EP1397687A2 - Verfahren zur bestimmung von peptiden/proteinen, massenspektrometrie für metalle und leitfähigkeitsfeststellung - Google Patents
Verfahren zur bestimmung von peptiden/proteinen, massenspektrometrie für metalle und leitfähigkeitsfeststellungInfo
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- EP1397687A2 EP1397687A2 EP02750770A EP02750770A EP1397687A2 EP 1397687 A2 EP1397687 A2 EP 1397687A2 EP 02750770 A EP02750770 A EP 02750770A EP 02750770 A EP02750770 A EP 02750770A EP 1397687 A2 EP1397687 A2 EP 1397687A2
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
- G01N33/6866—Interferon
Definitions
- the invention is generally concerned with the determination of peptides / proteins.
- the invention also relates to mass spectrometry for metals and conductivity detectors.
- mass spectrometry for metals and conductivity detectors are disclosed in the present documents and within the scope of the invention, these are additionally independent inventions with, under certain circumstances, independent protection needs and protection options.
- the invention relates to the measurement of certain peptides / proteins that can serve as evidence of allergies.
- this aspect of the present invention is concerned with the measurement of gamma interferon. It has to be clarified how much active gamma interferon is still in the blood in order to be able to determine the amount of gamma interferon to be added from outside for a patient.
- ⁇ EFN undifferentiated (active plus inactive degraded) ⁇ EFN (peptides, proteins) in cell cultures, cell lines from secretion assays with stimulated isolated cells. It is also known that the active ⁇ lFN (peptides, proteins) molecules relevant for patients / persons (species) are contained in their body fluids, e.g. Blood, are metabolized very quickly, are broken down and an exact allocation of the relevant active ⁇ lFN (peptide, protein) amounts is not possible with the conventional assays.
- the invention aims to overcome the above drawbacks.
- the invention aims to enable an exact allocation of the relevant active ⁇ IFN (peptide, protein) amounts.
- the invention thus provides a method for determining peptides / proteins, characterized in that peptides / proteins at their C end, N end and / or their modified sites and in their entirety with specific antibodies, which are marked such that a later measurement is possible.
- the basic idea of the invention is based on the measurement of peptides / proteins at their C-end, N-end, their modified sites, and in their entirety (comparison with conventional ⁇ IFN assays) with specific antibodies which are labeled such that a later measurement is possible.
- the invention leads to new methods for the determination of peptides / proteins, for the detection of active ⁇ lFN (interleukins, cytokines) and their degradation products / metabolites in blood, in plasma, in serum (body) liquids, in tissues, and for the separation of active ⁇ lFN (interleukins, cytokines) and its degradation products / metabolites from these media.
- therapies of I ranldieitssente ⁇ i / metabolic diseases urticaria, allergies, leukaemias, thromboses, atherosclerosis, rheumatism, rheumatoid arthritis, etc.
- therapies of clinical pictures / metabolism can be achieved which are associated with the presence of active ⁇ lFN (Interleukins, cytokines) and their degradation products / metabolites are linked, developed, selected, facilitated or improved.
- the present invention enables a determination of peptides / proteins, for the replacement of active ⁇ lFN (interleukins, cytokines) and its degradation products / metabolites in the absence of a quantity to the normal value.
- the present invention also makes positive contributions to the development, selection, facilitation and improvement of therapies for clinical pictures / metabolic diseases which are associated with the lack of active ⁇ IFN (hiterleukins, cytokines) and their breakdown products / metabolites, and simultaneous (proportionate) evidence of the different ⁇ lFN / interleukins, cytokines (peptides / proteins) to one another and conclusions about the effect of this special molecule on the metabolism and on the triggering or therapy of derailments.
- the invention also makes contributions to the explanation of the effect of ⁇ IFN (11-4, II's, cytokines) peptides / proteins on the therapy of various antitumor drugs / antagonist agonists (Cyt P 450 system etc.) to explain the Change in redox potential, etc.
- the method further provides that a detection possibility (defection device) is coupled to the antibodies, which allows the amount of the antibody molecules to be determined via their concentration. le and thus to determine the quantity of molecules to be determined qualitatively and / or quantitatively.
- a detection possibility is coupled to the antibodies, which allows the amount of the antibody molecules to be determined via their concentration. le and thus to determine the quantity of molecules to be determined qualitatively and / or quantitatively.
- the detection or defect device is designed to duplicate or amplify the concentration to be measured. This can be further developed by either designing the detection possibility or the defect device itself to be very large and, in particular, breaking it down into smaller, preferably identical parts in such a way that their concentration can be assumed to be known and / or easily measured, or that the detection possibility or defect Device itself can be duplicated or amplified in such a way that measurement is easily possible using known methods.
- this also relates to mass spectrometry for metals or metal determination in general, specifically in the form of a mass spectrometer and a method for metal determination with a mass spectrometer.
- the starting point for this aspect of the invention is conventional mass spectrometry, in which an organic sample in the chamber of the mass spectrometer is bombarded with electrons or a LASER. The resulting positively charged cations are separated by a magnetic field according to mass and charge and recorded with a detector.
- This conventional mass spectrometry relies on volatile substances.
- the present invention provides a mass spectrometer, which is characterized in that a carrier gas source, in particular a CO source, is provided in order to bombard a sample with carrier gas, corresponding in particular CO, or that an enzyme solution container with / for an enzyme solution is provided for reaction with at least one metal.
- a carrier gas source in particular a CO source
- the aim of the invention is thus achieved by replacing the electron source, which is conventionally customary, for example, with a CO source or generally a carrier gas source, in particular metal-containing fluids being introduced into a sample chamber.
- the Trä- Gas source or in particular CO source causes the metals contained in the fluids to volatilize in carbonyls and can thus be recorded by the detector.
- Metal determination method which is characterized in that a sample is bombarded with carrier gas, in particular CO, from a carrier gas source, corresponding in particular with a CO source, or that an enzyme solution reacts with at least one sample metal.
- Metal-containing fluids are preferably introduced into a sample chamber as part of this method.
- Carrier gas or, in particular, CO radiation or carrier gas or, in particular, CO bombardment causes the metals contained in the fluids to evaporate in carbonyls and thus to be recorded by the detector.
- inorganic cations Pt (2+), Pd (2+), Ni (2+), incl.
- These metals can not or only insufficiently in low concentration with the currently common methods (AAS, etc.) be measured.
- the measurement of these metals is particularly interesting with regard to various environmental diseases such as contact dermatitis, asthma or BSE, as well as the ozone hole and the greenhouse effect.
- These metals usually have a low vapor pressure. The tendency of these metals to form volatile carbonyls is used, which makes these metals detectable in the mass spectrometer. Car exhaust gases can then also be measured directly, making the device and method suitable for technical inspections of motor vehicles, such as TÜV in Germany, as well as atmospheric metals and compounds (complexes) as well as organics etc. more.
- the mass spectrometer and mass determination method according to the invention are designed to determine the concentration of the metals by determining contained and / or emerging peptides, amino acids, etc. This is preferably, but not limited to, e.g. PCR reaction or the methods described above according to the first aspect of the present invention.
- the metals can also be determined by means of an enzymatic reaction.
- these metals are introduced into corresponding enzyme solutions which react specifically with these metals, ie are activated (for example nickel-activated horse radical peroxidase, Me proteases, superoxide dismutase, glutathione peroxidase, etc.).
- this also relates to conductivity measurement and conductivity determination.
- a biosensor with two electrodes, to which a constant voltage is applied is known.
- Blood cells for example, are placed on the electrodes, the change in resistance being measured when the cells are added to the electrodes.
- cell activity can also be measured when the blood cells are already on the electrodes and additional substances are added.
- this method cannot be used to measure cells that are still alive. It should be noted that cells can still be measured for about half an hour under in vivo conditions after blood has been drawn.
- the third aspect of the present invention aims to remedy this drawback.
- a conductivity measurement according to the invention is characterized in that a blood sample is introduced into a measuring tube, which is surrounded by a plurality of electrodes, and that the electrodes are controlled crosswise with a frequency generator according to a predetermined scheme.
- a measuring tube is provided for the introduction of a blood sample, which is surrounded by a plurality of electrodes which can be controlled crosswise with a frequency generator according to a predefinable scheme.
- the invention in the context of the aspect dealt with here therefore consists in introducing the blood sample into a measuring tube which is surrounded by a multiplicity of electrodes.
- the electrodes are controlled crosswise according to a certain scheme with a frequency generator.
- this method it is possible, for example, to measure certain redox conditions; overall, it is possible to measure the patient's individual reaction to certain additives.
- the drawing shows: 1 shows a molecule with modification sites on the example of ⁇ IFN in the context of the method according to the invention for the determination of peptides / proteins,
- FIG. 3 shows an exemplary embodiment of a protein, peptide or ⁇ IFN with antibody with a defect device as detection means, within the scope of the method according to the invention for determining peptides / proteins,
- Fig. 4 shows another embodiment of a ⁇ lFN with antibody with a defect
- FIG. 5 shows a diagrammatic representation of the separation of the defection device as detection means, within the scope of the method according to the invention for determining peptides / proteins
- FIG. 6 shows an exemplary embodiment of a conversion step in the context of the method according to the invention for determining peptides / proteins
- FIG. 7 shows an exemplary embodiment of a detection step in the context of the method according to the invention for determining peptides / proteins
- FIG. 8 shows an exemplary embodiment of a calculation step within the scope of the method according to the invention for determining peptides / proteins
- FIG. 8a shows an embodiment variant according to FIG. 8, but especially for a missing N end
- 11 still exemplary embodiments of method variants within the scope of the method according to the invention for the determination of peptides / proteins
- 12 shows another example of the implementation of process variants within the scope of the method according to the invention for determining peptides / proteins
- FIG. 17 schematically shows two exemplary embodiments of a conductivity measuring cell
- FIG. 1 shows a molecule such as ⁇ IFN (identical to the notation gIFN) with different modification sites, with 0. the entire active molecule, 1. to 3. the degradation product, th and 4th to 6th correspond to the modification points.
- Figure 2 shows a molecule like gIFN that lacks the N-terminus.
- a monoclonal antibody AK specific for the C-end is added to the sample. Then shake for a few minutes.
- Antibodies AK are preferably commercially available or newly manufactured. The principle applies in particular to every protein (molecule) to be measured, modified or changed.
- ⁇ IFN identical to the notation gIFN
- U / ml blood 2.5-25 ng / ml blood.
- the corresponding detection possibility or Defection Device DD is preferably able to reproduce or amplify the concentration to be measured in such a way that the measurement of the unknown concentration is easily possible, for example also in normal blood samples is.
- the determination method for peptides / proteins can provide that the detection possibility or Defection Device DD itself is designed to be very large and in particular can be broken down into smaller, preferably identical, parts such that their concentration can be assumed to be known and / or easily measured , In another variant it can be provided that this detection possibility or Defection Device DD itself can be reproduced or amplified in such a way that measurement is easily possible using known methods, for example by means of a subsequent PCR reaction.
- the detection possibility or defect device DD can then be a magnetic particle, an RNA, a DNA, a polylysine, a polysaccharide, a polypeptide, etc., which is coupled via PCR, magnetically, electrically, electrophoretically (blotting) Dyes (UV, IR, luminescence, fluorescence, etc.) can be easily measured qualitatively and quantitatively.
- a coupled DNA or RNA is e.g. easy to disassemble.
- modified ⁇ lFN e.g. commercially available poly (Ad) or poly (G; T; C) chains (balls) are suitable, which would be coupled to an antibody AK in the context of the invention using any coupling method.
- Ad poly (Ad) or poly (G; T; C) chains (balls) are suitable, which would be coupled to an antibody AK in the context of the invention using any coupling method.
- These coupling methods are e.g. used routinely in DNA chip technology to couple these compounds to the biochip (see Figure 4).
- This complex can now be detected in the sample (blood etc.) directly and / or after appropriate separation or washing (centrifugation, TLC plate, column means, inter alia, polyclonal AKs against the entire molecule and digestion of the entire molecule by proteases, peptidases) ,
- DD ⁇ Poly (Ad) ⁇ is via a chip or a microtiter plate (or other possibilities) by e.g. easily isolate or separate hybidization from (T) covered / occupied surfaces from the sample.
- the detection is carried out radioactively using labeled nucleotides, 125 J antibodies, etc. Or the detection is carried out by means of a coupled PCR reaction or after digestion of the DNA, RNA, poly (A) (chains) by means of acid bases, DNAases, RNAases, endonucleases etc., followed by an enzyme. Detection of the released nucleotides carried out (1st digestion with common methods to monophosphates).
- the triphosphates / ATP formed are now detected, for example, by means of downstream enzymes.
- a measurement of the kinase activity is also possible.
- the most sensitive method, however, is the measurement using coupled luciferase via luminescence.
- Detection is also possible using RNA-F, DNA-F, polyNu-F (polylysine-F, polysaccharide-F, etc.) labeled with fluorescent dye (cf. FIG. 7).
- the concentration calculation is carried out, for example, in accordance with the embodiment shown in FIG. 8 as process component I.
- process component II is missing for the C-terminus: analogous to L, but with an antibody AK specifically for the N end according to FIG. 8a.
- a process component HI applies. analogously I. with antibodies AK specifically for these modified molecules, etc.
- a process component IV applies to the modified molecule ( ⁇ IFN (identical to the notation gIFN)) with policlonal antibodies AK against the modified molecule.
- the surfaces are coupled with the corresponding counter nucleotides, so that hybridization can take place.
- the variant a) in FIG. 10 relates to a microtiter plate, etc. for separation or as proof.
- the variant b) in FIG. 10 relates to a chip, a tube (advantageously, for example, in dialysis) or a column, etc. for separation or for detection.
- polypeptides are detected using common assays, such as with ninhydrin (Edman degradation, etc.).
- Evidence of poly sugar e.g. Chitisan, done by coupling with e.g. Dyes, degradation with chitobiose-chitobiase, detection as described (chelates, flocculants for metals).
- Another way of determining the complex is achieved by means of atomic force microscopy (AFM) titration (cf. FIG. 11).
- AFM atomic force microscopy
- the isolated, labeled complexes are applied directly from the separation columns, using nanopipettes, etc. to a suitable sample holder (glass, paper, nylon, etc.) in such a way that a number of spots with increasing concentration arises, which after drying (+ fixation with e.g. formalin, coupling with isothiocyanates, epoxy (-D3), NHS, etc.) are measured orthographically using a CCD camera, scintillation counter, etc.
- cytokines for testing and control, incubate for certain time intervals and then measure the concentration of cytokines, interferons, etc. ( ⁇ lFN, interleukin-1 (ß), IGF BPs, IGFI etc.) using the methods described.
- a combination of the different assays on a microtiter plate or on a biochip is also possible.
- FIG. 13 shows the structure of a conventional mass spectrometer 1 with an electron source 2, an accelerator 3, in particular with a negative potential, a magnet 4, a gap 5 and a collecting vessel 6. Furthermore, a line 14 to a vacuum pump (not shown) is shown and a feeder 15 for a sample (not shown).
- valve 14 shows the representation of a mass spectrometer analogous to FIG. 1 with the configurations and arrangements according to the invention: valve / switch 7, heatable sample space with furnace 8, (air, gas) CO source / reservoir 9, valve 10 and valve 11 (three - directional valves).
- the electron source 2 can be switched off according to the schematic illustration in FIG. 14 by means of the valve / switch 7 and the heatable sample space with sample 8 and CO (air, gas, carrier gas) source 9 by means of valves (in particular three-way valves) 10 and 11 connectable to the mass spectrometer 1.
- Exhaust gases are also (Air, atmosphere, car exhaust gases) can be supplied via the valve 11.
- the heatable sample space 8 can be opened by means of a closure 12 and can be loaded with a sample carrier / sample 13.
- the sample space 8 with the sample e.g. Blood or other metal-containing fluids can be loaded with the aid of the closure 12.
- the CO source 9 and the sample space 8 are connected to the sample 13 via the valves 10 and 11 with the mass spectrometer 1.
- the sample is heated in the heatable sample room (e.g. to 300 ° C), whereby volatile metal carbonyls are formed which, by means of a vacuum pump and accelerator 3, pass through the magnet 4 and the gap 5 into the collecting vessel 6 after they have been detected.
- Exhaust gases e.g. Car exhaust gases, air, atmosphere, etc. are introduced directly into the system via valve 11 and measured / detected.
- the detection limit is preferably in the vicinity of 0.1 pmol / ⁇ l sample.
- 15 shows the mass spectrogram of ethanol as an example.
- 16 shows an example of the assumed mass peak of Pt 2+.
- the metals can also be determined by means of an enzymatic reaction.
- these metals are introduced into corresponding enzyme solutions which react specifically with these metals, i.e. activated (e.g. nickel-activated horse radical peroxidase, Me proteases, superoxide dismutase, glutathione peroxidase, etc.).
- activated e.g. nickel-activated horse radical peroxidase, Me proteases, superoxide dismutase, glutathione peroxidase, etc.
- the determination of the resulting peptides, amino acids, etc. using e.g. PCR reaction or the methods described above gives the concentration of the metals.
- the specific inactivation of various enzymes by these metals can also be used to determine the metals (and vice versa), these are proteases, peptidases, transferases, etc.
- a microtiter plate (e.g. a chip, etc.) covered with glutathione, metallothionine, transferrin, ferritin, dextrin (or another chelating agent, fusion protein, etc.) binds e.g. Nickel from a sample (liquid, air, etc.) (1), a recombinant horse radish peroxidase is activated (2) and can be removed using substrates such as e.g. Polyhistidine and PCR (among others) detection show the concentration of nickel in the sample.
- substrates such as e.g. Polyhistidine and PCR (among others) detection show the concentration of nickel in the sample.
- Aeroallergens such as metal ions
- B SA filters / columns can be enriched via B SA filters / columns and then detected in / from these filters / columns using the methods described.
- a conductivity determiner can then also be used to determine these ions, as is explained below in connection with yet another aspect of the present invention.
- redox potentials in biol are defined by Me ions. Systems, among others.
- the invention in the context of this aspect consists in introducing a blood sample into a measuring tube which is surrounded by a plurality of electrodes.
- the electrodes are controlled crosswise according to a certain scheme with a frequency generator.
- this method it is possible, for example, to measure certain redox conditions; overall, it is possible to measure the patient's individual reaction to certain additives.
- this redox measuring cell / conductivity measuring cell enables the "ex vivo" (in vivo) measurement of the potential over a (biological) sample, blood sample (cell (s), over cell components, membranes - mitochondria, bacteria (etc.), Cell nucleus cytosol, solutions; blood and its components / serum, plasma; etc., with and without different compounds, under different treatments, conditions.
- FIG. 17 shows an example for the construction of a conductivity measuring cell 100 with electrodes 102, an opening 103, and feed lines 104 for a frequency generator 105 (FIG. 18).
- the conductivity measuring cell 100 is designed in Kugelfönn (FIG. 17, example a)), one side being open for the addition of various substances, additives, etc.
- the total internal volume of the conductivity measuring cell 100 is preferably approximately 0.5 ml.
- Suitable electrode material would be e.g. Gold.
- An electromagnetic rotating field, in particular constantly circulating and / or oscillating, is generated by means of the frequency generator 105 (FIG. 18).
- the conductivity measuring cell 100 is designed in a continuous form (FIG. 17, example b)), the conductivity measuring cell 100 being open at the top and bottom for the passage of liquids (such as, for example: blood). Openings 103 and 107 are provided with a network 106 and 108.
- the conductivity measuring cell 100 can be used as a perfusion cell.
- At least two conductivity measuring cells 100 are preferably connected in series, at least one conductivity measuring cell 100 acting as a control.
- a computer controls voltage / current as well as the resistance and at the same time ensures the change between the measuring cells within an experiment.
- the frequency generator 105 works as a current source with 4 output channels (I J to L) whose current or voltage phases are each shifted by 90 ° (ij to i 4 , with Oi to O 4 , 11), which leads to a rotating field that serves to stabilize the sample.
- an amplifier 109 for tapping the voltage Uj at the frequency generator 105 is interposed in front of the computer 110.
- the behavior (redox, etc.) of an individual species in the measuring cell can be measured with a known cell / particle number in the conductivity measuring cell 100.
- redox potentials such as Fe 2 Fe 3+ ; ascorbate; glutathione, amino acids, etc.
- cell biosystems including prion proteins, depending on various conditions (reference to BSE, Kreutzfeld-Jakob), from allergies, asthma in relation to the addition / effect of metals, ROS.
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen, dadurch gekennzeichnet, dass Peptide/Proteine an deren C-Ende, N-Ende und/oder deren modifizierten Stellen sowie in ihrer Gesamtheit mit spezifischen Antikörpern vermessen werden, die derart markiert sind, dass eine spätere Vermessung möglich ist. Weiterhin betrifft die Erfindung vorrichtungs- und verfahrensmässig Massenspektrometrie, wobei eine Trägergasquelle, insbesondere eine CO-Quelle, vorgesehen ist, um eine Probe mit Trägergas, entsprechend insbesondere CO, zu beschiessen, oder wobei ein Enzymlösungsbehälter mit/für eine(r) Enzymlösung zur Reaction mit wenigstens einem Metall vorgesehen ist. Die Erfindung betrifft vorrichtungs- und verfahrensmässig auch eine Leitfähigkeitsmessung, wobei eine Blutprobe in einem Messtubus eingeführt wird, der von einer Vielzahl von Elektroden umgeben ist, und wobei die Elektroden nach einem vorgegebenen Schema kreuzweise mit einem Frequenzgenerator angesteuert werden.
Description
Verfahren zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen, Massenspektrometrie für Metalle und Leitfähigkeitsfeststellung
Beschreibung
Die Erfindung befaßt sich allgemein mit der Bestimmung von Peptiden/Proteinen. Insbesondere in diesem Zusammenhang, aber auch allgemein, befaßt sich die Erfindung auch mit Massenspektrometrie für Metalle und Leitfähigkeitsfeststellern. Soweit in den vorliegenden Unterlagen und im Rahmen der Erfindung Massenspektrometrie für Metalle und Leitfähigkeitsfest- steller offenbart sind, handelt es sich dabei zusätlich auch um jeweils eigenständige Erfindungen mit unter Umständen unabhängigen Schutzbedürfnissen und Schutzmöglichkeiten.
Insbesondere betrifft die Erfindung gemäß einem Aspekt die Messung von bestimmten Peptiden/Proteinen, die als Nachweis für Allergien dienen können. Speziell geht es gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung um die Vermessung von Gamma-Interferon. Zu klären ist dabei, wieviel aktives Gamma-Interferon sich noch im Blut befindet, um die von außen zuzugebende Menge von Gamma-Interferon für einen Patienten bestimmen zu können.
Bekannt ist die Vermessung von undifferenziertem (aktiven plus inaktiven abgebauten) γEFN (Peptiden, Proteinen) in Zellkulturen, Zelllinien aus Sekretionsassays mit stimulierten isolierten Zellen. Bekannt ist auch, daß die für Patienten/Personen (Spezies) relevanten aktiven γlFN (Peptide, Proteine) -Moleküle in deren Körperflüssigkeiten, wie z.B. Blut, sehr schnell ver- stoffwechselt werden, abgebaut werden und somit eine genaue Zuordnung der relevanten aktiven γlFN (Peptid, Protein) Mengen mit den herkömmlichen Assays nicht möglich ist.
Gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung hat diese zum Ziel, die vorstehenden Nachteile zu beseitigen. Insbesondere strebt die Erfindung insoweit an, eine genaue Zuordnung der relevanten aktiven γlFN (Peptid, Protein) Mengen zu ermöglichen.
Dies wird mit einem Verfahren gemäß dem Anspruch 1 erreicht.
Erfindungsgemäß wird somit geschaffen, ein Verfahren zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen, dadurch gekennzeichnet, dass Peptide/Proteine an deren C-Ende, N-Ende und/oder deren
modifizierten Stellen sowie in ihrer Gesamtheit mit spezifischen Antikörpern vermessen werden, die derart markiert sind, dass eine spätere Vermessung möglich ist.
Die grundsätzliche Idee der Erfindung basiert auf der Vermessung von Peptiden/Proteinen an deren C-Ende, N-Ende, deren modifizierten Stellen, und in ihrer Gesamtheit (Vergleich mit gängigen γlFN-Assays) mit spezifischen Antikörpern, die derart markiert sind, daß eine spätere Vermessung möglich ist.
Die Erfindung führt zu neuen Verfahren zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen, zum Nachweis von aktivem γlFN (Interleukinen, Cytokinen) und dessen Abbauprodukten/Metaboliten im Blut, in Plasma, in Serum-(Kö er)flüssigkeiten, in Geweben, sowie zur Abtrennung von aktivem γlFN (Interleukinen, Cytokinen) und dessen Abbauprodukten/Metaboliten aus diesen Medien. Mit den Ergebnissen dieser Verfahren können in vorteilhafter Weise Therapien von I ranldieitsbildeπi/Stoffwechselerkrankuiigen (Urtikaria, Allergien, Leukämien, Thrombosen, Artheriosklerosen, Rheuma, Rheumatoide Arthritis, u.a.m.) sowie Therapien von Krankheits- bildern/Stoffwechselerl rankungen, die mit der Anwesenheit von aktivem γlFN (Interleukinen, Cytokinen) und dessen Abbauprodukten/Metaboliten verbunden sind, entwickelt, ausgewählt, erleichtert oder verbessert werden.
Weiterhin ermöglicht die vorliegende Erfindung eine Bestimmung von Peptiden/Proteinen, zum Ersatz von aktivem γlFN (Interleukinen, Cytokinen) und dessen Abbauprodukten/Metaboliten bei fehlender Menge zum Normalwert. Auch insofern liefert die vorliegende Erfindung positive Beiträge für die Entwicklung, Auswahl, Erleichterung und Verbesserung von Therapien von Krankheitsbildem/Stoffwechselerkrankungen, die mit dem Fehlen von aktivem γlFN (hiterleukinen, Cytokinen) und dessen Abbauprodukten/Metaboliten verbunden sind, und gleichzeitige (verhältnismäßige) Nachweise der verschiedenen γlFN/Interleukine, Cytoki- ne (Peptide/Proteine) zueinander sowie Rückschluß auf die Wirkung dieses speziellen Moleküls am Stoffwechselgeschehen sowie an der Auslösung oder Therapie von Entgleisungen.
Die Erfindung liefert ferner Beiträge zur Erklärung der Wirkung von γlFN (11-4, II 's, Cytoki- nen)-Peptiden/Proteinen auf die Therapie verschiedener Antitumor Drugs/Antagonisten-Ago- nisten (Cyt P 450 System u.a.) zur Erklärung der Änderung des Redoxpotentials u.a.m.
Gemäß einer bevorzugten und vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist bei dem Verfahren ferner vorgesehen, dass an den Antikörpern eine Nachweismöglichkeit (defection device) angekoppelt wird, die es erlaubt, über deren Konzentration die Menge der Antikörpermolekü-
le und damit die der unbekannten zu bestimmenden Molekülmenge qualitativ und/oder quantitativ zu bestimmen.
Eine andere bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung, wie vorstehend erläutert, sieht vor, dass die Nachweismöglichkeit oder Defection Device ausgelegt ist, die zu messende Konzentration so zu vervielfältigen oder amplifizieren. Die kann dadurch weitergebildet werden, dass entweder die Nachweismöglichkeit oder Defection Device selbst sehr groß ausgelegt wird und insbesondere in kleinere vorzugsweise gleiche Teile so zerlegt werden kann, dass deren Konzentration als bekannt vorausgesetzt und/oder leicht gemessen werden kann, oder dass die Nachweismöglichkeit oder Defection Device selbst so vervielfältigt oder amplifiziert werden kann, dass eine Vermessung leicht mit bekannten Methoden möglich ist.
Im Rahmen eines weiteren Aspektes der vorliegenden Erfindung betrifft diese auch Massenspektrometrie für Metalle oder allgemein Metallbestimmung, und zwar im Form eines Mas- senspektrometers und eines Verfahrens zur Metallbestimmung mit einem Massenspektrometer.
Ausgangspunkt für diesen Aspekt der Erfindung ist die herkömmliche Massenspektrometrie, bei der eine organische Probe in der Kammer des Massenspektrometers mit Elektronen oder einem LASER beschossen wird. Die dadurch entstehenden positiv geladenen Kationen werden über ein Magnetfeld nach Masse und Ladung getrennt und mit einem Detektor aufgenommen. Diese herkömmliche Massenspetrometrie ist auf leicht flüchtige Substanzen angewiesen.
Das Problem dieses herkömmlichen Massenspektrometers besteht deshalb darin, daß Metalle oder Metallsalze mit dieser Methode bisher nicht untersucht werden können. Entsprechend dem diesbezüglichen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es deren Ziel, Massenspektrometrie auch für Metalle oder Metallsalze zu ermöglichen.
Dazu schafft die vorliegende Erfindung ein Massenspektrometer, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Trägergasquelle, insbesondere eine CO-Quelle, vorgesehen ist, um eine Probe mit Trägergas, entsprechend insbesondere CO, zu beschießen, oder dass ein Enzymlösungsbe- hälter mit/für eine Enzymlösung zur Reaktion mit wenigstens einem Metall vorgesehen ist.
Das erfindungsgemäße Ziel wird somit dadurch erreicht, dass die beispielsweise herkömmlich übliche Elektronenquelle durch eine CO-Quelle oder allgemein Trägergasquelle ersetzt wird, wobei insbesondere metallhaltige Fluide in eine Probenkammer eingebracht werden. Die Trä-
gergasquelle oder insbesondere CO-Quelle bewirkt, daß die in den Fluiden enthaltenen Metalle in Karbonyle verflüchtigt und damit vom Detektor aufgenommen werden können.
Weiterhin schafft die Erfindung im Rahmen dieses Aspektes ein
Metallbestimmungsverfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Probe mit Trägergas, insbesondere CO, von einer Trägergasquelle, entsprechend insbesondere einer CO-Quelle, beschossen wird, oder dass eine Enzymlösung mit wenigstens einem Probenmetall reagiert.
Vorzugsweise werden im Rahmen dieses Verfahrens metallhaltige Fluide in eine Probenkammer eingebracht. Die Trägergas- oder insbesondere CO-Bestrahlung oder der Trägergas- oder insbesondereCO-Beschuss bewirkt, daß die in den Fluiden enthaltenen Metalle in Karbonyle verflüchtigt und damit vom Detektor aufgenommen werden können.
Gemessen werden sollen vor allem anorganische Kationen, Pt (2+), Pd (2+), Ni (2+), inkl. Diese Metalle können in niederer Konzentration mit den zur Zeit gängigen Methoden (AAS, usw.) nicht oder nur unzureichend vermessen werden. Interessant ist die Vermessung dieser Metalle vor allem im Hinblick auf verschiedene Umwelterkrankungen, wie Kontaktdermatitis, Asthma oder BSE, sowie das Ozonloch und den Treibhauseffekt.
Diese Metalle weisen normalerweise einen kleinen Dampfdruck auf. Es wird die Tendenz dieser Metalle zur Bildung flüchtiger Carbonyle ausgenutzt, womit diese Metalle im Massenspektrometer detektierbar werden. Autoabgase können damit dann ebenfalls direkt vermessen werden, womit die Vorrichtung und Methode für technische Überprüfungen von Kraftfahrzeugen, wie in Deutschland den TÜV, geeignet sind, ebenso athmosphärische Metalle und Verbindungen (Komplexe) sowie auch Organika u.a. mehr.
Insbesondere sind das erfindungsgemäße Massenspektrometer und Massenbestimmungsverfahren dafür ausgelegt, die Konzentration der Metalle durch die Bestimmung von enthaltenen und/oder entstehenden Peptide, Aminosäuren, etc., zu ermitteln. Vorzugsweise, jedoch nicht beschränkt darauf erfolgt dies mittels z.B. PCR-Reaktion oder den Methoden, die vorstehend gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden erfindung beschrieben sind.
Bei einer anderen Variante der Erfindung im Zusammenhang mit der Massensprktrometrie können die Metalle auch mittels enzymatischer Reaktion bestimmt werden. Dazu werden diese Metalle in entsprechende Enzymlösungen eingetragen, welche spezifisch mit diesen Metallen reagieren, d.h. aktiviert werden (z.B. Nickel aktivierte Horse radish Peroxidase, Me-Pro- teasen, Superoxiddismutase, Glutathione-Peroxidase, usw.).
Im Rahmen noch eines weiteren Aspektes der vorliegenden Erfindung betrifft diese auch Leitfähigkeitsmessung und Leitfähigkeitsfeststeller.
Bekannt ist ein Biosensor mit zwei Elektroden, an denen eine konstante Spannung anliegt. Auf die Eletroden werden beispielsweise Blutzellen gegeben, wobei die Widerstandsänderung bei Zugabe der Zellen auf die Elektroden gemessen wird. Zusätzlich kann auch die Zellaktivität gemessen werden, wenn die Blutzellen sich bereits auf den Elektroden befinden und zusätzliche Stoffe zugegeben werden. Mit dieser Methode kann allerdings keine Messung von noch lebenden Zellen durchgeführt werden. Hierbei muß beachtet werden, daß Zellen nach Blutentnahme noch ca. eine halbe Stunde unter In-vivo-Bedingungen meßbar sind. Der dritte Aspekt dxer vorliegenden Erfindung hat und erreicht das Ziel, bei diesem Nachteil Abhilfe zu schaffen.
Eine erfindungsgemäße Leitfähigkeitsmessung ist dadurch gekennzeichnet, dass eine Blutprobe in einen Meßtubus eingeführt wird, der von einer Vielzahl von Elektroden umgeben ist, und dass die Elektroden nach einem vorgegebenen Schema kreuzweise mit einem Frequenzgenerator angesteuert werden. Bei einem Leitfähigkeitsfeststeller nach der Erfindung ist vorgesehen, dass für die Einführung einer Blutprobe ein Meßtubus vorgesehen, der von einer Vielzahl von Elektroden umgeben ist, die nach einem vorgebbaren Schema kreuzweise mit einem Frequenzgenerator ansteuerbar sind.
Die Erfindung im Rahmen des hier behandelten Aspektes somit besteht darin, die Blutprobe in einen Meßtubus einzuführen, der von einer Vielzahl von Elektroden umgeben ist. Die Elektroden werden nach einem bestimmten Schema kreuzweise mit einem Frequenzgenerator angesteuert. Mit dieser Methode ist es beispielsweise möglich, bestimmte Redox-Zustände zu messen, insgesamt ist es möglich, die individuelle Reaktion des Patienten auf bestimmte Zugabestoffe zu messen.
Weitere vorzugsweise und oder vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen und deren Kombinationen sowie insbesondere auch aus den gesamten vorliegenden Unterlagen, in denen weitere kombiniert oder alleine schutzfähige und schutzwürdige Ausgestaltungen offenbart sind.
Anhand der nachfolgend beschriebenen und in den Zeichnungen dargestellten Ausfuhrungsund Anwendungsbeispiele wird die Erfindung näher erläutert. In der Zeichnung zeigen:
Fig. 1 ein Molekül mit Modifikationsstellen am Besipiel von γlFN im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen,
Fig. 2 ein Molekül, dem der N-terminus fehlt, am Besipiel von γlFN im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen,
Fig. 3 ein Ausführungsbeispiel eines Proteins, Peptids oder γlFN mit Antikörper mit einer Defection Device als Nachweismittel, im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen,
Fig. 4 ein weiteres Ausführungsbeispiel eines γlFN mit Antikörper mit einer Defection
Device als Nachweismittel in Verbindung mit einem Biochip, im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen,
Fig. 5 eine diagrammartige Darstellung der Abtrennung der Defection Device als Nachweismittel, im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen,
Fig. 6 ein Ausführungsbeispiel eines Umwandlungsschrittes im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen,
Fig. 7 ein Ausführungsbeispiel eines Nachweisschrittes im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen,
Fig. 8 ein Ausführungsbeispiel eines Berechnungsschrittes im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen,
Fig. 8a eine Ausfuhrungsvariante gemäß Fig. 8, jedoch speziell für ein fehlendes N-Ende,
Fig. 9 ein Ausführungsbeispiel eines Auswertungsschrittes im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen,
Fig. 10 zwei weitere Ausführungsbeispiele von Verfahrensvarianten im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen,
Fig. 11 noch Ausfuhrungsbeispiele von Verfahrensvarianten im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen,
Fig. 12 noch ein Ausfülirungsbeispiel von Verfahrensvarianten im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen,
Fig. 13 schematisch den Aufbau eines herkömmlichen Massenspektrometers,
Fig. 14 schematisch den Aufbau eines Massenspektrometers mit den erfindungsgemäßen Ausgestaltungen und Anordnungen,
Fig. 15 ein Massenspektrogramm von Äthanol,
Fig. 16 einen angenommenen Massenpeak von Pt 2+,
Fig. 17 schematisch zwei Ausführungsbeispiele einer Leitfähigkeitsmeßzelle, und
Fig. 18 schematisch ein Ausführungsbeispiel eines Frequenzgenerators.
Gleiche Bezugszeichen in den einzelnen Figuren und Abbildungen der Zeichnungen bezeichnen gleiche oder ähnliche oder gleich oder ähnlich wirkende Komponenten. Anhand der Darstellungen in der Zeichnung werden auch solche Merkmale deutlich, die nicht mit Bezugszeichen versehen sind, unabhängig davon, ob solche Merkmale nachfolgend beschrieben sind oder nicht. Andererseits sind auch Merkmale, die in der vorliegenden Besclireibung enthalten, aber nicht in der Zeichnung sichtbar oder dargestellt sind, ohne weiteres für einen Fachmann verständlich.
Einzelne Merkmale, die im Zusammenhang mit konkreten Ausführungsbeispielen angeben und/oder dargestellt sind, sind nicht auf diese Ausführungsbeispiele oder die Kombination mit den übrigen Merkmalen dieser Ausführungsbeispiele beschränkt, sondern können im Rahmen des technisch Möglichen, mit jeglichen anderen Varianten, auch wenn sie in den vorliegenden Unterlagen nicht gesondert behandelt sind, kombiniert werden.
In den Fig. 1 bis 12 wird ein erster Aspekt der Erfindung zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen anhand von Ausfuhrungsbeispielen näher erläutert.
Die Fig. 1 zeigt ein Molekül, wie γlFN (identisch mit der Schreibweise gIFN), mit verschiedenen Modifikationsstellen, wobei 0. dem ganzen aktiven Molekül, 1. bis 3. den Abbauproduk-
ten und 4. bis 6. den Modifikationsstellen entspricht. Die Fig. 2 zeigt ein Molekül, wie gIFN, dem der N-terminus fehlt.
Nachfolgend wird der Aspekt der Erfindung betreffend die Bestimmung von Peptiden/Proteinen anhand eines Ausführungsbeispiels für die Vermessung in Blut, Plasma, Serum, Flüssigkeiten unter Darstellung mehrerer Lösungsmöglichkeiten für die Erreichung des Zieles näher erläutert.
Unter Bezugnahme auf die Fig. 3 wird ein monoklonaler Antikörper AK spezifisch für das C- Ende zu der Probe addiert. Daraufhin wird für einige Minuten geschüttelt. Diesem Antikörper AK ist eine Nachweismöglichkeit DD (= Defection Device) angekoppelt, die es erlaubt, über deren Konzentration die Menge der Antikörper-Molelcüle AK und damit die der unbekannten zu bestimmenden Molekühnenge (Protein, Peptide etc.) qualitativ und quantitativ zu bestimmen.
Antikörper AK sind vorzugsweise käuflich zu erwerben oder neu herzustellen. Das Prinzip gilt insbesondere für jedes zu messende Protein (Molekül), modifiziert oder verändert. Insbesondere ist bei dem gezeigten Beispiel in der Fig. 3 der Normalwert von γlFN (identisch mit der Schreibweise gIFN) = 50 - 500 U/ml Blut = 2,5 - 25 ng/ml Blut.
Da die unbekannte zu messende Konzentration der Verbindung, die modifiziert, abgebaut, usw. ist und der z.B. ein N-terminales Ende oder ein C-terminales Ende fehlt, hier für γlFN (identisch mit der Schreibweise gIFN), im femto- oder nanogramm Bereich (fg oder ng-Be- reich) oder kleiner erwartet wird, ist die entsprechende Nachweismöglichkeit oder Defection Device DD vorzugsweise in der Lage, die zu messende Konzentration so zu vervielfältigen oder amplifizieren, dass die Messung der unbekannten Konzentration leicht beispielsweise auch in normalen Blutproben möglich ist. Dazu kann bei dem Bestimmungs verfahren für Peptide/Proteine vorgesehen sein, dass die Nachweismöglichkeit oder Defection Device DD selbst sehr groß ausgelegt wird und insbesondere in kleinere vorzugsweise gleiche Teile so zerlegt werden kann, dass deren Konzentration als bekannt vorausgesetzt und/oder leicht gemessen werden kann. Bei einer anderen Variante kann vorgesehen sein, dass diese Nachweismöglichkeit oder Defection Device DD selbst so vervielfältigt oder amplifiziert werden kann, dass eine Vermessung leicht mit bekannten Methoden möglich wird z.B. durch eine nachgeschaltete PCR-Reaktion. Die Nachweismöglichkeit oder Defection Device DD kann dann ein Magnetpartikel, eine RNA, eine DNA, ein Polylysin, ein Polysaccharid, ein Polypeptid, etc., sein, welches über PCR, magnetisch, elektrisch, elektrophoretisch (Blotting), gekoppelte
Farbstoffe (UV, IR, Lumineszenz, Fluoreszenz, usw.) leicht qualtitativ und quantitativ vermessen werden kann.
Eine gekoppelte DNA oder RNA ist z.B. leicht in die Bestandteile zu zerlegen. Lediglich exemplarisch, aber mit Vorteil ist beispielsweise für die Vermessung einer unbekannten Menge an modifizierten γlFN (identisch mit der Schreibweise gIFN), sind z.B. käufliche Poly-(Ad) oder Poly-(G; T; C)-Ketten (-Knäuel) geeignet, die mit einer beliebigen Kopplungsmethode an einen Antikörper AK im Rahmen der Erfindung zu koppeln wären. Diese Kopplungsmethoden werden z.B. in der DNA-Chip-Technologie routinemäßig benutzt zur Kopplung dieser Verbindungen an den Biochip (siehe Fig. 4). Dieser Komplex kann in der Probe (Blut etc.) nun direkt und/oder nach entsprechendem Abtrennen oder Waschen (Zentrifugation, DC-Plat- te, Säule- mittels u.a. polyklonaler AK's gegen das Gesamtmolekül sowie Verdauung des Gesamtmoleküls durch Proteasen, Peptidasen) nachgewiesen werden.
Hierzu ist in der Fig. 5 ein Beispiel angegeben. DD∞ = Poly(Ad)∞ ist über eine Chip- oder eine Mikrotiterplatte (oder andere Möglichkeiten) durch z.B. Hybidisierung über (T) bedeckte/belegte Oberflächen leicht aus der Probe zu isolieren oder abtrennen.
Der Nachweis wird mittels markierter Nukleotide, 125 J- Antikörper, etc. radioaktiv durchgeführt. Oder aber der Nachweis wird mittels gekoppelter PCR-Reaktion oder aber nach Verdauung der DNA-, RNA-, Poly(A)- (Ketten) mittels Säuren-Basen, DNAasen, RNAasen, En- donukleasen etc., mit anschließendem Enzym. Nachweis der freigesetzten Nukleotide durchgeführt (1. Verdauung mit gängigen Methoden zu Monophosphaten).
Weiterhin liegt im Rahmen des erfindungsgemäßen Peptid/Protein-Bestimmungsverfahrens eine Umwandlung mit Pi-Transferasen zu Di- und Triphosphaten, z.B.
- mit Phosphorsäuren, Polyphosphaten zu Diphosphaten, mit Kinasen zu Triphosphaten; oder
- mit Adeylatkinasen zu Diphosphaten, e.g. mit Myokinasen zu Diphosphaten (vgl. Fig. 6).
Der Nachweis der entstandenen Triphosphate/ATP erfolgt nun beispielsweise mittels nachgeschalteter enzym. (ATPase-) Messung mittels Biolumineszens (Luciferase/Luminometer). Ebenfalls ist eine Messung über die Kinasen- Aktivität möglich. Die sensitivste Methode ist aber die Vermessung mittels gekoppelter Luciferase über Lumineszenz. Der Nachweis ist auch möglich über mit Fluoreszenz-Farbstoff-markierter RNA-F, DNA-F, polyNu-F (polyly- sin-F, polysaccharid-F, etc.) (vgl. Fig. 7).
Die Konzentrationsberechnung erfolgt z.B. gemäß der Ausführung entsprechend der Darstellung in der Fig. 8 als Verfahrensbestandteil I. Weiterhin gilt als Verfahrensbestandteil II. für C-Terminus fehlend: analog L, aber mit einem Antikörper AK speziell für das N-Ende gemäß Fig. 8a. Für fehlendes X, Y, (S) Z = Zucker gilt ein Verfahrensbestandteil HI. analog I. mit Antikörpern AK speziell für diese modifizierten Moleküle, usw. Ein Verfahrensbestandteil IV. gilt für das modifizierte Molekül (γlFN (identisch mit der Schreibweise gIFN)) mit po- liklonalen Antikörpern AK gegen das modifiziere Molekül. Ein Verfahrensbestandteil V. ergibt für das ganze Molekül als Kontrolle = 0.
Resultat: Qualität und Quantität - 0. = unverändertes ganzes Molekül 1. - 3. Abbau-Produkte/Moleküle 4. - 6. modifizierte Produkte/Moleküle
z.B.: 0./1. Und 3. γlFN (identisch mit der Schreibweise gIFN) (Konz.)
Die Auswertung erfolgt analog Fig. 9 unter Anwendung entsprechender Mathematik und (Computer)-Berechnung anhand der erhaltenen Kurven, Werte und/oder auch mittels Kompe- titivem Assay!
Wenn bekannt ist, daß z.B. bei γlFN (identisch mit der Schreibweise gIFN) nur ein Ende fehlt => I + π ergibt: abgebaut + abgebaut plus (gesamtes) ganzes γlFN => Diff. = Intaktes γlFN
Für die verschiedenen nachzuweisenden Moleküle, wie γIFNc, γIFNN, γIFNx, γIFNY, γIFNz können verschiedene Nachweismöglichkeiten oder Defection Devices DD, oder anders ausgedrückt insbesondere Amplifier benutzt werden, was eine weitere Vereinfachung bringt: Für γIFNc = gIFN = (Ad)poly, γIFNN = gIFN = (T)poly, γIFNx = gIFN = (G)poly, γTFNY = gIFN = (C)poly, γIFNz = gIFN = usw. Die Oberflächen werden mit den entsprechenden Gegennukleotiden gekoppelt, so daß die Hybridisierung stattfinden kann. Dann erfolgt ebenso der Nachweis, wie aufgezeigt (Fig. 10). Damit kann insbesondere realisiert werden vom einfachen ELISA zur Platte zum Chip = Proteinchip. Die Variante a) in der Fig. 10 betrifft eine Mikrotiterplatte, etc. zur Trennung oder
zum Nachweis. Die Variante b) in der Fig. 10 betrifft einen Chip, einen Schlauch (vorteilhaft z.B. bei der Dialyse) oder eine Säule, etc. zur Trennung oder zum Nachweis.
Nachweise der Polypeptide erfolgen nach Verdauung über gängige Assays, wie z.B. mit Nin- hydrin (Edman- Abbau, usw.). Nachweise der Polyzucker, wie z.B. Chitisan, erfolgen durch Koppeln mit z.B. Farbstoffen, Abbau mit Chitobiose-Chitobiase, Nachweis wie beschrieben (Chelate, Flockungsmittel für Metalle).
Eine weitere Möglichkeit der Bestimmung des Komplexes, wie z.B. die weiter oben erläuterte Version mit DNA oder RNA wird mittels Atomic Force Mikroskopie (AFM)-Titration erreicht (vgl. Fig. 11). Hier werden die isolierten markierten Komplexe (eine Abtrennung ist auch über eine Immunfällung möglich) direkt aus den Trennsäulen, mittels Nanopipetten, usw. auf einen geeigneten Probenträger (Glas, Papier, Nylon, etc.) aufgebracht und zwar so, daß eine Reihe von Spots mit aufsteigender Konzentration entsteht, die nach Antrocknung (+-Fixierung mit z.B. Formalin, Kopplung mit Isothiocyanaten, Epoxy (-D3), NHS, usw.) mittels CCD-Kamera, Scintilationszähler, usw. und/oder mittels einer AFM-Nadel orthographisch vermessen und integriert werden können. Mit entsprechenden Standards kann dann eine direkte Konzentrationszugehörigkeit zur unbekannten Probe vorgenommen werden. Es ist damit möglich einige wenige Komplexe (Moleküle) direkt nachzuweisen und auf deren Konzentration in der ursprünglichen Probe (Blut, Serum, Plasma, etc.) zurückzurechnen.
Nachfolgend wird noch ein Ausführungsbeispiel betreffend Collagenase, Gelatinase- Aktivitätsnachweis im Blut, Serum, etc. erläutert. Addiere die Proteasen (u.a. MMP-l^Collagenase, MMP-2=GelatinaseA, MMP-3 (Stromelysin 1) und MMP-9 (Gelatinase B)
1. zur Probe und Kontrolle, inkubiere für bestimmte Zeitintervalle und messe anschließend mit den beschriebenen Methoden die Konzentration der Cytokine, Interferone, etc. (γlFN, Interleukin-l(ß), IGF BPs, IGFI usw.)
2. zur Probe oder Kontrolle mit Inhibitor oder Aktivator der Protenasen zur Vermessung der Wirkung der Inhibitoren oder Aktivatoren = zum Screenen von neuen Inhibitoren oder Aktivatoren = Therapie Kontrolle für diese Wirkstoffe zur Testung der Aktivität der Proteasen selbst und/oder zum Nachweis der Proteasen- Wirkung zum Nachweis der Cytokin- Wirkung, Nachweis der Wirkung auf die Zeil-Oberfläche und deren Rezeptoren (Befreiung von z.B. TNF-α und FasL (MMP-7)).
Es ist auch eine Kombination der verschiedenen Assays auf einer Mikrotiterplatte oder auf einem Biochip möglich.
Weiterhin besteht die Möglichkeit der Bestimmung der verschiedenen Proteine, Peptide mittels monoklonalen Antikörpern gegen diese verschiedenen Moleküle, die an Glas, -Chip, Nylon, Gold, also irgendeinen geeigneten Träger gekoppelt sind. Diese Moleküle werden so aus den Proben (Blut, Seren, Plasmen, etc.) herausgefiltert. Zugabe von polyklonalen Antikörpern mit den Nachweismöglichkeiten oder Defection Devices DD, Waschen und Zugabe von Pep- tidasen, Proteasen, führt wiederum, wie beschrieben, zur Bestimmung der unbekannten Moleküle (vgl. Fig. 12).
Das Abtrennen und Zählen der Partikel-Nachweismöglichkeiten oder -Defection Devices DD ist auch über die Flow-Cytometrie möglich. Dies gilt allgemein für die bis hierher beschriebenen Methoden.
Die direkte Abtrennung von "defekten" Molekülen, ein Zuviel an Molekülen in den beschriebenen biologischen Systemen (Personen, Tieren, etc.), ist über angeschlossene Dialyse-Systeme oder entsprechende Bypass-Systeme (die z.B. direkt in den Blutkreislauf implantiert werden ) mit den beschriebenen Methoden möglich.
Nachfolgend werden Ausführungsbeispiele zum zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung betreffend Massenspektrometrie unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert.
Die Fig. 13 zeigt den Aufbau eines herkömmlichen Massenspektrometers 1 mit einer Elektronenquelle 2, einem Beschleuniger 3, insbesondere mit negativem Potential, einem Magneten 4, einem Spalt 5 sowie einem Auffanggefäß 6. Weiterhin sind gezeigt eine Leitung 14 zu einer Vakuumpumpe (nicht gezeigt) und eine Zuführung 15 für eine Probe (nicht gezeigt).
Die Fig. 14 zeigt die Darstellung eines Massenspektrometers analog Figur 1 mit den erfindungsgemäßen Ausgestaltungen und Anordnungen: Ventil/Schalter 7, heizbarer Probenraum mit Ofen 8, (Luft, Gas-)CO-Quelle/Reservoir 9, Ventil 10 sowie Ventil 11 (Drei- Wege-Ventile).
Von besonderem Vorteil ist bei der vorliegenden Erfindung, dass ein herkömmliches Massenspektrometer mit den erfindungsgemäßen Merkmalen erweitert werden kann und damit einen optimalen Funktions- und Wirkungsumfang zum Einsatz für jegliche Messungen bietet. Bei einer solchen Ausführung ist die Elektronenquelle 2 entsprechend der schematischen Darstellung in der Fig. 14 mittels des Ventils/Schalters 7 abschaltbar und der beheizbare Probenraum mit Probe 8 und CO (Luft, Gas, Trägergas) -Quelle 9 mittels Ventilen (insbesondere Dreiwegeventilen) 10 und 11 an das Massenspektrometer 1 anschließbar. Ebenso sind Abgase
(Luft, Atmosphäre, Autoabgase) über das Ventil 11 zuführbar. Der beheizbare Probenraum 8 ist mittels eines Verschlusses 12 zu öffnen und mit einem Probenträger/einer Probe 13 beladbar.
Alternativ oder zusätzlich kann vorgesehen sein, dass der Probenraum 8 mit der Probe, wie z.B. Blut oder anderen metallhaltigen Fluiden unter Zuhilfenahme des Verschlusses 12 beladen werden kann. Weiter kann vorgesehen sein, dass die CO-Quelle 9 sowie der Probenraum 8 mit der Probe 13 über die Ventile 10 und 11 mit dem Massenspektrometer 1 verbunden werden. Die Probe wird im beheizbaren Probenraum aufgeheizt (z.B. auf 300°C), wobei sich flüchtige Metallcarbonyle bilden, die mittels Vakuumpumpe und Beschleuniger 3 durch den Magneten 4 sowie den Spalt 5 in das Auffanggefäß 6 gelangen, nachdem sie detektiert wurden. Abgase, wie z.B. Autoabgase, Luft, Atmosphäre, usw. werden über Ventil 11 direkt in das System eingeleitet und vermessen/detektiert.
Zur Eichung wird eine bekannte Menge an Me-Carbonyl, oder Me plus CO unter identischen Bedingungen eingegeben und vermessen, und zwar mit oder ohne die unbekannte Probe: Eichung: I) bekannte Menge Me-Carbonyl
II) bekannte Menge Me plus CO
Uf) unbekannte Probe
IV) unbekannte Probe plus bekannte Menge an Me
Die Detektionsgrenze liegt vorzugsweise in der Nähe von 0,1 pmol/μl Probe.
Die Fig. 15 zeigt als Beispiel das Massenspektrogramm von Äthanol. Die Fig. 16 zeigt als Beispiel den angenommenen Massenpeak von Pt 2+.
Analog zur Bildung und Vermessung von flüchtigen Metallcarbonylen können auch andere flüchtige Metallverbindungen in diesem beschriebenen System, nach Austausch der CO-Quelle gegen andere Gase/Trägergase, gebildet und vermessen/detektiert werden. So sind damit auch atmosphärische Gase, Metallverbindungen, -komplexe leicht detektierbar. Das heißt, kompakte Leichtbaugeräte können mittels meteorologischen Wettersonden (Radiosonden) und deren Auswertegeräten (Bodenstationen) für Zustands großen der Luft in Höhen bis z.B. 45 km eingesetzt werden und ein Zustandsbild der Atmosphäre liefern. Zusammen mit den Bodenmessungen ergibt sich so ein Gesamtzustand unserer Lufthülle mit Austausch. Der Einfluß der Metalle auf die Entstehung des O3 -Loches, sowie der Entstehung des Treibhauseffektes kann damit exakt vermessen und bestimmt werden. Schuld an diesen Effekten haben u.a. diese in die Atmosphäre geblasenen Metalle, was hiermit leicht und kostensparend nachgewiesen
werden kann. Der Einsatz von ICP-MS-Geräten, welche sehr kostenintensiv und aufwendig sind, wird damit überflüssig.
Die Metalle können auch mittels enzymatischer Reaktion bestimmt werden. Dazu werden diese Metalle in entsprechende Enzymlösungen eingetragen, welche spezifisch mit diesen Metallen reagieren, d.h. aktiviert werden (z.B. Nickel aktivierte Horse radish Peroxidase, Me-Pro- teasen, Superoxiddismutase, Glutathione-Peroxidase, usw.). Die Bestimmung der entstehenden Peptide, Aminosäuren, etc., mittels z.B. PCR-Reaktion oder den Methoden die weiter oben beschrieben wurden, ergibt die Konzentration der Metalle. Auch die spezifische Inakti- vierung verschiedener Enzyme, durch diese Metalle kann zur Bestimmung der Metalle benutzt werden (und umgekehrt), es sind dies Proteasen, Peptidasen, Transferasen, usw.
Durch Mutation und Rekombination können für einzelne Metalle spezifische Enzyme kombiniert und hergestellt werden, welche nur mit einem bestimmten Metall reagieren und damit zu deren Bestimmung geeignet sind. Sofern diese Enzyme einen Chromophor tragen, welcher sich dabei in seinen Eigenschaften ändert, kann die Konzentration des Moleküls hiermit direkt vermessen werden:
Eine Mikrotiterplatte (z.B. ein Chip, etc.), die mit Glutathion, Metallothionin, Transferrin, Ferritin, Dextrin (oder einem anderen Chelatbildner, Fusionsprotein, etc.) bedeckt ist, bindet z.B. Nickel aus einer Probe (Flüßigkeit, Luft, u.a.) (1), eine rekombinante Horse radish Peroxidase wird aktiviert (2), und kann mittels Substraten, wie z.B. Polyhistidin und PCR (u.a.)-Detektion die Konzentration von Nickel in der Probe ergeben.
Aeroallergene, wie Metallionen, können über B SA-Filter/Säulen angereichert werden und in/aus diesen Filtern/Säulen dann mit den beschriebenen Methoden detektiert werden.
Zur Bestimmung dieser Ionen kann dann auch ein Leitfähigkeitsfeststeller dienen, wie er nachfolgend im Zusammenhang mit noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung erläutert wird. Insbesondere werden dabei durch Me-Ionen definiert Redoxpotentiale in biol. Systemen, u.a., vermessen.
Nachfolgend werden Ausführungsbeispiele zum dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung betreffend Leitfähigkeitsmessung und Leitfähigkeitsfeststeller unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert.
Die Erfindung im Rahmen dieses Aspektes besteht darin, eine Blutprobe in einem Meßtubus einzuführen, der von einer Vielzahl von Elektroden umgeben ist. Die Elektroden werden nach einem bestimmten Schema kreuzweise mit einem Frequenzgenerator angesteuert. Mit dieser Methode ist es beispielsweise möglich, bestimmte Redox-Zustände zu messen, insgesamt ist es möglich, die individuelle Reaktion des Patienten auf bestimmte Zugabestoffe zu messen.
Die Entwicklung dieser Redox-Meßzelle/-Leitfähigkeitsmeßzelle ermöglicht die äex vivo" (in vivo)- Vermessung des Potentials über einer (biol.) Probe, Blutprobe (Zelle(n), über Zellbestandteilen, Membranen - Mitochondrien, Bakterien (etc.), Zellkernen-Cytosol, Lösungen; Blut und dessen Bestandteilen/Serum, Plasma; etc., mit und ohne verschiedene Verbindungen, unter verschiedenen Behandlungen, Bedingungen.
Die Fig. 17 zeigt ein Bespiel für den Aufbau einer Leitfähigkeitsmeßzelle 100 mit Elektroden 102, einer Öffnung 103, sowie Zuleitungen 104 für einen Frequenzgenerator 105 (Fig. 18).
Die Leitfähigkeitsmeßzelle 100 wird in Kugelfönn (Fig. 17, Beispiel a)) ausgelegt, wobei eine Seite für die Addition verschiedener Substanzen, Zusatzstoffe, etc., offen ist. Das innere Gesamtvolumen der Leitfahigkeitsmeßzelle 100 beträgt vorzugsweise ca. 0,5 ml betragen. Geeignetes Elektrodenmaterial wäre z.B. Gold. Ein elektromagnetisches Drehfeld, insbesondere konstant zirkulierend und/oder oszilierend, wird mittels des Frequenzgenerators 105 (Fig. 18) erzeugt.
Alternativ ist die Leitfahigkeitsmeßzelle 100 in Durchlaufform (Fig. 17, Beispiel b)) ausgelegt, wobei die Leitfahigkeitsmeßzelle 100 für den Durchlauf von Flüssigkeiten (wie z.B: Blut) oben und unten offen ist. Öffnungen 103 und 107 sind mit einem Netz 106 und 108 versehen. Die Leitfahigkeitsmeßzelle 100 kann als Perfussionszelle benutzt werden.
Es werden vorzugsweise mindestens 2 Leitfähigkeitsmeßzellen 100 in Serie geschaltet, wobei mindestens eine Leitfahigkeitsmeßzelle 100 als Kontrolle fungiert. Ein Computer (PC) kontrolliert Spannung/Strom sowie den Widerstand und sorgt gleichzeitig für den Wechsel zwischen den Meßzellen innerhalb eines Experiments.
Die Fig. 18 zeigt in einem groben Meßaufbau die Kopplung der Leitfahigkeitsmeßzelle 100 an den Frequenzgenerator 105 über die einzelnen Elektroden 102. Wobei die jeweils gegenüberliegenden Elektroden als Elektrodenpaare (plus und minus) an den Generator 105 angekoppelt sind. Insgesamt sind 4 solcher Elektrodenpaare vorhanden, die so an den Generator angeschlossen sind ( Ij bis L). Die Strom-/Spannungsermittlung erfolgt per PC 110, und aus diesen
Ergebnissen wird die Impedanz R = UJ/IJ (Gleichstromwiderstand) ermittelt. Der Strom wird durch die Stromquelle (105) konstant gehalten (z.B. bei 1mA), so daß nur die Spannung vom PC aufgezeichnet werden muß. Es wird ein repräsentativer Kanal in die Messung aufgenommen (Ui). Der Frequenzgenerator 105 arbeitet als Stromquelle mit 4 Ausgangskanälen (IJ bis L) dessen Strom- bzw. Spannungs-Phasen jeweils um 90° verschoben sind (ij bis i4, mit Oi bis O4, 11) was zu einem Drehfeld führt, das zur Stabilisierung der Probe dient. Zur Verstärkung der Signale/der Spannung Ui wird vor den Computer 110 ein Verstärker 109 zum Abgriff der Spannung Uj am Frequenzgenerator 105 zwischengeschaltet. Mit bekannter Zell-/Partikelzahl in der Leitfahigkeitsmeßzelle 100 kann das Verhalten (Redox, usw.) einer einzelnen Spezies in der Meßzelle ausgemessen werden.
Es kann die Vermessung verschiedener Redoxpotentiale (wie Fe2 Fe3+; Ascorbat; Glutathion, Aminosäuren, etc.) erfolgen und damit standartisiert werden für die Ausmessung der einzelnen (Zellen)Biosysteme u.a. auch von Prionen-Proteinen, in Abhängigkeit verschiedener Bedingungen (Bezug zu BSE, Kreutzfeld- Jakob), von Allergien, Asthma in Bezug zur Addition/Wirkung von Metallen, ROS.
Die Erfindung ist anhand der Ausführungsbeispiele in der Beschreibung und in den Zeichnungen lediglich exemplarisch dargestellt und nicht darauf beschränlct, sondern umfaßt alle Variationen, Modifikationen, Substitutionen und Kombinationen, die der Fachmann den vorliegenden Unterlagen insbesondere im Rahmen der Ansprüche und der allgemeinen Darstellungen in der Einleitung dieser Beschreibung sowie der Beschreibung der Ausfuhrungsbeispiele und deren Darstellungen in der Zeichnung entnehmen und mit seinem fachmännischen Wissen sowie dem Stand der Technik insbesondere unter Einbeziehung der vollständigen Offenbarungsgehalte der am Anfang dieser Beschreibung angegebenen älteren Anmeldungen kombinieren kann. Insbesondere sind alle einzelnen Merkmale und Ausgestaltungsmöglichkeiten der Erfindung und ihrer Ausführungsbeispiele kombinierbar.
Claims
1. Verfahren zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen, dadurch gekennzeichnet, dass Peptide/Proteine an deren C-Ende, N-Ende und/oder deren modifizierten Stellen sowie in ihrer Gesamtheit mit spezifischen Antikörpern vermessen werden, die derart markiert sind, dass eine spätere Vermessung möglich ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadruch gekennzeichnet, dass an den Antikörpern eine Nachweismöglichkeit (Defection Device) angekoppelt wird, die es erlaubt, über deren Konzentration die Menge der Antikörpermoleküle und damit die der unbekannten zu bestimmenden Molekülmenge qualitativ und/oder quantitativ zu bestimmen.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweismöglichkeit (Defection Device) ausgelegt ist, die zu messende Konzentration so zu vervielfältigen oder amplifizieren.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweismöglichkeit (Defection Device) selbst sehr groß ausgelegt wird und insbesondere in kleinere vorzugsweise gleiche Teile so zerlegt werden kann, dass deren Konzentration als bekannt vorausgesetzt und/oder leicht gemessen werden kann.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweismöglichkeit (Defection Device) selbst so vervielfältigt oder amplifiziert werden kann, dass eine Vermessung leicht mit bekannten Methoden möglich ist.
6. Massenspektrometer, dadurch gekennzeichnet, dass eine Trägergasquelle, insbesondere eine CO-Quelle, vorgesehen ist, um eine Probe mit Trägergas, entsprechend insbesondere CO, zu beschießen, oder dass ein Enzymlösungsbehälter mit/für eine Enzymlösung zur Reaktion mit wenigstens einem Metall vorgesehen ist.
7. Metallbestimmungsverfaliren, dadurch gekennzeichnet, dass eine Probe mit Trägergas, insbesondere CO, von einer Trägergasquelle, entsprechend insbesondere einer CO-Quelle, beschossen wird, oder dass eine Enzymlösung mit wenigstens einem Probenmetall reagiert.
8. Leitfähigkeitsmessung, dadurch gekennzeichnet, dass eine Blutprobe in einen Meßtubus eingeführt wird, der von einer Vielzahl von Elektroden umgeben ist, und dass die Elektroden nach einem vorgegebenen Schema kreuzweise mit einem Frequenzgenerator angesteuert werden.
9. Leitfähigkeitsfeststeller, dadurch gekennzeichnet, dass für die Einfuhrung einer Blutprobe ein Meßtubus vorgesehen, der von einer Vielzahl von Elektroden umgeben ist, die nach einem vorgebbaren Schema kreuzweise mit einem Frequenzgenerator ansteuerbar sind.
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