EP1929294A2 - Methode de detection d'interaction intracellulaire entre bio-molecules - Google Patents

Methode de detection d'interaction intracellulaire entre bio-molecules

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Publication number
EP1929294A2
EP1929294A2 EP06808277A EP06808277A EP1929294A2 EP 1929294 A2 EP1929294 A2 EP 1929294A2 EP 06808277 A EP06808277 A EP 06808277A EP 06808277 A EP06808277 A EP 06808277A EP 1929294 A2 EP1929294 A2 EP 1929294A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
fluorescent
compounds
fluorescent compound
bio
molecules
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP06808277A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Iris Pribilla
Hervé Bazin
Sraboni Ghose
Norbert Tinel
Michel Fink
Eric Trinquet
Gérard Mathis
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CIS Bio International SA
Original Assignee
CIS Bio International SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CIS Bio International SA filed Critical CIS Bio International SA
Publication of EP1929294A2 publication Critical patent/EP1929294A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching

Definitions

  • the present invention relates to a non-microscopic, quantitative method for detecting intracellular interactions between biomolecules, on living cells, in response to biological or pharmacological stimulation, by the effect of proximity energy transfer in time resolved between two members.
  • a fluorescence donor / acceptor pair and its applications such as in particular the high-throughput screening of molecules and the detection of intracellular signaling pathways.
  • the molecules with pharmacological activity act on molecular targets located either at the plasma membrane or inside living cells.
  • the selection and optimization of candidate molecules in research processes within the pharmaceutical industry requires the determination of their molecular actions and, as far as possible, in a native environment in order to integrate the modulations possibly brought about by interactions between different partners. From a more fundamental point of view, in physiological or pathological conditions, it is important to have cell models where the direct interactions between bio-molecules involved in intracellular signaling pathways can be easily studied, characterized and quantified [see for example Takesono et al. Journal of CeII Sciences, 115, 3039-3048, (2002)]. This desire to understand mechanisms of action in native conditions explains why more and more cell assays are used in primary screening of molecules.
  • high throughput screening techniques can primarily detect the end products of biological events, such as the production of second messengers.
  • the cells must be lysed to allow access to the intracellular target molecule to be assayed.
  • Very few kinetic observations are currently possible and rare events are easily undetected.
  • New approaches using live cell microscopy or imaging techniques provide access to dynamic and kinetic parameters of one or more bio-molecules of interest in their native environment, in response to stimulation. These techniques are based on movement studies of these biomolecules in response to a stimulus. The analysis of these displacements makes use of a treatment of the images which give access, a posteriori and by indirect methods, with arbitrary values which make it possible to quantify the biological events considered.
  • microscopy techniques consist of determining the location of a molecular target and monitoring any localization changes.
  • the molecular target is generally fused to a fluorescent protein that may be of the GFP family.
  • Such direct visualization techniques inside a cell are carried out using a conventional fluorescence microscope, cofocal microscopes or new platforms integrating microscopy and image acquisition.
  • Such platforms are, for example, used in TRANSFLUOR technology (Molecular Devices) or on instruments such as OPERA (Evotech Technologies) or In CeII analyze (GE Healthcare) (see John Comley review, DDW, summer 2005, pp 31-53).
  • these technologies are used to qualify one or more cellular events, which most often result from a cascade of past events, giving indirect access to the event that one wishes to measure. Moreover, these techniques do not make it possible to directly give information on the interactions between biomolecules or on conformational changes within the same molecule, both of which are direct indicators of the biological event that is desired. detect and quantify.
  • intracellular technologies to characterize interactions between biomolecules or conformational changes within the same bio-molecule, both witnesses of biological events are based on energy transfer technology (FRET) between different fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP) and its different mutants. For example, two protein variants of GFP (CFP and YFP) form a compatible pair to establish FRET.
  • FRET energy transfer technology
  • Both variants of GFP can also be expressed in living cells in fusion with a single target protein.
  • This biomolecule doubly fused with the two variants of GFP, is defined as a biro-sensor.
  • a bio-sensor is able to adopt different conformations depending on changes in the biological environment, these conformational changes being able to be followed by a FRET process.
  • Such biomolecules can be used in the monitoring of numerous cellular events such as the production of cAMP, IP3 or cGMP (see Nikolaev et al., JBC, vol 279, No. 36, pp. 37215-37218, 2004). , Tanimura et al., JBC, vol 279, No. 37, pp. 38095-38098, 2004 and US Patent 6,924,191 B2).
  • BRET a molecule that generates bioluminescence
  • a BRET process can take place in living cells between luciferase and GFP labeled proteins respectively.
  • Several intracellular protein interactions could be measured by fusing luciferase to one partner and GFP to another (see Milligan G Eur J Pharm Sci 2004 Mar; 21 (4): 397-405, Boute N et al. Trends Pharmacol Sci., 2002 Aug; 23 (8) 351-4 and Trugnan G. et al., Sci Med (Paris), 2004 Nov; 20 (11); 1027-34.).
  • the energy transfer process is initiated when the substrate of the luciferase enzyme is provided in the cell preparation to be tested. Luciferase produces a light which, in the case of a protein interaction allowing close proximity between the two partners, excites the GFP. The fluorescence signal emitted by the GFP is then measured.
  • the fluorescence signal can be easily masked by an autofluorescence of the tested products.
  • the BRET technology is not robust enough for screening molecules because of the low stability of the signal over time, which leaves a very short reading window, which is not very compatible with the high-throughput screening of molecules.
  • Another set of technologies for studying interactions between biomolecules is to use a functional complementation process.
  • Biological molecules of interest are fused with two inactive fragments of a 3rd protein.
  • the 2 active fragments of the 3 rd protein then reconstitute, by direct interaction or by a more complex process of protein splicing, a 3 rd functional protein whose activity can be measured.
  • This protein the activity of which has been restored by the interaction between the biomolecules of interest, may be a luciferase; in this case, a luminescence signal is measured, a fluorescent protein such as GFP (see Ozawa T, Current Opinion in Chemical Biology, 2001, No.
  • QuantumDots offer a much wider possible number of possible donor / acceptor couples, makes it possible to work on a range of longer excitation wavelengths and, by combining different couples, to measure concomitantly different interactions between bio-molecules (multiplex approach). However, it is difficult to specifically label the biomolecules by these compounds in the cell.
  • the use of fluorescent organic molecules for intracellular FRET applications has, for example, been described for visualizing messenger RNAs in living cells.
  • the interaction involved in this case is based on an apartment between the target messenger RNA and anti-sense oligonucleotide sequences labeled with fluorescent organic molecules (see Dirks et al., 2003, METHODS, Jan. 29, No. 1). pp. 51-57 and Tsuji et al., Biophys J. 2001 JuI 81 (1): 501-15).
  • the information obtained in this case is not quantitative because it uses microscopic detection. Furthermore, it does not qualify an interaction between two biomolecules of interest and serves only to reveal the presence of a messenger RNA of interest.
  • TR-FRET time-resolved FRET
  • This technique uses a first long-lived donor fluorescent compound and one or more acceptor fluorescent compounds having spectral characteristics compatible with the first fluorescent compound.
  • the long life of the fluorescent compound preferably greater than 100 nanoseconds, makes it possible to define a window of time to achieve the measurement in which the emissions of short-lived fluorescent compounds are not present;
  • the TR-FRET allows in the method of the invention to eliminate all the disadvantages of FRET applications between CFP / YFP or BRET with luciferase and GFP observed in living cells, in particular;
  • the time-resolved reading makes it possible to suppress the effects of the auto-fluorescence of the cells and products to be tested;
  • the amplitude of the signals in TR-FRET is higher than that measured with FRET techniques using dyes / fluorescent proteins.
  • TR-FRET technique has never been used in living cells until now. This is due to many technical obstacles that the Applicant has been able to overcome.
  • the method of the invention makes it possible to circumvent these obstacles and thus provides effective means for studying biological phenomena within living cells.
  • the method of the invention allows the detection and quantification of conformational interactions or modifications between living cell biomolecules in response to specific stimulation.
  • the invention relates to a method for detecting interactions between bio-molecules, translocation or conformational change of biomolecules in living cells, comprising the following steps:
  • the light excitation of living cells can be achieved by methods well known to those skilled in the art, such as by a laser source, flash lamps or Xenon.
  • the emission, intensity and lifetime measurements of the various fluorescent compounds used in the method of the invention are carried out by means of the FRET signals by conventional methods well known to those skilled in the art.
  • the appropriate readers for detecting the time resolved FRET signal according to the method of the invention are of the RUBYstar or PHERAstar type from BMG Labtech or other readers compatible with time resolved such as ULTRA, ULTRA Evolution or the GENios Pro from TECAN or PAnalyst from Molecular Devices.
  • the calculation of the ratio between the fluorescence of the first fluorescent compound and the fluorescence of the second fluorescent compound or others is carried out by a method known to those skilled in the art and described in particular in EP 569 496 Bl.
  • the fluorophores used to label biomolecules are fluorescent compounds that partner with TR-FRET.
  • TR-FRET partner fluorescent compounds means pairs of fluorescent compounds whose fluorescence spectra partially overlap, and whose donor is a long-lived fluorescent compound and the acceptor is a fluorescent compound with a shorter lifetime than the donor.
  • the two fluorescent compounds are used to mark one and the same biomolecule.
  • the method according to the invention comprises additional steps for labeling biomolecules with other fluorescent compounds, which makes it possible to study more complex biological phenomena.
  • the system will always include a first long-lived donor fluorescent compound, as well as several other fluorescent acceptor partners partners of TR-FRET, which will make it possible to measure several interactions, translocations or conformational changes in the same cell.
  • bio-molecule we mean a molecule present in a living organism, and in particular the molecules constituting the structure of an organism, those involved in the production and transformation of energy or in the transmission of biological signals.
  • This definition includes nucleic acids, proteins, sugars, lipids, peptides, oligonucleotides, metabolic intermediates, enzymes, hormones and neurotransmitters.
  • biomolecules that can be studied using the process according to the invention are all types of molecules expressed, thanks to heterologous expression techniques known to those skilled in the art, in living cells in culture.
  • bio-molecules may be, for example, any proteins, all lipids, sugars or oligonucleotides artificially produced by living cells, such as for example membrane receptors, such as tyrosine kinase receptors, 7-transmembrane domain-coupled receptors.
  • G-proteins and subunits of hetero-trimeric G-proteins non-membrane receptors, such as hormone receptors, ion channels, transporters present at the membrane (aquaria, sodium transporters, bicarbonate carriers (HCO 3 ), ionic pumps (sodium / potassium pump), signal transduction proteins, such as monomeric G proteins, enzymes, such as kinases, phosphatases, transglutaminases, hydrolases, halogenases, lipases, transferases, metabolic enzymes, scaffolding proteins, such as SOS, GRB, 1RS, HSP, x lipids, proteins containing PH domains, or FYVE, associating with the membrane by lipid anchoring of N-myristoylation type, S-palmitoylation, S-prenylation geranylgéranylation, proteins associated with G-protein-coupled receptors (monomeric or trimeric) such as GEFs, GAPs and RGS, heterotrimeric G-protein subunits and G-
  • the living cells used in the present invention are all types of living cells cultured according to techniques known to those skilled in the art, such as, for example, prokaryotic cells (bacteria), yeasts, immortalized eukaryotic cell lines, insect cells, primary cultures, such as cultures from mammalian blood, tissue or organs. It is important to emphasize that the method of the invention makes it possible to work on living cells and to preserve the integrity of intracellular biochemical mechanisms: the cell membranes are not permeabilized as is the case in other processes of the invention. state of the art and the cells do not need to be fixed.
  • interactions between molecules that can be demonstrated by the process according to the invention are numerous and varied and are dependent on the nature of the bio-molecules used in said process. These interactions may be, for example, the interactions between the androgen receptor and androgen which induce a translocation of the cytoplasmic receptor to the cell nucleus, PKC- ⁇ which undergoes a translocation after stimulation of the cytoplasm to the lipids composing the membrane. cell plasma, the calcineurin complex which requires a calmodulin binding to be active, p65 / p50, etc.
  • the conformational changes of biomolecules within the living cell can take place in certain stimulation circumstances, such modifications can be, for example, beta-arrestin, EPAC (binding proteins), cAMP), exchange factors of small monomeric G proteins (GEFs), ion channels, such as K + channels dependent on fast inactivation potential, etc.
  • modifications can be, for example, beta-arrestin, EPAC (binding proteins), cAMP), exchange factors of small monomeric G proteins (GEFs), ion channels, such as K + channels dependent on fast inactivation potential, etc.
  • fluorescent compounds also known as fluorophores
  • the first of these compounds has a long fluorescence lifetime and the others have generally short fluorescence lifetimes.
  • the fluorescent compounds are partners of TR-FRET.
  • the long-lived fluorescent compounds particularly suitable for the purposes of the invention preferably have a lifetime equal to or greater than 100 nanoseconds.
  • these suitable fluorescent compounds are rare earth complexes, such as cryptates and chelates, in particular cryptates containing one or more pyridine units.
  • rare earth cryptates are described, for example, in EP 180 492, EP 321 353, EP 601 113 and WO 01/96 877.
  • Terbium (Tb3 +) and Europium (Eu3 +) cryptates are particularly suitable for the purposes of the invention. of the present invention.
  • the rare earth chelates are described in particular in patents US 4,761,481, US 5,032,677, US 5,055,578, US 5,106,957, US 5,116,989, US 4,761,481, US 4,801,722 and US 4,794,191.
  • chelates are composed of a nonadentant ligand such as terpyridine (EP 403,593, US 5,324,825, US 5,202,423). , US 5,316,909).
  • a particular example of a rare earth chelate which is suitable for the purposes of the invention is the chelate having the formula:
  • Fluorescent compounds having a short lifetime can be selected from fluorescent proteins, such as green fluorescent protein (GFP) and its derivatives (especially CFP, YFP), or fluorescent compounds having a lifetime of less than 100 nanoseconds, such as cyanines, rhodamines, fluoresceins, squarenes and fluorescent molecules known as BODIPY's (difluoroboradiazaindacenes), the compounds known under the name AlexaFluor, fluorescent proteins extracted from corals, phycobiliproteins, such as B- phycoerythrin, R-phycoerythrin, C-phycocyanin, allophycocyanins, in particular those known under the name XL665, the "Quantum Dots".
  • Other suitable fluorescent compounds are described in patent application FR 2,840,611 and comprise a fluorophore coupled to an oligonucleotide.
  • fusion protein between the bio-molecules of interest and a protein having intrinsic fluorescence properties, such as the GFP family proteins.
  • Expression of such fusion proteins is based on molecular biology techniques well known to those skilled in the art, such as transiently transfecting into the living cell, stably or transiently, expression vectors, such as plasmids, whose DNA encodes the fusion protein.
  • a fusion protein between the biomolecules of interest and a protein having a suicide enzyme activity such as, for example, SnapTag (Covalys) or HaloTag (Promega) proteins that transfer covalently and irreversibly the fluorescent compound on the bio-molecules of interest.
  • the fluorescent is covalently bound to the substrate of the suicide enzyme and is introduced into the extracellular medium.
  • Suicide enzymes are proteins that have enzymatic activity modified by specific mutations that give them the ability to bind a substrate quickly and covalently. These enzymes are called suicides because each can bind only one fluorescent molecule, the activity of the enzyme being blocked by the attachment of the substrate. Currently two families of known suicide enzymes allow this type of labeling:
  • the substrate that will be incorporated by these suicide enzymes must first be labeled with a fluorescent organic compound.
  • Protein splicing This approach exploits a biological process of post-translational processing, called protein splicing. This process catalyzes a series of chemical reactions whose ultimate goal is to remove a domain named intein present in a precursor protein and to bind by a peptide bond the two domains lying on either side of the intein domain. Protein trans-splicing requires two halves of complementary intein domain. The first half is fused to the target protein and the second half to the fluorescent molecule. This method is described by Muir TW et al. (2003) J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 7180-7181. The techniques described below make it possible to cross the cell membrane with conjugated "fluorescent compound - intein" which would not be naturally epophilic.
  • These bi-arsenic compounds can be easily labeled with an organic molecule of the fluorescein or rhodamine type (see BAGriffin et al (1998) Science, 1998, 281, 269-271 and SA Adams et al (2002) J. Am. Soc., 2002, 124, 6063-6076 for details on the technology).
  • the PoIy histidine repeats bind to metal ions that can be coupled to "quencher” molecules of fluorescent compounds (see E.G. Guignet et al (2004), Nature Biotech., 2004, 22, 440-444).
  • BTX tag composed of a peptide of 13 amino acids that is recognized by bungarotoxin (BTX)
  • BTX bungarotoxin
  • streptavidin binding sequence is a 38 amino acid sequence that has a high affinity for biotin that can be previously labeled with a fluorophore (see CM McCann et al (2005), Biotechnology (2005)). 38, 945-952).
  • the peptide sequence PKPQQFM (Proline-Lysine-Proline-Glutamine-Glutamine-Phenylalanine-Methionine) is for example recognized by an enzyme called transglutaminase.
  • Transglutaminase transfers the coupled organic fluorescent compound to its substrate, cadaverine, directly to the first glutamine residue of the PKPQQFM sequence (see Taki et al (2004) Protein Engeneering, Design Selection, 2004, 17, 119-12).
  • the techniques described below make it possible to cross the cell membrane with fluorescent compound-substrate conjugates that would not be naturally lipophilic.
  • the sequence of the dihydrofolate reductase enzyme of E. coli (eDHFR) which binds specifically and with high affinity ligands such as trimethoprim onto which fluorescent compounds can be grafted according to the technology called "Ligand link Universal labeling technology" of the Active Motif Company,
  • Nucleic sequences can also be specifically recognized by enzymes having transferase activities allowing them to covalently link a fluorescent organic molecule present on a cofactor or a substrate directly to the specific sequence.
  • a te! The method can be illustrated by the specific 5'-TCGA-3 'nucleic sequence on which the TaqI methyltransferase transfers the previously grafted fluorescent compound to the aziridine cofactor (see Pljevaljcic G. et al., (2004) ChemBiochem, 5: 265-269). .
  • the fluorescent compound / biomolecule labeling is thus carried out by coupling the fluorescent compound and the bio-molecule, respectively with the members of the pairs chosen from: a SNAP-Tag substrate / the SNAP-Tag enzyme , a HALO-Tag substrate / the HALO-Tag enzyme, an intein part such as the intein of Ssp DnaE / the complementary intein part for reconstituting a functional intein, a bi-arsenic unit / the Cys-Cys-X-X-Cys-Cys sequence, X representing any amino acid, metal ion / poly-histidine sequence, biotin / streptavidin, streptavidin / biotin, bungarotoxin / BTX tag, cadaverine / the PKPQQFM protein sequence, the aziridine / the TCGA nucleic sequence.
  • the labeling techniques mentioned above sometimes involve passing the cell membrane to compounds that are not naturally lipophilic and do not naturally enter the cell. These compounds or their conjugates with substrates, tags, or members of a pair of binding partners as described above can be introduced into the cell using, for example, one of the following techniques: :
  • esters which mask the charged groups during the passage of the lipid bilayer fall into the category of compounds named pro-drugs and refer to compounds that are rapidly transformed in vivo to give the "parent" compound following hydrolysis under conditions physiological.
  • examples include mainly pivaloyloxymethyl, acetoxymethyl and glycol esters [Nielsen and Bundgaard, Int. J. of Pharmacy. 39 (1984) 75-85].
  • this technique is used, one of these groups is grafted covalently on the fluorophore.
  • viral peptides grafted covalently to the fluorophore some of these peptides make it possible to convey the fluorophore through the cell membrane.
  • viral peptides include the analogues of "penetratin” and "transportan” [Langel et al. Bioconj. Chem. (2000), 11, 619-626], poly-Arginines [Wender et al. Arginine-based molecular transporters. Org. Lett. (2003), 5 (19), 3459-3462], or peptoids, peptides analogs carrying guanidine groups [The design, synthesis, and evaluation of molecules that enable or enhance cellular uptake: peptoid molecular transporters.
  • At least one fluorescent compound has a pattern enabling it to cross the plasma membrane, this pattern being selected from the following groups; esters such as valvaloyloxymethyl ester, acetoxymethyl ester, or glycol esters; viral peptides supported by membrane transporters, such as penetratin and its like, transport it! and its analogs, polyarginine groups, peptoids bearing guanidine groups, such as oligoguanidinium groups; cholesterol groups, vitamin E or aliphatic chains, such as undecyl or 1,2-di-O-hexadecylglycerol chains.
  • esters such as valvaloyloxymethyl ester, acetoxymethyl ester, or glycol esters
  • viral peptides supported by membrane transporters such as penetratin and its like, transport it! and its analogs
  • polyarginine groups such as peptoids bearing guanidine groups, such as oligoguanidinium groups
  • cholesterol groups vitamin E or aliphatic chains,
  • At least two TR-FRET partner fluorescent compounds include such motifs allowing them to cross the plasma membrane.
  • the fluorescent compound can be bonded to the substrate of the suicide enzyme and at the same time generate on said fluorescent compound a reactive chemical function, such as, in particular, an amine or acid function which subsequently makes it possible to couple onto said fluorescent compound a motif allowing him to cross the plasma membrane.
  • a reactive chemical function such as, in particular, an amine or acid function which subsequently makes it possible to couple onto said fluorescent compound a motif allowing him to cross the plasma membrane.
  • FIGS. 7 and 8 illustrate the synthesis of a conjugate between a fluorescent compound, the compound DY647 (from the DYOMICS Company) and the substrate of a suicide enzyme (substrate of the "SnapTag” enzyme), namely benzylguanine on which an amine functional group has been added and the introduction of a reactive chemical function on said fluorescent compound (this conjugate is hereinafter referred to as "tripod").
  • a suicide enzyme substrate of the "SnapTag” enzyme
  • the tripode with an NH 2 function will integrate the vector systems having a COOH function and that with a COOH function will integrate the vector systems having an NH 2 function.
  • kit of components comprising the reagents for implementing the method for detecting interactions between bio-molecules, translocation or change of conformation of bio -molecules in living cells according to the invention.
  • This kit includes:
  • first fluorescent compound and a second fluorescent compound these compounds being partners of TR-FRET and at least one of these compounds having a motif enabling it to cross the plasma membrane;
  • live cells comprising said bio-molecules; means for labeling the biomolecules with the fluorescent compounds;
  • the reagents present in this kit allow the labeling of the biomolecules to be studied present in the living cell by the fluorescent compounds partnering with TR-FRET; in practice, this means that the fluorescent compound and the bio-molecule are coupled, respectively, with the members of the pairs chosen from: a SNAP-Tag substrate such as benzylguanine / SNAP-Tag enzyme, a HALO-substrate; Tag such as a chloroalkane / HALO-Tag enzyme, a part of intein such as the internal of Ssp DnaE / the complementary intein part allowing to reconstitute a functional intein, a bi-arsenic motif / the Cys sequence -Cys-XX-Cys-Cys, X representing any amino acid, metal ion / poly-histidine sequence, biotin / streptavidin, streptavidin / biotin, bungarotoxin / BTX tag, cadaverine /
  • At least one of the fluorescent compounds furthermore comprises a motif enabling it to cross the plasma membrane, and this unit is chosen from the following compounds: esters such as pivaloyloxymethyl ester, acetoxymethyl ester, or glycol esters; viral peptides supported by membrane transporters such as penetratin and analogues thereof, transanan and analogues thereof, polyarginine groups, peptoids bearing guanidine groups; cholesterol groups, vitamin E or aliphatic chains such as undecyl or 1,2-di-O-hexadecyl-glycerol chains.
  • esters such as pivaloyloxymethyl ester, acetoxymethyl ester, or glycol esters
  • viral peptides supported by membrane transporters such as penetratin and analogues thereof, transanan and analogues thereof, polyarginine groups, peptoids bearing guanidine groups
  • cholesterol groups vitamin E or aliphatic chains such as undecyl or 1,2-di-O
  • the living cells included in this kit may be genetically modified so as to express bio-molecules whose interaction we wish to study, these modifications make use of conventional molecular biology techniques well known to those skilled in the art, such as transfectomy.
  • stable or transient cells by plasmids expressing the bio-molecules, or fusion proteins comprising the bio-molecules of interest.
  • the fluorophore partners of TR-FRET present in the kit according to the invention are a long-lived fluorescent compound and at least one fluorescent compound chosen from the following: fluorescent proteins such as the protein green fluorescent (GFP) and its derivatives (in particular CFP, YFP), or fluorescent compounds having a lifetime of less than 100 nanoseconds, such as cyanines, rhodamines, fluoresceins, squarenes and fluorescent molecules known under the name of BODIPY's (difluorobora-diaza indacenes), the compounds known under the name AlexaFluor, the fluorescent proteins extracted from corals, the phycobiliproteins, such as B-phycoerythrin, R-phycoerythrin, C-phycocyanin, allophycocyanins, in particular those known as XL665.
  • fluorescent proteins such as the protein green fluorescent (GFP) and its derivatives (in particular CFP, YFP), or fluorescent compounds having a lifetime of less than 100 nanoseconds, such as
  • the long-lived fluorescent compound has a lifetime greater than 100 ns and even more preferably is a rare earth chelate or cryptate.
  • the rare earth is terbium or europium.
  • Protein kinases C are proteins belonging to a group of serine / threonine kinases dependent on phospholipids. These proteins play a large role in many cell signaling pathways.
  • Physiologically PKC- ⁇ is activated in a calcium-dependent manner by phosphodiesterines (PS) and binds diacylglycerol (DAG), but PKC- ⁇ can be activated independently of the presence of DAG by phorbol esters inducing tumors (PMA).
  • PS phosphodiesterines
  • DAG diacylglycerol
  • PMA phorbol esters inducing tumors
  • PKC- ⁇ undergoes translation from the cytoplasm to the plasma membrane, this translocation can be measured using a fusion protein with GFP after stimulation with PMA (Sakai NJ CeII Bio (1997) 139 , 1465-1476).
  • a fusion protein between PKC- ⁇ and a suicide enzyme, named HaloTag, was created to label PKC- ⁇ with an acceptor fluorescent organic compound and a tool was developed to specifically label the plasma membrane. with a donor fluorescent organic compound that can enter FRET with the labeled PKC- ⁇ .
  • the plasma membrane is specifically labeled with a suicide enzyme, named SnapTag fused to a Cys-Ala-Ala-X sequence (X is any amino acid) which is a recognition sequence for post-translational modification enzymes. This sequence will cause the grafting of a C-terminal farnesyl group of the Snaptag enzyme, which results in the addressing and anchoring of this enzyme on the inner sheet of the plasma membrane.
  • COS-7 cells were transiently transfected with both plasmid constructs with pofectamine 2000 or by electroporation.
  • the cells are incubated for 1 hour with cell medium containing 5 ⁇ M of each specific substrate of the enzymes HaloTag and SnapTag, each of the substrates carrying the fluorescent organic molecules forming FRET.
  • the translocation is measured by TR-FRET after induction by different stimulations, for example after addition of 12-myristate 13-acetate phorbol ester (PIWA).
  • PIWA 12-myristate 13-acetate phorbol ester
  • Potentially inhibitory molecules of the PKC- ⁇ translocation pathway can be added to the culture medium to test their effects on stimulation of transitization.
  • Example 2 Demonstration of Androgen Receptor-Coactivator or Orroqene-Correpressor Receptor Interactions. (see block diagram figure 2)
  • Androgens and their functional receptor are responsible for the normal differentiation of the external male phenotype.
  • the cytosolic androgen receptors in the inactive state, are associated with chaperone proteins (known by the English name “heat shock proteins”). After binding with the ligand, the receptors dimerize and are translocated to the nucleus.
  • the coregulators (coactivators or corepressors) of the AR will then interact or not with the receptor and the result of these interactions will eventually cause the binding of the complex to the DNA at the level of a specific sequence (called ARE for "androgen receptor responsive element ”) and thus regulate transcription.
  • the method according to the invention is used to highlight the interactions between a corepressor, a coactivator, and an AR.
  • expression vectors are introduced into the cell in order to express in the intracellular medium:
  • the suicide enzyme Snaptag allows coupling with a fluorescent compound labeled with a snaptag substrate.
  • HDAC1 histone acetyltransferase 1
  • RA RA-binding protein 1
  • suicide halotag enzyme allows coupling with a fluorescent compound labeled with a halotag substrate.
  • P160 is a coactivator of likely to fix on AR.
  • the intein fragment allows coupling with a fluorescent compound comprising the complementary intein fragment by protein trans-splicing.
  • the AR When the AR is localized in the nucleus after stimulation (binding of its ligand), one can assay its final effect by measuring the TR-FRET signal; the AR is labeled with the donor fluorescent compound and the coactivator and the corepressor with two acceptor fluorescent compounds which are quite distinct in their spectral properties, and whose emission wavelength following a transfer of energy is respectively
  • TR-FREET signal at 665 nm will therefore be representative of the binding of the AR with its coactivator, whereas the measurement of a TR-FREET at 780 nm will be significant of an AR-corepressor interaction.
  • This test format thus allows the detection of two types of interaction in a single cellular test.
  • This multi-detection assay can be further enhanced by the addition of other fluorescent acceptor compounds to simultaneously reveal other interactions.
  • Bio-sensor cAMP Detection of conformational changes of a fusion protein comprising a TAMPc binding domain (See Schematic diagram, Fig. 31)
  • the variations of the TR-FREET signal of a pair of fluorescent donor / acceptor compounds are measured by coupling these fluorophores to a cAMP binding domain (for example that of the regulatory subunit ⁇ 11 of the PKA , that of the exchange proteins activated by cAMP) known by the term of CAMPS.
  • a cAMP binding domain for example that of the regulatory subunit ⁇ 11 of the PKA , that of the exchange proteins activated by cAMP
  • GPCR G protein-coupled receptor
  • the plasmid encoding a SNAP-tag / CAMPS / Halo-tag fusion protein is transfected into HEK cells. 24 hours or 48 hours after transfection, cells are incubated (1 hour at 37 ° C) with SNAP-Tag and HALO-Tag substrates, each coupled to a member of a TR-FREH donor / acceptor pair "
  • the fluorophores are covalently coupled via the suicide reactions of the SNAP-Tag and HALO-Tag enzymes, and the CAMPS protein is labeled by the pair of fluorophores involved in TR-FRET. .
  • a TR-FRET signal is measured because of the proximity of the fluorophores.
  • pharmacological stimulation eg, agonist stimulation of a Gs protein-coupled receptor expressed in HEK cells
  • intracellular cAMP concentration will increase and cAMP binding to CAMPS will cause a conformational change in this latter protein.
  • a decrease in the measured TR-FRET signal is then observed.
  • This example shows that the amplitude of the TR-FRET signal is directly correlated to the binding of the cAMP to the CAMPS protein.
  • the same experiment can be conducted with a GPCR antagonist, which causes a decrease in cAMP concentration in the cell and a conformational change in CAMPS protein that can be detected by measuring an increase in the TR-FRET signal.
  • Example 4 Measurement of the calcineurin / calmodulin interaction (see block diagram FIG. 4)
  • Calcineurin possesses phosphatase activity and plays a fundamental role in the cellular signaling pathway involving intracellular calcium levels.
  • Ca / cineurine is involved in the development and adaptation to stress in mammals, through two classes of transcription factors: NFAT and MEF2.
  • Calcineurin is a heterodimer with two subunits, calcineurin A (CnA) and calcineurin B (CnB).
  • the enzyme is active in its heterodimeric form and the phosphatase activity is stimulated by the formation of a calcineurin-calmodulin complex upon increasing the intracellular calcium concentration.
  • a plasmid encoding a fusion protein comprising the CnA subunit and the HALO-Tag enzyme and a plasmid encoding a fusion protein comprising calmodulin and the SNAP-Tag enzyme are co-transfected into cells using the lipofectamine 2000 or by electroporation. After 24 or 48 hours, the cells are incubated for 1 hour at 37 ° C. in a medium comprising the SNAP-Tag and HALO-Tag enzyme substrates, each coupled to a member of a pair of fluorophores compatible for TR-FRET.
  • the cells After washing, the cells are stimulated pharmacologically or by stress (for example by cyclosporin A, or acidification of the medium).
  • stress for example by cyclosporin A, or acidification of the medium.
  • the amplitude of the measured TR-FRET signal increases and is correlated with the association of the CnA-CnB heterodimer with calmodulin.
  • TNF alpha is a factor of inflammation that causes several cellular responses when bound to its membrane receptor.
  • One of the responses caused by TNF alpha in B cells is the activation of the transcription factor NFkB, which controls the production of antibody light chains - a critical step in the immune response.
  • Inhibitors of TNF alpha are therefore useful for regulating the immune response, and may for example be used in the prevention of septic shock, or as anti-inflammatory drugs.
  • Such inhibitors of TNFalpha activity can be discovered by measuring the activation level of NFkB, which the present invention allows.
  • FIG. 5 illustrates the cytosolic retention of NFkB by the cytosolic protein IkB: the NFkB complex (p65, p50) -IkB is retained in the cytosol.
  • Appropriate stimulation causes IkB phosphoryiation, causes degradation and releases NFkB which can then penetrate the cell nucleus and activate the production of antibody light chains.
  • the method according to the invention is applied by introducing into B lymphocytes by conventional molecular biology techniques the following constructions:
  • a vector expressing a p50-Halotag fusion protein which may be labeled with a fluorescent acceptor compound conjugated to a Halotag substrate.
  • the NFkB complex ( ⁇ 65 / p50) forms a complex with I ⁇ B and a TR-FRFJT signal can be measured.
  • TNFalpha After stimulation of the cells by TNFalpha, the phosphoryiation of I ⁇ B and its dissociation of the complex will cause a decrease of the TR-FREET signal. The magnitude of this decrease is representative of the degree of activation of NFkB.
  • This example illustrates the application of the method according to the invention to the screening of drugs and is particularly suitable for so-called high throughput screening.
  • Cells are seeded in LABTEK culture chambers [density 80 000c / ml], cultured for 24 hours and then washed with culture medium.
  • the europium chelate of formula below is added to the culture medium (concentration 20 .mu.m) and the cells are incubated for 24 hours at 37.degree.
  • Hoechst stain 33342 [concentration 2 ⁇ g / ml; supplier reference: Sigma Aldrich B2261] is added to the culture chambers, which are then incubated for 15 min. protected from light at room temperature. This dye has the property of specifically labeling the cell nuclei.
  • the culture chambers are washed again with culture medium before proceeding with the acquisition of images by microscopy, in "time resolved” mode, with the following equipment: an Axiovert 200M microscope (Zeiss), a source of UV excitation: a pulsed nitrogen laser (Spectra Physics) and a Pi-Max intensified CCD (charge coupled device) camera (Roper Scientific), with the following parameters:
  • the image in transmission makes it possible to ensure the integrity of the cells and the density of the cellular mat.
  • the image Hoechst allows to locate the cellular nuclei.
  • the negative control shows the signal obtained in time-resolved detection mode in the absence of fluorescent compound.
  • the image obtained with the donor fluorescent compound tested at a concentration of 20 ⁇ M (FIG. 1) makes it possible to demonstrate an intracellular localization of the FRET donor compound.
  • the superposition of the images (2) and (1) shows that the fluorescence is localized in the cell.
  • This type of time-resolved measurement can be quantified by designating regions of interest on signal and noise areas, and subtracting the average value of the noise from the measured signal value.
  • This example shows that a rare earth chelate capable of crossing the plasma membrane can be used to implement the invention, and that the signal emitted by such a compound can be measured by time-resolved microscopy.
  • CHO cells are cultured at 37 ° C. under a controlled atmosphere at 5% CO 2 in F-12 HAM medium (Invitrogen) + 10% fetal calf serum (FCS) previously inactivated for 20 min at 60 ° C.
  • F-12 HAM medium Invitrogen
  • FCS fetal calf serum
  • the cells are dissociated and seeded in LABTECK culture chambers (Nunc) at a density of 75,000 cells / well.
  • the test compounds (BG-DY647 or Dy647-R9-BG) are prepared in culture medium at a concentration of 5 ⁇ M and placed in contact for one hour with the cells.
  • the microscopic analysis is carried out using an Axiovert 200M (Zeiss) epifluorescence microscope, objective 40 X, a source of UV excitation; a pulsed nitrogen laser (Spectra Physics) and a CooISNAP CCD camera (Photometrics).
  • Axiovert 200M Zeiss epifluorescence microscope
  • objective 40 X a source of UV excitation
  • pulsed nitrogen laser Spectra Physics
  • CooISNAP CCD camera Photometrics
  • Figure 11 shows the images obtained with either the BG-DY647 conjugate or the DY647-R9-BG conjugate. It is found that the DY647-R9-BG conjugate is located in the cells while the BG-DY647 conjugate remains in solution in the culture medium.
  • a compound such as DY647-R9-BG can therefore be used in the method according to the invention, especially as an acceptor conjugate capable of crossing the plasma membrane to label an intracellular protein comprising the SnapTag enzyme,
  • CHO cells are cultured at 37 0 C, under a controlled atmosphere of 5% COi medium HAM F-12 (Invitrogen) + 10% fetal calf serum (FCS) previously inactivated 20 min at 60 0 C. The day before experiment, CHO-M1 cells are seeded in a plate 96 well at the density of 10,000 cells per well.
  • COi medium HAM F-12 (Invitrogen) + 10% fetal calf serum (FCS) previously inactivated 20 min at 60 0 C.
  • FCS fetal calf serum
  • the culture medium is aspirated and replaced by the test compounds at a concentration of 2.5 ⁇ M or 5 ⁇ M in KREBS buffer (Sigma).
  • the cells are then lysed in PBS buffer + 0.1% Triton X100.
  • the fluorescence is measured on a reader of the Analyst AD (UL, Molecular Devices) type with the filters and the dichroic suitable for the spectral specificities of the compound to be detected.
  • Emission filter 535/35 nm bandwidth
  • Example for a compound carrying a rare earth complex Excitation filter: 330/80 nm bandwidth Dichroic: BBUV Emission filter: 620/10 nm bandwidth
  • the tetraguanidinium-fluorescein derivative a tetraguanidinium sequence (as described by Femandez-Cameado J. et al, X Am Chem Soc 2005, 127, 869-874) was grafted onto the carboxyfluorescein structure
  • the fluorescence intensity measured for each of the compounds (FIG. 13) according to the above protocol shows that the poly arginine and tetraguanidinium sequences can be used to introduce into the cell one of the FRET partners, and therefore as a pattern allowing one of FRET's partners to cross the cell membrane.
  • Example 9 Example of Constitutive Intracellular TR-FRlT (Chameleon HaloTaq-S ⁇ apTaq)
  • the method according to the invention is used to highlight a FRET signal in a living cell.
  • an expression vector is introduced into the cell in order to express in the intracellular medium a fusion protein composed of SnapTag and HaloTag.
  • the suicide enzyme SnapTag allows coupling with a fluorescent compound labeled with a SnapTag substrate (benzylguanine).
  • the suicide enzyme Halo-tag allows coupling with a fluorescent compound labeled with a substrate of the Halo-tag (a chloroalkane).
  • the pHT2 plasmid carrying the HafoTag sequence is from Promega.
  • the plasmid pSem-Sl-ST26m carrying the SnapTag sequence comes from the company
  • the cassette corresponding to the coding sequence of HaloTag is isolated from the plasmid pHT2 by enzymatic digestion EcoRV-Not I (Biolabs) and transferred into the plasmid pCDNA3.1 (Invitrogen) previously digested with the same enzymes.
  • the ligation is done by T4 ligase (Invitrogen).
  • the ligating product is transformed into chemocompetent Turbo celis bacteria (GenetherapySystem).
  • the transformed bacteria are spread on LB-Agar medium (Sigma) + 0.1 mg / ml of ampicillin (Eurogentec) allowing the selection of bacteria possessing the plasmid pCDNA3.1Halo-Tag.
  • the plasmid DNA is obtained by column purification (QIAGEN). The integrity of the sequence is verified by sequencing.
  • the cassette corresponding to the coding sequence of SnapTag is isolated from pSEM-Sl-
  • Ligation is by T4 Ligase (Invitrogen). The ligation product is transformed into chem / ocompetent bacteria Turbo cells (GenetherapySystem).
  • the transformed bacteria are spread on one of LB-Agar medium (Sigma) + 0.1 mg / ml of ampicillin (Eurogentec) allowing the selection of bacteria possessing the plasmid pBfescriptKS-ST26m. Plasmid DNA is obtained by column purification
  • the plasmid making it possible to obtain the coding sequence of the SnapTag-HaloTag fusion protein is obtained by transferring the cassette corresponding to the sequence of SnapTag, isolated by digestion of the plasmid pBlescrIptKS-ST26m with XbaI-Kpnel (Biolabs), into the plasmid pCDNA3 .1Haio-Tag previously digested by Nhel-Kpnel.
  • the plasmid DNA corresponding to plasmid pB) escriptKS-ST26m-HaloTag is obtained by column purification (QIAGEN). ). The integrity of the sequence is verified by sequencing.
  • Cos-7 cells are transiently transfected with the plasmid construct pBlescriptKS-ST26m-HaloTag with lipofectamine 2000 or by 96 well plate electroporation. 24 h or 48 h after the transient transfection, the COS-7 cells are incubated for 1 hour with cell medium containing 5 ⁇ M of each specific substrate of the enzymes HaloTag and SnapTag, each of the substrates being covalently bound to a member of a couple of FREET partners and a pattern allowing it to cross the plasma membrane (manufactured for example according to the diagram of Figures 7 or 8).
  • Example 10 Example of Induced Intracellular TR-FRET (FRB-FKBP)
  • the method according to the invention is here applied to the demonstration of the interaction of the intracellular proteins FKBP12 and the FRB domain of the FRAP protein when rapamycin is added to the culture medium.
  • FKBP12 is a 12 kDa protein that belongs to the family of immunophilins. Rapamycin binding to FKBP12 renders the protein cytosoluble by dissociating FKBP from these partners.
  • the FRAP (or mTOR) protein contains the FRB domain: this domain is composed of 99 amino acids (corresponding to the mTOR sequence E2015 - Q 2114),
  • Rapamycin is a molecule isolated from a bacterium Streptomyces hygroscopicus and commercially available. Rapamycin occupies two distinct hydrophobic pockets, one on FKBP and one on FRB, it binds both proteins at the same time.
  • the PCR is made with Phosponase polymerase (Finnzyme) at a hybridization temperature of 72 ° C.
  • the PCR product is digested with the enzymes NcoI-PstI, 1 h at 37 ° C, the enzymes are then inactivated at 80 0 C for 20 min.
  • the plasmid pBAD-ST26-FRB supplied by Covaiys is digested with Ncol and
  • the ligation is made by T4 ligase (Invitrogen).
  • the ligation product is transformed into chemiocompetent bacteria Turbo cells
  • Agar Sigma + 0.1 mg / ml ampicillin (Eurogentec) allowing the selection of bacteria with plasmid.
  • the plasmid obtained pBAD-HT-FRB is purified on a column (QIAGEN) and controlled by sequencing.
  • HT HT-FRB is amplified by PCR from the pBAD-HT-FRB template with the following primers:
  • ERV-Nco-HT-s primer 5 'gcggatatcgccaccatgggatcc 3'
  • Primer pBAD rev 5 'gttctgatttaatctgtatca 3'
  • the PCR is made with the Phusion polymerase (Finnzyme) at a hybridization temperature of 72 ° C.
  • the PCR product is digested with the enzymes EcoRV-AscI, 1 h at 37 0 C, the enzymes are then inactivated at 65 0 C for 20 min.
  • the digested PCR product is transferred into a pSEM-XT cell expression plasmid (cova (ys) digested with EcoRV and AscI.
  • the ligation is made by T4 Legase (Invitrogen).
  • the ligation product is transformed into chemiocompetent bacteria Turbo cells (GenetherapySystem).
  • the transformed bacteria are plated on LB-Agar medium (Sigma) + 0.1 mg / ml of ampicillin (Eurogentec) allowing the selection of the bacteria possessing the plasmid.
  • L 1 plasmid DNA is obtained by purification on column (QIAGEN). ). The integrity of the sequence is verified by sequencing.
  • the cassette corresponding to the coding sequence of the FKBP protein is isolated from the plasmid pBAD-ST-FKBP (Covalys) by PstI-AscI digestion, and transferred into a cell expression plasmid pSEMXT-26 (covalys).
  • the ligation is made by T4 ligase (Invitrogen).
  • the ligation product is transformed into chemiocompetent bacteria Turbo cells (GenetherapySystem).
  • the transformed bacteria are plated on LB-Agar medium (Sigma) + 0.1 mg / ml of ampicillin (Eurogentec) allowing the selection of the bacteria possessing the plasmid.
  • the plasmid DNA is obtained by column purification (QIAGEN). ). The integrity of the sequence is verified by sequencing.
  • Cos-7 cells are transiently transfected with the two plasmid constructs (Halo-Tag-FRB and SNAP-Tag-FKBP) with lipofectamine 2000 or by 96-well plate electroporation at a cell concentration of 10,000 cells per well. .
  • the COS-7 cells are incubated for 1 hour with cell medium containing 5 ⁇ M of each specific substrate of the enzymes HaloTag and SnapTag, each of the substrates being covalently bound to a member of a couple FRET partners and a pattern allowing it to cross the plasma membrane (manufactured for example according to the diagram of Figures 7 and 8).
  • This example shows that the method according to the invention makes it possible to demonstrate a biological interaction in a living cell by means of the TR-FRET technique.

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Abstract

La présente invention concerne une méthode non microscopique, quantitative, de détection d'interactions intracellulaires entre bio-molécules, sur cellules vivantes, en réponse à une stimulation biologique ou pharmacologique, par effet de transfert d'énergie de proximité en temps résolu entre deux membres d'un couple donneur/accepteur de fluorescence. Applications : criblage à haut débit de molécules et détection des voies de signalisation intracellulaire

Description

Méthode de détection d'interaction intracellulaire entre bio-molécules
La présente invention concerne une méthode non microscopique, quantitative, de détection d'interactions intracellulaires entre bio-molécules, sur cellules vivantes, en réponse à une stimulation biologique ou pharmacologique, par effet de transfert d'énergie de proximité en temps résolu entre deux membres d'un couple donneur/accepteur de fluorescence et ses applications telles que notamment le criblage à haut débit de molécules et la détection des voies de signalisation intracellulaire.
Domaine technique et art antérieur
Les molécules à activité pharmacologique (médicaments par exemple) agissent sur des cibles moléculaires localisées soit à la membrane plasmique soit à l'intérieur même des cellules vivantes. La sélection et l'optimisation de molécules candidates dans les processus de recherche au sein des industries pharmaceutiques nécessite de déterminer leurs actions moléculaires et, dans la mesure du possible, dans un environnement natif afin d'intégrer les modulations éventuellement apportées par des interactions entre différents partenaires. D'un point de vue plus fondamental, dans les conditions physiologiques ou pathologiques, il est important de disposer de modèles cellulaires où les interactions directes entre bio-molécules impliquées dans des voies de signalisation intracellulaire, peuvent être facilement étudiées, caractérisées et quantifiées [voir par exemple Takesono et al. Journal of CeII Sciences, 115, 3039-3048, (2002)]. Cette volonté de compréhension de mécanismes d'action en condition native explique pourquoi de plus en plus d'essais sur cellules sont utilisés dans les criblages primaires de molécules. Mais à l'heure actuelle, les techniques de criblage à haut débit permettent de détecter principalement les produits finaux des événements biologiques, tels que la production de seconds messagers. Dans ce cas, les cellules doivent être lysées pour permettre l'accès à la molécule cible intracellulaire qu'il faut doser. Très peu d'observations cinétiques sont actuellement possibles et les événements rares sont facilement non détectés. De nouvelles approches utilisant les techniques de microscopie ou d'imagerie sur cellules vivantes permettent d'avoir accès aux paramètres dynamiques et cinétiques d'une ou plusieurs bio-molécules d'intérêt dans leur environnement natif, en réponse à une stimulation. Ces techniques sont basées sur les études de mouvements de ces bio-molécules en réponse à un stimulus. L'analyse de ces déplacements fait appel à un traitement des images qui donnent accès, a posteriori et par des méthodes indirectes, à des valeurs arbitraires qui permettent de quantifier les événements biologiques considérés.
Ces techniques de microscopîe consistent à déterminer la localisation d'une cible moléculaire et le suivi d'éventuels changements de localisation. Pour ces approches, la cible moléculaire est généralement fusionnée à une protéine fluorescente pouvant être de la famille des GFP. De telles techniques de visualisation directe à l'intérieur d'une cellule sont réalisées à l'aide d'un microscope à fluorescence classique, de microscopes cofocaux ou de nouvelles plates-formes intégrant la microscopie et l'acquisition d'image. De telles plates-formes sont, par exemple, utilisées dans la technologie TRANSFLUOR (Molecular Devices) ou sur des instruments tels que OPERA (Evotech Technologies) ou In CeII analyser (GE Healthcare) (voir revue de John Comley, DDW, summer 2005, pp 31-53).
De nombreux désavantages limitent toutefois l'utilisation de telles technologies :
- Les études microscopiques sont délicates, difficilement automatisables et elles nécessitent des outils complexes d'analyse d'image, des logiciels spécifiques et des utilisateurs très expérimentés et elles nécessitent beaucoup de temps.
- L'analyse des images est compliquée, souvent source d'erreurs et ces technologies sont difficilement reproductibles et peu fiables (faible valeur de paramètre ZQ.
- Elles permettent le suivi d'événements biologiques dans des cellules vivantes avec un débit moyen de criblage de molécules limitant leur utilisation dans les étapes de criblage primaire.
- Les effets visualisés sont généralement en aval de la cascade de signalisation. C'est pour ces principales raisons que ces techniques ne sont pas compatibles avec un criblage de molécules à haut débit.
Outre ces aspects, ces technologies servent à qualifier un ou plusieurs événements cellulaires, qui découlent le plus souvent d'une cascade d'événements antérieurs, ce qui donne un accès indirect à l'événement que l'on souhaite mesurer. De plus, ces techniques ne permettent pas de donner directement des informations sur les interactions entre bio-molécules ou sur les changements de conformation au sein d'une même molécule qui sont tous deux des indicateurs directs de l'événement biologique que l'on souhaite détecter et quantifier. Actuellement les technologies intracellulaires permettant de caractériser les interactions entre bio-molécules ou les changements de conformation au sein d'une même bio-molécule, tous deux témoins d'événements biologiques, sont basées sur la technologie de transfert d'énergie (FRET) entre différentes protéines fluorescentes telles que la protéine fluorescente verte (GFP) et ses différents mutants. A titre d'exemple, deux variants protéiques de la GFP (CFP et YFP) forment une paire compatible pour établir un FRET. Elles peuvent être fusionnées avec les protéines cibles d'intérêt et être exprimées dans les cellules vivantes. De nombreux événements d'interaction ou de changements de conformation entre protéines ainsi marquées ont été détectés en utilisant un procédé de FRET (voir Janetopoulos et al. SCIENCE (2001) 291 : 2408-2411, Vilardaga et al. NATURE BIOTECH. (2003) 21 : 807-812 et WO 2004 057333 Al).
Les deux variants de la GFP (CFP et YFP) peuvent être également exprimés dans les cellules vivantes en fusion avec une seule et même protéine cible. Cette biomolécule, doublement fusionnée avec les deux variants de la GFP, est définie comme bïo-senseur. Un bio-senseur est capable d'adopter différentes conformations en fonction des changements d'environnement biologique, ces changements de conformation pouvant être suivis par un procédé de FRET. De telles bio-molécules peuvent être utilisées dans le suivi de nombreux événements cellulaires comme la production de cAMP, d'IP3 ou cGMP (voir Nikolaev et al., JBC, vol. 279, N°36, pp. 37215-37218, 2004 , Tanimura et al. JBC, vol. 279, N°37, pp. 38095-38098, 2004 et le brevet US 6.924.119 B2).
Toutefois, l'utilisation de ces protéines fluorescentes présente certains désavantages majeurs;
- Les spectres de recouvrement des deux molécules fluorescentes (CFP et YFP) sont larges et ils entraînent une forte excitation parasite de l'accepteur (YFP) dans les longueurs d'ondes utilisées pour exciter le donneur (CFP). Cette contamination parasite induit un fort bruit de fond qui réduit le rapport signal sur bruit à une valeur inférieure à 1.5. De si faibles différences de modulation empêchent une utilisation confortable de ces techniques en criblage de molécule à haut débit.
- Aux longueurs d'ondes utilisées pour la détection du FRET avec ces protéines fluorescentes, une auto-fluorescence intrinsèque aux cellules perturbe la lecture de FRET. - Des analyses microscopiques peuvent être nécessaires pour révéler des changements subtils en signaux de FRET. De telles analyses présentent alors les mêmes inconvénients que ceux décrits ci-dessus pour la première approche de détection.
- La limitation du nombre de variants de la GFP restreint l'utilisation de telles protéines à des applications où les changements de proximité sont en accord avec le rayon de Fôrster (Ro) de la paire CFP/YFP.
- Ces protéines sont fusionnées avec les protéines cibles. La fluorescence de ces protéines est détectée dès que la cellule l'exprime et ne peut être déclenchée ou contrôlée par l'expérimentateur sans mettre en place des systèmes d'expression beaucoup plus complexes.
Une alternative au FRET utilisant la GFP ou ses variants, qui peut être contrôlée par l'expérimentateur, est l'utilisation d'une molécule qui génère de la bioluminescence, on parle alors de BRET. Un processus de BRET peut avoir lieu, dans des cellules vivantes, entre des protéines marquées respectivement à la luciférase et à la GFP. Plusieurs interactions protéiques intracellulaires ont pu être mesurées en fusionnant la luciférase à l'un des partenaires et la GFP à l'autre (voir Milligan G Eur J Pharm Sci. 2004 Mar;21(4):397-405, Boute N et al. Trends Pharmacol Sci. 2002 Aug; 23(8)351-4 et Trugnan G. et al. Med Sci (Paris). 2004 Nov; 20(11); 1027-34.). Le processus de transfert d'énergie est initié lorsque le substrat de l'enzyme luciférase est apportée dans la préparation cellulaire à tester. La luciférase produit une lumière qui, dans le cas d'une interaction protéique permettant une proche proximité entre les deux partenaires, excite la GFP. Le signal de fluorescence émis par la GFP est alors mesuré.
Tout comme pour le couple CFP-YFP, de nombreux désavantages limitent l'utilisation du couple Luciférase-GFP en criblage au haut débit (HTS) :
- Le rapport signal/bruit des essais BRET est assez faible.
- Le signal de fluorescence peut être facilement masqué par une autofluorescence des produits testés. La technologie BRET n'est pas assez robuste pour un criblage de molécules du fait de la faible stabilité du signal dans le temps qui laisse une fenêtre de lecture très courte, peu compatible avec le criblage à haut débit de molécules.
Une autre série de technologies permettant d'étudier les interactions entre biomolécules consiste à utiliser un processus de complémentation fonctionnelle. Les bio- molécules d'intérêt sont fusionnées avec 2 fragments inactifs d'une 3eme protéine. Lorsque l'interaction directe entre les bio-molécules d'intérêt intervient, les 2 fragments înactifs de la 3eme protéine reconstituent alors, par interaction directe ou par un processus plus complexe d'épissage protéique, une 3eme protéine fonctionnelle dont l'activité peut être mesurée. Cette protéine, dont l'activité a été restaurée par l'interaction entre les bio-molécules d'intérêt, peut être une luciférase ; on mesure dans ce cas un signal de luminescence, une protéine fluorescente telle que la GFP (voir Ozawa T, Current Opinion in Chemical Biology, 2001, N°5, pp578-583 pour revue) ou une enzyme telle que la β-galactosidase dont on mesure l'activité enzymatique par méthode colorimétrique (voir Eglen R, ASSAY and Drug Develop. Technologies, 2002, vol. 1, pp 97-104) et la méthode Path Hunter® de DISCOVER.
L'inconvénient principal de ces approches utilisant la complémentation fonctionnelle réside dans le fait que la mesure d'interaction entre bio-molécules est dépendante d'une parfaite reconstitution de la 3eme protéine sous sa forme active, telle que la β-galactosidase et nécessite parfois un déplacement du complexe d'interaction dans un compartiment cellulaire autre que celui où interagissent normalement les biomolécules. Enfin, il s'agit d'une méthode indirecte de caractérisation d'une interaction entre bio-molécules d'intérêt où la mesure d'une activité enzymatique rend compte de l'interaction. L'utilisation de la complémentation fonctionnelle est plus complexe à mettre en œuvre dans le cas d'une bio-molécule unique du type bio-senseur.
En fonction des propriétés intrinsèques des protéines mises œuvre dans ces processus de transfert d'énergie, les technologies utilisant des protéines fluorescentes telles que la GFP (ou ses autres variants) ou des protéines bio-luminescentes telle que la lucîférase, ne permettent pas d'avoir une grande flexibilité dans le choix du couple donneur/accepteur impliqué dans le processus de transfert d'énergie.
L'utilisation de molécules fluorescentes particulières, appelées "QuantumDots", offre un nombre de couples donneur/accepteur possible beaucoup plus large, permet de travailler sur une gamme de longueur d'ondes d'excitation plus important et permet, en combinant différents couples, de mesurer de façon concomitante différentes interactions entre bio-molécules (approche multiplex). Cependant, il est difficile de marquer spécifiquement les bio-molécules par ces composés dans la cellule.
L'utilisation de molécules organiques fluorescentes pour des applications en FRET intracellulaire a par exemple été décrite pour visualiser des ARN messagers dans les cellules vivantes. L'interaction mise en œuvre dans ce cas repose sur un appartement entre l'ARN messager cible et des séquences d'oligonucléotides anti-sens marqués avec des molécules organiques fluorescentes (voir Dirks et al. 2003, METHODS, Jan 29, N°l, pp 51-57 et Tsuji et al. Bîophys J. 2001 JuI; 81(l):501-15). L'information obtenue dans ce cas n'est pas quantitative puisqu'elle fait appel à une détection en microscopie. Par ailleurs, elle ne qualifie en rien une interaction entre deux bio-molécules d'intérêt et sert uniquement à révéler la présence d'un ARN messager d'intérêt.
Il existe dans la communauté scientifique un réel besoin de nouveaux outils et procédés permettant d'étudier les phénomènes biologiques dans des cellules vivantes, tout en s'affranchissant des inconvénients liés à l'utilisation des techniques connues.
DESCRIPTION DE L'INVENTION
La présente méthode d'analyse quantitative et directe d'interactions intracellulaires sur cellules vivantes sans l'aide de la microscopie, exploite les propriétés des composés fluorescents à durée de vie longue pour effectuer une détection par FRET en temps résolu (TR-FRET).
Cette technique met en œuvre un premier composé fluorescent donneur à durée de vie longue et un ou plusieurs composés fluorescents accepteurs possédant des caractéristiques spectrales compatibles avec le premier composé fluorescent.
Cette mesure de FRET en temps résolu permet de s'affranchir des problèmes de bruit de fond, d'auto-fluorescence des cellules et éventuellement des molécules à tester par deux voies :
- la longue durée de vie du composé fluorescent, de préférence supérieure à 100 nanosecondes, permet de définir une fenêtre de temps pour réaliser la mesure où les émissions des composés fluorescents à durée de vie courte ne sont pas présentes ;
- la mesure de deux traceurs, dont un comme référence, permet de compenser les effets d'auto-fluorescence résiduelle en utilisant comme lecture le rapport d'émission de fluorescence entre les deux traceurs.
De part sa sensibilité, sa spécificité, sa robustesse et sa résolution moléculaire, le TR-FRET permet dans la méthode de l'invention d'éliminer tous les désavantages des applications FRET entre CFP/YFP ou BRET avec la luciférase et la GFP observés dans les cellules vivantes, notamment ;
- le large choix des composés fluorescents et la lecture en temps résolu permet d'éliminer la forte excitation parasite de l'accepteur dans les longueurs d'ondes utilisées pour exciter le donneur ;
- la lecture en temps résolu permet de supprimer les effets de l'auto- fiuorescenœ des cellules et des produits à tester ;
- l'amplitude des signaux en TR-FRET est plus élevée que celle mesurée avec des techniques de FRET utilisant des colorants/protéines fluorescentes.
La technique de TR-FRET n'a jusqu'à présent jamais été utilisée dans des cellules vivantes. Cela est dû à de nombreux obstacles techniques que la Demanderesse a pu surmonter.
Un des problèmes techniques majeur pour mettre en œuvre cette technique dans une cellule vivante réside dans le fait que la plupart des composés fluorescents sont souvent très hydrophiles et ne traversent pas la membrane plasmique. Un autre problème est lié au fait que ces composés sont sensibles à leur environnement et en particulier leur rendement de fluorescence peut être très affecté dans un milieu biologique. Enfin, la Demanderesse a dû surmonter un autre obstacle afin de marquer des bio-molécules présentes dans la cellule par des composés fluorescents introduits à l'extérieur de la cellule, et ce sans affecter l'intégrité biologique des cellules.
Le procédé de l'invention permet de contourner ces obstacles et fournit donc des moyens efficaces pour étudier des phénomènes biologiques à l'intérieur de cellules vivantes.
Le procédé de l'invention permet la détection et la quantification d'interactions ou de modifications de conformation entre bio-molécules sur cellules vivantes en réponse à une stimulation spécifique.
L'invention concerne un procédé de détection d'interactions entre bio-molécules, de translocation ou de changement de conformation de bio-molécules dans des cellules vivantes, comprenant les étapes suivantes qui consistent à :
1) marquer une première bio-molécule, dans la cellule vivante, avec un premier composé fluorescent possédant une durée de vie de fluorescence longue ;
2) marquer, dans la cellule vivante, au moins une deuxième bio-molécule avec un deuxième composé fluorescent ;
3) soumettre les cellules vivantes à une stimulation spécifique adaptée à la réponse biologique à étudier, en présence ou non d'une librairie de molécules à activité pharmacologique (candidats potentiels pour de futurs médicaments) à tester ; 4) soumettre les cellules vivantes à une source lumineuse ayant une longueur d'onde permettant l'excitation dudït premier composé fluorescent à durée de vie longue ;
5) mesurer l'intensité de la fluorescence émise par lesdits premier et second composés fluorescents, et calculer le rapport entre les intensités de fluorescence dudit premier composé fluorescent et dudît second composé fluorescent, ou mesurer la durée de vie du premier ou du second composé fluorescent ;
6) comparer les signaux mesurés à ceux obtenus avant stimulation des cellules. L'excitation lumineuse des cellules vivantes peut être réalisée par des procédés bien connus de l'homme du métier, tels que par une source laser, des lampes flash ou au Xénon.
Les mesures d'émission, d'intensité et de durée de vie des différents composés fluorescents utilisés dans la méthode de l'invention sont réalisées aux moyens des signaux FRET par des méthodes conventionnelles bien connues de l'homme du métier. Les lecteurs appropriés pour détecter le signal de FRET en temps résolu selon la méthode de l'invention sont du type RUBYstar ou PHERAstar de chez BMG Labtech ou d'autres lecteurs compatibles avec le temps résolu tels que l'ULTRA, l'ULTRA Evolution ou le GENios Pro de chez TECAN ou PAnalyst de chez Molecular Devices. Le calcul du rapport entre la fluorescence du premier composé fluorescent et la fluorescence du second composé fluorescent ou des autres (dans le cadre d'une analyse en multiplexing) s'effectue par une méthode connue par l'homme du métier et décrite notamment dans EP 569 496 Bl.
Les fluorophores utilisés pour marquer les bio-molécules sont des composés fluorescents partenaires de TR-FRET. Selon l'invention, on entend par « composés fluorescents partenaires de TR-FRET », des paires de composés fluorescents dont les spectres de fluorescence se recouvrent partiellement, et dont le donneur est un composé fluorescent à durée de vie longue et l'accepteur est un composé fluorescent à durée de vie plus courte que le donneur. L'homme du métier est à même de sélectionner des couples de composés fluorescents partenaires de TR-FRET pour mettre en œuvre le procédé selon l'invention.
Dans une mise en œuvre alternative du procédé selon l'invention, et dans le cas où l'on souhaite étudier des changements de conformation d'une bio-molécule dans la cellule, les deux composés fluorescents sont utilisés pour marquer une seule et même bio-molécule.
Selon une variante de mise en œuvre, le procédé selon l'invention comporte des étapes additionnelles de marquage de bio-molécules avec d'autres composés fluorescents, ce qui permet d'étudier des phénomènes biologiques plus complexes. Dans ce cas, le système comportera toujours un premier composé fluorescent donneur à durée de vie longue, ainsi que plusieurs autres composés fluorescents accepteurs partenaires de TR-FRET, ce qui permettra de mesurer plusieurs interactions, translocations ou changement de conformation dans une même cellule.
Les bio-molécules
Par bio-molécule, on entend une molécule présente dans un organisme vivant, et en particulier les molécules constituant la structure d'un organisme, celles impliquées dans la production et la transformation d'énergie ou dans la transmission des signaux biologiques. Cette définition englobe les acides nucléiques, les protéines, les sucres, les lipides, les peptides, les oligonucléotides, les intermédiaires métaboliques, les enzymes, les hormones et les neurotransmetteurs.
Les bio-molécules qui peuvent être étudiées à l'aide du procédé selon l'invention sont tous les types de molécules exprimées, grâce à des techniques d'expression hétérologues connues par l'homme du métier, dans des cellules vivantes en culture. Ces bio-molécules peuvent être par exemple, toutes protéines, tous lipides, sucres ou oligo-nucléotides artificiellement produits par les cellules vivantes, comme par exemple les récepteurs membranaires, tels que les récepteurs à tyrosine kinase, les récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés aux protéines G et sous-unités des protéines G hétéro-trimériques, les récepteurs non-membranaires, tels que les récepteurs aux hormones, les canaux ioniques, les transporteurs présents à la membrane (les aquarines, les transporteurs sodium, les transporteurs bicarbonate (HCO3), les pompes ioniques (pompe sodium/potassium), les protéines de la transduction du signal, telles que les protéines G monomériques, les enzymes, telles que les kinases, les phosphatases, les transglutaminases, les hydrolases, les halogénases, les lipases, les transférases, les enzymes du métabolisme, les protéines d'échafaudage, telles que SOS, GRB, 1RS, HSP, les protéines de liaison aux lipides, les protéines contenant des domaines PH, ou FYVE, s'associant à la membrane par ancrage lipidique du type N- myristoylation, S-palmitoylation, S-prénylation géranylgéranylation, les protéines associées aux récepteurs couplés aux protéines G (monomériques ou trimériques) telles les GEFs, GAPs et RGS, les sous-unités des protéines G hétéro-trimériques et les récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés aux protéines G, les protéines adaptatrices telles que les protéines contenant les domaines SH2, SH3, les facteurs de transcription tels c-fos, c-jun, CREB, les protéines mitochondriales (telles que les protéines de la chaîne respiratoire, les cytochromes C, les caspases, le PBR ...), les phospholipides, les protéines nucléaires telles que les polymérases à DNA, les hélicases, les topoisomérases, les protéines de la famille des récepteurs dits "de mort", telles que FAS, les protéines de l'apoptose, telles que celles de la famille de bcl-2, les protéines du cycle cellulaire, telles que les cdk et les cyclines.
Les cellules vivantes
Les cellules vivantes utilisées dans la présente invention sont tous les types de cellules vivantes mises en culture selon des techniques connues par l'homme du métier, comme par exemple, les cellules procaryotes (bactéries), les levures, les lignées de cellules eucaryotes immortalisées, les cellules d'insectes, les cultures primaires, telles que des cultures provenant du sang, de tissus ou d'organes de mammifères. Il est important de souligner que le procédé de l'invention permet de travailler sur des cellules vivantes et de conserver l'intégrité des mécanismes biochimiques intracellulaires : les membranes cellulaires ne sont pas perméabilisées comme c'est le cas dans d'autres procédés de l'état de la technique et les cellules n'ont pas besoin d'être fixées.
Les interactions entre molécules pouvant être mis en évidence par le procédé selon l'invention sont nombreuses et variées et elles sont dépendantes de la nature des bio-molécules utilisées dans ledit procédé. Ces interactions peuvent être, par exemple, les interactions entre le récepteur androgène et l'androgène qui induisent une translocation du récepteur du cytoplasme vers le noyau cellulaire, de la PKC-γ qui subit une translocation après stimulation du cytoplasme vers les lipides composant la membrane plasmique cellulaire, du complexe calcineurine qui nécessite une liaison avec la calmoduline pour être active, de p65/p50, etc.
Les changements de conformation de bio-molécules au sein même de la cellule vivante peuvent avoir lieu dans certaines circonstances de stimulation, ces modifications peuvent être, par exemple, la béta-arrestine, EPAC (protéines liant le cAMP), les facteurs d'échange des petites protéines G monomériques, (GEFs), les canaux ioniques, tels que les canaux K+ dépendants du potentiel à inactivation rapide, etc.
Les composés fluorescents
Plusieurs composés fluorescents, également dénommés fluorophores, sont utilisés dans le procédé de l'invention, le premier de ces composés possède une durée de vie de fluorescence longue et les autres des durées de vie de fluorescence généralement courtes. Dans tous les cas, les composés fluorescents sont des partenaires de TR-FRET.
Les composés fluorescents à durée de vie longue particulièrement appropriés aux fins de l'invention ont de préférence une durée de vie égale ou supérieure à 100 nanosecondes.
Plus précisément ces composés fluorescents appropriés sont des complexes de terre rare, tels que les cryptâtes et les chélates, en particulier les cryptâtes comportant un ou plusieurs motifs pyridine. De tels cryptâtes de terre rare sont décrits par exemple dans les brevets EP 180 492, EP 321 353, EP 601 113 et WO 01/96 877. Les cryptâtes de Terbium (Tb3+) et d'Europium (Eu3+) sont particulièrement appropriés aux fins de la présente invention. Les chélates de terres rares sont décrits notamment dans les brevets US 4 761 481, US 5 032 677, US 5 055 578, US 5 106 957, US 5 116 989, US 4 761 481, US 4 801 722, US 4 794 191, US 4 637 988, US 4 670 572, US 4 837 169, US 4 859 777. D'autres chélates sont composés d'un ligand nonadenté tel que la terpyridîne (EP 403 593, US 5 324 825, US 5 202 423, US 5 316 909).
Un exemple particulier de chélate de terre rare qui convient aux fins de l'invention est le chélate ayant la formule :
La synthèse de ce composé qui peut être utilisé comme membre donneur d'un couple de partenaires de FRET, est décrite par Poole R. et al. Org. Dans Biomol. Chem, 2005, 3, 1013-1024 "Synthesis and characterisation of highly emissive and kinetically stable lanthanide complexes suitable for usage in cellulo". L'exemple 6 ci-après montre que ce type de composé peut être utilisé pour quantifier des signaux en temps résolu dans la cellule.
Les composés fluorescents ayant une durée de vie courte peuvent être sélectionnés parmi les protéines fluorescentes, telles que la protéine fluorescente verte (GFP) et ses dérivés (notamment CFP, YFP), ou des composés fluorescents ayant des durée de vie inférieure à 100 nanosecondes, telles que les cyanines, les rhodamines, les fluorescéines, les squarènes et les molécules fluorescentes connues sous le nom de BODIPY's (difluoroboradiazaindacenes), les composés connus sous la dénomination AlexaFluor, les protéines fluorescentes extraites de coraux, les phycobiliprotéines, telles que la B-phycoérythrine, la R-phycoérythrine, la C-phycocyanine, les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination XL665, les "Quantum Dots". D'autres composés fluorescents appropriés sont décrits dans la demande de brevet FR 2 840 611 et comprennent un fluorophore couplé à un oligonucléotide.
Marquage des molécules biologiques par tes composés fluorescents
Les différentes méthodes de marquage des bio-molécules par des composés fluorescents sont détaillées ci-dessous.
1) Génération d'une protéine de fusion entre la / les bio-molécules d'intérêt et une protéine possédant des propriétés intrinsèques de fluorescence, telles que les protéines de la famille des GFP. L'expression de telles protéines de fusion fait appel à des techniques de biologie moléculaire bien connues de l'homme du métier, consistant par exemple à transfecter dans la cellule vivante, de manière stable ou transitoire, des vecteurs d'expression, tels que des plasmides, dont l'ADN code pour la protéine de fusion.
2) Génération d'une protéine de fusion entre la / les bio-molécules d'intérêt et une protéine possédant une activité enzymatique suicide, telles que par exemple les protéines SnapTag (Covalys) ou HaloTag (Promega) qui transfèrent de façon covalente et irréversible le composé fluorescent sur la / les bio-molécules d'intérêt. Le composé fluorescent est dans ce cas lié de manière covalente au substrat de l'enzyme suicide et est introduit dans le milieu extracellulaire. Les techniques décrites ci-après permettent de faire franchir la membrane cellulaire aux conjugués composé fluorescent - substrat qui ne seraient pas naturellement lipophiles.
Les enzymes suicides sont des protéines qui ont une activité enzymatique modifiée par des mutations spécifiques qui leur confèrent la capacité de lier rapidement et de façon covalente un substrat. Ces enzymes sont dites suicides car chacune ne peut lier qu'une seule molécule fluorescente, l'activité de l'enzyme étant bloquée par la fixation du substrat. Actuellement deux familles d'enzymes suicides connues permettent ce type de marquage :
- le mutant d'une alkylguanine-DNA alkyltransférase (ou SnapTag commercialisé par la société Covalys) (voir Klepper A. et al. (2003) in Nature Biotechnology, vol. 21, p. 86 et WO 02/083937 A2), dont un des substrats est la benzylguanine.
- le mutant d'une déhalogénase (HaloTag commercialisé par Promega) qui génère également une réaction enzymatique du type suicide (voir WO 04/072232 A2), dont certains des substrats sont des composés de la famille des chloroalcanes.
Dans ces deux cas, le substrat qui sera incorporé par ces enzymes suicides devra au préalable être marqué avec un composé organique fluorescent.
3) Génération d'une protéine de fusion entre la/les bio-molécules d'intérêt et une séquence retrouvant une activité d'épissage protéique après liaison avec une séquence complémentaire préalablement marquée avec le/les molécules fluorescentes d'intérêt transférant ainsi de façon covalente et irréversible par une liaison peptidique le composé fluorescent sur la/les bio-molécules cibles, telles que la séquence codant pour le domaine intéine de la Ssp DnaE.
Cette approche exploite un procédé biologique de maturation post- traductionnelle, appelé épissage protéique. Ce procédé catalyse une série de réactions chimiques qui a pour but final d'enlever un domaine nommé intéine présent dans une protéine précurseur et de lier par une liaison peptidique les deux domaines se trouvant de part et d'autre du domaine intéine. Le trans-épissage protéique nécessite deux moitiés de domaine intéine complémentaire. La première moitié est fusionnée à la protéine cible et la seconde moitié à la molécule fluorescente. Cette méthode est décrite par Muir T.W. et al. (2003) J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 7180-7181. Les techniques décrites ci-après permettent de faire franchir la membrane cellulaire aux conjugués "composé fluorescent - intéine" qui ne seraient pas naturellement lîpophiles.
4) Génération d'une protéine de fusion entre la/les bio-molécules à étudier et une séquence peptidique ou un membre d'un couple de partenaires de liaison possédant des caractéristiques de reconnaissance spécifique et de liaison à haute affinité avec un substrat préalablement marqué avec le /les molécules fluorescentes d'intérêt telles que par exemple :
- Les séquences cystéine-cystéine-X-X-cystéine-cystéine (CCXXCC) qui ont la propriété de se lier à des composés bi-arsenic. Ces composés bi-arsenic peuvent être facilement marqués avec une molécule organique du type fluorescéine ou rhodamine (voir BAGriffîn et al. (1998) Science. 1998, 281, 269-271 et S.A. Adams et al. (2002) J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 6063-6076 pour des détails sur la technologie).
Les répétitions PoIy histïdine se lient à des ions métalliques qui peuvent être couplés à des molécules "quencheurs" de composés fluorescents (voir E.G. Guignet et al. (2004), Nature biotech., 2004, 22, 440-444).
Le Tag BTX (bungarotoxine), composé d'un peptide de 13 acides aminés qui est reconnu par la bungarotoxine (BTX), peut être préalablement couplé à une molécule fluorescente, (voir C. M. McCann et al. (2005), Biotechnique (2005), 38, 945- 952).
La séquence de liaison de la Streptavidine (SBP-Tag) est une séquence formée par 38 acides aminés qui présente une haute affinité pour la biotine pouvant être préalablement marquée avec un fluorophore ( voir C. M. McCann et al. (2005), Biotechnique (2005), 38, 945-952).
5) Génération d'une protéine de fusion entre la / les bio-molécules à étudier et une séquence peptidique de reconnaissance de certaines enzymes comme, par exemple, les transgiutaminases ou les ligases qui transfèrent sur un acide aminé spécifique de la séquence Tag le composé fluorescent préalablement fixé sur le substrat de l'enzyme.
La séquence peptidique PKPQQFM (Proline-Lysine-Proline-Glutamine-Glutamine- Phenylalanine-Methionine) est par exemple reconnue par une enzyme nommée transglutaminase. La transglutaminase transfère le composé organique fluorescent couplé à son substrat, la cadaverine, directement sur le premier résidu glutamine de la séquence PKPQQFM (voir Taki et al (2004) Protein Engeneering, Design Sélection, 2004,17, 119-12). Les techniques décrites ci-après permettent de faire franchir la membrane cellulaire aux conjugués composé fluorescent - substrat qui ne seraient pas naturellement lipophiles. La séquence de l'enzyme dihydrofolate réductase d'E. coli (eDHFR) qui lie spécifiquement et avec une haute affinité des ligands tels que la triméthoprime sur lesquels peuvent être greffés des composés fluorescents selon la technologie dénommée « Ligand link Universal labelling technology » de la Société Active Motif,
6) Des séquences nucléiques peuvent être elles aussi spécifiquement reconnues par des enzymes ayant des activités transférases leur permettant de lier de façon covalente une molécule organique fluorescente présente sur un cofacteur ou un substrat directement sur la séquence spécifique. Un te! procédé peut être illustré par la séquence nucléique spécifique 5'-TCGA-3' sur laquelle la méthyltranférase Taql transfère le composé fluorescent préalablement greffé sur le cofacteur aziridine (voir Pljevaljcic G. et al. (2004) ChemBîoChem, 5; 265-269).
Dans le procédé selon l'invention, le marquage composé fluorescent / biomolécule est donc effectué en couplant le composé fluorescent et la bio-molécule, respectivement avec les membres des couples choisis parmi : un substrat de SNAP- Tag/l'enzyme SNAP-Tag, un substrat d'HALO-Tag/l'enzyme HALO-Tag, une partie d'intéine telle que l'intéine de Ssp DnaE / la partie d'intéine complémentaire permettant de reconstituer une intéine fonctionnelle, un motif bi-arsenic / la séquence Cys-Cys-X- X-Cys-Cys, X représentant un acide aminé quelconque, un ion métallique / une séquence poly-histidine, la biotine / la streptavidine, la streptavidine / la biotine, la bungarotoxine / le tag BTX, la cadavérine / la séquence protéique PKPQQFM, l'aziridine / la séquence nucléique TCGA.
Les techniques de marquage citées ci-dessus impliquent parfois de faire franchir la membrane cellulaire à des composés qui ne sont pas naturellement lipophiles et qui ne rentrent pas naturellement dans la cellule. Ces composés ou leurs conjugués avec des substrats, des étiquettes ("tags"), ou des membres d'un couple de partenaires de liaison tels que décrits plus haut, peuvent être introduits dans la cellule en utilisant par exemple l'une des techniques suivantes :
1). Utilisation d'esters qui masquent les groupes chargés pendant le passage de la bicouche lipidique ; ces esters rentrent dans la catégorie des composés nommés pro-drogues et font référence à des composés qui sont rapidement transformés in vivo pour donner le composé « parent » suite à une hydrolyse dans des conditions physiologiques. [T. Higuchi et V. Stella in "Pro-drugs as Novel Deliverγ Systems", Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Séries, American Chemical Society (1975)]. Des exemples incluent principalement les groupes pivaloyl-oxyméthyle, acétoxyméthyle ainsi que esters glycoliques [Nielsen et Bundgaard, Int. J. of Pharmacy. 39(1984) 75-85]. Lorsque cette technique est utilisée, un de ces groupements est greffé de manière covalente sur le fluorophore.
2). Utilisation de peptides viraux greffés de manière covalente au fluorophore : certains de ces peptides permettent en effet de véhiculer le fluorophore à travers la membrane cellulaire. A titre d'exemple de tels peptides viraux, on peut citer les analogues de « penetratine » et « transportan » [Langel et al. Bioconj. Chem. (2000), 11, 619-626], les poly-Arginines [Wender et al. Arginine-based molecular transporters. Org. Lett. (2003), 5(19), 3459-3462], ou encore les peptoïdes, analogues de peptides portant des groupes guanidines [The design, synthesis, and évaluation of molécules that enable or enhance cellular uptake: peptoid molecular transporters. Wender et al. Proc Natl Acad Sci U S A. (2000), 13003-8], ou encore les dérivés non-hydrolysables à motifs tétraguanidinium [Fernandez-Carneado J. et al. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 869-874]
3). Modification de la lipophilie et de la polarité des composés fluorescents par l'addition de chaînes latérales contenant des molécules de cholestérol, de vitamine E ou des chaînes aliphatiques qui interagissent avec les membranes cellulaires en utilisant l'approche exemplifiée sur les oligonucléotides utilisant des chaînes undécyl- ou 1,2-di-O-hexadécyl-glycérol. [3'-end conjugates of minimally phosphorothioate- protected oligonucléotides with 1-O-hexadecylglycerol: synthesis and anti-ras activity in radiation-résistant cells. RaIt ét al. Bioconj. Chem. (2000), 11, 153-160].
Ces modifications sont plus efficaces que les surfactants cationiques (cationic Tipids") qui forment des complexes supramoléculaires avec les acides nucléiques et augmentent l'endocytose mais qui sont toxiques et endommagent les membranes cellulaires.
Avantageusement, dans le procédé selon l'invention, au moins un composé fluorescent comporte un motif lui permettant de franchir la membrane plasmique, ce motif étant sélectionné parmi les groupes suivants ; esters tels que les pîvaloyl- oxyméthyle ester, acétoxyméthyle ester, ou les esters glycolîques ; des peptides viraux pris en charge par des transporteurs membranaires, tels que la pénétratine et ses analogues, le transportai! et ses analogues, les groupes polyarginines, les peptoïdes portant des groupes guanidines, tel que les groupes oligoguanidinium; des groupes cholestérol, vitamines E ou des chaînes aliphatiques, telles que les chaînes undécyle ou 1,2-di-O-hexadécyl-glycérol.
Dans une mise en œuvre alternative, au moins deux composés fluorescents partenaires de TR-FRET comportent de tels motifs leur permettant de franchir la membrane plasmique.
De manière avantageuse, on peut lier le composé fluorescent au substrat de l'enzyme suicide et générer en même temps sur ledit composé fluorescent une fonction chimique réactive, telle que notamment une fonction aminé ou acide qui permet ultérieurement de coupler sur ledit composé fluorescent un motif lui permettant de franchir la membrane plasmique.
A titre d'exemples, on pourra se référer aux figures 7 et 8 qui illustrent la synthèse d'un conjugué entre un composé fluorescent, le composé DY647 (de la Société DYOMICS) et le substrat d'une enzyme suicide (substrat de l'enzyme « SnapTag »), à savoir la benzylguanine sur laquelle on a ajouté un groupe fonctionnel aminé et l'introduction d'une fonction chimique réactive sur ledit composé fluorescent (ce conjugué est ci-après dénommé « tripode »).
On peut ultérieurement, grâce à cette fonction chimique réactive, introduire par liaison covalente, ledit motif permettant de franchir la membrane plasmique.
Le tripode avec une fonction NH2 permettra d'intégrer les systèmes vecteurs possédant une fonction COOH et celui avec une fonction COOH permettra d'intégrer les systèmes vecteurs possédant une fonction NH2.
L'invention fournit également un nécessaire de composants (communément appelé "kit of parts" en langue anglaise) comprenant les réactifs permettant la mise en œuvre du procédé de détection d'interactions entre bio-molécules, de translocation ou de changement de conformation de bio-molécules dans des cellules vivantes selon l'invention.
Ce nécessaire (ou kit) comprend :
- un premier composé fluorescent et un second composé fluorescent, ces composés étant partenaires de TR-FRET et l'un au moins de ces composés comportant un motif lui permettant de franchir la membrane plasmique ;
- des cellules vivantes comprenant lesdites bio-molécules ; - des moyens de marquage des bio-molécules par les composés fluorescents ;
- des instructions permettant d'étudier des phénomènes d'interactions entre biomolécules, de translocation ou de changement de conformation de bio-molécules dans des cellules vivantes.
Les réactifs présents dans ce nécessaire permettent le marquage des biomolécules à étudier présentes dans la cellule vivante par les composés fluorescents partenaires de TR-FRET ; en pratique, cela signifie que le composé fluorescent et la bio-molécule sont couplés, respectivement avec les membres des couples choisis parmi : un substrat de SNAP-Tag tel que la benzylguanine/ l'enzyme SNAP-Tag, un substrat d'HALO-Tag tel qu'un chloroalcane/ l'enzyme HALO-Tag, une partie d'intéine telle que l'interne de Ssp DnaE / la partie d'intéine complémentaire permettant de reconstituer une intéine fonctionnelle, un motif bi-arsenic / la séquence Cys-Cys-X-X- Cys-Cys, X représentant un acide aminé quelconque, un ion métallique / une séquence poly-histidine, la biotine / la streptavidine, la streptavidine / la biotine, la bungarotoxine / le tag BTX, la cadaverine / la séquence protéique PKPQQFM, l'aziridine / la séquence nucléique TCGA.
Au moins un des composés fluorescents comporte par ailleurs un motif lui permettant de franchir la membrane plasmique, et ce motif est choisi parmi les composés suivants : les esters tels que les pivaloyl-oxyméthyle ester, acétoxyméthyle ester, ou les esters glycoliques ; des peptides viraux pris en charge par des transporteurs membranaires tels que la penetratine et ses analogues, le transportan et ses analogues, les groupes polyarginines, les peptoïdes portant des groupes guanidines ; des groupes cholestérol, vitamines E ou des chaînes aliphatiques telles que les chaînes undécyl ou 1,2-di-O-hexadécyl-glycérol.
Les cellules vivantes comprises dans ce nécessaire peuvent être génétiquement modifiée de manière à exprimer des bio-molécules dont on veut étudier l'interaction, ces modifications font appel aux techniques classiques de biologie moléculaire bien connues de l'homme du métier, telle que la transfectïon stable ou transitoire des cellules par des plasmides exprimant les bio-molécules, ou des protéines de fusion comprenant les bio-molécules d'intérêt.
Les fluorophores partenaires de TR-FRET présent dans le nécessaire selon l'invention sont un composé fluorescent à durée de vie longue et au moins un composé fluorescent choisi parmi les suivants : les protéines fluorescentes telles que la protéine fluorescente verte (GFP) et ses dérivés (notamment CFP, YFP), ou des composés fluorescents ayant des durée de vie inférieure à 100 nanosecondes, telles que les cyanines, les rhodamines, les fluorescéines, les squarènes et les molécules fluorescentes connues sous le nom de BODIPY's (difluorobora-diaza indacenes), les composés connus sous la dénomination AlexaFluor, les protéines fluorescentes extraites de coraux, les phycobiliprotéines, telles que la B-phycoérythrine, la R-phycoérγthrine, la C-phycocyanine, les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination XL665.
De manière préférée, le composé fluorescent à durée de vie longue a une durée de vie supérieure à 100 ns et de manière encore plus préférée est un chélate ou un cryptate de terre rare. Dans une formulation particulière du nécessaire selon l'invention, la terre rare est le terbium ou l'europium.
La présente invention peut être maintenant décrite plus en détail par les exemples illustratifs suivants, qui ne doivent en aucun cas limiter les applications de la présente invention.
Exemple N°l: Mesure de la translocation de la protéine kinase C -gamma (PKC-γ) (Voir schéma de principe. Fia. 11
Les protéines kinases C sont des protéines appartenant à un groupe de kinases sérine/thréonine dépendantes des phospholipides. Ces protéines jouent un grand rôle dans de nombreuses voies de signalisation cellulaire. Physiologiquement la PKC-γ est activée d'une manière dépendant au calcium par les phosphoditylsérines (PS) et elle lie le diacylglycérol (DAG), mais la PKC-γ peut être activée indépendamment de la présence de DAG par les esters de phorbol inducteur de tumeurs (PMA).
Après stimulation, la PKC-γ subit une translation du cytoplasme vers la membrane plasmique, cette translocatîon peut être mesurée à l'aide d'une protéine de fusion avec la GFP après une stimulation au PMA (Sakai N. J. CeII Bio. (1997) 139, 1465-1476).
On a créé une protéine de fusion entre la PKC-γ et une enzyme suicide, nommée HaloTag, pour marquer la PKC-γ avec un composé organique fluorescent accepteur et on a élaboré un outil pour faire un marquage spécifique de la membrane plasmique avec un composé organique fluorescent donneur pouvant entrer en FRET avec la PKC-γ marquée.
La membrane plasmique est spécifiquement marquée avec une enzyme suicide, nommée SnapTag fusionnée avec une séquence Cys-Ala-Ala-X (X est un acide aminé quelconque) qui est une séquence de reconnaissance pour les enzymes de modification post-traductionnelle. Cette séquence va provoquer le greffage d'un groupe farnésyl en C-terminal de l'enzyme Snaptag, qui a pour conséquence l'adressage et l'ancrage de cette enzyme sur le feuillet interne de la membrane plasmique. Des cellules COS-7 ont été transfectées de façon transitoire avec les deux constructions plasmidiques avec de la lîpofectamine 2000 ou par électroporation.
24 h ou 48h après la transfection transitoire, les cellules sont incubées pendant 1 heure avec du milieu cellulaire contenant 5 μM de chaque substrat spécifique des enzymes HaloTag et SnapTag, chacun des substrats étant porteur des molécules organiques fluorescentes formant le FRET.
Après 3 lavages avec du milieu, la translocation est mesurée par TR-FRET après induction par différentes stimulations comme par exemple après addition de 12-myristate 13-acétate phorbol ester (PIWA). Une augmentation du signal TR-FRET est corrélée avec une augmentation du processus de translocation.
Des molécules potentiellement inhibitrices de la voie de translocation de la PKC-γ peuvent être ajoutées au milieu de culture afin de tester leurs effets sur la stimulation de la transîocation.
Exemple 2 : Mise en évidence d'interactions récepteur androgène - coactivateur ou récepteur androqène - corépresseur. (voir schéma de principe figure 2)
Les androgènes et leur récepteur fonctionnel (AR) sont responsables de la différenciation normale du phénotype mâle externe. Les récepteurs des androgènes cytosoliques, à l'état inactif, sont associés avec les protéines chaperonnes (connues sous la dénomination anglaise "heat shock proteins"). Après liaison avec le ligand, les récepteurs se dimérisent et font l'objet d'une translocation vers le noyau. Les corégulateurs (coactivateurs ou corépresseurs) du AR vont alors interagir ou pas avec le récepteur et le résultat de ces interactions va éventuellement provoquer la liaison du complexe à l'ADN au niveau d'une séquence spécifique (dite ARE pour « androgen receptor responsive élément ») et ainsi réguler la transcription.
La méthode selon l'invention est utilisée pour mettre en évidence les interactions entre un corépresseur, un coactivateur, et un AR. Pour cela, des vecteurs d'expression sont introduits dans la cellule, afin d'exprimer dans le milieu intracellulaire :
- une protéine de fusion AR-enzyme SnapTag. L'enzyme suicide Snaptag permet le couplage avec uncomposé fluorescent marqué avec un substrat de snaptag.
- une protéine de fusion HDACl-Halotag. HDACl (histone acétyltransfèrase 1) est un corépresseur susceptible de se fixer sur AR. L'enzyme suicide halotag permet le couplage avec un composé fluorescent marqué avec un substrat d'halotag.
- une protéine de fusion pl60-fragment inteine. P160 est un coactivateur de susceptible de se fixer sur AR. Le fragment d'intéine permet le couplage avec un composé fluorescent comportant le fragment d'intéine complémentaire par transépissage protéique.
Lorsque l'AR se localise dans Ie noyau après stimulation, (liaison de son ligand), on peut doser son effet final en mesurant le signal de TR-FRET ; l'AR est marqué avec le composé fluorescent donneur et le coactivateur et le corépresseur avec deux composés fluorescents accepteurs bien distincts dans leur propriétés spectrales, et dont la longueur d'onde d'émission suite à un transfert d'énergie est respectivement
665 et 780 nm.
La mesure d'un signal de TR-FREET à 665 nm sera donc représentative de la liaison de l'AR avec son coactivateur, alors que la mesure d'un TR-FREET à 780 nm sera significative d'une interaction AR-corépresseur. Ce format d'essai permet donc la détection de deux types d'interaction dans un seul et unique essai cellulaire. Cet essai de multidétection peut être encore amélioré par l'addition d'autres composés fluorescents accepteurs pour révéler simultanément d'autres interactions.
Exemple 3 : Bio-senseur cAMP : Détection de modifications de la conformation d'une protéine de fusion comprenant un domaine de liaison à TAMPc (Voir schéma de principe. Fia. 31
Dans cet exemple, on mesure les variations du signal TR-FREET d'une paire de composés fluorescents donneur / accepteur en couplant ces fluorophores à un domaine de liaison à l'AMPc (comme par exemple celui de la sous unité régulatrice βll de la PKA, celui des protéines d'échange activées par la cAMP) connues sous le terme de CAMPS. Ces constructions moléculaires peuvent être utilisées pour quantifier dans des cellules vivantes les niveau d'AMPc après stimulation pharmacologique d'un récepteur couplé aux protéines G (GPCR) (voir (Nikolaev et al., JBC, vol. 279, N°36, pp. 37215-37218, 2004).
Le plasmide codant pour une protéine de fusion de type SNAP-tag / CAMPS / Halo-tag est transfecté dans des cellules HEK. 24 heures ou 48 heures après la transfection, les cellules sont incubées (1 heure à 37°C) avec les substrats de SNAP- Tag et HALO-Tag, chacun étant couplé à un membre d'un couple donneur / accepteur de TR-FREH".
A l'issue de l'étape d'incubation, les fluorophores sont couplés de manière covaiente via ies réactions suicides des enzymes SNAP-Tag et HALO-Tag, et la protéine CAMPS est marquée par la paire de fluorophores impliqués dans le TR-FRET.
A l'état basai, un signal de TR-FRET est mesuré en raison de la proximité des fluorophores. Après stimulation pharmacologique (par exemple stimulation par un agoniste d'un récepteur couplé aux protéines Gs exprimé dans des cellules HEK), la concentration intracellulaire d'AMPc va augmenter et la liaison de cAMP à CAMPS va provoquer un changement de conformation de cette dernière protéine. On observe alors une diminution du signal de TR-FRET mesuré.
Cet exemple montre que l'amplitude du signal de TR-FRET est directement corrélée à la liaison de l'AMPc à la protéine CAMPS.
La même expérience peut être menée avec un antagoniste du GPCR, qui provoque une diminution de la concentration d'AMPc dans la cellule et une variation de la conformation de la protéine CAMPS qui peut être détectée en mesurant une augmentation du signal de TR-FRET.
Exemple 4 : Mesure de l'interaction calcineurîne / calmoduline (voir schéma de principe figure 4)
La calcineurine possède une activité de phosphatase et joue un rôle fondamental dans la voie de signalisation cellulaire impliquant ies niveaux de calcium intracellulaire. La ca/cineurine est impliquée dans le développement et l'adaptation au stress chez les mammifères, et ce par l'intermédiaire de deux classes de facteurs de transcription : NFAT et MEF2.
La calcineurîne est un hétérodîmère comprenant deux sous-unités, la calcineurine A (CnA) et la calcineurine B (CnB). L'enzyme est înactive sous sa forme hétérodimérique et l'activité phosphatase est stimulée par la formation d'un complexe calcineurine-calmoduline lors de l'augmentation de la concentration en calcium intracellulaire.
Un plasmide codant pour une protéine de fusion comprenant la sous-unité CnA et l'enzyme HALO-Tag et un plasmide codant pour une protéine de fusion comprenant la calmoduline et l'enzyme SNAP-Tag sont co-transfectés dans des cellules en utilisant la lipofectamine 2000 ou par électroporation. Après 24 ou 48 heures, les cellules sont incubées 1 heure à 37°C dans un milieu comprenant les substrats des enzymes SNAP- Tag et HALO-Tag, chacun couplé à un membre d'une paire de fluorophores compatible pour le TR-FRET.
Après lavage, les cellules sont stimulées pharmacologiquement ou par un stress (par exemple par la cyclosporine A, ou acidification du milieu). L'amplitude du signal de TR-FRET mesuré augmente et est corrélée à l'association de l'hétérodimère CnA-CnB avec la calmoduline.
On peut ajouter au milieu de mesure avant stimulation des molécules dont on veut tester l'effet sur l'activation de la voie de signalisation calcineurine-dépendante. Cet exemple montre que le procédé selon l'invention permet d'étudier la voie de signalisation calcineurine dépendante dans des cellules vivantes, éventuellement en présence de composés à tester. Ce type de test permet le criblage à haut débit de composés candidates susceptibles de permettre le traitement de pathologies impliquant cette voie de signalisation.
Exemple 5 : Criblage de composés avant une activité anti-inflammatoire
Le TNF alpha est un facteur de l'inflammation qui provoque plusieurs réponses cellulaires lors de sa liaison à son récepteur membranaire. Une des réponses provoquée par le TNF alpha dans les lymphocytes B est l'activation du facteur de transcription NFkB, qui contrôle la production des chaînes légères des anticorps - une étape critique de la réponse immunitaire. Les inhibiteurs du TNF alpha sont donc utile pour réguler la réponse immunitaire, et peuvent par exemple être utilisé dans la prévention du choc septique, ou comme médicaments anti-inflammatoires. De tels inhibiteurs de l'activité TNFalpha peuvent être découvert en mesurant le niveau d'activation de NFkB, ce que permet la présente invention. La figure 5 illustre la rétention cytosolique de NFkB par la protéine cytosolique IkB : le complexe NFkB (p65, p50)-IkB est retenu dans le cytosol. Une stimulation appropriée (mitogenes de cellules T et B, le lipopolysaccharide, et le TNFalpha) provoque la phosphoryiation de IkB, entraîne sa dégradation et libère NFkB qui peut alors pénétrer le noyau cellulaire et activer la production des chaînes légères d'anticorps.
Le procédé selon Vinvention est appliqué en introduisant dans des lymphocytes B par les techniques classiques de biologie moléculaire les constructions suivantes :
- un vecteur exprimant une protéine de fusion IkB-Snaptag, qui pourra être marquée par un composé fluorescent donneur conjugué au substrat de Snaptag ;
- un vecteur exprimant une protéine de fusion p50-Halotag, qui pourra être marqué par un composé fluorescent accepteur conjugué à un substrat d'Halotag.
Dans les conditions de repos, le complexe NFkB (ρ65/p50) forme un complexe avec IkB et l'on peut mesures un signal de TR-FRFJT. Après stimulation des cellules par le TNFalpha, la phosphoryiation de IkB et sa dissociation du complexe va provoquer une diminution du signal de TR-FREET. L'amplitude de cette diminution est représentative du degré d'activation de la NFkB.
Ces cellules sont cultivés dans une plaque micropuits, et l'on applique à différents puits l'un des traitements suivants :
- ajout des composés fluorescents donneur et accepteur couplés aux substrats Snaptag et Halotag, mesure du signal de TR-FRET (puit de contrôle TR-FRET élevé) ;
- ajout des composés fluorescents couplés aux substrats Snaptag et Halotag, stimulation des cellules par ajout de TNFafpha, mesure du signal de TR-FRET (puit de contrôle TR-FRET bas) ;
- ajout des composés fluorescents couplés aux substrats Snaptag et Halotag, ajout d'un composé à tester, stimulation des cellules par ajout de TNFalpha , mesure du signai de TR-FRET (puits tests).
Lorsque le signal des puits tests est similaire à celui mesuré dans les puits de contrôle TR-FRET élevé, on peut conclure que les composés à tester ont un effet inhibiteur sur l'activité TIMF alpha. Lorsque cette valeur est proche de la valeur mesurée dans les puits de contrôle TR-FRET bas, on peut conclure que les composés à tester n'ont pas d'effet sur l'action de TNF alpha.
Cet exemple illustre l'application du procédé selon l'invention au criblage de médicaments et est particulièrement adapté au criblage dit à haut débit.
Exemple 6 : Microscopie en temps résolu d'un chélate d'europium
Cet exemple illustre l'utilisation d'un composé fluorescent capable de franchir naturellement la membrane plasmique et sa capacité à émettre un signal en temps résolu dans une cellule, a) Protocole
Des cellules sont ensemencées dans des chambres de culture LABTEK [densité 80 OOOc/ml], mise en culture 24 heures puis subissent un lavage avec du milieu de culture.
Le chélate d'europium de formule ci-dessous est rajouté au milieu de culture (concentration 20μM) et les cellules sont incubées 24 heures à 37°C.
Après lavage avec du milieu de culture, le colorant de Hoechst 33342 [concentration 2μg/ml ; référence fournisseur : Sigma Aldrich B2261] est ajouté aux chambres de culture, qui sont alors incubées 15 min. à l'abri de la lumière à température ambiante. Ce colorant à la propriété de marquer spécifiquement les noyaux cellulaires.
Les chambres de cultures sont lavées une nouvelle fois avec du milieu de culture avant de procéder à l'acquisition des images par microscopie, en mode « temps résolu », avec le matériel suivant : un microscope Axiovert 200M (Zeiss), une source d'excitation UV: un laser azote puisé (Spectra Physics) et une caméra intensifiée CCD (charge coupled device) Pi-Max (Roper Scientific), avec les paramètres suivants :
• Durée de lecture 2 millisecondes : La caméra détecte pendant 2 millisecondes pour récupérer tout le signal du chélate ;
• Délai 100 microsecondes : délais imposé pour éliminer la fluorescence parasitaire avant de capter le signal en temps résolu ;
Nombre de cycles par lecture : le signal est acquis pendant 30 expositions durant les 2 millisecondes puis compilé.
b) Résultats ;
Les images obtenues sont représentées dans la Figure 6.
L'image en transmission (image 3) permet de s'assurer de l'intégrité des cellules et de la densité du tapis cellulaire. L'image Hoechst (Image 2) permet de localiser les noyaux cellulaires. Le contrôle négatif (image 5) montre le signal obtenu en mode de détection temps-résolu en l'absence de composé fluorescent.
L'image obtenue avec le composé fluorescent donneur testé à la concentration de 20 μM (image 1) permet de mettre en évidence une localisation intracellulaire du composé donneur de FRET. La superposition des images (2) et (1) montre que la fluorescence est localisée dans la cellule.
Ce type de mesure en temps résolu peut être quantifié en désignant des régions d'intérêt sur des zones de signaux et de bruit, et de soustraire la valeur moyenne du bruit à la valeur de signal mesuré.
Cet exemple montre qu'un chélate de terre rare capable de franchir la membrane plasmique peut être utilisé pour mettre en oeuvre l'invention, et que le signal émis par un tel composé peut être mesuré par microscopie en temps résolu.
Exemple 7 : Synthèse d'un conjugué fluorescent comportant un motif polvarqinine et un groupe benzylquanine, données microscopiques. a) Synthèse de BG-DY647 et de Dy647-R9-BG
Le schéma de synthèse d'un conjugué comprenant la benzylguanine BG (substrat de l'enzyme SNAPTAG) lié de manière covalente au composé fluorescent DY647 est décrit sur la Figure 9.
La Figure 10 représente le schéma de synthèse d'un conjugué comprenant une séquence de 9 arginines (R9), sur laquelle sont greffés d'une part, le fluorophore DY647, et d'autre part la benzylguanine BG. b) Analyse microscopique :
Des cellules CHO sont cultivées à 37 0C, sous atmosphère contrôlée à 5% CO2 en milieu F-12 HAM (Invitrogen) + 10 % de sérum de veau fœtal (SVF) préalablement inactivé pendant 20 min à 60 0C.
La veille de l'expérience les cellules sont dissociées et ensemencées dans des chambres de culture LABTECK (Nunc) à une densité de 75 000 cellules/puits. Le jour de l'expérience, les composés à tester (BG-DY647 ou Dy647-R9-BG) sont préparés dans du milieu de culture à une concentration de 5 μM et mis en contact une heure avec les cellules.
Après l'incubation, 3 lavages sont effectués avec du milieu de culture. Avant l'analyse microscopique, une coloration nucléaire est réalisée avec du colorant Hoescht.
L'analyse microscopique se fait à l'aide d'un microscope à épifluorescence Axiovert 200M (Zeiss), objectif 40 X, une source d'excitation UV; un laser azote puisé (Spectra Physics) et une caméra CCD CooISNAP (Photometrics).
La Figure 11 montre les images obtenues avec soit le conjugué BG-DY647, soit le conjugué DY647-R9-BG. On constate que le conjugué DY647-R9-BG est localisé dans les cellules alors que le conjugué BG-DY647 reste en solution dans le milieu de culture. Un composé tel que le DY647-R9-BG peut donc être utilisé dans la méthode selon l'invention, notamment en tant que conjugué accepteur capable de traverser la membrane plasmique pour marquer une protéine intracellulaire comprenant l'enzyme SnapTag,
Exemple 8 : Exemple comparatif de l'effet d'une modification polyArαinine ou oliquoquanidinium sur l'entrée d'un fluorophore dans des cellules en culture, données sur lecteur de fluorescence a) Protocole
Des cellules CHO sont cultivées à 37 0C, sous atmosphère contrôlée à 5% COi en milieu F-12 HAM (Invitrogen) + 10 % de sérum de veau fœtal (SVF) préalablement inactivé 20 min à 60 0C. La veille de l'expérience, des cellules CHO-Ml sont ensemencées dans une plaque 96 puits à la densité de 10 000 cellules par puit.
Le jour de l'expérience, le milieu de culture est aspiré et remplacé par les composés à tester à une concentration de 2,5 μM ou 5μM dans du Tampon KREBS (Sigma). Après
1 heure d'incubation, les puits sont lavés avec un tampon KREBS+0.05 % Tween-20.
Les cellules sont ensuite lysées dans un tampon PBS+0.1% Triton XlOO. La fluorescence est mesurée sur un lecteur du type Analyst AD (UL, Molecular Devices) avec les filtres et le dichroïque adéquat aux spécificités spectrales du composé à détecter.
Exemple pour un composé porteur d'une fluorescéine :
Filtre à l'excitation : bande passante 485/22 nm
Dichroïque : passe haut 505 nm
Filtre à l'émission : bande passante 535/35 nm
Exemple pour un composé porteur d'un complexe de terre rare : Filtre à l'excitation : bande passante 330/80 nm Dichroïque : BBUV Filtre à l'émission : bande passante 620/10 nm
b) Résultats Dans ces conditions, 4 composés ont été testés :
La fluorescéine capable de franchir naturellement la membrane plasmique et la carboxyfluorescéine qui n'est pas capable de franchir naturellement la membrane plasmique comme contrôles ; - le dérivé R7-fluorescéine de formule ci-dessous :
obtenu par greffage d'une séquence poly Arginine comportant 7 motifs arginine sur la structure fiuorescéine selon le schéma de synthèse décrit sur la Figure
12 ;
Le dérivé tétraguanidinium-fluorescéine : une séquence tétraguanidinium (telle que décrite par Femandez-Cameado J. et al. X Am. Chem. Soc. 2005, 127, 869-874).) a été greffée sur la structure carboxyfluorescéine
L'intensité de fluorescence mesurée pour chacun des composés (Figure 13) selon le protocole ci-dessus montre que les séquences poly Arginine et tétraguanidinium peuvent être utilisées pour faire entrer dans la cellule l'un des partenaires de FRET, et donc en tant que motif permettant à l'un des partenaires de FRET de traverser la membrane cellulaire.
Exemple 9 : Exemple de TR-FRlT intracellulaire constitutif (caméléon HaloTaq- SπapTaq)
La méthode se/on l'invention est utilisée pour mettre en évidence un signal de FRET dans une cellule vivante. Pour cela, un vecteur d'expression est introduit dans la cellule, afin d'exprimer dans le milieu intracellulaire une protéine de fusion composée du SnapTag et de l'HaloTag. L'enzyme suicide SnapTag permet le couplage avec un composé fluorescent marqué avec un substrat de SnapTag (la benzylguanine). L'enzyme suicide Halo-tag permet le couplage avec un composé fluorescent marqué avec un substrat de l'Halo-tag (un chloroalcane).
Obtention de la construction plasmidique pour l'expression cellulaire d'une protéine de fusion SnapTag-HaloTag :
Le plasmide pHT2 portant îa séquence de ('HafoTag provient de la société Promega. Le plasmide pSem-Sl-ST26m portant la séquence du SnapTag provient de la société
Covalys.
La cassette correspondant à la séquence codante de l'HaloTag est isolée du plasmide pHT2 par digestion enzymatique EcoRV-Not I (Biolabs) et transférée dans le plasmide pCDNA3.1 (Invitrogen) préalablement digéré par les mêmes enzymes.
La ligation est faite par de la T4 Ligase (Invitrogen), Le produit de ligatîon est transformé dans des bactéries chîmîocompétentes Turbo celis (GenetherapySystem).
Les bactéries transformées sont étalées sur du milieu LB-Agar (Sigma) + 0.1 mg/ml d'ampiciline (Eurogentec) permettant la sélection des bactéries possédant le plasmide pCDNA3.1Halo-Tag.
L' ADN plasmidique est obtenu par purification sur colonnes (QIAGEN). L'intégrité de la séquence est vérifiée par séquençage.
La cassette correspondant à (a séquence codante du SnapTag est isolée du pSEM-Sl-
ST26m par digestion enzymatique Clal-Xhol (Biolabs) et transférée dans le plasmide pBIuescript KS (Stratagene) préalablement digéré par les mêmes enzymes.
La ligation est faite par de Ia T4 Ligase (Invitrogen). Le produit de ligation est transformée dans des bactéries chim/ocompétentes Turbo cells (GenetherapySystem).
Les bactéries transformées sont étalées sur un du milieu LB-Agar (Sigma) + 0.1 mg/ml d'ampiciline (Eurogentec) permettant la sélection des bactéries possédant le plasmide pBfescriptKS-ST26m. L'ADN plasmidique est obtenu par purification sur colonnes
(QIAGEN). L'intégrité de la séquence est vérifiée par séquençage.
Le plasmide permettant d'obtenir la séquence codante de la protéine de fusion SnapTag - HaloTag est obtenu en transférant la cassette correspondant à la séquence du SnapTag, isolée par digestion du plasmide pBlescrïptKS-ST26m par Xbal-Kpnel (Biolabs), dans le plasmide pCDNA3.1Haio-Tag préalablement digéré par Nhel-Kpnel. L'ADN plasmidique correspondant au plasmide pB)escriptKS-ST26m-HaloTag est obtenu par purification sur colonnes (QIAGEN). ). L'intégrité de la séquence est vérifiée par séquençage.
Les cellules Cos-7 sont transfectées de façon transitoire avec la construction plasmidîque pBlescriptKS-ST26m-HaloTag avec de la lipofectamine 2000 ou par électroporation en plaque 96 puits. 24 h ou 48h après la transfection transitoire, les cellules COS-7 sont incubées pendant 1 heure avec du milieu cellulaire contenant 5 μM de chaque substrat spécifique des enzymes HaloTag et SnapTag, chacun des substrats étant lié de manière covalente à un membre d'un couple de partenaires de FREET et à un motif lui permettant de traverser la membrane plasmique (fabriqué par exemple selon le schéma des Figures 7 ou 8).
Après 3 lavages en KREBS+0.05 % Tween-20, un signal de FREET est mesuré sur un lecteur du RubyStar (BMG), ce qui montre que la méthode selon l'invention peut être utilisée pour mesurer un signai de FRET généré à l'intérieur de celMes vivantes.
Exemple 10 : Exemple de TR-FRET intracellulaire induit (FRB-FKBP)
Modèle utilisé :
La méthode selon l'invention est ici appliquée à Ja mise en évidence de l'interaction des protéines intracellulaires FKBP12 et le domaine FRB de la protéine FRAP lorsque de la rapamycine est ajoutée au milieu de culture.
FKBP12 est une protéine de 12 kDa qui appartient à la famille des immunophilines. La fixation de rapamycine sur FKBP12 rend la protéine cytosoluble en dissociant FKBP de ces partenaires.
La protéine FRAP (ou mTOR) contient le domaine FRB : ce domaine est composé de 99 acides aminés (correspondant à la séquence de mTOR E2015 - Q 2114),
La rapamycine est une molécule isolée d'une bactérie Streptomyces hygroscopicus et disponible commercialement. La rapamycine occupe deux poches hydrophobes distinctes, une sur FKBP et une sur FRB, elle lie les deux protéines en même temps.
Rapamycine
FKBP j| JTg C ooommpplieexxe Ternaire
FRB Construction pour l'obtention d'une protéine de fusion Halotag-FRB dans un plasmide d'expression cellulaire.
Une PCR sur le plasmide pHT2 (Promega) est réalisée avec les amorces suivantes :
Amorce ERV-Nco-HT-s ; 5' gcggatatcgccaccatgggatcc 31
Amorce HT-Pstl-HT-as : 5' acttaattaactgcaggccggccagc 3'
La PCR est faite avec la polymérase Phusîon (Finnzyme) à une température d'hybridation de 72 0C.
Le produit de PCR est digéré par les enzymes NcoI-PstI, 1 h à 37 °C, les enzymes sont ensuite inactivées à 800C pendant 20 min.
Le plasmide pBAD-ST26-FRB fourni par la société Covaiys est digéré par Ncol et
PstI pour retirer la cassette correspondant au SnapTag (ST26). Le plasmide linéaire pBAD-FRB obtenu est ligué avec le produit de PCR HaloTag décrit plus haut.
La ligation est faite par de la T4 Ligase (Invitrogen). Le produit de ligation est transformé dans des bactéries chimiocompétentes Turbo cells
(GenetherapySystem). Les bactéries transformées sont étalées sur un milieu LB-
Agar (Sigma) + 0.1 mg/ml d'ampicilline (Eurogentec) permettant la sélection des bactéries possédant le piasmide.
Le plasmide obtenu pBAD-HT-FRB est purifié sur colonne (QIAGEN) et contrôlé par séquençage.
La cassette correspondant à la séquence codante de la protéine de fusion HaloTag
(HT)-FRB est amplifiée par PCR à partir de la matrice pBAD-HT-FRB avec (es amorces suivantes :
Amorce ERV-Nco-HT-s : 5' gcggatatcgccaccatgggatcc 3'
Amorce pBAD rev : 5' gttctgatttaatctgtatca 3'
La PCR est faite avec la polymérase Phusion (Finnzyme) à une température d'hybridation de 72 0C.
Le produit de PCR est digéré par les enzymes EcoRV-AscI, 1 h à 37 0C, les enzymes sont ensuite ïnactivées à 650C pendant 20 min.
Le produit de PCR digéré est transféré dans un plasmide d'expression cellulaire pSEM-XT (cova(ys) digéré par EcoRV et Ascl.
La ligation est faite par de la T4 Lîgase (Invitrogen). Le produit de ligation est transformé dans des bactéries chimiocompétentes Turbo cells (GenetherapySystem). Les bactéries transformées sont étalées sur un milieu LB- Agar (Sigma) + 0.1 mg/ml d'ampiciline (Eurogentec) permettant la sélection des bactéries possédant le plasmide.
L1ADN plasmidique est obtenu par purification sur colonne (QIAGEN). ). L'intégrité de la séquence est vérifiée par séquençage.
- Construction pour l'obtention d'une protéine de fusion SNAPTAG-FKBP dans un plasmide d'expression cellulaire.
La cassette correspondant à la séquence codante de la protéine FKBP est isolée du plasmide pBAD-ST-FKBP (Covalys) par digestion Pstl-Ascl, et transférée dans un plasmide d'expression cellulaire pSEMXT-26 (covalys).
La ligation est faite par de la T4 Ligase (Invitrogen). Le produit de ligation est transformé dans des bactéries chimiocompétentes Turbo cells (GenetherapySystem). Les bactéries transformées sont étalées sur un milieu LB- Agar (Sigma) + 0.1 mg/ml d'ampiciline (Eurogentec) permettant la sélection des bactéries possédant le plasmide.
L'ADN plasmidique est obtenu par purification sur colonnes (QIAGEN). ). L'intégrité de la séquence est vérifiée par séquençage.
Les cellules Cos-7 sont transfectées de façon transitoire avec les deux constructions plasmidiques (Halo-Tag-FRB et SNAP-Tag-FKBP) avec de la lipofectamine 2000 ou par électroporation en plaque 96 puits à une concentration cellulaire de 10 000 cellules par puits.
24 h ou 48h après la transfection transitoire les cellules COS-7 sont incubées pendant 1 heure avec du milieu cellulaire contenant 5 μM de chaque substrat spécifique des enzymes HaloTag et SnapTag, chacun des substrats étant lié de manière covalente à un membre d'un couple de partenaires de FRET et à un motif lui permettant de traverser la membrane plasmique (fabriqué par exemple selon le schéma des Figures 7 et 8).
Après 3 lavages en KREBS+ 0.05 % tween-20, la fluorescence est mesurée sur un lecteur du type RubyStar (BMG) avant et après induction de l'interaction protéique par 100 nM de rapamycine (Calbiochem) : le signal de TR-FRET est significativement plus élevé après incubation avec la rapamycîne.
Cet exemple montre que la méthode selon I "invention permets de mettre en évidence une interaction biologique dans une cellule vivante par à l'aide de la technique de TR- FRET.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détection d'interactions entre bio-molécules, de translocation ou de changement de conformation de bio-molécules dans des cellules vivantes, comprenant les étapes suivantes :
1) marquer, dans une cellule vivante, une première bio-molécule avec un premier composé fluorescent possédant une durée de vie de fluorescence longue ;
2) marquer, dans ladite cellule vivante, au moins une deuxième biomolécule avec un deuxième composé fluorescent ;
3) soumettre les cellules vivantes à une stimulation spécifique adaptée à la réponse biologique à étudier, en présence ou non d'un composé appartenant à une librairie de molécules à tester ;
4) soumettre les cellules vivantes à une source lumineuse ayant une longueur d'onde permettant l'excitation dudit premier composé fluorescent à durée de vie longue ;
5) mesurer l'intensité de la fluorescence émise par lesdits premier et second composés fluorescents, calculer le rapport entre les intensités de fluorescence dudit premier composé fluorescent et dudit second composé fluorescent, ou mesurer la durée de vie du premier ou du second composé fluorescent ; et
6) comparer les signaux mesurés à ceux obtenus avant stimulation des cellules ; lesdit premier et au moins second composés fluorescents étant partenaires de TR-FRCT.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on étudie un changement de conformation d'une bio-molécule et en ce que les composés fluorescents sont couplés à la même bio-molécule
3. Procédé selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le marquage des bio-molécules par les composés fluorescents est effectué à l'aide d'une technique choisi parmi les suivantes : marquage covalent par action d'un enzyme suicide, marquage covalent par épissage protéique, marquage par expression d'une protéine de fusion comprenant la bio-molécule et une protéine fluorescente en tant que composé fluorescent, marquage non-covalent de haute affinité par l'intermédiaire de partenaires de liaison.
4. Procédé selon les revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que (e marquage composé fluorescent / bio-moiécuie est effectué en couplant Ie composé fluorescent et la bio-molécule, respectivement avec les membres des couples choisi parmi : un substrat de SNAP-Tag / l'enzyme SNAP-Tag, un substrat d'HALO-Tag / l'enzyme HALO-Tag, une partie d'intéine telle que l'intéine de Ssp DnaE / la partie d'intéine complémentaire permettant de reconstituer une intéine fonctionnelle, un motif bi-arsenic / la séquence Cys-Cys-X-X-Cys-Cys, X représentant un acide aminé quelconque, un ion métallique / une séquence poly-histidine, la biotine / Ja streptavidine, la streptavidine / la biotine, la bungarotoxine / le tag BTX, la cadaverine / la séquence protéique PKPQQFM, l'azirïdine / la séquence nucléique TCGA
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'au moins un des composés fluorescents comporte un motif lui permettant de franchir la membrane plasmique.
6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que le motif permettant au composé fluorescent de franchir la membrane plasmique est choisi parmi les motifs suivants : ester tels que les pivaloyl-oxyméthyle ester, acétoxyméthyle ester, ou les esters glycoliques ; des peptides viraux pris en charge par des transporteurs membranaires tels que la penetratin et ses analogues, le transportan et ses analogues, les groupes polyarginines, les peptoïdes portant des groupes guanidines ; les dérivés non-hydrolysables à motifs tétraguanidinium ; des groupes cholestérol, vitamines E ou des chaînes aliphatiques, telles que les chaînes undécyl ou 1,2-di-O-hexadécyl-glycérol.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la durée de vie du premier composé fluorescent est supérieure à 100 nanosecondes.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le premier composé fluorescent est choisi parmi les chélates ou cryptâtes de terres rares.
9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le premier composé fluorescent est un cryptate de terre rare comprenant un motif pyridine
10. Procédé selon les revendications 7 à 9, caractérisé en ce que la terre rare est le terbium ou l'europium.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le deuxième composé fluorescent est choisi parmi les composés suivants : les protéines fluorescentes telles que la protéine fluorescente verte (GFP) et ses dérivés (notamment CFP, YFP), les protéines fluorescentes extraites de coraux, les phycobiliprotéines, telles que la B-phycoérythrine, la R-phycoérythrine, la C-phycocyanine, les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination XL665 ou les composés fluorescents organiques ayant des durée de vie inférieure à 100 nanosecondes, telles que les cyanines, les rhodamines, les fluorescéines, les squarènes et les molécules fluorescentes connues sous le nom de BODIPY's (difluorobora-diaza indacenes), les composés connus sous la dénomination AlexaFluor.
12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le deuxième composé fluorescent est un composé fluorescent organique comportant un motif lui permettant de franchir la membrane plasmique.
13. Nécessaire de composants (kit of parts), comprenant ;
- un premier composé fluorescent et au moins un second composé fluorescent, ces composés étant partenaires de TR-FRET et l'un au moins de ces composés comportant un motif lui permettant de franchir la membrane plasmique ;
- des cellules vivantes comprenant lesdites bio-molécules ;
- des moyens de marquage des bio-molécules par lesdits composés fluorescente;
- des instructions permettant d'étudier des phénomènes d'interactions entre bio-molécules, de translocation ou de changement de conformation de bio-molécules dans les cellules vivantes.
14. Nécessaire de composants selon la revendication 13, caractérisé en ce que les moyens de marquage des bio-molécules par les composés fluorescente consistent à coupler le composé fluorescent et la bio-molécule, respectivement avec les membres des couples choisi parmi : un substrat de SNAP-Tag / l'enzyme SNAP-Tag, un substrat d'HALO-Tag / l'enzyme HALO-Tag, une partie d'intéine telle que l'intéine de Ssp DnaE / la partie d'întéïne complémentaire permettant de reconstituer une intéine fonctionnelle, un motif bi-arsenic / la séquence Cys-Cys-X-X-Cys-Cys, X représentant un acide aminé quelconque, un ion métallique / une séquence poly-histidine, la biotine / la streptavidine, la streptavidine / la biotine, la bungarotoxine / le tag BTX, \a cadaverine / la séquence protéique PKPQQFM, l'aziridine / la séquence nucléique TCGA, l'enzyme dihydrofolate réductase / triméthoprime.
15. Nécessaire de composants selon la revendication 13, caractérisé en ce que le motif permettant à au moins un des composés fluorescents de franchir la membrane plasmique est choisi parmi les suivants : ester tels que les pivaloyi-oxyméthyle ester, acétoxyméthyie ester, ou les esters glycoliques ; des peptîdes viraux pris en charge par des transporteurs membranaires tels que la penetratine et ses analogues, le transportan et ses analogues, les groupes polyarginines, les peptoïdes portant des groupes guanidines ; les dérivés non-hydrolysables à motifs tétraguanidintum des groupes cholestérol, vitamines E ou des chaînes aliphatiques telles que les chaînes undécyl ou 1,2-di-O-hexadécyl-glycérol.
16. Nécessaire de composants selon la revendication 13, caractérisé en ce que les cellules sont génétiquement modifiées de manière à exprimer les bio-molécules à étudier, ou des protéines de fusion comprenant les molécules à étudier.
17. Nécessaire de composants selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend un composé fluorescent à durée de vie longue et au moins un autre composé fluorescent choisi parmi les suivants : les protéines fluorescentes, telles que la protéine fluorescente verte (GFP) et ses dérivés (notamment CFP, YFP), ou des composés fluorescents ayant des durée de vie inférieure à 100 nanosecondes, tels que les cyanines, les rhodamines, les fluorescéines, les squarènes et les molécules fluorescentes connues sous le nom de BODIPY's (difluorobora-diaza indacenes), les composés connus sous la dénomination AlexaFluor, les protéines fluorescentes extraites de coraux, les phycobiliprotéines, telles que la B-phycoérythrine, la R-phycoérythrîne, la C-phycocyanine, les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination XL665.
18. Nécessaire selon la revendication 17, caractérisé en ce que le composé fluorescent à durée de vie longue à une durée de vie supérieure à 100 ns.
19. Nécessaire selon la revendication 18, caractérisé en ce que le composé fluorescent à durée de vie longue est un chélate de terre rare ou un cryptate de terre rare.
20. Nécessaire selon la revendication 18, caractérisé en ce que le composé fluorescent à durée de vie longue est un chélate de terre rare ou un cryptate de terbium ou d'europium.
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