EP1448792A1 - Diagnose-kit, dns-chip sowie verfahren zur diagnostik oder behandlungskontrolle bei hodenkrebs - Google Patents

Diagnose-kit, dns-chip sowie verfahren zur diagnostik oder behandlungskontrolle bei hodenkrebs

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Publication number
EP1448792A1
EP1448792A1 EP01274739A EP01274739A EP1448792A1 EP 1448792 A1 EP1448792 A1 EP 1448792A1 EP 01274739 A EP01274739 A EP 01274739A EP 01274739 A EP01274739 A EP 01274739A EP 1448792 A1 EP1448792 A1 EP 1448792A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cdna
diagnostic kit
cells
oligonucleotides
kit according
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01274739A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Cengiz Tamak
Alf-Andreas Krehan
Pia Steffens
Stefanie WASCHÜTZA
Veit Zieglschmid
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Alere Diagnostics GmbH
Original Assignee
Adnagen GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Adnagen GmbH filed Critical Adnagen GmbH
Publication of EP1448792A1 publication Critical patent/EP1448792A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/5759—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds localised on the membrane of tumour or cancer cells

Definitions

  • the present invention relates to a diagnostic kit, a DNA chip and a method for diagnosis or treatment control for testicular cancer.
  • I - In the context of cancer prevention and follow-up care, it is very important to be able to detect malignant testicular tumors or recurrent malignant testicular tumors early on using the appearance of metastatic tumor lines in the blood.
  • Testicular cancer is responsible for less than 2% of all malignant tumors in men. However, 20-30% of all cancers among men aged 40 are testicular cancer. The number of new cases each year in the Federal Republic of Germany, for example, is approximately 3600, with approximately 240 men dying from testicular cancer. The highest incidence is found between the ages of 25 and 40. By progress in oncology see therapy, over 90% of all those affected can be cured in the long term. The high survival rates are due to the pronounced effectiveness of cis-platinum-based chemotherapy.
  • tumor markers at the protein level are determined quantitatively in the blood or in other body fluids in cancer patients.
  • these detection methods are only of limited suitability for tumor diagnosis or treatment control / aftercare in testicular tumors, since increased tumor marker values in body fluids are also caused by non-tumor diseases, such as inflammation of the gastrointestinal tract, cirrhosis of the liver, viral infections or heavy smoking • can .
  • EP 0 520 794 B1 discloses such a method in which metastases in body tissues or liquids are detected. In doing so, nucleic acids are detected, for example by means of amplification by polymerase chain reaction. The method is now crucially based on the fact that the detected nucleic acid sequence is expressed in cells of the tissue of origin of a tumor, ie in tumor cells and, depending on the markec, also in the healthy cells of the tissue of origin. Another condition is that this sequence is not expressed in those cells whose tissue is being examined.
  • this method is ultimately based on the detection of cells that should not occur in the blood sample of ⁇ healthy individuals.
  • the object of the present invention is therefore to provide a method, a diagnostic kit and a nucleic acid microarray with which tumor cells in testicular tumor diseases in peripheral blood can be detected.
  • This object is achieved by the diagnostic kit according to claim 1, the microarray according to claim 20 and the method according to claim 22 and their use according to claim 45.
  • Advantageous further developments of the diagnostic kit, microarrays, method or uses according to the invention are given in the respective dependent claims.
  • the present invention is essentially based on the fact that testicular tumor markers are not detected in the blood of patients at an immunological or enzymatic level, but that the mRNA (messenger ribonucleic acid) of testicular tumor markers is detected in a blood sample, the tumor markers being associated with a tumor Represent gene expression.
  • the placenta-specific alkaline phosphatase (PLAP) and the germline-specific alkaline phosphatase (GCAP), which are expressed in testicular tumors, the epithelial glycoprotein (GA733__2 or EGP40), the high-mobility group protein isoform IC (HMGI-C) and the gastrin releasing peptide receptor (GRPR) are detected.
  • the detection can be carried out for only one of the markers or for any number of these four testicular tumor markers in combination with one another, but at least the mRNA of the markers GA733.2 and / or GCAP / PLAP is detected.
  • the kit according to the invention can therefore Contain oligonucleotide pairs for only one or any selection or all of the four testicular tumor markers.
  • testicular tumor markers are also expressed in the original tissue and as a protein in the bloodstream. long.
  • only cells are detected that are on the one hand in the blood sample and on the other hand express the respective testicular tumor marker. Consequently, these are tumor cells that originate from their original testicular tumor tissue and have been carried over into the patient's blood. Since the mRNA of the markers examined is not expressed in the blood of a testicular tumor patient, there is a direct correlation between the occurrence of the associated mRNA and metastasis even in the early stage of the metastasis process.
  • testicular tumor marker not only is the mRNA of an individual testicular tumor marker detected, but a combination of markers is examined.
  • This makes it possible, for example, to detect all types of testicular cancer via their cells metastasizing in the blood.
  • seminous and non-seminous testicular cancer forms or mixed tumors with a semino fraction and thus 90-95% of all malignant tumors of the testis, namely all germ cell tumors, are detected.
  • tumor cells can also be recognized when the expression of a particular marker in a patient or in a disease stage is relatively low, which could otherwise lead to a supposedly negative result.
  • additional markers mostly comes up against limits because mononuclear blood cells express background expression
  • the specificity is a critical point due to the very high amplification rate.
  • the slightest contamination, such as from foreign RNA or atypical transcription, can falsify the result.
  • RNA isolated as a detection basis and the cDNA synthesized from it Central to the quality of the RNA isolated as a detection basis and the cDNA synthesized from it is the enrichment of the cell fraction used for this from the blood sample used. Various methods are available for this:
  • tumor cell detection rate from 1 tumor cell to 10 7 mononuclear blood cells.
  • the tumor cells are separated from mononuclear blood cells by means of specific antibodies or an antibody mixture.
  • the separation can be carried out by means of magnetic particles (Dynal) to which the antibodies are bound. This is described in more detail below.
  • Eukaryotic cells have a large number of different molecules on their cell surface.
  • the combination of the expressed surface molecules differs according to the origin and the function of the individual cell, so that cell-type-specific patterns arise.
  • For ' detection antibodies are used in this cell type-specific pattern.
  • Antibodies bind to their antigen with high specificity, here to selected surface molecules. This property is used to recognize and differentiate cells by means of specific antibody binding based on their cell type-specific patterns.
  • tumor cells of this cell type Since this special pattern of surface antigens in tumor cells also differs from the typical blood cell patterns, tumor cells can be differentiated in the blood. To identify tumor cells, antibodies that specifically recognize these special surface proteins are used as tools. The specific antibody binding is used for different analysis and separation methods.
  • Antibodies are coupled with fluorescent dyes for flow cytometric analysis. Scattered cells become constant
  • Laser light source
  • the fluorescent dyes bound to the antibodies are excited and emit light of specific wavelengths.
  • the emitted light is detected and the measured one
  • Digitized signal stored The light signal can be assigned to individual cells.
  • the antibody-labeled cell is thus recognized and can now be separated from other cells. For separation, the cells are made in the smallest
  • Such an enrichment can be done, for example, by FACS flow cytometry.
  • the mononuclear cells from the fraction enriched under b) are incubated with fluorescence-labeled mononuclear antibodies against tumor-specific surface proteins.
  • the labeled cells are washed twice with PBS and then 10 7 cells are resuspended in 1 ml PBS.
  • a FACS Vantage SE flow cytometer (Becton Dickinson) is used to isolate the tumor cells.
  • the CellQuest program is used for data acquisition, instrument control and data evaluation.
  • the sorted cells are transferred to a 1.5 l reaction vessel (filled with 1 ml PBS).
  • the RNA can then be isolated as described later.
  • antibodies are consequently covalently coupled to pseudomagnetic particles that have a defined number of chemically activated sites on their surface.
  • the specificity of the separation is determined via the specificity of the antibodies.
  • a blood sample containing tumor cells is mixed with antibody-coupled magnetic particles; then particles and blood are moved relative to each other, for example by “over-
  • tumor cells are detected in general, but with high specificity. This is due to the selective expression of certain surface proteins that differentiate cancer cells from other cells.
  • Antibody mixtures of this type show an increased sensitivity in comparison to the separately used antibodies in cell recognition and cell separation, regardless of the method used.
  • a blood sample is taken from a patient.
  • RNS processing from a milliliter of this whole blood is carried out using the QIAampRNA-Blood Mini Kit TM (from Qiagen, Hilden). Contamination with genomic DNA is avoided by an additional DNA digestion with the RNase-Free DNase Set TM (company Qiagen, Hilden) on the column.
  • RNA isolation As an alternative to the RNA isolation described above, it is also possible to take up the isolated fraction of mononuclear blood cells, as described above, in TRIzol reagent from Gibco BRL, NY, USA, to lyse them and to homogenize them using a pipette. The RNA-containing aqueous phase is then precipitated from a chloroform extraction in isopropanol at -80 ° C. After washing twice in 80% ethanol, the pellet is air-dried and then resuspended in RNase-free water.
  • RNA was then denatured in an appropriate volume of water together with oligo (dT) ⁇ 5 primers from Promega, Mannheim for 5 minutes at 65 ° C. and then incubated directly on ice. This was followed by cDNA synthesis at 37 ° C for one hour and a subsequent inactivation of the added reverse transcriptase for 5 minutes at 93 ° C and Cooling down on ice.
  • the entire reverse transcription was carried out using the Sensiscript TM reverse transcriptase kit from Qiagen, Hilden.
  • the PCR synthesis was carried out in a 20 ⁇ l reaction mixture
  • the multiplex PCR was carried out under the conditions given in Table 5 and at the marker-specific annealing temperatures and number of cycles given in Table 6.
  • the annealing temperature is indicated by x, whereby the corresponding annealing temperature from table 6 was used in each case.
  • Lane 1 shows the result of a detection by means of electrophoresis using a DNA 500 chip (Agilent) and an Agilent Bioanalyzer 2100.
  • Lane 1 shows a 100 bp ladder
  • lane 2 shows a cDNA control without RNA in the approach
  • lane 3 one PCR control without cDNA in the approach
  • lane 4 a negative control for GCAP / PLAP with RNA from a healthy control person in the approach
  • lane 5 the sample from a diseased person.
  • control measurement of ⁇ -actin is only positive in the two real blood samples of lanes 4 and 5, while only lane 5 has the expected band for GCAP / PLAP as testicular tumor marker.
  • FIG. 2 Another result is shown in FIG. 2.
  • the detection was also carried out using an Agilent Bioanalyzer 2100 and a DNA 500 assay chip from Agilent.
  • Lanes 1 to 6 show a multiplex PCR of the cDNA from GCAP and GA733.2 and lanes 7 to 13 show a multiplex PCR of the cDNA from GCAP, GA733.2, GRPR and HMGI-C.
  • the designations cDNA- Control, PCR control and negative control refer to samples without RNA, without cDNA or with RNA from a healthy control person. It can be seen in lanes 5, 9 and 13, respectively, that only the testicular tumor samples in the detection of the cDNA and therefore the mRNA are positive for GCAP / PLAP, GA733.2, GRPR and HMGI-C.
  • agarose gel electrophoresis can of course also be used, in which, for example, 25 ⁇ l of the PCR product shown above are separated using a 2.5% agarose gel and the DNA bands are subsequently stained and visible with ethidium bromide be made.
  • the documentation can be carried out, for example, using the Inta DUO Store System.
  • a fragment analysis using the ABI Prism 310 Genetic Analyzer can also be used for evaluation.
  • a PCR with fluorescence-labeled primers is carried out and then, for example, 1 ⁇ l of the respective PCR product is used in a dilution of 1:50.
  • tumor marker detection can also be carried out using real-time PCR using DANN-intercalating fluorescent dyes (eg LightCycler TM and CybrGreen TM from Hoffmann-Röche). For this purpose, for example, quantification is carried out using fluorescence-based real-time PCR.
  • DANN-intercalating fluorescent dyes eg LightCycler TM and CybrGreen TM from Hoffmann-Röche.
  • quantification is carried out using fluorescence-based real-time PCR.
  • a sequence-specific fluorescence-labeled hybridization sample is added to the PCR approach, by means of which the product development, ie the amplification, can be followed after each cycle of the PCR by means of the fluorescence emitted by it.
  • Special standards can then be used to draw conclusions about the quantities of starting RNA.
  • This also makes it possible to quantify the testicular tumor-associated RNA present in the blood sample and, consequently, to make a direct statement about the response to a selected therapy method.
  • This method can be carried out, for example, with a Light-Cycler TM from Röche, Basel or a Taq-Man TM from PE Applied Bio-Systems, Wieterstadt, as is already well known from the literature.
  • the device according to the invention and the method according to the invention also make it possible to continue using the sorted and separated cells as described above as desired.
  • these can be inserted into a suitable cell culture medium and cultivated in situ.
  • the sorted cells are carrier applied. Additional surface markers can be detected chytochemically or using fluorescence microscopy. Genetic analyzes can also be carried out, such as chromosome analyzes using FISH (fluorescence in situ hybridization) or karyogram generation.
  • FISH fluorescence in situ hybridization

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Abstract

The invention relates to a diagnosis kit, a DNA chip, and to methods for diagnosing or supervising the treatment of testicular cancer, which are of greatest importance, in particular, within the scope of cancer prevention and post-treatment. The invention is essentially characterized in that the mRNA of testicular tumor markers is detected in a blood sample, whereby the tumor markers depict a tumor-associated gene expression. To this end, particularly beta -hCG, AFP, PLAP or GCAP come into question. The detection of the mRNA is carried out by reverse transcription in cDNA and by subsequently amplifying selected segments of the cDNA by means of polymerase chain reaction.

Description

Diagnose-Kit, DNS-Chip sowie Verfahren zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle bei Hodenkrebs
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Diagnose-Kit, einen DNS-Chip sowie ein Verfahren zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle bei Hodenkrebs. I - Rahmen der Krebsvor- und -nachsorge ist es von großer Wichtigkeit, maligne Hodentu ore bzw. rezidive maligne Hodentumore anhand des Auftretens metastasierender Tumo Zeilen im Blut frühzeitig nachweisen zu können.
Hodenkrebs ist für weniger als 2% aller bösartigen Neubildungen von Tumoren beim Mann verantwortlich. Allerdings handelt es sich bei 20-30% aller Krebser- krankungen unter 40jähriger Männer um Hodenkrebs. Die Zahl der jährlichen Neuerkrankungen beispielsweise in der Bundesrepublik Deutschland beträgt ca. 3600, wobei ca. 240 Männer an Hodenkrebs sterben. Die höchste Inzidenz findet man dabei zwischen dem 25. und 40. Lebensjahr. Durch den Fortschritt in der onkologi- sehen Therapie können heute über 90% aller Betroffenen langfristig geheilt werden. Die hohen Überlebens- raten begründen sich dabei in der ausgeprägten Wirksamkeit der cis-Platin-basierenden Chemotherapien.
Dabei gilt es, im klinischen Stadium 1 der Erkrankung zu entscheiden, ob der Patient mit einer Chemotherapie und/oder mit einer Operation belastet werden muß, um einen dauerhaften Heilungserfolg zu erzielen. Eine große Anzahl von Patienten wird dabei chemotherapeutisch behandelt, obwohl kein gesicherter Nachweis einer Metastasierung vorliegt. In den Konzepten, die auf einer reinen Überwachung aufbauen, kommt es jedoch in 25% der Fälle zu Rezidiven mit zum Teil töd- liehern Ausgang.
Bei den derzeit angewandten Untersuchungsmethoden werden bei Krebspatienten sogenannte Tumormarker auf Proteinebene (immunologisch bzw. enzymatisch) quanti- tativ im Blut oder in anderen Körperflüssigkeiten ermittelt. Diese Nachweisverfahren sind jedoch für die Tumordiagnostik bzw. Behandlungskontrolle/Nachsorge bei Hodentumor nur bedingt geeignet, da erhöhte Tu- mormarkerwerte in .Körperflüssigkeiten auch durch nichttumoröse Erkrankungen, wie beispielsweise Entzündungen des Magen-Darm-Traktes, Leberzirrhose, Virusinfekte oder starkes Rauchen hervorgerufen werden •können .
Molekulargenetische Verfahren erscheinen hier für den Nachweis von Tumorzellen im peripheren Blut hilfreich, da am Beginn des Metastasierungsprozesses der Übertritt von Tumorzellen ins venöse Blut stehen kann. Die EP 0 520 794 Bl offenbart ein derartiges Verfahren, bei dem Metastasierungen in Körpergeweben oder Flüssigkeiten erfaßt werden. Dabei werden Nukleinsäuren erfaßt, beispielsweise mittels Vervielfältigung durch Polymerase-Kettenreaktion. Das Verfahren beruht nun entscheidend darauf, daß die nachgewiesene Nu- kleinsäuresequenz in Zellen des Herkunftsgewebes eines Tumors exprimiert wird, d.h. in Tumorzellen und markec- abhängig auch in den gesunden Zellen des Her- kunftsgewebes. Weitere Bedingung ist, daß diese Sequenz jedoch nicht in denjenigen Zellen exprimiert wird, deren Gewebe untersucht wird. Wird also eine entsprechende Sequenz in der untersuchten Probe gefunden, so muß diese von verschleppten, d.h. metasta- sierenden Zellen eines ortsfremden Tumors herrühren. Damit beruht dieses Verfahren letztlich auf dem Nachweis von Zellen, die in der Blutprobe ~von gesunden Personen nicht vorkommen sollten.
Insgesamt ist festzustellen, daß die derzeit verwendeten diagnostischen Methoden zu ungenau sind, wenn es um die Beurteilung der malignen Potenz von Resttumoren nach durchgeführter Chemotherapie in den meta- stasierenden Stadien geht. Es gilt also weiterhin, Nachweise für eine okkulte bzw. restliche Metastasie- rung zu finden, die eine rechtzeitige Einordnung in die vielfältigen primär kurativen therapeutischen Optionen zulassen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren, ein Diagnose-Kit sowie einen Nukleinsäure- Mikroarray zur Verfügung zu stellen, mit denen Tumorzellen bei Hodentumorerkrankungen im peripheren Blut nachgewiesen werden können. Diese Aufgabe wird durch das Diagnose-Kit nach Anspruch 1, den Mikroarray nach Anspruch 20 sowie das Verfahren nach Anspruch 22 und deren Verwendung nach Anspruch 45 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Diagnose-Kits, Mikroarrays, Verfahrens oder der Verwendungen werden in den jeweiligen abhängigen Ansprüchen gegeben.
Die vorliegende Erfindung beruht im wesentlichen dar- auf, daß nicht etwa auf immunologischer oder enzyma- tischer Ebene Hodentumormarker im Blut von Patienten nachgewiesen werden, sondern daß die mRNS (Messenger- Ribonukleinsäure) von Hodentumormarkern in einer Blutprobe nachgewiesen wird, wobei die Tumormarker eine tumorassoziierte Genexpression darstellen. Als Marker für Hodentumoren werden erfindungsgemäß die Plazenta-spezifische alkalische Phosphatase (PLAP) und die Keimzeil-spezifische alkalische Phosphatase (GCAP) , die bei Hodentumoren exprimiert werden, das epitheliale Glycoprotein (GA733__2 oder EGP40) , das high-mobility group protein Isoform I-C (HMGI-C) sowie der Gastrin freisetzendes Peptid-Rezeptor (GRPR) erfaßt. Der Nachweis kann dabei für nur einen der Marker oder auch für eine beliebige Anzahl dieser vier Hodentumorenmarker in Kombination miteinander durchgeführt werden, wobei jedoch zumindest ein Nachweis der mRNA der Marker GA733.2 und/oder GCAP/PLAP erfolgt.. Das erfindungsgemäße Kit kann daher Oligonu- kleotidpaare für nur einen oder eine beliebige Aus- wähl oder auch alle der vier Hodentumormarker enthalten.
Dadurch werden alle diejenigen Fälle nicht erfaßt, bei denen beispielsweise aufgrund von anderen Krank- heiten ebenfalls die Hodentumormarker im Ursprungsgewebe exprimiert und als Protein in die Blutbahn ge- langen. Es werden folglich lediglich Zellen erfaßt, die zum einen sich selbst in der Blutprobe befinden und zum anderen den jeweiligen Hodentumormarker ex- primieren. Dabei handelt es sich folglich um Tumor- zellen, die aus ihrem ursprünglichen Hodentumorgewebe stammen und in das Blut der Patienten verschleppt wurden. Da im Blut nicht an einem Hodentumor Erkrankter die mRNA der untersuchten Marker nicht exprimiert wird, zeigt sich eine direkte Korrelation zwischen dem Auftreten der zugehörigen mRNA und einer Metasta- sierung schon im frühen Stadium im Metastasierungs- prozeß .
Vorteilhafterweise wird nicht nur die mRNS eines ein- zelnen Hodentu ormarkers erfaßt sondern eine Kombination von Markern untersucht. Dadurch ist es möglich, beispielsweise alle Hodenkrebsformen über ihre im Blut metastasierenden Zellen erfassen zu können. Dies bedeutet, daß sowohl seminöse als auch nichtseminöse Hodenkrebsformen bzw. auch Mischtumore mit Anteilen eines Semino s und damit 90-95 % aller malignen Tumo- re des Hodens, nämlich sämtliche Keimzelltumoren, erfaßt werden.
Da einzelne Marker in therapieabhängiger Weise unterschiedlich exprimiert werden, ist es vorteilhaft, eine Kombination von Tumormarkern zu untersuchen, um alle im Blut zirkulierenden Tumorzellen zu erfassen. Hierdurch lassen sich Tumorzellen auch dann erkenn- nen, wenn die Expression eines bestimmten Markers bei einem Patienten bzw. in einem Krankheitsstadium relativ gering ist, was sonst zu einem vermeintlich negativen Ergebnis führen könnte. Die Verwendung weiterer Marker stößt jedoch meist deswegen auf Grenzen, weil mononukleäre Blutzellen eine Hintergrundexpression
(„illegitime Transkription ) aufweisen, die eine ex- akte Analyse behindern.
Für die Erkennung von Hodenzellen wird daher erfindungsgemäß die folgende Kombination aus Markern vorgeschlagen:
- GA733.2
- GCAP/PLAP
- HMGI-C - GRPR,
wobei GA733.2 und/oder GCAP/PLAP für eine sichere Erkennung von Hodentumorzellen obligatorisch erfaßt werden müssen.
Bei der Anwendung von RT-PCR-Syste en zum Nachweis von Tumorzellen ist aufgrund der sehr hohen Amplifi- kationsrate die Spezifität ein kritischer Punkt. Geringste Kontaminationen, etwa durch Fremd-RNA oder untypische Transkription, können hierbei das Ergebnis verfälschen.
Zentral für die Qualität der als Nachweisbasis isolierten RNS und der daraus synthesitierten cDNS ist die Anreicherung der hierfür verwendeten Zellfraktion aus der verwendeten Blutprobe. Hierfür stehen verschiedene Methoden zur Verfügung:
a) Anreicherung durch wiederholte Zentrifugation nach Erythrozytenlyse:
1 ml EDTA-Blut werden nach Zugabe von 5 Volumina Erythrozyten-Lysepuffer („QIAmp Blood Kitλ , Qia- gen; Hilden) für 20 Minuten auf Eis lysiert. Nach Abnehmen des Plas as/Lysates von den pelletierten
Zellen und Resuspension erfolgt eine erneute Zen- trifugation bei 3000 x g für 20 Minuten. Nach Abnehmen des Überstandes steht die pelletierte Leukozytenfraktion für die RNA-Präparation zur Verfügung.
b) Anreicherung durch Dichtegradienten- Zentrifugation:
Mittels eines über Zentrifugation erzeugten Dich- tegradienten lassen sich Zellen unterschiedlicher mittlerer Volumendichte voneinander trennen. Mononukleare Blutzellen werden mittels eines Ficoll- Hypaque-Gradienten (Pharmacia, Uppsala, Schweden) separiert und anschließend zweifach mit PBS/1% FCS gewaschen.
c) Anreicherung mittels Antikörpermarkierung
Durch die Verwendung der Immunzytochemie mit mono- klonalen Antikörpern gegen Tumorzellantigene kann eine Steigerung der Spezifität des Tumorzell- Nachweises erzielt werden (Nachweisquote von 1 Tumorzelle auf 107 mononukleären Blutzellen) . Die Tumorzellen werden dabei mittels spezifischer An- tikörper bzw. einer Antikörpermischung von mononukleären Blutzellen getrennt. Die Trennung kann mittels Magnetpartikel (Dynal), an die die Antikörper gebunden werden, erfolgen. Dies wird im folgenden detaillierter beschrieben.
Eukaryontische Zellen tragen eine Vielzahl unterschiedlicher Moleküle an ihrer Zelloberfläche. Entsprechend des Ursprungs und der Funktion der einzelnen Zelle unterscheidet sich die Kombination der exprimierten Oberflächenmoleküle, so daß zell- typ-spezifische Muster entstehen. Zur' Erkennung dieser zelltyp-spezifischen Muster werden Antikörper genutzt. Antikörper binden mit hoher Spezifi- tät an ihr Antigen, hier an ausgewählte Oberflächenmoleküle. Diese Eigenschaft wird genutzt, um Zellen mittels spezifischer Antikörperbindung anhand ihrer Zelltyp-spezifischen Muster zu erkennen und voneinander zu unterscheiden.
Die Expression spezieller Oberflächenproteine un- terscheidet Tumorzellen von nichttransfor ierten
Zellen dieses Zelltyps. Da sich dieses spezielle Muster der Oberflächen-Antigene bei Tumorzellen auch von den Blutzeil-typischen Mustern unterscheidet, können Tumorzellen im Blut unter- schieden werden. Um Tumorzellen zu identifizieren, werden Antikörper, die diese speziellen Oberflächenproteine spezifisch erkennen, als Werkzeuge genutzt. Die spezifische Antikörperbindung wird für verschiedene Analyse- und Separations-Methoden nutzbar gemacht.
Aufgrund der intensiven Bindung von speziell dafür selektionierten Immunglobulinen ist neben der Erkennung von Zellen über deren Oberflächenepitope auch eine Separierung der erkannten Zellen von nicht erkannten möglich.
Verschiedene Trennprinzipien sind möglich:
1. Trennprinzip beruhend auf Flüssigphase; z. B.
Durchflußzytometrie :
Für die durchflußzytometrische Analyse werden Antikörper mit Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt. Vereinzelte Zellen werden in einem konstanten
Flüssigkeitsstrom einzeln an einer Lichtquelle (Laser) vorbeigeleitet. Bei Beleuchtung der Zellen werden die an den Antikörpern gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe angeregt und strahlen Licht bestimmter Wellenlängen ab. Das abge- strahlte Licht wird detektiert und das gemessene
Signal digitalisiert gespeichert. Das Lichtsignal kann einzelnen Zellen zugeordnet werden. Die Antikörper-markierte Zelle wird so erkannt und kann nun von anderen Zellen getrennt werden. Zur Trennung werden die Zellen in kleinsten
Tropfen vereinzelt. Nach Erkennung der Antikörper-markierten Zelle wird der entsprechende Tropfen in ein Auffangbehältnis gelenkt.
Eine derartige Anreicherung kann beispielsweise durch FACS-Durchflußzytometrie erfolgen. Dabei werden beispielsweise die mononukleären Zellen aus der unter b) angereicherten Fraktion mit fluoreszenzmarkierten- mononuklearen Antikörpern gegen tumorspezifische Oberflächenproteine inkubiert. Die markierten Zellen werden zweifach mit PBS gewaschen und im Anschluß werden 107 Zellen in 1 ml PBS resuspendiert. Für die Isolierung der Tumorzellen wird ein FACS Vantage SE- Durchflußzytometer (Becton Dickinson) verwendet.
Über das CellQuest Programm erfolgen Datenaufnahme, Instrumentenkontrolle und Datenauswertung. Die sortierten Zellen werden in ein 1,5 l-Reaktionsgefäß (gefüllt mit 1 ml PBS) über- führt. Die RNS kann dann wie später beschrieben isoliert werden.
2. Trennprinzip beruhend auf Festphase; z. B. magnetische Separation: Für die magnetische Separation werden Antikörper mit pseudomagnetischen Partikeln gekoppelt. Nach Einbringen der pseudomagnetischen Partikel in ein Magnetfeld wandern die Partikel im magnetischen Feld. Bei der Bewegung in diesem magnetischen Feld werden Zellen, an die diese gekoppelten Antikörper gebunden sind, mitgerissen und von anderen Zellen getrennt.
Zur Tumorzellenerkennung mittels Magnetpartikel werden folglich an pseudomagnetische Partikel, die eine definierte Anzahl an chemisch aktivierten Stellen auf ihrer Oberfläche besitzen, Anti- körper kovalent gekoppelt. Über die Spezifität der Antikörper wird die Spezifität der Trennung bestimmt. Eine Tumorzellen enthaltende Blutprobe wird mit Antikörper-gekoppelte Magnetpartikel versetzt; dann werden Partikel und Blut relativ zueinander bewegt, beispielsweise durch „Über-
Kopf-Rotieren in einem geschlossenen Behälter befindlicher Proben oder durch Bewegung der Partikel aufgrund wechselnder Magnetfelder. Jene (Tumor-) Zellen, die von den Festphase-gebundenen Antikörpern erkannt und damit fest gebunden werden, folgen der Bewegung der Partikel. Hierdurch 'ist es möglich, bei Anlegen eines magnetischen Feldes, die Partikel mit den daran gebundenen Zellen aus dem Blut herauszuziehen (z.B. an die Wand des Trenngefäßes) . Das auf diese Weise Tu- morzellen-depletierte Blut kann gegen andere Lösungen ausgetauscht werden, wobei die über Magnetpartikel separierten Zellen bis zum Abschalten/Entfernen des Magnetfeldes vor Ort verblei- ben und für weitere Anwendungen zur Verfügung stehen. Vorteilhafterweise können für die Erkennung der Tumorzellen spezifische Antikörper-Mischungen verwendet werden, die entweder allgemein auf Tumorzellen oder auch spezifisch für Hodenzellen-Erkennung optimiert sind. Beispielsweise eignet sich zur Erkennung von Tumorzellen im Blut eine Kombination der Antikörper MOC-31 und Ber-EP4.
Tabelle A: Antikörper-Mischung 1
Mittels der Antikörpermischung in der vorhergehenden Tabelle A werden ganz allgemein Tumorzellen, jedoch mit hoher Spezifität erfaßt. Dies beruht auf der selektiven Expression bestimmter Oberflächenproteine, die Krebszellen von anderen Zellen unterscheidet.
Derartige Antikörpermischungen zeigen im Vergleich zu den jeweils separat eingesetzten Antikörpern bei der Zellerkennung und Zelltrennung unabhängig von der angewandten Methode eine erhöhte Sensitivität .
Im folgenden werden einige Beispiele erfindungsgemäßer Verfahren, hierzu verwendeter Diagnose-Kits und dergleichen beschrieben. Es zeigen :
Fig. 1 den, Nachweis von PCR-Produkten mittels
Elektrophorese; und
Fig. 2 einen weiteren Nachweis von PCR-Produkten mittels Elektrophorese.
In einem ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfah- rens wird einem Patienten eine Blutprobe entnommen. Aus einem Milliliter dieses Vollblutes (als EDTA- Vollblut) erfolgt eine RNS-Aufarbeitung mit dem QIAampRNA-Blood Mini Kit™ (Firma Qiagen, Hilden) . Kontaminationen mit genomischer DNS werden durch ei- nen zusätzlichen DNS-Verdau mit dem RNase-Free DNase Set™, (Firma Qiagen, Hilden) auf der Säule vermieden.
Alternativ zur oben beschriebenen RNS-Isolierung ist es auch möglich, die isolierte Fraktion mononukleärer Blutkörpercen, wie sie oben beschrieben sind, in TRI- zol-Reagenz der Firma Gibco BRL, NY, USA aufzunehmen, zu lysieren und mittels Pipette zu homogenisieren. Anschließend wird die RNS-haltige wäßrige Phase aus einer Chloroform-Extraktion in Isopropanol bei -80°C gefällt. Nach zweimaligem Waschen in 80%igem Ethanol wird das Pellet an der Luft getrocknet und anschließend in RNase-freiem Wasser resuspendiert.
Anschließend wurde die RNS in einem entsprechenden Volumen Wasser zusammen mit Oligo (dT) ι5-Primern der Firma Promega, Mannheim für 5 Minuten bei 65 °C denaturiert und anschließend direkt auf Eis inkubiert. Es folgte eine cDNS-Synthese bei 37 °C für eine Stunde und eine nachfolgende Inaktivieruήg der zugegebenen reversen Transkriptase für 5 Minuten bei 93 °C und Abkühlung auf Eis. Die gesamte reverse Transkription wurde mittels des Sensiskript™ Reverse Transkriptase Kit der Firma Qiagen, Hilden durchgeführt.
Der Reaktionsansatz für 20 μl für die cDNS-Synthese ist in der nachfolgenden Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1: Komponenten der cDNS-Synthese
Im Anschluß an die reverse Transkription wurde eine Multiplex-PCR mit ß-Aktin als interner Kontrolle durchgeführt. Der entsprechende Reaktionsansatz geht aus Tabelle 2 im folgenden hervor.
Tabelle 2: PCR-Ansatz
Die PCR-Synthese erfolgte in einem 20 μl-Reaktionsansatz
* enthält 15 mM MgCl2
** HotStar Taq™ DNA Polymerase, Fa. Qiagen, Hilden *** Q-Solution; Fa. Quiagen, Hilden;
(Der Zusatz von Q-Solution ist zum Nachweis von GCAP/PLAP notwendig) .
Als Primer wurden die in der folgenden Tabelle 3 zusammengefaßten PCR-Primer eingesetzt.
Tabelle 3: Liste der PCR-Primer
Diese Primer wurden in den in Tabelle 4 aufgelisteten Mengen und Kombinationen eingesetzt, die dort spaltenweise aufgeführt sind.
Tabelle 4: Auflistung der Pri ermengen und Pri- merkominationen
Die Multiplex-PCR wurde unter den in Tabelle 5 angegebenen Bedingungen und bei den in Tabelle 6 angegebenen markerspezifischen Annealingtemperaturen und Zyklenzahlen durchgeführt. In Tabelle 5 ist die An- nealingtemperatur mit x angegeben, wobei dabei jeweils die entsprechende Annealingtemperatur aus Tabelle 6 verwendet wurde.
Tabelle 5 PCR-Bedingungen
Vorabdenaturierung 95 ° C 15 min
Zyklus
1 . Denaturierung 94 °c 1 min
2 . Annealing x °c 1 min ( s . Tab . 6)
3 . Extension 72 °c 1 min
Finale Extension 72 °c 10 min
4 °c Pause Tabelle 6: Marker-spezifische Annealingtemperatur und Zyklenzahl
1 μl des so erzeugten PCR-Produktes wurde in einem Agilent Bioanalyzer 2100 auf einem DNA-Chip 500 aufgetrennt und das Trennergebnis elektrophoretisch dokumentiert.
Fig. 1 zeigt das Ergebnis eines Nachweises mittels Elektrophorese unter Einsatz eines DNA-500-Chip (Agilent) und eines Agilent Bioanalyzer 2100. Spur 1 zeigt eine 100 bp-Leiter, Spur 2 eine cDNA-Kontrolle ohne RNA im Ansatz, Spur 3 eine PCR-Kontrolle ohne cDNA im Ansatz, Spur 4 eine Negativkontrolle für GCAP/PLAP mit RNA einer gesunden Kontrollperson im Ansatz und Spur 5 die Probe einer erkrankten Person.
Die Kontrollmessung von ß-Aktin ist lediglich bei den beiden realen Blutproben der Spuren 4 und 5 positiv, während lediglich Spur 5 die zu erwartende Bande für GCAP/PLAP als Hodentumormarker aufweist.
Ein weiteres Ergebnis ist in Fig. 2 dargestellt. Der Nachweis erfolgte dabei ebenfalls mittels eines Agilent Bioanalyzer 2100 und einem DNA-500 Assay-Chip von Agilent. Die Spuren 1 bis 6 zeigen dabei eine Multiplex-PCR der cDNA von GCAP und GA733.2 und die Spuren 7 bis 13 eine Multiplex-PCR der cDNA von GCAP, GA733.2, GRPR und HMGI-C. Die Bezeichnungen cDNA- Kontrolle, PCR-Kontrolle und Negativ-Kontrolle bezeichnen Proben ohne RNA, ohne cDNA bzw. mit RNA einer gesunden Kontrollperson. Es ist in den Spuren 5, 9 bzw. 13 zu erkennen, daß lediglich die Proben an Hodentumor erkrankter Personen im Nachweis der cDNA unddamit der mRNA für GCAP/PLAP, GA733.2, GRPR und HMGI-C positiv sind.
Damit ist gezeigt, daß die entsprechenden Hodentumor- marker wie beschrieben und beansprucht, nachgewiesen werden können.
Alternativ zu den hier dargestellten Methoden können selbstverständlich auch herkömmliche Analysemethoden wie Agarose-Gelelektrophorese angewandt werden, bei denen beispielsweise 25 μl des oben dargestellten PCR-Produktes über ein 2,5%iges Agarosegel aufgetrennt werden und die DNS-Banden anschließend mit Ethidiumbromid angefärbt und sichtbar gemacht werden. Die Dokumentation kann beispielsweise mit Hilfe des DUO Store Systems der Fa. Inta durchgeführt werden.
Auch eine Fragmentanalyse mittels ABI Prism 310 Gene- tic Analyzer (Fa. PE Applied Biosystems, Weiterstadt) kann zur Auswertung verwendet werden. Hierzu wird eine PCR mit fluoreszenzmarkierten Primern durchgeführt und anschließend beispielsweise jeweils 1 μl des jeweiligen PCR-Produktes in einer Verdünnung von 1 : 50 eingesetzt.
Als weiterer Nachweis ist ein Nachweis mittels sequenzspezifischer fluoreszenzmarktierter Hybridisie- rungsproben möglich, die nach jedem Zyklus der PCR die Produktentwicklung verfolgen lassen. Anhand spe- zieller Standards kann dann auch ein Rückschluß auf die Menge an Ausgangs-RNS gezogen werden. Als Alter- native zur Block-PCR kann der Tumormarkernachweis auch mittels Echtzeit-PCR unter Verwendung DANN- interkallierender Fluoreszenzfarbstoffe erfolgen (z.B. LightCycler™ und CybrGreen™ der Fa. Hoffmann- Röche) .Dazu erfolgt beispielsweise eine Quantifizierung über fluoreszenzbasierte Echtzeit-PCR. Hierzu wird dem PCR-Ansatz eine sequenzspezifische fluoreszenzmarkierte Hybridisierungsprobe zugesetzt, durch die nach jedem Zyklus der PCR mittels der von ihr emittierten Fluoreszenz die Produktentwicklung, d.h. die Amplifikation, verfolgt werden kann. Anhand spezieller Standards können dann Rückschlüsse auf die Mengen an Ausgangs-RNS gezogen werden. Damit ist auch eine Quantifizierung der in der Blutprobe vorliegen- den Hodentumor-assoziierten RNS und folglich eine direkte Aussage über das Ansprechen auf eine gewählte Therapiemethode möglich. Dieses Verfahren kann beispielsweise mit einem Light-Cycler™ der Firma Röche, Basel oder einem Taq-Man™ der Firma PE Applied Bio- Systems, Wieterstadt, wie es bereits hinlänglich aus der Literatur bekannt ist, durchgeführt werden.
Abschließend sei darauf hingewiesen, daß die erfindungsgemäße Vorrichtung und das erfindungsgemäße Ver- fahren es weiterhin ermöglichen, die wie oben beschriebenen sortierten und separierten Zellen anschließend beliebig weiter zu verwenden. Beispielsweise können diese in ein geeignetes Zellkulturmedium eingesetzt und in situ kultiviert werden.
Da die Zellen nach der Trennung intakt sind, bleiben auch die Eigenschaften der Zellmembran und des Zellkerns erhalten. Dies eröffnet die Möglichkeit, mikroskopisch die Expression weiterer Oberflächenmarker untersuchen oder auch Chromosomen-Analysen durchzuführen. Die sortierten Zellen werden dazu auf Objekt- träger aufgebracht. Der Nachweis weiterer Oberflä- chenmarker kann chytochemisch oder über Fluoreszenzmikroskopie erfolgen. Ebenso können genetische Analysen durchgeführt werden, wie beispielsweise Chromosomenanalysen mittels FISH (Fluorescence in situ hybri- disation) oder Karyogramm-Erstellung.

Claims

Patentansprüche
1. Diagnose-Kit zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle von Hodentumoren mit mindestens einem Paar Oligonukleotide (Reverse- primer, Forwardprimer) , wobei die beiden Oligonukleotide des Paares als Primer zur Amplifikation mittels Polymeraseket- tenreaktion jeweils eines der beiden komplementären Stränge eines gesuchten DNS-Abschnittes geeignet sind, und wobei der gesuchte DNS-Abschnitt Teil der cDNS zu einem der Tumormarkerproteine plazentaspezifische alkalische Phosphatase (PLAP) , kei - zell-spezifische alkalische Phosphatase (GCAP) , epitheliales Glykoprotein 40 (GA 733.2 bzw. EGP 40) , high-mobility group protein isoform I-C (HMGI-C) und/oder Gastrin-releasing peptide re- ceptor (GRPR) ist.
2. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens zwei Paare Oligonukleotide (Reverseprimer, Forwardprimer) enthält, wobei die beiden Oligonukleotide der jeweiligen Paare als Primer zur Amplifikation mittels Poly- merasekettenreaktion jeweils eines der beiden komplementären Stränge verschiedener gesuchter
DNS-Abschnitte geeignet sind, und wobei die gesuchten DNS-Abschnitte jeweils Teil der c-DNS zu verschiedenen Tumormarkerproteinen ausgewählt aus den Tumormarkerproteinen plazen- ta-spezifische alkalische Phosphatase (PLAP) , kei zell-spezifische alkalische Phosphatase (GCAP), epitheliales Glykoprotein 40 (GA 733.2 bzw. EGP 40), high-mobility group protein isoform I-C (HMGI-C) und/oder Gastrin-releasing peptide receptor (GRPR) sind.
3. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens ein weiteres Paar Oligonukleotide (Rever- seprimer, Forwardprimer) enthält, wobei die beiden Oligonukleotide des Paares als
Primer zur Amplifikation mittels Polymeraseket- tenreaktion der Reaktionsprodukte einer Polyme- rasekettenreaktion mit einem der anderen Oligo- nukleotidpaare geeignet sind.
4. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ein weiteres Paar Oligonukleotide enthält, die jeweils als Primer zur Amplifikation zumindest eines Ab- Schnitts eines der beiden komplementären Stränge der cDNS zu dem Protein ß-Aktin als interne Kontrolle geeignet sind.
. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Oligonukleotide eines Paares paarweise die folgenden Sequenzen aufweisen:
GCCACGCAGCTCATCTCCAACATG und ATGATCGTCTCAGTCAGTGCCCGG; und/oder
AATCGTCAATGCCAGTGTACTTCA und TAACGCGTTGTGATCTCCTTCTGA; und/oder
AAAGGCAGCAAAAACAAGAGTCCC und CCAACTGCTGCTGAGGTAGAAATC; und/oder
TCTCCCCGTGAACGATGACTGGTC und TGAAGACAGACACCCCAACAGAGG .
6. Diagnose-Kit nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest jeweils eines der beiden Oligonukleotide eines Paares von Oligonukleotiden mit Fluoropho- ren markiert ist.
7. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide verschiedener Paare mit verschiedenen Fluoropho- ren markiert sind.
8. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Amplifikation der cDNS zu ß-Aktin ein Paar Oligonukleotide mit den folgenden Sequenzen enthält: CTGGAGAAGAGCTACGAGCTGCCT und ACAGGACTCCATGCCCAGGAAGGA.
9. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest jeweils eines der beiden Oligonukleotide des Paares zur Amplifikation der cDNS zu ß-Aktin mit Fluoropho- ren markiert ist.
10. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid mit folgender Sequenz
CTGGAGAAGAGCTACGAGCTGCCT mit dem Fluorophor 4,7,2' ,4" ,5', 7' -Hexachloro-6-Carboxyfluorescein markiert ist.
11. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es die zur Durchführung einer Polymerasekettenreaktion erforderlichen Substanzen enthält.
12. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es als zur Durchführung einer Polymerasekettenreaktion erforderliche Substanzen eine Pufferlösung, Magnesiumchlorid, Desoxynukleotid-Triphosphate sowie eine hitzestabile Polymerase enthält.
13. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß es als hitzestabile
Polymerase eine Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq-Polymerase) enthält.
14. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An- Sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es als Positivkontrolle eine DNS-Probe mit dem jeweils gesuchten DNS-Abschnitt enthält.
15. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An- sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Anleitung zur Durchführung der Polymerasekettenreaktion und/oder eine Anleitung zur Durchführung einer Fragmentanalyse enthält.
16. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Schema zur Auswertung der erhaltenen Meßergebnisse enthält.
17. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Mikroarray (DNS-Chip) enthält, wobei der Array eine Anzahl voneinander getrennter Zellen (Felder) aufweist und in mindestens einer Zelle des Mikroarrays ein Oligonukleotid angeordnet ist, das mit dem gesuchten DNS-Abschnitt hybridisiert.
18. Diagnosekit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens einer weiteren Zelle des Mikroarrays ein weiteres Oligonukleotid angeordnet ist und die Sequenz des Oligonukleotids, das in der mindestens einen
Zelle angeordnet ist, sich von der Sequenz des weiteren Oligonukleotides unterscheidet.
19. Diagnose-Kit nach einem der beiden vorhergehen- den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens zwei Zellen jeweils ein Oligonukleotid angeordnet ist, wobei die. in verschiedenen Zellen angeordneten Oligonukleotide jeweils mit verschiedenen gesuchten DNS-Abschnitten hybridi- sieren.
20. Mikroarray zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle von Hodentumoren, beispielsweise DNS- Chip, mit einer Anordnung von mehreren, von- einander getrennten Zellen, dadurch gekennzeich- net, daß in mindestens einer Zelle ein Oligonu- kleotid angeordnet ist, das mit einem DNS- Abschnitt hybridisiert, der Teil der cDNS zu einem der Tumormarkerproteine, plazenta- spezifische alkalische Phosphatase (PLAP) , keimzellspezifische alkalische Phosphatase (GCAP) , epitheliales Glykoprotein 40 (GA 733.2 bzw. EGP 40) , high-mobility group protein isoform I-C (HMGI-C) und/oder Gastrin-releasing peptide re- ceptor (GRPR) ist.
21. Mikroarray nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß in zwei bis vier Zellen jeweils verschiedene Oligonukleotide angeordnet sind, die mit jeweils zwei bis vier verschiedenen DNS-
Abschnitten, die Teil der cDNS von jeweils verschiedenen Tumormarkerproteinen ausgewählt aus den Tumormarkerproteinen plazenta-spezifische alkalische Phosphatase (PLAP) , keimzell- spezifische alkalische Phosphatase (GCAP) , epitheliales Glykoprotein 40 (GA 733.2 bzw. EGP 40), high-mobility group protein isoform I-C (HMGI-C) und/oder Gastrin-releasing peptide receptor (GRPR) sind, hybridisieren.
22. Verfahren zur Diagnostik oder Behandlungskon- trolle von Hodentumoren bei einem Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß in einer Blutprobe des Menschen das Vorhandensein oder Fehlen von mRNS erfaßt wird, die für mindestens eines der Tumormarkerproteine plazenta-spezifische alkalische Phosphatase (PLAP) , keimzell-spezifische alkalische Phosphatase (GCAP) , epitheliales Glykoprotein 40 (GA 733.2 bzw. EGP 40), high-mobility group protein isoform I-C (HMGI-C) und/oder Gastrin-releasing peptide receptor (GRPR) kodiert und daraus auf das Vorhandensein von Tumorzellen in der Blutprobe und damit auf mögliche Metasta- sierung geschlossen wird.
23. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, -dadurch gekennzeichnet, daß die mRNS in herkömmlicher Weise unmittelbar aus der Vollblutprobe isoliert wird.
24. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß anschließend an' die Isolation der mRNS ein DNS-Verdau durchgeführt wird.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die RNS-haltigen Bestandteile der Blutprobe zuerst aufkonzentriert werden und anschließend diese Fraktion untersucht wird.
26. Verfahren' nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß zur Auf konzentration der RNS-haltigen Bestandteile mindestens eine Zentrifugation der Blutprobe zur Pelletierung der in ihr enthaltenen Leukozyten durchgeführt wird.
27. Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Aufkonzentration der RNS-haltigen Bestandteile eine Lyse darin enthaltener Erythrozyten durchgeführt und anschließend die nichtlysierten Leukozyten als Fraktion pelletiert und für die weitere Dia- gnose gewonnen werden.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß zur Aufkonzentration der RNS-haltigen Bestandteile mindestens eine Dichtegradienten-Zentrifugation der Blutprobe zur Abseparierung und Gewinnung der in ihr enthaltenen mononuklearen Blutzellen durchgeführt wird.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß zur Separation von Hodentumorzellen die Zellen mit gegen Tumorzellen oder Hodentumorzellen gerichteten fluoreszenzmarkierten Antikörpern markiert und mittels fluoreszenzassoziierter- Zellsortierung (FACS) von der Probe abgetrennt und gewonnen werden.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß zur Separation von Tumorzellen oder Hodentumorzellen die Zellen mit magnetischen Partikeln in Kontakt gebracht werden, auf derenOberfläche gegen Tumorzellen oder Hodentumorzellen gerichtete Antikörper immobilisiert sind und die magnetischen Partikel an- schließend abgetrennt werden.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß die mononuklearen Zellen der gewonnenen Fraktion lysiert und die mRNS abgetrennt wird.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß die gewonnene mRNS in cDNS revers transkribiert wird und anschlie- ßend das Vorhandensein oder Fehlen der cDNS erfaßt wird, die dem Tumormarkerprotein zugeordnet ist.
33. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, da- durch gekennzeichnet, daß zumindest ein vorbestimmter Abschnitte der cDNS durch Polymerase- Kettenreaktion ("PCR") bzw. verschachtelte Polymerase-Kettenreaktion ("nested
PCR") vervielfältigt wird.
34. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vervielfältigung der cDNS eines oder mehrere Oligonukleotid-Paare verwendet werden, die die folgenden Sequenzen aufweisen: GCCACGCAGCTCATCTCCAACATG und ATGATCGTCTCAGTCAGTGCCCGG; und/oder
AATCGTCAATGCCAGTGTACTTCA und TAACGCGTTGTGATCTCCTTCTGA; und/oder
AAAGGCAGCAAAAACAAGAGTCCC und CCAACTGCTGCTGAGGTAGAAATC; und/oder
TCTCCCCGTGAACGATGACTGGTC und TGAAGACAGACACCCCAACAGAGG.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß als interne Kontrolle die mRNS des Proteins ß-Aktin bestimmt wird.
36. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, da- durch gekennzeichnet, daß die mRNS für ß-Aktin in cDNS revers transkribiert und ein Abschnitt der cDNS mittels Polymerasekettenreaktion vervielfältigt wird.
37. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vervielfältigung der cDNS des ß-Aktin ein Oligonukleotid-Paar verwendet wird, wobei die Oligonukleotide des Paares die folgenden Sequenzen aufweisen: CTGGAGAAGAGCTACGAGCTGCCT und ACAGGACTCCATGCCCAGGAAGGA.
38. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid mit der Sequenz
CTGGAGAAGAGCTACGAGCTGCCT mit dem Fluorophor 4, 7, 2 ' , 4 ' , 5 ' , 7 ' -Hexachloro-β- Carboxyfluorescein markiert ist.
39. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß der vervielfältigte cDNS-Abschnitt durch geeignete Restriktionsenzyme verdaut und anhand der erzeugten cDNS- Bruchstücke das Vorhandensein oder Fehlen der mRNS eines Tu ormarkerproteins bestimmt wird.
40. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der am- plifizierten cDNS- bschnitte eine Gelelektrophorese der PCR-Produkte durchgeführt wird.
41.' Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der am- plifizierten cDNS-Abschnitte eine Fragmentanalyse durchgeführt wird.
42. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß während des Verlaufs der Polymerasekettenreaktion die von den Produk- ten erzeugte Fluoreszenz erfaßt und die Produktentwicklung erfaßt wird (fluoreszenzbasierte Echtzeit-PCR) .
43. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der mRNS oder cDNS ein Nukleotid-Mikroarray nach einem der Ansprüche 20 oder 21 verwendet wird.
44. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, da- durch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der am- plifizierten cDNS das PCR-Produkt auf ein Nukleotid-Mikroarray nach einem der Ansprüche 20 oder 21 aufgetragen wird.
45. Verwendung eines Diagnose-Kits, eines Mikroarrays und/oder eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Diagnose von Erkrankungen oder Metastasierung oder zur Behandlungskontrolle bei Hodentumor.
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