EP1819363A2 - Verfahren zur herstellung von albumin-konjugaten mit nichtsteroidalen antirheumatika (nsar) - Google Patents

Verfahren zur herstellung von albumin-konjugaten mit nichtsteroidalen antirheumatika (nsar)

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Publication number
EP1819363A2
EP1819363A2 EP05813969A EP05813969A EP1819363A2 EP 1819363 A2 EP1819363 A2 EP 1819363A2 EP 05813969 A EP05813969 A EP 05813969A EP 05813969 A EP05813969 A EP 05813969A EP 1819363 A2 EP1819363 A2 EP 1819363A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
albumin
nsaid
conjugate
protein
conjugates
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP05813969A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hannsjörg SINN
Marcel MÜLBAIER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SCHMIEDEBERG-SINN, CHRISTA
Original Assignee
AlbuPharm Heidelberg GmbH and Co KG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by AlbuPharm Heidelberg GmbH and Co KG filed Critical AlbuPharm Heidelberg GmbH and Co KG
Publication of EP1819363A2 publication Critical patent/EP1819363A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]

Definitions

  • the present invention relates to NSAIDs (non-steroidal anti-inflammatory drugs) - protein conjugates, and more particularly to NSAID-albumin conjugates, to processes for their preparation and to their use as medicaments, in particular for the treatment of inflammation.
  • NSAIDs non-steroidal anti-inflammatory drugs
  • NSAID-albumin conjugates to processes for their preparation and to their use as medicaments, in particular for the treatment of inflammation.
  • Non-steroidal anti-inflammatory drugs also called NSAIDs (non-steroidal anti-inflammatory drugs) have been used in their low-molecular forms for the treatment of inflammatory processes.
  • a disadvantage of the previously used therapies using NSAIDs is, in particular, the short residence time of the substances used in the circulation, so that they have only a very narrow time window for the development of their effectiveness and, moreover, only a small proportion of the administered medicament reaches the destination. This results in unwanted side effects, which lead to problems especially with longer applications.
  • side effects are, for example, complaints in the gastrointestinal tract and an inhibition of blood clotting.
  • concentration disorders or headaches were also observed.
  • acute allergic reactions favoring of asthma attacks (especially in acetylsalicylic acid) as well as the reduction of white and / or red blood cells on.
  • EP 0 630 263 describes conjugates consisting of a carboxyl group-containing active substance, a spacer and a carrier.
  • the active substance which may be a non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID), such as naproxen, is via an ester bond to the Spacer coupled, which in turn is linked via a covalent bond to the carrier.
  • NSAID non-steroidal anti-inflammatory drug
  • Suitable spacers for the controlled release of the active substance to the target tissue are (poly) - ⁇ -hydroxy acids and, as carriers, proteins such as isozyme, cytochrome C and aprotein.
  • a disadvantage of these conjugates is that while the active substance at the site of action is cleaved enzymatically from the spacer in the body, the carrier protein initially remains in the body, without as an energy supplier for associated with inflammatory processes cells that have a high turnover of plasma proteins to serve.
  • the additional use of a spacer to the drug and carrier is associated with a significant amount of work and thus increased costs without being of additional pharmacological benefit.
  • WO 98/00172 discloses pharmaceutical compositions intended to effect specific delivery of drugs to the target site in the body. They include microbubbles that are encased in a protein shell and that are the actual transporters for the drugs.
  • the protein shell preferably consists of human serum albumin and, as an active ingredient, naproxen may be present as an example.
  • the microbubbles are formed by means of an ultrasound.
  • WO 98/00172 does not disclose that there is a direct covalent bond between the albumin and the drug. Although it is the high specificity of the composition, but a higher residence time of the substance in the body, which is based on a direct covalent bond, not disclosed.
  • Kostiainen et al. Journal of Chromatography (1993), 647 (2), 361-365) disclose the study of naproxen-lysozyme conjugates by capillary electrophoresis and mass spectroscopy wherein the naproxen is covalently coupled via an amide bond to the lysine group in the lysozyme.
  • the document Kostiainen et al. only physical examinations of the disclosed conjugate.
  • Antirheumatics such as diclofenac, naproxen or ibuprofen and their action in the treatment of osteoarthritis or rheumatoid
  • An object of the present invention was therefore to provide NSAIDs in a form with which the difficulties arising in the prior art can be overcome and with which, in particular, targeted uptake into inflamed tissue can be achieved with simultaneously long half-life in the organism.
  • an NSAID-protein conjugate comprising an NSAID and a protein. More preferably, the NSAID-protein conjugate is an NSAID-albumin conjugate comprising a NSAID and albumin characterized in that the NSAID is directly covalently linked to the albumin and that the molar ratio of NSAID: protein is 2: 1 to 0 , 1: 1.
  • NSAIDs By directly coupling NSAIDs to proteins, particularly to carrier proteins, the low molecular weight drugs that are rapidly removed from the body are hidden from the body's excretion or trapping mechanisms, and a long half-life is achieved in the body. This makes it possible to administer small amounts of active ingredient and thus practically eliminate any possible side effects virtually completely.
  • Direct covalent coupling of the NSAID to the carrier means that the NSAID is linked to the transport protein through a linker or spacer-free linkage.
  • the NSAID is covalently linked to the protein via an acid amide linkage formed from a carboxyl group of the NSAID and an amino group, preferably a lysine group of the protein.
  • Albumin in particular serum albumin, and most preferably human albumin or human serum albumin (HSA) are preferably used as protein in the conjugates according to the invention.
  • a protein is preferably used which is native to the patient for whom the conjugate is intended.
  • native protein is meant a protein derived from the same species as the species to which the protein is administered. This means, for example, that when administered to humans, human proteins, when administered to mice according to mouse proteins, etc. are used.
  • Human albumin is an endogenous, ubiquitously distributed and non-immunogenic protein. It has a molecular weight of about 68 kDa and is therefore not excreted via the kidney. Albumin accounts for approximately 60% of the total plasma protein level. In the healthy organism it fulfills transport functions for many substances and serves as a reserve energy source in acute emergencies, which is available everywhere in the body and at any time. Under normal conditions, it is not absorbed by healthy tissue. In contrast, cells associated with inflammatory processes have a high turnover of proteins, especially plasma proteins, predominantly albumin. As a result, the albumin in the inflamed target cells, for which the protein serves as an energy source, degraded and released the drug.
  • the biokinetic behavior of the conjugates according to the invention is determined solely by the macromolecule albumin, but not by the low-molecular weight NSAID.
  • the coupling of the NSAID to the carrier protein, for example albumin is preferably carried out without limiting its biologically active character.
  • Particularly preferred is a covalent coupling of the active ingredient to the carrier protein.
  • the covalent coupling is preferably selected so that it can be cleaved again in pathologically altered tissues, so that the biological effectiveness of the original pharmaceutical is retained and can be utilized.
  • NSAID-protein conjugates in particular NSAID-albumin conjugates, occurs without altering the biological activity of the active substance and without loss of the biologically active character of the protein used as a carrier, in particular of albumin.
  • a biologically active protein is understood to mean, in particular, an undenatured protein whose biological function is retained.
  • the protein has a biological activity of> 50%, more preferably of> 70%, more preferably of> 80%, and most preferably of> 90%, based on the activity of natural albumin.
  • the molar ratio of active ingredient to carrier protein is 2: 1 to 0.1: 1, preferably 1.5: 1 to 0.2: 1, and in particular 1, 1: 1 to 0.5: 1.
  • Albumin is still biologically active at 1: 1 loading with an NSAID.
  • conjugates can be obtained which have no or only a very small proportion of cross-linking during the loading. This further avoids rapid elimination from the circulation and unwanted side effects.
  • the proportion of dimeric albumin in the conjugates according to the invention is advantageously ⁇ 5 wt .-%, more preferably ⁇ 3 wt .-%.
  • NSAIDs which are selected in particular from acetylsalicylic acid, diclofenac, indomethacin, naproxen, flufenamic acid, mefenamic acid, tolmetin, ibuprofen, fenoprofen, ketoprofen, acemetacin or niflumic acid are used according to the invention.
  • the active substances are released only in the area of the inflammatory process, in particular by enzymatic cleavage of the protein.
  • the usual side effects that occur when using low-molecular weight NSAIDs no longer appear because in vivo healthy cells do not absorb albumin or its conjugates.
  • the biological half-life of the conjugates is determined solely by the macromolecule protein, in particular albumin. Thus, the initially available drug concentration falls after about 20 days to about 50% of the initial value.
  • the protein used according to the invention for the formation of the conjugates preferably has a molecular weight of ⁇ 18,000 Da, more preferably ⁇ 30,000 Da and even more preferably ⁇ 50,000 Da.
  • the conjugate according to the invention is active ingredient in a drug.
  • a drug has in particular low side effects and can be administered, for example, on an outpatient basis.
  • the administration is preferably intravenous.
  • a dosage unit preferably contains 0.1 to 10 mg of active ingredient NSAID per kilogram of body weight per day and in particular 0.5 to 5 mg of active ingredient per kilogram of body weight per day.
  • the dose can be chosen lower than in the conventional therapy with NSAIDs.
  • the conjugates according to the invention are particularly suitable for the treatment of inflammatory processes. All the inflammatory processes that are also treated with the NSAIDs alone can be treated with the conjugates according to the invention. Inflammatory processes which can be treated according to the invention are, for example, rheumatoid arthritis.
  • conjugates according to the invention in the combination therapy, for example together with other anti-inflammatory agents.
  • the doses of the respective components continue to reduce.
  • Another object of the present invention is a method for producing an NSAID-protein conjugate.
  • Particularly preferred within the scope of the present invention is a method of producing an NSAID-albumin conjugate comprising reacting an NSAID with albumin by direct covalent coupling, wherein the molar ratio of NSAID: albumin is 2: 1 to 0.1: 1.
  • the low molecular weight drug NSAR and the high molecular weight carrier protein are reacted with each other.
  • succinimidyl ester is first formed from the low molecular weight NSAID and this is subsequently reacted with the protein.
  • a succinimidyl ester of NSAIDs can be made by reacting low molecular weight NSAIDs with a carbodiimide.
  • Efficient covalent coupling of the active ingredient to the carrier molecule is important for the preparation of the conjugates used according to the invention.
  • the coupling must not lead to an undesired change in the carrier protein and / or the active ingredient.
  • Conventional activation of carboxyl-containing organic compounds with dicyclohexylcarbodiimide (DCC) requires at room temperature or at +4 0 C more than 12 hours (DP 41 22 210 A1; EP 0879604 A1; EP 0820308).
  • This object is achieved according to the invention by a process for the preparation of a conjugate in which NSAIDs and albumin in the presence of N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide (EDC) as carbodiimide and N-hydroxysuccinimide.
  • EDC N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide
  • the activation is preferably carried out at a temperature of 10 to 100 0 C, more preferably from 20 to 90 0 C and even more preferably from 50 to 75 0 C for a reaction time of 1 minute to 10 hours, more preferably from 20 to 50 minutes.
  • the reaction of the activated active substance with the carrier protein is preferably carried out at a temperature between 10 and 50 ° C., in particular between 20 and 40 ° C.
  • the activation of the carboxyl-containing compound, in particular of methotrexate with EDC and N-hydroxysuccinimide in a 5 organic solvent, preferably in dimethyl sulfoxide (DMSO) is performed.
  • a 5 organic solvent preferably in dimethyl sulfoxide (DMSO)
  • suitable organic solvents include dimethylacetamide or dioxane.
  • the activation is preferably carried out in the absence of water, in particular in the presence of ⁇ 5% by weight of water, more preferably ⁇ 1% by weight of water and most preferably completely anhydrous.
  • An essential advantage of the preparation process according to the invention is that the activating reagents used, ie EDC and N-hydroxysuccinimide, have a high water solubility.
  • the unused coupling reagents can be removed in a simple manner from the product obtained, for example by washing with water during the reaction.
  • the coupling reagents used in the prior art for example when using di-cyclohexyl-carbodiimide (DCC), a non-resolvable residue of coupling reagent remains in the conjugate.
  • DCC di-cyclohexyl-carbodiimide
  • Another preferred aspect of the invention relates to an optimized method of producing a conjugate according to the invention comprising reacting an NSAID with albumin by direct covalent coupling, characterized in that an NSAID and albumin in the presence of N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethyl -c.arbodiimid reacts as the sole activating reagent.
  • the NSAID is preferably a cytostatic or immunosuppressant, more preferably indomethacin, acetylsalicylic acid, diclofenac, ibuprofen and / or naproxen, most preferably indomethacin.
  • the protein is preferably albumin.
  • N-hydroxysuccinimide When N-hydroxysuccinimide is used, the latter also has a high UV absorption on HPLC when the UV measuring cell is set to 280 nm and disturbs or impedes by its retention time of about 11.5 minutes, during which other low molecular weight compounds appear direct determination of the coupling yield. This means that in many cases a yield determination is possible only at the end of the purification of the conjugate. Due to the optimized process without the use of N-hydroxysuccinimide this factor can now be excluded. This is also a great advantage for product safety. Another advantage of the optimized process is that the coupling yield is surprisingly on average 98-99%.
  • conjugates prepared by the processes according to the invention can be used for numerous uses and, in particular, for intravenous administration.
  • conjugates for example when using an anti-inflammatory NSAID, can be advantageously used for the preparation of medicaments for the treatment of inflammatory processes, in particular for the manufacture of a medicament for the treatment of rheumatoid arthritis.
  • the invention will be further elucidated by the following example and the attached figures.
  • FIG. 1 shows an HPLC chromatogram of indomethacin alone
  • FIG. 2 shows the chromatogram of the indomethacin-HSA conjugate prepared according to Example 1.
  • Indomethacin IMC 1 SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen
  • N- (3-dimethylaminopropyl) -N'ethylcarbodiimide hydrochloride EDC, SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen
  • N-hydroxysuccinimide Sigma-Aldrich, Taufmün
  • albumin Göricke, Dessau
  • the other NSAIDs acetylsalicylic acid.Diclofenac, ibuprofen, naproxen, etc. can be used for conjugation with albumin.
  • indomethacin IMC, MW 357.8
  • EDC N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide hydrochloride
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the proportion of dimeric albumin is ⁇ 3%.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft NSAR (nicht-steroidale Antirheumatika)-Protein-Konjugate und insbesondere NSAR-Albumin-Konjugate, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie deren Verwendung als Arzneimittel, insbesondere zur Behandlung von Entzündungen.

Description

Verfahren zur Herstellung von Albumin-Konjugaten mit Nicht¬ steroidalen Antirheumatika (NSAR)
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft NSAR (nicht-steroidale Antirheumatika)- Protein-Konjugate und insbesondere NSAR-Albumin-Konjugate, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie deren Verwendung als Arzneimittel, insbesondere zur Behandlung von Entzündungen.
Nicht-steroidale Antirheumatika (NSAR), auch NSAIDs (non-steroidal antiinflammatory drugs) genannt, wurden bisher in ihren niedermolekularen Formen zur Therapie entzündlicher Prozesse eingesetzt. Nachteilig bei den bisher angewandten Therapien unter Verwendung von NSAR ist insbesondere die kurze Verweilzeit der eingesetzten Substanzen in der Zirkulation, sodass sie nur ein sehr schmales Zeitfenster für die Entfaltung ihrer Wirksamkeit aufweisen und zudem nur ein geringer Anteil des verabreichten Medikaments an den Zielort gelangt. Daraus resultieren unerwünschte Nebenwirkungen, die vor allen Dingen bei längeren Anwendungen zu Problemen führen. So wird der weitaus größte Teil der Wirkstoffe von gesunden Organen aufgenommen und verursacht dort partielle oder schwere Schädigungen. Beobachtete Nebenwirkungen sind beispielsweise Beschwerden im Bereich des Magen-Darmtraktes sowie eine Hemmung der Blutgerinnung. Weiterhin wurden auch Konzentrationsstörungen oder Kopfschmerzen beobachtet. Schließlich traten in einigen Fällen sogar allergische Reaktionen, Begünstigung von Asthmaanfällen (insbesondere bei Acetylsalicylsäure) sowie die Verminderung weißer und/oder roter Blutkörperchen auf.
EP 0 630 263 beschreibt Konjugate bestehend aus einem Carboxylgruppen- haltigen Wirkstoff, einem Abstandshalter sowie einem Träger. Der Wirkstoff, welcher ein nicht-steroidales Antirheumatikum (NSAR), wie bespielsweise Naproxen, sein kann, ist dabei über eine Esterbindung an den Abstandshalter gekoppelt, welcher wiederum über eine kovalente Bindung an den Träger geknüpft ist. Als Abstandshalter, die zur kontrollierten Abgabe des Wirkstoffes an die Zielgewebe dienen, kommen (Poly)-α-hydroxysäuren und als Träger Proteine wie Isozym, Cytochrom C und Aprotein in Betracht. Nachteilig an diesen Konjugaten ist jedoch, dass im Körper zwar der Wirkstoff am Wirkort enzymatisch vom Abstandshalter abgespalten wird, das Trägerprotein jedoch zunächst weiterhin im Körper verbleibt, ohne als Energielieferant für die mit entzündlichen Prozessen assoziierten Zellen, die einen hohen Umsatz an Plasmaproteinen haben, zu dienen. Außerdem ist die zu dem Wirkstoff und Träger zusätzliche Verwendung eines Abstandshalters mit einem erheblichen Arbeitsaufwand und somit erhöhten Kosten verbunden, ohne von zusätzlichem pharmakologischen Nutzen zu sein.
WO 98/00172 offenbart pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine spezifische Abgabe von Wirkstoffen an den Zielort im Körper bewirken sollen. Sie umfassen Mikrobläschen, die von einer Proteinhülle ummantelt sind und die die eigentlichen Transporter für die Wirkstoffe sind. Die Proteinhülle besteht bevorzugt aus Humanserumalbumin und als Wirkstoff kann bespielsweise Naproxen enthalten sein. Die Mikrobläschen werden mittels einer Ultrabeschallung gebildet. Allerdings offenbart WO 98/00172 nicht, däss eine direkte kovalente Bindung zwischen dem Albumin und dem Wirkstoff vorhanden ist. Es ist zwar von der hohen Spezifität der Zusammensetzung die Rede, jedoch wird eine höhere Verweilzeit der Substanz im Körper, welche auf einer direkten kovalenten Bindung beruht, nicht offenbart.
Kostiainen et al. (Journal of Chromatography (1993), 647(2), 361-365) offenbaren die Untersuchung von Naproxen-Lysozym-Konjugaten mittels Kapillarelektophorese und Massenspektroskopie, wobei das Naproxen über eine Amidbindung kovalent mit der Lysingruppe im Lysozym gekoppelt ist. Es werden jedoch keinerlei Angaben über die pharmakologische Wirkung des Konjugates, die Beladungshöhe des Lysozyms mit dem Wirkstoff Naproxen, das Herstellungsverfahren des Konjugates etc. gemacht. Somit betrifft das Dokument Kostiainen et al. lediglich physikalische Untersuchungen des offenbarten Konjugates.
Manoharan et al. (ChemBioChem (2002), 3(12), 1257-1260) behandeln die Bindungsaffinität von Antisense-Oligonukleotiden an Serumalbumin und stellen fest, dass die Bindung von Ibuprofen an die Oligonukleotide eine verstärkende Wirkung auf die Affinität der Oligonukleotide an Humanserumalbumin aufweist. Somit handelt es sich hierin weder um eine kovalente Bindung des Wirkstoffes' Ibuprofen an das Humanserumalbumin noch werden pharmakologische und native Eigenschaften eines NSAR- HSA-Konjugates erwähnt.
Lister et al. (Am. J. Med. 1993 Aug 9; 95(2A):2S-9S) offenbaren lediglich einen klinischen Vergleich von entzündungshemmenden nicht-steroidalen
Antirheumatika wie beispielsweise Diclofenac, Naproxen oder Ibuprofen und deren Wirkung bei der Behandlung von Osteoarthritis oder rheumatoider
Arthritis. Eine Konjugation dieser Wirkstoffe an Albumin und eine damit verbundene erhöhte Bioverfügbarkeit der NSAR im Körper werden nicht offenbart.
Zia-Amirhosseini et al. (Biochem. J. (1995), 311, 431-435) beschreiben die Synthese und massenspektrorήetrische . Charakterisierung von Humanserumalbumin, das durch kovalente Bindung an Tolmetin modifiziert ist. Pharmakologische Eigenschaften des Konjugates werden jedoch nicht angegeben.
Melgert et al. (CeIIs of the Hepatic Sinusoid (1997), Band 1996, 6, 389-390) beschreiben ein Naproxen-HSA-Konjugat, wobei Naproxen und HSA kovalent miteinander verbunden sind. Es war das Ziel der Erfinder, Naproxen effizienter in Kupfer- bzw. Epithelzellen der Leber einzuschleusen als dies mit den freien niedermolekularen Wirkstoffen möglich ist. Die Konjugate werden zur Behandlung von akuter/chronischer Leberentzündung verwendet. Ein wesentlicher Nachteil der in Melgert et al. und Zia- Amirhosseini et al. offenbarten Experimente liegt jedoch in dem aufgeführten hohen Mengenverhältnis von NSAR zu Albumin, da bei einer solch hohen Beladung keinesfalls mehr von einem aktiven Protein ausgegangen werden kann. Somit liegt ein denaturiertes, nicht mehr applikationsfähiges Produkt vor. Damit ist nicht mehr gewährleistet, dass der Wirkstoff direkt am Wirkort freigesetzt wird und somit weitgehend nebenwirkungsfrei ist.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, NSAR in einer Form bereitzustellen, mit der die im Stand der Technik auftretenden Schwierigkeiten überwunden werden können und mit der insbesondere eine gezielte Aufnahme in entzündetem Gewebe bei gleichzeitig langer Halbwertszeit im Organismus erreicht werden kann.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein NSAR-Protein- Konjugat, welches ein NSAR sowie ein Protein umfasst. Besonders bevorzugt ist das NSAR-Protein-Konjugat ein NSAR-Albumin-Konjugat, umfassend ein NSAR und Albumin, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass das NSAR direkt kovalent an das Albumin gebunden ist, und dass das Molverhältnis NSAR : Protein 2 : 1 bis 0,1 : 1 beträgt.
Durch direkte Kopplung von NSAR an Proteine, insbesondere an Trägerproteine, werden die niedermolekularen Wirkstoffe, welche an sich schnell aus dem Körper entfernt werden, vor den Ausscheidungs- bzw. Abfangmechanismen des Körpers verborgen und es wird eine lange Halbwertszeit im Körper erreicht. Dadurch ist es möglich, geringe Mengen an Wirkstoff zu verabreichen und somit ggf. auftretende Nebenwirkungen praktisch vollkommen auszuschalten.
Toxische Effekte auf gesundes Gewebe oder Organe sind praktisch nicht zu beobachten, da normale, gesunde Zellen keine Veranlassung zur Proteinaufnahme haben. Im Gegensatz dazu werden Proteine und insbesondere Albumin von mit entzündlichen Prozessen assoziierten Zellen aufgenommen und führen somit zu einer Wirkstoffanreicherung in diesen Zellen.
Eine direkte kovalente Kopplung des NSAR an den Träger bedeutet, dass das NSAR durch eine Linker- bzw. Spacer-freie Bindung an das Transportprotein gebunden ist. Bevorzugt ist das NSAR über eine Säureamidbindung, die aus einer Carboxylgruppe des NSAR und einer Aminogruppe, bevorzugt einer Lysingruppe des Proteins gebildet wird, kovalent an das Protein gebunden.
Bevorzugt ist als Protein in den erfindungsgemäßen Konjugaten Albumin, insbesondere Serumalbumin, und am meisten bevorzugt humanes Albumin bzw. humanes Serumalbumin (HSA) eingesetzt. Grundsätzlich wird bevorzugt ein Protein verwendet, welches für den Patienten, für den das Konjugat vorgesehen ist, nativ ist. Unter einem nativen Protein ist ein Protein zu verstehen, das von der gleichen Spezies stammt wie diejenige Spezies, an die das Protein verabreicht wird. Das bedeutet beispielsweise, dass bei Verabreichung an Menschen humane Proteine, bei Verabreichung an Maus entsprechend Maus-Proteine, etc. eingesetzt werden.
Humanes Albumin ist ein körpereigenes, ubiquitär verteiltes und nicht immunogenes Protein. Es hat ein Molekulargewicht von etwa 68 kDa und wird somit nicht über die Niere ausgeschieden. Albumin macht ungefähr 60% der gesamten Plasma-Eiweißmenge aus. Es erfüllt im gesunden Organismus u.a. für viele Stoffe Transportfunktionen und dient im akuten Notfall als Reserve-Energieträger, der überall im Körper und jederzeit verfügbar ist. Unter normalen Bedingungen wird es von gesundem Gewebe nicht aufgenommen. Im Gegensatz dazu, haben mit entzündlichen Prozessen assoziierte Zellen einen hohen Umsatz an Proteinen, insbesondere an Plasmaproteinen, vorwiegend an Albumin. Dadurch wird das Albumin in den entzündeten Zielzellen, für die das Protein als Energielieferant dient, abgebaut und der Wirkstoff freigesetzt. Dies bedeutet, dass durch die erfindungsgemäße Kopplung von NSAR an Proteine, insbesondere Albumin, eine spezifische Aufnahme und damit eine Anreicherung des Wirkstoffes am Zielort erreicht werden kann. Durch diese Anreicherung ist es zum einen möglich, insgesamt geringere Dosen einzusetzen, zum anderen sind kaum oder keine Nebenwirkungen zu beobachten, da das Konjugat vom übrigen, gesunden Körpergewebe nicht aufgenommen wird.
Das biokinetische Verhalten der erfindungsgemäßen Konjugate wird allein durch das Makromolekül Albumin bestimmt, nicht aber durch das niedermolekulare NSAR. Die Kopplung des NSAR an das Trägerprotein, beispielsweise Albumin, erfolgt vorzugsweise ohne Einschränkung dessen biologisch aktiven Charakters. Besonders bevorzugt erfolgt eine kovalente Kopplung des Wirkstoffes an das Trägerprotein. Weiterhin wird die kovalente Kopplung bevorzugt so gewählt, dass sie in pathologisch veränderten Geweben wieder spaltbar ist, sodass die biologische Wirksamkeit des ursprünglichen Pharmakons erhalten bleibt und genutzt werden kann.
Erfindungsgemäß erfolgt somit eine Bildung von NSAR-Protein-Konjugaten, insbesondere von NSAR-Albumin-Konjugaten ohne Veränderung der biologischen Wirksamkeit der Wirksubstanz und ohne Verlust des biologisch aktiven Charakters des als Träger benutzten Proteins, insbesonderedes Albumins.
Unter einem biologisch aktiven Protein versteht man insbesondere ein nicht denaturiertes Protein, dessen biologische Funktion erhalten bleibt. Bevorzugt weist das Protein eine biologische Aktivität von > 50 %, besonders bevorzugt von > 70 %, insbesondere bevorzugt von > 80 %, und am meisten bevorzugt von > 90 %, bezogen auf die Aktivität von natürlichem Albumin, auf. In den Konjugaten beträgt das Molverhältnis von Wirkstoff zu Trägerprotein 2 : 1 bis 0,1 : 1, bevorzugt 1,5 : 1 bis 0,2 : 1, und insbesondere 1 ,1 : 1 bis 0,5 : 1. So zeigt z.B. Albumin bei einer 1 : 1 Beladung mit einem NSAR immer noch biologisch aktives Verhalten. Weiterhin wurde festgestellt, dass erfindungsgemäß Konjugate erhalten werden können, die kein oder nur einen sehr geringen Anteil an Cross- Linking während der Beladung aufweisen. Dadurch kann eine schnelle Elimination aus dem Kreislauf und unerwünschte Nebenwirkungen weiter vermieden werden. Der Anteil an dimerem Albumin in den erfindungsgemäßen Konjugaten liegt vorteilhafterweise ≤ 5 Gew.-%, mehr bevorzugt ≤ 3 Gew.-%.
Als Wirkstoff werden erfindungsgemäß NSAR eingesetzt, die insbesondere ausgewählt werden aus Acetylsalicylsäure, Diclofenac, Indomethacin, Naproxen, Flufenaminsäure, Mefenaminsäure, Tolmetin, Ibuprofen, Fenoprofen, Ketoprofen, Acemetacin oder Nifluminsäure.
Mit den erfindungsgemäßen Konjugaten und den hierin beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen können insbesondere folgende Vorteile erhalten werden. Die Wirkstoffe werden nur im Bereich des entzündlichen Prozesses, insbesondere durch enzymatische Spaltung des Proteins freigesetzt. Die bisher üblichen Nebenwirkungen, die beim Einsatz niedermolekularer NSARs auftreten, treten nicht mehr in Erscheinung, da in vivo gesunde Zellen kein Albumin oder dessen Konjugate aufnehmen. Die biologische Halbwertszeit der Konjugate wird allein durch das Makromolekül Protein, insbesondere Albumin, bestimmt. Damit fällt die anfänglich verfügbare Wirkstoffkonzentration erst nach ungefähr 20 Tagen auf etwa 50 % des Ausgangswertes ab. Das erfindungsgemäß zur Bildung der Konjugate eingesetzte Protein weist bevorzugt ein Molekulargewicht von ≥ 18.000 Da, mehr bevorzugt ≥ 30.000 Da und noch mehr bevorzugt ≥ 50.000 Da auf.
Durch die lange biologische Halbwertszeit wird das bisher zeitlich sehr enge Zeitfenster der Wirkstoffverfügbarkeit wesentlich verbreitert, ohne dass weitere Nebenwirkungen auftreten. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Konjugat Wirkstoff in einem Arzneimittel. Ein solches Arzneimittel weist insbesondere geringe Nebenwirkungen auf und kann beispielsweise auch ambulant verabreicht werden. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise intravenös.
Eine Dosiseinheit enthält vorzugsweise 0,1 bis 10 mg Wirkstoff NSAR pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag und insbesondere 0,5 bis 5 mg Wirkstoff pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag. Die Dosis kann insbesondere niedriger als bei der herkömmlichen Therapie mit NSARs gewählt werden.
Aufgrund der langen Halbwertszeit der Konjugate im Körper ist es möglich, längere Zeitintervalle zwischen der Verabreichung vorzusehen, so dass eine Dosiseinheit beispielsweise höchstens alle sieben Tage verabreicht wird.
Die erfindungsgemäßen Konjugate eignen sich insbesondere zur Behandlung von entzündlichen Prozessen. Dabei können mit den erfindungsgemäßen Konjugaten alle entzündlichen Prozesse behandelt werden, die auch mit den NSAR alleine behandelt werden. Entzündliche Prozesse, die erfindungsgemäß behandelt werden können, sind beispielsweise rheumatoide Arthritis.
Weiterhin ist es möglich, die erfindungsgemäßen Konjugate in der Kombinationstherapie einzusetzen, beispielsweise zusammen mit anderen entzündungshemmenden Mitteln. In einer solchen Kombinationstherapie reduzieren sich die Dosen der jeweiligen Komponenten weiter.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines NSAR-Protein-Konjugates. Besonders bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines NSAR-Albumin-Konjugates, umfassend das Umsetzen eines NSAR mit Albumin durch eine direkte kovalente Kopplung, wobei das Molverhältnis NSAR : Albumin 2 : 1 bis 0,1 : 1 beträgt. Dabei werden der niedermolekulare Wirkstoff NSAR und das hochmolekulare Trägerprotein miteinander umgesetzt. Bevorzugt erfolgt eine direkte kovalente Kopplung des Wirkstoffs an das Trägermolekül, beispielsweise Albumin, ohne Einschränkung dessen biologisch aktiven Charakters. Besonders vorteilhaft hat sich eine Kopplung erwiesen, bei der zunächst aus dem niedermolekularen NSAR ein Succinimidylester gebildet wird und diese anschließend mit dem Protein umgesetzt wird. Ein Succinimidylester von NSAR kann beispielsweise durch Umsetzung niedermolekularer NSAR mit einem Carbodiimid hergestellt werden.
Für die Herstellung der erfindungsgemäß eingesetzten Konjugate ist eine effiziente kovalente Kopplung des Wirkstoffes an das Trägermolekül (also das Protein) von Bedeutung. Bei der Kopplung darf es insbesondere nicht zu einer unerwünschten Veränderung des Trägerproteins oder/und des Wirkstoffes kommen. Die bisher übliche Aktivierung Carboxylgruppen- haltiger organischer Verbindungen mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) erfordert bei Raumtemperatur oder bei +4 0C mehr als 12 Stunden (DP 41 22 210 A1 ; EP 0 879 604 A1 ; EP 0 820 308). Bei diesem Verfahren bilden sich zudem bei der Aktivierung unlösliche Substanzen, die zum Teil bereits während der Aktivierung und zum Teil beim Eintragen des aktivierten Wirkstoffs in eine wässrige Proteinlösung ausfallen und, damit das Konjugat medizinisch verabreicht werden kann, durch zeitaufwändige und teure Filtrationsschritte zusätzlich zu der eigentlichen Produktreinigung abgetrennt werden müssen und nie 100%-ig sind (wegen der lipophilen Domänen im Albumin).
Es bestand deshalb der Bedarf, ein Verfahren zur Herstellung von Wirkstoff- Protein-Konjugaten bereitzustellen, bei dem diese Probleme nicht auftreten und bei dem insbesondere keine wasserunlöslichen Nebenprodukte gebildet werden.
Diese Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines Konjugates, bei dem NSAR und Albumin in Gegenwart von N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid (EDC) als Carbodiimid und N-Hydroxysuccinimid umgesetzt werden.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass durch die Verwendung von 5 EDC, insbesondere in Form des Hydrochlorids, eine Aktivierung der Carboxylgruppen-haltigen organischen Verbindung und eine Umsetzung mit einem Trägerprotein erreicht werden kann, ohne dass wasserunlösliche Nebenprodukte gebildet werden, die zeit- und kostenaufwändig abzutrennen wären. Durch dieses Verfahren werden Zwischenreinigungsschritte o überflüssig und die Präparationszeit und damit auch die Herstellungskosten werden wesentlich reduziert. Weiterhin werden Probleme, die bei der Injektion des Konjuats in einen menschlichen oder tierischen Körper durch unlösliche Substanzen oder Nebenprodukte hervorgerufen werden, vermieden. 5
Die Aktivierung erfolgt bevorzugt bei einer Temperatur von 10 bis 100 0C, mehr bevorzugt von 20 bis 90 0C und noch mehr bevorzugt von 50 bis 75 0C für eine Reaktionszeit von 1 Minute bis 10 Stunden, mehr bevorzugt von 20 bis 50 Minuten. Die Umsetzung des aktivierten Wirkstoffes mit dem o Trägerprotein erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 10 und 50 0C, insbesondere zwischen 20 und 40 0C.
Bevorzugt wird die Aktivierung der Carboxyl-haltigen Verbindung, insbeson¬ dere von Methotrexat mit EDC und N-Hydroxysuccinimid in einem 5 organischen Lösungsmittel, bevorzugt in Dimethylsulfoxid (DMSO) durchgeführt. Weitere geeignete organische Lösungsmittel sind z.B. Dimethylacetamid oder Dioxan. Die Aktivierung wird vorzugsweise unter Ausschluss von Wasser durchgeführt, insbesondere in Gegenwart von ≤ 5 Gew.-% Wasser, mehr bevorzugt ≤ 1 Gew.-% Wasser und am meisten o bevorzugt vollständig wasserfrei. Durch Aktivierung der Carboxylgruppen- haltigen Verbindung mit eingesetzten Substanzen EDC und N- Hydroxysucchinimid in einem organischen, wasserfreien Lösungsmittel reagieren diese nicht mit Protein, z.B. Albumin und verändern auch nicht dessen Struktur.
Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens be- steht darin, dass die eingesetzten Aktivierungsreagenzien, also EDC sowie N-Hydroxysuccinimid eine hohe Wasserlöslichkeit aufweisen. Dadurch können bei der Umsetzung nicht verbrauchte Kopplungsreagenzien auf einfache Weise aus dem gewonnen Produkt, beispielsweise durch Waschen mit Wasser entfernt werden. Im Gegensatz dazu verbleibt bei den im Stand der Technik verwendeten Kopplungsreagenzien, beispielsweise bei der Verwendung von Di-cyclohexyl-carbodiimid (DCC) ein nicht auftrennbarer Rest an Kopplungsreagenz im Konjugat. So ist bei einem NSAR-Albumin- Konjugat bei Verwendung von DCC ein nicht abtrennbarer Rest von etwa 13 bis 15 Gew.-% an DCC im Konjugat zu beobachten, der wahrscheinlich an eine lipophile Domäne im Albumin gebunden ist. Dieser Rest kann nur mit Hilfe von HPLC nachgewiesen und nur unter erheblichem Aufwand präparativ abgetrennt werden.
Ein weiterer bevorzugter Aspekt der Erfindung betrifft ein optimiertes Herstellungsverfahren eines erfindungsgemäßen Konjugats umfassend das Umsetzen eines NSAR mit Albumin durch eine direkte kovalente Kopplung, dadurch gekennzeichnet, dass man ein NSAR und Albumin in Gegenwart von N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-c.arbodiimid als alleiniges Aktivierungsreagenz umsetzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem NSAR bevorzugt um ein Cytostatikum oder Immunsuppressivum, besonders bevorzugt um Indomethacin, Acetylsalicylsäure, Diclofenac, Ibuprofen und / oder Naproxen, insbesondere bevorzugt um Indomethacin. Beim Protein handelt es sich bevorzugt um Albumin.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass sich das optimierte Verfahren, welches ohne N-Hydroxysuccinimid oder andere zusätzliche Aktivierungsreagenzien arbeitet, bei der Reinigungsprozedur positiv auf die Vereinfachung der Herstellung auswirkt. Durch die Verwendung von EDC zur Aktivierung ohne den Zusatz von N-Hydroxysuccinimid (HSI) beträgt die Aktivierungszeit von Indomethacin nur noch wesentlich weniger als die bei Verwendung von HSI benötigten 30 Minuten. Ein weiterer Vorteil des optimierten Verfahrens liegt darin, dass nach Zugabe des aktivierten Wirkstoffs zu dem vorgelegten Protein, insbesondere Albumin, ohne N- Hydroxysuccinimid eine direkte Kontrolle der Kopplungseffizienz erfolgen kann. Bei Verwendung von N-Hydroxysuccinimid besitzt dieses bei der HPLC bei einer Einstellung der UV-Messzelle auf 280 nm ebenfalls eine hohe UV-Absorption und stört oder erschwert durch seine Retentionszeit von etwa 11,5 Minuten, bei der auch andere niedermolekulare Verbindungen erscheinen, eine direkte Bestimmung der Kopplungsausbeute. Dies bedeutet, dass in vielen Fällen eine Ausbeutebestimmung erst am Ende der Reinigung des Konjugats möglich ist. Durch das optimierte Verfahren ohne Einsatz von N-Hydroxysuccinimid kann dieser Faktor nun ausgeschlossen werden. Dies ist auch für die Produktsicherheit von großem Vorteil. Ein weiterer Vorteil des optimierten Verfahrens liegt darin, dass die Kopplungsausbeute überraschenderweise durchschnittlich bei 98 bis 99 % liegt.
Somit sind die Gesamtkosten des jeweiligen Konjugats durch diese Vereinfachung der Herstellung deutlich gesenkt.
Die mit den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Konjugate können aufgrund ihrer hohen Reinheit für zahlreiche Verwendungen und insbeson¬ dere für eine intravenöse Verabreichung vorgesehen werden. Somit können solche Konjugate, beispielsweise bei Verwendung eines NSAR mit entzündungshemmender Wirkung vorteilhafterweise zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung entzündlicher Prozesse, insbesondere zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von rheumatoider Arthritis eingesetzt werden. Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel und die beigefügten Figuren weiter erläutert.
Figur 1 zeigt ein HPLC Chromatogramm von Indomethacin alleine, und Figur 2 zeigt das Chromatogramm des gemäß Beispiel 1 hergestellten Indomethacin-HSA-Konjugat.
Beispiel 1
Indomethacin-HSA-Konjugat
Ausgangsstoffe:
Indomethacin (IMC1 SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen), N-(3- Dimethylaminopropyl)-N'ethylcarbodiimid Hydrochlorid (EDC, SIGMA- ALDRICH, Taufkirchen), N-Hydroxysuccinimid (Sigma-Aldrich, Taufkirchen) und Albumin (Göricke, Dessau). Anstelle des Indomethacins können auch die anderen NSARs: Acetylsalicylsäure.Diclofenac, Ibuprofen, Naproxen etc. zur Konjugation mit Albumin eingesetzt werden.
Standardansatz im Labormaßstab:
Etwa 10,5 mg Indomethacin (IMC, MG 357,8) werden zusammen mit etwa 11 ,3 mg N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid (EDC MG 191 ,71 , Molverhältnis 1 :2) und etwa 34 mg N-Hydroxysuccinimid (NHS, MG 115,9, Molverhältnis 1 : 10) in einem Reagenzglas mit NS 14,5 Schliff und Stopfen vorgelegt. Nach der Zugabe von 1 mL Dimethylsulfoxid (DMSO) wird die Reaktionsmischung in ein auf 65 0C vorgeheiztes Wasserbad eingebracht. Nach einer Reaktionszeit von etwa 30 min liegt eine klare, farblose Lösung von Indomethacinsuccinimidylester vor, die nach Abkühlung auf Raumtemperatur sehr langsam in eine 5%-ige Albuminlösung eingetragen wird. An der Einlaufstelle bildet sich kurzzeitig eine Trübung, die sich jedoch schnell wieder auflöst. Das Kontrollchromatogramm kann direkt im Anschluss an die Kopplung angefertigt werden. Die Kopplungsausbeute liegt bei über 80%.
Die Abtrennung der im Endprodukt unerwünschten Begleitstoffe DMSO, NHS, N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-Harnstoff und nicht gebundenes Indomethacin erfolgt durch Ultrafiltration (YM 30, Millipore).
Qualitätskontrolle (HPLC/SEC):
Vorsäule: Reprosil 200 SEC 5 x 4 mm, 5 μm (Dr. Maisch GmbH) Säule: Reprosil 200 SEC 300 x 4,6 mm, 5 μm (Dr. Maisch GmbH)
Laufmittel: 0,18 M Na2HPO4 ; pH 7,4 ; 5% Methanol
Fluß: 0,3 mL/min
Druck: etwa 50 b
UV-vis: 280 nm
Retentionszeiten: oligomere Albumin-Fraktion 5,93 min dimere Albumin-Fraktion 8,19 min monomere Albumin-Fraktion 8,98 min freies Indomethacin 29,45 min
Der Anteil an dimerem Albumin liegt bei < 3 %.

Claims

Ansprüche
1. NSAR-Albumin-Konjugat umfassend ein nicht-steroidales Antirheumatikum (NSAR) und Albumin, dadurch gekennzeichnet, dass im Konjugat das NSAR direkt kovalent an das Albumin gebunden ist und das Molverhältnis NSAR : Albumin 2 : 1 bis 0,1 : 1 beträgt.
2. NSAR-Albumin-Konjugat nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Albumin humanes Albumin ist.
3. NSAR-Albumin-Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Albumin in nativer Form vorliegt.
4. NSAR-Albumin-Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das NSAR ausgewählt ist aus Acetylsalicylsäure, Diclofenac,
Indomethacin, Naproxen, Flufenaminsäure, Mefensäure, Tolmetin, Ibuprofen, Fenoprofen, Ketoprofen, Acemetacin oder Nifluminsäure.
5. NSAR-Albumin-Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Molverhältnis NSAR : Albumin 1,1 : 1 bis 0,5 : 1 beträgt.
6. Arzneimittel, enthaltend als Wirkstoff ein NSAR-Albumin-Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
7. Verwendung eines NSAR-Albumin-Konjugats nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung entzündlicher Prozesse.
8. Verwendung nach Anspruch 7 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von rheumatoider Arthritis.
9. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats umfassend das Umsetzen eines NSAR mit Albumin durch eine direkte kovalente Kopplung, dadurch gekennzeichnet, dass das Molverhältnis NSAR : Albumin 2 : 1 bis 0,1 : 1 beträgt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass zunächst aus dem NSAR ein Succinimidylester mittels eines Carbodiimids gebildet wird und anschließend der Succinimidylester des NSAR mit Albumin umgesetzt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Succinimidylester von NSAR durch Umsetzung eines NSAR mit N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid und N- Hydroxysuccinimid gebildet wird.
12. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats umfassend das Umsetzen eines NSAR mit Albumin durch eine direkte kovalente Kopplung, dadurch gekennzeichnet, dass man ein NSAR und Albumin in Gegenwart von N-(3-
Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-carbonyldiimid als Aktivierungsreagenz umsetzt und dass das Molverhältnis NSAR : Albumin 2 : 1 bis 0,1 : 1 beträgt.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das NSAR in einem organischen Lösungsmittel, insbesondere in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel, mit N-(3- Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-carbocliimid umgesetzt, durch Erwärmung aktiviert und anschließend das NSAR mit Albumin umgesetzt wird.
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