EP1472378A2 - Genetische marker für die diagnose der ausprägung von stülpzitzen bei haus-, zucht- und nutztieren - Google Patents

Genetische marker für die diagnose der ausprägung von stülpzitzen bei haus-, zucht- und nutztieren

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Publication number
EP1472378A2
EP1472378A2 EP03737302A EP03737302A EP1472378A2 EP 1472378 A2 EP1472378 A2 EP 1472378A2 EP 03737302 A EP03737302 A EP 03737302A EP 03737302 A EP03737302 A EP 03737302A EP 1472378 A2 EP1472378 A2 EP 1472378A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
chromosome
microsatellite
mammals
nucleotides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03737302A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Torsten Hardge
Karl Schellander
Klaus Wimmers
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Forderverein Biotechnologieforschung Der Deutschen Schweineproduktion Ev
Original Assignee
Forderverein Biotechnologieforschung Der Deutschen Schweineproduktion Ev
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Forderverein Biotechnologieforschung Der Deutschen Schweineproduktion Ev filed Critical Forderverein Biotechnologieforschung Der Deutschen Schweineproduktion Ev
Priority to EP03737302A priority Critical patent/EP1472378A2/de
Publication of EP1472378A2 publication Critical patent/EP1472378A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/172—Haplotypes

Definitions

  • the invention relates to the use of a first nucleic acid for determining the predisposition for the expression or inheritance of the quantitative feature of inverted teat in a mammal, the first nucleic acid having a length of at least 8 nucleotides and being identical or essentially identical to a second nucleic acid that occurs in the region of microsatellite S0220 on chromosome 6 of the pig or in a homologous position in the genome of other mammals; or from microsatellite SW2443 on chromosome 2 of the pig or in a homologous position in the genome of other mammals; or from microsatellite S0097 on chromosome 4 of the pig or in a homologous position in the genome of other mammals; or from microsatellite S0007 on chromosome 14 of the pig or in a homologous position in the genome of other mammals; or from microsatellite SW1301 on chromosome 1 of the pig or in a homologous position in the genome of
  • the invention further relates to methods for determining the predisposition for the expression or inheritance of the quantitative feature of teat in mammals, preferably in domestic, breeding or farm animals, whereby the mammals, their fertilized or unfertilized egg cells, or their sperm on the presence, nature or expression of the above-mentioned second nucleic acid.
  • the invention relates to a kit containing at least one pair of primers for the amplification of one of the above-mentioned second nucleic acids, one primer each binding to the + strand and another primer to the - strand of the nucleic acid, or a hybridization probe with a length of at least 8 nucleotides which binds to one of the second nucleic acids mentioned above, or a specific antibody or an antibody fragment which binds to the second nucleic acid disclosed above.
  • Genetic maps are created through coupling analyzes (Morton 1955; Xu 1997; Penalver 1999). Two prerequisites are required for this, namely an animal population with a known lineage (family structure) and numerous polymorphic loci (Archibald and Haley 1998). Molecular genetic markers can be used as polymorphic loci (Jarne and Lagoda 1996; Hui Liu 1998; Luikart and England 1999). A molecular genetic marker can be defined as a section of the genetic material that has or has a specific property. It is a marked locus that is inherited from generation to generation (Nagel 1996; O ⁇ rien et al. 1999).
  • RFLPs restriction fragment length polymorphisms
  • microsatellites Jarne and Lagoda 1996; Montaldo and Herrera-Meza 1998.
  • Most RFLPs are diallelic and, according to Hui Liu (1998), have low PIC (Polymorphism Information Content) values compared to microsatellites.
  • PIC Polymorphism Information Content
  • Microsatellites are numerous and have high PIC values. Around 65,000 to 100,000 microsatellite loci are evenly distributed in the pig genome (Ellegren 1993; Schlötterer 1997; Dounavi 2000). The identification of microsatellites is carried out by various laboratories, the current number of identified microsatellites is 1286 (as of 05.03.2001). A large number of quantitative performance characteristics of pigs and other mammals can already be achieved with the help of genetic Markers are predicted. To date, however, there is no possibility of demonstrating predisposing teat.
  • the present invention is therefore based on the object of providing genetic markers by means of which animals are identified which are predisposed to the expression of teats or pass on such a predisposition. This object is achieved according to the invention by providing the embodiments characterized in the patent claims.
  • the invention thus relates to the use of a first nucleic acid for determining the predisposition for the expression or inheritance of the quantitative feature of inverted teat in a mammal, the first nucleic acid having a length of at least 8 nucleotides and being identical or essentially identical to a second nucleic acid, which occurs in the region of microsatellite S0220 on chromosome 6 of the pig or in a homologous position in the genome of other mammals; or from microsatellite SW2443 on chromosome
  • the first nucleic acid is preferably DNA.
  • the second nucleic acid disclosed above is preferably genomic DNA or cDNA, but can also be an RNA transcript of this DNA. Genomic DNA and cDNA are mostly double-stranded, but the use according to the invention also includes single-stranded DNA molecules.
  • the first nucleic acid is preferably an oligonucleotide, but in certain embodiments can also be a polynucleotide.
  • the first nucleic acid mentioned usually has a length of at least 8 nucleotides, preferably at least 15 nucleotides, more preferably at least 18 nucleotides, even more preferably 21 nucleotides, most preferably 25 nucleotides.
  • the first nucleic acid can also be up to 50 nucleotides, more preferably up to 100 nucleotides, even more preferably up to 1000 nucleotides and most preferably up to 5000 nucleotides long or longer.
  • the first or second nucleic acid comprises whole genes or even groups of genes.
  • the first or second nucleic acid has a length of up to 1000 nucleotides, preferably up to 5000 nucleotides, for example up to 25000 nucleotides, such as up to 150,000 nucleotides.
  • Hybridization probes are nucleic acids that are used in hybridization and bind to homologous nucleic acids.
  • the hybridization probe is preferably a radioactively labeled nucleic acid or it contains modified nucleotides.
  • the invention also includes such modifications of the nucleic acids claimed here.
  • Hybridization probes and primers the second with the nucleic acids, preferably under stringent conditions' hybridize.
  • stringent hybridization conditions are understood to mean, for example, 0.2 ⁇ SSC (0.03 M NaCl, 0.003M sodium citrate, pH 7) at 65 ° C.
  • the hybridization temperature is below 65 ° C., for example above 55 ° C., preferably above 50 ° C.
  • Stringent hybridization temperatures depend on the size or length of the nucleic acid and its nucleotide compositions and are to be determined by a person skilled in the art by manual tests.
  • predisposition refers to the presence of a hereditary disposition, which can possibly result in an inheritance of the hereditary disposition and / or the expression of a characteristic.
  • the characteristic teat is a particularly broad and flat teat with a centrally located indentation of different thickness, where the teat tip can be invisible, instead of the teat tip a crater-shaped pit is then formed is mostly filled with black colored dirt particles.
  • teat teats can occur in all mammals, so the term “mammal” is to be viewed comprehensively and includes humans.
  • microsatellite S0220 is at position SSC6 98cM, microsatellite SW2443 at position SSC2 20cM, microsatellite SS40097 100cM, microsatellite S0007 at position SSC14 70cM, microsatellite SSW1301 at position SSC1 160cM and microsatellite S0164 at position SSC3 70cM. Since genetic mapping positions are dependent on the population, this position specification is subject to fluctuations.
  • microsatellite S0220 on chromosome 6 of the pig denotes a position on chromosome 6 which is specific for a population and comprises 5 cm upstream and / or downstream of the indicated position, preferably up to 10 cm upstream and / or downstream, more preferably 20 cm upstream and / or downstream and most preferably 30 cm upstream and / or downstream of the indicated position on the chromosome, the same applies to the other microsatellites mentioned.
  • microsatellite S0220 is defined as the region between microsatellites S0087 to S0003
  • microsatellite SW2443 is defined as the region between microsatellites SW2443 to SW240
  • microsatellite S0097 is defined as the region between microsatellites S0001 to S0097
  • microsatellite S0007 as the area between microsatellites S0007 to SWC27
  • microsatellite SW1301 defined as the area between microsatellites S0155 to SW1301
  • microsatellite S0164 defined as the area between microsatellites SW72 to SW2570.
  • the comparative genome maps between different species are based on the mapping of one or more loci in the genome of the species in question.
  • "Homologous position” refers to nucleic acid segments in the genome of other mammals that have a sequence identity with the second nucleic acid disclosed above, of at least 95% sequence identity, preferably at least 30%, stronger over the entire sequence length or in specific genes located here or at one or more loci preferably at least 40%, even more preferably at least 50% and particularly preferably 75% sequence identity
  • the sequence identity is preferably determined by the FASTA, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) or Bestfit algorithms of the GCG sequence analysis program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Ge ⁇ etics Computer Group, University Research Park, 575 Madison, Wl 53711).
  • the parameters are preferably set so that the percentage of identity is calculated over the entire length of the reference sequence and homology gaps ("gaps" ) of up to 5% of the G total number of nucleotides are allowed.
  • the so-called optional parameters are preferably left at their preset values.
  • the term “essentially identical” means that, for example, 7 nucleotides are identical in a range of 8 nucleotides. However, the invention also includes embodiments in which 4, 5 or 6 of the 8 nucleotides have the corresponding sequence of second nucleic acid are identical.
  • the first nucleic acid can be identical or essentially identical to the + strand as well as the - strand.
  • the term "a first nucleic acid” in the sense of the invention also includes that more than one (first) nucleic acid in the use according to the invention can be used. This can be, for example, two, three or four nucleic acids.
  • second nucleic acid can mean both the + strand and the - strand.
  • the first nucleic acid can be identical or essentially identical to the + strand during the other first nucleic acid may be identical or substantially identical to the strand, in which case it is preferred that the "Alignment" of the first nucleic acid is in opposite directions, which enables a PCR to be carried out.
  • nucleic acids are made available for the first time, which allow a targeted molecular-biological diagnosis of the predisposition to the teat. It must be taken into account in particular that the teat assessment is still carried out at a very early point in time, which mostly does not or only insufficiently permits detection of teats. With the invention disclosed here, the time of the selection can be shifted significantly forward, so that there is no longer any need to wait for the phenotypic expression of the feature. In addition, the introduction of molecular biological markers can significantly increase the efficiency of the selection process.
  • This selection process includes the determination of the genotype of the subject / mammal at one or more loci in a region of the above-mentioned second nucleic acids, preferably in two regions, more preferably three, more preferably four, more preferably five, most preferably in six regions and the assessment of an individual as suitable or unsuitable for breeding, including information about the coupling phase between the genotyped marker locus and the genes responsible for the defect expression.
  • the genotypes of suitable and unsuitable mammals can be distinguished by a different number of copies of a repetitive nucleotide sequence within the microsatellite locus under consideration.
  • nucleic acid can be shown in a PCR reaction using suitable primers and is reflected in different PCR product sizes and / or different restriction fragment lengths.
  • the tests are usually performed on tissue samples from the mammal, or on samples of sperm, egg, urine or blood.
  • a preferred embodiment of the invention relates to the use of combinations of at least two, three, four, five or six of the above-mentioned nucleic acids for determining the predisposition for the expression or inheritance of the quantitative feature of the teat. This preferred embodiment is particularly suitable for increasing the reliability of the detection.
  • the second nucleic acid disclosed above being a microsatellite or a sequence flanking it.
  • the microsatellite is S0164, SW1301, S0007, S0097, S2443 or S0220, or one of the neighboring microsatellites SW72 and S0002, SW1301, SW857 and SWC27, S0214, SW240, S0087, S0003, SW2570, S0155, S0001.
  • Microsatellite S0164 is preferred here, more preferably SW1301, even more preferably S0007, more preferably S0097, even more preferably S2443 and most preferably S0220.
  • the flanking sequence lies outside the repetitive sequences typical of the microsatellite and preferably comprises a region of 1 kB upstream or downstream of the repetitive sequences.
  • the second nucleic acid is a specific gene.
  • the genes ryrl, TGFB1, GPI, POU2F2, EAH, Tenascingen, HSPA5, orosomucoid gene, steroidogenic factor 1, relaxingen, GGTA1, TSHB, ATP1A1, NGFB, PKLR, OAT, MLB2, Npy4R, PLAU, parathyroid hormone-like are preferred (parathyroid-hormone-like hormones) and parathyroid hormone receptor 1, as well as all other genes located in the nucleic acids disclosed above but not listed here individually.
  • Genes in the sense of the invention can include the coding as well as the non-coding sections of the DNA, ie introns, exons and regulatory areas such as promoters.
  • such genes can also be surrounded by flanking sequences, which preferably comprise a region of 1 kB upstream or downstream of the genes.
  • the invention relates to the use of the disclosed second nucleic acids for the selection of domestic, breeding or farm animals with missing teats.
  • the domestic, breeding or farm animals are cattle, pigs, goats, sheep, horses, donkeys, rats or mice.
  • a genome screen is carried out on several related mammals in a population.
  • the term "several related mammals” includes at least two animals of a population, preferably at least 5 animals, more preferably at least 10 animals, even more preferably at least 10 animals, more preferably at least 50 animals, even more preferably at least 250 animals, most preferably 1500 animals
  • the animals are ultimately derived from a pair of parents
  • the genome screen is used to examine whether a nucleic acid of at least 8 nucleotides in length, preferably up to 50 nucleotides, more preferably 350 nucleotides, even more preferably 1000 nucleotides, most preferably up to 5000 nucleotides or is inherited for a longer time together with the characteristic teat, especially in this case it is clarified, for example with the aid of nucleic acid amplification methods or hybridization methods, which marker is inherited together with the characteristic teat.
  • a common inheritance of nucleic acids with the phenotypic expression of the teat implies genetic coupling of the nucleic acid to the trait.
  • Preferred markers are microsatellite S0220 on chromosome 6 of the pig or from microsatellites in a homologous position in the genome of other mammals; or from SW2443 microsatellite on pig chromosome 2 or from microsatellites in a homologous position in the genome of other mammals; or from microsatellite S0097 on chromosome 4 of the pig or from microsatellites in a homologous position in the genome of other mammals; or from microsatellite S0007 on pig chromosome 14 or from microsatellites in a homologous position in the genome of other mammals; or from SW1301 microsatellite on pig chromosome 1 or from microsatellites in a homologous position in the genome of other mammals; or from microsatellite S0164 on chromosome 3 of
  • the preferred marker here is microsatellite S0164, more preferably SW1301, even more preferred S0007, more preferably S0097, even more preferably S2443 and most preferably S0220.
  • other nucleic acid sequences can also be used as markers, provided they are identical or essentially identical in the sense of the invention to the second nucleic acid disclosed in the invention or lie in one of the above-mentioned nucleic acid regions.
  • nucleic acid segments disclosed in the invention can readily use or develop detection methods for determining the predisposition to teat.
  • the invention also discloses methods for determining the predisposition for the expression or inheritance of the quantitative feature of teat in domestic, breeding, or farm animals, the animals, their fertilized or unfertilized egg cells, or their sperm, depending on the presence, expression or nature of a of the above second nucleic acid tests.
  • Different "forms or textures" of nucleic acids can be caused, for example, by insertions, duplications, deletions, substitutions or translocations. Inserts or deletions, for example, result in a changed nucleic acid length. Duplications are a phenomenon usually observed in the generation of microsatellites.
  • This length polymorphism can, for example are shown in a PCR reaction and is reflected when using suitable flanking primers, for example in the case of insertion in a longer PCR product.
  • the different "expression or nature” can also, for example be a closely related gene variant, which in extreme cases differs from the related gene sequence only by a single nucleotide exchange.
  • Such different “forms or qualities” of the nucleic acid can optionally be carried out with the aid of RFLP analyzes (restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) or through
  • the methods according to the invention also relate to other mammals, in particular humans.
  • the domestic, breeding or farm animals are cattle, pigs, goats, sheep, horses, donkeys, rats or mice.
  • a PCR amplification is carried out with complementary primers with a length of at least 8 nucleotides, one primer binding to the + strand and another primer in opposite orientation to the - strand of the second nucleic acid, or it will a hybridization is carried out, wherein a hybridization probe with a length of at least 8 nucleotides binds to the second nucleic acid, or a sequencing of the second nucleic acid is carried out, or a detection is carried out with a specific antibody or antibody fragment or antibody derivative or an aptamer, the Antibody or the antibody fragment or the antibody derivative or the aptamer is specifically directed against the second nucleic acid.
  • the reaction mixture also contains an excess of deoxynucleoside triphosphates and a DNA polymerase, for example Taq polymerase.
  • a DNA polymerase for example Taq polymerase.
  • the primers bind to the nucleic acid and the DNA polymerase extends the primers based on the nucleotide sequence specified in the nucleic acid.
  • the cycles and reaction conditions shown in Table 4 are preferably selected.
  • the annealing temperature of a primer is influenced by its adenine + tymine and cytosine + guanine content. 2 ° C are calculated for each adenine and tymin, while 4 ° C is calculated for each cytosine and guanine.
  • the quality of a PCR reaction is directly influenced by the primer concentration, the changing amount of dNTP in the PCR mix and the quality of the Taq DNA polymerase.
  • PCR reactions with a final volume of 12.5 ⁇ l.
  • the PCR reactions were set up at 25 ⁇ l.
  • the reaction mixture at 12.5 ⁇ l final volume was composed as follows: 0.20 ⁇ M primer, 200 ⁇ M dNTPs, 0.50 U Taq polymerase, 1.25 ⁇ l 10 ⁇ buffer, 1.50 ⁇ l DNA (50ng / ⁇ l) and made up to 12.5 ⁇ l with H 2 O.
  • Primers are those nucleic acids that are at least 8 nucleotides in length and bind to one of the second nucleic acids disclosed above.
  • Preferred primers have a length of at least 8 nucleotides, preferably at least 13, 15, 17 or 20 nucleotides, more preferably at least 30 nucleotides, even more preferably at least 50 nucleotides and most preferably at least 70 nucleotides.
  • the nucleotide sequences of the primers can be combined as desired from the second nucleic acid sequences disclosed above, provided that they have at least 8 consecutive nucleotides.
  • primers when the primers are hybridized with the target sequence within the second nucleic acid, base mismatches can also occur (provided that they are hybridized under the chosen reaction conditions, which can lead to an elongation reaction).
  • a primer should have 7 identical nucleotides within 8 neighboring nucleotides.
  • the invention also includes those embodiments in which 4, 5 or 6 of the 8 nucleotides are identical to the corresponding sequence of the second nucleic acid.
  • the basic principles of the PCR methodology must be observed, the process steps and reaction conditions of which are state of the art. In detail, however, the method steps may nevertheless require adjustment by a person skilled in the art.
  • PCR reverse polymerase chain reaction
  • RT-PCR reverse polymerase chain reaction
  • Amplification methods have been developed in recent years, further amplification methods, which are also preferred embodiments of the invention.
  • Other amplification methods are for example the “Ligase Chain Reaction” (LCR, EPA 320308), “Cyclic Probe Reaction” (CPR,), “Strand Displacement Amplification” (SDA, Walker et al., Nucleic Acids Res. 1992 (7): 1691-6. ) or “Transciption-based amplification systems” (TAS, Kwoh et al Proc. Nat. Acad Sei. USA 86: 1173 (1989), Gingeras et al., PCT Application WO 88/10315).
  • the hybridization probe is understood to mean a nucleic acid with a length of at least 8 nucleotides, preferably up to 50 nucleotides, more preferably up to 100 nucleotides, even more preferably up to 1000 nucleotides and most preferably up to 5000 nucleotides, which are attached to one of the above disclosed second nucleic acids binds.
  • the first nucleic acid is preferably provided with a detectable label, such as a radioactive or fluorescent label. Examples of hybridization methods are dot blot, northern blot, reverse northern blot, in situ hybridization or southern blot.
  • primers are understood to be those nucleic acids which comprise at least 8 nucleotides, preferably up to 13, 15, 17 or 20 nucleotides, more preferably up to 30 nucleotides, even more preferably up to 50 nucleotides and most preferably up to 70 nucleotides.
  • the properties shown for the PCR primers apply accordingly to sequencing primers.
  • primers or hybridization probes which are derived from the above-mentioned second nucleic acids, are suitable for special detection methods, for example PCR methods, sequencing or hybridization methods, and which are not, or less are suitable.
  • the primers or hybridization probes for use in the invention can also be present, for example, in larger DNA or RNA sequences, for example flanked by restriction sites, and moreover Nucleic acids, hybridization probes and primers can also be constructed from base derivatives.
  • the nucleic acids can have a label for detection. Examples of this are radioactive labeling, for example with 32 P or 3 H fluorescent labeling, biotin labeling, digoxigenin labeling,
  • Peroxidase labeling or labeling with an alkaline phosphatase Another preferred detection method is the detection of the first or second nucleic acid with a specific antibody or antibody fragment or antibody derivative or an aptamer. This method generates specific antibodies that recognize the first or second nucleic acids. Fragments of antibodies are e.g. Fab or F (ab) 2 fragments
  • Derivatives include scFvs.
  • Aptamers are nucleic acids that bind specifically to a target molecule due to their three-dimensional structure.
  • Methods for generating specific antibodies are known from the prior art.
  • the specificity of binding to the genomic nucleic acid can e.g. by competition experiments with radioactively labeled desired target nucleic acid and unwanted, e.g. randomly selected nucleic acid can be tested.
  • Common detection methods in which the antibodies are used are e.g. ELISA or RIPA but also immunofluorescence and other detection methods.
  • the antibodies specifically bind the first or second nucleic acids. Antibody binding can e.g.
  • the antibodies can e.g. be modified with fluorescent substances, by radioactive labeling or an enzymatic labeling.
  • immunological detection methods using specific antibodies are known from the prior art. Examples include Harlow et al., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press and all subsequent editions.
  • a genome screen is carried out on several related mammals in a population.
  • the term “several related mammals” includes at least two animals in a population, preferably up to 5 animals, more preferably 10 animals, even more preferably 10 animals, more preferably 50 animals, even more preferably 250 animals, on most preferred 1500 animals.
  • the genome screen examines whether a nucleic acid of at least 8 nucleotides in length, preferably up to 50 nucleotides, more preferably 350 nucleotides, even more preferably 1000 nucleotides, most preferably up to 5000 nucleotides or longer, is inherited together with the feature teat.
  • a common inheritance of nucleic acids with the phenotypic expression of the inverted tip implies a genetic coupling of the nucleic acid to the gene controlling the characteristic and also indicates which marker allele is located on the same homologous chromosome as the allele involved in the phenotypic expression of the inverted tip on the defect gene, ie in which coupling phase there is marker locus and defect locus.
  • Preferred markers are microsatellite S0220 on pig chromosome 6 or microsatellites in a homologous position in the genome of other mammals; or SW2443 microsatellite on pig chromosome 2 or microsatellites in a homologous position in the genome of other mammals; or microsatellite S0097 on pig chromosome 4 or microsatellites in a homologous position in the genome of other mammals; or microsatellite S0007 on pig chromosome 14 or microsatellites in a homologous position in the genome of other mammals; or SW1301 microsatellite on pig chromosome 1 or microsatellites in a homologous position in the genome of other mammals; or microsatellite S0164 on chromosome 3 of the pig or microsatellites in a homologous position in the genome of other mammals.
  • the preferred marker here is microsatellite S0164, more preferably SW1301, even more preferably S0007, more preferably S0097, even more preferably S2443 and most preferably S0220.
  • other nucleic acid sequences can also be used as markers, provided that they are identical or essentially identical to the second nucleic acid disclosed in the invention in the sense of the invention.
  • sequences flanking the microsatellites for example as target sequences for the PCR primers, can also be included in the analysis.
  • the invention further relates to a kit containing at least one pair of primers for the amplification of the second nucleic acid, one primer each on the + strand and another primer binds to the strand of this nucleic acid; or a hybridization probe with a length of at least 8 nucleotides that binds to the second nucleic acid; or an antibody or an antibody fragment or an antibody derivative or an aptamer that specifically binds the first or second nucleic acid.
  • primers are understood to be those nucleic acids which comprise at least 8 nucleotides, preferably up to 20 nucleotides, more preferably up to 30 nucleotides, even more preferably up to 50 nucleotides and most preferably up to 70 nucleotides.
  • the nucleotide sequences of the primers can be combined as desired from the second nucleic acid sequences disclosed above, provided that they have at least 8 consecutive nucleotides.
  • a primer should have at least 7 nucleotides identical to the target sequence within 8 neighboring nucleotides.
  • the invention also includes those embodiments in which 4, 5 or 6 of the 8 nucleotides are identical to the corresponding sequence of the second nucleic acid.
  • Kits based on hybridization methods contain a hybridization probe.
  • the hybridization probe can be up to 50 nucleotides long, more preferably up to 100 nucleotides, even more preferably up to 1000 nucleotides, and most preferably up to 5000 nucleotides or longer.
  • the hybridization probe is preferably a radioactively labeled nucleic acid or it contains modified nucleotides.
  • Kits for the detection of nucleic acids on ELISA, RIPA or similar basis contain a specific antibody or an antibody fragment or an antibody derivative or an aptamer. Antibodies or antibody fragments or antibody derivatives or aptamers are specifically directed against the first or second nucleic acid. Common detection methods in which the kits are used are, for example, ELISA or RIPA, but also immunofluorescence and other detection methods. Immunological detection methods and methods for generating specific antibodies are known from the prior art.
  • the components of the kit can be packed in containers such as vials, optionally also in buffers and / or solutions. Optionally, one or more of the components can be packaged in the same container. Additionally or alternatively, one or more components can be absorbed on a solid support, such as on nitrocellulose filters, nylon membranes, or on the well of a microtiter plate.
  • Figure 1 Coupling card on chromosome 1. The figure shows gender-neutral, female and male coupling cards of the markers SW1515, SW1851,
  • FIG. 1 QTL effects for inverted teats on chromosome 1. A significant effect in the range of microsatellite SW1301 was identified.
  • Figure 3 Coupling card on chromosome 4.
  • the figure shows gender-neutral, female and male coupling cards of markers S0227, S0001, S0214, S0097 on chromosome 4.
  • Figure 4 QTL effects for inverted teats on chromosome 4. From the microsatellite S0001, the graph rises to the location of the marker S0097, where it reaches its maximum value.
  • Figure 5 Coupling card on chromosome 6.
  • the figure shows gender-neutral, female and male coupling cards of markers S0035, S0087, S0220 and S0003 on chromosome 6.
  • Figure 6 QTL effects for teat on chromosome 6. The highest NPL value for the feature teat was identified on chromosome 6 in the area of marker S0220.
  • FIG 7 Coupling card on chromosome 14.
  • the figure shows gender-neutral, female and male coupling cards of markers SW857, S0007 and SWC27 on chromosome 14.
  • Figure 8 QTL effects for inverted teats on chromosome 14. The NPL value increases to 4.8 in the localization of microsatellite S0007.
  • Figure 9 Coupling card on chromosome 8.
  • the figure shows gender-neutral, female and male coupling cards of markers SW 2410, S0086, S0144, SW61 on chromosome 8.
  • Figure 11 Coupling card on chromosome 10. The figure shows gender-neutral, female and male coupling cards of markers SW830, S0070, SW2067 on chromosome 10.
  • Figure 12 QTL effects for teats on chromosome 10.
  • the course of the NPL graphic shows a maximum of less than 2.5, which is below the level of significance and otherwise remains below 1.5.
  • Figure 13 Coupling card on chromosome 10. The figure shows gender-neutral, female and male coupling cards of the markers SO143
  • Figure 14 QTL effects for teats on chromosome 12.
  • the NPL value shows a peak of two and is therefore clearly not significant.
  • Figure 15 Coupling card on chromosome 16.
  • the figure shows gender-neutral, female and male coupling cards of markers S0111, S0026 and S0061 on chromosome 16.
  • Figure 16 QTL effects for teats on chromosome 16.
  • the NPL value rises between the microsatellite markers S0111 and S0026 and reaches its maximum value of 4.2.
  • Figure 17 Coupling card on chromosome 18. The figure shows gender-neutral, female and male coupling cards of markers SW1023, SW787 and SWR414 on chromosome 18.
  • Figure 18 QTL effects for teats on chromosome 18.
  • the NPL value on chromosome 18 rises above 3.5 in the location of the marker SWR414.
  • Figure 19 a-c QTL regions for the feature teat on chromosomes 1 (Sscrl), 2 (Sscr2) and 6 (Sscr6) in animals of commercial origins of the German Landrace breed and their crossing with German noble pig.
  • microsatellites and other loci and microsatellite typing A total of 72 microsatellite loci, which are evenly distributed over the autosomes, were selected and typed.
  • the microsatellites used are summarized in Tables 1 and 2.
  • the typings of two microsatellites on chromosome 8 (S0086 and S0144) were provided by the Institute for Farm Animal Science, Humbold University Berlin.
  • the coupling card of the American group (USDA-MARC) was used.
  • the coupling card of the European group (PiGMaP) was used to select the four microsatellite loci, S0035, S0087, S0220 and S0003.
  • Table 3 Selected Type I markers and candidate genes, their function and effects on the mammary gland
  • Leptin receptor mediates growth and mediator effect
  • Estrogen receptor mediates effect of the growth of the duct system, Oka et al, 1991, Gravert, 1983, Nicholson et al, ESR1 Ostrogen's teat development 1988
  • Parathyroid hormone epithehal-mesenchymale mediates effect of receptor 1, interactions during Lanske et al, 1996 PTHLH PTHR1 development of the mammary gland
  • the polymerase chain reaction is a fast and effective method with which nucleotide sequences can be enzymatically amplified (amplified) in vitro.
  • the method mainly consists of repeating three steps. In the first step, the DNA is denatured (the two DNA strands are separated), in the second, the temperature of the primers attaches to their complementary sequences. In the last step, the Taq polymerase supplements the single strands to the double strands.
  • Table 4 shows the program used in the present work.
  • Table 4 PCR programs used. The annealing temperatures vary between 55 and 65 ° C.
  • the annealing temperature of a primer is influenced by its adenine + tymine and cytosine + guanine content. 2 ° C are calculated for each adenine and tymin, while 4 ° C is calculated for each cytosine and guanine.
  • the quality of a PCR reaction is directly influenced by the primer concentration, the changing amount of dNTP in the PCR mix and the quality of the Taq DNA polymerase.
  • PCR reactions with a final volume of 12.5 ⁇ l were set up.
  • the PCR reactions were set up at 25 ⁇ l. With a final volume of 12.5 ⁇ l, the reaction mixture was composed as follows:
  • a DNA sequencer (DNA Analyzer 4200, LI-COR) was used for the electrophoretic separation of the PCR products. PCR reactions can show different results, which result from different band intensities. This is particularly the case with multiplex PCR reactions.
  • the LI-COR sequencer system also enables weaker bands to be detected. With the "Intensity adjustment" function, the weaker bands can be made clearer and analyzed. An overview of the LI-COR system is provided by Mclndoe et al. (1996).
  • the glass plates were rinsed thoroughly with warm water and detergent to remove gel residues and dried thoroughly with a lint-free paper towel.
  • the rinsed glass plates were then washed again with double-distilled water and rubbed with alcohol (70% ethanol). After washing, binding silane was pipetted onto the upper glass plate in the area of the gel pocket comb and wiped off with the paper towel. This allows stable gel pockets to be created.
  • Two spacers, which determine the thickness of the gel, were inserted between the two glass plates. The glass plates lying on top of each other were then assembled with brackets.
  • the software program "ONE-DSCAN" was used for the fragment length determination of the alleles.
  • the program calculates the fragment length of the samples to be examined based on the previously entered fragment lengths of the standard samples. Fragments were used as standard, the fragment lengths of 75 bp, 100 bp, 105 bp, 120 bp, 145 bp, 175 bp, 200 bp, 204 bp, 230 bp, 255 bp, 300 bp, both at 700 nm and 800 nm, 1 ⁇ l of each of the fragments mentioned was mixed together and from this Mix 0.7 ⁇ l of mixture on the gel. linkage analysis
  • the program CRI-MAP was used for the coupling analysis, which estimates the genetic distances between loci according to the Kosambi mapping function and using the maximum likelihood method.
  • multi-loci gene maps can be created quickly and fully automatically and differences in recombination rates between the sexes can be taken into account.
  • Various options were used in the CRI-MAP program.
  • With the "Build” function a genetic gene map was calculated by successively incorporating the loci.
  • the "Twopoint” function two-point coupling analyzes were calculated for each pair of markers. The resulting arrangement of the loci was checked with the "Flipsn" function.
  • Female, male and gender-neutral coupling cards were created with the CRI-MAP program.
  • the main goal of QTL studies is to localize disease-causing or performance-determining chromosome regions in the genome of farm animals or humans.
  • the program packages "Genehunter” (Kruglyak et al., 1996) and “Allegro” (Gudbjartsson et al. 2000) were used for the QTL analysis in this work.
  • the two programs are statistical analysis programs that can perform both parametric and nonparametric analyzes with many genetic markers. This is particularly necessary if you want to map the genes that are responsible for a complex disease and family tree data are available, as is the case in the analyzed population.
  • the Allegro program is a new version of Genehunter and includes all of its functions, but can accommodate larger families and work faster.
  • the program packages perform nonparametric analyzes as follows.
  • the individuals of a pedigree are divided into " founder” and "Non founder” individuals.
  • the founders are individual parents (sows and boars) whose ancestor information is not known or is not taken into account, while the descendants of founder individuals represent the non-founder animals.
  • Each parent animal (founder) has two alleles, a paternal allele and a maternal allele.
  • inheritance vectors can be created which represent all possible states of the parental alleles in the offspring concerned.
  • inheritance vectors in which one progeny receives a maternal allele from the boar and the other a paternal allele are excluded.
  • the other inheritance vectors are considered to be equally probable and a "normalized score" Z (v) is calculated, which has a mean value of 0 and a variance of 1 under the null hypothesis Ho (no link between disease locus and marker allele).
  • v normalized score
  • NPL non parametric lodscore
  • Example 1 Creation of a resource population and isolation of the DNA A test population was created in the F 2 generation of which there are high incidence of teats.
  • the F 2 test population is based on the reciprocal crossing of the Berlin miniature pig with Duroc.
  • a Duroc boar with four sows of the breed Berlin miniature pig and a miniature pig boar with five Duroc sows were mated repeatedly using artificial insemination.
  • the animals were mated to one another by the F ⁇ generation.
  • the resource population the characteristics of the mammal quality, in particular the number of teats and their location, were recorded. In the population, 53.6% of the animals are affected by a mammal anomaly.
  • the proportion of animals that show at least one teat is 42.2%.
  • the phenotypic teat anomalies were recorded in 969 F2 animals of the resource population.
  • the evaluation of the suckles took place approximately between the 130th and 200th day of life. This period largely coincides with that of the youngster selection in breeding practice.
  • DNA was isolated from both blood and tissue (tail and ears). The isolation of high molecular DNA was carried out in the following steps by disrupting the cells and releasing the DANN using ProteineaseK digestion, phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation.
  • the F 2 generation of the test population was initially genotyped using 69 microsatelite markers, which cover the genome with an average spacing of 35 cM. After evaluating the gel images and assigning the genotypes, the genetic maps were calculated and the statistical analysis was carried out to identify QTL regions. To narrow the QTL regions, additional microsatellites and type I markers were typed in two test areas; a total of 85 DNA markers were analyzed in this way. Nonparametric approaches were used for statistical analysis. In order to achieve a level of significance of 1% in a genome-wide study, an NPL value of approximately 4.3 is necessary for an F 2 population. The corresponding NPL value at a significance level of 5% is approximately 3 (Lander and Kruglyak 1995).
  • NPL> 4.3 A total of six QTL regions with highly significant NPL values (NPL> 4.3) were identified that contain one or more genes that have a significant effect on the occurrence of teats. The results are summarized in the table below.
  • the length of the entire chromosome 1 is 145.3 cM for the gender-neutral map in this study, while it is 110.4 cM for the female map and 143.6 cM for the male map.
  • the coupling map of chromosome 1 is shown in Figure 1.
  • the microsatellite markers used are highly polymorphic.
  • the microsatellites SW1515 and SW1851 each have four alleles, the microsatellite S0155 has three, SW1301 has seven alleles and is highly informative. A significant effect could be identified on chromosome 1 with the microsatellites used.
  • the NPL value in the localization of microsatellite SW1301 reached 4.7.
  • the QTL effects on chromosome 1 are shown in Figure 2.
  • the microsatellites S0227, S0001, S0214 and S0097 were genetically mapped on chromosome 4.
  • the length of the entire chromosome 4 in the gender-neutral map is 117.7 cM in this study, while it is 165.9 cM in the female map and 101.5 cM in the male map.
  • Coupling map of chromosome 4 is shown in FIG. 3.
  • FIG. 4 shows the result of the coupling analysis for teats on chromosome 4. There is no effect in the area between microsatellites S0227 and S0001. From the microsatellite S0001, the graph rises to the location of the marker S0097, where it reaches its maximum value and drops immediately. On chromosome 4, an NPL value of 5.0 was achieved for the feature teat.
  • the microsatellite loci S0035, S0087, S0220, S0003 were mapped on chromosome 6.
  • the length of the gender-neutral coupling card of chromosome 6 is 147.7 cM.
  • the length of the female coupling card is 193.4 and that of the male 184.4 cM. 5 shows the microsatellites that were used in this work.
  • the microsatellite markers S0035, S0087, S0220 and S0003 were used on chromosome 6. The distribution of the 4 microsatellites on chromosome 6 is even. The number of alleles is three for S0220 and S0035, four for S0003 and five for S0087.
  • the S0220 microsatellite delivers a high PIC value of 0.85.
  • the PIC of the other microsatellite markers is 0.80 for S0035, 0.67 for S0003 and 0.64 for S0087.
  • the highest NPL value for the feature teat was identified on chromosome 6 in the area of marker S0220.
  • the NPL value reaches a maximum value of 8.8. This value is highly significant.
  • the course of the NPL values on chromosome 6 is shown in FIG. 6.
  • the SW857, S0007 and SWC27 microsatellites were genetically mapped on chromosome 14.
  • the length of the entire chromosome 14 is 95.2 cM for the gender-neutral map in this investigation, while it is 90.2 cM in the female map and 100.7 cM in the male map.
  • Microsatellites on chromosome 14 are shown in FIG. 7.
  • Genotyping with the microsatellites SW857, S0007 and SWC27 resulted in over 2736 genotypes for QTL analysis on chromosome 14.
  • the microsatellite markers S0007 and SWC27 used were not so highly polymorphic with PIC values of 0.60 and 0.68.
  • the PIC value for microsatellite SW857 is 0.85.
  • the number of alleles identified is three for SWC27 and four for SW857 and S0007.
  • microsatellites SW2410, S0086, S0144 and SW61, were genetically mapped on chromosome 8, the length of the gender-neutral coupling card being 101.0 cM.
  • the lengths of the female and male coupling cards 116.4 and 87.7 cM were estimated on chromosome 8.
  • the gender-neutral, female and male coupling map of four microsatellites on chromosome 8 is shown in FIG. 9.
  • the microsatellite markers SW2410, S0086, S0144 and SW61 for chromosome 8 were selected and genotyped for the analysis of gene effects on teats.
  • KIT1 on chromosome 8 was also included in the analysis.
  • FIG. 10 shows the result of the coupling analysis for teats on chromosome 8.
  • Example 8 QTL and coupling analysis of chromosome 10
  • the SW830, S0070 and SW2067 microsatellites were genetically mapped on chromosome 10.
  • the length of the entire chromosome 10 is 135 cM in the gender-neutral map in this investigation, while it is 134.6 cM in the female map and 129.3 cM in the male map.
  • the coupling map of three microsatellites on chromosome 10 are shown in FIG. 11.
  • NPL value of 2.3 was identified on chromosome 10.
  • the PIC value of markers SW2067 and SW830 is low at 0.32 and 0.50 respectively, while marker S0070 has a larger PIC value of 0.85.
  • the graph of gene effects on teats on chromosome 10 runs below 1.5 with a maximum value above 2.5, which is far below the level of significance.
  • the course of the NPL on chromosome 10 is shown in FIG.
  • microsatellites S0143, SW874 and SW605, were genetically mapped on chromosome 12, with the length of the gender-neutral coupling card being 90.8 cM. On chromosome 12, the lengths of the female and male coupling cards were estimated to be 116.4 and 87.7 cM.
  • the gender-neutral, female and male coupling map of 4 microsatellites on chromosome 8 are shown in FIG. 13. An NPL value of 1.9 was identified on chromosome 12.
  • the microsatellites selected for QTL analysis on chromosome 12 are evenly distributed. Genotyping with the microsatellites S0143, SW874 and SW605 resulted in over 2736 genotypes for QTL analysis on chromosome 12.
  • microsatellite markers used were highly polymorphic with PIC values of 0.87 for SW605, 0.81 for SW874 and 0, 63 for S0143.
  • the number of alleles identified is six for SW874; four for SW605 and three for S0143.
  • the course of the NPL values on chromosome 12 is shown in FIG. 14. The maximum value is two.
  • the coupling between the markers S0143, SW874 and SW605 on chromosome 12 and the characteristic teat is clearly not significant.
  • Example 10 QTL and coupling analysis of chromosome 16
  • the microsatellite loci S0111, S0026 and S0061 were mapped on chromosome 16.
  • the length of the gender-specific coupling map of chromosome 16 is 94.7 cM.
  • the length of the female coupling card is 103.6 and the length of the male coupling card of chromosome 16 is 87.8 cM.
  • the gender-neutral, female and male coupling map of three microsatellites on chromosome 16 are shown in FIG. 15.
  • Three microsatellite loci, S0111, S0026 and S0061, were selected and genotyped for QTL analysis for the feature teat on chromosome 16. 2736 genotypes were available for performing the QTL analysis.
  • the allele number of microsatellite markers is three for S0061, four for S0026 and five for S0111.
  • the PIC value is 0.70 for marker S0061, 0.82 for marker S0111 and 0.87 for marker S0026.
  • the gene effect on chromosome 16 is particularly high with the microsatellite markers S0026 and S0061 with a value of 4.2.
  • the curve rises between the microsatellite markers S0111 and S0026 and reaches its maximum value on this chromosome of 4.2.
  • marker S0026 drops to 3.3 and rises again to form a second peak with a value of 4.1.
  • the course of the NPL on chromosome 16 was shown in FIG. 16.
  • the SW1023, SW787 and SWR414 microsatellites were genetically mapped on chromosome 18.
  • the length of the entire chromosome 18 is 68.8 cM for the gender-specific map in this investigation, while it is 78 cM in the female map and 61.3 cM in the male map.
  • Microsatellites on chromosome 18 are shown in FIG. 17.
  • FIG. 18 shows the result of the association analysis for teats on the chromosome
  • Microsatellite S2443 a value of 7.9.
  • microsatellites SW72 (51, 1 cM), S0164 (25.6 cM) SW2570 (32.6 cM) S0002 were genetically mapped on chromosome 3 with the specified distances. A significant effect could be identified on chromosome 3 with the microsatellites used become.
  • Ear notch samples from rated gilts as well as further ear notch or sperm samples from their parents were collected in breeding establishments from three breeding organizations. These animals were used for the coupling analysis and the investigation of the
  • the sample material from the commercial breeding populations comprises 201
  • Table 3 provides an overview of the animal material in the breeding population.
  • Table 6 Number of gilts and genetic structure of the sample material from the breeding populations
  • Breeding associations B C Total gilts rated (excluding parents) 105 30 66 201 affected 84 30 57 171 not affected 21 0 9 30 paternal half-sibling groups 19 8 10 37
  • the coupling analysis in animals from commercial herds shows a QTL with a maximum NPL of 2.6 for chromosome 6 when calculated over the entire animal material with 70 affected sibpairs from the breed Academic Landrasse, DL, and their crossing with Deutscher Edelschwein, DE This is in the position in which a QTL region with NPL 3.8 (SSC6 position OcM microsatellite S0035) was detected in animals of the DUMI resource population, but not the maximum NPL of 8.8 (SSC6 position 120 cM microsatellite) S0220) for this chromosome.
  • Including only the 45 affected sibpairs of the DL breed shows a maximum NPL of 1.9 in the position of the microsatellite S0220.
  • the development of the mammary gland is regulated by a number of hormones.
  • hormones In particular, the influence of sex hormones and metabolic hormones on the development of the mammary gland has been established and has been experimentally proven in various animal species (Oka et al., 1991; Günther, 1984). The effects of these hormones are mediated by various growth factors (Oka et al., 1991). It can be assumed that the development of lactation abnormalities is due to a dysregulation of the hormonal control. Therefore, genes coding for hormones, hormone receptors and growth factors are candidate genes for the analysis of teat abnormalities.
  • SNPs were identified by comparative sequencing of the project Transcripts of an adult animal of the breeds Duroc, Berlin miniature pig, Hampshire, Pietrain, German landrace, German noble pig as well as the F1 and F2 of the resource population.
  • the other candidate genes are genotyped using the polymorphisms described in the literature.
  • Chi-square tests and transmission disequilibrium tests were carried out for statistical analysis of the relationship between genotypic variation in the candidate gene locations and the trait.
  • the chi-square tests were carried out with the program package SAS (SAS, 2000), the TDTs with the program TDT / S-TDT program 1.1 (Shman et al., 1993).
  • genes TGFB1, LEPR on chromosome 6 and RLN on chromosome 1 map within the QTL regions identified here also represent positional candidate genes.
  • the test results are supported by the fact that the position of the leptin receptor and the TGFB1 on chromosome 6 is in the chromosome area, which also had a highly significant NPL score (8.8) in the QTL analysis.
  • the relaxin maps to chromosome 1 in the area of the QTL.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer ersten Nukleinsäure zur Bestimmung der Prädisposition für die Ausprägung oder Vererbung des quantitativen Merkmals Stülpzitze in einem Säuger, wobei die erste Nukleinsäure eine Länge von mindestens 8 Nukleotiden aufweist und identisch oder im wesentlichen identisch ist mit einer zweiten Nukleinsäure, die vorkommt im Bereich von Mikrosatellit S0220 auf Chromosom 6 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger oder von Mikrosatellit SW2443 auf Chromosom 2 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger oder von Mikrosatellit S0097 auf Chromosom 4 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger oder von Mikrosatellit S0007 auf Chromosom 14 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger oder von Mikrosatellit SW1301 auf Chromosom 1 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger oder von Mikrosatellit S0164 auf Chromosom 3 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Bestimmung der Prädisposition für die Ausprägung oder Vererbung des quantitativen Merkmals Stülpzitze in Säugern, vorzugsweise in Haus-, Zucht- oder Nutztieren, wobei man die Säuger, deren befruchtete oder unbefruchtete Eizellen, oder deren Sperma auf die Anwesenheit, Beschaffenheit oder Ausprägung der oben genannten zweiten Nukleinsäure testet. Schliesslich betrifft die Erfindung ein Kit, mindestens enthaltend ein Primerpaar zur Amplifikation einer der oben genannten zweiten Nukleinsäure, wobei jeweils ein Primer an den + Strang und ein weiterer Primer an den - Strang der Nukleinsäure bindet, oder eine Hybridisierungssonde mit einer Länge von mindestens 8 Nukleotiden die an eine der oben gennanten zweiten Nukleinsäuren bindet, oder einen Spezifischen Antikörper oder ein Antikörperfragment, das an die zweite vorstehend offenbarte Nukleinsäure bindet.

Description

Genetische Marker für die Diagnose der Ausprägung von Stülpzitzen bei
Haus-, Zucht- und Nutztieren
Die Erfindung betrifft die Verwendung einer ersten Nukleinsaure zur Bestimmung der Prädisposition für die Ausprägung oder Vererbung des quantitativen Merkmals Stülpzitze in einem Säuger, wobei die erste Nukleinsaure eine Länge von mindestens 8 Nukleotiden aufweist und identisch oder im wesentlichen identisch ist mit einer zweiten Nukleinsaure, die vorkommt im Bereich von Mikrosatellit S0220 auf Chromosom 6 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger; oder von Mikrosatellit SW2443 auf Chromosom 2 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger; oder von Mikrosatellit S0097 auf Chromosom 4 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger; oder von Mikrosatellit S0007 auf Chromosom 14 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger; oder von Mikrosatellit SW1301 auf Chromosom 1 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger; oder von Mikrosatellit S0164 auf Chromosom 3 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Bestimmung der Prädisposition für die Ausprägung oder Vererbung des quantitativen Merkmals Stülpzitze in Säugern, vorzugsweise in Haus-, Zucht- oder Nutztieren, wobei man die Säuger, deren befruchtete oder unbefruchtete Eizellen, oder deren Sperma auf die Anwesenheit, Beschaffenheit oder Ausprägung der oben genannten zweiten Nukleinsaure testet. Schließlich betrifft die Erfindung ein Kit, mindestens enthaltend ein Primerpaar zur Amplifikation einer der oben genannten zweiten Nukleinsaure, wobei jeweils ein Primer an den + Strang und ein weiterer Primer an den - Strang der Nukleinsaure bindet, oder eine Hybridisierungssonde mit einer Länge von mindestens 8 Nukleotiden die an eine der oben genannten zweiten Nukleinsäuren bindet, oder einen spezifischen Antikörper oder ein Antikörperfragment, das an die zweite vorstehend offenbarte Nukleinsaure bindet.
In der Beschreibung sind eine Reihe von Dokumenten zitiert. Der Offenbarungsgehalt dieser Dokumente inklusive von Gebrauchsanweisungen von Herstellern ist hiermit per Referenz inkorporiert. Die Ausbildung eines funktionsfähigen Gesäuges ist maßgebend für die Anzahl aufgezogener Ferkel und damit auch für die Fruchtbarkeit beim Schwein. Nur Ferkel, die eine ausreichende Möglichkeit zur Milchaufnahme haben, können die Säugeperiode überleben. Gesäugemängel wirken sich besonders negativ bei der Aufzucht großer Würfe aus und können ohne Wurfausgleich zu einem Ansteigen der Ferkelsterblichkeit auf 40% bis 50% führen. Die häufigste Gesäugeanomalie stellen die „Stülpzitzen" dar, gefolgt von funktionsuntüchtigen Bei- und Zwischenzitzen. Darüber hinaus ist die jeweilige Anzahl funktionsfähiger Zitzen im Vor- bzw. Hinternabelbereich des Gesäuges von Bedeutung, da die Anzahl an Zitzendefekten in den Gesäugeregionen variiert. Obwohl das Drüsengewebe von Stülpzitzen nicht verändert ist, sind die Ferkel nicht in der Lage, diese Komplexe zu besaugen und meiden sie deshalb auch bei großen Würfen. Dies führt zu einer erhöhten Mastitisdisposition und Ferkelsterblichkeit.
Die geschilderten negativen Auswirkungen von Gesäugeanomalien auf das betriebsökonomische Ergebnis in der Schweinehaltung führen zu einer vorrangigen Beachtung der Gesäugequalität in der Schweinezüchtung. Eine Schlüsselposition bildet der Jungsauenverkauf. Gesäugemängel wie Stülpzitzen, Beizitzen und Mängel in der Zitzenverteilung führen zum Ausschluss einer Zuchtsau, für die dann nur der jeweilige Schlachtpreis erzielt werden kann. Zusätzliche Verluste entstehen den Zuchtverbänden durch den Ausschluss von Eberferkeln sowie von Besamungsebern mit Nachkommeninformation aufgrund von Gesäugeanomalien. Dabei ist aber zu berücksichtigen, dass die Zitzenbonitur der Eberferkel zu einem sehr frühen Zeitpunkt erfolgt, der die Erkennung von Stülpzitzen zumeist nicht zulässt.
Die Entwicklung molekulargenetischer Methoden, besonders die Entdeckung der Mikrosatelliten als polymorphe Marker, hat es ermöglicht, die molekulargenetischen Grundlagen vieler wirtschaftlich wichtiger Merkmale und Erbdefekte zu identifizieren. Die Zahl der genetisch kartierten Loci beim Schwein beträgt zur Zeit (Rothschild 2001) ungefähr 2000 Marker und Gene. Dies ermöglicht eine genomweite Suche nach Genomregionen, die Einfluss auf das betrachtete Merkmal ausüben. Diese Regionen werden als Quantitative Trait Loci (QTL) bezeichnet. Viele QTL-Untersuchungen wurden und werden im Hinblick auf Merkmale wie Reproduktionsleistung, Mast- und Schlachtleistung, Fleischqualität, Krankheitsresistenz, Immunantwort und andere Merkmale durchgeführt.
In den letzten zehn Jahren hat sich die Genkartierung beim Schwein rasch entwickelt. Dies war hauptsächlich die Leistung von drei Forschergruppen, nämlich in Europa das PiGMaP-Programm (Archibald et al. 1991 ; Archibald et al. 1995; Yerle et al. 1997) und das nordische Konsortium (Ellegren et al. 1994; Marklund et al. 1996) und in den USA das Meat Animal Research Center des US Department of Agriculture (USDA) (Rohrer et al. 1994).
Genetische Karten werden durch Kopplungsanalysen erstellt (Morton 1955; Xu 1997; Penalver 1999). Dafür sind zwei Voraussetzungen erforderlich, nämlich eine Tierpopulation mit bekannter Abstammung (Familienstruktur) und zahlreiche polymorphe Loci (Archibald and Haley 1998). Als polymorphe Loci kommen molekulargenetische Marker in Frage (Jarne and Lagoda 1996; Hui Liu 1998; Luikart and England 1999). Ein molekulargenetischer Marker kann definiert werden als ein Abschnitt des Erbmaterials, der eine bestimmte Eigenschaft hat oder hervorruft. Es handelt sich dabei um einen gekennzeichneten Locus, der von Generation zu Generation vererbt wird (Nagel 1996; OΕrien et al. 1999). Dass man die molekulargenetischen Marker relativ einfach identifizieren kann und dass sie zahlreich zur Verfügung stehen, sind Vorteile gegenüber anderen Markersystemen wie biochemischen oder immunologischen Markern. Die Genomanalyse beim Hausschwein wird hauptsächlich von zwei molekularen Markertypen dominiert. Diese Markertypen sind Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen (RFLPs) und Mikrosatelliten (Jarne and Lagoda 1996; Montaldo and Herrera-Meza 1998). Die meisten RFLPs sind diallelisch und haben nach Hui Liu (1998) im Vergleich mit Mikrosatelliten niedrige PIC-Werte (Polymorphism Information Content). Darüber hinaus ist die Darstellung von RFLPs zeit- und kostenaufwendig (Botstein et al. 1980; Winter et al,1992; Yue 1999). Mikrosatelliten dagegen sind zahlreich vorhanden und haben hohe PIC-Werte. Etwa 65.000 bis 100.000 Mikrosatellitenloci sind im Schweinegenom gleichmäßig verteilt (Ellegren 1993; Schlötterer 1997; Dounavi 2000). Die Identifizierung von Mikrosatelliten wird von verschiedenen Labors durchgeführt, die aktuelle Zahl von identifizierten Mikrosatelliten beträgt 1286 (Stand 05.03,2001 ). Eine große Anzahl an quantitative Leistungsmerkmale von Schweinen und anderen Säugern können bereits mit Hilfe von genetischen Markern vorhergesagt werden. Es gibt bis heute allerdings keine Möglichkeit Stülpzitzen-Prädisposition nachzuweisen.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, genetische Marker zur Verfügung zu stellen, durch die Tiere identifiziert werden, die zur Ausprägung von Stülpzitzen prädisponiert sind oder eine solche Prädisposition vererben. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen charakterisierten Ausführungsformen gelöst.
Somit betrifft die Erfindung die Verwendung einer ersten Nukleinsaure zur Bestimmung der Prädisposition für die Ausprägung oder Vererbung des quantitativen Merkmals Stülpzitze in einem Säuger, wobei die erste Nukleinsaure eine Länge von mindestens 8 Nukleotiden aufweist und identisch ist oder im wesentlichen identisch ist mit einer zweiten Nukleinsaure, die vorkommt im Bereich von Mikrosatellit S0220 auf Chromosom 6 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger; oder von Mikrosatellit SW2443 auf Chromosom
2 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger; oder von Mikrosatellit S0097 auf Chromosom 4 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger; oder von Mikrosatellit S0007 auf Chromosom 14 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger; oder von Mikrosatellit SW1301 auf Chromosom 1 des Schweins, oder homologe Positionen im Genom anderer Säuger oder von Mikrosatellit S0164 auf Chromosom
3 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger. Die erste Nukleinsaure ist vorzugsweise DNA.
Die oben offenbarte zweite Nukleinsaure ist vorzugsweise genomische DNA oder cDNA, kann aber auch ein RNA Transkript dieser DNA sein. Genomische DNA und cDNA sind meist doppelsträngig, die erfindungsgemäße Verwendung umfasst aber auch einzelsträngige DNA Moleküle. Die erste Nukleinsaure ist bevorzugt ein Oligonukleotid, kann aber in bestimmten Ausführungen auch ein Polynukleotid sein. Als Primer in PCR- oder Sequenzierreaktionen hat die genannte erste Nukleinsaure üblicherweise eine Länge von mindestens 8 Nukleotiden, bevorzugt mindestens 15 Nukleotiden, stärker bevorzugt mindestens 18 Nukleotiden, noch stärker bevorzugt 21 Nukleotiden, am stärksten bevorzugt 25 Nukleotiden. Bei einer Verwendung als Hybridisierungssonde z.B. im Southern Blot kann die erste Nukleinsaure aber auch bis zu 50 Nukleotide, stärker bevorzugt bis zu 100 Nukleotide, noch stärker bevorzugt bis zu 1000 Nukleotide und am meisten bevorzugt bis zu 5000 Nukleotide lang oder länger sein. In manchen Fällen umfasst die erste oder zweite Nukleinsaure ganze Gene oder sogar Gruppen von Genen. In diesen Fällen hat die erste oder zweite Nukleinsaure eine Länge von bis zu 1000 Nukleotiden, vorzugsweise bis zu 5000 Nukleotide, beispielsweise bis zu 25000 Nukleotide, wie bis zu 150000 Nukleotide.
Als Hybridisierungssonde sind solche Nukleinsäuren zu verstehen, die in einer Hybridisierung verwendet werden und hierbei an homologe Nukleinsäuren binden. Vorzugsweise ist die Hybridisierungssonde eine radioaktiv-markierte Nukleinsaure oder sie enthält modifizierte Nukleotide. Die Erfindung umfasst auch solche Abwandlungen der vorliegend beanspruchten Nukleinsäuren,
Hybridisierungssonden und Primer, die mit den zweiten Nukleinsäuren, bevorzugt unter stringenten ' Bedingungen, hybridisieren. Unter stringenten Hybridisierungsbedingungen werden im Sinne dieser Erfindung beispielsweise 0.2 x SSC (0.03 M NaCI, 0.003M Natriumeitrat, pH 7) bei 65°C verstanden. Bei kürzeren Fragmenten, beispielsweise Nukleinsäuremoleküle aus bis zu 20 Nukleotiden, liegt die Hybridisierungstemperatur unter 65°C, beispielsweise bei über 55°C, bevorzugt über 50°C. Stringente Hybridisierungstemperaturen sind abhängig von der Größe bzw. Länge der Nukleinsaure und ihrer Nukleotidzusammensetzungen und sind vom Fachmann durch Handversuche zu ermitteln. Die Grundprizipien der Hybridisierung und die Anforderungen an eine Hybridisierungssonde sind dem Fachmann hinreichend bekannt. Beispielsweise sei hier auf Maniatis, et al. Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1982 oder Harnes und Higgins, Nucleic acid hybridisation: a practical approach, IRL Press, Oxford 1985 verwiesen.
Als „Prädisposition" bezeichnet man das Vorhandensein einer Erbanlage, die gegebenenfalls in einer Vererbung der Erbanlage und/oder einer Ausprägung eines Merkmals resultieren kann. Bei dem Merkmal Stülpzitze handelt es sich um eine besonders breite und flache Zitze mit einer zentral gelegenen Einstülpung unterschiedlicher Stärke, wobei bei Einstülpung die Zitzenspitze unsichtbar sein kann, anstelle der Zitzenspitze ist dann eine kraterförmige Grube ausgebildet, die meist durch schwarzgefärbte Schmutzpartikel ausgefüllt wird. Grundsätzlich können Stülpzitzen bei allen Säugern auftreten, der Begriff „Säuger" ist also umfassend anzusehen und schließt den Menschen mit ein. Die Stülpzitze und ihre unterschiedlichen Ausprägungen bei Mensch und Tier sind dem Fachmann durchaus bekannt, dennoch sei auf die einschlägige Literatur verwiesen wie z.B. Günther et al., 1985; Brevern et al., 1994; Wendt und Haider, 1994; Steffens 1993.
Bezogen auf die geschlechtsneutrale PiGMaP Kopplungskarte (Brown und Archibald, 1995; Muladno et al., 1996; Korwin-Kossakowska et al., 1998) ist Mikrosatellit S0220 an Position SSC6 98cM gelegen, Mikrosatellit SW2443 an Position SSC2 20cM, Mikrosatellit S0097 an Position SSC4 100cM, Mikrosatellit S0007 an Position SSC14 70cM, Mikrosatellit SSW1301 an Position SSC1 160cM und Mikrosatellit S0164 an Position SSC3 70cM gelegen. Da genetische Kartierungspositionen populationsabhängig sind, ist diese Positionsangabe Schwankungen unterworfen. Der Bereich „Mikrosatellit S0220 auf Chromosom 6 des Schweins" bezeichnet eine für eine Population spezifische Position auf Chromosom 6 und umfasst 5cM stromaufwärts und/oder stromabwärts der angegebenen Position, vorzugsweise bis zu 10cM stromaufwärts und/oder stromabwärts, stärker bevorzugt 20cM stromaufwärts und/oder stromabwärts und am meisten bevorzugt 30cM stromaufwärts und/oder stromabwärts der angegebenen Position auf dem Chromosom. Entsprechendes gilt für die weiteren genannten Mikrosatelliten.
Ist der Mikrosatellit entständig, d.h. am Ende des Chromosom gelegen, insbesondere weniger als 30cM vom Ende entfernt, so kann der stromaufwärts oder stromabwärts gelegene Bereich auch kürzer als 5cM sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Position von Mikrosatellit S0220 definiert als der Bereich zwischen den Mikrosatelliten S0087 bis S0003, Mikrosatellit SW2443 definiert als der Bereich zwischen den Mikrosatelliten SW2443 bis SW240, Mikrosatellit S0097 definiert als der Bereich zwischen den Mikrosatelliten S0001 bis S0097, Mikrosatellit S0007 definiert als der Bereich zwischen den Mikrosatelliten S0007 bis SWC27, Mikrosatellit SW1301 definiert als der Bereich zwischen den Mikrosatelliten S0155 bis SW1301 und Mikrosatellit S0164 definiert als der Bereich zwischen den Mikrosatelliten SW72 bis SW2570. Die vergleichenden Genomkarten zwischen verschiedenen Spezies beruhen auf der Kartierung eines oder mehrer Loci im Genom der betreffenden Spezies. „Homologe Position" bezeichnet Nukleinsäureabschnitte im Genom anderer Säuger, die über die gesamte Sequenzlänge oder in spezifischen hierin gelegenen Genen oder an einem oder mehreren Loci eine Sequenzidentität mit der oben offenbarten zweiten Nukleinsaure, von mindestens 95% Sequenzidentität aufweisen, bevorzugt mindestens 30%, stärker bevorzugt mindestens 40%, noch stärker bevorzugt mindestens 50% und insbesondere bevorzugt 75% Sequenzidentität. Die Sequenzidentität wird vorzugsweise durch die FASTA, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) oder Bestfit Algorithmen des GCG- Sequenzanalyseprogramms bestimmt (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Geπetics Computer Group, University Research Park, 575 Madison, Wl 53711 ). Bei der Verwendung von Bestfit werden die Parameter vorzugsweise so eingestellt, dass der prozentuale Anteil der Identität über die gesamte Länge der Referenzsequenz berechnet wird und Homologielücken („gaps") von bis zu 5% der Gesamtzahl der Nukleotide erlaubt sind. Bei der Verwendung von Bestfit werden die sogenannten optionalen Parameter vorzugsweise bei ihren voreingestellten Werten belassen.
Der Begriff „im wesentlichen identisch" bedeutet im Sinne dieser Erfindung, dass beispielsweise in einem Bereich von 8 Nukleotiden 7 Nukleotide identisch sind. Allerdings schließt die Erfindung auch solche Ausführungsformen ein, bei denen 4, 5 oder 6 der 8 Nukleotide mit der entsprechenden Sequenz der zweiten Nukleinsaure identisch sind. Dabei kann die erste Nukleinsaure mit dem + Strang wie auch dem - Strang identisch oder im wesentlichen identisch sein. Der Begriff „einer ersten Nukleinsaure" schließt im Sinne der Erfindung auch ein, dass mehr als eine (erste) Nukleinsaure in der erfindungsgemäßen Verwendung eingesetzt werden kann. Dies können zum Beispiel zwei, drei oder vier Nukleinsäuren sein. Ferner kann der Begriff „zweite Nukleinsaure" sowohl den + Strang wie auch den -Strang bedeuten. Sofern zwei erste Nukleinsäuren mit der zweiten Nukleinsaure identisch oder im wesentlichen identisch sind, kann die eine erste Nukleinsaure mit dem + Strang identisch oder im wesentlichen identisch sein während die andere ersten Nukleinsaure mit dem - Strang identisch oder im wesentlichen identisch sein kann. In diesem Fall ist bevorzugt, dass die „Ausrichtung" der ersten Nukleinsaure gegenläufig ist, was die Durchführung einer PCR ermöglicht.
Gesäugeanomalien haben einen deutlich negativen Einfluss auf das betriebsökonomische Ergebnis in der Tierzucht, da sie in der Regel zum Ausschluss einer Zuchtsau führen. Mit der Erfindung werden erstmals Nukleinsäuren bereitgestellt, die eine gezielte molekularbiologische Diagnosestellung der Stülpzitzen-Prädisposition erlauben. Dabei ist insbesondere zu berücksichtigen, dass die Zitzenbonitur heute noch zu einem sehr frühen Zeitpunkt erfolgt, der die Erkennung von Stülpzitzen zumeist nicht oder nur unzureichend zulässt. Durch die hier offenbarte Erfindung kann der Zeitpunkt der Selektion deutlich nach vorne verlagert werden, so dass nicht mehr auf die phänotypische Ausprägung des Merkmals gewartet werden muss. Zusätzlich kann die Einführung von molekularbiologischen Markern eine deutliche Effizienzsteigung des Selektionsprozesses bewirken. Dabei beinhaltet dieser Selektionsprozess die Bestimmung des Genotypen des Probanden/Säugers an einem oder mehreren Loci in einem Bereich der oben genannten zweiten Nukleinsäuren, bevorzugt in zwei Bereichen, mehr bevorzugt drei, noch mehr bevorzugt vier, stärker bevorzugt fünf, am stärksten bevorzugt in sechs Bereichen und die Bewertung eines Individuums als zur Zucht geeignet oder nicht geeignet unter Einbeziehung von Informationen über die Kopplungsphase zwischen dem genotypisierten Markerlocus und den für die Defektausprägung verantwortlichen Genen. Beispielsweise können sich die Genotypen von geeigneten und ungeeigneten Säugern durch eine unterschiedliche Kopienanzahl einer repetitiven Nukleotidsequenz innerhalb des betrachteten Mikrosatellitenlocus unterscheiden. Dieses unterschiedliche Beschaffenheit der Nukleinsaure kann mit Hilfe von geeigneten Primern in einer PCR Reaktion dargestellt werden und schlägt sich in unterschiedlichen PCR-Produktgrößen und/oder unterschiedlichen Restriktionsfragementlängen nieder. Die Tests werden üblicherweise an Gewebeproben des Säugers, oder an Proben von Sperma, Eizelle, Urin oder Blut durchgeführt.
Selbstverständlich kann eine molekularbiologische Charakterisierung der Stülpzitzen-Prädisposition auch für den Menschen von besonderem Interesse sein. So ist vorstellbar, dass die Identifizierung einer Stülpzitzen-Prädisposition zu neuen therapeutischen Ansätzen gegen diesen Defekt führt. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung von Kombinationen von mindestens zwei, drei, vier, fünf oder sechs der oben genannten Nukleinsäuren zur Bestimmung der Prädisposition für die Ausprägung oder Vererbung des quantitativen Merkmals Stülpzitze. Diese bevorzugte Ausführungsform ist besonders geeignet die Zuverlässigkeit des Nachweises zu erhöhen.
Von der Erfindung umfasst werden weiterhin bevorzugte Ausführungsformen, wobei die oben offenbarte zweite Nukleinsaure ein Mikrosatellit ist oder eine dazu flankierende Sequenz. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der Mikrosatellit S0164, SW1301 , S0007, S0097, S2443 oder S0220, oder aber einer der benachbarten Mikrosatelliten SW72 und S0002, SW1301 , SW857 und SWC27, S0214, SW240, S0087, S0003, SW2570, S0155, S0001. Hierbei ist Mikrosatellit S0164 bevorzugt, mehr bevorzugt SW1301 , noch mehr bevorzugt S0007, stärker bevorzugt S0097, noch stärker bevorzugt S2443 und am meisten bevorzugt S0220. Die flankierende Sequenz liegt außerhalb der für den Mikrosatelliten typischen repetitiven Sequenzen und umfasst vorzugsweise einen Bereich von 1 kB stromaufwärts bzw. stromabwärts der repetitiven Sequenzen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die zweite Nukleinsaure ein spezifisches Gen. Hierbei sind bevorzugt die Gene ryrl , TGFB1 , GPI, POU2F2, EAH, Tenascingen, HSPA5, Orosomucoidgen, Steroidogenic-Factor 1 , Relaxingen, GGTA1 , TSHB, ATP1A1 , NGFB, PKLR, OAT, MLB2, Npy4R, PLAU, Parathyroidhormon-ähnliches Hormon (parathyroid-hormone-like hormone) und Parathyroidhormon-Rezeptor 1 anzuführen, sowie alle weiteren in den oben offenbarten Nukleinsäuren gelegenen, hier aber nicht einzeln aufgeführten Gene. Gene im Sinne der Erfindung können umfassen die kodierenden wie auch die nicht- kodierenden Abschnitte der DNA, also Introns, Exons und regulatorische Bereiche wie z.B. Promotoren. Darüber hinaus können erfindungsgemäß auch derartige Gene von flankierenden Sequenzen umgeben werden, die vorzugsweise einen Bereich von 1 kB stromaufwärts bzw. stromabwärts von den Genen umfassen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung der offenbarten zweiten Nukleinsäuren zur Selektion von Haus-, Zuchtoder Nutztieren mit fehlenden Stülpzitzen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung sind die Haus-, Zucht-, oder Nutztiere Rinder, Schweine, Ziegen, Schafe, Pferde, Esel, Ratten oder Mäuse.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung wird ein Genomscreen an mehreren verwandten Säugern einer Population durchgeführt. Der Begriff „mehreren verwandten Säuger" umfasst mindestens zwei Tiere einer Population, bevorzugt mindestens 5 Tiere, mehr bevorzugt mindestens 10 Tiere, noch mehr bevorzugt mindestens 10 Tiere, stärker bevorzugt mindestens 50 Tiere, noch stärker bevorzugt mindestens 250 Tier, am stärksten bevorzugt 1500 Tiere; dabei stammen die Tiere schlussendlich von einem Elternpaar ab. Bei dem Genomscreen wird untersucht, ob eine Nukleinsaure von mindestens 8 Nukleotiden Länge, bevorzugt bis zu 50 Nukleotide, mehr bevorzugt 350 Nukleotide, noch mehr bevorzugt 1000 Nukleotide, am meisten bevorzugt bis zu 5000 Nukleotide oder länger gemeinsam mit dem Merkmal Stülpzitze vererbt wird. Insbesondere wird hierbei geklärt, beispielsweise mit Hilfe von Nukleinsäure- Amplifikationsverfahren oder Hybridisierungsverfahren, welches Markerallel gemeinsam mit dem Merkmal Stülpzitze vererbt wird. Eine gemeinsame Vererbung von Nukleinsäuren mit der phänotypischen Ausprägung der Stülpzitze impliziert eine genetische Kopplung der Nucleinsäure an das Merkmal. Bevorzugte Marker sind Mikrosatellit S0220 auf Chromosom 6 des Schweins oder von Mikrosatelliten in einer homologen Position im Genom anderer Säuger; oder von Mikrosatellit SW2443 auf Chromosom 2 des Schweins oder von Mikrosatelliten in einer homologen Position im Genom anderer Säuger; oder von Mikrosatellit S0097 auf Chromosom 4 des Schweins oder von Mikrosatelliten in einer homologen Position im Genom anderer Säuger; oder von Mikrosatellit S0007 auf Chromosom 14 des Schweins oder von Mikrosatelliten in einer homologen Position im Genom anderer Säuger; oder von Mikrosatellit SW1301 auf Chromosom 1 des Schweins oder von Mikrosatelliten in einer homologen Position im Genom anderer Säuger; oder von Mikrosatellit S0164 auf Chromosom 3 des Schweins oder von Mikrosatelliten in einer homologen Position im Genom anderer Säuger. Hierbei ist als Marker Mikrosatellit S0164 bevorzugt, mehr bevorzugt SW1301 , noch mehr bevorzugt S0007, stärker bevorzugt S0097, noch stärker bevorzugt S2443 und am meisten bevorzugt S0220. Neben den genannten Mikrosatelliten können auch andere Nukleinsäuresequenzen als Marker verwendet werden, sofern sie im Sinne der Erfindung identisch oder im wesentlichen identisch sind mit der zweiten, in der Erfindung offenbarten Nukleinsaure oder in einem der oben genannten Nukleinsäurebereiche liegen.
Ausgehend von den in der Erfindung offenbarten Nukleinsäureabschnitten kann der Fachmann Nachweisverfahren zur Bestimmung der Stülpzitzen-Prädisposition ohne weiteres anwenden oder entwickeln. Die Erfindung offenbart auch Verfahren zur Bestimmung der Prädisposition für die Ausprägung oder Vererbung des quantitativen Merkmals Stülpzitze in Haus-, Zucht-, oder Nutztieren, wobei man die Tiere, deren befruchtete oder unbefruchtete Eizellen, oder deren Sperma auf die Anwesenheit, Ausprägung oder Beschaffenheit einer der oben genannten zweiten Nukleinsaure testet. Unterschiedliche „Ausprägungen oder Beschaffenheiten" von Nukleinsäuren können z.B. aufgrund von Insertionen, Duplikationen, Deletionen, Substitutionen oder Translokationen hervorgerufen werden. Insertionen oder Deletionen resultieren beispielsweise in einer geänderten Nukleinsäurelänge. Duplikationen sind ein üblicherweise bei der Generierung von Mikrosatelliten beobachtetes Phänomen. Dieser Längenpolymorphismus kann z.B. in einer PCR Reaktion dargestellt werden und schlägt sich bei Verwendung von geeigneten flankierenden Primern z.B. im Falle der Insertion in einem längeren PCR-Produkt nieder. Die unterschiedliche „Ausprägung oder Beschaffenheit" kann weiterhin auch z.B. eine nah verwandte Genvariante sein, die sich im Extremfall lediglich durch einen einzelnen Nukleotidaustausch von der verwandten Gensequenz unterscheidet. Derartige unterschiedliche „Ausprägungen oder Beschaffenheiten" der Nukleinsaure können gegebenenfalls mit Hilfe von RFLP-Analysen (Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen (RFLPs) oder durch
Nukleinsäuresequenzierung dargestellt werden.
Neben den hier explizit aufgeführten Haus-, Zucht-, oder Nutztieren betreffen die erfindungsgemäßen Verfahren aber auch andere Säugetiere, insbesondere den Menschen. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Haus-, Zucht-, oder Nutztiere Rinder, Schweine, Ziegen, Schafe, Pferde, Esel, Ratten oder Mäuse.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine PCR Amplifikation mit komplementären Primern mit einer Länge von mindestens 8 Nukleotiden durchgeführt, wobei ein Primer an den + Strang und ein weiterer Primer in entgegengesetzter Orientierung an den - Strang der zweiten Nukleinsaure bindet, oder es wird eine Hybridisierung durchgeführt, wobei eine Hybridisierungssonde mit einer Länge von mindestens 8 Nukleotiden an die zweite Nukleinsaure bindet, oder es wird eine Sequenzierung der zweiten Nukleinsaure durchführt, oder es wird eine Detektion mit eine spezifischen Antikörper oder Antikörperfragment oder Antikörperderivat oder einem Aptamer durchführt, wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment oder das Antikörperderivat oder das Aptamer spezifisch gegen die zweite Nukleinsaure gerichtet ist. In der PCR Reaktion bindet ein Primer an den + Strang und ein weiterer Primer in entgegengesetzter Orientierung an den - Strang der oben offenbarten zweiten Nukleinsaure. Im Reaktionsgemisch sind neben der oben genannten Nukleinsaure und einem Überschuss an Primern weiterhin vorhanden ein Überschuss an Desoxynukleosidtriphosphaten sowie eine DNA Polymerase, z.B. Taq Polymerase. Bei geeigneten Puffer- und Reaktionsbedingungen binden die Primer an die Nukleinsaure und die DNA Polymerase verlängert die Primer anhand der in der Nukleinsaure vorgegebenen Nukleotidsequenz. Durch Anheben und Absenken der Reaktionstemperatur lösen sich die Polymerisationsprodukte von der Nukleinsaure, so dass andere Nukleinsäuren, meist die im Überschuss vorhandenen Primer, an die Nukleinsaure binden können. Eine zyklische Wiederholung dieser Temperaturbedingungen resultiert konsequenterweise in einer Amplifikation der Nukleinsäuresequenz. Bevorzugt werden die in Tabelle 4 dargestellten Zyklen und Reaktionsbedingungen gewählt. Die Annealingtemperatur eines Primers wird von seinem Adenin + Tymin sowie Cytosin + Guanin Gehalt beeinflusst. Für jedes Adenin und Tymin werden 2 °C gerechnet, während für jedes Cytosin und Guanin 4 °C berechnet wird. Die Qualität einer PCR-Reaktion wird von der Primer- Konzentration, der wechselnden dNTP-Menge im PCR-Mix und der Qualität der Taq-DNA-Polymerase direkt beeinflusst. In der vorliegenden Arbeit wurden, ausgenommen die Mikrosatelliten an Chromosomen 1 , 4 (außer S0097) und Chromosom 6, PCR-Reaktionen mit 12,5 μl Endvolumen angesetzt. Für die Mikrosatelliten auf den erwähnten Chromosomen wurden die PCR-Reaktionen mit 25 μl angesetzt. Das Reaktionsgemisch war bei 12.5μl Endvolumen wie folgt zusammengesetzt: 0.20μM Primer, 200μM dNTPs, 0.50 U Taq-Polymerase, 1.25μl 10 x Buffer, 1.50 μl DNA (50ng/μl) und mit H2O auf 12.5 μl aufgefüllt. Als Primer werden solche Nukleinsäuren verstanden, die mindestens eine Länge von 8 Nukleotiden aufweisen und an eine der oben offenbarten zweite Nukleinsäuren binden. Bevorzugte Primer haben eine Länge von mindestens 8 Nukleotiden, bevorzugt mindestens 13, 15, 17 oder 20 Nukleotiden, stärker bevorzugt mindestens 30 Nukleotiden, noch stärker bevorzugt mindestens 50 Nukleotiden und am meisten bevorzugt mindestens 70 Nukleotiden. Die Nukleotidsequenzen der Primer können beliebig aus den oben offenbarten zweiten Nukleinsäuresequenzen zusammengestellt werden, soweit sie zumindest 8 aufeinanderfolgende Nukleotide aufweisen. Alternativ dazu kann es (bei Identität) bei der Hybridisierung der Primer mit der Zielsequenz innerhalb der zweiten Nukleinsaure auch zu Basenfehlpaarungen kommen, sofern unter den gewählten Reaktionsbedingungen eine Hybridisierung zustande kommt, die zu einer Elongationsreaktion führen kann. Ein Primer sollte innerhalb von 8 benachbarten Nukleotiden 7 identische Nukleotide aufweisen. Allerdings schließt die Erfindung auch solche Ausführungsformen ein, bei denen 4, 5 oder 6 der 8 Nukleotide mit der entsprechenden Sequenz der zweiten Nukleinsaure identisch sind. Selbstverständlich sind die Grundprinzipien der PCR-Methodik einzuhalten, deren Verfahrensschritte und Reaktionsbedingungen Stand der Technik sind. Im Einzelnen können die Verfahrensschritte aber dennoch einer Anpassung durch den Fachmann bedürfen. Nur beispielsweise sei hier auf dem Fachmann bekannte Laborbücher verwiesen, die diese Methodik beschreiben, beispielsweise auf Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor und alle nachfolgenden Auflagen. PCR-Verfahren sind z.B. beschrieben in Newton, PCR, BIOS Scientific Publishers Limited, 1994, und nachfolgende Auflagen. Neben der PCR-Amplifikation ist aber auch die Reverse Polymerase Kettenreaktion (RT- PCR) ein bevorzugtes Nachweisverfahren. Neben den genannten
Amplifikationsmethoden sind in den vergangenen Jahren weitere Amplifikationsverfahren entwickelt worden, die ebenfalls bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung darstellen. Weitere Amplifikationsverfahren sind beispielsweise die „Ligase Chain Reaction" (LCR, EPA 320308), „Cyclic Probe Reaction" (CPR, ), „Strand Displacement Amplification" (SDA, Walker et al., Nukleic Acids Res. 1992 (7):1691-6.) oder „Transciption-based amplification Systems" (TAS, Kwoh et al Proc. Nat. Acad Sei. USA 86:1173 (1989), Gingeras et al., PCT Application WO 88/10315).
Ein anderes bevorzugtes Nachweisverfahren zur Bestimmung der Stülpzitzen- Prädisposition ist die Hybridisierung mit einer Hybridisierungssonde. Hierbei versteht man unter der Hybridisierungssonde eine Nukleinsaure mit einer Länge von mindestens 8 Nukleotiden, bevorzugt bis zu 50 Nukleotiden, stärker bevorzugt bis zu 100 Nukleotiden, noch stärker bevorzugt bis zu 1000 Nukleotiden und am meisten bevorzugt bis zu 5000 Nukleotiden, die an eine der oben offenbarten zweiten Nukleinsäuren bindet. Vorzugsweise ist die ersten Nukleinsaure mit einer detektierbaren Markierung, wie einer radioaktiven oder fluoreszierenden Markierung versehen. Beispiele für Hybridisierungsverfahren sind Dot Blot, Northern Blot, Reverse Northern Blot, in situ Hybridisierung oder Southern Blot. Ein anderes bevorzugtes Nachweisverfahren ist die Sequenzierung einer der oben offenbarten zweiten Nukleinsaure. Sequenzierverfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt und bedürfen für den Fachmann keiner weiteren Erläuterung. Beispielsweise sei hier auf Maniatis, et al. Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1982 verwiesen, worin die Verfahren nach Sanger und Maxam/Gilbert dargestellt sind. Als Primer werden erfindungsgemäß solche Nukleinsäuren verstanden, die mindestens 8 Nukleotide, bevorzugt bis zu 13, 15, 17 oder 20 Nukleotide, mehr bevorzugt bis zu 30 Nukleotide, noch mehr bevorzugt bis zu 50 Nukleotide und am meisten bevorzugt bis zu 70 Nukleotide umfassen. Für Sequenzierprimer gelten die für die PCR-Primer dargestellten Eigenschaften entsprechend.
Ausgehend von den vorstehend offenbarten Nukleinsäuren kann der Fachmann ohne unzumutbaren Aufwand durch Austesten feststellen, welche Primer oder Hybridisierungssonden, die aus den oben genannte zweiten Nukleinsäuren abgeleitet sind, zu speziellen Nachweisverfahren, beispielsweise PCR- Verfahren, Sequenzierung oder Hypridisierungsverfahren geeignet und welche nicht, oder weniger geeignet sind. Die Primer oder Hybridisierungssonden zum Einsatz in der Erfindung können auch beispielsweise in größeren DNA- oder RNA-Sequenzen vorliegen, z.B. flankiert von Restriktionsschnittstellen, darüber hinaus können Nukleinsäuren, Hybridisierungssonden und Primer auch aus Basenderivaten aufgebaut sein. Zur Detektion können die Nukleinsäuren eine Markierung aufweisen. Beispiele hierfür sind eine radioaktive Markierung z.B. mit 32P oder 3H Fluoreszenzmarkierung, Biotinmarkierung, Digoxigeninmarkierung,
Peroxidasemarkierung oder Markierung mit einer alkalischen Phosphatase. Ein anderes bevorzugtes Nachweisverfahren ist die Detektion der ersten oder zweiten Nukleinsaure mit einem spezifischen Antikörper oder Antiköperfragment oder Antikörperderivat oder einem Aptamer. Bei diesem Verfahren werden spezifische Antiköper generiert, die die ersten oder zweiten Nukleinsäuren erkennen. Fragmente von Antikörpern sind z.B. Fab- oder F(ab)2 - Fragmente
Derivate schließen scFvs ein. Aptamere sind Nukleinsäuren, die aufgrund ihrer dreidimensionalen Struktur spezifisch an ein Zielmolekül binden. Verfahren zur Generierung spezifischer Antikörper sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Spezifität der Bindung an die genomische Nukleinsaure kann z.B. durch Kompetitionsexperimente mit radioaktiv markierter gewünschter Zielnukleinsäure und nicht gewünschter, z.B. zufällig ausgewählter Nukleinsaure getestet werden. Übliche Nachweisverfahren in denen die Antikörper Verwendung finden sind z.B. ELISA oder RIPA aber auch Immunfluoreszenz und andere Nachweisverfahren. Die Antikörper binden hierbei spezifisch die ersten oder zweiten Nukleinsäuren. Die Antikörper-Bindung kann z.B. durch Markierung der primären Antikörper sichtbar gemacht werden oder wird mit Hilfe von Antiköper-bindenden zweiten Antikörper detektiert, die dann Ihrerseits markiert sind. Die Antikörper können z.B. mit fluoreszerenden Substanzen, durch radioaktive Markierung oder eine enzymatische Markierung modifiziert sein. Immunologische Nachweisverfahren unter Verwendung von spezifischen Antikörpern sind, wie bereits erwähnt aus dem Stand der Techni i bekannt. Beispielsweise sei hier genannt Harlow et al., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press und alle nachfolgenden Auflagen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Genomscreen an mehreren verwandten Säugern einer Population durchgeführt. Der Begriff „mehreren verwandten Säuger" umfasst mindestens zwei Tiere einer Population, bevorzugt bis zu 5 Tiere, mehr bevorzugt 10 Tiere, noch mehr bevorzugt 10 Tiere, stärker bevorzugt 50 Tiere, noch stärker bevorzugt 250 Tier, am stärksten bevorzugt 1500 Tiere. Bei dem Genomscreen wird untersucht, ob eine Nukleinsaure von mindestens 8 Nukleotiden Länge, bevorzugt bis zu 50 Nukleotide, mehr bevorzugt 350 Nukleotide, noch mehr bevorzugt 1000 Nukleotide, am meisten bevorzugt bis zu 5000 Nukleotide oder länger gemeinsam mit dem Merkmal Stülpzitze vererbt wird. Insbesondere wird hierbei geklärt, beispielsweise mit Hilfe von Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren oder Hybridisierungsverfahren, welches Markerallel gemeinsam mit dem Merkmal Stülpzitze vererbt wird. Eine gemeinsame Vererbung von Nukleinsäuren mit der phänotypischen Ausprägung der Stülpzitze impliziert eine genetische Kopplung der Nukleinsaure an das das Merkmal steuernde Gen und kennzeichnet darüber hinaus welches Markerallel sich auf demselben homologen Chromosom befindet wie das an der phänotypischen Ausprägung der Stülpzitze beteiligte Allel am Defektgen, d.h. in welcher Kopplungsphase sich Markerlocus und Defektlocus befinden. Bevorzugte Marker sind Mikrosatellit S0220 auf Chromosom 6 des Schweins oder Mikrosatelliten in einer homologen Position im Genom anderer Säuger; oder Mikrosatellit SW2443 auf Chromosom 2 des Schweins oder Mikrosatelliten in einer homologen Position im Genom anderer Säuger; oder Mikrosatellit S0097 auf Chromosom 4 des Schweins oder Mikrosatelliten in einer homologen Position im Genom anderer Säuger; oder Mikrosatellit S0007 auf Chromosom 14 des Schweins oder Mikrosatelliten in einer homologen Position im Genom anderer Säuger; oder Mikrosatellit SW1301 auf Chromosom 1 des Schweins oder Mikrosatelliten in einer homologen Position im Genom anderer Säuger; oder Mikrosatellit S0164 auf Chromosom 3 des Schweins oder Mikrosatelliten in einer homologen Position im Genom anderer Säuger. Hierbei ist als Marker Mikrosatellit S0164 bevorzugt, mehr bevorzugt SW1301 , noch mehr bevorzugt S0007, stärker bevorzugt S0097, noch stärker bevorzugt S2443 und am meisten bevorzugt S0220. Neben den genannten Mikrosatelliten können auch andere Nukleinsäuresequenzen als Marker verwendet werden, sofern sie im Sinne der Erfindung identisch oder im wesentlichen identisch sind mit der zweiten, in der Erfindung offenbarten Nukleinsaure. Wie bereits vorstehend erwähnt, können auch die Mikrosatelliten flankierenden Sequenzen, beispielsweise als Targetsequenzen für die PCR-Primer, in die Analyse mit einbezogen werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Kit, mindestens enthaltend ein Primerpaar zur Amplifikation der zweiten Nukleinsaure, wobei jeweils ein Primer an den + Strang und ein weiterer Primer an den - Strang dieser Nukleinsaure bindet; oder eine Hybridisierungssonde mit einer Länge von mindestens 8 Nukleotiden die an die zweite Nukleinsaure bindet; oder einen Antikörper oder ein Antikörperfragment oder ein Antikörperderivat oder ein Aptamer, das die erste oder zweite Nukleinsaure spezifisch bindet.
PCR basierende Kits enthalten ein Primerpaar zur Amplifikation einer der oben genannten zweiten Nukleinsaure. Als Primer werden erfindungsgemäß solche Nukleinsäuren verstanden, die mindestens 8 Nukleotide, bevorzugt bis zu 20 Nukleotide, mehr bevorzugt bis zu 30 Nukleotide, noch mehrbevorzugt bis zu 50 Nukleotide und am meisten bevorzugt bis zu 70 Nukleotide umfassen. Die Nukleotidsequenzen der Primer können beliebig aus den oben offenbarten zweiten Nukleinsäuresequenzen zusammengestellt werden, soweit sie zumindest 8 aufeinanderfolgende Nukleotide aufweisen. Ein Primer sollte innerhalb von 8 benachbarten Nukleotiden mindestens 7 mit der Zielsequenz identische Nukleotide aufweisen. Allerdings schließt die Erfindung auch solche Ausführungsformen ein, bei denen 4, 5 oder 6 der 8 Nukleotide mit der entsprechenden Sequenz der zweiten Nukleinsaure identisch sind.
Auf Hybridisierungverfahren basierende Kits enthalten eine Hybridisierungssonde. Die Hybridisierungssonde kann bis zu 50 Nukleotide lang sein, stärker bevorzugt bis zu 100 Nukleotide, noch stärker bevorzugt bis zu 1000 Nukleotide und am meisten bevorzugt bis zu 5000 Nukleotide oder länger sein. Vorzugsweise ist die Hybridisierungssonde eine radioaktiv-markierte Nukleinsaure oder sie enthält modifizierte Nukleotide.
Kits zum Nachweis von Nukleinsäuren auf ELISA, RIPA oder ähnlicher Basis enthalten einen spezifischen Antikörper oder ein Antikörperfragment oder ein Antikörperderivat oder ein Aptamer. Antikörper oder Antikörperfragment oder Antikörperderivat oder Aptamer sind spezifisch gegen die erste oder zweite Nukleinsaure gerichtet. Übliche Nachweisverfahren in denen die Kits Verwendung finden sind z.B. ELISA oder RIPA aber auch Immunfluoreszenz und andere Nachweisverfahren. Immunologische Nachweisverfahren und Verfahren zur Generierung von spezifischen Antikörpern sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Komponenten des Kits können in Behältern verpackt sein wie z.B. Fläschchen, optional auch in Puffern und /oder Lösungen. Gegebenenfalls können einer oder mehrere der Komponenten in demselben Behälter verpackt sein. Zusätzlich oder alternativ können eine oder mehrere Komponenten an einen festen Träger absorbiert sein, wie z.B. an Nitrozellulosefilter, Nylonmembranen, oder an die Vertiefung einer Mikrotiterplatte.
Die Figuren zeigen:
Figur 1 : Kopplungskarte auf Chromosom 1. Die Figur zeigt geschlechtsneutrale, weibliche und männliche Kopplungskarten der Marker SW1515, SW1851 ,
S0155 und SW1301 auf Chromosom 1.
Figur 2: QTL-Effekte für Stülpzitzen auf Chromosom 1. Es wurde ein signifikanter Effekt im Bereich von Mikrosatellit SW1301 identifiziert.
Figur 3: Kopplungskarte auf Chromosom 4. Die Figur zeigt geschlechtsneutrale, weibliche und männliche Kopplungskarten der Marker S0227, S0001 , S0214, S0097 auf Chromosom 4.
Figur 4: QTL-Effekte für Stülpzitzen auf Chromosom 4. Ab dem Mikrosatellit S0001 steigt der Graph bis zur Lokalisation des Markers S0097, wo er seinen Maximumwert erreicht.
Figur.5: Kopplungskarte auf Chromosom 6. Die Figur zeigt geschlechtsneutrale, weibliche und männliche Kopplungskarten der Marker S0035, S0087, S0220 sowie S0003 auf dem Chromosom 6.
Figur 6: QTL-Effekte für Stülpzitzen auf Chromosom 6. Der höchste NPL-Wert für das Merkmal Stülpzitze wurde auf Chromosom 6 im Bereich des Markers S0220 identifiziert.
Figur 7: Kopplungskarte auf Chromosom 14. Die Figur zeigt geschlechtsneutrale, weibliche und männliche Kopplungskarten der Marker SW857, S0007 und SWC27 auf dem Chromosom 14. Figur 8: QTL-Effekte für Stülpzitzen auf Chromosom 14. Der NPL-Wert steigt bis auf 4,8 in der Lokalisation von Mikrosatellit S0007.
Figur 9: Kopplungskarte auf Chromosom 8. Die Figur zeigt geschlechtsneutrale, weibliche und männliche Kopplungskarten der Marker SW 2410, S0086, S0144, SW61 auf dem Chromosom 8.
Figur 10:QTL-Effekte für Stülpzitzen auf Chromosom 8. Der NPL Maximalwert beträgt 3,8.
Figur 11 :Kopplungskarte auf Chromosom 10. Die Figur zeigt geschlechtsneutrale, weibliche und männliche Kopplungskarten der Marker SW830, S0070, SW2067 auf dem Chromosom 10.
Figur 12:QTL-Effekte für Stülpzitzen auf Chromosom 10. Der Verlauf der NPL- Graphik zeigt ein Maximum von unter 2,5, was unter Signifikanzniveau ist und bleibt sonst überall unter 1 ,5.
Figur 13:Kopplungskarte auf Chromosom 10. Die Figur zeigt geschlechtsneutrale, weibliche und männliche Kopplungskarten der Marker SO143| SW874 und SW605 auf dem Chromosom 12.
Figur 14:QTL-Effekte für Stülpzitzen auf Chromosom 12. Der NPL-Wert zeigt eine Spitze von zwei und ist damit deutlich nicht signifikant.
Figur 15:Kopplungskarte auf Chromosom 16. Die Figur zeigt geschlechtsneutrale, weibliche und männliche Kopplungskarten der Marker S0111 , S0026 sowie S0061 auf dem Chromosom 16.
Figur 16:QTL-Effekte für Stülpzitzen auf Chromosom 16. Der NPL-Wert steigt zwischen den Mikrosatellitenmarkem S0111 und S0026 und erreicht seinen Maximalwert mit 4,2. Figur 17:Kopplungskarte auf Chromosom 18. Die Figur zeigt geschlechtsneutrale, weibliche und männliche Kopplungskarten der Marker SW1023, SW787 sowie SWR414 auf dem Chromosom 18.
Figur 18:QTL-Effekte für Stülpzitzen auf Chromosom 18. Der NPL-Wert auf Chromosom 18 steigt über 3,5 in der Lokalisation vom Marker SWR414.
Figure 19 a-c: QTL-Regionen für das Merkmal Stülpzitzen auf den Chromosomen 1 (Sscrl ), 2 (Sscr2) und 6 (Sscr6) bei Tieren kommerzieller Herkünfte der Rasse Deutsche Landrasse sowie deren Kreuzung mit Deutschem Edelschwein.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Material und Methoden
Auswahl der Mikrosatelliten und weiterer Loci und Mikrosatellitentypisierung Insgesamt wurden 72 Mikrosatellitenloci, die gleichmäßig über die Autosomen verteilt sind, ausgewählt und typisiert. Die benutzten Mikrosatelliten sind in den Tabellen 1 und 2 zusammengefasst. Die Typisierungen von zwei Mikrosatelliten auf Chromosom 8 (S0086 und S0144) wurden aus dem Institut für Nutztierwissenschaft, Humbold Universität Berlin geliefert.
Tabellel : Liste der typisierten Mikrosatellitenmarker
Für die Auswahl der Mikrosatellitenloci wurde, außer vier Mikrosatellitenloci auf dem Chromosom 6, die Kopplungskarte der amerikanischen Gruppe (USDA-MARC) benutzt. Für die Auswahl der vier Mikrosatellitenloci, S0035, S0087, S0220 und S0003 wurde die Kopplungskarte der europäischen Gruppe (PiGMaP) benutzt.
Tabelle 2: Primersequenzen der untersuchten Mikrosatellitenmarker
Bei der Auswahl der Mikrosatelliten wurden die hohe Informativität der Mikrosatelliten und eine gleichmäßige Verteilung auf Chromosomen berücksichtigt. Des weiteren wurden Polymorphismen in einigen Genen genotypisiert:
Tabelle 3: Ausgewählte TypI-Marker und Kandidatengene, deren Funktion und Wirkung auf die Milchdrüse
Kandidateπgen Funktion Hormonwirkung auf die Referenz Milchdrüse
Proliferation epithelialen
TGF-beta, TGFB Wachstumsfaktor Soriano et al., 1996 Drüsengewebes
Hypophysenspez.
Transkriptionsfaktor f. extraparenchymale Proliferation
Transkriptionsfaktor, Oka et al., 1991 ; Wachstumshormon des Drüsengewebes
POU1 F1
Insulin-ähnlicher
Zelldifferenzierung während der Wachstumsfaktor 1 , Wachstumsfaktor Oka et al., 1991 ; Milchdrüsenentwicklung IGF1
Follikel morphologische Entwicklung
Laktogenese McNeilly, 1997 stimulierendes der Milchdrüse Hormon, FSHB
Prolaktin, lobulo-alveolare Entwicklung Oka et al , 1991 , e ta et
Laktogenese PRL der Milchdruse al , 1991
Prolaktinrezeptor, vermittelt Wirkung des Entwicklung und oka et al , 1991, Mehta et PRLR Prolaktins Differenzierung der Milchdruse al < 1991
Wachstumshormon, Stoffwechsel, extraparenchymale Proliferation oka et al , 1991 , Pump et GH1 Differenzierung des Drusengewebes a| . 1993
Wachstumshormon- reguliert Wachstums- extraparenchymale Proliferation oka et al , 1991, Purup et
Releasinghormon, hormonausschuttung des Drusengewebes al . 1993
GHRHR
Leptin, Mediator für Wachstum und
Laktogenese Moschos et al , 2002 LEP Differenzierung der Milchdrüse
Leptinrezeptor, vermittelt Wirkung des Mediator für Wachstum und
Moschos et al , 2002 LEPR Leptins Differenzierung der Milchdruse
Tate-Ostroff & Bn ges,
Androgenrezeptor, vermittelt Wirkung der Geschlechtsdimorphismus, 1988, Imperato-McGinley AR Androgene Zitzenentwicklung et al , 1986
Relaxin, Morphologische/funktionelle Kuenzi et al 1995, Zhao et
Geburtsvorbereitung RLN1 Entwicklung der Milchdrüse al 1999
Ostrogenrezeptor, vermittelt Wirkung des Wachstum des Gangsystems, Oka et al , 1991 , Gravert, 1983, Nicholson et al , ESR1 Ostrogens Zitzenentwicklung 1988
Parathyroidhormon- endogener epithe al-mesenchymale
Holick et al , 1994, ahnliches Hormon, antipro ferativer Interaktionen wahrend Wysolmerski et al , 1998 PTHLH Faktor Entwicklung der Milchdrüse
Parathyroidhormon epithehal-mesenchymale vermittelt Wirkung des Rezeptor 1 , Interaktionen wahrend Lanske et al , 1996 PTHLH PTHR1 Entwicklung der Milchdruse
Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die Polymerase Ketten Reaktion (PCR) ist eine schnelle und effektive Methode, womit Nukleotidsequenzen in vitro enzymatisch vermehrt (amplifiziert) werden können. Die Methode besteht hauptsächlich aus Wiederholung dreier Schritte. Bei dem ersten Schritt wird die DNA denaturiert (beide DNA-Stränge werden auseinander gelöst), beim zweiten wird durch entsprechende Temperatur die Anlagerung der Primer an ihre komplementären Sequenzen bewirkt. Im letzten Schritt ergänzt die Taq-Polymerase die Einzelstränge zu den Doppelsträngen. In der Tabelle 4 wurde das Programm, das bei der vorliegenden Arbeit benutzt wurde, wiedergegeben.
Tabelle 4: Eingesetzte PCR-Programme. Die Annealingtemperaturen variieren zwischen 55 und 65 °C.
Funktion Temperatur (°C) Dauer Zyklen
Initiale Denaturierung 94 3 Minuten
Denaturierung 94 1 Minute
Annealing 55 - 65 1 Minute 30 - 40 Zyklen
Extension 72 1 Minute
Endextension 72 10 Minuten
Die Annealingtemperatur eines Primers wird von seinen Adenin + Tymin sowie Cytosin + Guanin Gehalt beeinflusst. Für jedes Adenin und Tymin werden 2 °C gerechnet während für jedes Cytosin und Guanin 4 °C berechnet wird. Die Qualität einer PCR-Reaktion wird von der Primer-Konzentration, der wechselnden dNTP- Menge im PCR-Mix und der Qualität der Taq-DNA-Polymerase direkt beeinflusst. In der vorliegenden Arbeit wurden, ausgenommen die Mikrosatelliten an Chromosomen 1 , 4 (außer S0097) und Chromosom 6, PCR-Reaktionen mit 12,5 μl Endvolumen angesetzt. Für die Mikrosatelliten auf den erwähnten Chromosomen wurden die PCR-Reaktionen mit 25 μl angesetzt. Das Reaktionsgemisch war bei 12,5 μl Endvolumen wie folgt zusammengesetzt:
Je Primer 0,20 μM dNTPs 200,00 μM
Taq-Polymerase 0,50 U
10 x Buffer 1 ,25 μl
DNA (50ng/μl) 1 ,50 μl
Ergänzt mit H2O auf 12,50 μl
Darstellung des PCR-Produktes im DNA-Sequenzer
Für die elektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte wurde eine DNA- Sequenziereinrichtung (DNA Analyser 4200, LI-COR) benutzt. PCR-Reaktionen können unterschiedliche Ergebnisse zeigen, welche aus unterschiedlichen Bandenintensitäten resultieren. Dies ist besonders bei Multiplex-PCR Reaktionen der Fall. Das LI-COR Sequenzersystem ermöglicht es auch schwächere Banden zu detektieren. Mit der Funktion „Intensity adjustment" können die schwächeren Banden deutlicher gemacht und analysiert werden. Eine Übersicht über das LI-COR System geben Mclndoe et al. (1996).
Vorbereitung des Polyacrylamidgeles
Für die Herstellung des Gels wurden die Glasplatten gründlich mit warmem Wasser und Spülmittel gespült, um Gelreste zu entfernen und mit einem fusselfreien Papiertuch gründlich abgetrocknet. Die gespülten Glasplatten wurden danach mit doppeldestilliertem Wasser nochmals gewaschen und mit Alkohol (70% Ethanol) abgerieben. Nach dem Waschen wurde Bindesilan auf die obere Glasplatte im Bereich des Geltaschenkammes pipettiert und mit dem Papiertuch abgewischt. Dies erlaubt es, stabile Geltaschen zu erzeugen. Zwischen den beiden Glasplatten wurden zwei Spacer eingelegt, die die Dicke des Gels bestimmen. Die Glasplatten die auf einander liegen wurden dann mit Haltern zusammengebaut. Für eine 41 cm große Glasplatte wurden 15 ml Sequagel XR, 3,75 ml Sequagelbuffer, 200 ml DMSO, 150 ml 10% APS zusammen gemischt und zwischen die Glasplatten gegossen. Für die Polymerisierung des Gels wurde 1 Stunde gewartet. Nach einer Stunde wurde das Gel in den DNA-Sequencer eingebaut und der Sequenzer für den Vorlauf (Pre-run) der Elektrophorese eingeschaltet.
Bestimmung der Allellänge
Für die Fragmentlängenbestimmung der Allele wurde das Software-Program„ONE- DSCAN" benutzt. Das Programm berechnet anhand der vorher eingegebenen Fragmentlängen der Standardproben die Fragmentlänge der zu untersuchenden Proben. Als Standard wurden Fragmente genutzt, die Fragmentlängen von 75 bp, 100 bp, 105 bp, 120 bp, 145 bp, 175 bp, 200 bp, 204 bp, 230 bp, 255 bp, 300 bp, sowohl bei 700 nm als auch 800 nm, aufwiesen. Von den genannten Fragmenten wurde jeweils 1 μl zusammen gemischt und von dieser Mischung 0,7 μl auf das Gel aufgetragen. Kopplungsanalyse
Für die Kopplungsanalyse wurde das Programm CRI-MAP benutzt, das die genetischen Abstände zwischen Loci nach der Kosambi-Kartierungsfunktion und mittels der Maximum-Likelihood- Methode schätzt. Mit dem Programm können schnell und vollautomatisch Mehr-Loci-Genkarten erstellt und Unterschiede in Rekombinationsraten zwischen den Geschlechtern berücksichtigt werden. Verschiedene Optionen wurden bei dem Programm CRI-MAP benutzt. Mit der Funktion „Build" wurde eine genetische Genkarte durch sukzessive Eingliederung der Loci errechnet. Mit der Funktion „Twopoint" wurden für jedes Markerpaar Zwei- Punkt-Kopplungsanalysen berechnet. Mit der Funktion „Flipsn" wurde die jeweils resultierende Anordnung der Loci überprüft. Es wurden mit dem Programm CRI- MAP weibliche, männliche und geschlechtsneutrale Kopplungskarten erstellt.
QTL-Analyse
Das wesentliche Ziel von QTL-Untersuchungen besteht darin, krankheitsverursachende oder leistungsbestimmende Chomosomenregionen im Genom der Nutztiere oder des Menschen zu lokalisieren. Für die QTL-Analyse wurden in dieser Arbeit die Programmpakete „Genehunter" (Kruglyak et al.,1996), und „Allegro" (Gudbjartsson et al. 2000) eingesetzt. Die beide Programme sind statistische Analyseprogramme, die sowohl parametrische als auch nichtparametrische Analysen mit vielen genetischen Markern durchführen können. Dies ist besonders dann notwendig, wenn man die mitverursachenden Gene einer komplexen Krankheit kartieren möchte und Stammbaumdaten vorliegen, wie es in der analysierten Population der Fall ist. Das Programm Allegro ist eine neue Version von Genehunter und beinhaltet alle dessen Funktionen, kann jedoch größere Familien berücksichtigen und schneller arbeiten.
Die Programmpakete führen nichtparametrische Analysen folgendermaßen durch. Die Individuen eines Pedigrees werden in „Founder" und „Non founder" Individuen unterteilt. Die Founder sind Elternindividuen (Sauen und Eber) deren Vorfahreninformationen nicht bekannt sind oder nicht berücksichtigt werden, während die Nachkommen von Founder-Individuen die Non founder Tiere darstellen. Jedes Elterntier (Founder) besitzt zwei Allele, ein paternales Allel und ein maternales Allel. Mit Hilfe eines Vererbungsvektors kann es verfolgt werden ob das patemale oder maternale Allel an die betroffenen Nachkommen weitergegeben wurde. Für alle möglichen Allelkombinationen in den Nachkommen lassen sich Vererbungsvektoren (inheritance vectors) erstellen, die alle möglichen Zustände der elterlichen Allele in den betroffenen Nachkommen darstellen. Anhand der Markergenotypen werden Vererbungsvektoren, bei denen ein Nachkomme vom Eber ein maternales Allel erhält und der andere ein paternales Allel, ausgeschlossen. Die andere Vererbungsvektoren werden als gleichwahrscheinlich betrachtet und ein „normalized score" Z(v) berechnet, der unter der Nullhypothese Ho (keine Kopplung zwischen Krankheitslocus und Markerallel) einen Mittelwert von 0 und eine Varianz von 1 hat. Letztendlich wird die unter der Nullhypothese standardnormalverteilte Teststatistik NPL (non parametric lodscore) berechnet.
Bei der statistischen Analyse der Daten treten zwei unterschiedliche Fehler auf, falschpositive (Typ I) und falschnegative (Typ II). Die falschpositiven Ergebnisse stellen bei der QTL-Analyse das wesentliche Problem dar. Um falschpositive Ergebnisse beim Genomscan möglichst zu reduzieren wird ein Signifikanzniveau festgelegt. Um ein Signifikantniveau von 1 % bei einer genomweiten Untersuchung zu erreichen, ist bei einer F2-Population ein NPL-Wert von ca. 4,3 notwendig. Der entsprechende NPL-Wert bei einem Signifikanzniveau von 5 % beträgt ca. 3 (Lander and Kruglyak 1995).
Beispiel 1 : Erstellung einer Ressourcenpopulation und Isolierung der DNA Es wurde eine Versuchspopulation erstellt in deren F2-Generation Stülpzitzen mit hoher Inzidenz auftreten. Die F2-Versuchspopulation beruht auf der reziproken Kreuzung des Berliner Miniaturschweins mit Duroc. Für die Erzeugung der F Generation (Elterntiere) wurden ein Duroc-Eber mit vier Sauen der Rasse Berliner Miniaturschwein sowie ein Miniaturschwein-Eber mit fünf Duroc-Sauen mittels künstlicher Besamung wiederholt angepaart. Für die Erzeugung der F2-Tiere wurden die Tiere von der F^Generation untereinander angepaart. Bei der Ressourcenpopulation wurden die Merkmale der Gesäugequalität, insbesondere die Anzahl an Stülpzitzen und deren Lokalisation erfasst. In der Population sind 53,6 % der Tiere von einer Gesäugeanomalie betroffen. Der Anteil der Tiere, die mindestens eine Stülpzitze zeigen beträgt 42,2 %. Die Erfassung der phänotypischen Zitzenanomalien wurde bei 969 F2-Tieren der Ressourcenpopulation durchgeführt. Die Bonitierung der Gesäuge fand etwa zwischen dem 130. und 200. Lebenstag statt. Dieser Zeitraum stimmt weitgehend mit dem der Jungsauenselektion in der Zuchtpraxis überein. Für die Untersuchung wurde DNA sowohl aus Blut als auch aus Gewebe (Schwanz und Ohren) isoliert. Die Isolierung hochmolekularer DNA erfolgte in folgenden Schritten durch Aufschluss der Zellen und Freisetzung der DANN mittels ProteineaseK Verdauung, Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanol-Fällung.
Beispiel 2: Mikrosatellitenkartierunq und Kopplungsanalvse
Die Genotypisierung der F2-Generation der Versuchspopulation erfolgte zunächst mit 69 Mikrosatelitten-Markern, die das Genom mit einem durchschnittlichen Abstand von 35 cM abdecken. Nach Auswertung der Gelbilder und Zuweisung der Genotypen erfolgte die Berechnung der genetischen Karten sowie die statistische Analyse zur Identifizierung von QTL-Regionen. In zwei Genombereichen wurden zur Einengung der QTL-Regionen jeweils weitere Mikrosatelliten und TypI-Marker in der Versuchspopulation typisiert; insgesamt wurden so 85 DNA-Marker anaylsiert. Nichtparametrische Ansätze wurden zur statistischen Analyse eingesetzt. Um ein Signifikanzniveau von 1 % bei einer genomweiten Untersuchung zu erreichen, ist bei einer F2-Population ein NPL-Wert von ca. 4,3 notwendig. Der entsprechende NPL-Wert bei einem Signifikanzniveau von 5 % beträgt ca. 3 (Lander and Kruglyak 1995).
Insgesamt konnten sechs QTL-Regionen mit hoch signifikanten NPL-Werten (NPL > 4,3) identifiziert werden, die ein oder mehrere Gene enthalten, die einen signifikanten Effekt auf das Auftreten von Stülpzitzen haben. Die Ergebnisse sind in nachfolgender Tabelle zusammengefasst.
Tabelle 5: Anzahl je Chromosom typisierter Marker sowie beobachtete maximale NPL-Werte bei verschiedenen Chromosomen
Beispiel 3: QTL und Kopplungsanalvse von Chromosom 1
Auf dem Chromosom 1 wurden die Mikrosatelliten SW1515, SW1851 , S0155 und. SW1301 genetisch kartiert. Die Länge des gesamten Chromosoms 1 ist bei der geschlechtsneutralen Karte in dieser Untersuchung 145,3 cM, während sie bei der weiblichen Karte 110,4 cM und bei der männlichen Karte 143,6 cM beträgt. Die Kopplungskarte des Chromosoms 1 ist in Figur 1 wiedergegeben. Auf dem Chromosom 1 wurden vier Mikrosatellitenmarker, möglichst gleichmäßig verteilt, für QTL-Analyse eingesetzt. Die eingesetzten Mikrosatellitenmarker sind hoch polymorph. Die Mikrosatelliten SW1515 und SW1851 weisen jeweils vier Allele auf, der Mikrosatellit S0155 weist drei, SW1301 weist sieben Allele auf und ist hoch informativ. Mit den eingesetzten Mikrosatelliten konnte auf dem Chromosom 1 , ein signifikanter Effekt identifiziert werden. Der NPL-Wert erreichte in der Lokalisation von Mikrosatellit SW1301 einen Wert von 4,7. Die QTL-Effekte auf Chromosom 1 sind in Figur 2 dargestellt.
Beispiel 4: QTL und Kopplungsanalvse von Chromosom 4
Auf dem Chromosom 4 wurden die Mikrosatelliten S0227, S0001 , S0214 und S0097 genetisch kartiert. Die Länge des gesamten Chromosoms 4 bei der geschlechtsneutralen Karte beträgt in dieser Untersuchung 117,7 cM, während es in der weiblichen Karte 165,9 cM und der männlichen Karte 101 ,5 cM beträgt. Die
Kopplungskarte des Chromosoms 4 ist in der Figur 3 dargestellt.
Für die Analyse von Geneffekten auf Stülpzitzen wurden die Mikrosatellitenmarker
S0227, S0001 , S0214 und S0097 für Chromosom 4 ausgewählt. Die Marker sind sowohl auf der eigenen Kopplungskarte als auch auf der Karte von USDA-MARC gleichmäßig verteilt, so dass das ganze Chromosom gut analysiert werden kann. Die benutzten Mikrosatelliten stellen mit ihrer Vielzahl an Allelen (S0097= 3, S0227= 4, S0214= 5 und S0001 = 6) und hohen PIC Werten (S0227= 0,74, S0214= 0,77, S0001 und S0097 jeweils 0,78) gut geeignete Marker für die QTL-Analyse dar. In Figur 4 ist das Ergebnis der Kopplungsanalyse für Stülpzitzen auf Chromosom 4 wiedergegeben. Es ist kein Effekt im Bereich zwischen Mikrosatelliten S0227 und S0001 festzustellen. Ab dem Mikrosatellit S0001 steigt der Graph bis zur Lokalisation des Markers S0097, wo er seinen Maximumwert erreicht und gleich abfällt. Auf Chromosom 4 wurde ein NPL- Wert von 5,0 für das Merkmal Stülpzitzen erreicht.
Beispiel 5: QTL und Kopplungsanalvse von Chromosom 6
Die Mikrosatellitenloci S0035, S0087, S0220, S0003 wurden auf dem Chromosom 6 kartiert. Die Länge der geschlechtsneutralen Kopplungskarte von Chromosom 6 beträgt 147,7 cM. Die Länge der weiblichen Kopplungskarte beträgt 193,4, die der männlichen 184,4 cM. In Figur 5 werden die Mikrosatelliten, die in dieser Arbeit eingesetzt wurden, dargestellt.
Auf dem Chromosom 6 wurden die Mikrosatellitenmarker S0035, S0087, S0220 und S0003 eingesetzt. Die Verteilung der 4 Mikrosatelliten auf Chromosom 6 ist gleichmäßig. Die Zahl der Allele beträgt drei für S0220 und S0035, vier für S0003 und fünf für S0087. Der Mikrosatellit S0220 liefert einen hohen PIC-Wert von 0,85. Der PIC-Wert der anderen Mikrosatellitenmarker beträgt 0,80 für S0035, 0,67 für S0003 und 0,64 für S0087.
Der höchste NPL-Wert für das Merkmal Stülpzitze wurde auf Chromosom 6 im Bereich des Markers S0220 identifiziert. Der NPL-Wert erreicht einen Maximalwert von 8,8. Dieser Wert ist hoch signifikant. Der Verlauf der NPL-Werte auf Chromosom 6 wird in Figur 6 wiedergegeben.
Beispiel 6: QTL und Kopplungsanalvse von Chromosom 14
Auf dem Chromosom 14 wurden die Mikrosatelliten SW857, S0007 und SWC27 genetisch kartiert. Die Länge des gesamten Chromosoms 14 beträgt bei der geschlechtsneutralen Karte in dieser Untersuchung 95,2 cM während sie in der weiblichen Karte 90,2 cM und der männlichen Karte 100,7 cM beträgt. Die geschlechtsneutrale, weibliche und männliche Kopplungskarte von drei
Mikrosatelliten auf dem Chromosom 14 sind in Figur 7 dargestellt.
Mit dem eingesetzten Mikrosatellitenmarker S0007 konnte auf dem Chromosom 14 ein deutlich signifikanter Effekt identifiziert werden (NPL-Wert von 4,8). Die
Kopplungsanalyse von anderen Mikrosatellitenmarkern, SW857 und SWC27, ist bedeutungslos mit einem niedrigen NPL-Wert unter 2.
Aus den Genotypisierungen mit den Mikrosatelliten SW857, S0007 und SWC27 resultierten über 2736 Genotypen für die QTL-Analyse auf dem Chromosom 14. Die eingesetzten Mikrosatellitenmarker S0007 und SWC27 waren nicht so hoch polymorph mit PIC-Werten von 0,60 und 0,68. Der PIC-Wert für Mikrosatellit SW857 beträgt 0,85. Die Anzahl der identifizierten Allele beträgt drei für SWC27 und jeweils vier für SW857 und S0007.
Der Verlauf der NPL-Wert auf Chromosom 14 wurde in Figur 8 wiedergegeben.
Beispiel 7: QTL und Kopplungsanalvse von Chromosom 8
Vier Mikrosatelliten, SW2410, S0086, S0144 und SW61 , wurden auf dem Chromosom 8 genetisch kartiert, wobei die Länge der geschlechtsneutralen Kopplungskarte 101 ,0 cM betrug. Auf dem Chromosom 8 wurden die Längen der weiblichen und männlichen Kopplungskarte 116,4 bzw. 87,7 cM geschätzt. Die geschlechtsneutrale, weibliche sowie männliche Kopplungskarte von vier Mikrosatelliten auf dem Chromosom 8 ist in der Figur 9 dargestellt. Für die Analyse von Geneffekten auf Stülpzitzen wurden die Mikrosatellitenmarker SW2410, S0086, S0144 und SW61 für Chromosom 8 ausgewählt und genotypisiert.. Zusätzlich zu den 4 Mikrosatelliten wurde KIT1 auf Chromosom 8 in die Analyse miteinbezogen.
Der NPL-Wert auf Chromosom 8 steigt zwischen Mikrosatelliten SW2410 und S0086 von 0 auf 1 ,5 und fällt gleich nach der Lokalisation des Markers S0086 bis zur Lokalisation des KIT1. Nach der Lokalisation von KIT1 steigt die Kurve regelmäßig bis zur Lokalisation von Mikrosatellit SW61 , wo sie ihren Maximalwert erreicht. Der Maximalwert beträgt 3,8. In der Figur 10 ist das Ergebnis der Kopplungsanalyse für Stülpzitzen auf Chromosom 8 dargestellt. Beispiel 8: QTL und Kopplungsanalvse von Chromosom 10
Auf dem Chromosom 10 wurden die Mikrosatelliten SW830, S0070 und SW2067 genetisch kartiert. Die Länge des gesamten Chromosoms 10 beträgt in der geschlechtsneutralen Karte in dieser Untersuchung 135 cM während es in der weiblichen Karte 134,6 cM und in der männlichen Karte 129,3 cM beträgt. Die Kopplungskarte von drei Mikrosatelliten auf dem Chromosom 10 sind in Figur 11 dargestellt.
Auf dem Chromosom 10 wurde ein NPL-Wert von 2,3 identifiziert. Drei Mikrosatelliten, nämlich SW830, S0070 und SW2067, wurden zur QTL-Analyse für das Merkmal Stülpzitzen auf dem Chromosom 10 ausgewählt und genotypisiert. Für die Durchführung der QTL-Analyse standen 2736 Genotypisierungen zur Verfügung. Die Zahl der Allele beträgt für SW2067 und S0070 jeweils vier und für SW830 fünf. Der PIC-Wert von Marker SW2067 und SW830 ist gering mit jeweils 0,32 und 0,50, während Marker S0070 einen größeren PIC wert von 0,85 hat. Der Graph von Geneffekt auf Stülpzitzen auf Chromosom 10 verläuft unterhalb 1 ,5 mit einem maximalen Wert bei über 2,5, was weit unter Signifikanzniveau ist. Der Verlauf der NPL auf Chromosom 10 wird in Figur 12 wiedergegeben.
Beispiel 9: QTL und Kopplungsanalvse von Chromosom 12
Drei Mikrosatelliten, S0143, SW874 und SW605 wurden auf dem Chromosom 12 genetisch kartiert, wobei die Länge der geschlechtsneutralen Kopplungskarte 90,8 cM betrug. Auf dem Chromosom 12 wurden die Längen der weiblichen und männlichen Kopplungskarte auf 116,4 und 87,7 cM geschätzt. Die geschlechtsneutrale, weibliche und männliche Kopplungskarte von 4 Mikrosatelliten auf dem Chromosom 8 sind in Figur 13 dargestellt. Auf dem Chromosom 12 wurde NPL-Wert von 1 ,9 identifiziert. Die für QTL-Analyse auf dem Chromosom 12 ausgewählten Mikrosatelliten sind gleichmäßig verteilt. Aus den Genotypisierungen mit den Mikrosatelliten S0143, SW874 und SW605 resultierten über 2736 Genotypen für die QTL-Analyse auf dem Chromosom 12. Die eingesetzten Mikrosatellitenmarker waren hoch polymorph mit PIC-Werten von 0,87 für SW605, 0,81 für SW874 und 0,63 für S0143. Die Anzahl der identifizierten Allele beträgt sechs für SW874; vier für SW605 und drei für S0143. Der Verlauf der NPL-Werte auf Chromosom 12 ist in Figur 14 wiedergegeben. Dabei beträgt der Maximalwert zwei. Damit ist die Kopplung zwischen den Markern S0143, SW874 und SW605 auf dem Chromosom 12 und dem Merkmal Stülpzitze deutlich nicht signifikant.
Beispiel 10: QTL und Kopplungsanalvse von Chromosom 16 Die Mikrosatellitenloci S0111 , S0026 und S0061 wurden auf dem Chromosom 16 kartiert. Die Länge der geschlechtspezifischen Kopplungskarte von Chromosom 16 beträgt 94,7 cM. Die Länge der weiblichen Kopplungskarte beträgt 103,6 und die Länge der männlichen Kopplungskarte von Chromosom 16 beträgt 87,8 cM. Die geschlechtsneutrale, weibliche und männliche Kopplungskarte von drei Mikrosatelliten auf Chromosom 16 sind in Figur 15 dargestellt. Drei Mikrosatellitenloci, S0111 , S0026 und S0061 , wurden für die QTL-Analyse für das Merkmal Stülpzitze auf dem Chromosom 16 ausgewählt und genotypisiert. Für die Durchführung der QTL-Analyse standen 2736 Genotypisierungen zur Verfügung. Die Allelzahl der Mikrosatellitenmarker beträgt drei für S0061 , vier für S0026 und fünf für S0111. Der PIC-Wert beträgt 0,70 für den Marker S0061 , 0,82 für den Marker S0111 und 0,87 für den Marker S0026. Der Gen-Effekt auf dem Chromosom 16 ist besonders hoch bei den Mikrosatellitenmarkern S0026 und S0061 mit einem Wert von 4,2. Die Kurve steigt zwischen den Mikrosatellitenmarkern S0111 und S0026 und erreicht ihren Maximalwert auf diesem Chromosom von 4,2. Gleich nach dem Marker S0026 fällt sie auf 3,3 und steigt wieder, um einen zweiten Gipfel mit einem Wert von 4,1 zu bilden. Der Verlauf der NPL auf dem Chromosom 16 wurde in Figur 16 wiedergegeben.
Beispiel 11 : QTL und Kopplungsanalvse von Chromosom 18
Auf dem Chromosom 18 wurden die Mikrosatelliten SW1023, SW787 und SWR414 genetisch kartiert. Die Länge des gesamten Chromosoms 18 beträgt bei der geschlechtspezifischen Karte in dieser Untersuchung 68,8 cM während sie in der weiblichen Karte 78 cM und der männlichen Karte 61 ,3 cM beträgt. Die geschlechtsneutrale, weibliche und männliche Kopplungskarte von drei
Mikrosatelliten auf dem Chromosom 18 sind in Figur 17 dargestellt.
Ergebnisse der QTL-Analyse auf Chromosom 18
In Figur 18 ist das Ergebnis der Assoziationsanalyse für Stülpzitzen auf Chromosom
18 wiedergegeben. Auf dem Chromosom 18, ähnlich wie bei Chromosom 16, wurde ein positiver, jedoch nicht signifikanter NPL-Wert identifiziert. Der NPL-Wert steigt besonders hoch bei dem Mikrosatellitenmarker SWR414 mit einem Wert von 3,7. Für die Durchführung der QTL-Analyse standen 2736 Genotypisierungen zur Verfügung. Die Allelezahl der Mikrosatellitenmarker beträgt sechs für SW787, jeweils vier für SW1023 und für SWR414. Der PIC-Wert beträgt 0,73 für den Marker SW787 und 0,78 für die Marker SW1023 und SWR414. Der Verlauf des NPL- Wertes auf dem Chromosom 18 ist in Figur 18 wiedergegeben.
Beispiel 12: QTL und Kopplungsanalvse von Chromosom 2
Auf dem Chromosom 2 wurden die Mikrosatelliten SW2443, SW240, SW1564 und
S0226 sowie die TypI-Marker FTH, STS2 und C3 genetisch kartiert. Die genetische
Karte sieht wie folgt aus: SW2443 - 42,8 cM - FTH - 20,2 cM - SW240 - 22,9 cM -
STS2 - 13,8 cM - C3 18,4 cM - SW1564 - 24,8 cM - S0226.
Mit den eingesetzten Mikrosatelliten konnte auf dem Chromosom 2, ein signifikanter
Effekt identifiziert werden. Der NPL-Wert erreichte in der Lokalisation von
Mikrosatellit S2443 einen Wert von 7,9.
Beispiel 13: QTL und Kopplungsanalvse von Chromosom 3
Auf dem Chromosom 3 wurden die Mikrosatelliten SW72 (51 ,1 cM), S0164 (25,6 cM) SW2570 (32,6 cM) S0002 mit den angegebenen Abständen genetisch kartiert Mit den eingesetzten Mikrosatelliten konnte auf dem Chromosom 3, ein signifikanter Effekt identifiziert werden. Der NPL-Wert erreichte in der Lokalisation von Mikrosatellit S0164 einen Wert von 4,0.
Beispiel 14: QTL und Kopplungsanalvse bei Tiere kommerzieller Herden
In Zuchtbetrieben von drei Zuchtorganisationen wurden Ohrkerbproben von bonitierten Jungsauen sowie weitere Ohrkerb- bzw. Spermaproben ihrer Eltern gesammelt. Diese Tiere dienten der Kopplungsanalyse sowie der Untersuchung des
Effekts direkter biologischer und positioneller Kandidatengene in Genombereichen, die in der Ressourcenpopulation einen Einfluss auf die Stülpzitzenausprägung aufwiesen.
Das Probenmaterial aus den kommerziellen Zuchtpopulationen umfasst 201
Gewebe- bzw. DNA-Proben von Jungsauen mit Stülpzitzen, die aus Familien stammen, in denen mindestens ein Tier Stülpzitzen aufwies, sowie deren Eltern. Neben 37 väterlichen Halbgeschwistergruppen mit bis zu 22 Tieren je Gruppe sind in der Population 37 „klassische affected sibpairs" (37 Geschwistergruppen von mindestens zwei Tieren, die den Defekt phänotypisch aufweisen) enthalten. Bei Nachkommen von 5 Elternpaaren wurden Würfe mit mehr als zwei betroffenen Nachkommen beobachtet, wodurch sich die Gesamtanzahl an affected sibpairs auf 70 erhöht. Tabelle 3 gibt einen Überblick über das Tiermaterial in der Zuchtpopulation.
Tabelle 6: Anzahl Jungsauen und genetische Struktur des Probenmaterials aus den Zuchtpopulationen
Zuchtverbande B C Summe bonitierte Jungsauen (ohne Elterntiere) 105 30 66 201 betroffen 84 30 57 171 nicht betroffen 21 0 9 30 vaterliche Halbgeschwistergruppen 19 8 10 37
"klass affected sibpairs" 15 14 8 37 affected sibpair mit Kombis 70
)
Die Kopplungsanalyse bei Tieren kommerzieller Herden weist für das Chromosom 6 bei Berechnung über das gesamte Tiermaterial mit 70 „affected sibpairs" aus der Rasse Deutsche Landrasse, DL, und deren Kreuzung mit Deutschem Edelschwein, DE, einen QTL mit maximalem NPL von 2,6 aus. Dieser befindet sich in der Position, in der bei Tieren der DUMI-Ressourcenpopulation eine QTL-Region mit NPL 3,8 (SSC6 Position OcM Mikrosatellit S0035) detektiert wurde, nicht jedoch der maximale NPL von 8,8 (SSC6 Position 120 cM Mikrosatellit S0220) für dieses Chromosom. Bei Einbeziehung nur der 45 affected sibpairs der Rasse DL zeigt sich ein maximaler NPL von 1 ,9 in Position des Mikrosatelliten S0220. Die Auswertung der Daten der Kreuzungstiere alleine (15 affected sibpairs) ergibt einen maximalen NPL von 6,8 am Mikrosatelliten S0035. Die nach Rassen (DL bzw. DL*DE) getrennte Analyse der Daten der Tiere kommerzieller Herden legt, wie auch der zweigipflige Verlauf der NPL-Wert-Kurve über das Chromosom 6 für die experimentelle Population, nahe, dass auf diesem Chromosom mindestens zwei QTL segregieren. Der QTL auf Chromosom 2 konnte bei den untersuchten Tieren der kommerziellen Herden bestätigt werden. Dabei ergibt sich über alle Tiere ein maximaler NPL von 1 ,8; nur für die DL-Tiere von 1 ,9 und nur für die Kreuzungstiere von 2,4 in Position des Markers S2443 wie bei den Tieren der Ressourcenpopulation. Der in der experimentellen Population auf Chromosom 1 identifizierte QTL ließ sich für die Tiere kommerzieller Herkunft nicht nachvollziehen. (Tabelle 7, Abbildung 19a-c).
Tab 7: QTL-Regionen für das Merkmal „Stülpzitzen" bei Tieren kommerzieller Herden
Beispiel 15: Kandidatengenanalyse
Die Entwicklung der Milchdrüse wird durch eine Reihe von Hormonen reguliert. Insbesondere der Einfluss der Geschlechtshormone und der Stoffwechselhormone auf die Entwicklung der Milchdrüse ist etabliert und wurde bei verschiedenen Tierarten experimentell nachgewiesen (Oka et al., 1991 ; Günther, 1984). Die Wirkung dieser Hormone wird durch verschiedene Wachstumsfaktoren vermittelt (Oka et al., 1991). Es kann davon ausgegangen werden, dass die Entstehung von Gesäugeanomalien auf eine Dysregulation der hormonellen Steuerung zurückzuführen ist. Daher stellen Gene, die für Hormone, Hormonrezeptoren und Wachstumsfaktoren kodieren, Kandidatengene für die Analyse der Zitzenanomalien dar.
Für die Gene Transforming Growth Factor beta 1 , TGFB1 , Androgenrezeptor, AR, parathyroid hormone-like hormone, PTHLH, und Relaxin, RLN, erfolgte im Rahmen des Projektes Identifizierung von SNPs durch vergleichende Sequenzierung der Transkripte von einem adulten Tier der Rassen Duroc, Berliner Miniaturschwein, Hampshire, Pietrain, Deutsche Landrasse, Deutsches Edelschwein sowie der F1- und F2 der Resourcenpopulation. Die Genotypisierung der übrigen Kandidatengene erfolgt an in der Literatur beschriebenen Polymorphismen.
Zur statistischen Analyse des Zusammenhangs zwischen genotypischer Variation an den Kandidatengenorten und dem Merkmal wurden Chi-Quadrat-Tests sowie Transmission Disequilibrium Tests, TDT, durchgeführt. Die Chi-Quadrat-Tests erfolgten mit dem Programm Paket SAS (SAS, 2000), die TDTs mit dem Programm TDT/S-TDT program 1.1 (Spielman et al., 1993).
Insgesamt wurden Genotypisierungen an 15 Genen vorgenommen. Diese Gene stellen direkte biologische Kandidatengene für das Merkmal Stülpzitze dar. Die Gene TGFB1 , LEPR auf Chromosom 6 sowie RLN auf Chromosom 1 kartieren innerhalb von hier identifizierten QTL-Regionen stellen so auch positionelle Kandidatengene dar.
Zwei Kandidatengene (Östrogenrezeptor und Prolaktin) waren in den F2- Ressourcefamilien nicht polymorph. Für das Androgenrezeptorgen und das Gen für den Wachstumsfaktor TGFB1 und für PTHLH erfolgte im Rahmen des Projektes die Klonierung und Sequenzierung sowie die Detektion von bislang nicht in der Literatur beschriebenen Polymorphismen, SNPs (Single nucleotide polymorphisms):
Die Ergebnisse des Chi-Quadrat-Tests auf Assoziation und des Transmission Disequilibrium Test auf Association und Kopplung deuten auf einen signifikanten Zusammenhang zwischen Genvarianten des Leptinrezeptors, LEPR, (TDT p=0,003), des Hypophysen-spezifischen Transkriptionsfaktors, POU1 F1 , Bestandteil der Wachstumhormonachse (TDT p=0,01 ), des transformierende Wachstumsfaktors beta 1 , TGFB1 (TDT p=0,02) und des Relaxin, RLN, (TDT p=0,0009) und dem Auftreten von Stülpzitzen hin. Die Untersuchungsergebnisse werden dadurch gestützt, dass die Position des Leptinrezeptors und des TGFB1 auf dem Chromosom 6 in dem Chromosomenbereich liegt, der auch in der QTL- Analyse einen hochsignifikanten NPL-Score (8,8) aufwies. Das Relaxin kartiert im Bereich des QTL auf Chromosom 1.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung einer ersten Nukleinsaure zur Bestimmung der Prädisposition für die Ausprägung oder Vererbung des quantitativen Merkmals Stülpzitze in einem Säuger, wobei die erste Nukleinsaure eine Länge von mindestens 8 Nukleotiden aufweist und identisch oder im wesentlichen identisch ist mit einer zweiten Nukleinsaure, die vorkommt im Bereich von
(a) Mikrosatellit S0220 auf Chromosoms 6 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger; oder
(b) Mikrosatellit SW2443 auf Chromosoms 2 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger; oder
(c) Mikrosatellit S0097 auf Chromosoms 4 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger; oder
(d) Mikrosatellit S0007 auf Chromosoms 14 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger; oder
(e) Mikrosatellit SW1301 auf Chromosoms 1 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger; oder
(f) Mikrosatellit S0164 auf Chromosoms 3 des Schweins oder in einer homologen Position im Genom anderer Säuger.
2. Verwendung einer Kombinationen von mindestens zwei, drei, vier, fünf oder sechs der in Anspruch 1 genannten Nukleinsäuren zur Bestimmung der Prädisposition für die Ausprägung oder Vererbung des quantitativen Merkmals Stülpzitze.
3. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die zweite Nukleinsaure ein Mikrosatellit oder eine den Mikrosatelliten flankierende Sequenz ist.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die zweite Nukleinsaure abgeleitet ist von einem Gen aus der Gruppe bestehend aus ryrl , TGFB1 , GPI, POU2F2, EAH oder eines dieser Gene ist.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die zweite Nukleinsaure abgeleitet ist von einem Gen aus der Gruppe bestehend aus Tenascingen, HSPA5, Orosomucoidgen, Steroidogenic-Factor 1 , Relaxingen, GGTA1 , Parathyroidhormon-ähnliches Hormon, Parathyroidhormon-Rezeptor 1 oder eines dieser Gene ist.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die zweite Nukleinsaure abgeleitet ist von einem Gen aus der Gruppe bestehend aus TSHB, ATP1 A1 , NGFB, PKLR oder eines dieser Gene ist.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die zweite Nukleinsaure abgeleitet ist von einem Gen aus der Gruppe bestehend aus OAT, MLB2, Npy4R, PLAU oder eines dieser Gene ist.
8. Verwendung der zweiten Nukleinsaure nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Selektion von Haus-, Zucht-, oder Nutztieren mit fehlenden Stülpzitzen.
9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Haus-, Zucht-, oder Nutztiere Tiere sind aus der Gruppe bestehend aus Rind, Schwein, Ziege, Schaf, Pferd, Esel, Ratte und Maus.
10. Verwendung nach Anspruch 8, wobei ein Genomscreen an mehreren verwandten Säugern einer Population durchgeführt wird.
11. Verfahren zur Bestimmung der Prädisposition für die Ausprägung oder Vererbung des quantitativen Merkmals Stülpzitze in Säugern, vorzugsweise in Haus-, Zucht-, oder Nutztieren, wobei man die Tiere, deren befruchtete oder unbefruchtete Eizellen, oder deren Sperma auf die Anwesenheit, Beschaffenheit oder Ausprägung einer in einem der Ansprüche 1 bis 7 genannten zweiten Nukleinsaure testet.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , wobei die Haus-, Zucht-, oder Nutztiere Tiere sind aus der Gruppe bestehend aus Rind, Schwein, Ziege, Schaf, Pferd, Esel, Ratte und Maus.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei man
(a) eine PCR Amplifikation mit komplementären Primern mit einer Länge von mindestens 8 Nukleotiden durchführt, wobei ein Primer an den + Strang und ein weiterer Primer in entgegengesetzter Orientierung den - Strang der zweiten Nukleinsaure aus den Ansprüchen 1 bis 7 bindet; oder
(b) eine Hybridisierung durchführt, wobei eine Hybridisierungssonde mit einer Länge von mindestens 8 Nukleotiden an die zweite Nukleinsaure aus den Ansprüchen 1 bis 7 bindet; oder
(c) eine Sequenzierung der zweiten Nukleinsaure aus den Ansprüchen 1 bis 7 durchführt
(d) eine Detektion mit einem spezifischen Antikörper oder Antikörperfragment oder Antikörperderivat oder Aptamer durchführt, wobei der Antikörper oder das Antiköperfragment oder das Antikörperderivat oder der Aptamer spezifisch gegen eine erste oder zweite Nukleinsaure aus den Ansprüchen 1 bis 7 gerichtet ist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei ein Genomscreen an mehreren verwandten Säugern einer Population durchgeführt wird.
15. Kit mindestens enthaltend
(a) ein Primerpaar zur Amplifikation der in den Ansprüchen 1 bis 7 genannten zweiten Nukleinsaure, wobei jeweils ein Primer an den + Strang und ein weiterer Primer an den - Strang dieser Nukleinsaure bindet; oder
(b) eine Hybridisierungssonde mit einer Länge von mindestens 8 Nukleotiden die an die zweite Nukleinsaure aus den Ansprüchen 1 bis 7 bindet; oder (c) einen spezifischen Antikörper oder ein Antikörperfragment oder ein Antikörperderivat oder ein Aptamer das an die erste oder zweite Nukleinsaure aus den Ansprüchen 1 bis 7 bindet.
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See also references of WO03066891A3 *

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