EP1573051A1 - Verfahren und vorrichtung zur bestimmung von keimen - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur bestimmung von keimen

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Publication number
EP1573051A1
EP1573051A1 EP03767723A EP03767723A EP1573051A1 EP 1573051 A1 EP1573051 A1 EP 1573051A1 EP 03767723 A EP03767723 A EP 03767723A EP 03767723 A EP03767723 A EP 03767723A EP 1573051 A1 EP1573051 A1 EP 1573051A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
germs
sample
fluorescent
fluorescence
membrane filter
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03767723A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tilo Weiss
Stefan Stumpe
Friedhelm Siepmann
Andreas Thunchen
Frank Wienhausen
Andreas Katerkamp
Michael Heinzel
Roland Breves
Mirko Weide
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henkel AG and Co KGaA
Original Assignee
Henkel AG and Co KGaA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henkel AG and Co KGaA filed Critical Henkel AG and Co KGaA
Publication of EP1573051A1 publication Critical patent/EP1573051A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a method for the quantitative and / or qualitative determination of germs according to the preamble of claim 1. Furthermore, the present invention relates to a device for the quantitative and / or qualitative determination of germs according to the preamble of claim 27, in particular for carrying out the aforementioned method, and the use of this device, in particular for the preferably automated production and / or quality control.
  • Microbiological safety must be guaranteed for a large number of substances, raw materials and products from the various areas of industry, handicraft, household, health, catering, etc.
  • Quantitative microbiological analysis techniques have been used for quality assurance for a long time.
  • the basis of these methods is to multiply individual germs that occur in the material to be examined so that they become visible as smears or colonies with the naked eye.
  • cultivation methods are used for this, which multiply these germs either on solid nutrient media or in liquid nutrient solutions or media. Depending on the method and type of germ, it takes up to several days to carry out conventional cultivation methods for the detection of bacteria and fungi.
  • the cultivation processes are generally carried out in such a way that culture media (typically culture dishes with culture media based on agar-agar) are inoculated with the sample and, at the respective germs, adapted, generally elevated temperatures for up to a week can be cultivated (e.g. in an incubator). From growth and the form of the resulting cultures, a person skilled in the art can then deduce the type and extent of the microbial load on the sample.
  • culture media typically culture dishes with culture media based on agar-agar
  • adapted, generally elevated temperatures for up to a week can be cultivated (e.g. in an incubator). From growth and the form of the resulting cultures, a person skilled in the art can then deduce the type and extent of the microbial load on the sample.
  • This technology has the decisive disadvantage that only an undetermined fraction of the germs contained in the sample can be cultivated and the information is only available after a week.
  • fluorescence-optical methods have increasingly replaced the conventional "rapid detection methods" and cultivation methods.
  • the direct epifluorescence filter technique (DEFT) is the first direct method available that also allows quantitative "live / dead” germ detection in less than an hour.
  • This non-specific, fluorescence-optical method has been known as a qualitative method for over 25 years in basic university research (see, for example, Pettipher et al., Appl. Environ. Microbiol. 44 (4): 809-13, 1982) and has been used since In the early 1990s increasingly in industrial applications (e.g. breweries, dairies, food industry etc.) as quantitative Test method established (Hermida et al., J. AOAC Int.
  • MMCF method membrane filter microcolony fluorescence method
  • MMCF method see e.g. Baumgart, microbiological analysis of food, Behr's ... Verlag 1993, 3rd edition, p. 98 ff.
  • the disadvantages here are that a time-consuming pre-enrichment of the germs must precede, the membrane filter must be pretreated for the subsequent epifluorescence microscopy (moistening with special media, dimensioning and drying) and the number of germs by counting the fluorescence-marked colonies under an epifluorescence microscope or a UV lamp must be done.
  • the significance of the analysis is limited by the time available. At the end of the enrichment period, all germs must have multiplied to such an extent that they have become visible. Delayed growth due to unfavorable sampling or growing conditions can lead to erroneously negative results. Therefore, the implementation of the conventional cultivation methods for the detection of bacteria and fungi often requires several days, so that the microbiological results are often too late to allow a regulatory intervention in the production process.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a method of the type mentioned at the outset which is suitable for the quantitative or qualitative determination of germs and in particular at least partially avoids the disadvantages described above, and a corresponding device for carrying out such a method.
  • the subject of the present invention is therefore a method for the quantitative and / or qualitative determination of germs in a sample, the method comprising a method step (a) of sample preparation and a method step (b) of detection and / or evaluation comprises, in method step (a) marking at least some of the germs present in the sample by means of at least one fluorescence marker and in method step (b) quantitative and / or qualitative detection and / or evaluation taking place, the method step (b) Detection and / or evaluation carried out is carried out by fluorescence reflection spectrometry or fluorescence reflection photometry (the two terms "fluorescence reflection spectrometry” and “fluorescence reflection photometry” are used synonymously in the following, and the basic measurement method is explained in more detail below).
  • a special feature of the method according to the invention is thus the combination of fluorescent labeling of germs, in particular microorganisms, with suitable fluorescent markers and the subsequent detection of the fluorescence-labeled germs with a simplified, namely fluorescence reflection photometric detection or evaluation method and a corresponding device. Since the sample is only exposed to radiation for a short time in the method of fluorescence reflection photometry, the fluorescent markers fade and thus falsify the measurement result is efficiently avoided.
  • the fluorescence reflection spectrometric or fluorescence reflection photometric detection or evaluation detects the radiation emitted by the fluorescence-marked nuclei upon irradiation of the corresponding wavelength in reflection or their intensity, which correlates with the number of bacteria present in the sample (for further details on reflection photometric or reflection photometric methods, for example the relevant explanations in Römpp, Chemielexikon, Thieme Verlag, 10th edition, Vol. 5, pages 3756/3757, keywords “reflection” and “reflection spectroscopy” as well as Vol. 4, pages 3312 to 3314, keyword “photometry”, each including the referenced literature, the entire content of which is hereby incorporated by reference).
  • the z. B. applied in the context of the MMCF method (membrane filter microcolony fluorescence method)
  • Fluorescence reflection photometers or spectrometers which can be used in the context of the method according to the invention can be readily designed for the person skilled in the art on the basis of commercially available components which are usually available for this purpose.
  • the phrase "marking at least part of the germs present in the sample” means in particular the following: depending on whether only special ones germs or types of germs present in the sample or all the germs present in the sample are to be determined, in the former case only a specific part of the germs present in the sample (generally with germ-specific fluorescence markers) is marked, while in the latter case all Marked germs present in the sample (generally with non-germ-specific fluorescent markers or a mixture of different germ-specific fluorescent markers).
  • the number of germs present in the sample can be determined by means of suitable calibration on the basis of the measurement value determined by fluorescence reflection photometry (in the case of fluorescent labeling of all germs present in the sample, the total number of all germs present in the sample and only in the case of fluorescent labeling) special germs their total number).
  • fluorescence reflection photometry in the case of fluorescent labeling of all germs present in the sample, the total number of all germs present in the sample and only in the case of fluorescent labeling
  • special germs their total number special germs their total number.
  • the fluorescence-labeled nuclei are applied to a membrane filter (for example a polycarbonate membrane filter), which is preferably porous, in the sample preparation carried out in process step (a).
  • a membrane filter for example a polycarbonate membrane filter
  • the membrane filter should generally be designed such that it retains the germs or is impermeable to the germs.
  • the size of the pores of the membrane filter should be chosen so that the pore size is smaller than the germs present in the sample.
  • part or area of the membrane filter generally the edge, should not be provided with germs, because this ensures referencing or internal calibration or standardization for each sample.
  • membrane filter materials suitable according to the invention are also PTFE, polyester and cellulose and cellulose derivatives, such as cellulose acetate, regenerated cellulose, nitrocellulose or mixed cellulose esters.
  • Membrane filters suitable according to the invention are sold, for example, by Macherey-Nagel (for example the "PORAFIL ® " series).
  • Macherey-Nagel for example the "PORAFIL ® " series.
  • the use of a membrane filter offers the great advantage that the fluorescence reflection photometric detection or evaluation, in particular without further sample treatment, preparation, transfer or the like (ie in particular without pre-enrichment), can be carried out directly on the membrane filter.
  • the fluorescence-labeled germs are applied to a silicon microsieve in the sample preparation carried out in method step (a).
  • silicon microsieves have a particularly smooth and even surface and therefore germs located thereon can be better detected.
  • the cleaning of such screens is relatively easy to do and they can be used several times.
  • the silicon microsieves also have good biocompatibility and good reflectivity. Another advantage of microsieves can be seen in their rigid structure, which have considerable advantages in their handling.
  • the particularly uniform pore size is another advantage that further increases the accuracy of selective filtrations.
  • the pore sizes of the microsieves to be used for the method according to the invention should advantageously be between approximately 0.1 and 2 ⁇ m.
  • Microsieves with pore sizes of 0.45 ⁇ m and 1.2 ⁇ m are particularly preferred.
  • sieves with different pore sizes can also be used, i.e. also with pores smaller than 0.1 ⁇ m or larger than 2 ⁇ m.
  • the fluorescent marker used in the method according to the invention is advantageously selected such that it is membrane-permeable with respect to the membrane filter used in the sample preparation carried out in method step (a). This has the advantage that the fluorescence reflection photometric detection or evaluation no interference signals caused by excess fluorescence markers or no background noise occurs and consequently a favorable signal / background ratio or signal / noise ratio is achieved.
  • the fluorescent labeling of the germs present in the sample in method step (a) of the method according to the invention is carried out in a manner known per se.
  • the germs to be labeled can be brought into contact with a solution or dispersion of the fluorescent markers present in excess with respect to the existing germs, the contact time having to be sufficient to ensure complete fluorescence labeling of all the germs involved in this process step should be marked (depending on the selection of the fluorescent marker, for example, all germs present in the sample or all germs of only one or more types of germs).
  • the excess fluorescence markers can then be removed or separated from the fluorescence-marked germs.
  • method step (a) of sample preparation can also include inactivating and / or removing any germ-inhibiting and / or germicidal substances or components (eg preservatives, surfactants etc.) present in the sample.
  • germ-inhibiting and / or germicidal substances or components eg preservatives, surfactants etc.
  • method step (a) of sample preparation can also include inactivating and / or removing any germ-inhibiting and / or germicidal substances or components (eg preservatives, surfactants etc.) present in the sample.
  • germ-inhibiting and / or germicidal substances or components e.g. preservatives, surfactants, etc.
  • the method step of inactivating or removing any germ-inhibiting or germ-killing substances or constituents that may be present in the sample is advantageously carried out before the fluorescence marking, preferably immediately after sampling or immediately at the beginning of the method step (a) performed sample preparation performed by the method according to the invention; In this way it is ensured that the germ-inhibiting or germ-killing substances, constituents, ingredients and the like can essentially have not yet brought about a change in the number of germs present in the original sample.
  • the process step of inactivating or removing any germ-inhibiting or germ-killing substances or constituents which may be present in the sample, depending on the type of sample, is carried out in a manner known per se.
  • Stumpe et al. “Chemiluminescence-based direct detection of microorganisms - An experience report from the food and cosmetics industry” on pages 317 to 323 of the conference proceedings "HY-PRO 2001, Hygienic Production Technology / Hygienic Production Technology", 2nd international Specialist congress and exhibition, Wiesbaden May 15-17, 2001 and the literature cited in this article; the entire content of this article, including the content of the literature cited therein, is hereby incorporated by reference.
  • An inactivation or conditioning solution which is particularly suitable according to the invention has the following composition:
  • the TLH water which can be used according to the invention has the following composition in particular:
  • Polysorbate 80 (Tween 80) 30.0 g
  • the phosphate buffer solution which can be used according to the invention has the following composition in particular:
  • fluorescent marker is understood very broadly in the context of the present invention and means in particular any fluorescent marker which is designed such that it interacts with the germs, for example on the germs, in particular on their cell wall (shell) and / or nucleic acid , binds and / or is taken up by the germs, in particular metabolized and / or implemented enzymatically.
  • the fluorescent marker used according to the invention can be, for example, a non-germ-specific fluorescent marker or a mixture of non-germ-specific fluorescent markers. This enables a relatively inexpensive fluorescence labeling of all germs present in the sample and thus a relatively quick determination of the total number of germs in the sample.
  • a germ-specific fluorescence marker or a mixture of different germ-specific fluorescence markers can be used as the fluorescence marker.
  • a mixture of germ-nonspecific and germ-specific fluorescence markers can be used as the fluorescence marker.
  • a fluorescent marker which interacts with living germs can also be used as the fluorescent marker.
  • a fluorescent marker which interacts with "dead” germs can also be used as the fluorescent marker.
  • Such mixtures are known per se from the prior art (see, for example, Stumpe et al., Loc. Cit. And the system from EasyProof Labor case GmbH, Voerde).
  • a non-fluorescent precursor i.e. a precursor or precursor
  • esterase enzymatic activity
  • green color living proof
  • an intact cell membrane with membrane potential must be present.
  • the fluorescent markers commonly used for seed labeling in epifluorescence microscopy or in DEFT (direct epifluorescence filter technology) or in MMCF (membrane filter microcolony fluorescence method) can also be used as fluorescent markers.
  • a fluorescent dye or a precursor of such a fluorescent dye can be used as the fluorescent marker, from which interaction with the germs, in particular through metabolism and / or enzymatic conversion, the fluorescent dye is generated, are used.
  • Examples of such precursors of fluorescent dyes are e.g. B. is described in WO 86/05206 A1 and in EP 0 443 700 A2, the entire respective disclosure content of which is hereby incorporated by reference (eg non-fluorescent diacetyl fluorescein which can be converted enzymatically to fluorescein).
  • fluorescent dyes which can be used according to the invention as fluorescent markers are, without limitation, e.g. B. 3,6-bis [dimethylamino] acridine (acridine orange), 4 ', 6-diamido-2-phenylindole (DAPI), 3,8-diamino-5-ethyl-6-phenylphenanthridinium bromide (ethidium bromide), 3,8-diamino-5- [3- (diethylmethylammonio) propyl] -6-phenylphenanthridinium diiodide (propidium iodide),
  • Rhodamines such as Rhodamine B and Sulforhodamine B as well as fluorescein isothiocyanate.
  • EP 0 940 472 A1 or to Molecular Probes' Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 5th edition, Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon (PR Haugland, Editor, 1992), the the entire respective disclosure content is hereby incorporated by reference.
  • nucleic acid probes for example, germ-specific nucleic acid probes
  • fluorescent markers which in turn are fluorescence-labeled, in particular with a fluorescent group or a fluorescent molecule.
  • the fluorescent group or the fluorescent molecule can, for example, be covalently or otherwise bound to the nucleic acid probe.
  • the nucleic acid probe used according to the invention as a fluorescence marker can be, for example, a fluorescence-labeled oligo or polynucleotide or a fluorescence-labeled DNA or RNA probe.
  • DNA probes are preferred according to the invention for reasons of stability.
  • nucleic acid probes which can be used according to the invention as fluorescent markers are, for example, “the probes mentioned in WO 01/85340 A2, WO 01/07649 A2 and WO 97/14816 A1, the entire respective disclosure content of which is hereby incorporated by reference.
  • nucleic acid probes that are typically used for fluorescence jn situ hybridization (FISH) for labeling (DNA or RNA labeling) used nucleic acid probes are used.
  • FISH fluorescence jn situ hybridization
  • DNA or RNA labeling used nucleic acid probes.
  • a particularly germ-specific antibody can also be used as the fluorescence marker, which in turn is fluorescence-labeled, in particular with a fluorescent group or a fluorescent molecule, it being possible for the fluorescent group or the fluorescent molecule to be covalently or otherwise bound to the antibody.
  • the detection limit in the method according to the invention with regard to the germs to be determined is ⁇ 100 colony-forming units (CFU) per milliliter of sample volume, preferably ⁇ 10 colony-forming units (CFU) per milliliter of sample volume.
  • the method according to the invention therefore does not require any prior enrichment.
  • the low detection limit is of crucial importance for the fulfillment of certain guidelines or regulations, for example.
  • a significantly higher bacterial count limit e.g. 10 2 to 10 3 CFU / ml
  • a time-consuming and cost-intensive absence check of certain problem germs, ie pathogenic germs must be carried out.
  • the number of bacteria in the range from about 10 CFU per milliliter of sample volume or even less to about 10 8 CFU per milliliter of sample volume can be determined with the method according to the invention.
  • the sample should be diluted in advance accordingly, ie in a suitable manner, for the purpose of quantitative evaluations from a certain number of bacteria (generally from about 10 2 CFU per milliliter sample volume).
  • the method according to the invention is suitable in principle for the determination of any germs, in particular pathogenic germs of all kinds (e.g. microorganisms of all kinds, in particular unicellular microorganisms such as bacteria and fungi, e.g. yeasts or molds).
  • pathogenic germs of all kinds e.g. microorganisms of all kinds, in particular unicellular microorganisms such as bacteria and fungi, e.g. yeasts or molds.
  • the method according to the invention is suitable in principle for the quantitative and / or qualitative determination of germs in any products (i.e. media, matrices, solutions etc.), preferably filterable, in particular liquid and / or flowable products.
  • any products i.e. media, matrices, solutions etc.
  • filterable in particular liquid and / or flowable products.
  • solid products or products which cannot be filtered as such these have to be converted into a form accessible to the method according to the invention during sample preparation; this is done using methods known per se, for example by transferring to a solution or dispersion, comminution, extraction, etc.
  • the method according to the invention is suitable for the quantitative and / or qualitative determination of germs in foods, surfactant-containing products such as detergents and cleaning agents, agents for surface treatment, dispersion products, cosmetics, hygiene products and personal care products, pharmaceuticals, adhesives, cooling lubricants, lacquers and (lacquer -) Coagulation as well as raw materials and raw materials for the aforementioned products.
  • surfactant-containing products such as detergents and cleaning agents, agents for surface treatment, dispersion products, cosmetics, hygiene products and personal care products, pharmaceuticals, adhesives, cooling lubricants, lacquers and (lacquer -) Coagulation as well as raw materials and raw materials for the aforementioned products.
  • the method according to the invention is therefore suitable for all types of possible raw materials, intermediate and end products from the various fields, such as, for example, food, branded articles, cosmetics, adhesives, cooling lubricants (for example oily cooling lubricant emulsions); Process fluids from plants etc., with the restriction that the germs to be detected can be separated using a separation process, such as filtration or sedimentation. It does not matter whether the products are in solid or liquid form.
  • the process according to the invention is particularly suitable for automated implementation (for example in the context of production and / or quality control).
  • the method according to the invention is usually carried out as follows:
  • the sample with the germs to be determined quantitatively and / or qualitatively is introduced into a suitable sample vessel, the bottom of which is provided with a generally round membrane filter and which should be closable without germs.
  • the outer edge of the membrane filter lies on the sample vessel, so that the outer, concentric edge is not covered with germs.
  • germ-inhibiting or germ-killing substances or components e.g. preservatives or surfactants
  • these substances or components are first inactivated and / or removed by removing the sample with a suitable inactivation and / or conditioning solution is brought into contact for a period of time sufficient to enable the inactivation and / or removal of these substances or components.
  • the inactivation and / or conditioning solution is removed via the membrane filter by means of positive or negative pressure. Subsequently, excess or remaining inactivating and / or conditioning solution is removed via the membrane filter, if necessary by simple or multiple washing with water, usually by applying an overpressure or underpressure, so that the washing water is also on simple way is removed. This is followed by a marking of at least part of the germs present in the sample by means of at least one fluorescent marker.
  • the nuclei can, for example, be brought into contact with a solution or dispersion of the fluorescent marker for a time sufficient to mark the nuclei. The excess solution or dispersion of the fluorescent marker is then removed by applying an overpressure or underpressure again via the membrane filter.
  • the sample can be subjected to a single or multiple washing with water, buffer solutions or other liquids.
  • the membrane filter can then finally be separated from the sample vessel, so that a membrane filter coated with fluorescence-labeled germs, the outer edge of which is free of germs, results.
  • This can be fed directly to the fluorescence reflection photometry, ie generally without further preparation of the sample or treatment of the sample or filter.
  • the membrane filter covered with fluorescence-labeled nuclei is then irradiated with light of a suitable wavelength and, as it were, scanned or scanned.
  • the measured value determined correlates with the number of bacteria on the membrane filter or in the sample.
  • the following detergent products of different viscosities were examined using the device according to the invention:
  • a typical process sequence of the method according to the invention in the case of automated implementation includes, for example, that the user of a sample in a defined quantity (for example 1 ml) in a predetermined sample vessel is sealed germ-free and contains a conditioning or inactivation medium and a membrane filter at the outlet.
  • a conditioning or inactivation medium for example 1 ml
  • a membrane filter at the outlet.
  • the sample is shaken and thermostatted at a suitable temperature (for example 37 ° C.) depending on the type of germs.
  • the medium is filtered off through the membrane filter.
  • One or more washing steps with aseptic water, buffer solutions or other liquids follow automatically in order to wash out substances contained in the sample and then the marking with a fluorescent marker.
  • the labeling can be done with an unspecific fluorescent marker that attaches to all germs present in the sample (e.g. nucleotide fragments), or with a marker that uses the DEFT method to distinguish all living and "dead” microorganisms, or in the third case with a fluorescence marker based on FISH technology, which enables the selective staining of individual microorganisms by means of gene-labeled fluorescence probes.
  • excess marking solution is in turn automatically washed off with water, so that after completion of the automatic protocol, fluorescence-marked microorganisms are present on a membrane filter.
  • the intensity of the respective fluorescence and thus the number of microorganisms is then automatically determined with a fluorescence reflection photometer or spectrometer.
  • the filter membrane is irradiated with light of a suitable wavelength and the fluorescent light emitted by the marked microorganisms is detected in a correspondingly wavelength-resolved manner.
  • the subsequent evaluation compares the intensity in the edge area of the membrane filter, which should not be covered with germs, with the intensity in the area with marked microorganisms and calculates the number of germs present in the sample on the basis of a stored calibration.
  • An advantage of the method according to the invention is that it can be carried out automatically. By fully automating the entire process, the process can be carried out more easily, quickly and reproducibly. This has advantages in terms of costs, personnel expenditure and sensitivity. The high reproducibility when carrying out the examinations is also of great advantage.
  • Another advantage of the method according to the invention is that it does not require an epifluorescence microscope.
  • the epifluorescence microscope used according to the prior art by the simplified, namely fluorescence reflection photometric evaluation or detection method or system, the work and investment required for the user is reduced, and the evaluation of the samples can be carried out fully automatically (e.g. with an appropriate algorithm). Furthermore, the radiation exposure is reduced.
  • Yet another advantage of the method according to the invention is the use of standardized or conventional components: the overall system required for carrying out the method according to the invention is integrated in such a way that a large number of standardized or conventional components (vessels, media, filters etc.) are used can be reduced, thereby reducing operator effort and increasing the security of the process.
  • Another advantage of the method according to the invention is the simple detection and evaluation: the method according to the invention can be carried out, for example, in a suitable sample vessel, so that the marked germs are prepared on a suitable filter membrane.
  • a suitable sample vessel e.g. 8 mm diameter
  • a concentric, non-seeded edge enables referencing and internal standardization for each sample.
  • Another advantage of the method according to the invention is the speed with which the method according to the invention is carried out: the method according to the invention already allows the number of bacteria to be determined a time between a few (approx. 3-5) minutes, depending on the type of germs and their number. Conventional culture methods, on the other hand, take up to several days.
  • the high sensitivity of the method according to the invention is also of particular advantage: the method according to the invention allows the determination of germs even in high dilution. Accelerated culture methods are not sufficiently sensitive for a detection limit of 10 CFU per milliliter sample volume.
  • Another advantage of the method according to the invention is the fact that the fluorescence-labeled germs are only exposed to radiation for a relatively short time, since the measured values are acquired relatively quickly by fluorescence reflection photometry. This largely prevents the fluorescence marker from bleaching and thus falsifying the measurement result. This also avoids the killing of living germs, which is particularly important in the case of a live / dead differentiation.
  • “Scanning” or “scanning” the sample (more precisely the membrane filter coated with fluorescence-marked nuclei) in the context of the method according to the invention or in the context of fluorescence reflection photometric evaluation has further advantages: On the one hand, the Scanning large areas can be stimulated. On the other hand - in particular in comparison to a conventional fluorescence microscope with a limited detected area - a high excitation intensity is achieved with a brief comparison. The homogeneous illumination of the samples by scanning is particularly important for intensity measurements.
  • the entire process of determining the microbial load of a sample in the case of automated execution merely consists of filling the sample and starting the process. Subsequently, the User the numerical value for the germ load. The effort for sample preparation and measurement is minimal.
  • the system can thus also be ideally integrated into process systems for quality monitoring, assurance and documentation.
  • the present invention also relates to a device as described in claim 28 for the quantitative and / or qualitative determination of germs in a sample by a method with sample preparation and subsequent detection and / or evaluation, by means of the device in the course of sample preparation, at least a portion of the germs present in the sample can be marked by means of at least one fluorescence marker and the detection and / or evaluation can be carried out using the fluorescence marker, in particular for carrying out a method as described above.
  • sample container 1 shows the schematic representation of a device for carrying out a method for the quantitative and / or qualitative determination of germs in a sample.
  • the heart of this device is a sample container 1.
  • This sample container 1 is, as indicated schematically, in the device via various lines 2 to control valves 3 for ventilation 4 and compressed air 5 and via pumps 6 to connections for dye 7 ("fluorescent marker") and for Rinsing solution 8 included.
  • dye 7 dye 7
  • Rinsing solution 8 included.
  • Sterilfilter_2a integrated.
  • Fig. 1 shows the relationships that have been explained above in a schematic representation. The method of operation of such a device logically follows the procedure explained for the method claims.
  • a membrane filter 9 is arranged, which is indicated in the illustrated embodiment as a simple circular disk. This is designed so that it retains the germs to be detected and / or is impermeable to the germs to be detected.
  • a detection system 10 which is designed to carry out a fluorescence reflection photometric measurement and on which the sample receptacle 1 with the membrane filter 9 or preferably the membrane filter 9 removed from the sample receptacle 1 can be positioned for the purposes of detection and / or evaluation.
  • FIG. 1 shows the membrane filter 9 indicated at the bottom of the sample receptacle 1. This means that the membrane filter 9 in the embodiment shown in FIG. 1 can be removed downwards from the sample receptacle 1 in order to be fed to the detection system 10. How the arrangement looks in detail here is left to the constructive considerations of the expert.
  • the membrane filter 9 is a membrane filter having pores, in particular a polycarbonate membrane filter, and if, in particular, the size of the pores of the membrane filter 9 is smaller than the size of the germs present or to be determined in the sample to be determined.
  • a silicon microsieve is used instead of the membrane filter 9.
  • the advantages of using silicon microsieves have already been discussed in detail above.
  • a silicon microsieve can generally be used in the device according to the invention instead of a membrane filter. Both when arranged within the sample container 1 and when the membrane filter 9 is separated from the sample container 1 for the purpose of detecting the marked germs, it is advisable to work with a reference surface in order to be able to standardize the respective sample independently.
  • the membrane filter 9 arranged in the sample receptacle 1 has an area 12, in particular edge, which cannot or cannot be practically occupied during the sample preparation of germs and which serves as a reference surface when carrying out the detection and / or evaluation.
  • the area or edge 12 not covered with markings enables the internal standardization of the sample itself on the membrane filter 9.
  • the membrane filter 9 has an effective diameter for the filtration of approximately 5 to approximately 25 mm, in particular approximately 6 mm to approximately 12 mm, preferably approximately 8 mm to about 10 mm.
  • the membrane filter 9 retains the germs, that is to say the germs marked with the fluorescence marker remain on the top of the membrane filter 9. It is advisable to select the fluorescence marker in such a way that it is membrane-permeable with respect to the membrane filter 9, so that a favorable signal / noise ratio is achieved in the detection system 10. To handle the sample in the sample receptacle 1, one has to isolate the fluorescence-marked ("marked") germs on the membrane filter 9.
  • FIG. 1 shows a variant in which pressure is taken with compressed air 5.
  • FIG. 1 also shows that the device has a thermostat 13 for thermostatting the sample receptacle 1.
  • the thermostatic device 13 with a total of four receiving openings can be seen here, so that a total of four sample receiving containers 1 can be thermostatted simultaneously to the normally desired temperature, which is dependent on the target germs (e.g. 37 ° C.).
  • the evaluation device 11 controls a central controller 14, which forwards the measurement parameters to control electronics 15 for the excitation optics 16 and a positioning table 17.
  • the measuring object is located on the positioning table 17, that is to say here the membrane filter 9 is populated with marked germs.
  • Excitation light emitted by the excitation optics 16 onto the measurement object 18 is reflected as fluorescence light to a detection optics 19.
  • the detected signal is fed to measurement electronics 20, which in turn feeds the controller 14.
  • the present invention relates to the use according to the invention of the device according to the invention, as described above, as is the subject of the claims for use (claims 37 to 39).

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Abstract

Beschrieben ist ein Verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen in einer Probe, wobei das Verfahren einen Verfahrensschritt (a) der Probenaufbereitung und einen Verfahrensschritt (b) der Detektion und/oder Auswertung umfaßt, wobei im Verfahrensschritt (a) eine Markierung zumindest eines Teils der in der Probe vorhandenen Keime mittels mindestens eines Fluoreszenzmarkers erfolgt und im Verfahrensschritt (b) eine quantitative und/oder qualitative Detektion und/oder Auswertung erfolgt, wobei die in Verfahrensschritt (b) durchgeführte Detektion und/oder Auswertung fluoreszenzreflexionsphotometrisch erfolgt. Gleichermaßen beschrieben ist eine entsprechende Vorrichtung zur Durchführung eines solchen Verfahrens.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung von Keimen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen nach dem Oberbegriff des Anspruchs 27, insbesondere zur Durchführung des vorgenannten Verfahrens, sowie die Verwendung dieser Vorrichtung, insbesondere für die vorzugsweise automatisierte Produktions- und/oder Qualitätskontrolle.
Für eine Vielzahl von Substanzen, Rohstoffen und Produkten aus den unterschiedlichen Bereichen Industrie, Handwerk, Haushalt, Gesundheit, Gastronomie etc. muß die mikrobiologische Sicherheit gewährleistet sein.
Dabei ist zu beachten, daß die Art und Anzahl unterschiedlicher Keime, wie z. B. Bakterien und Pilze, in engen Grenzen kontrolliert werden muß.
Quantitative mikrobiologische Analysetechniken werden zur Qualitätssicherung schon seit langer Zeit eingesetzt. Grundlage dieser Methoden ist es, einzelne Keime, die in dem zu untersuchenden Material vorkommen, so zu vermehren, das sie als Ausstriche oder Kolonien mit bloßem Auge sichtbar werden. Standardmäßig werden hierfür Kultivierungsmethoden eingesetzt, die diese Keime entweder auf festen Nährböden oder in flüssigen Nährlösungen bzw. -medien vermehren. Die Durchführung herkömmlicher Kultivierungsverfahren zum Nachweis von Bakterien und Pilzen dauert je nach Methode und Keimart bis zu mehreren Tagen.
Nach dem Stand der Technik geht man bei den Kultivierungsverfahren im allgemeinen derart vor, daß Nährmedien (typischerweise Kulturschalen mit Nährmedien auf Basis von Agar-Agar) mit der Probe beimpft werden und bei den jeweiligen Keimen angepaßten, im allgemeinen erhöhten Temperaturen für bis zu einer Woche kultiviert werden (z. B. in einem Brutschrank). Aus dem Wachstum und der Form der entstandenen Kulturen kann ein Fachmann dann die Art und das Ausmaß der mikrobiellen Belastung der Probe ableiten.
Diese Technologie hat den entscheidenden Nachteil, daß sich nur ein unbestimmter Bruchteil der in der Probe enthaltenen Keime kultivieren läßt und die Information erst nach einer Woche zur Verfügung steht.
Um die zuvor beschriebenen Probleme zu lösen, wurden in der Vergangenheit bereits eine Reihe von Verfahren entwickelt, um den mikrobiellen Nachweis zu beschleunigen bzw. die Empfindlichkeit zu erhöhen. Dazu zählen mikroskopische Verfahren, welche die Keime unselektiv oder selektiv anfärben und entsprechend nachweisen, aber auch Verfahren, die auf Immuno-Assays basieren, und direkte molekularbiologische Verfahren, welche die Erbsubstanz der Keime amplifizieren und anschließend gel-elektrophoretisch nachweisen.
Seit einiger Zeit wird versucht, durch neue, sogenannte "Schnellnachweismethoden" die Nachweiszeit von einigen Tagen auf wenige Stunden oder noch darunter zu reduzieren. "Schnellnachweismethoden" werden partiell schon eingesetzt (Impedanz, Biolumineszenz etc.), aber es besteht die Nachfrage nach direkteren und schnelleren Methoden. Denn auch die bisher etablierten "Schnellnachweisverfahren" beruhen auf einer zeitabhängigen Anreicherung von biologischem Material, so daß immer noch 24 bis 48 Stunden für eine Analyse benötigt werden.
Fluoreszenzoptische Verfahren haben in der jüngeren Vergangenheit die herkömmlichen "Schnellnachweismethoden" und Kultivierungsverfahren mehr und mehr abgelöst. Beispielsweise steht mit der Direkten Epifluoreszenz-Filter-Technik (DEFT) erstmals eine Direktmethode zur Verfügung, welche auch einen quantitativen "lebend/tot"-Keimnachweis in weniger als einer Stunde erlaubt. Dieses unspezifische, fluoreszenzoptische Verfahren ist als qualitatives Verfahren seit über 25 Jahren in der universitären Grundlagenforschung bekannt (siehe z. B. Pettipher et al., Appl. Environ. Microbiol. 44(4): 809-13, 1982) und hat sich seit Anfang der 1990er Jahre zunehmend in industriellen Anwendungen (z. B. Brauereien, Molkereien, Lebensmittelindustrie etc.) als quantitative Untersuchungsmethode etabliert (Hermida et al., J. AOAC Int. 83(6): 1345-1348, 2000 und Nitzsche et al., Brauwelt, Nr. 5, 177-178, 2000). Es existiert außerdem eine Euro-Vorschrift für die Untersuchung bestrahlter Lebensmittel mit einem DEFT- Screeningverfahren (EN 13783: 2001 "Nachweis der Bestrahlung von Lebensmitteln mit Epifluoreszenz-Filtertechnik/aerober mesophiler Keimzahl (DEFT/APC) - Screeningverfahren").
Alternative, selektiv wirkende Fluoreszenzfarbstoffe werden als Laborkits für Vitalnachweise von diversen Herstellern angeboten (z. B. von den Firmen Molecular Probes und EasyProof Laborbedarf GmbH). Einige Anbieter (z. B. die Firma Chemunex) verkaufen Gerätesysteme; die beispielsweise von der Firma Chemunex angebotenen Systeme beruhen entweder auf dem Prinzip der Durchflußcytometrie (L. Philippe, SÖFW-Journal 126, 28-31 , 2000), die zur Untersuchung niedriger Keimgehalte einer Anreicherungsphase von 24 Stunden bedarf, oder auf einem mikroskopischen Filtrationsverfahren, welches aber keine "lebend/tof'-Differenzierung erlaubt (Wallner et al., PDA J. Pharm. Sei. Technol. 53(2): 70-74, 1999).
Die sogenannte Membranfilter-Mikrokolonie-Fluoreszenz-Methode (MMCF- Methode, siehe z. B. J. Baumgart, Mikrobiologische Untersuchung von Lebensmitteln, Behr's...Verlag 1993, 3. Auflage, S. 98 ff.) sieht die Vorbereitung der Probe bzw. der in der Probe vorhandenen Keime auf einem Membranfilter vor. Nachteilig ist dabei, daß eine zeitaufwendige Voranreicherung der Keime vorangehen muß, der Membranfilter für die anschließende Epifluoreszenzmikroskopie vorbehandelt werden muß (Befeuchtung mit speziellen Medien, Dimensionierung und Trocknung) und die Zahl der Keime durch Auszählung der fluoreszenzmarkierten Kolonien unter einem Epifluoreszenzmikroskop oder einer UV-Lampe erfolgen muß.
Einige der zuvor beschriebenen Technologien liefern zwar innerhalb weniger Stunden ein Ergebnis, sie sind aber im allgemeinen sehr aufwendig hinsichtlich der erforderlichen Nachweisgeräte und der nötigen Kenntnisse des Benutzers. Aus diesem Grund haben sich diese Verfahren bisher nicht im ausreichenden Maße im Routineeinsatz etabliert. Weiterhin weisen die einzelnen Methoden Einschränkungen im Hinblick auf Spezifität und Sensitivität auf. Des weiteren besitzen einige der zuvor beschriebenen Methoden eine zu hohe Keimnachweisgrenze, so daß auf eine vorangehende Kultivierung oftmals nicht verzichtet werden kann.
Bei den herkömmlichen Kultivierungsmethoden und bei
"Schnellnachweismethoden" mit entsprechenden Anreicherungsschritten sind außerdem durch die Arbeitsweise grundsätzliche Nachteile vorhanden:
Die Auswahl der Nährmedien spielt eine entscheidende Rolle, welche Mikroorganismen vermehrt werden können. Selektive Nährmedien bieten hier Vorteile. Aber auch diese können nur die Mikroorganismen vermehren, die physiologisch dazu in der Lage sind. Laut neuesten Erkenntnissen sind jedoch nur 5 % der Mikroorganismen kultivierbar. Daher entstehen mit den konventionellen Methoden oft falsch negative Ergebnisse, obwohl tatsächliche Verkeimungen der Probe vorliegen.
Darüber hinaus ist die Aussagekraft der Analytik durch die zur Verfügung stehenden Zeit begrenzt. Nach Abschluß der Anreicherungszeit müssen alle Keime sich soweit vermehrt haben, daß sie sichtbar geworden sind. Bei verzögertem Anwachsen durch ungünstige Probenahme- oder Anzuchtbedingungen kann es somit zu irrtümlich negativen Ergebnissen kommen. Deshalb erfordert die Durchführung der herkömmlichen Kultivierungsverfahren zum Nachweis von Bakterien und Pilzen oft mehrere Tage, so daß die mikrobiologischen Ergebnisse aber oftmals zu spät kommen, um noch einen regulativen Eingriff in den Produktionsprozeß zu ermöglichen.
Mit Nachweisverfahren mittels Kultivierung der Keime lassen sich nur vitale, vermehrungsfähige Keime nachweisen. Oftmals hat aber die bestehende Produktkonservierung Kontaminanten abgetötet. Die im Produkt vorliegenden "toten" Keime lassen sich auf diese Weise jedoch nicht nachweisen, so daß mögliche Hygieneprobleme bei der Produktion oder bei der Abfüllung nicht bemerkt werden bzw. erst dann, wenn Störfälle eintreten, d. h. nach Versagen der Konservierung). Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der eingangs genannten Art, welches sich zur quantitativen bzw. qualitativen Bestimmung von Keimen eignet und insbesondere die zuvor geschilderten Nachteile zumindest teilweise vermeidet, und eine entsprechende Vorrichtung zur Durchführung eines solchen Verfahrens bereitzustellen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Anmeldung ist somit ein Verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen in einer Probe, wobei das Verfahren einen Verfahrensschritt (a) der Probenaufbereitung und einen Verfahrensschritt (b) der Detektion und/oder Auswertung umfaßt, wobei im Verfahrensschritt (a) eine Markierung zumindest eines Teils der in der Probe vorhandenen Keime mittels mindestens eines Fluoreszenzmarkers erfolgt und im Verfahrensschritt (b) eine quantitative und/oder qualitative Detektion und/oder Auswertung erfolgt, wobei die in Verfahrensschritt (b) durchgeführte Detektion und/oder Auswertung fluoreszenzreflexionsspektrometrisch bzw. fluoreszenzreflexionsphotometrisch erfolgt (Die beiden Begriffe "fluoreszenzreflexionsspektrometrisch" bzw. "fluoreszenzreflexionsphotometrisch" werden nachfolgend synonym gebraucht, und die prinzipielle Meßmethode ist nachfolgend noch näher erläutert.).
Ein wesentlicher Gedanke der vorliegenden Erfindung ist somit darin zu sehen, daß die in der Probe vorhandenen Keime zunächst fluoreszenzmarkiert und die anschließende quantitative und/oder qualitative Auswertung bzw. Detektion fluoreszenzreflexionsphotometrisch erfolgt. Wie im folgenden noch näher erläutert, bietet der Einsatz der Fluoreszenzreflexionsphotometrie den großen Vorteil einer relativ einfachen, wenig aufwendigen Detektion bzw. Auswertung, weil die fluoreszenzmarkierten Keime hierzu im wesentlichen keiner weiteren Aufbereitung bedürfen. Insbesondere entfällt der zeit- und arbeitsaufwendige Verfahrensschritt der (Vor-)Anreicherung von Keimen, d. h. die erfindungsgemäße fluoreszenzreflexionsphotometrische Detektion bzw. Auswertung liefert direkt die "authentische" bzw. in der Probe vorhandene Keimzahl. Eine Besonderheit des erfindungsgemäßen Verfahrens ist somit in der Kombination aus Fluoreszenzmarkierung von Keimen, insbesondere Mikroorganismen, mit geeigneten Fluoreszenzmarkern und dem anschließenden Nachweis der fluoreszenzmarkierten Keime mit einem vereinfachten, nämlich fluoreszenzreflexionsphotometrischen Detektions- bzw. Auswerteverfahren und einer entsprechenden Vorrichtung. Da die Probe bei der Methode der Fluoreszenzreflexionsphotometrie nur kurzzeitig einer Bestrahlung ausgesetzt ist, wird außerdem ein Ausbleichen der Fluoreszenzmarker und somit eine Verfälschung des Meßergebnisses effizient vermieden.
Die fluoreszenzreflexionsspektrometrische bzw. fluoreszenzreflexionsphotometrische Detektion bzw. Auswertung erfaßt die von den fluoreszenzmarkierten Keimen bei Bestrahlung entsprechender Wellenlänge in Reflexion emittierte Strahlung bzw. deren Intensität, die mit der in der Probe vorhandenen Keimzahl korreliert (Für weitere Einzelheiten zu reflexionsphotometrischen bzw. reflexionsphotometrischen Methoden kann beispielsweise auf die diesbezüglichen Ausführungen in Römpp, Chemielexikon, Thieme Verlag, 10. Auflage, Bd. 5, Seiten 3756/3757, Stichworte "Reflexion" und "Reflexionsspektroskopie" sowie Bd. 4, Seiten 3312 bis 3314, Stichwort "Photometrie", jeweils einschließlich der dort referierten Literatur verwiesen werden, deren gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist). Auf diese Weise wird die bei der z. B. im Rahmen der MMCF-Methode (Membranfilter-Mikrokolonie-Fluoreszenz-Methode) angewandten
Epifluoreszenzlichtmikroskopie noch erforderliche, relativ aufwendige Auszählung der Kolonien und eine der Auszählung vorhergehende Anreicherung der Keime vermieden.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens einsetzbare Fluoreszenzreflexionsphotometer bzw. -spektrometer sind für den Fachmann ausgehend von im Handel erhältlichen, hierfür üblicherweise verfügbaren Komponenten ohne weiteres konzipierbar.
Die Formulierung "Markierung zumindest eines Teils der in der Probe vorhandenen Keime" meint insbesondere folgendes: Je nachdem, ob nur spezielle in der Probe vorhandene Keime bzw. Keimarten oder aber sämtliche in der Probe vorhandenen Keime bestimmt werden sollen, markiert man im ersteren Fall gezielt nur ein speziellen Teil der in der Probe vorhandenen Keime (im allgemeinen mit keimspezifischen Fluoreszenzmarkern), während man im letzteren Fall sämtliche in der Probe vorhandenen Keime markiert (im allgemeinen mit keimunspezifischen Fluoreszenzmarkern oder aber einer Mischung verschieden keimspezifischer Fluoreszenzmarker).
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich aufgrund des fluoreszenzreflexionsphotometrisch ermittelten Meßwertes mittels geeigneter Kalibrierung die in der Probe vorhandene Zahl an Keimen bestimmen (und zwar im Fall der Fluoreszenzmarkierung sämtlicher in der Probe vorhandenen Keime die Gesamtzahl aller in der Probe vorhandenen Keime und im Fall der Fluoreszenzmarkierung nur spezieller Keime deren Gesamtzahl). Wie im folgenden noch erläutert, ermöglicht der Einsatz keimspezifischer Fluoreszenzmarker darüber hinaus auch eine qualitative Aussage in bezug auf das Vorhandensein spezieller Keime in der Probe.
Im allgemeinen werden die fluoreszenzmarkierten Keime bei der in Verfahrensschritt (a) durchgeführten Probenaufbereitung auf einem Membranfilter (z. B. einem Polycarbonatmembranfilter) aufgebracht, der vorzugsweise porös ist. Der Membranfilter sollte im allgemeinen derart ausgebildet sein, daß er die Keime zurückhält bzw. in bezug auf die Keime undurchlässig ist. Zu diesem Zwecke sollte die Größe der Poren des Membranfilters so gewählt sein, daß die Porengröße kleiner als die in der Probe vorhandenen Keime ist. Wie im folgenden noch erläutert, sollte ein Teil bzw. Bereich des Membranfilters, im allgemeinen der Rand, nicht mit Keimen versehen bzw. belegt sein, weil dies eine Referenzierung bzw. interne Kalibrierung oder Standardisierung für jede Probe gewährleistet. Erfindungsgemäß geeignete Membranfiltermaterialien sind neben Polycarbonat auch PTFE, Polyester sowie Cellulose und Cellulosederivate, wie Celluloseacetat, regenerierte Cellulose, Nitrocellulose oder Celluloselosemischester. Erfindungsgemäß geeignete Membranfilter werden beispielsweise von der Firma Macherey-Nagel vertrieben (z. B. die "PORAFIL®"-Serie). Der Einsatz eines Membranfilters bietet den großen Vorteil, daß die fluoreszenzreflexionsphotometrische Detektion bzw. Auswertung, insbesondere ohne weitere Probenbehandlung, -aufbereitung, -Übertragung oder dergleichen (d. h. insbesondere ohne Voranreicherung), unmittelbar auf dem Membranfilter erfolgen kann.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die fluoreszenzmarkierten Keime bei der in Verfahrensschritt (a) durchgeführten Probenaufbereitung auf einem Silizium-Mikrosieb aufgebracht. Dies ist besonders vorteilhaft, weil Silizium-Mikrosiebe eine besonders glatte und ebenmäßige Oberfläche aufweisen und deshalb darauf befindliche Keime besser detektiert werden können. Ferner ist die Reinigung solcher Siebe relativ einfach zu bewerkstelligen und sie sind mehrfach verwendbar. Weiterhin besitzen die Silizium-Mikrosiebe eine gute Biokompartibilität und eine gute Reflektivität. Ein weiterer Vorteil der Mikrosiebe ist in ihrer starren Struktur zu sehen, die erhebliche Vorteile bei ihrer Handhabung bewirken. Die besonders einheitliche Porengröße ist ein weiterer Vorteil, der die Genauigkeit selektiver Filtrationen weiter erhöht. Die Porengrößen der für das erfindungsgemäße Verfahren einzusetzenden Mikrosiebe sollte Vorteilhafterweise zwischen etwa 0,1 und 2 μm liegen. Besonders bevorzugt sind Mikrosiebe mit Porengrößen von 0,45 μm und 1 ,2 μm. Selbstverständlich können je nach Größe der zu bestimmenden Keim auch Siebe mit hiervon abweichenden Porengrößen eingesetzt werden, d.h. auch mit Poren kleiner als 0,1 μm bzw auch größer als 2 μm.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist der Einsatz der Silizium-Mikrosiebe ebenfalls überall dort möglich, wo Membranfilter eingesetzt werden. Somit sind vorteilhafte Ausgestaltungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens oder der Vorrichtung mit einem Membranfilter auch jeweils mit Hilfe eines Silizium- Mikrosiebs realisierbar.
Vorteilhafterweise wird der in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Fluoreszenzmarker derart ausgewählt wird, daß er membrangängig in bezug auf den bei der in Verfahrensschritt (a) durchgeführten Probenaufbereitung verwendeten Membranfilter ist. Dies hat den Vorteil, daß bei der fluoreszenzreflexionsphotometrischen Detektion bzw. Auswertung keine durch überschüssige Fluoreszenzmarker verursachten Störsignale bzw. kein Hintergrundrauschen auftritt und folglich ein günstiges Signal/Hintergrund- Verhältnis bzw. Signal/Rausch-Verhältnis erzielt wird.
Die Durchführung der Fluoreszenzmarkierung der in der Probe vorhandenen Keime in Verfahrensschritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in an sich bekannter Weise durchgeführt. Dies ist dem Fachmann ohne weiteres geläufig. Beispielsweise können zu diesem Zweck die zu markierenden Keime mit einer Lösung oder Dispersion der im Überschuß in bezug auf die vorhandenen Keime vorliegenden Fluoreszenzmarker in Kontakt gebracht werden, wobei die Kontaktzeit ausreichend sein muß, um eine vollständige Fluoreszenzmarkierung aller Keime zu gewährleisten, die bei diesem Verfahrensschritt markiert werden sollen (je nach Auswahl des Fluoreszenzmarkers z. B. sämtliche in der Probe vorhandenen Keime oder aber sämtliche Keime nur einer oder mehrerer Keimarten). Nach der eigentlichen Fluoreszenzmarkierung können dann die überschüssigen Fluoreszenzmarker entfernt bzw. von den fluoreszenzmarkierten Keimen abgetrennt werden. Dies kann im Fall der Verwendung eines porösen Membranfilters, der membrangängig in bezug auf die Fluoreszenzmarker, aber undurchlässig in bezug auf die Keime ist, beispielsweise dadurch geschehen, daß man (z. B. durch Anlegen von Überdruck oder Unterdruck) die Lösung bzw. Dispersion der überschüssigen Fluoreszenzmarker über den porösen Membranfilter abführt und gegebenenfalls das Ganze mit Wasser, Pufferlösungen oder anderen Flüssigkeiten nachspült, so daß auf dem Membranfilter schließlich nur noch die fluoreszenzmarkierten Keime (gegebenenfalls zusammen mit den Keimen, die gezielt unmarkiert geblieben sind) verbleiben. Dies ermöglicht dann eine sich ohne weiteres in Verfahrensschritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens anschließende fluoreszenzreflexionsphotometrische Detektion bzw. Auswertung. -
Gegebenenfalls kann der Verfahrensschritt (a) der Probenaufbereitung auch eine Inaktivierung und/oder Entfernung von gegebenenfalls in der Probe vorhandenen keimhemmenden und/oder keimtötenden Substanzen oder Bestandteilen (z. B. Konservierungsstoffe, Tenside etc.) umfassen. Dies verhindert, daß die späteren Meßergebnisse dadurch verfälscht werden, daß ein Teil der Keime während der Probenaufbereitung oder Messung durch die keimhemmenden bzw. keimtötenden Substanzen oder Bestandteilen abgetötet bzw. inaktiviert werden und somit eine fälschlich zu geringe Keimzahl bestimmt wird. Auf diese Weise wird eine Bestimmung der Keimzahl auch in Proben mit keimhemmenden und/oder keimtötenden Substanzen oder Bestandteilen (z. B. Konservierungsstoffe, Tenside etc.) ermöglicht, so daß das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise auch bei Tensid- und Dispersionsprodukten angewendet werden kann.
Der je nach Art der Probe nur gegebenenfalls durchgeführte Verfahrensschritt der Inaktivierung bzw. Entfernung von gegebenenfalls in der Probe vorhandenen keimhemmenden bzw. keimtötenden Substanzen oder Bestandteilen wird vorteilhafterweise vor der Fluoreszenzmarkierung, vorzugsweise unmittelbar nach der Probenahme bzw. unmittelbar zu Beginn der in Verfahrensschritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführten Probenaufbereitung ausgeführt; auf diese Weise ist sichergestellt, daß die keimhemmenden bzw. keimtötenden Substanzen, Bestandteile, Inhaltsstoffe und dergleichen im wesentlichen noch keine Änderung der in der ursprünglichen Probe vorhandenen Keimzahl bewirkt haben können. Gleichermaßen, wenn auch weniger bevorzugt, ist es möglich, die Inaktivierung bzw. Entfernung von gegebenenfalls in der Probe vorhandenen keimhemmenden bzw. keimtötenden Substanzen oder Bestandteilen nach der Fluoreszenzmarkierung durchzuführen. Ebenfalls ist es möglich, die Fluoreszenzmarkierung und die Inaktivierung bzw. Entfernung der keimhemmenden bzw. keimtötenden Substanzen oder Bestandteilen gleichzeitig durchzuführen.
Der je nach Art der Probe nur gegebenenfalls durchgeführte Verfahrensschritt der Inaktivierung bzw. Entfernung von gegebenenfalls in der Probe vorhandenen keimhemmenden bzw. keimtötenden Substanzen oder Bestandteilen erfolgt in an sich bekannter Weise. Beispielsweise kann auf den Beitrag von Stumpe et al. "Chemolumineszenz-basierte Direktnachweise von Mikroorganismen - Ein Erfahrungsbericht aus der Lebensmittel- und Kosmetikindustrie" auf den Seiten 317 bis 323 des Tagungsbandes "HY-PRO 2001 , Hygienische Produktionstechnologie/Hygienic Production Technology", 2. Internationaler Fachkongreß und Ausstellung, Wiesbaden 15.-17.5.2001 und die in diesem Beitrag angegebene Literatur verwiesen werden; der gesamte Inhalt dieses Beitrags einschließlich des Inhalts der dort genannten Literatur wird hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen. Im allgemeinen kann dies dadurch erfolgen, daß die zu analysierende Probe mit einer geeigneten Inaktivierungs- und/oder Konditionierlösung in Kontakt gebracht wird. Solche Inaktivierungs- bzw. Konditionierlösungen sind dem Fachmann an sich bekannt (z. B. wäßrige THL- Konditionierlösung, TLH = Tween-Lecϊthin-Hjstidin). Erfindungsgemäß geeignete wäßrige Inaktivierungs- bzw. Konditionierlösungen können beispielsweise neben TLH (z. B. Polysorbat 80 = Tween 80, Soyalecithin und L-Histidin) auch noch Puffersubstanzen (z. B. Phosphatpuffer, wie Hydrogenphosphat und/oder Dihydrogenphosphat), weitere Salze (z. B. Natriumchlorid und/oder Natriumthiosulfat) und Trypton (Pepton aus Casein) enthalten.
Eine erfindungsgemäß besonders geeignete Inaktivierungs- bzw. Konditionierlösung hat die folgende Zusammensetzung:
- Trypton 1 ,0 g
- Natriumchlorid 8,5 g
- Natriumthiosulfatpentahydrat 5,0 g
- 0,05 M Phosphatpufferlösung 10 ml
- TLH-Wasser ad 1000 ml.
Das erfindungsgemäß einsetzbare TLH-Wasser hat insbesondere folgende Zusammensetzung:
- Polysorbat 80 (Tween 80) 30,0 g
- Soyalecithin 3,0 g
- L-Histidin 1 ,0 g
- Vollentsalztes Wasser ad 1000 ml.
Die erfindungsgemäß einsetzbare Phosphatpufferlösung hat insbesondere folgende Zusammensetzung:
- Kaliumdihydrogenphosphat 6,8045 g
- Dikaliumhydrogenphosphat 8,709 g
- Vollentsalztes Wasser ad 1000 ml. Die Auswahl an Fluoreszenzmarker(n) ist nicht kritisch. Hier können, je nach Anwendung und Art der Keime, die aus dem Stand der Technik an sich bekannten Fluoreszenzmarker verwendet werden, sofern sie sich zur Verwendung im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eignen.
Der Begriff "Fluoreszenzmarker" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung sehr breit verstanden und meint insbesondere jeden Fluoreszenzmarker, der derart ausgebildet ist, daß er mit den Keimen in Wechselwirkung tritt, beispielsweise an die Keime, insbesondere an deren Zellwand (Hülle) und/oder Nukleinsäure, anbindet und/oder von den Keimen aufgenommen, insbesondere metabolisiert und/oder enzymatisch umgesetzt wird.
Bei dem erfindungsgemäß eingesetzten Fluoreszenzmarker kann es sich beispielsweise um einen keimunspezifischen Fluoreszenzmarker oder ein Gemisch keimunspezifischer Fluoreszenzmarker handeln. Dies ermöglicht eine relativ kostengünstige Fluoreszenzmarkierung aller in der Probe vorhandenen Keime und somit eine relativ schnelle Bestimmung der Gesamtkeimzahl in der Probe.
Insbesondere für den Fall, daß selektiv nur spezielle Keime qualitativ und quantitativ erfaßt werden sollen, kann als Fluoreszenzmarker ein keimspezifischer Fluoreszenzmarker oder ein Gemisch verschieden keimspezifischer Fluoreszenzmarker eingesetzt werden.
Gleichermaßen kann als Fluoreszenzmarker ein Gemisch keimunspezifischer und keimspezifischer Fluoreszenzmarker eingesetzt werden.
Beispielsweise kann als Fluoreszenzmarker auch ein mit lebenden Keimen in Wechselwirkung tretender Fluoreszenzmarker eingesetzt werden. Gleichermaßen kann als Fluoreszenzmarker auch ein mit "toten" Keimen in Wechselwirkung tretender Fluoreszenzmarker eingesetzt werden. Ebenfalls ist es möglich, als Fluoreszenzmarker ein Gemisch von mit lebenden Keimen in Wechselwirkung tretenden Fluoreszenzmarkern und mit "toten" Keimen in Wechselwirkung tretenden Fluoreszenzmarkern einzusetzen. Auf diese Weise kann eine lebend/tot-Differenzierung der in der Probe vorhandenen Keime erreicht werden. Solche Gemische sind aus dem Stand der Technik an sich bekannt (siehe beispielsweise Stumpe et al., loc. cit. und das dort genannten System der Firma EasyProof Laborbedarf GmbH, Voerde).
Das zuvor genannte Markersystem der Firma EasyProof Laborbedarf GmbH wurde ursprünglich für die Brauereiindustrie eingeführt (Eggers et al., Brauindustrie 6, 34-35, 2001 ). Dabei wird eine nichtfluoreszierende Vorstufe (d. h. ein Vorläufer oder Precursor) eines Fluoreszenzmarkers in eine intakte mikrobielle Zelle aufgenommen und durch enzymatische Aktivität (Esterase) innerhalb der Zelle (im Zytoplasma) in eine fluoreszierende Verbindung umgewandelt (Grünfärbung = Lebendnachweis); damit dieser Vorgang ablaufen kann, muß eine intakte Zellmembran mit Membranpotential vorhanden sein. Der Nachweis "toter" Zellen erfolgt über die Einlagerung eines spezifischen Fluoreszenzfarbstoffes in die DNA der Zelle. Dieser Einbau kann wiederum nur bei Zellen erfolgen, die eine defekte Zellmembran aufweisen (Rotfärbung = Todnachweis). Da beide Reaktionen auf unterschiedlichen Prinzipien beruhen, sind die Ergebnisse voneinander unabhängig. Diese Markierungstechnik schädigt die Zellen nicht, so daß bei der Auswertung der aktuelle mikrobiologische Status der Probe bestimmt werden kann.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich als Fluoreszenzmarker beispielsweise auch die in der Epifluoreszenzmikroskopie oder in der DEFT (Direkte Epifluoreszenz-Filter-Technik) oder in der MMCF (Membranfilter-Mikro- kolonie-Fluoreszenz-Methode) üblicherweise zur Keimmarkierung verwendeten Fluoreszenzmarker einsetzen.
Beispielsweise kann als Fluoreszenzmarker ein Fluoreszenzfarbstoff oder aber eine Vorstufe eines solchen Fluoreszenzfarbstoffs, aus dem durch Wechselwirkung mit den Keimen, insbesondere durch Metabolisierung und/oder enzymatische Umsetzung, der Fluoreszenzfarbstoff generiert wird, eingesetzt werden.
Beispiele für derartige Vorstufen von Fluoreszenzfarbstoffen sind z. B. in der WO 86/05206 A1 und in der EP 0 443 700 A2 beschrieben, deren gesamter jeweiliger Offenbarungsgehalt hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist (z. B. nichtfluoreszierendes Diacetylfluorescein, das enzymatisch zu Fluorescein umgesetzt werden kann)
Beispiele für erfindungsgemäß als Fluoreszenzmarker verwendbare Fluoreszenzfarbstoffe sind, ohne Beschränkung, z. B. 3,6-Bis[dimethylamino]acridin (Acridin- orange), 4',6-Diamido-2-phenylindol (DAPI), 3,8-Diamino-5-ethyl-6-phenyl- phenanthridiniumbromid (Ethidiumbromid), 3,8-Diamino-5-[3-(diethyl- methylammonio)propyl]-6-phenyl-phenanthridiniumdiiodid (Propidiumiodid),
Rhodamine wie Rhodamin B und Sulforhodamin B sowie Fluoresceiniso- thiocyanat. Für weitere Beispiele kann auch auf die EP 0 940 472 A1 oder aber auf Molecular Probes' Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 5. Ausgabe, Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon (P. R. Haugland, Editor, 1992) verwiesen werden, deren gesamter jeweiliger Offenbarungsgehalt hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Des weiteren kann auch auf die einschlägigen Chemikalienkataloge verwiesen werden (z. B. Katalog Biochemikalien und Reagenzien für die Life Science Forschung der Firma Sigma- Aldrich, "Fluorescent Labeling Reagents", Ausgabe 2002/2003).
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich als Fluoreszenzmarker beispielsweise auch Nukleinsäuresonden (z. B. keimspezifische Nukleinsäuresonden) einsetzen, die ihrerseits fluoreszenzmarkiert sind, insbesondere mit einer fluoreszierenden Gruppe oder einem fluoreszierenden Molekül. Die fluoreszierende Gruppe oder das fluoreszierende Molekül können beispielsweise kovalent oder anderweitig an die Nukleinsäuresonde gebunden sein. Bei der erfindungsgemäß als Fluoreszenzmarker eingesetzten Nukleinsäuresonde kann es sich beispielsweise um ein fluoreszenzmarkiertes Oligo- oder Polynukleotid oder eine fluoreszenzmarkierte DNA- oder RNA-Sonde handeln. Im allgemeinen werden aus Stabilitätsgründen DNA-Sonden erfindungsgemäß bevorzugt.
Beispiele für erfindungsgemäß als Fluoreszenzmarker einsetzbare Nukleinsäuresonden -sind beispielsweise „die in der WO 01/85340 A2, WO 01/07649 A2 und WO 97/14816 A1 genannten Sonden, deren gesamter jeweiliger Offenbarungsgehalt hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
So können beispielsweise als Nukleinsäuresonden die in der Fluoreszenz-jn-situ- jiybridisierung (FISH) üblicherweise zur Markierung (DNA- oder RNA-Markierung) verwendeten Nukleinsäuresonden eingesetzt werden. Für weitere diesbezügliche Einzelheiten kann auf RÖMPP Lexikon Biotechnologie und Gentechnik, 2. Auflage, Georg Thieme Verlag Stuttgart, Seiten 285/286, Stichwort: "FISH" und die dort angegebene Literatur sowie auf die WO 01/07649 A2 verwiesen werden, deren gesamter jeweiliger Offenbarungsgehalt hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Gleichermaßen kann als Fluoreszenzmarker auch ein insbesondere keimspezifischer Antikörper eingesetzt werden, der seinerseits fluoreszenzmarkiert ist, insbesondere mit einer fluoreszierenden Gruppe oder einem fluoreszierenden Molekül, wobei die fluoreszierende Gruppe oder das fluoreszierende Molekül kovalent oder anderweitig an den Antikörper gebunden sein kann.
Die Menge bzw. Konzentration an eingesetzten Fluoreszenzmarkern wird der Fachmann den jeweiligen Gegebenheiten des Einzelfalls anpassen. Dies ist ihm ohne weiteres geläufig. Beispielsweise sollte bei einer lebend/tot-Differenzierung der in der Probe vorhandenen Keime für eine gute Keimanfärbund bei gleichzeitig schwacher "Hintergrundfärbung" ein geeignetes Mischungsverhältnis von "LebendfarbstoffTTotfarbstoff" gewählt werden; dies im Einzelfall auszuwählen, liegt im Rahmen des fachmännischen Könnens.
Im allgemeinen liegt die Nachweisegrenze bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in bezug auf die zu bestimmenden Keime bei <100 Koloniebildende Einheiten (KBE) pro Milliliter Probevolumen, vorzugsweise bei <10 Koloniebildende Einheiten (KBE) pro Milliliter Probevolumen. Daher kommt das erfindungsgemäße Verfahren ohne jegliche Voranreicherung aus. Die niedrige Nachweisgrenze ist beispielsweise zur Erfüllung bestimmter Richtlinien oder Vorschriften von entscheidender -Bedeutung. So muß beispielsweise laut CTFA-Richtlinie für kosmetische Rohstoffe bei deutlich höher liegender Keimzahlgrenze (z. B. 102 bis 103 KBE/ml) eine zeitaufwendige und kostenintensive Abwesenheitsprüfung von bestimmten Problemkeimen, d. h. pathogenen Keimen, durchgeführt werden. Im allgemeinen lassen sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Keimzahlen im Bereich von etwa 10 KBE pro Milliliter Probevolumen oder sogar weniger bis etwa 108 KBE pro Milliliter Probevolumen bestimmen. Dabei sollte zu Zwecken quantitativer Auswertungen ab einer bestimmten Keimzahl (im allgemeinen ab ca. 102 KBE pro Milliliter Probevolumen) die Probe vorab entsprechend, d. h. in geeigneter Weise, verdünnt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich prinzipiell für die Bestimmung beliebiger Keime, insbesondere pathogener Keime aller Art (z. B. Mikroorganismen aller Art, insbesondere einzellige Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilze, z. B. Hefen oder Schimmelpilze).
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich prinzipiell zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen in beliebigen Produkten (d. h. Medien, Matrices, Lösungen etc.), vorzugsweise filtrierbaren, insbesondere flüssigen und/oder fließfähigen Produkten. Bei festen oder als solchen nicht filtrierbaren Produkten müssen diese bei der Probenaufbereitung in eine dem erfindungsgemäßen Verfahren zugängliche Form überführt werden; dies geschieht mit an sich bekannten Methoden, beispielsweise durch Überführen in eine Lösung oder Dispersion, Zerkleinerung, Extraktion etc.
Beispielsweise eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen in Lebensmitteln, tensidhaltigen Produkten wie Wasch- und Reinigungsmitteln, Mitteln zur Oberflächenbehandlung, Dispersionsprodukten, Kosmetika, Hygieneprodukten und Produkten der Körperpflege, Pharmazeutika, Klebstoffen, Kühlschmierstoffen, Lacken und (Lack-)Koagulationen sowie Rohstoffen und Ausgangsstoffen für die vorgenannten Produkte.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich damit für alle Arten möglicher Rohstoffe, Zwischen- und Endprodukte aus den unterschiedlichen Bereichen, wie z.B. Lebensmittel, Markenartikel, Kosmetika, Klebstoffe, Kühlschmierstoffe (z. B. ölige Kühlschmierstoffemulsionen); Prozeßflüssigkeiten von Anlagen etc., mit der Einschränkung, daß die nachzuweisenden Keime sich über ein Trennverfahren, wie Filtration oder Sedimentation, abtrennen lassen sollten. Dabei ist es auch nicht von Bedeutung, ob die Produkte in fester oder flüssiger Form vorliegen.
Aufgrund der relativ einfachen Durchführbarkeit und der besonderen Kombination von Verfahrensschritten eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere für die automatisierte Durchführung (z. B. im Rahmen von Produktions- und/oder Qualitätskontrolle). Neben der Produktions- und/oder Qualitätskontrolle (z. B. bei der Abfüllung von Tensid-Flüssigprodukten, Dispersionen, konservierten Produkten etc.) eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise auch zur Untersuchung von Störfällen bzw. Kontaminationen zur Bestimmung des Keimstatus oder auch zur Bewertung von Maßnahmen zur Produktsanierung oder aber auch zur Optimierung bzw. Überprüfung von Anlagenreinigungen (z. B. in Anlagen zur Herstellung konservierter Produkte), beispielsweise im Rahmen von ClP-Verfahren (CIP = Cleaning in Place) und SIP-Verfahren (SIP = Sterilisation in Place).
Das erfindungsgemäße Verfahren wird üblicherweise wie folgt durchgeführt: Die Probe mit den quantitativ und/oder qualitativ zu bestimmenden Keimen wird in ein geeignetes Probengefäß eingebracht, dessen Boden mit einem im allgemeinen runden Membranfilter versehen ist und das keimfrei verschließbar sein sollte. Der Membranfilter liegt mit seinem äußeren Rand auf dem Probengefäß auf, so daß der äußere, konzentrische Rand nicht mit Keimen belegt wird. Falls eine Probe untersucht werden soll, die keimhemmende bzw. keimtötende Substanzen oder Bestandteile (z. B. Konservierungsstoffe oder Tenside) aufweist, wird zunächst eine Inaktivierung und/oder Entfernung dieser Substanzen bzw. Bestandteile durchgeführt, indem die Probe mit einer geeigneten Inaktivierungs- und/oder Konditionierlösung in Kontakt gebracht wird, und zwar für eine Zeitdauer die ausreicht, um die Inaktivierung und/oder Entfernung dieser Substanzen bzw. Bestandteile zu -ermöglichen. Mittels Über- oder Unterdruck wird die Inaktivierungs- und/oder Konditionierlösung über den Membranfilter entfernt. Anschließend wird gegebenenfalls durch einfaches oder mehrfaches Waschen mit Wasser überschüssige bzw. verbleibende Inaktivierungs- und/oder Konditionierlösung über den Membranfilter entfernt, und zwar üblicherweise durch Anlegen eines Über- oder Unterdrucks, so daß auch das Waschwasser auf einfache Art entfernt wird. Hieran schließt sich eine Markierung zumindest eines Teils der in der Probe vorhandenen Keime mittels mindestens eines Fluoreszenzmarkers an. Zu diesem Zweck können die Keime beispielsweise mit einer Lösung oder Dispersion des Fluoreszenzmarkers in Kontakt gebracht werden für eine Zeit, die ausreicht, um die Keime zu markieren. Anschließend wird die überschüssige Lösung oder Dispersion des Fluoreszenzmarkers durch erneutes Anlegen eines Über- oder Unterdrucks über den Membranfilter entfernt. Schließlich kann gegebenenfalls zur Entfernung überschüssigen Fluoreszenzmarkers die Probe einer einfachen oder mehrfachen Wäsche mit Wasser, Pufferlösungen oder anderen Flüssigkeiten unterzogen werden. Nach Abziehen des Wassers über den Membranfilter durch Anlegen von Über- oder Unterdruck kann der Membranfilter dann schließlich vom Probengefäß abgetrennt werden, so daß ein mit fluoreszenzmarkierten Keimen belegter Membranfilter, dessen äußerer Rand frei von Keimen ist, resultiert. Dieser kann unmittelbar, d. h. im allgemeinen ohne weitere Aufbereitung der Probe oder Behandlung der Probe bzw. des Filters, der Fluoreszenzreflexionsphotometrie zugeführt werden. Im Rahmen der fluoreszenzreflexionsphotometrischen Messung wird der mit fluoreszenzmarkierten Keimen belegte Membranfilter dann mit Licht geeigneter Wellenlänge bestrahlt und hierbei sozusagen abgerastert bzw. abgescannt. Der ermittelte Meßwert korreliert mit der Keimzahl auf dem Membranfilter bzw. in der Probe. Die folgenden Waschmittelprodukte unterschiedlicher Viskosität wurden unter Einsatz der erfindungsgemäßen Vorrichtung untersucht:
Ein typischer Verfahrensablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens bei automatisierter Durchführung beinhaltet beispielsweise, daß der Nutzer einer Probe in definierter Menge (z. B. 1 ml) in ein vorgegebenes Probengefäß, das keimfrei verschlossen ist und ein Konditionier- bzw. Inaktivierungsmedium und einen Membranfilter am Auslaß enthält, einfüllt. Durch das Starten des Meßprogramms wird die Probe geschüttelt und bei einer in Abhängigkeit von der Art der Keime abhängigen geeigneten Temperatur (z. B. 37 °C) thermostatisiert. Nach einer definierten Zeit wird das Medium über den Membranfilter abfiltriert. Es folgen automatisch ein oder mehrere Waschschritte mit keimfreiem Wasser, Pufferlösungen oder anderen Flüssigkeiten, um in der Probe enthaltene Substanzen auszuwaschen und daran anschließend die Markierung mit einem Fluoreszenzmarker. Abhängig von der Aufgabenstellung kann die Markierung dabei mit einem unspezifischen Fluoreszenzmarker, der sich an alle in der Probe vorhandenen Keime (z. B. an Nukleotid-Bruchstücke) anlagert, oder mit einem Marker, der nach der DEFT-Methode eine Unterscheidung aller lebenden und "toten" Mikroorganismen ermöglicht, oder aber im dritten Fall mit einem Fluoreszenzmarker nach der FISH-Technologie, der die selektive Anfärbung einzelner Mikroorganismen durch genmarkierte Fluoreszenzsonden ermöglicht, erfolgen. An den Markierungsschritt anschließend wird wiederum automatisch überschüssige Markierungslösung mit Wasser abgewaschen, so daß nach dem Abschluß des automatischen Protokolls fluoreszenzmarkierte Mikroorganismen auf einem Membranfilter vorliegen. Mit einem Fluoreszenzrefiexionsphotometer bzw. -spektrometer wird anschließend automatisch die Intensität der jeweiligen Fluoreszenz und damit die Anzahl der Mikroorganismen bestimmt. Dabei wird die Filtermembran mit Licht geeigneter Wellenlänge bestrahlt und das durch die markierten Mikroorganismen abgestrahlte Fluoreszenzlicht entsprechend wellenlängenaufgelöst detektiert. Die nachfolgende Auswertung vergleicht die Intensität im Randbereich des Membranfilters, der nicht mit Keimen belegt sein sollte, mit der Intensität im Bereich mit markierten Mikroorganismen und berechnet auf der Basis einer hinterlegten Kalibrierung die Anzahl der in der Probe vorhandenen Keime.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sind eine Vielzahl von Vorteile verbunden, von denen die wesentlichen, jedoch nicht beschränkend, im folgenden aufgeführt sind. Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist darin zu sehen, daß es automatisiert durchgeführt werden kann. Durch die vollständige Automatisierung des gesamten Ablaufs läßt sich das Verfahren einfacher, schneller und reproduzierbarer durchführen. Dies bringt Vorteile hinsichtlich Kosten, Personalaufwand und Empfindlichkeit mit sich. Die hohe Reproduzierbarkeit bei der Durchführung des Untersuchungen ist ebenfalls von großem Vorteil.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß es ohne Epifluoreszenzmikroskop auskommt. Durch den Ersatz des gemäß dem Stand der Technik eingesetzten Epifluoreszenzmikroskops durch das vereinfachte, nämlich fluoreszenzreflexionsphotometrische Auswertungs- bzw. Detektionsverfahren bzw. -System wird der für den Anwender erforderliche Arbeits- und Investitionsaufwand reduziert, und die Auswertung der Proben kann vollautomatisch erfolgen (z. B. mit einem entsprechenden Algorithmus). Des weiteren wird die Strahlenbelastung vermindert.
Noch ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Verwendung standardisierter bzw. herkömmlicher Komponenten: Das für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderliche Gesamtsystem ist in der Weise integriert, daß eine Vielzahl standardisierter bzw. herkömmlicher Komponenten (Gefäße, Medien, Filter etc.) verwendet werden kann und damit der Bedieneraufwand reduziert und die Sicherheit des Verfahrens erhöht wird.
Ein anderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der einfachen Detektion und Auswertung: Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise in einem geeigneten Probengefäß durchgeführt werden, so daß die markierten Keime auf einer geeigneten Filtermembran präpariert werden. Die Wahl der geeigneten Größe der Membran (z. B. 8 mm Durchmesser) und ein konzentrischer, nicht, mit Keimen belegter Rand ermöglicht die Referenzierung und interne Standardisierung für jede Probe.
Wiederum ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Geschwindigkeit der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens: Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt eine Bestimmung der Keimzahl bereits nach einer Zeit zwischen wenigen (ca. 3-5) Minuten, abhängig von der Art der Keime und ihrer Anzahl. Konventionelle Kulturmethoden benötigen dagegen bis zu mehreren Tage.
Auch die hohe Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens ist von besonderem Vorteil: Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Bestimmung von Keimen auch in großer Verdünnung. Beschleunigte Kulturverfahren sind nicht ausreichend empfindlich für eine Nachweisgrenze von 10 KBE pro Milliliter Probevolumen.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Tatsache, daß die fluoreszenzmarkierten Keime nur relativ kurze Zeit einer Bestrahlung ausgesetzt sind, da die Meßwerte fluoreszenzreflexionsphotometrisch relativ schnell erfaßt werden. Hierdurch wird ein Ausbleichen ("bleaching effect") des Fluoreszenzmarkers und somit eine Verfälschung des Meßergebnisses weitestgehend vermieden. Auch wird hierdurch die Abtötung von lebenden Keimen vermieden, was insbesondere bei eine lebend/tot-Differenzierung von entscheidender Bedeutung ist.
Das "(Ab-)Scannen" bzw. "Abrastem" der Probe (genauer gesagt des mit fluoreszenzmarkierten Keimen belegten Membranfilters) im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. im Rahmen der fluoreszenzre- flexionsphotometrischen Auswertung bringt weitere Vorteile mit sich: Zum einen können durch das Scannen große Flächen angeregt werden. Zum anderen wird - insbesondere im Vergleich zu einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop mit limitierter erfaßter Fläche - punktuell eine hohe Anregungsintensität erreicht bei gleichzeitig kurzem Vergleich erreicht. Die homogene Ausleuchtung der Proben durch das Scannen ist insbesondere bei Intensitätsmessungen von entscheidender Bedeutung.
Schließlich muß ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Bedienerfreundlichkeit gesehen werden: Der gesamte Prozeß der Bestimmung der Keimbelastung einer Probe besteht bei automatisierter Durchführung lediglich aus dem Einfüllen der Probe und dem Starten des Ablaufs. Im Anschluß erhält der Benutzer den numerischen Wert für die Keimbelastung. Der Aufwand für Probenaufbereitung und Messung ist minimal. Das System läßt sich damit auch in idealer Weise in Prozeßsysteme zur Qualitätsüberwachung, -Sicherung und -dokumentation einbinden.
Gemäß einem weiteren, zweiten Aspekt der vorliegenden Anmeldung betrifft die vorliegende Erfindung auch eine wie in Anspruch 28 beschriebene Vorrichtung zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen in einer Probe nach einem Verfahren mit Probenaufbereitung und anschließender Detektion und/oder Auswertung, wobei mittels der Vorrichtung im Zuge der Probenaufbereitung eine Markierung zumindest eines Teils der in der Probe vorhandenen Keime mittels mindestens eines Fluoreszenzmarkers durchführbar ist und die Detektion und/oder Auswertung unter Nutzung des Fluoreszenzmarkers durchführbar ist, insbesondere zur Durchführung eines wie zuvor beschriebenen Verfahrens.
Weitere, vorteilhafte Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind Gegenstand der Vorrichtungsunteransprüche (Ansprüche 29 bis 36). Die in bezug auf das erfindungsgemäße Verfahren gemachten Ausführungen gelten für die erfindungsgemäße Vorrichtung entsprechend.
In der Zeichnung zeigt Fig. 1 die schematische Darstellung einer Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen in einer Probe. Kernstück dieser Vorrichtung ist ein Probenaufnahmebehälter 1. Dieser Probenaufnahmebehälter 1 ist, wie schematisch angedeutet ist, in der Vorrichtung über verschiedene Leitungen 2 an Steuerventile 3 für Entlüftung 4 und Druckluft 5 sowie über Pumpen 6 an Anschlüsse für Farbstoff 7 ("Fluoreszenzmarker") und für Spüllösung 8 eingeschlossen. In die Leitungen 2 sind jeweils. Sterilfilter_2a integriert.
Fig. 1 zeigt die Zusammenhänge, die zuvor erläutert worden sind, in schematischer Darstellung. Die Arbeitsweise einer solchen Vorrichtung folgt logisch der zu den Verfahrensansprüchen erläuterten Vorgehensweisen. An einem Auslaß des Probenaufnahmebehälters 1 , im dargestellten und bevorzugten Ausführungsbeispiel am Boden des Probenaufnahmebehälters 1 , ist ein Membranfilter 9 angeordnet, der im dargestellten Ausführungsbeispiel als einfache Kreisscheibe angedeutet ist. Dieser ist so ausgebildet, daß er die zu detektierenden Keime zurückhält und/oder in bezug auf die zu detektierenden Keime undurchlässig ist. Weiter vorgesehen ist ein Detektionssystem 10, das zur Ausführung einer fluoreszenzreflexionsphotometrischen Messung ausgestaltet ist und an dem der Probenaufnahmebehälter 1 mit dem Membranfilter 9 oder vorzugsweise der aus dem Probenaufnahmebehälter 1 entnommene Membranfilter 9 zu Zwecken der Detektion und/oder Auswertung positionierbar ist. Die Analyse des mit Keimen besetzten Membranfilters 9 im fluoreszenzreflexionsphotometrischen Detektionssystem 10, dessen prinzipieller Aufbau in Fig. 2 dargestellt ist, erfolgt im dargestellten Ausführungsbeispiel unter Einsatz einer computergesteuerten Steuer- und/oder Auswerteeinrichtung 11 , die auch in Fig. 1 bereits angedeutet ist.
Fig. 1 zeigt im übrigen angedeutet den Membranfilter 9 am Boden des Probenaufnahmebehälters 1. Das bedeutet, daß der Membranfilter 9 im in Fig. 1 dargestellten Ausführungsbeispiel nach unten vom Probenaufnahmebehälter 1 abgenommen werden kann, um dem Detektionssystem 10 zugeführt zu werden. Wie im einzelnen hier die Anordnung aussieht, bleibt den konstruktiven Überlegungen des Fachmannes überlassen.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn der Membranfilter 9 ein Poren aufweisender Membranfilter, insbesondere ein Polycarbonatmembranfilter, ist und wenn, insbesondere, die Größe der Poren des Membranfilters 9 kleiner ist als die Größe der in der Probe vorhandenen bzw. zu erwartenden, zu bestimmenden Keime.
Ganz besonders bevorzugt ist es, wenn anstelle des Membranfilters 9 ein Silizium-Mikrosieb eingesetzt wird. Auf die Vorteile, die aus dem Einsatz von Silizium-Mikrosieben erwachsen wurde bereits weiter oben ausführlich eingegangen. Jedoch soll auch an dieser Stelle darauf hingewiesen werden, daß generell anstelle eines Membranfilters ein Silizium-Mikrosieb in der erfindungsgemäßen Vorrichtung eingesetzt werden kann. Sowohl bei Anordnung innerhalb des Probenaufnahmebehälters 1 als auch bei Separierung des Membranfilters 9 vom Probenaufnahmebehälter 1 zum Zwecke der Detektion der markierten Keime empfiehlt es sich, mit einer Referenzfläche zu arbeiten, um die jeweilige Probe autark standardisieren zu können. Nach bevorzugter Ausführung kann man dazu vorsehen, daß der Membranfilter 9 angeordnet im Probenaufnahmebehälter 1 einen bei der Probenaufbereitung von Keimen nicht oder praktisch nicht besetzbaren Bereich 12, insbesondere Rand, aufweist, der bei der Durchführung der Detektion und/oder Auswertung als Referenzfläche dient. Der mit Markierungen nicht belegte Bereich bzw. Rand 12 ermöglicht die interne Standardisierung der Probe selbst auf dem Membranfilter 9.
Hinsichtlich der Bemessung des Membranfilters 9 bzw. des Probenaufnahmebehälters 1 empfiehlt sich für den angegebenen Anwendungsfall, daß der Membranfilter 9 einen für die Filtrierung wirksamen Durchmesser von etwa 5 bis etwa 25 mm, insbesondere von etwa 6 mm bis etwa 12 mm, vorzugsweise von etwa 8 mm bis etwa 10 mm, aufweist.
Weiter oben ist bereits darauf hingewiesen worden, daß der Membranfilter 9 die Keime zurückhält, also die mit dem Fluoreszenzmarker markierten Keime auf der Oberseite des Membranfilters 9 zurückbleiben. Es empfiehlt sich dazu, den Fluoreszenzmarker derart auszuwählen, daß dieser membrangängig bezüglich des Membranfilters 9 ist, so daß im Detektionssystem 10 ein günstiges Signal/Rausch-Verhältnis erreicht wird. Zur Handhabung der Probe im Probenaufnahmebehälter 1 muß man die Isolierung der fluoreszenzmarkierten ("gemarkerten") Keime auf dem Membranfilter 9 bewerkstelligen. Vorrichtungsmäßig empfiehlt sich dazu die Verwendung einer Abtropfeinrichtung, einer Absaugeinrichtung (Unterdruck) und/oder einer Abdrückeinrichtung zum Abtropfen und Auffangen eines oberhalb des Membranfilters 9 anstehenden Probenfluids und/oder Aufnahmefluids für den Fluoreszenzmarker und/oder Spülfluids. Das in Fig. 1 dargestellte Ausführungsbeispiel zeigt insoweit eine Variante, bei der mit Druckluft 5 ein Abdrücken erfolgt. Fig. 1 zeigt schließlich in vorrichtungsmäßiger Hinsicht noch, daß die Vorrichtung eine Thermostatisierungseinrichtung 13 zur Thermostatisierung des Probenaufnahmebehälters 1 aufweist. Man erkennt hier die Thermostatisierungseinrichtung 13 mit insgesamt vier Aufnahmeöffnungen, so daß insgesamt vier Probenaufnahmebehälter 1 gleichzeitig auf die normalerweise gewünschte Temperatur, die abhängig ist von den Zielkeimen (z. B. 37 °C), thermostatisiert werden können.
Fig. 2 läßt die Grundstruktur des erfindungsgemäß verwendeten fluoreszenzreflexionsphotometrischen Detektionssystems 10 erkennen. Die Auswerteeinrichtung 11 steuert einen zentralen Kontroller 14, der die Meßparameter an eine Steuerelektronik 15 für die Anregungsoptik 16 und einen Positioniertisch 17 weitergibt. Auf dem Positioniertisch 17 befindet sich das Meßobjekt, hier also der Membranfilter 9 mit gemarkerten Keimen besetzt. Von der Anregungsoptik 16 auf das Meßobjekt 18 ausgesandtes Anregungslicht wird als Fluoreszenzlicht zu einer Detektionsoptik 19 reflektiert. Das detektierte Signal wird einer Meßelektronik 20 zugeleitet, die wiederum den Kontroller 14 speist. Die Verwendung eines vereinfachten fluoreszenzreflexionsphotometrischen Detektionssystems 10 anstelle eines aufwendigen Epifluoreszenzmikroskops verringert den Investitionsaufwand des Anwenders.
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung - gemäß einem weiteren, dritten Aspekt der vorliegenden Anmeldung - die erfindungsgemäße Verwendung der erfindungsgemäßen, wie zuvor beschriebenen Vorrichtung, wie sie Gegenstand der Verwendungsansprüche (Ansprüche 37 bis 39) ist.
Weitere Ausgestaltungen, Abwandlungen und Variationen sowie Vorteile der vorliegenden Erfindung sind für den Fachmann beim Lesen der Beschreibung ohne weiteres erkennbar und realisierbar, ohne daß er dabei den Rahmen der vorliegenden Erfindung verläßt.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen in einer Probe, wobei das Verfahren einen Verfahrensschritt (a) der Probenaufbereitung und einen Verfahrensschritt (b) der Detektion und/oder Auswertung umfaßt, wobei im Verfahrensschritt (a) eine Markierung zumindest eines Teils der in der Probe vorhandenen Keime mittels mindestens eines Fluoreszenzmarkers erfolgt und im Verfahrensschritt (b) eine quantitative und/oder qualitative Detektion und/oder Auswertung erfolgt,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t ,
daß die in Verfahrensschritt (b) durchgeführte Detektion und/oder Auswertung fluoreszenzreflexionsphotometrisch erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß aufgrund des fluoreszenzreflexionsphotometrisch ermittelten Meßwertes die in der Probe vorhandene Zahl an Keimen bestimmt werden kann, insbesondere mittels geeigneter Kalibrierung.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die fluoreszenzmarkierten Keime bei der in Verfahrensschritt (a) durchgeführten Probenaufbereitung auf einem Silizium-Mikrosieb aufgebracht werden, das so ausgebildet ist, daß es die Keime zurückhält und/oder in bezug auf die Keime undurchlässig ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die fluoreszenzmarkierten Keime bei der in Verfahrensschritt (a) durchgeführten Pröbenaufbereitung auf einem insbesondere porösen Membranfilter, insbesondere einem Polycarbonatmembranfilter, aufgebracht werden, der so ausgebildet ist, daß er die Keime zurückhält und/oder in bezug auf die Keime undurchlässig ist.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Größe der Poren des Membranfilters oder des Silizium-Mikrosiebs so gewählt ist, daß die Porengröße kleiner als die in der Probe vorhandenen Keime ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die fluoreszenzreflexionsphotometrische Detektion und/oder Auswertung, insbesondere ohne weitere Probenbehandlung oder -aufbereitung oder -Übertragung, unmittelbar auf dem Membranfilter oder Mikrosieb erfolgt.
7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluoreszenzmarker derart ausgewählt wird, daß er membrangängig in bezug auf den bei der in Verfahrensschritt (a) durchgeführten Probenaufbereitung verwendeten Membranfilter ist oder filterdurchgängig in Bezug auf ein verwendetes Silizium-Mikrosieb ist.
8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Verfahrensschritt (a) der Probenaufbereitung auch eine Inaktivierung und/oder Entfernung von gegebenenfalls in der Probe vorhandenen keimhemmenden und/oder keimtötenden Substanzen oder Bestandteilen, insbesondere Konservierungsstoffen oder Tensiden, umfaßt, insbesondere wobei die Inaktivierung und/oder Entfernung der gegebenenfalls in der Probe vorhandenen keimhemmenden und/oder keimtötenden Substanzen oder Bestandteile dadurch erfolgen kann, daß die Probe mit einer geeigneten Inaktivierungs- und/oder Konditionierlösung in Kontakt gebracht wird.
9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluoreszenzmarker derart ausgewählt wird, daß er mit den Keimen in Wechselwirkung tritt, insbesondere an die Keime, insbesondere an deren Zellwand (Hülle) und/oder Nukleinsäure, anbindet und/oder von den Keimen aufgenommen, insbesondere metabolisiert und/oder enzymatisch umgesetzt wird.
10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Fluoreszenzmarker ein keimunspezifischer Fluoreszenzmarker oder ein Gemisch keimunspezifischer Fluoreszenzmarker eingesetzt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Fluoreszenzmarker ein keimspezifischer Fluoreszenzmarker oder ein Gemisch verschieden keimspezifischer Fluoreszenzmarker eingesetzt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Fluoreszenzmarker ein Gemisch keimunspezifischer und
13. gekennzeichnet, daß als Fluoreszenzmarker ein mit lebenden Keimen in Wechselwirkung tretender Fluoreszenzmarker eingesetzt wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß als Fluoreszenzmarker ein mit toten Keimen in Wechselwirkung tretender Fluoreszenzmarker eingesetzt wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß als Fluoreszenzmarker ein Gemisch von mit lebenden Keimen in Wechselwirkung tretenden Fluoreszenzmarkern und mit toten Keimen in Wechselwirkung tretenden Fluoreszenzmarkern eingesetzt wird, so daß eine lebend/tot-Differenzierung der in der Probe vorhandenen Keime erfolgt.
16. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Fluoreszenzmarker ein in der Epifluoreszenzmikroskopie oder in -der DEFT (Direkte Epifluoreszenz-Filter- Technik) oder in der MMCF (Membranfilter-Mikrokolonie-Fluoreszenz- Methode) üblicherweise zur Keimmarkierung verwendeter Fluoreszenzmarker eingesetzt wird.
17. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet daß als Fluoreszenzmarker ein Fluoreszenzfarbstoff oder aber eine Vorstufe eines solchen Fluoreszenzfarbstoffs, aus dem durch Wechselwirkung mit den Keimen, insbesondere durch Metabolisierung und/ oder enzymatische Umsetzung, der Fluoreszenzfarbstoff generiert wird, eingesetzt wird.
18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluoreszenzfarbstoff ausgewählt ist aus der Gruppe von 3,6-Bis[dimethylami- nojacridin (Acridinorange), 4',6-Diamido-2-phenylindol (DAPI), 3,8-Diamino- 5-ethyl-6-phenyl-phenanthridiniumbromid (Ethidiumbromid), 3,8-Diamino-5- [3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenyl-phenanthridiniumdiiodid (Propidiumiodid), Rhodaminen wie Rhodamin B und Sulforhodamin B sowie Fluoresceinisothiocyanat.
19. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet daß als Fluoreszenzmarker eine insbesondere keimspezifische Nukleinsäuresonde eingesetzt wird, die ihrerseits fluoreszenzmarkiert ist, insbesondere mit einer fluoreszierenden Gruppe oder einem fluoreszierenden Molekül, insbesondere wobei die fluoreszierende Gruppe oder das fluoreszierende Molekül kovalent oder anderweitig an die Nukleinsäuresonde gebunden sein kann und/oder insbesondere wobei die Nukleinsäuresonde ein fluoreszenzmarkiertes Oligo- oder Polynukleotid umfaßt und/oder insbesondere wobei die Nukleinsäuresonde eine fluoreszenzmarkierte DNA- oder RNA-Sonde ist.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß als Nukleinsäuresonde eine in der Fluoreszenz-in-situ-jjybridisierung (FISH) üblicherweise zur -Markierung verwendete Nukleinsäuresonde eingesetzt wird.
21. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Fluoreszenzmarker ein insbesondere keimspezifischer Antikörper eingesetzt wird, der seinerseits fluoreszenzmarkiert ist, insbesondere mit einer fluoreszierenden Gruppe oder einem fluoreszierenden Molekül, insbesondere wobei die fluoreszierende Gruppe oder das fluoreszierende Molekül kovalent oder anderweitig an den Antikörper gebunden sein kann.
22. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet daß die Nachweisegrenze in bezug auf die Keime <100 Koloniebildende Einheiten (KBE) pro Milliliter Probevolumen, vorzugsweise <10 Koloniebildende Einheiten (KBE) pro Milliliter Probevolumen, ist.
23. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den zu bestimmenden Keimen um pathogene Keime aller Art handelt, insbesondere Mikroorganismen aller Art, insbesondere einzellige Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilze (z. B. Hefen oder Schimmelpilze).
24. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen in Lebensmitteln, tensidhaltigen Produkten wie Wasch- und Reinigungsmitteln, Mitteln zur Oberflächenbehandlung, Dispersionsprodukten, Kosmetika, Hygieneprodukten und Produkten der Körperpflege, Pharmazeutika, Klebstoffen, Kühlschmierstoffen, Lacken und (Lack-)Koagulationen sowie Rohstoffen und Ausgangsstoffen für die vorgenannten Produkte.
25. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen in filtrierbaren, insbesondere flüssigen und/oder fließfähigen Produkten.
26. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren automatisiert durchgeführt wird.
27. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren im Rahmen der Produktions- und/oder Qualitätskontrolle durchgeführt wird.
28. Vorrichtung zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen in einer Probe nach einem Verfahren mit Probenaufbereitung und anschließender Detektion und/oder Auswertung, wobei mittels der Vorrichtung im Zuge der Probenaufbereitung eine Markierung zumindest eines Teils der in der Probe vorhandenen Keime mittels mindestens eines Fluoreszenzmarkers durchführbar ist und die Detektion und/oder Auswertung unter Nutzung des Fluoreszenzmarkers durchführbar ist, insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der vorangehenden Verfahrenansprüche,
g e k e n n z e i c h n e t d u r c h
- einen Probenaufnahmebehälter (1 ),
- einen an einem Auslaß des Probenaufnahmebehälters (1), insbesondere an dessen Boden, angeordneten Silizium-Mikrosieb oder Membranfilter (9), der so ausgebildet ist, daß er die zu detektierenden Keime zurückhält und/oder in bezug auf die zu detektierenden Keime undurchlässig ist,
- ein Detektionssystem (10), das zur Ausführung einer fluoreszenzreflexionsphotometrischen Messung ausgestaltet ist und an dem der Probenaufnahmebehälter (1 ) mit dem Silizium-Mikrosieb oder Membranfilter (9) oder vorzugsweise das aus dem Probenaufnahmebehälter (1) entnommene Silizium-Mikrosieb oder Membranfilter (9) zu Zwecken der Detektion und/oder Auswertung positionierbar ist.
29. Vorrichtung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß eine computergesteuerte Steuer- und/oder Auswerteeinrichtung (11) als Teil des Detektionssystems (10) vorhanden oder zur Steuerung des Detektionssystems (10) vorgesehen ist.
30. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Vorrichtungsansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung anstelle des Membranfilters (9) ein Silizium-Mikrosieb aufweist.
31. Vorrichtung nach einem der Vorrichtungsansprüche 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, daß der Membranfilter (9) ein Poren aufweisender Membranfilter, insbesondere ein Polycarbonatmembranfilter, ist.
32. Vorrichtung nach Anspruch 30 oder 31 , dadurch gekennzeichnet, daß die Größe der Poren des Membranfilters (9) oder Silizium-Mikrosiebs kleiner ist als die Größe der in der Probe vorhandenen und/oder zu erwartenden, zu bestimmenden Keime.
33. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Vorrichtungsansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Membranfilter (9) oder das Silizium- Mikrosieb angeordnet im Probenaufnahmebehälter (1) einen bei der Probenaufbereitung von Keimen nicht oder praktisch nicht besetzbaren Bereich (12), insbesondere Rand, aufweist, der bei der Durchführung der Detektion und/oder Auswertung als Referenzfläche dient.
34. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Vorrichtungsansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Membranfilter (9) oder das Silizium- Mikrosieb einen für die Filtrierung wirksamen Durchmesser von etwa 5 mm bis etwa 25 mm, insbesondere von etwa 6 mm bis etwa 12 mm, vorzugsweise von etwa 8 mm bis etwa 10 mm, aufweist.
35. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Vorrichtungsansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß dem Probenaufnahmebehälter (1) eine Abtropfeinrichtung, eine Absaugeinrichtung und/oder eine Abdrückeinrichtung zum Abtropfen, Absaugen und/oder Abdrücken eines oberhalb des Membranfilters (9) oder des Silizium-Mikrosiebs anstehenden Probenfluids und/oder Aufnahmefluids für den Fluoreszenzmarker und/oder Spülfluids aufweist.
36. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Vorrichtungsansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung eine Thermostatisierungseinrichtung (13) zur Thermostatisierung des Probenaufnahmebehälters (1) aufweist.
37. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 28 bis 36 zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen in Lebensmitteln, tensidhaltigen Produkten wie Wasch- und Reinigungsmitteln, Mitteln zur Oberflächenbehandlung, Dispersionsprodukten, Kosmetika, Hygieneprodukten und Produkten der Körperpflege, Pharmazeutika, Klebstoffen, Kühlschmierstoffen, Lacken und Lackkoagulationen sowie Rohstoffen und Ausgangsstoffen für die vorgenannten Produkte.
38. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 28 bis 36 zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Keimen in filtrierbaren, insbesondere flüssigen und/oder fließfähigen Produkten, insbesondere Medien, Lösungen, Flüssigkeiten, Matrices und dergleichen.
39. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 28 bis 36 zur vorzugsweise automatisierten Produktions- und/oder Qualitätskontrolle.
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