EP2040623A2 - Dispositif de prelevement cellulaire par contact. - Google Patents

Dispositif de prelevement cellulaire par contact.

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Publication number
EP2040623A2
EP2040623A2 EP07787418A EP07787418A EP2040623A2 EP 2040623 A2 EP2040623 A2 EP 2040623A2 EP 07787418 A EP07787418 A EP 07787418A EP 07787418 A EP07787418 A EP 07787418A EP 2040623 A2 EP2040623 A2 EP 2040623A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protuberances
capture
cells
support
zones
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP07787418A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Marie-Line Cosnier
Patrice Caillat
Franck Martin
François Berger
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat a lEnergie Atomique CEA, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Publication of EP2040623A2 publication Critical patent/EP2040623A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B10/00—Instruments for taking body samples for diagnostic purposes; Other methods or instruments for diagnosis, e.g. for vaccination diagnosis, sex determination or ovulation-period determination; Throat striking implements
    • A61B10/02—Instruments for taking cell samples or for biopsy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B10/00—Instruments for taking body samples for diagnostic purposes; Other methods or instruments for diagnosis, e.g. for vaccination diagnosis, sex determination or ovulation-period determination; Throat striking implements
    • A61B10/02—Instruments for taking cell samples or for biopsy
    • A61B10/0291—Instruments for taking cell samples or for biopsy for uterus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B10/00—Instruments for taking body samples for diagnostic purposes; Other methods or instruments for diagnosis, e.g. for vaccination diagnosis, sex determination or ovulation-period determination; Throat striking implements
    • A61B10/02—Instruments for taking cell samples or for biopsy
    • A61B2010/0216—Sampling brushes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B17/00—Surgical instruments, devices or methods
    • A61B17/32—Surgical cutting instruments
    • A61B2017/320004—Surgical cutting instruments abrasive
    • A61B2017/320008—Scrapers

Definitions

  • the invention relates to the field of clinical diagnosis and / or noninvasive therapeutic monitoring. More particularly, the invention relates to a microtechnological device for collecting cells of biological interest by contact.
  • spatula-type cell harvesting tools such as the cytological cell collection devices described in US Pat. No. 6,607,494 and in PCT Patent Application 99/25251. Such devices are intended to collect cells on the surface of a cellular tissue directly accessible by natural means.
  • the invention in one aspect aims to overcome the disadvantages of existing sampling devices.
  • An object of the present invention is in particular to perform non-invasive samples of small amounts of cells.
  • the present invention thus provides a microtechnological device for collecting cells by contact with a tissue or other body element comprising a support having at least one face of interest on which is present at least one capture zone consisting of a bottom wall provided with a plurality of protuberances.
  • the height of the protuberances of a device according to the invention is between 10 ⁇ m and 400 ⁇ m and the surface of the protuberances is between 3 x 3 ⁇ m and 80 x 80 ⁇ m; the protuberances, for example hexagonal or octagonal section, can be separated by spaces whose width is less than 50 microns.
  • a capture zone comprises a bowl, said bottom wall corresponding to the bottom of the bowl.
  • the bottom wall and / or the protuberances of a capture zone are functionalized, for example by adhesion molecules and / or by anti-bodies, the functionalized surfaces can be of anionic type. or cationic.
  • bottom wall and / or the protuberances of a capture zone may be covered with microbeads, which may be functionalized.
  • the functionalization may in particular comprise the presence of ligands joined to the surface by a silylated function.
  • the device according to the invention comprises a plurality of capture zones on the same face of interest, the capture zones being separated by first interval zones.
  • Means may be present in the gap areas to separate the capture areas, for example notches on one side of said support.
  • the support of the device is in the form of a plate; it comprises first and second main planar faces with the exception of capture areas and possible means for separating them.
  • the support may be plastic or be a microtechnological substrate, especially silicon.
  • the invention may further comprise a handling rod whose end is associated with the support.
  • a guide sleeve may also be provided.
  • the invention relates to a method of removing cells from or in a tissue or other body element using a microtechnological device comprising a support having at least one face of interest on which there is at least one capture zone consisting of a bottom wall provided with a plurality of protuberances, the collection of cells being carried out by placing said at least one capture zone in contact with the tissue or the body element.
  • the sample is not of the surgical type, that is to say for example that it relates to a tissue that has been previously removed, for example by biopsy, or that it relates to a dead body.
  • the method can also be adapted and used in a patient or a living animal.
  • the invention relates to a method for diagnosing and / or analyzing a tissue or other body element comprising a sampling step as defined above.
  • a step of observation, by means of a microscope, of the cells present on the device after sampling may be provided, and / or a step of culturing the cells present on the device after sampling.
  • Figure 1 shows a contact pickup system according to an embodiment of the invention.
  • Figure 2 shows an embodiment of a capture area for a device according to the invention.
  • FIG. 3 illustrates an example of functionalization of the surface of the device according to the invention.
  • Figure 4 illustrates a functionalization by beads.
  • FIGS. 5A to 5D illustrate different embodiments of means for separating the capture zones of a device according to the invention.
  • Figure 6 shows a method of using a device according to the invention.
  • the present invention aims to collect a small amount of cells from a tissue or a body element by means of a microtechnological sampling device described below.
  • tissue or other body element any structural or functional entity of a human or animal body. It is for example an organ, that is to say a differentiated functional and structural entity that is specialized for a particular function (brain, lungs, ).
  • a fabric is by example a tumor.
  • other body element refers, among other things, to the skin, the venous-cardiac system and the digestive system.
  • the collection of cells from a tissue or a body element by means of a device according to the present invention can be carried out in vivo or ex vivo, for example in situ.
  • microtechnological sampling device Since the microtechnological sampling device according to the invention is very small, millimetric or less, it is preferably associated with handling means. Various sampling systems including such a microtechnological sampling device can be envisaged depending on the type of sampling planned.
  • FIG. 1 illustrates an example of a sampling system 1 making it possible to take cells inside a tissue or a body element; the sample may concern a body, human or animal, living or dead, or even a biopsy extracted from an animal or a patient, or any other tissue of interest.
  • the system comprises a guide sleeve 2, for example a catheter: the guide 2 makes it possible, among other things, to define the passageway for the sampling device. In particular, it may be put in place, possibly under optical or radiological control, beforehand in a target zone 3 of a tissue or other body element.
  • the end portion 4 of the guide 2 is provided with closure means 5 which protect the sampling device 6 during its insertion and make it possible to put it in contact with the tissue or the bodily element of interest 3 once in place.
  • the sealing means 5 are preferably located along the longitudinal axis of the guide 2, the distal end is closed.
  • the sealing means 5 may for example be a rotary or sliding window, or a partially absorbable membrane.
  • the sampling device 6 advantageously comprises a handling rod 7, the length of which depends on the use and the depth of insertion, and which can slide in the guide 2.
  • the end portion 8 of the rod 7 is intended to to the sample itself.
  • the guide 2 and thus the manipulation rod 7 have a very small diameter so as not to alter the tissue or the body element 3, and so as to allow non-invasive procedures.
  • the rod 7 may have a diameter restricted to a few millimeters, or even 100 microns; the guide 2 has an outer diameter close to the diameter of the rod 7.
  • the rod may, for example, be of surgical stainless steel.
  • the end portion 8 of the sampling device 6 has at least one capture zone 10 whose developed surface is much greater than the normal surface, from 3 to more than 20 times.
  • the sampling device 6 thus comprises a support 12 which is preferably independent of the handling rod 7 at the end of which it can be secured, for example by gluing preferably with a biocompatible glue. This makes it possible in particular to separate the manufacturing processes of the two handling and sampling parts, and to use a biocompatible rod 7 conventional low cost.
  • the support 12 is preferably made of a biocompatible material, in particular silicon as specified below; the different elements making up the guide sleeve 2 are also compatible with a biological and / or medical use, for example in gold or plastic, ....
  • the support 12 may be of any shape, but advantageously it is plane, in the form of a plate, as will appear in the description of the manufacturing processes. Whatever the case, it is possible to define on the support 12 a first face 14 and a second opposite face 16: in the case of a non-planar support 12, the terms “face” and “opposite face” designate portions of the outer surface of the support 12 which are symmetrical with respect to a secant plane of the support 12.
  • the faces 14, 16 are included in a support 12 which is of the order of 1 to 3 cm long (in the direction of the rod) over a width of 300 to 800 ⁇ m, for a thickness of the order of 200 to 400 ⁇ m.
  • the first face 14 of the support 12 is provided with a capture zone 10; it is preferable that the capture zone 10 leaves a proximal end portion 8 sufficiently long, for example from 2 to 5 mm, to allow easy attachment to the rod 7.
  • a preferred embodiment P relates to a support 12 rectangular silicon of dimensions 300 ⁇ m ⁇ 600 ⁇ m ⁇ 2 cm, the structured zone 10 starting at 3.2 mm from the edge secured to the rod 7.
  • several capture zones 10a, 10b, 10c, 10d are present on the face 14 of the support 12, separated by zones of gap 18.
  • the interval zones 18 may be only "virtual”, that is to say that the capture zones 10 are a priori confused at the macroscopic level, but that means make it possible to distinguish them at the microscopic level. or even to separate them.
  • capture zones 20 are placed on the second face 16.
  • the second capture zones 20 are aligned and in opposition with the first zones 10.
  • the second capture areas 20 may be identical in nature and geometry to the first zones 10, or different, as shown diagrammatically in FIG. 1: the various embodiments presented below may be combined.
  • At least one capture zone of the sampling device comprises a set of protuberances or pins.
  • the pins are intended to come into contact with the cells to be taken, the cells removed being trapped between the pins of the device.
  • FIG 2 illustrates an example of a sampling device including a set of protuberances on a capture area.
  • the capture zone 10 comprises a bottom wall 22.
  • the bottom wall 22 can be placed at the bottom of an open cavity formed on the surface of the support 12 or can be an "open" surface laterally, as this is shown in Figure 2.
  • the bottom wall 22 has a surface s_, and has a plurality of protuberances 24.
  • the capture area comprises a cavity
  • the height of the protuberances 24 is identical to the depth of the cavity but it is possible that they are prominent.
  • the surface of the support 12 is uniform, preferably flat, with the exception of the capture zones 10, and any separation means (described later).
  • the developed area _S of the capture zone 10 is therefore equal to the surface s_ of the bottom wall 22 to which is added the surface of each of the lateral walls of the protuberances 24.
  • the surfaces satisfy the relation: S> 3 -s, the factor 3 may advantageously take the values 5 or 10 for example.
  • the protuberances 24 can take any desired geometry, for example square columns or hexagonal section. Preferably, the protuberances 24 are arranged in a regular manner, for example in a square or hexagonal mesh network. According to the mode preferred embodiment P, the surface patterning is in the form of octagonal pins 24 of silicon, 50 ⁇ m high and 20 or 80 ⁇ m wide. Different manufacturing processes can be envisaged for such capture zones 10: for example, if the support 12 is made of plastic, it is possible to use injection or hot-stamping techniques ("hot embossing”), which make it possible to obtain, by replication, complementary pieces of molds previously produced.
  • hot embossing injection or hot-stamping techniques
  • the removal of cells from or into a tissue or other body element by means of a microtechnological sampling device involves contacting the capture areas of the device with the tissue or body component. This contact can be more or less pronounced. By a micro-abrasion effect, it is possible to recover cells between the protuberances or pins of the sampling device.
  • the capture zones are preferably covered with a coating having an "attractive” power on the cells.
  • This attractive power can be electrical, chemical, physical ...
  • the capture areas covered with such a coating are called “functionalized”. Examples of coating are described below. Among these examples we can define two families coating.
  • the first family includes coatings able to react or interact directly with cells.
  • the second family includes coatings capable of reacting or interacting with smaller elements, such as proteins, present around cells or in the extracellular matrix of cells. In the case of a coating of the second family, the attraction of the cells is via the attraction between the device and the smaller target cells of the cell.
  • coatings consisting of adhesion molecules such as adhesion proteins or peptides, coatings consisting of antibodies or anionic or cationic coatings.
  • an electrically conductive coating possibly covered with a thin, biocompatible insulating layer.
  • Such an electrical coating can be polarized positively or negatively by means of an electric polarization device.
  • Such an electrical polarization device could be "embedded" on the sampling device and possibly be realized monolithically with the latter.
  • a capture zone 10 In order to increase the attractive power of a capture zone, it is also possible to increase the developed area of a capture zone 10 by covering the bottom wall 22 and possibly the protuberances 24 with microbeads. It should be noted that the microbeads must not completely fill the spaces 26 between the protuberances 24 in order to maintain a sufficient space between the protuberances for the sampled cells.
  • Microbeads are commonly used in microbiology; they conventionally have a diameter of the order of ten nanometers up to a hundred microns, and may be composed of glass, porous or not, which allows them to be functionalized and remain biocompatible.
  • the coupling function A corresponds to all existing organic and inorganic functions such as the functions: CH 3 , alkenes, alkynes, aryl derivatives, halogens (Br, Cl, I, F), organometallic derivatives, alcohols, phenols, diols , ethers, epoxies, carbonyl derivatives (aldehydes, ketones, carboxylic acids, carboxylates, esters, amides, acid chlorides, acid anhydrides), nitrogen derivatives (amines, nitro derivatives, diazos derivatives, imines, enamines, oximes, nitriles ), phosphorus derivatives (phosphines, phosphites, phosphates, phosphonates), silicon derivatives, sulfur derivatives (sulphides, disulphides, thiols, thioethers, sulphones, sulphites, sulphates, sulphonic acids, sulphonates, azasulfonium
  • a spacer group E, used between the two functions A, Y of the coupling agent, makes it possible to confer particular properties on the film obtained by silanization.
  • the group E is chosen from among the radicals making it possible to obtain an organized monolayer: a long chain alkylene radical E allows interchain interaction (among the radicals E of the alkylene type, those having from 8 to 24 atoms are particularly preferred.
  • a radical E comprising two triple bonds -C C- allows crosslinking; a radical E comprising a conjugated aromatic chain confers nonlinear optical properties (for example, mention may be made of phenylene-vinylene and phenylene-acetylene radicals); a radical E of the pyrrole, thiophene or polysilane type confers an electronic conduction; a radical E of the heterosubstituted polyaromatic type confers photo / electroluminescence properties (for example, mention may be made of quinones and diazo compounds); a group E of the alkyl or fluoroalkyl type, in particular an alkyl or fluoroalkyl group having from 3 to 24 carbon atoms, makes it possible to use the layers obtained by chromatography or electrophoresis.
  • the surface ester functions located on the tool will react with functionalized beads bearing primary hydroxyl function. After immobilization of the balls, the tool has a hydrophilic developed surface (FIG. 4).
  • a sampling device makes it possible, thanks to the pins present on the cell capture zones, to recover one or more cell layers of the tissue or of the body element of interest. In the case of pins of a few tens of microns in height, it is possible to recover up to ten cell layers, depending on the size of the cells collected. Once the cell collection is done, it is possible to analyze the spatial composition of the sampled cell layers. For example, a microscope can be used to visually identify the nature of the cells removed.
  • An advantage of the sampling device according to the present invention is that the presence of cell multilayers makes it possible to obtain a histological section of a tissue or other body element. After collection, the recovered cells can be cultured in order to have a larger number of cells.
  • a sampling device makes it possible to recover "aggregates" of cells and not “dissociated” cells.
  • the culturing of cell aggregates makes it possible to obtain better yields and a better quality of the cultured cells. It is thus possible to envisage practicing cellular therapies from cells, and in particular cell aggregates, taken by a device according to the present invention.
  • Such a therapy would consist, for example, of taking "sick" autologous cells, of amplifying them (in particular by culture), of modifying their genome and then of reintroducing them into the tissue or the body element that one wishes to heal. Moreover, from the cells taken by means of a device according to the present invention, it is possible to carry out various analyzes of the molecules present in the cells or generated by them.
  • the capture zones are covered with a coating of the second family, it will also be possible to eliminate the cells present between the protuberances of a capture zone, and then carry out analyzes of the molecules "trapped" by the coating.
  • sampling device 6 has several capture areas 10i (see FIG. 1), it is possible to use the same functions on each capture zone, or to perform a spatial differentiation, for example by the known localized spotting ("spotting") for DNA chips.
  • spotting localized spotting
  • the supports 12 may be divisible for each of the preceding embodiments.
  • the interval zones 18 between the capture zones 10 are provided with separation means. For example, notches may have been etched at the same time as the realization of the protuberances 24 and / or walls: FIGS. Interval areas 18 can then easily be sectioned.
  • cleavage primer 42 by etching the support 12 on the face 16 opposite to the face 14 comprising the capture zones 10, by mask and etching for example (FIG. 5A ). It is also possible to make this notch 44 on the "front" face 14, or to choose, for example, an isotropic chemical etching, for example KOH (FIG. 5B).
  • capture zones 10, 20 are present on each face 14, 16, it is possible to position separation means only on one of the faces (FIG. 5C), or both (FIG. 5D).
  • two embodiments can be noted for the devices comprising capture zones 10, 20 on each of their opposite faces 14, 16: a support 12 (FIG. 5C) or bonding of two supports 12, 12 '(FIG. 5D ).
  • notches 42, 44 can be used interchangeably and in combination.
  • a silicon wafer 100 mm in diameter is machined to obtain 142 end devices after cutting.
  • the support 12 of silicon is advantageously marked: in particular, the name of the device, alignment crosses, cutting marks, etc. are etched, for example at 500 nm, by photolithography with mask and dry etching.
  • the rear face undergoes a similar treatment (photolithography with mask aligned with the previous one, dry etching of 5 to 10 ⁇ m, removal of the resin from the mask) to form notches.
  • the front face is then drawn and engraved for microstructuring, with photolithography with aligned mask, 50 ⁇ m deep dry etching and removal of the resin.
  • the surfaces are then prepared to allow their biological and / or medical use: in particular the polymer (for example C 4 F 8 ) formed on the flanks of the cavities during etching is removed, by total deoxidation, followed by wet oxidation. over 100 nm, then total deoxidation; a final SiO 2 layer is obtained by wet oxidation over 500 nm.
  • the polymer for example C 4 F 8
  • the guide 2 is first put in place, preferably under control in the target zone 3; the support 12 is glued at the end of the rod 7.
  • the rod 7 is inserted into the guide 2, under optical control also to ensure the accuracy of its positioning, and in particular to determine the areas A, B, C, D of the tumor 3 corresponding to each of the capture zones 10a-10d.
  • the sealing means 5 are open, and the sample is taken by apposition; no manipulation of the device itself is necessary, the contact area of the capture areas 10 being directly accessible (without cover for example). This also allows a miniaturization of the whole, and In particular, the support 12.
  • the closure means 5 can then optionally be closed again.
  • the rod 7 is then removed from the guide 2, the support 12 is detached, and the capture areas 10a-10d can be analyzed.
  • each zone 10a-10d is treated independently.
  • the support 12 is broken and the different zones 10a-10d can be processed, analyzed separately.
  • the cells A, B, C, D are extracted and introduced into tubes 50a-50d and "rinsed" with solutions for extracting the cells from the capture zones.
  • the support 12 which thus retains the definition of the active zones AD stepped within the tumor 3. It is the support 12 itself which serves as a substrate for the device 60 of final analysis, for example for microscopic observation or cell culture. Whichever approach is chosen, one can obtain a map of the tissue of interest, and results concerning the cellular and protein composition as a function of the depth in the target zone 3.
  • the sampling device according to the invention thus has particularly advantageous characteristics: the sample is not very invasive: in particular, the apparent diameter of the device 6, and even of the system 1, is reduced, in particular to a few millimeters, preferably 1 mm,
  • the sample is not aggressive: it is done by contact (or "apposition") without tissue section 3,
  • the portion of the machined device actually used for sampling is reduced and covers only the support 12, which can be associated with a low-cost handling rod, the machining of the sampling portion 12 is reduced to the manufacture of the contact zones 10, 20, without other mechanical elements or additional steps of sealing or gluing, the device 6 can be used in surgical procedure in vivo or post-operatively, or be used in vitro on a tissue removed and requesting cellular and possibly molecular analysis,
  • staged capture zones 10a-IOd makes it possible to analyze, after imprinting, the distribution of the cells of interest in the sampling zone 3, each capture zone 10 can be functionalized according to the targeted cells and / or the type of analysis or subsequent treatment, each capture zone 10a-10d can be separated from the others and be analyzed by a clean technique, the support of the device 12 can be compatible with any equipment for analysis or subsequent treatment, mapping along the depth axis of the zone 3 analyzed can be established according to the successive active zones DA differentiated along the device; the stereoscopic method of operation makes it possible to precisely guide the device 6 and to know exactly which region AD has been probed.
  • anionic type coating is described below.
  • the previous device P Si support 600 ⁇ 300 ⁇ m 2 , with 24 octagonal protuberances was silanized and then functionalized to give the carboxylate function. Indeed, at physiological pH, biological systems are naturally charged; ionic interactions (based on the principles of chromatography) can be used to specifically absorb protein markers. For anionic surfaces (negatively charged), the carboxylate derivatives are the most commonly used.
  • the acid function is protected in the form of a methyl ester after reaction of undecenoic acid with sulfuric acid and methanol; the incorporation of the silyl group is conventionally carried out by a hydrosilylation reaction.
  • 10-undec-1-ene is manufactured to form the methyl ester of trimethoxysilylundecan-10-oic acid by the following method:
  • the hydroxylation of the silicon substrate coated with a thermal oxide layer of 500 nm is carried out in a 3.5 M sodium hydroxide solution for 2 hours, with a silanizing solution of concentration 10 -2 M in anhydrous trichlorethylene, the silanization reactions being carried out at a controlled temperature of 2 ° C for 24 h.
  • the modified support is brought into contact with a solution of aluminum iodide in order to release the carboxylic acid function, which will in turn react with an aqueous sodium hydroxide solution to give the corresponding carboxylate function.
  • a solution of aluminum iodide in order to release the carboxylic acid function, which will in turn react with an aqueous sodium hydroxide solution to give the corresponding carboxylate function.

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Abstract

Un dispositif microtechnologique (6) permet le prélèvement de cellules sur ou dans un tissu ou un autre élément corporel. Il comprend un support (12) ayant au moins une face d'intérêt (14) sur laquelle est présente au moins une zone de capture (10) constituée d'une paroi de fond (22) munie d'une pluralité de protubérances (24). De préférence, le dispositif microtechnologique comprend au moins une zone de capture recouverte d'un revêtement ayant un pouvoir attractif sur les cellules à prélever.

Description

DISPOSITIF DE PRELEVEMENT CELLULAIRE PAR CONTACT
DESCRIPTION
DOMAINE TECHNIQUE
L' invention concerne le domaine du diagnostic clinique et/ou du suivi thérapeutique non invasif. Plus particulièrement, l'invention se rapporte à un dispositif microtechnologique de prélèvement de cellules d'intérêt biologique par contact.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE
II existe des outils de prélèvement de cellules, de type spatule, tels que les dispositifs de collecte de cellules cytologiques décrits dans le brevet US 6 607 494 et dans la demande de brevet PCT 99/25251. De tels dispositifs sont destinés à collecter des cellules en surface d'un tissu cellulaire directement accessible par des voies naturelles.
Dans le cas où l'on souhaite recueillir des cellules d'un organe non accessible directement, on procède de façon générale à une biopsie. Les cellules recueillies sont ensuite analysées ex situ. Ces techniques altèrent donc l'intégrité biologique. De plus, elles ne peuvent pas toujours être utilisées, d'autant plus que l'insertion même d'un dispositif de prélèvement doit être minimale dans certaines régions, telles que le cerveau.
De plus, même dans le cas où l'on réalise une biopsie ou un prélèvement d'organes sur un humain ou un animal, il est de façon générale souhaitable de pouvoir récupérer une petite quantité de cellules sans dégrader le tissu ou l'organe prélevé. Ceci permet en effet de pouvoir procéder à d' autres traitements ou analyses du prélèvement effectué.
EXPOSÉ DE L'INVENTION
L'invention sous l'un de ses aspects vise à pallier les inconvénients des dispositifs de prélèvement existants.
Un objet de la présente invention est notamment de pouvoir effectuer des prélèvements non- invasifs de petites quantités de cellules.
Pour atteindre cet objet, la présente invention prévoit ainsi un dispositif microtechnologique de prélèvement de cellules par contact avec un tissu ou un autre élément corporel comprenant un support ayant au moins une face d' intérêt sur laquelle est présente au moins une zone de capture constituée d'une paroi de fond munie d'une pluralité de protubérances . Avantageusement, la hauteur des protubérances d'un dispositif selon l'invention est comprise entre 10 μm et 400 μm et la surface des protubérances est comprise entre 3 x 3 μm et 80 x 80 μm ; les protubérances, par exemple à section hexagonale ou octogonale, peuvent être séparées par des espaces dont la largeur est inférieure à 50 μm.
Il est possible qu'une zone de capture comprenne une cuvette, ladite paroi de fond correspondant au fond de la cuvette. Selon un mode de réalisation avantageux, la paroi de fond et/ou les protubérances d'une zone de capture sont fonctionnalisées, par exemple par des molécules d'adhésion et/ou par des anti-corps, les surfaces fonctionnalisées pouvant être de type anionique ou cationique.
Par ailleurs, la paroi de fond et/ou les protubérances d'une zone de capture peuvent être recouvertes de microbilles, qui peuvent être fonctionnalisées.
La fonctionnalisation peut notamment comprendre la présence de ligands solidarisés à la surface par une fonction silylée.
Avantageusement, le dispositif selon l'invention comprend une pluralité de zones de capture sur une même face d'intérêt, les zones de capture étant séparées par des premières zones d'intervalle. Des moyens peuvent être présents dans les zones d'intervalle pour séparer les zones de capture, par exemple des encoches sur une des faces dudit support.
Selon un mode de réalisation préféré, le support du dispositif est sous forme de plaque ; il comprend des première et deuxième faces principales planes à l'exception des zones de capture et des éventuels moyens pour les séparer.
Le support peut être en plastique ou être un substrat microtechnologique, notamment en silicium.
Il peut comprendre en outre une tige de manipulation dont une extrémité est associée au support. Un manchon de guidage peut également être prévu. Sous un autre aspect, l'invention concerne un procédé de prélèvement de cellules sur ou dans un tissu ou un autre élément corporel au moyen d'un dispositif microtechnologique comprenant un support ayant au moins une face d' intérêt sur laquelle est présente au moins une zone de capture constituée d'une paroi de fond munie d'une pluralité de protubérances, le prélèvement de cellules étant effectué par une mise en contact de ladite au moins une zone de capture avec le tissu ou l'élément corporel.
Selon l'invention, le prélèvement n'est pas du type chirurgical, c'est-à-dire par exemple qu'il concerne un tissu qui a été préalablement prélevé, par exemple par biopsie, ou qu'il concerne un corps mort. Cependant, il est évident que le procédé peut également être adapté et utilisé chez un patient ou un animal vivant .
En particulier, l'invention concerne un procédé de diagnostic et/ou d'analyse d'un tissu ou d'un autre élément corporel comprenant une étape de prélèvement telle que définie précédemment. Une étape d'observation, au moyen d'un microscope, des cellules présentes sur le dispositif après prélèvement peut être prévue, et/ou une étape de mise en culture des cellules présentes sur le dispositif après prélèvement.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS
Les caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre et en référence aux dessins annexés, donnés à titre illustratif et nullement limitatifs .
La figure 1 représente un système de prélèvement par contact selon un mode de réalisation de 1' invention .
La figure 2 montre un mode de réalisation d'une zone de capture pour un dispositif selon 1' invention .
La figure 3 illustre un exemple de fonctionnalisation de la surface du dispositif selon 1' invention .
La figure 4 illustre une fonctionnalisation par billes.
Les figures 5A à 5D illustrent différents modes de réalisation de moyens pour séparer les zones de capture d'un dispositif selon l'invention.
La figure 6 présente un procédé d'utilisation d'un dispositif selon l'invention.
EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE L'INVENTION
La présente invention vise à prélever une petite quantité de cellules d'un tissu ou d'un élément corporel au moyen d'un dispositif de prélèvement microtechnologique décrit ci-après.
Dans la présente description, on entend par tissu ou autre élément corporel, n'importe quelle entité structurelle ou fonctionnelle d'un corps humain ou animal. C'est par exemple un organe, c'est-à-dire une entité fonctionnelle et structurelle différenciée qui est spécialisée pour une fonction particulière (cerveau, poumons,...). Un tissu est par exemple une tumeur. Le terme « autre élément corporel » fait référence entre autres à la peau, au système veineux-cardiaque, à l'appareil digestif.
Le prélèvement de cellules sur un tissu ou un élément corporel au moyen d'un dispositif selon la présente invention peut être effectué in vivo ou ex vivo, par exemple in situ.
Le dispositif de prélèvement microtechnologique selon l'invention étant de très petite taille, millimétrique ou moins, celui-ci est de préférence être associé à des moyens de manipulation. Divers systèmes de prélèvement incluant un tel dispositif de prélèvement microtechnologique peuvent être envisagés en fonction du type de prélèvement prévu.
La figure 1 illustre un exemple de système de prélèvement 1 permettant de prélever des cellules à l'intérieur d'un tissu ou d'un élément corporel ; le prélèvement peut concerner un corps, humain ou animal, vivant ou mort, voire une biopsie extraite d'un animal ou d'un patient, ou tout autre tissu d'intérêt. Le système comprend un manchon de guidage 2, par exemple un cathéter : le guide 2 permet entre autres de définir la voie de passage du dispositif de prélèvement. On peut en particulier le mettre en place, éventuellement sous contrôle optique ou radiologique, préalablement dans une zone cible 3 d'un tissu ou d'un autre élément corporel. Avantageusement, la partie d'extrémité 4 du guide 2 est munie de moyens d' obturation 5 qui protègent le dispositif de prélèvement 6 lors de son insertion et permettent de le mettre en contact avec le tissu ou l'élément corporel d'intérêt 3 une fois en place. Les moyens d'obturation 5 sont de préférence localisés le long de l'axe longitudinal du guide 2 dont l'extrémité distale est fermée. Les moyens d'obturation 5 peuvent par exemple être une fenêtre rotative ou coulissante, ou une membrane résorbable partiellement.
Le dispositif de prélèvement 6 comprend avantageusement une tige de manipulation 7, dont la longueur dépend de l'utilisation et de la profondeur d'insertion, et qui peut coulisser dans le guide 2. La partie d'extrémité 8 de la tige 7 est destinée au prélèvement proprement dit. Avantageusement, le guide 2 et donc la tige de manipulation 7 ont un diamètre très faible de façon à ne pas altérer le tissu ou l'élément corporel 3, et de façon à permettre des interventions non invasives. Ainsi, la tige 7 peut avoir un diamètre restreint à quelques millimètres, voire 100 μm ; le guide 2 a un diamètre externe voisin du diamètre de la tige 7. La tige peut, par exemple, être en acier inoxydable chirurgical.
La partie d'extrémité 8 du dispositif de prélèvement 6 possède au moins une zone de capture 10 dont la surface développée est très supérieure à la surface normale, de 3 à plus de 20 fois. Le dispositif de prélèvement 6 comprend ainsi un support 12 qui est de préférence indépendant de la tige de manipulation 7 à l'extrémité de laquelle il peut être solidarisé, par exemple par collage de préférence par une colle biocompatible. Ceci permet notamment de séparer les procédés de fabrication des deux parties de manipulation et de prélèvement, et d'utiliser une tige biocompatible 7 classique de faible coût. Le support 12 est fabriqué de préférence en un matériau biocompatible, notamment le silicium tel que précisé plus loin ; les différents éléments composant le manchon de guidage 2 sont eux aussi compatibles avec un usage biologique et/ou médical, par exemple en or ou en plastique,....
Le support 12 peut être de forme quelconque, mais avantageusement il est plan, sous forme de plaque, tel qu'il apparaîtra à la description des procédés de fabrication. Quoi qu'il en soit, on peut définir sur le support 12 une première face 14 et une deuxième face opposée 16 : dans le cas d'un support 12 non plan, les termes « face » et « face opposée » désignent des portions de la surface externe du support 12 qui sont symétriques par rapport à un plan sécant du support 12. Avantageusement, les faces 14, 16 sont comprises dans un support 12 qui fait de l'ordre de 1 à 3 cm de long (dans le sens de la tige) sur une largeur de 300 à 800 μm, pour une épaisseur de l'ordre de 200 à 400 μm.
La première face 14 du support 12 est munie d'une zone de capture 10 ; il est préférable que la zone de capture 10 laisse une partie proximale d'extrémité 8 suffisamment longue, par exemple de 2 à 5 mm, pour permettre une solidarisation aisée avec la tige 7. Ainsi, un mode de réalisation préféré P concerne un support 12 en silicium, rectangulaire de dimensions 300 μm x 600 μm x 2 cm, la zone structurée 10 commençant à 3,2 mm du bord solidarisé à la tige 7. De façon préférée, et tel que schématisé, plusieurs zones de capture 10a, 10b, 10c, 1Od sont présentes sur la face 14 du support 12, séparées par des zones d'intervalle 18. Dans le cadre représenté, quatre zones de capture sont présentes, mais il est clair que leur nombre dépend de l'utilisation, en particulier de la taille du dispositif 6, de la taille de la zone cible 3 et de la quantité de cellules d'intérêt dans cette zone 3, ainsi que du procédé de fabrication. De même, les zones d'intervalle 18 peuvent n'être que « virtuelles », c'est-à-dire que les zones de capture 10 sont confondues a priori au niveau macroscopique, mais que des moyens permettent de les distinguer au niveau microscopique, voire de les séparer.
Il est possible aussi que des zones de capture 20 soient placées sur la deuxième face 16. De façon préférée, et tel qu'il apparaîtra plus clairement plus loin, les deuxièmes zones de capture 20 sont alignées et en opposition avec les premières zones 10. Les deuxièmes zones de capture 20 peuvent être de nature et géométrie identiques aux premières zones 10, ou différentes, tel que schématisé dans la figure 1 : les divers modes de réalisation présentés plus loin peuvent être combinés.
Selon un aspect du dispositif de prélèvement selon la présente invention, au moins une zone de capture du dispositif de prélèvement comprend un ensemble de protubérances ou picots. Comme cela est décrit plus en détail ci-après, les picots sont destinés à venir en contact avec les cellules à prélever, les cellules prélevées étant piégées entre les picots du dispositif.
La figure 2 illustre un exemple de dispositif de prélèvement incluant un ensemble de protubérances sur une zone de capture. La zone de capture 10 comprend une paroi de fond 22. Suivant le mode de fabrication, la paroi de fond 22 peut être placée au fond d'une cavité ouverte formée en surface du support 12 ou peut être une surface « ouverte » latéralement, comme cela est représenté en figure 2. La paroi de fond 22 a une surface s_, et présente une pluralité de protubérances 24. De préférence, si la zone de capture comprend une cavité, la hauteur des protubérances 24 est identique à la profondeur de la cavité, mais il est possible qu'elles soient saillantes. Par ailleurs, il est préférable que la surface du support 12 soit uniforme, de préférence plane, à l'exception des zones de capture 10, et des éventuels moyens de séparation (décrits plus loin) . La surface développée _S de la zone de capture 10 est donc égale à la surface s_ de la paroi de fond 22 à laquelle s'ajoute la surface de chacune des parois latérales des protubérances 24. Selon l'invention, les surfaces vérifient la relation : S > 3 -s, le facteur 3 pouvant avantageusement prendre les valeurs 5 ou 10 par exemple.
Les protubérances 24 peuvent prendre toute géométrie désirée, par exemple des colonnes carrées ou à section hexagonale. De préférence, les protubérances 24 sont arrangées de façon régulière, par exemple en réseau à mailles carrées ou hexagonales. Selon le mode de réalisation préféré P, la structuration de surface se présente sous la forme de picots octogonaux 24 de silicium, de 50 μm de hauteur et 20 ou 80 μm de largeur . Différents procédés de fabrication sont envisageables pour de telles zones de capture 10 : par exemple, si le support 12 est en plastique, il est possible d'utiliser des techniques d'injection ou d'empreinte à chaud (« hot embossing ») , qui permettent d'obtenir par réplication des pièces complémentaires de moules réalisés préalablement. On pourra ainsi fabriquer des protubérances 24 de 20 μm de côté, sur une hauteur de 50 μm à bas coût, sur un support 12 en polyéthylène, ou poly (méthyl) métacrylate (PMMA), ou polycarbonate, ou polydiméthylsiloxane (PDMS) , ou parylène, ou Téflon™ ; une option est également de déposer un de ces matériaux, notamment le parylène ou le Téflon™, sur une surface plastique, voire métallique, quelconque afin de la rendre biocompatible. Si un rapport surface/volume plus élevé est souhaité, il est possible d'utiliser des techniques de microtechnologie. Par exemple, le procédé décrit en référence aux figures 7 du document FR-A-2 846 957 peut être utilisé ; le procédé décrit dans ce document est cependant simplifié car seul le support 12 est usiné : il n'y a pas de formation de canaux d'alimentation et/ou de scellement de capot. Un tel procédé permet d'obtenir des protubérances 24 de 5 μm de côté sur une hauteur de 100 μm sur un support 12 en silicium. Plus généralement, les protubérances 24 peuvent faire de 5 à 20 μm (même si des tailles jusque 80 ou 100 μm peuvent aussi être réalisées de cette manière) de côté pour 50 à 400 μm de profondeur ; l'usinage du support 12 est tel qu'en fin de procédé, le dispositif soit biocompatible. En particulier, un support 12 en silicium est oxydé pour être revêtu de Siθ2, de comportement biocompatible analogue au verre.
Pour réaliser des zones de capture 10, 20 sur les deux faces opposées du support 12, il est possible par exemple de coller deux supports 12, 12' réalisés comme précédemment (voir figure 5D), ou de fabriquer un module double face par les techniques microtechnologiques sur silicium ou de moulage plastique (figure 5C) .
Le prélèvement de cellules sur ou dans un tissu ou un autre élément corporel au moyen d'un dispositif de prélèvement microtechnologique tel que celui décrit ci-dessus consiste à mettre en contact les zones de capture du dispositif avec le tissu ou l'élément corporel. Ce contact peut être plus ou moins prononcé. Par un effet de micro-abrasion, il est possible de récupérer des cellules entre les protubérances ou picots du dispositif de prélèvement.
Afin de pouvoir prélever des cellules avec un contact le plus « léger » possible, les zones de capture sont de préférence recouvertes d'un revêtement ayant un pouvoir « attractif » sur les cellules. Ce pouvoir attractif peut être de nature électrique, chimique, physique... Les zones de capture recouvertes d'un tel revêtement sont dites « fonctionnalisées ». Des exemples de revêtement sont décrits ci- après. Parmi ces exemples on peut définir deux familles de revêtement. La première famille inclut des revêtements aptes à réagir ou interagir directement avec des cellules. La seconde famille inclut des revêtements aptes à réagir ou interagir avec des éléments plus petits, tels que des protéines, présents autour des cellules ou dans la matrice extra-cellulaire des cellules. Dans le cas d'un revêtement de la seconde famille, l'attraction des cellules se fait par l'intermédiaire de l'attraction entre le dispositif et les éléments cibles plus petits de la cellule.
Dans la première famille, on citera notamment des revêtements constitués de molécules d'adhésion tels que des protéines d'adhésion ou des peptides, des revêtements constitués d' anti-corps ou encore des revêtements anioniques ou cationiques.
Dans la seconde famille de revêtements, on citera l'utilisation de sondes ADN.
On citera en outre la possibilité d'utiliser un revêtement électriquement conducteur éventuellement recouvert d'une fine couche isolante biocompatible. Un tel revêtement électrique peut être polarisé positivement ou négativement au moyen d'un dispositif de polarisation électrique. Un tel dispositif de polarisation électrique pourrait être « embarqué » sur le dispositif de prélèvement et être éventuellement réalisé de façon monolithique avec ce dernier .
Afin d'augmenter le pouvoir attractif d'une zone de capture, on pourra également augmenter la surface développée d'une zone de capture 10, en recouvrant la paroi de fond 22 et éventuellement les protubérances 24 avec des microbilles. On notera que les microbilles ne doivent pas remplir intégralement les espaces 26 entre les protubérances 24 afin de conserver un espace suffisant entre les protubérances pour les cellules prélevées.
Les microbilles sont utilisées de façon courante en microbiologie ; elles ont classiquement un diamètre de l'ordre d'une dizaine de nanomètres jusqu'à une centaine de microns, et peuvent être composées de verre, poreux ou non, ce qui leur permet d'être fonctionnalisées et de rester biocompatibles.
Un exemple de fonctionnalisation d'une zone de capture est décrit en relation avec la figure 3. Le procédé de fonctionnalisation s'effectue en deux ou trois étapes.
1) Synthèse d'une molécule organique bifonctionnelle Y-E-A appelée agent de couplage qui va permettre l'adhésion interfaciale non covalente entre des protéines et le support organique. 2) Fixation de l'agent de couplage sur le support inorganique 12, qui peut avoir été préalablement traité pour présenter une fonction de couplage W
(en particulier, il s'agit de la fonction W silylée
O-Si pour les substrats 12 en silicium recouvert d'une couche d'oxyde de silice), par réaction d'une des deux fonctions Y avec la surface, l'autre fonction A réagissant avec la protéine en formant une liaison non covalente.
3) Si la fonction terminale A permettant l'adsorption de la protéine n'a pu être synthétisée avec la fonction silylée pour cause d' incompatibilité chimique, le support modifié va subir une ou plusieurs réactions post-silanisation jusqu'à l'obtention de cette dernière.
La fonction de couplage A correspond à l'ensemble des fonctions organiques et minérales existantes telles que les fonctions : CH3, alcènes, alcynes, dérivés aryles, halogènes (Br, Cl, I, F), dérivés organométalliques, alcools, phénols, diols, éthers, époxys, dérivés carbonylés (aldéhydes, cétones, acides carboxyliques, carboxylates, esters, amides, chlorures d'acide, anhydrides d'acides), dérivés azotés (aminés, dérivés nitrés, dérivés diazos, imines, énamines, oximes, nitriles) , dérivés phosphores (phosphines, phosphites, phosphates, phosphonates) , dérivés du silicium, dérivés du soufre (sulfures, dissulfures, thiols, thioéthers, sulfones, sulfites, sulfates, acides sulfoniques, sulfonates, azasulfoniums) , dérivés du sélénium,....
Un groupe espaceur E, utilisé entre les deux fonctions A, Y de l'agent de couplage, permet de conférer des propriétés particulières au film obtenu par la silanisation . Le groupe E est choisi parmi les radicaux permettant d' obtenir une monocouche organisée : un radical E de type alkylène à longue chaîne permet une interaction interchaînes (parmi les radicaux E du type alkylène, on préfère tout particulièrement ceux qui ont de 8 à 24 atomes de carbone) ; un radical E comprenant deux triples liaisons -C=C- permet une réticulation ; un radical E comprenant une chaîne aromatique conjuguée confère des propriétés d'optique non linéaire (à titre d'exemple, on peut citer les radicaux phénylène-vinylène et phénylène-acétylène) ; un radical E du type pyrrole, thiophène ou polysilane confère une conduction électronique ; un radical E du type polyaromatique hétérosubstitué confère des propriétés de photo/électroluminescence (à titre d'exemple, on peut citer les quinones et les composés diazoïques) ; un groupe E du type alkyle ou fluoroalkyle, en particulier un groupe alkyle ou fluoroalkyle ayant de 3 à 24 atomes de carbone, permet d'utiliser les couches obtenues en chromatographie ou en électrophorèse .
En ce qui concerne la fonctionnalisation des billes, le même principe est utilisé.
Par ailleurs, il est possible de déposer différents types de billes selon les zones 1Oi de prélèvement, et ainsi d'obtenir un outil présentant un étagement de fonctions d'affinité A.
Par exemple, pour un substrat 12 de surface hydrophile comme Siθ2, silanisé, les fonctions esters de surface situées sur l'outil vont réagir avec des billes fonctionnalisées porteuses de fonction hydroxyle primaire. Après l'immobilisation des billes, l'outil possède une surface développée hydrophile (figure 4).
Un dispositif de prélèvement selon la présente invention permet grâce aux picots présents sur les zones de capture de cellules de récupérer une ou plusieurs couches de cellules du tissu ou de l'élément corporel d'intérêt. Dans le cas de picots de quelques dizaines de microns de hauteur, il est possible de récupérer jusqu'à une dizaine de couches cellulaires, en fonction de la taille des cellules recueillies. Une fois le prélèvement de cellules effectué, il est possible d'analyser la composition spatiale des couches de cellules prélevées. On peut par exemple utiliser un microscope pour identifier visuellement la nature des cellules prélevées.
Un avantage du dispositif de prélèvement selon la présente invention est que la présence de multicouches de cellules permet d'obtenir une coupe histologique d'un tissu ou d'un autre élément corporel. Après prélèvement, les cellules récupérées peuvent être mises en culture afin de disposer d'un plus grand nombre de cellules.
A partir des cellules prélevées et/ou des cellules cultivées, il est possible de réaliser des analyses génomiques ou transcriptomiques .
Par ailleurs, un dispositif de prélèvement selon la présente invention permet de récupérer des « agrégats » de cellules et non des cellules « dissociées ». Or la mise en culture d'agrégats de cellules permet d'obtenir de meilleurs rendements et une meilleure qualité des cellules cultivées. Il est ainsi possible d'envisager de pratiquer des thérapies cellulaires à partir de cellules, et notamment d'agrégats de cellules, prélevées par un dispositif selon la présente invention.
Une telle thérapie consisterait par exemple à prélever des cellules autologues « malades », à les amplifier (notamment par culture) , à modifier leur génome puis à les réintroduire dans le tissu ou l'élément corporel que l'on souhaite guérir. Par ailleurs, à partir des cellules prélevées au moyen d'un dispositif selon la présente invention, il est possible d'effectuer diverses analyses des molécules présentes dans les cellules ou générées par ces dernières.
Dans le cas où les zones de capture sont recouvertes d'un revêtement de la seconde famille, on pourra également éliminer les cellules présentes entre les protubérances d'une zone de capture, puis procéder à des analyses des molécules « piégées » par le revêtement .
Par ailleurs, dans le cas où le dispositif de prélèvement 6 possède plusieurs zones de capture 1Oi (voir figure 1), il est possible d'utiliser les mêmes fonctions sur chaque zone de capture, ou d'opérer une différenciation spatiale, comme par exemple par le dépôt localisé par gouttes (« spotting ») connu pour les puces à ADN.
Selon l'utilisation et notamment les analyses des molécules prélevées, il peut être intéressant de séparer les zones de capture 1Oa-IOd d'un même dispositif 6. En particulier, les supports 12 peuvent être sécables pour chacun des modes de réalisation précédents. Afin de faciliter la section du support 12, avantageusement, les zones d'intervalle 18 entre les zones de capture 10 sont munies de moyens de séparation. Par exemple, des encoches peuvent avoir été gravées en même temps que la réalisation des protubérances 24 et/ou des parois : figures 5. Les zones d'intervalle 18 peuvent alors facilement être sectionnées .
Différents modes de réalisation sont envisageables : par exemple, il est possible de réaliser une amorce de clivage 42 par gravure du support 12 sur la face 16 opposée à la face 14 comprenant les zones de capture 10, par masque et gravure par exemple (figure 5A) . On peut également réaliser cette encoche 44 sur la face « avant » 14, ou choisir par exemple une gravure chimique isotrope, par exemple au KOH (figure 5B) .
Si des zones de capture 10, 20 sont présentes sur chaque face 14, 16, il est possible de ne positionner des moyens de séparation que sur l'une des faces (figure 5C) , ou sur les deux (figure 5D) . On peut noter à cet égard deux modes de réalisation pour les dispositifs comprenant des zones de capture 10, 20 sur chacune de leurs faces opposées 14, 16 : un support 12 (figure 5C) ou collage de deux supports 12, 12' (figure 5D) .
Il est clair également que les différents modes de réalisation d'encoches 42, 44 peuvent être utilisés indifféremment et en combinaison.
Selon le mode de réalisation préféré P, une plaquette de silicium de 100 mm de diamètre est usinée pour obtenir 142 dispositifs finaux après découpe. Le support 12 en silicium est avantageusement marqué : en particulier, le nom du dispositif, des croix d'alignement, des repères de découpe,... sont gravés, par exemple à 500 nm, par photolithographie avec masque et gravure sèche. La face arrière subit un traitement similaire (photolithographie avec masque aligné sur le précédent, gravure sèche de 5 à 10 μm, retrait de la résine du masque) pour former des encoches. La face avant est alors dessinée et gravée pour la microstructuration, avec photolithographie avec masque aligné, gravure sèche profonde à 50 μm et retrait de la résine. Les surfaces sont ensuite préparées afin de permettre leur utilisation biologique et/ou médicale : en particulier le polymère (par exemple C4F8) formé sur les flancs des cavités lors des gravures est éliminé, par désoxydation totale, suivi d'une oxydation humide sur 100 nm, puis d'une désoxydation totale ; une couche de SiO2 finale est obtenue par oxydation humide sur 500 nm.
Selon un mode d'utilisation du dispositif selon l'invention schématisé en figure 6, le guide 2 est d'abord mis en place, de préférence sous contrôle dans la zone cible 3 ; le support 12 est collé en bout de tige 7. La tige 7 est insérée dans le guide 2, sous contrôle optique également afin d'assurer la précision de son positionnement, et en particulier de déterminer les zones A, B, C, D de la tumeur 3 correspondant à chacune des zones de capture 1Oa-IOd. Une fois les zones de capture 1Oa-IOd en place, les moyens d'obturation 5 sont ouverts, et le prélèvement est effectué par apposition ; aucune manipulation du dispositif lui-même n'est nécessaire, la surface de contact des zones de capture 10 étant directement accessible (sans capot par exemple) . Ceci permet par ailleurs une miniaturisation de l'ensemble, et notamment du support 12. Les moyens d'obturation 5 peuvent ensuite éventuellement être refermés. La tige 7 est alors retirée du guide 2, le support 12 en est détaché, et les zones de capture 1Oa-IOd peuvent être analysées.
Deux approches pour le traitement de l'échantillon prélevé peuvent être mises en œuvre lors de l'analyse :
1) Le dispositif 6 est sécable, et chaque zone 1Oa-IOd est traitée de façon indépendante. De fait, une fois la tige 7 retirée, le support 12 est cassé et les différentes zones 1Oa-IOd peuvent être traitées, analysées séparément. A titre d'exemple, les cellules A, B, C, D sont extraites puis introduites dans des tubes 50a-50d et « rincées » par des solutions permettant d'extraire les cellules des zones de capture .
2) II est possible également de ne pas couper le support 12, qui conserve ainsi la définition des zones actives A-D étagées au sein de la tumeur 3. C'est le support 12 lui-même qui sert de substrat pour le dispositif 60 d'analyse finale, par exemple pour une observation sous microscope ou une culture des cellules . Quelle que soit l'approche choisie, on peut obtenir une cartographie du tissu d'intérêt, et des résultats concernant la composition cellulaire et protéique en fonction de la profondeur dans la zone cible 3. Le dispositif de prélèvement selon l'invention présente ainsi des caractéristiques particulièrement avantageuses : le prélèvement est peu invasif : en particulier, le diamètre apparent du dispositif 6, et même du système 1, est réduit, notamment à quelques millimètres, de préférence 1 mm,
- le prélèvement est peu agressif : il se fait par contact (ou « apposition ») sans section de tissu 3,
- la partie du dispositif usinée et servant réellement au prélèvement est réduite et ne couvre que le support 12, qui peut être associé à une tige de manipulation 7 de bas coût, - l'usinage de la partie servant au prélèvement 12 est réduit à la fabrication des zones de contact 10, 20, sans autres éléments mécaniques ni étapes supplémentaires de scellement ou collage, le dispositif 6 peut être utilisé en geste opératoire in vivo ou en post-opératoire, ou être utilisé in vitro sur un tissu prélevé et demandeur d'analyse cellulaire et éventuellement moléculaire,
- la présence de zones de capture 1Oa-IOd étagées permet d' analyser après empreinte la répartition des cellules d'intérêt dans la zone de prélèvement 3, chaque zone de capture 10 peut être fonctionnalisée selon les cellules ciblées et/ou le type d'analyse ou de traitement ultérieur, - chaque zone de capture 1Oa-IOd peut être séparée des autres et être analysée par une technique propre, le support du dispositif 12 peut être compatible avec tout équipement d' analyse ou de traitement ultérieur, une cartographie selon l'axe de profondeur de la zone 3 analysée peut être établie selon les zones actives A-D successives différentiées le long du dispositif ; la méthode opératoire sous stéréoscopie permet en effet de guider précisément le dispositif 6 et de savoir exactement quelle région A-D a été sondée.
EXEMPLE DE REALISATION
Un exemple de revêtement de type anionique est décrit ci-après.
Le dispositif précédent P (support 12 en Si de 600 x 300 μm2 , avec protubérances 24 octogonales) a été silanisé puis fonctionnalisé pour donner la fonction carboxylate. En effet, à pH physiologique, les systèmes biologiques sont naturellement chargés ; les interactions ioniques (basés sur les principes de la chromatographie) peuvent être utilisées pour absorber de façon spécifique des marqueurs protéiques. Pour les surfaces anioniques (chargées négativement) , les dérivés carboxylates sont les plus couramment utilisés.
Les fonctions carboxylate et silane étant incompatibles, une stratégie de synthèse indirecte via l'ester de méthyle de l'acide triméthoxysilylundécan- 10-oique a été choisie.
HSi(OMe)3 Cat. de Karstedt
La fonction acide est protégée sous la forme d'un ester de méthyle après réaction de l'acide undécénoique avec de l'acide sulfurique et du méthanol ; l'incorporation du groupement silylié s'effectue classiquement par une réaction d' hydrosilylation . Par exemple, un ester de méthyle de l'acide
10-undéc-l-ènoique est fabriqué pour former l'ester de méthyle de l'acide triméthoxysilylundécan-10-oique par le procédé suivant :
- A une solution d' acide undécénoique (98 %) (10,47 g ; 11,5 mL ; 56 mmol) dissout dans
500 mL de méthanol, est additionné de l'acide sulfurique concentré (12,88 g ; 7 mL ; 131 mmol ; 2,3 éq.) . La réaction se déroule à 00C durant 4 heures.
— Après évaporation du méthanol et reprise à l'acétate d'éthyle, le mélange réactionnel est lavé successivement avec de l'EDI (x 2) et avec une solution saturée de chlorure de sodium, séché sur du sulfate de magnésium anhydre puis concentré pour donner un liquide incolore (10,99 g ; 99 %) . On obtient les caractéristiques suivantes : δH (200 MHz ; CDCl; 1,30 (10H m Rb-9,
1 ,62 (2H m • H
2 ,04 (2H m • H 10)
3 ,67 (3H s • H λ)
4 ,97 (2H m • H 12 )
5 ,81 (IH m • H lλ) δc (200 MHz ; CDCl3) 2 5,31
2 9,26
2 9,42
2 9,50
2 9,58
2 9, 66
34, 16
34,44
51,76 (C1)
1 14,51 (C] 2
)
1 39,4 1
6 (C] )
174,61 (C2 )
- L'ester méthylique de l'acide 10-undéc- 1-ènoique (10,58 g ; 53 mmol) est mélangé avec du triméthoxysilane (95 g 9,1 ml mmol
1,3 éq.) . Le catalyseur de Karstedt (0,13 g ; 0,13 mmol ; 0,0025 éq.) est additionné très lentement. La réaction se déroule à température ambiante durant 16 heures. Le brut réactionnel est purifié par distillation pour donner un liquide incolore (120-1250C à 0,5 mbar ; 11,7 g ; 70 %) : Su (200 MHz ; CDCl3) : 0,65 (2H ; m ; H12 >
1,27 (14H ; m ; H5"11)
1, 62 (2H ; m ; H4)
2,30 (2H ; t ; H3 ; 3JH-H = 7, 4 Hz)
3,57 (9H ; s ; H13)
3, 67 (3H ; s ; H1) δc (200 MHz ; CDCl; 9,21 (C12)
22, 68
25, 04
29,23
29,38 (2C)
29,50 (2C)
33,17
34, 19
50,55 (C13)
51,46 (C1)
174,38 (C2 ) δ Sl (200 MHz ; CDCl; :-41,30 (s)
L' hydroxylation du substrat en silicium recouvert d'une couche d'oxyde thermique de 500 nm est réalisée dans une solution de soude 3,5 M pendant 2 heures, avec une solution silanisante de concentration 10~2 M dans du trichloroéthylène anhydre, les réactions de silanisation étant effectuées à une température contrôlée de 2°C pendant 24 h.
Le support modifié est mis au contact d'une solution d' iodure d'aluminium afin de libérer la fonction acide carboxylique, qui va à son tour réagir avec une solution aqueuse de soude pour donner la fonction carboxylate correspondante. L'homme de l'art pourra imaginer d'autres modes de réalisation d'un dispositif de prélèvement selon la présente invention ainsi que d'autres utilisations d'un tel dispositif.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif microtechnologique (6) de prélèvement de cellules par contact avec un tissu ou un autre élément corporel comprenant un support (12) ayant au moins une face d'intérêt (14) sur laquelle est présente au moins une zone de capture (10) constituée d'une paroi de fond (22) munie d'une pluralité de protubérances (24).
2. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel la paroi de fond (22) et/ou les protubérances (24) d'une zone de capture sont fonctionnalisées .
3. Dispositif selon la revendication 2, dans lequel la fonctionnalisation est effectuée par des molécules d'adhésion.
4. Dispositif selon la revendication 2, dans lequel la fonctionnalisation est effectuée par des anti-corps .
5. Dispositif selon la revendication 2, dans lequel les surfaces fonctionnalisées sont de type anionique ou cationique.
6. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 5 dans lequel au moins une zone de capture comprend une cuvette, ladite paroi de fond (22) correspondant au fond de la cuvette.
7. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 6 comprenant une pluralité de zones de capture (1Oa-IOd) sur une même face d'intérêt (14), les zones de capture étant séparées par des premières zones d'intervalle (18).
8. Dispositif selon la revendication 7 comprenant des moyens (42, 44) pour séparer les zones de capture (1Oa-IOd, 30) dans les zones d'intervalle (18) .
9. Dispositif selon la revendication 8 dans lequel les moyens pour séparer comprennent des encoches sur une des faces (14, 16) dudit support (12) .
10. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 9 dans lequel le support (12) est sous forme de plaque.
11. Dispositif selon la revendication 10 dans lequel le support (12) comprend des première et deuxième faces principales (14, 16) planes à l'exception des zones de capture (10, 20) et des éventuels moyens pour les séparer (42, 44) .
12. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 11 dans lequel le support (12) est en plastique.
13. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 11 dans lequel le support (12) est un substrat microtechnologique, notamment en silicium.
14. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 13 dans lequel la hauteur des protubérances (24) est comprise entre 10 μm et 400 μm et la surface des protubérances (24) est comprise entre 3 x 3 μm et 80 x 80 μm.
15. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 14 dans lequel les protubérances (24) sont séparées par des espaces (26) dont la largeur est inférieure à 50 μm.
16. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 15 dans lequel les protubérances (24) sont à section hexagonale ou octogonale.
17. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 16, dans lequel la paroi de fond (22) et/ou les protubérances (24) d'une zone de capture sont recouvertes de microbilles.
18. Dispositif selon la revendication 17, dans lequel les microbilles sont fonctionnalisées.
19. Dispositif selon l'une des revendications 2, 3, 4, 5 ou 18 dans lequel la fonctionnalisation comprend la présence de ligands solidarisés à la surface par une fonction silylée.
20. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 19 comprenant en outre une tige de manipulation (7), le support (12) pouvant être associé à une extrémité de la tige.
21. Système de prélèvement (1) comprenant un dispositif (6) selon la revendication 20 et un manchon de guidage (2) .
22. Procédé de prélèvement de cellules sur ou dans un tissu ou un autre élément corporel au moyen d'un dispositif microtechnologique comprenant un support (12) ayant au moins une face d'intérêt (14) sur laquelle est présente au moins une zone de capture (10) constituée d'une paroi de fond (22) munie d'une pluralité de protubérances (24), le prélèvement de cellules étant effectué par une mise en contact de ladite au moins une zone de capture avec le tissu ou l'élément corporel.
23. Procédé de diagnostic comprenant une étape de prélèvement selon la revendication 22.
24. Procédé d'analyse d'un tissu ou d'un autre élément corporel comprenant une étape de prélèvement selon la revendication 22.
25. Procédé selon la revendication 23 ou 24, comprenant une étape d'observation, au moyen d'un microscope, des cellules présentes sur le dispositif après prélèvement.
26. Procédé selon la revendication 23 ou 24, comprenant une étape de mise en culture des cellules présentes sur le dispositif après prélèvement.
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