhh 14 <210> 192 <211> 14 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 192 hhhhcgacca hhhh 14
<210> 193 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 193 ddgatgttdd 10
<210> 194 <211> 10 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 194 ddgacgttdd 10
<210> 195 <211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 195 hhaacatchh 10
<210> 196
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 196 hhaacgtchh 10
<210> 197 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 197 ddttgtgadd 10 <210> 198 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 198 ddttgcgadd 10
<210> 199
<211> 10
<212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 199 hhtcacaahh 10
<210> 200 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 200 hhtcgcaahh 10
<210> 201 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 201 ddtttgaadd 10
<210> 202 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 202 hhttcaaahh 10
<210> 203 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 203 ddttcgaadd 10
<210> 204
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 204 hhttcgaahh 10
<210> 205 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 205 ddattgatdd 10
<210> 206 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 206 hhatcaathh 10 <210> 207 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 207 ddatcgatdd 10
<210> 208 <211> 10 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 208 hhatcgathh 10
<210> 209 <211> 10 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 209 dtgg ttgdd 10
<210> 210
<211> 10
<212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen
Sequenz : Oligonukleotid
<400> 210 ddtggwttgd 10
<210> 211
<211> 10
<212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 211 dcggwttgdd 10
<210> 212 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 212 ddcggwttgd 10 <210> 213 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 213 dtgg tcgdd 10
<210> 214
<211> 10
<212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 214 ddtgg tcgd 10
<210> 215 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 215 dcggwtcgdd 10
<210> 216 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 216 ddcgg tcgd 10
<210> 217 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 217 hcaasccahh 10
<210> 218 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 218 hhcaasccah 10 <210> 219 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 219 hcaasccghh 10
<210> 220 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 220 hhcaasccgh 10
<210> 221
<211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 221 hcgasccahh 10 <210> 222 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 222 hhcgasccah 10
<210> 223 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 223 hcgasccghh 10
<210> 224 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 224 hhcgasccgh 10
<210> 225
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 225 ddagtgttdd 10
<210> 226 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 226 ddagcgttdd 10
<210> 227 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 227 hhaacacthh 10 <210> 228 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 228 hhaacgcthh 10
<210> 229 <211> 10 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 229 ddtatgtgdd 10
<210> 230 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 230 ddtacgtgdd 10
<210> 231 <211> 10
<212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 231 hhcacatahh 10
<210> 232
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 232 hhcacgtahh 10
<210> 233 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 233 ddtatgtadd 10 <210> 234
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 234 hhtacatahh 10
<210> 235 <211> 10 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz :01ιgonukleotιd
<400> 235 ddtacgtadd 10
<210> 236 <211> 10 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 236 hhtacgtahh 10
<210> 237 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 237 ddtttggadd 10
<210> 238
<211> 10
<212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 238 ddttcggadd 10
<210> 239 <211> 10 <212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 239 hhtccaaahh 10 <210> 240 <211> 10 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 240 hhtccgaahh 10
<210> 241
<211> 10 <212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 241 ddatgtgtdd 10
<210> 242
<211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 242 hhacacathh 10 <210> 243 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz :Oligonukleotid
<400> 243 ddatgtgtdd 10
<210> 244 <211> 10 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 244 hhacgcgthh 10
<210> 245 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 245 dgtggttgtd 10
<210> 246
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen
Sequenz : Oligonukleotid
<400> 246 dgcggttgtd 10
<210> 247 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 247 dgcggtcgtd 10
<210> 248 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 248 dgtggtcgtd 10 <210> 249
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz :01ιgonukleotιd
<400> 249 hacaaccach 10
<210> 250
<211> 10
<212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 250 hacaaccgch 10
<210> 251 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 251 hacgaccgch 10
<210> 252 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 252 hacgaccach 10
<210> 253
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 253 ddtgtgtadd 10
<210> 254 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 254 ddtgcgtadd 10 <210> 255 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 255 hhtacacahh 10
<210> 256 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 256 hhtacgcahh 10
<210> 257
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 257 ddgtgtgtdd 10
<210> 258 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 258 hhacacachh 10
<210> 259
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 259 ddgcgcgtdd 10
<210> 260 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 260 hhacgcgchh 10
<210> 261
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 261 ddtgtatgdd 10
<210> 262 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 262 ddcgtatgdd 10
<210> 263 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 263 ddtgtacgdd 10 <210> 264 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 264 ddcgtacgdd 10
<210> 265 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 265 hhcatacahh 10
<210> 266 <211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 266 hhcatacghh 10
<210> 267 <211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 267 hhcgtacahh 10
<210> 268
<211> 10
<212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 268 hhcgtacghh 10
<210> 269 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 269 ddaatgttdd 10 <210> 270 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 270 hhaacatthh 10
<210> 271 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 271 ddaacgttdd 10
<210> 272 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 272 hhaacgtthh 10
<210> 273 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz :Oligonukleotid
<400> 273 ddtgattgdd 10
<210> 274
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 274 ddtgatcgdd 10
<210> 275 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 275 ddcgattgdd 10 <210> 276 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 276 ddcgatcgdd 10
<210> 277 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 277 hhcaatcahh 10
<210> 278 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 278 hhcgatcahh 10
<210> 279 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 279 hhcaatcghh 10
<210> 280
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 280 hhcgatcghh 10
<210> 281 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 281 ddgttgatdd 10
<210> 282
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen
Sequenz : Oligonukleotid
<400> 282 ddgtcgatdd 10
<210> 283
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 283 hhatcaachh 10
<210> 284 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 284 hhatcgachh 10 <210> 285 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz :Oligonukleotid
<400> 285 dtggtattgd 10
<210> 286
<211> 10
<212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 286 dcggtatcgd 10
<210> 287 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 287 dtggtatcgd 10
<210> 288 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 288 dcggtattgd 10
<210> 289 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 289 hcaataccah 10
<210> 290 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 290 hcgataccgh 10 <210> 291
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 291 hcgataccah 10
<210> 292 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 292 hcaataccgh 10
<210> 293
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 293 ddtgttttdd 10
<210> 294 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 294 ddcgttttdd 10
<210> 295
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 295 hhaaaacahh 10
<210> 296 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz :01ιgonukleotιd
<400> 296 hhaaaacghh 10 <210> 297 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 297 dgtgtatgdd 10
<210> 298
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 298 ddgtgtatgd 10
<210> 299
<211> 10
<212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 299 dgtgtacgdd 10
<210> 300 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 300 ddgtgtacgd 10
<210> 301 <211> 12 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 301 hhhcatacac hh 12
<210> 302 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 302 hhcatacach 10
<210> 303 <211> 10
<212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 303 hcgtacachh 10
<210> 304 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 304 hhcgtacach 10
<210> 305 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 305 ddgattgddd 10 <210> 306 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 306 dddgattgdd 10
<210> 307
<211> 10
<212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 307 ddgatcgddd 10
<210> 308 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 308 dddgatcgdd 10
<210> 309 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 309 hhcaatchhh 10
<210> 310
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 310 hhhcaatchh 10
<210> 311 <211> 10 <212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 311 hhctagchhh 10 <210> 312
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 312 hhhctagchh 10
<210> 313 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 313 dtgtatatgd 10
<210> 314 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 314 dtgtatacgd 10
<210> 315 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 315 dcgtatatgd 10
<210> 316
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 316 dcgtatacgd 10
<210> 317 <211> 10 <212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 317 hcatatacah 10 <210> 318 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 318 hcgtatacah 10 <210> 319
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 319 hcatatacgh 10
<210> 320 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 320 hcgtatacgh 10
<210> 321
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 321 dtgagtttgd 10
<210> 322 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 322 dtgagttcgd 10
<210> 323 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 323 dcgagtttgd 10
<210> 324
<211> 10
<212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 324 dcgagttcgd 10
<210> 325
<211> 10
<212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 325 hcaaactcah 10
<210> 326 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 326 hcgaactcah 10 <210> 327
<211> 10
<212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 327 hcaaactcgh 10
<210> 328
<211> 10
<212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz :01ιgonukleotιd
<400> 328 hcgaactcgh 10
<210> 329
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 329 dtgttaatgd 10
<210> 330 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 330 dcgttaatgd 10
<210> 331
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 331 dtgttaacgd 10
<210> 332 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 332 dcgttaacgd 10 <210> 333 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 333 hcattaacah 10
<210> 334
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 334 hcattaacgh 10
<210> 335 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 335 hcgttaacah 10
<210> 336 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 336 hcgttaacgh 10
<210> 337
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 337 ddtgtatgdd 10
<210> 338 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 338 ddtgtacgdd 10 <210> 339 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz :01ιgonukleotιd
<400> 339 ddcgtatgdd 10 <210> 340
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 340 ddcgtacgdd 10
<210> 341 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:01ιgonukleotιd
<400> 341 hhcatacahh 10 <210> 342 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 342 hhcgtacahh 10
<210> 343 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz :01ιgonukleotιd
<400> 343 hhcatacghh 10
<210> 344 <211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 344 hhcgtacghh 10
<210> 345 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 345 dggtcggttd 10
<210> 346
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 346 dggttggttd 10
<210> 347 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 347 haaccgacch 10 <210> 348 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 348 haaccaacch 10
<210> 349
<211> 10
<212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 349 ddgacgtddd 10
<210> 350 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 350 dddgacgtdd 10
<210> 351 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 351 ddgatgtddd 10
<210> 352
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 352 dddgatgtdd 10
<210> 353 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 353 hhacgtchhh 10 <210> 354
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 354 hhhacgtchh 10 <210> 355 <211> 10 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 355 hhacatchhh 10
<210> 356 <211> 10 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 356 hhhacatchh 10
<210> 357 <211> 10 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 357 ddggcgttdd 10
<210> 358
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 358 ddggtgttdd 10
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<213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz :01ιgonukleotιd
<400> 359
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<211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 360 hhaacacchh 10
<210> 361
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 361 ddgtcggtdd 10
<210> 362 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 362 ddgttggtdd 10 <210> 363
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 363 hhaccgachh 10
<210> 364 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 364 hhaccaachh 10
<210> 365
<211> 9
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 365 ddtgcggdd
<210> 366 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 366 ddttgtggdd 10
<210> 367
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz :Oligonukleotid <400> 367 hhccgcgahh 10
<210> 368 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 368 hhccacaahh 10 <210> 369 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz :Oligonukleotid
<400> 369 ddttcgggdd 10
<210> 370
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 370 ddtttgggdd 10
<210> 371 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 371 hhcccgaahh 10
<210> 372 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 372 hhcccaaahh 10
<210> 373
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 373 ddttcgagdd 10
<210> 374
<211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz :01ιgonukleotιd
<400> 374 ddtttgagdd 10 <210> 375 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 375 hhctcgaahh 10 <210> 376 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 376 hhctcaaahh 10
<210> 377 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 377 ddcggtcgdd 10
<210> 378 <211> 10 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 378 ddtggttgdd 10
<210> 379
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 379 ddcggttgdd 10
<210> 380 <211> 10 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 380 ddtggtcgdd 10
<210> 381 <211> 10 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 381 hhcgaccghh 10
<210> 382
<211> 10
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 382 hhcaaccahh 10
<210> 383
<211> 10 <212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 383 hhcaaccghh 10 <210> 384 <211> 10 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 384 hhcgaccahh 10
<210> 385 <211> 20 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 385 gtttagaagt ttaagattag 20
<210> 386 <211> 20 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 386 caaaaactca acctctatct 20
<210> 387 <211> 18 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 387 tttttagtcg attttaga 18
<210> 388
<211> 18
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 388 tttttagttg attttaga 18
<210> 389 <211> 20 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 389 atttggagtt gaagtatttg 20 <210> 390
<211> 20
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 390 aactataccc aaacacctac 20 <210> 391 <211> 18 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 391 tgtttatgcg tatttgtt 18
<210> 392 <211> 18 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 392 tgtttatgtg tatttgtt
<210> 393 <211> 28 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid
<400> 393 agggagtttt ttttagggaa tagaggga 28
<210> 394
<211> 28
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid <400> 394 taatcccaaa acctctccac tacaacaa 28
<210> 395 <211> 11 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 395
caaacgttca a 11
<210> 396 <211> 11 <212> DNA
<213> Kunstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der kunstlichen Sequenz: Oligonukleotid
<400> 396 caaacattca a 11
Claims
1. Oligonukleotid oder PNA-Oligomer zur Detektion des Cytosin- Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomischer DNA, umfassend eine der folgenden Basensequenzen:
Oligonukleotide:
D)4GATGTT(D)4; (D)4GACGTT(D)4; (H)4AACATC(H)4; (H)4AACGTC(H)4;
D)4TTGTGA(D)4; (D)4TTGCGA(D)4; (H)4TCACAA(H)4; (H)4TCGCAA(H)4;
D)4TTTGAA(D)4; (H)4TTCAAA(H)4; (D)4TTCGAA(D)4; (H)4TTCGAA(H)4;
D)4ATTGAT(D)4; (H)4ATCAAT(H)4; (D)4ATCGAT(D)4; (H)4ATCGAT(H)4;
D)3TGGWTTG(D)4; (D)4TGGWTTG(D)3; (D)3CGGWTTG(D)4;
D)4CGGWTTG(D)3;
D)3TGGWTCG(D)4; (D)4TGGWTCG(D)3; (D)3CGGWTCG(D)4;
D)4CGGWTCG(D)3;
H)3CAASCCA(H)4; (H)4CAASCCA(H)3; (H)3CAASCCG(H)4;
H)4CAASCCG(H)3;
H)3CGASCCA(H)4; (H)4CGASCCA(H)3; (H)3CGASCCG(H)4;
H)4CGASCCG(H)3;
D)4AGTGTT(D)4; (D)4AGCGTT(D)4; (H)4AACACT(H)4; (H)4AACGCT(H)4;
D)4TATGTG(D)4; (D)4TACGTG(D)4; (H)4CACATA(H)4; (H)4CACGTA(H)4;
D)4TATGTA(D)4; (H)4TACATA(H)4; (D)4TACGTA(D)4; (H)4TACGTA(H)4;
D)4TTTGGA(D)4; (D)4TTCGGA(D)4; (H)4TCCAAA(H)4; (H)4TCCGAA(H)4;
D)4ATGTGT(D)4; (H)4ACACAT(H)4; (D)4ATGTGT(D)4; (H)4ACGCGT(H)4;
D)3GTGGTTGT(D)3; (D)3GCGGTTGT(D)3; (D)3GCGGTCGT(D)3;
D)3GTGGTCGT(D)3;
H)3ACAACCAC(H)3; (H)3ACAACCGC(H)3; (H)3ACGACCGC(H)3;
H)3ACGACCAC(H)3;
D)4TGTGTA(D)4; (D)4TGCGTA(D)4; (H)4TACACA(H)4; (H)4TACGCA(H)4;
D)4GTGTGT(D)4; (H)4ACACAC(H)4; (D)4GCGCGT(D)4; (H)4ACGCGC(H)4;
D)4TGTATG(D)4; (D)4CGTATG(D)4; (D)4TGTACG(D)4; (D)4CGTACG(D)4; (H)4CATACA(H)4; (H)4CATACG(H)4; (H)4CGTACA(H)4; (H)4CGTACG(H)4;
(D)4AATGTT(D)4; (H)4AACATT(H)4; (D)4AACGTT(D)4; (H)4AACGTT(H)4;
(D)4TGATTG(D)4; (D)4TGATCG(D)4; (D)4CGATTG(D)4; (D)4CGATCG(D)4;
(H)4CAATCA(H)4; (H)4CGATCA(H)4; (H)4CAATCG(H)4; (H)4CGATCG(H)4; (D)4GTTGAT(D)4; (D)4GTCGAT(D)4; (H)4ATCAAC(H)4; (H)4ATCGAC(H)4;
(D)3TGGTATTG(D)3; (D)3CGGTATCG(D)3; (D)3TGGTATCG(D)3;
(D)3CGGTATTG(D)3;
(H)3CAATACCA(H)3; (H)3CGATACCG(H)3; (H)3CGATACCA(H)3;
(H)3CAATACCG(H)3; (D)4TGTTTT(D)4; (D)4CGTTTT(D)4; (H)4AAAACA(H)4; (H)4AAAACG(H)4;
(D)3GTGTATG(D)4; (D)4GTGTATG(D)3; (D)3GTGTACG(D)4;
(D)4GTGTACG(D)3;
(H)3CATACAC(H)4; (H)4CATACAC(H)3; (H)3CGTACAC(H)4;
(H)4CGTACAC(H)3; (D)4GATTG(D)5; (D)5GATTG(D)4; (D)4GATCG(D)5; (D)5GATCG(D)4;
(H)4CAATC(H)5; (H)5CAATC(H)4; (H)4CTAGC(H)5; (H)5CTAGC(H)4;
(D)3TGTATATG(D)3; (D)3TGTATACG(D)3; (D)3CGTATATG(D)3;
(D)3CGTATACG(D)3;
(H)3CATATACA(H)3; (H)3CGTATACA(H)3; (H)3CATATACG(H)3; (H)3CGTATACG(H)3;
(D)3TGAGTTTG(D)3; (D)3TGAGTTCG(D)3; (D)3CGAGTTTG(D)3;
(D)3CGAGTTCG(D)3;
(H)3CAAACTCA(H)3; (H)3CGAACTCA(H)3; (H)3CAAACTCG(H)3;
(H)3CGAACTCG(H)3; (D)3TGTTAATG(D)3; (D)3CGTTAATG(D)3; (D)3TGTTAACG(D)3;
(D)3CGTTAACG(D)3;
(H)3CATTAACA(H)3; (H)3CATTAACG(H)3; (H)3CGTTAACA(H)3;
(H)3CGTTAACG(H)3;
(D)4TGTATG(D)4; (D)4TGTACG(D)4; (D)4CGTATG(D)4; (D)4CGTACG(D)4; (H)4CATACA(H)4; (H)4CGTACA(H)4; (H)4CATACG(H)4; (H)4CGTACG(H)4;
(D)3GGTCGGTT(D)3; (D)3GGTTGGTT(D)3; (H)3AACCGACC(H)3;
(H)3AACCAACC(H)3;
(D)4GACGT(D)5; (D)5GACGT(D)4; (D)4GATGT(D)5; (D)5GATGT(D)4;
(H)4ACGTC(H)5; (H)5ACGTC(H)4; (H)4ACATC(H)5; (H)5ACATC(H)4; (D)4GGCGTT(D)4; (D)4GGTGTT(D)4; (H)4AACGCC(H)4; (H)4AACACC(H)4; (D)4GTCGGT(D)4; (D)4GTTGGT(D)4; (H)4ACCGAC(H)4; (H)4ACCAAC(H)4; (D)4TGCGG(D)4; (D)4TTGTGG(D)4; (H)4CCGCGA(H)4; (H)4CCACAA(H)4; (D)4TTCGGG(D)4; (D)4TTTGGG(D)4; (H)4CCCGAA(H)4; (H)4CCCAAA(H)4; (D)4TTCGAG(D)4; (D)4TTTGAG(D)4; (H)4CTCGAA(H)4; (H)4CTCAAA(H)4;
(D)4CGGTCG(D)4; (D)4TGGTTG(D)4; (D)4CGGTTG(D)4; (D)4TGGTCG(D)4; (H)4CGACCG(H)4; (H)4CAACCA(H)4; (H)4CAACCG(H)4; (H)4CGACCA(H)4.
worin H eine der Basen Adenin (A), Cytosin (C) oder Thymin (T)
D eine der Basen Adenin (A), Guanin (G) oder Thymin (T)
W eine der Basen Adenin (A) oder Thymin (T)
S eine der Basen Cytosin (C) oder Guanin (G) ist,
PNA-Oligomere:
(D)2GATGTT(D)2; (D)2GACGTT(D)2; (H)2AACATC(H)2; (H)2AACGTC(H)2; D)2TTGTGA(D)2; (D)2TTGCGA(D)2; (H)2TCACAA(H)2; (H)2TCGCAA(H)2; D)2TTTGAA(D)2; (H)2TTCAAA(H)2; (D)2TTCGAA(D)2; (H)2TTCGAA(H)2; D)2ATTGAT(D)2; (H)2ATCAAT(H)2; (D)2ATCGAT(D)2; (H)2ATCGAT(H)2; D)1TGGWTTG(D)2; (D)2TGGWTTG(D)1 ; (D)1CGGWTTG(D)2; D)2CGGWTTG(D)1 ;
D)1TGGWTCG(D)2; (D)2TGGWTCG(D)1 ; (D)1CGGWTCG(D)2; D)2CGGWTCG(D)1 ;
H)1 CAASCCA(H)2; (H)2CAASCCA(H)1 ; (H)1CAASCCG(H)2; H)2CAASCCG(H)1 ;
H)1CGASCCA(H)2; (H)2CGASCCA(H)1 ; (H)1CGASCCG(H)2; H)2CGASCCG(H)1 ;
D)2AGTGTT(D)2; (D)2AGCGTT(D)2; (H)2AACACT(H)2; (H)2AACGCT(H)2; D)2TATGTG(D)2; (D)2TACGTG(D)2; (H)2CACATA(H)2; (H)2CACGTA(H)2; D)2TATGTA(D)2; (H)2TACATA(H)2; (D)2TACGTA(D)2; (H)2TACGTA(H)2; D)2TTTGGA(D)2; (D)2TTCGGA(D)2; (H)2TCCAAA(H)2; (H)2TCCGAA(H)2; D)2ATGTGT(D)2; (H)2ACACAT(H)2; (D)2ATGTGT(D)2; (H)2ACGCGT(H)2; ^GTGGTTG^D)^ (DJ^CGGTTG^D)^ (D^GCGGTCGT )., ;
^GTGGTCGT )., ;
)1ACAACCAC(H)1; (H)1ACAACCGC(H)1 ; (H)1ACGACCGC(H)1;
)1ACGACCAC(H)1 ;
)2TGTGTA(D)2; (D)2TGCGTA(D)2; (H)2TACACA(H)2; (H)2TACGCA(H)2;
)2GTGTGT(D)2; (H)2ACACAC(H)2; (D)2GCGCGT(D)2; (H)2ACGCGC(H)2;
)2TGTATG(D)2; (D)2CGTATG(D)2; (D)2TGTACG(D)2; (D)2CGTACG(D)2;
)2CATACA(H)2; (H)2CATACG(H)2; (H)2CGTACA(H)2; (H)2CGTACG(H)2;
)2AATGTT(D)2; (H)2AACATT(H)2; (D)2AACGTT(D)2; (H)2AACGTT(H)2;
)2TGATTG(D)2; (D)2TGATCG(D)2; (D)2CGATTG(D)2; (D)2CGATCG(D)2;
)2CAATCA(H)2; (H)2CGATCA(H)2; (H)2CAATCG(H)2; (H)2CGATCG(H)2;
)2GTTGAT(D)2; (D)2GTCGAT(D)2; (H)2ATCAAC(H)2; (H)2ATCGAC(H)2;
)1TGGTATTG(D)1 ; (D)1CGGTATCG(D)1 ; (D)1TGGTATCG(D)1;
)1CGGTATTG(D)1 ;
J-jCAATACCAfH).,; (H)1CGATACCG(H)1; (H^CGATACCAfH)., ;
)1CAATACCG(H)1 ;
)2TGTTTT(D)2; (D)2CGTTTT(D)2; (H)2AAAACA(H)2; (H)2AAAACG(H)2;
)1GTGTATG(D)2; (D)2GTGTATG(D)1 ; (D)1GTGTACG(D)2;
)2GTGTACG(D)1 ;
)3CATACAC(H)2; (H)2CATACAC(H)1 ; (H)1CGTACAC(H)2;
)2CGTACAC(H)1 ;
)2GATTG(D)3; (D)3GATTG(D)2; (D)2GATCG(D)3; (D)3GATCG(D)2;
)2CAATC(H)3; (H)3CAATC(H)2; (H)2CTAGC(H)3; (H)3CTAGC(H)2;
)1TGTATATG(D)1 ; (D)1TGTATACG(D)1 ; (D)1CGTATATG(D)1 ;
)1CGTATACG(D)1 ;
)1 CATATACA(H)1 ; (H)1 CGTATACA(H)1 ; (H)1 CATATACG(H)1 ;
)1CGTATACG(H)1;
)1TGAGTTTG(D)1 ; (D)1TGAGTTCG(D)1 ; (D)1CGAGTTTG(D)1 ;
)1CGAGTTCG(D)1;
J-.CAAACTCA-JH).*,; (HJ.-CGAACTCAflH)., ; (H^CAAACTCGfl-t).,;
^CGAACTCGOH).,;
)1TGTTAATG(D)1; (D)1CGTTAATG(D)1; (D)1TGTTAACG(D)1;
)1CGTTAACG(D)1; (H)1CATTAACA(H)1 ; (H)1CATTAACG(H)1 ; (H)1CGTTAACA(H)1;
(HJ.jCGTTAACG-JH)., ;
(D)2TGTATG(D)2; (D)2TGTACG(D)2; (D)2CGTATG(D)2; (D)2CGTACG(D)2;
(H)2CATACA(H)2; (H)2CGTACA(H)2; (H)2CATACG(H)2; (H)2CGTACG(H)2; (D^GGTCGGTIΪD).. ; (D^GGTTGGπΥD)., ; (H)1AACCGACC(H)1 ;
(H)1AACCAACC(H)1 ;
(D)2GACGT(D)3; (D)3GACGT(D)2; (D)2GATGT(D)3; (D)3GATGT(D)2;
(H)2ACGTC(H)3; (H)3ACGTC(H)2; (H)2ACATC(H)3; (H)3ACATC(H)2;
(D)2GGCGTT(D)2; (D)2GGTGTT(D)2; (H)2AACGCC(H)2; (H)2AACACC(H)2; (D)2GTCGGT(D)2; (D)2GTTGGT(D)2; (H)2ACCGAC(H)2; (H)2ACCAAC(H)2;
(D)2TGCGG(D)2; (D)2TTGTGG(D)2; (H)2CCGCGA(H)2; (H)2CCACAA(H)2;
(D)2TTCGGG(D)2; (D)2TTTGGG(D)2; (H)2CCCGAA(H)2; (H)2CCCAAA(H)2;
(D)2TTCGAG(D)2; (D)2TTTGAG(D)2; (H)2CTCGAA(H)2; (H)2CTCAAA(H)2;
(D)2CGGTCG(D)2; (D)2TGGTTG(D)2; (D)2CGGTTG(D)2; (D)2TGGTCG(D)2; (H)2CGACCG(H)2; (H)2CAACCA(H)2; (H)2CAACCG(H)2; (H)2CGACCA(H)2-
worin
H eine der Basen Adenin (A), Cytosin (C) oder Thymin (T)
D eine der Basen Adenin (A), Guanin (G) oder Thymin (T) W eine der Basen Adenin (A) oder Thymin (T)
S eine der Basen Cytosin (C) oder Guanin (G) ist.
2. Verwendung eines Satzes von Oligonukleotiden, umfassend mindestens zwei der Sequenzen der Liste 1 , gemäß Anspruch 1 zur Detektion von Cytosin- Methylierungen in DNA-Proben.
3. Verfahren zur parallelen Detektion des Methylierungszustandes von genomischer DNA, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte ausführt:
a) in einer genomischen DNA Probe wandelt man durch chemische Behandlung an der 5'-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil, Thymidin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base um; b) aus dieser chemisch behandelten genomischen DNA amplifiziert man mehr als zehn unterschiedliche Fragmente, die jeweils weniger als 2000 Basenpaare lang sind unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide als Primer;
c) man hybridisiert die Amplifikate an einen Satz von Oligonukleotiden oder PNA-
Oligomeren, der mindestens zwei der folgenden Sequenzen umfasst:
d) Oligonukleotide:
D)4GATGTT(D)4; (D)4GACGTT(D)4; (H)4AACATC(H)4; (H)4AACGTC(H)4;
D)4TTGTGA(D)4; (D)4TTGCGA(D)4; (H)4TCACAA(H)4; (H)4TCGCAA(H)4;
D)4TTTGAA(D)4; (H)4TTCAAA(H)4; (D)4TTCGAA(D)4; (H)4TTCGAA(H)4;
D)4ATTGAT(D)4; (H)4ATCAAT(H)4; (D)4ATCGAT(D)4; (H)4ATCGAT(H)4;
D)3TGGWTTG(D)4; (D)4TGGWTTG(D)3; (D)3CGGWTTG(D)4;
D)4CGGWTTG(D)3;
D)3TGGWTCG(D)4; (D)4TGGWTCG(D)3; (D)3CGGWTCG(D)4;
D)4CGGWTCG(D)3;
H)3CAASCCA(H)4; (H)4CAASCCA(H)3; (H)3CAASCCG(H)4;
H)4CAASCCG(H)3;
H)3CGASCCA(H)4; (H)4CGASCCA(H)3; (H)3CGASCCG(H)4;
H)4CGASCCG(H)3;
D)4AGTGTT(D)4; (D)4AGCGTT(D)4; (H)4AACACT(H)4; (H)4AACGCT(H)4;
D)4TATGTG(D)4; (D)4TACGTG(D)4; (H)4CACATA(H)4; (H)4CACGTA(H)4;
D)4TATGTA(D)4; (H)4TACATA(H)4; (D)4TACGTA(D)4; (H)4TACGTA(H)4;
D)4TTTGGA(D)4; (D)4TTCGGA(D)4; (H)4TCCAAA(H)4; (H)4TCCGAA(H)4;
D)4ATGTGT(D)4; (H)4ACACAT(H)4; (D)4ATGTGT(D)4; (H)4ACGCGT(H)4;
D)3GTGGTTGT(D)3; (D)3GCGGTTGT(D)3; (D)3GCGGTCGT(D)3;
D)3GTGGTCGT(D)3;
H)3ACAACCAC(H)3; (H)3ACAACCGC(H)3; (H)3ACGACCGC(H)3;
H)3ACGACCAC(H)3;
D)4TGTGTA(D)4; (D)4TGCGTA(D)4; (H)4TACACA(H)4; (H)4TACGCA(H)4;
D)4GTGTGT(D)4; (H)4ACACAC(H)4; (D)4GCGCGT(D)4; (H)4ACGCGC(H)4;
D)4TGTATG(D)4; (D)4CGTATG(D)4; (D)4TGTACG(D)4; (D)4CGTACG(D)4;
H)4CATACA(H)4; (H)4CATACG(H)4; (H)4CGTACA(H)4; (H)4CGTACG(H)4; (D)4AATGTT(D)4; (H)4AACATT(H)4; (D)4AACGTT(D)4; (H)4AACGTT(H)4;
(D)4TGATTG(D)4; (D)4TGATCG(D)4; (D)4CGATTG(D)4; (D)4CGATCG(D)4;
(H)4CAATCA(H)4; (H)4CGATCA(H)4; (H)4CAATCG(H)4; (H)4CGATCG(H)4;
(D)4GTTGAT(D)4; (D)4GTCGAT(D)4; (H)4ATCAAC(H)4; (H)4ATCGAC(H)4; (D)3TGGTATTG(D)3; (D)3CGGTATCG(D)3; (D)3TGGTATCG(D)3;
(D)3CGGTATTG(D)3;
(H)3CAATACCA(H)3; (H)3CGATACCG(H)3; (H)3CGATACCA(H)3;
(H)3CAATACCG(H)3;
(D)4TGTTTT(D)4; (D)4CGTTTT(D)4; (H)4AAAACA(H)4; (H)4AAAACG(H)4; (D)3GTGTATG(D)4; (D)4GTGTATG(D)3; (D)3GTGTACG(D)4;
(D)4GTGTACG(D)3;
(H)3CATACAC(H)4; (H)4CATACAC(H)3; (H)3CGTACAC(H)4;
(H)4CGTACAC(H)3;
(D)4GATTG(D)5; (D)5GATTG(D)4; (D)4GATCG(D)5; (D)5GATCG(D)4; (H)4CAATC(H)5; (H)5CAATC(H)4; (H)4CTAGC(H)5; (H)5CTAGC(H)4;
(D)3TGTATATG(D)3; (D)3TGTATACG(D)3; (D)3CGTATATG(D)3;
(D)3CGTATACG(D)3;
(H)3CATATACA(H)3; (H)3CGTATACA(H)3; (H)3CATATACG(H)3;
(H)3CGTATACG(H)3; (D)3TGAGTTTG(D)3; (D)3TGAGTTCG(D)3; (D)3CGAGTTTG(D)3;
(D)3CGAGTTCG(D)3;
(H)3CAAACTCA(H)3; (H)3CGAACTCA(H)3; (H)3CAAACTCG(H)3;
(H)3CGAACTCG(H)3;
(D)3TGTTAATG(D)3; (D)3CGTTAATG(D)3; (D)3TGTTAACG(D)3; (D)3CGTTAACG(D)3;
(H)3CATTAACA(H)3; (H)3CATTAACG(H)3; (H)3CGTTAACA(H)3;
(H)3CGTTAACG(H)3;
(D)4TGTATG(D)4; (D)4TGTACG(D)4; (D)4CGTATG(D)4; (D)4CGTACG(D)4;
(H)4CATACA(H)4; (H)4CGTACA(H)4; (H)4CATACG(H)4; (H)4CGTACG(H)4; (D)3GGTCGGTT(D)3; (D)3GGTTGGTT(D)3; (H)3AACCGACC(H)3;
(H)3AACCAACC(H)3;
(D)4GACGT(D)5; (D)5GACGT(D)4; (D)4GATGT(D)5; (D)5GATGT(D)4;
(H)4ACGTC(H)5; (H)5ACGTC(H)4; (H)4ACATC(H)5; (H)5ACATC(H)4;
(D)4GGCGTT(D)4; (D)4GGTGTT(D)4; (H)4AACGCC(H)4; (H)4AACACC(H)4; (D)4GTCGGT(D)4; (D)4GTTGGT(D)4; (H)4ACCGAC(H)4; (H)4ACCAAC(H)4; (D)4TGCGG(D)4; (D)4TTGTGG(D)4; (H)4CCGCGA(H)4; (H)4CCACAA(H)4; (D)4TTCGGG(D)4; (D)4TTTGGG(D)4; (H)4CCCGAA(H)4; (H)4CCCAAA(H)4; (D)4TTCGAG(D)4; (D)4TTTGAG(D)4; (H)4CTCGAA(H)4; (H)4CTCAAA(H)4; (D)4CGGTCG(D)4; (D)4TGGTTG(D)4; (D)4CGGTTG(D)4; (D)4TGGTCG(D)4;
(H)4CGACCG(H)4; (H)4CAACCA(H)4; (H)4CAACCG(H)4; (H)4CGACCA(H)4.
worin
H eine der Basen Adenin (A), Cytosin (C) oder Thymin (T) D eine der Basen Adenin (A), Guanin (G) oder Thymin (T)
W eine der Basen Adenin (A) oder Thymin (T)
S eine der Basen Cytosin (C) oder Guanin (G) ist,
c2) PNA-Oligomere:
(D)2GATGTT(D)2; (D)2GACGTT(D)2; (H)2AACATC(H)2; (H)2AACGTC(H)2;
(D)2TTGTGA(D)2; (D)2TTGCGA(D)2; (H)2TCACAA(H)2; (H)2TCGCAA(H)2;
(D)2"πTGAA(D)2; (H)2TTCAAA(H)2; (D)2TTCGAA(D)2; (H)2TTCGAA(H)2; (D)2ATTGAT(D)2; (H)2ATCAAT(H)2; (D)2ATCGAT(D)2; (H)2ATCGAT(H)2;
(D)1TGGWTTG(D)2; (D)2TGGWTTG(D)1 ; (D)1CGGWTTG(D)2;
(D)2CGGWTTG(D)1 ;
(D)1TGGWTCG(D)2; (D)2TGGWTCG(D)1 ; (D)1CGGWTCG(D)2;
(D)2CGGWTCG(D)1; (H)1CAASCCA(H)2; (H)2CAASCCA(H)1 ; (H)1CAASCCG(H)2;
(H)2CAASCCG(H)1 ;
(H)1CGASCCA(H)2; (H)2CGASCCA(H)1 ; (H)1CGASCCG(H)2;
(H)2CGASCCG(H)1 ;
(D)2AGTGTT(D)2; (D)2AGCGTT(D)2; (H)2AACACT(H)2; (H)2AACGCT(H)2; (D)2TATGTG(D)2; (D)2TACGTG(D)2; (H)2CACATA(H)2; (H)2CACGTA(H)2;
(D)2TATGTA(D)2; (H)2TACATA(H)2; (D)2TACGTA(D)2; (H)2TACGTA(H)2;
(D)2TTTGGA(D)2; (D)2TTCGGA(D)2; (H)2TCCAAA(H)2; (H)2TCCGAA(H)2;
(D)2ATGTGT(D)2; (H)2ACACAT(H)2; (D)2ATGTGT(D)2; (H)2ACGCGT(H)2; (D)1GTGGTTGT(D)1; (D^GCGGTTGTfD).,; (D^GCGGTCGT ).,;
(D)1GTGGTCGT(D)1;
(H)1ACAACCAC(H)1; (H)1ACAACCGC(H)1; (H)1ACGACCGC(H)1;
(H)1ACGACCAC(H)1; (D)2TGTGTA(D)2; (D)2TGCGTA(D)2; (H)2TACACA(H)2; (H)2TACGCA(H)2;
(D)2GTGTGT(D)2; (H)2ACACAC(H)2; (D)2GCGCGT(D)2; (H)2ACGCGC(H)2;
(D)2TGTATG(D)2; (D)2CGTATG(D)2; (D)2TGTACG(D)2; (D)2CGTACG(D)2;
(H)2CATACA(H)2; (H)2CATACG(H)2; (H)2CGTACA(H)2; (H)2CGTACG(H)2;
(D)2AATGTT(D)2; (H)2AACATT(H)2; (D)2AACGTT(D)2; (H)2AACGTT(H)2; (D)2TGATTG(D)2; (D)2TGATCG(D)2; (D)2CGATTG(D)2; (D)2CGATCG(D)2;
(H)2CAATCA(H)2; (H)2CGATCA(H)2; (H)2CAATCG(H)2; (H)2CGATCG(H)2;
(D)2GTTGAT(D)2; (D)2GTCGAT(D)2; (H)2ATCAAC(H)2; (H)2ATCGAC(H)2;
(D)1TGGTATTG(D)1; (D)1CGGTATCG(D)1; (D)1TGGTATCG(D)1;
(D)1CGGTATTG(D)1; (H^CAATACCAfH).,; (H^CGATACCG-JH).,; (H^CGATACCAH).,;
(H^CAATACCG-iH),-;
(D)2TGTTTT(D)2; (D)2CGTTTT(D)2; (H)2AAAACA(H)2; (H)2AAAACG(H)2;
(D)1GTGTATG(D)2; (D)2GTGTATG(D)1; (D)1GTGTACG(D)2;
(D)2GTGTACG(D)1; (H)3CATACAC(H)2; (H)2CATACAC(H)1; (H)1CGTACAC(H)2;
(H)2CGTACAC(H)1;
(D)2GATTG(D)3; (D)3GATTG(D)2; (D)2GATCG(D)3; (D)3GATCG(D)2;
(H)2CAATC(H)3; (H)3CAATC(H)2; (H)2CTAGC(H)3; (H)3CTAGC(H)2;
(D)1TGTATATG(D)1; (D)1TGTATACG(D)1; (D)1CGTATATG(D)1; (D)1CGTATACG(D)1;
(H)1CATATACA(H)1; (H)1CGTATACA(H)1; (H)1CATATACG(H)1;
(H)1CGTATACG(H)1;
(D)1TGAGTTTG(D)1; (D)1TGAGTTCG(D)1; (D)1CGAGTTTG(D)1;
(D)1CGAGTTCG(D)1; (H^CAAACTCAfl-l^; (H^CGAACTCAflH).,; (H)1CAAACTCG(H)1;
(H^CGAACTCGOH).,;
(D)1TGTTAATG(D)1; (D)1CGTTAATG(D)1; (D)1TGTTAACG(D)1;
(D)1CGTTAACG(D)1; (H)1 CATTAACA(H)1 ; (H)1CATTAACG(H)1 ; (H)1CGTTAACA(H)1 ;
(H)1CGTTAACG(H)1 ;
(D)2TGTATG(D)2; (D)2TGTACG(D)2; (D)2CGTATG(D)2; (D)2CGTACG(D)2;
(H)2CATACA(H)2; (H)2CGTACA(H)2; (H)2CATACG(H)2; (H)2CGTACG(H)2; (D^ GGTCGGT^D)., ; (D^GGTTGGTTfD)., ; (H^AACCGACCtH)., ;
O- -.AACCAACCO-I^ ;
(D)2GACGT(D)3; (D)3GACGT(D)2; (D)2GATGT(D)3; (D)3GATGT(D)2;
(H)2ACGTC(H)3; (H)3ACGTC(H)2; (H)2ACATC(H)3; (H)3ACATC(H)2;
(D)2GGCGTT(D)2; (D)2GGTGTT(D)2; (H)2AACGCC(H)2; (H)2AACACC(H)2; (D)2GTCGGT(D)2; (D)2GTTGGT(D)2; (H)2ACCGAC(H)2; (H)2ACCAAC(H)2;
(D)2TGCGG(D)2; (D)2TTGTGG(D)2; (H)2CCGCGA(H)2; (H)2CCACAA(H)2;
(D)2TTCGGG(D)2; (D)2TTTGGG(D)2; (H)2CCCGAA(H)2; (H)2CCCAAA(H)2;
(D)2TTCGAG(D)2; (D)2TTTGAG(D)2; (H)2CTCGAA(H)2; (H)2CTCAAA(H)2;
(D)2CGGTCG(D)2; (D)2TGGTTG(D)2; (D)2CGGTTG(D)2; (D)2TGGTCG(D)2; (H)2CGACCG(H)2; (H)2CAACCA(H)2; (H)2CAACCG(H)2; (H)2CGACCA(H)2*
worin
H eine der Basen Adenin (A), Cytosin (C) oder Thymin (T)
D eine der Basen Adenin (A), Guanin (G) oder Thymin (T) W eine der Basen Adenin (A) oder Thymin (T)
S eine der Basen Cytosin (C) oder Guanin (G) ist,
d) man detektiert die hybridisierten Amplifikate.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die chemische Behandlung mittels einer Lösung eines Bisulfits, Hydrogensulfits oder Disulfits durchführt.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4 dadurch gekennzeichnet, dass man die
Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchführt.
6. Verfahren nach Anspruch 3, 4 oder 5 dadurch gekennzeichnet, dass die in der Amplifikation verwendeten Primer jeweils Sequenzen aus an der Genregulation beteiligten und/oder transkribierten und/oder translatierten genomischen Sequenzen enthalten, wie sie nach einer Behandlung gemäß Schritt a) vorliegen würden;
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6 dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der in Schritt b) verwendeten Oligonukleotide weniger Nukleobasen enthält als es für eine sequenzspezifische Hybridisierung an die chemisch behandelte genomische DNA Probe erforderlich wäre.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7 dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der in Schritt b) des Anspruchs 3 verwendeten Oligonukleotide kürzer als 18 Nukleobasen ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7 dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der in Schritt b) des Anspruchs 3 verwendeten Oligonukleotide kürzer als 15 Nukleobasen ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man in Schritt b) des Anspruchs 3 mehr als 4 verschiedene Oligonukleotide gleichzeitig für die Amplifikation verwendet.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man in Schritt b) des Anspruchs 3 mehr als 26 verschiedene Oligonukleotide gleichzeitig für die Amplifikation verwendet.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass man zur Amplifikation der in Schritt b) des Anspruchs 3 beschriebenen DNA zwei Oligonukleotide oder zwei Klassen von Oligonukleotiden verwendet, von denen eines oder eine der Klassen außer im Kontext CpG die Basen C, A und T enthalten kann, nicht aber die Base G und von denen das andere oder die andere Klasse außer im Kontext CpG die Basen G, A und T, nicht aber die Base C enthalten kann.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 12 dadurch gekennzeichnet, dass die Untersuchung der in den ampiizierten Fragmenten enthaltenen CpG Dinukleotide vollständig oder teilweise gemäß Anspruch 3 d) durch Hybridisierung der bereits in der Amplifikation mit einer nachweisbaren Markierung versehenen Fragmente an einen Oligonukleotid-Array (DNA Chip) erfolgt.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierun- gen Fluoreszenzmarkierungen sind.
15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen Radionuklide sind.
16. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen ablösbare Massenmarkierungen sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 16 dadurch gekennzeichnet, dass die amplifizierten Fragmente auf einer Oberfläche immobilisiert sind.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 16 dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridisierung mit einer kombinatorischen Bibliothek von unterscheidbaren Oligonukleotid- oder PNA-Oligomersonden durchgeführt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 17 dadurch gekennzeichnet, dass die Sonden mittels Matrix-assistierter Laser-Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI-MS) anhand ihrer eindeutigen Masse nachgewiesen werden.
20. Verfahren nach Anspruch 17 oder 19 dadurch gekennzeichnet, dass die
Sonden jeweils eine einzelne positive oder negative Nettoladung tragen.
21. Verfahren nach Anspruch 17 bis 20 dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeten Sonden PNA, Alkylphosphonat-DNA, Phosphorothioat-DNA oder alkylier- te Phosphorothioat-DNA sind.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation wie beschrieben in Schritt b) des Anspruchs 1 durch eine Polymerase Kettenreaktion ausgeführt wird, in der die Größe der amplifizierten Fragmente auf weniger als 30 s verkürzter Kettenverlängerungsschritte begrenzt wird.
23. Verfahren nach den Ansprüchen 3 bis 12 und 17 dadurch gekennzeichnet, dass der feste Träger aus einer Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus: Beads,
Kapillaren, ebenen Trägermaterialen, Membranen, Wafers, Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Amplifikation gemäß Schritt b) des Anspruchs 3 die Produkte durch
Gelelektrophorese aufgetrennt werden und die Fragmente, die kleiner als 2000 Basenpaare oder kleiner als ein beliebiger Grenzwert unterhalb von 2000 Basenpaaren sind, durch Ausschneiden von den anderen Produkten der Amplifikation vor der Auswertung gemäß Schritt c) des Anspruchs 1 abgetrennt werden.
25. Verfahren nach Anspruch 24 dadurch gekennzeichnet, dass nach der Abtrennung von Amplifikaten bestimmter Größe diese vor der Durchführung des Schrittes c) des Anspruchs 1 nochmals amplifiziert werden.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 25 dadurch gekennzeichnet, dass Methylierungsanalysen des oberen und unteren DNA-Stranges gleichzeitig durchgeführt werden.
27. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekenn- zeichnet, dass man eine thermostabile DNA Polymerase aus folgender Gruppe auswählt: Taq DNA Polymerase, AmpliTaq FS DNA Polymerase, Deep Vent (exo.sup.-) DNA Polymerase, Vent DNA Polymerase, Vent (exo.sup.-) DNA Polymerase und Deep Vent DNA Polymerase, Thermo Sequenase, exo(-) Pseudococ- cus furiosus (Pfu) DNA Polymerase, AmpliTaq, Ultman, 9 degree Nm, Tth, Hot Tub, Pyrococcus furiosus (Pfu) und Pyrococcus woesei (Pwo) DNA Polymerase.
28. Kit, enthaltend mindestens zwei Primerpaare, Reagenzien und Hilfsstoffe für die Amplifikation und/oder Reagenzien und Hilfsmittel für die chemische Behandlung gemäß Anspruch 3 a) und/oder eine kombinatorische Sondenbibliothek und/oder einen Oligonukleotid-Array (DNA-Chip), soweit sie für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlich oder dienlich sind.
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