EP2137208A2 - Composes pour le diagnostique de l'apoptose - Google Patents

Composes pour le diagnostique de l'apoptose

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EP2137208A2
EP2137208A2 EP08718146A EP08718146A EP2137208A2 EP 2137208 A2 EP2137208 A2 EP 2137208A2 EP 08718146 A EP08718146 A EP 08718146A EP 08718146 A EP08718146 A EP 08718146A EP 2137208 A2 EP2137208 A2 EP 2137208A2
Authority
EP
European Patent Office
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peptide
seq
compound
apoptosis
signal
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08718146A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Marc Port
Olivier Rousseaux
Robert Muller
Carmen Burtea
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guerbet SA
Original Assignee
Guerbet SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Guerbet SA filed Critical Guerbet SA
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Publication of EP2137208A2 publication Critical patent/EP2137208A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07D403/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids

Definitions

  • the invention provides novel diagnostic compounds for apoptosis-related diseases, their method of preparation and their use in medical imaging.
  • Apoptosis refers to the mechanisms that lead to the suicide of eukaryotic cells in response to certain stimuli. This physiological phenomenon ensures the balance between cells that proliferate and those that must be naturally eliminated. In pathological conditions, it can be increased and have devastating functional consequences in some tissues.
  • the role of apoptosis has been widely demonstrated in chronic neurodegenerative diseases (Alzheimer's disease, Parkinson's disease), in ischemic diseases (myocardial infarction, cerebral ischemia) and in inflammatory diseases (atherosclerosis, arthritis). Conversely, apoptosis can play a beneficial role when it leads to the death of tumor cells during radiotherapy or chemotherapy treatments.
  • apoptosis in imaging is a new diagnostic tool that is very useful in helping clinicians to assess the severity of a disease, predict the risk of occurrence of a serious event, and monitor treatment efficacy through characterization. fine lesions.
  • the detection of apoptosis in vivo is difficult because of the fact that the phenomenon is not always expressed, and that it is relatively brief since it takes place over a period of 6 to 24 hours maximum, after which the Cell debris is removed by phagocytic cells.
  • the prior art describes several attempts to develop contrast agents intended to target apoptotic cells.
  • agents typically comprise a targeting part called a biovector intended for the specific recognition of the biological target associated with the apoptosis mechanism, and a part of the signal capable of being detected by the imaging methods: optical imaging, scintigraphy, magnetic resonance imaging (MRI).
  • the signal part is for example a paramagnetic metal chelate such as Gadolinium, linear or macrocyclic, in particular DTPA, DTPA BMA, DTPA BOPTA, D03A, DOTA.
  • PS phosphatidylserine
  • telomeres proteins have high affinity and specificity for PS. It is in particular annexin V. It is an endogenous protein of 35 kDa of molecular weight, present intra or extra cellular. It was linked to different reporter groups according to the imaging modalities chosen. In particular, it has been conjugated to superparamagnetic iron oxide particles (Schellenberger EA, et al., Mol Imaging, 2002, 1: 102-107). In vitro, this contrast agent made it possible to obtain an MRI image in Jurkat cells made apoptotic after treatment with camptothecin.
  • apoptosis usually occurs 24 to 48 hours after the initial accident.
  • Anti-apoptotic drugs acting for example on the caspase pathway, would certainly be useful if they could be associated with an imaging method.
  • immunosuppressive drugs in cases of organ transplant rejection. There are therefore many indications for a contrast agent capable of effectively detecting apoptotic cells in vivo.
  • the applicant has succeeded in obtaining compounds comprising a targeting portion of apoptosis zones, effective not only in vitro but also and especially in vivo MRI.
  • Such compounds are indeed difficult to obtain because it is necessary not only to identify an effective biovector in vitro, but to obtain an effective compound in human clinical diagnostic imaging. This is particularly the case for MRI, which is known to be a highly requested technique because it has no radioactivity, but its sensitivity is much lower than that of nuclear medicine.
  • the compound obtained must both have sufficient affinity to recognize its target, a high specificity to be a distinctive indicator of the disease state, a stability suitable not to be degraded or modified in vivo; and additionally without the signal part interfering in a way with these different parameters (for example without altering the affinity and stability of the ligand).
  • the following correspondence table is used.
  • Signal represents a signal entity
  • Link present or not, represents a chemical bond
  • Peptide represents a peptide comprising a peptide targeting apoptosis, the peptide targeting apoptosis being chosen from the peptides of the following formula and their functional equivalents:
  • X1-X2-X3-X4-X5-X6 (1) (SEQ ID NO: 1) wherein X1 and X2 independently of one another are leucine or isoleucine, X3 and X4 are lysine, X5 represents proline and X6 represents phenylalanine, advantageously peptide LIKKPF (SEQ ID No. 11) and its functional equivalents.
  • D-A-H-S-X7-S (2) (SEQ ID NO: 2) wherein X7 is phenylalanine or leucine;
  • HG-XI 0-LS-X11 (4) (SEQ ID No. 4) wherein X10 is aspartic acid or histidine, and XI is threonine or isoleucine; - VLGERG (5) (SEQ ID No. 5); and the pharmaceutically acceptable salts of these compounds.
  • the expression peptide targeting apoptosis and disease associated with apoptosis, it is meant that the applicant's compounds are compounds capable of targeting biological zones (cells, tissues, organs, etc.) undergoing an apoptosis mechanism. This mechanism results in a disease related to apoptosis at an early stage or already advanced.
  • This diagnostic information then allows the clinician more appropriate treatment, such as the administration of an anti-apoptosis drug adapted to the biological territory concerned, and possibly any additional diagnostics.
  • the invention relates to compounds of formula I and their use for targeting areas
  • peptide targeting apoptosis is also referred to as PEPTIDE P in the application.
  • Advantageously Peptide represents a PEPTIDE P.
  • LIKKPF SEQ ID No. 11
  • LIKKPF peptide SEQ ID No. 11
  • X1 is leucine L or another substituted alkyl hydrophobic amino acid (isoleucine, alanine, valine),
  • X2 is isoleucine I or another substituted alkyl hydrophobic amino acid (leucine, alanine, valine),
  • X3 and X4 are lysine K or another amino acid comprising a basic function (arginine, histidine, ornithine), but preferentially lysine which is very advantageous for the interaction of the peptide with its target X5 is proline P
  • X6 is phenylalanine F or another hydrophobic aromatic amino acid (eg, tryptophan, tyrosine, histidine, biphenylalanine, naphthylalanine)
  • the functional equivalents are analogous or derivative peptides which have an imaging efficiency similar to or better than that of the peptide of the formula (2) to (5).
  • the invention also relates to the compounds of formula (I) functionally equivalent to the compound of formula (I), that is to say having an activity in vitro and in vivo comparable to these compounds, the affinity and the specificity of the peptides equivalent to the peptide of the compound (I) being evaluated by appropriate screening methods, such as that described in the detailed description.
  • Peptide comprising at least one peptide targeting apoptosis
  • PEPTIDE P a peptide having the peptide sequence of recognition of the biological target of PEPTIDE P, optionally flanked at the N and / or C terminus of a chemical group not interfering on this sequence.
  • the peptide targeting apoptosis and its derivatives is designated by "PEPTIDE P”.
  • these peptides are excluded when Signal represents a lipid nanoparticle.
  • Signal entity is understood to mean a chemical entity that makes it possible to obtain a signal in medical imaging, in particular: a chelate capable of being coupled to a paramagnetic metal or to a radionuclide, a metal nanoparticle, especially a superparamagnetic iron oxide nanoparticle a lipid nanoparticle, advantageously in the form of an emulsion, this nanoparticle carrying at least one chelate capable of being coupled to a paramagnetic metal (in this case, PEPTIDE P is grafted to the emulsion lipid nanoparticle which is it even a carrier of chelates, the peptide is bound to the lipid nanoparticle by, for example, a chemical linking group).
  • Signal represents a signal entity chosen from:
  • a chelate coupled or not to a paramagnetic metal M or to a radionuclide
  • a superparamagnetic nanoparticle coated with an organic layer preferably having an iron oxide core and a marker for optical imaging
  • the signal entity comprises at least one chelate Ch (in the form of complexing a metal M).
  • the chelate is coupled to the metal M.
  • the metal M is a paramagnetic metal ion, or a radionuclide.
  • it is a paramagnetic metal.
  • the complex formed by the chelate and the metal M is stable under physiological conditions so as to avoid undesired release of the metal M into the body.
  • the chelate or the signal entity comprises at least one functional group making it possible to connect the signal entity with the link or directly with the peptide.
  • the invention also relates to the compounds of formula (I) in which the chelate is not complexed with the metal.
  • Ch is a linear chelate chosen from: EDTA, diethylenetriaminopentaacetic acid DTPA, N- [2- [bis (carboxymethyl) amino] -3- (4-ethoxyphenyl) propyl] -N- [2- [bis (carboxymethyl) amino ] ethyl-L-glycine (EOB-DTPA), mono- or bis-amide derivatives of DTPA, such as N, N-bis [2- [carboxymethyl [(methylcarbamoyl) methyl] amino] ethyl] glycine (DTPA) -BMA), 4-carboxy-5,8,1-tris (carboxymethyl) -1-phenyl-2-oxa-5,8,1,1-triazatridecan-13-oic acid (BOPTA).
  • EDTA diethylenetriaminopentaacetic acid
  • DTPA N- [2- [bis (carboxymethyl) amino] -3- (4-ethoxyphenyl) propy
  • Ch is a macrocyclic chelate selected from 1,4,7,10-tetraazacyclododecan-l, 4,7,10-tetraacetic acid (DOTA), 1,4,7,10-tetraazacyclododecan-l, 4,7 -triacetic acid (D03A), 10- (2-hydroxypropyl) -1,4,7,10- tetraazacyclododecan-l, 4,7-triacetic acid (HPDO3A) 2-methyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-l, 4,7,10-tetraacetic acid (MCTA), (alpha, alpha ', alpha ", 1 ', 4,7,10-tetraacetic acid (DOTMA), 3,6,9,15-tetraazabicyclo [9.3.1] pentadeca-1 (15') -tetramethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecan ), 11, 13-triene-3,6,9-
  • Ch may also be a derivative of those compounds in which one or more carboxylic groups are in the form of a salt, ester, corresponding amide; or a corresponding compound in which one or more carboxylic groups are replaced by a phosphonic and / or phosphinic group.
  • a chelate chosen from: DOTA gadofluorins, OD3A, HPDO3A, TETA, TRITA, HETA, DOTA-NHS, M4DOTA, M4DO3A, PCTA and their derivatives, advantageously chosen from. DOTA, DTPA, DO3A, HPDO3A, TRITA, TETA, BOPTA, NOTE, PCTA, DOTMA, AAZTA, HOPO and their derivatives.
  • the chelate (s) forming the signal entity may satisfy the following formula of WOO 1/60416:
  • the compounds DTPA, DOTA, NOTA, DO3A and derivatives may be used. Mention may also be made of the chelates recalled in WO03 / 011115, in particular of the following formulas:
  • X a group capable of coordinating a metal cation, preferably O-, OH, NH 2 , OPO 3 -, NHR with R an aliphatic chain, Y a chemical bond.
  • X1 to X4 and K1 to C18 of the above chelates representing H or a C 1 -C 20 chain
  • R 1, R 2, R 3, R 4, R 5 independently represent -COOH, -P (O) (OH) 2 ; and being selected such that the chelate comprises at least one function capable of being coupled to a PEPTIDE P directly or via the link.
  • Ch is DTPA or DOTA or their derivatives.
  • the relaxivity ri of these chelates is typically of the order of 4 to 20 s "1 mMol " 1 Gd "1 at a field of 0.5 to 1.5 T. It is recalled that the Longitudinal relaxivity of a paramagnetic contrast product gives the measure of its magnetic efficiency and allows its influence on the recorded signal to be appreciated. In medical imaging MRI, the contrast products modify the relaxation time of the protons, and the increase the relaxivity obtained makes it possible to obtain a higher signal.
  • the coupling of chelates with biovectors in particular peptides is described in the prior art, and generally involves a chemical bond (Link) as described in WO01 / 60416.
  • the structure and the chemical nature of the chemical bond are defined to allow the chemical coupling between the peptidic part of PEPTIDE P and the chelate (s) used, and so as to obtain an affinity of the PEPTIDE P part for its target and a specificity of the recognition suitable for use.
  • a large number of bonds may be used, as long as they are capable of interacting with at least one biovector functional group and at least one chelate functional group.
  • Link represents: a) a group of formula Q1-I-Q2, in which Q1 and Q2, which are identical or different, represent O, S, NH, CO 2 , -NHCO, CONH, NHCONH, NHCSNH, SO 2 NH- or NHSO 2 -, and 1 represents an alkyl group (preferably C 1 -C 1 0), alkoxyalkyl
  • alkenyl preferably C 2 -C O
  • alkynyl preferably C 2 -C O
  • polyalkoxyalkylène alkyl interrupted by one or more squarates, with one or more aryls, advantageously phenyl, or with one or more groups selected from -NH-, -O-, -CO-, -NH (CO) -, - (CO) NH-, - O (CO) -, or - (OC) O- ;
  • Signal represents a marker for optical imaging (fluorescent molecule used in optical imaging).
  • markers for optical imaging include those of US2006 / 0018830 and in particular those cited on pages 11 and 12 paragraph IB, with precise imaging modalities described in column 33 ([0259]) in paragraph 6 (techniques and chromophores and fluorophores described in detail).
  • Signal represents quantum dots (inorganic fluorophores comprising nanocrystals).
  • Signal represents a superparamagnetic nanoparticle coated with an organic layer, advantageously commonly referred to as SPIO or USPIO ("ultra small particles of iron oxide”).
  • the nanoparticle comprises a core of oxide or iron hydroxide, in particular magnetite (Fe3 ⁇ / i), maghemite ( ⁇ -Fe 2 ⁇ 3).
  • a nanoparticle covered with a bisphosphonate coating, advantageously gew-bisphosphonate, described in WO2004058275 is used, the particle and the coupling method between the peptide and the nanoparticle being detailed in the examples of the present application.
  • the magnetic nanoparticles used are acidic nanoparticles based on an iron compound, and covered by a layer comprising one or more identical or different gembisphosphonate compounds, the covering layer of the nanoparticle having the following formula (C):
  • the link L2 represents an organic group linking the function T to the gem-bisphosphonate function -CH (PO 3 H 2 ) 2 ;
  • T represents a chemical function coupled to the PEPTIDE P or the link of the present application.
  • T-L2 represents the bond of the compound of formula (I).
  • the composition is in the form of a stable aqueous solution of nanoparticles.
  • the complexation rate (of the layer with the peptide) of the compound (C) on the particles is greater than 50%, advantageously 70%, and preferably greater than 80, 90, 95%. It is particularly preferred that the acid magnetic particles (p) are complexed on at least 90% of their protonated sites with compounds of formula (C).
  • a part of the functions T of the layer is coupled to a PEPTIDE P, and part of the functions T is coupled to a hydrophilic compound, in particular a compound carrying hydroxyl groups and in particular a hydrophilic aminoalcoholic compound designated AAG1AA28 described in WO2004058275 ( Example 8) or a PEG group.
  • the magnetic particles (p) have a hydrodynamic diameter of between 5 and 300 nm, preferably between 5 and 60 nm, more preferably between 5 and 30 nm.
  • the linker L2 makes it possible to connect and / or space the gew-bisphosphonate function and the reactive entity T capable of ensuring the covalent grafting of the PEPTIDE P (the biovector) on the nanoparticle, via or without the Link. .
  • the link L2 represents a divalent group.
  • the link L 2 is chosen from: an aliphatic group; alicyclic; alicyclic alicyclic; aromatic; aliphatic aromatic, said aliphatic, alicyclic and aromatic groups being optionally substituted by a methyl, hydroxy, methoxy, acetoxy, amido, or a halogen atom, advantageously a chlorine, iodine or bromine atom; a group -IrNHCO-I 2 where Ii and I 2 , identical or different, represent an aliphatic group; alicyclic; aromatic; aliphatic alicyclic or aliphatic aromatic alicyclic group, said groups possibly being optionally substituted with a methyl, hydroxy, methoxy, acetoxy, amido group or a chlorine, iodine or bromine atom.
  • L 2 represents a substituted or unsubstituted aliphatic group, and more preferably a - (CH 2 ) p - group, where p is an integer of 1 to 5, or preferably - (CH 2 ) n -NHCO- (CH 2 ) m - where n and m represent an integer from 0 to 5.
  • T represents a group -COOH or -NH 2 and L 2 a substituted or unsubstituted aliphatic group, advantageously a group - (CH 2 ) P -, where p is an integer of 1 to 5.
  • the most preferred layer is following formula (Cl)
  • Signal represents a lipid nanoparticle comprising at least one chelate.
  • the lipid nanoparticles may be in the form of a nanoparticulate emulsion, containing or not perfluorocarbons, such as those described in the documents WO 03/062198, US 5,958,371, US 5,080,885 and US 6,403,056.
  • the lipid nanoparticles can be suspended in an aqueous or hydrophilic medium. These nanoparticles have a diameter of the order of 10 nm to 500 nm, especially 20 to 250 nm.
  • the emulsion nanoparticles may comprise or be coupled with a large number of chelates, for example 10,000 to 100,000 chelates per nanoparticle.
  • the emulsions comprise sufficient compounds of formula (I) and thus peptide to allow recognition of the apoptosis zone. Mention may be made, as nanoparticles, of liposomes, unilamellar or multilamellar, micelles, microgels, oil droplets, lipoproteins, such as HDL, LDL, IDL, VLDL, chylomicrons, fluorocarbon nanoparticles, nanobulles, or the like of which the surface is lipophilic.
  • the chelate is lipophilic and attached to the membrane of the nanoparticle.
  • the bond of the compound of formula (I) is sufficiently lipophilic to couple the peptide to the membrane of the lipid nanoparticle, the PEPTIDE P being sufficiently expressed on the outer part of the nanoparticle for the specific recognition of the apoptotic target.
  • the Link is for example a group lipophilic such as a C10-C20 alkylene chain, this chain being inserted into the lipid layer of the nanoparticle and thus enabling the peptide to be attached to the nanoparticle.
  • the chelate carries a long lipophilic chain (phospholipid for example) which is inserted into the membrane of the lipid nanoparticle (liposome, micelle, nanoemulsion).
  • the PEPTIDE P advantageously carries a lipophilic chain (the Link) which is inserted into the membrane of the lipid nanoparticle.
  • the lipid nanoparticle includes perfluorocarbons as described in US Pat. No.
  • the liquid emulsion containing nanoparticles comprising a perfluorocarbon with a relatively high boiling point (for example between 50 and 90 ° C.) surrounded by a coating.
  • a coating composed of a lipid and / or a surfactant.
  • the surfactant is capable of coupling directly to a targeting biovector or to include an intermediate compound covalently bound to the biovector, optionally using a chemical linker.
  • Phosphatidylcholine dioleoylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, distearoylphosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine are commonly used as membrane forming phospholipids of the nanoparticles.
  • compositions are described, for example, in US Pat. No. 5,989,520 and US Pat. No. 5,958,371, as recalled in document US 20040248856, which notably mentions perfluorocarbon compounds: perfluorodecalin, perfluorooctane, perfluorodichlorooctane, perfluoro-n-octyl bromide, perfluoroheptane and the like.
  • suitable methods and lipid compositions recalled in US Pat. No. 6,010,682 will be used to prepare contrast agents according to the invention, in particular as regards the detailed description of the lipid composition and the preparation of liposomes. , micelles, emulsions.
  • the emulsions are heterogeneous lipid mixtures obtained suitably by mechanical stirring and / or addition of emulsifying agents.
  • the lipophilically rendered chelates are mechanically mixed with organic solvents such as chloroform. After evaporation of the solvent, the lipids are resuspended in an aqueous medium such as PBS to obtain an emulsion which then typically undergoes sonication and microfluidization.
  • the emulsions obtained can be lyophilized with the use, if appropriate, of anti-agglutination agents.
  • To formulate the desired paramagnetic contrast agent emulsion typically 1 to 75% by weight of lipophilic chelate compound is used relative to the total ingredients of the emulsion.
  • the contrast agent-forming composition is preferably administered intravascularly, depending on the patient under examination, for example 0.1 mg to 1 g of lipophilic chelate compound and 1 to 50 micromoles of paramagnetic metal ion per kg. of patient.
  • the lipid compositions obtained are optionally formulated using additives recalled in US 6 010 682, in particular for administration by intravenous injection. These include dextrose, sodium chloride, antimicrobials.
  • compositions according to the invention it is possible to obtain an increase in relaxivity by ion.
  • the following characteristics are typically obtained, which can vary according to the precise compositions of the emulsions and their method of preparation: polydispersity index: 0.2 to 0.3
  • [Gd 3+ ] 2 to 10 mM, preferably 3 to 7 mM concentration in particles: 50 to 100 nM- 1 (InM 1 S 1 Gd- 1 ): 5 to 40, preferably 10 to 40
  • the invention also relates to those compounds of formula (I) wherein the Peptide contains a modified peptide sequence, but without altering the affinity and specificity for the target and the effectiveness of the compound in vivo.
  • PEPTIDE P is for example modified using appropriate methodologies described in the prior art for example in US2005100963 (column 20-21 paragraphs [529] to [541] in the case of peptides targeting KDR receptors), in order to select compounds of formula (I) effective:
  • hydrophobic amino acids leucine X1 and isoleucine X2 the use of another linear or branched C1-10 aliphatic side chain (alkyl, alkenyl, alkynyl) can be tested. It will thus be possible to test the substitution of the amino acids X1, X2 with other alkyl-substituted hydrophobic amino acids (alanine, leucine, isoleucine, valine, norleucine, S-2-aminobutyric acid).
  • proline other hydrophobic amino acids, in particular derivatives with a secondary amine, are also used.
  • X3 and X4 lysine
  • other dibasic amino acids arginine, histidine, ornithine
  • derivatives of lysine or of these other amino acids in particular the alkyl, alkenyl and aryl derivatives; such as N-epsilon-isopropyl-lysine derivatives.
  • the derivatives mentioned in paragraph [533] of US2005100963 may be tested;
  • the peptides are also studied with: A replaced by leucine, isoleucine, Valine and H derivatives replaced by lysine or arginine and S derivatives replaced by threonine and L derivatives replaced by isoleucine, valine and derivatives.
  • V replaced by leucine or isoleucine
  • L replaced by isoleucine
  • arginine replaced by valine
  • E derivatives replaced by aspartic acid R replaced by lysine
  • the invention relates to contrast products for MRI comprising a compound of formula (I) as previously described, the paramagnetic metal ion M of which is of atomic number 21-29, 42-44 or 58, 70, preferably gadolinium.
  • Paramagnetic metals M include lanthanides of atomic number 58-70 and transition metals of atomic number 21-29, 42 or 44, for example scandium, titanium, vanadium, chromium, manganese, iron, cobalt, nickel, copper, molybdenum , ruthenium, cerium, praseodymium, neodymium, promethium, samarium, europium, gadolinium, terbium, dysprosium, holmium, erbium, thulium, and ytterbium.
  • the elements Gd (III), Mn (II), europium and dysprosium are particularly preferred, advantageously M is chosen from Gd, Mn, Fe, Dy and Tm.
  • the invention relates to contrast agents for imaging.
  • X-ray or CT comprising a compound (I) as described above whose heavy metal ion M is atomic number 21-31, 39-50, 56-80, 82, 83 or 90.
  • the invention according to another aspect of the radiopharmaceutical products, comprising a compound of formula (I) as described above whose chelate is coupled with a radionuclide or a radiohalogen known to those skilled in the art, typically gadolinium, technetium, chromium gallium, indium, ytterbium, rhenium, lanthanium, yttrium, dysprosium, copper or the like.
  • the radionuclides include the radioactive forms of the elements Sm, Ho, Y, Pm, Gd, La, Lu, Yb, Sc, Pr, Tc, Re, Ru, Rh, Pd, Pt, Cu, Au, Ga, In, Sn, Cr, Pb, especially 99 Tc, 117 Sn,
  • the invention relates to a diagnostic method and a radiopharmaceutical treatment method using a compound of formula (I) as described above.
  • the present invention furthermore relates to a composition comprising at least one compound of general formula (I) as described above and a pharmaceutically acceptable excipient, advantageously intended for parenteral administration. It further relates to a process for preparing such a composition comprising the addition of a compound of general formula (I) as defined above to an injectable medium comprising the pharmaceutically acceptable excipient.
  • the invention relates to the use of a composition according to the present invention for the diagnosis of a pathology associated with apoptosis.
  • the diagnostic and radiopharmaceutical compositions according to the invention can be used as described in US 2002/0090342, US 2002/0098149, WO 02/055111 for anticancer indications.
  • the invention further relates to the compounds of general formula (I) as defined above for their use as diagnostic agent for diseases associated with apoptosis.
  • the invention also relates to the use of the compounds described above for the preparation of a diagnostic or radiopharmaceutical composition intended for the diagnosis and / or treatment of diseases associated with apoptosis, advantageously chosen from chronic neurodegenerative diseases, ischemic diseases and inflammatory pathologies.
  • a peptide targeting apoptosis of formulas (1) to (5) as defined above for the preparation of a diagnostic composition for diseases associated with apoptosis.
  • the compounds of the Applicant's general formula (I) will be used as a diagnostic agent, or as a therapeutic treatment agent at apoptosis zones, or as a diagnostic and diagnostic agent. therapeutic treatment, or diagnostic follow-up of therapeutic efficacy. If appropriate, the compound will be co-administered simultaneously or in a delayed manner with other diagnostic and / or therapeutic agents targeting apoptosis.
  • the invention also relates to an imaging method comprising the synthesis of a compound comprising a paramagnetic metal according to the invention, capable of targeting a pathological zone, its administration to a patient, MRI imaging.
  • the invention also relates to an imaging method comprising the synthesis of a radiopharmaceutical compound according to the invention, capable of targeting a pathological zone, its administration to a patient, SPECT or planar gamma scintigraphy imaging, or emission tomography. of positrons.
  • intravenous administration by injection usually in saline is typically at a metal ion dose of 0.001 to 1.5 mmol / kg body weight, for example 1 to 500 ⁇ mol Gd / kg.
  • intravenous administration by injection usually in saline is typically at a dose of 1 to 100 mCi per 70 kg body weight, preferably 5 to 50 mCi, with diagnostic imaging for example 180 minutes after injection for 99 Tc.
  • concentration of the heavy atom is typically from 0.1 M to 5 M, with concentrations by intravenous administration of the order of 0.5 to 1.5 mmol / kg.
  • the invention relates to the use of a compound of formula (I) as described above for the preparation of a composition intended for optical imaging.
  • compositions for medical imaging are described in the prior art, for example in WO 0226776 and US 2006/0018830 column 36 ([0282]) paragraph 8 (assays and additives).
  • Pharmaceutically physiologically acceptable vehicles for forming diagnostic compositions (contrast products) comprising the compounds described above are known from the prior art. For example, salts (sodium, calcium, meglumine), pH control agents (acetic acid, citric acid, fumaric acid, antioxidants) will be used.
  • the invention also relates to a process for preparing compounds comprising coupling a peptide with at least one chelate.
  • the Applicant has also studied the possibilities of combining a PEPTIDE P coupled to several chelates in the compound of formula (I).
  • the applicant has also studied compounds of formula (I) having an assembly between one or more peptides of the compound of formula (I) targeting apoptosis, and one or more chelates; and so that access to the target is not impeded despite the presence of the chelate (s).
  • the chelate is spaced from the PEPTIDES P by the link of sufficient size and a chemical structure such that the recognition of the peptide or peptides by their target is not impaired.
  • biovector associations peptides or possible other biovectors
  • a central biovector peptide connected to several identical or different chelates
  • a central chelate connected to several identical or different peptides a first set [chelate-carrying peptide (s)] coupled via a hydrophobic or hydrophilic link to a second set [peptide carrying chelates (s)]
  • a first set [chelate-carrying peptide (s)] coupled via a hydrophobic or hydrophilic link to a second set [peptide carrying chelates (s)]
  • the method for constructing multimeric compounds described in US2005 / 0100963 (WO2006 / 031885, line 25 to page 69, line 30) will be used in the case of peptides targeting KDR receptors (for example using the method 13).
  • examples: "preparation of homodimers and heterodimers” but using PEPTIDE P (for example, the peptides of the compounds of FIGS. 44 to 47 of US2005100963 will be replaced by PEPTIDES P).
  • the compound may thus advantageously comprise a peptide coupled to several chelates, or a chelate coupled to several identical or different peptides.
  • the invention also relates to mixed compounds comprising in addition to PEPTIDE P at least one other biovector targeting apoptosis, the biovector being either another peptide or another biovector but nonpeptide.
  • the specificity of the product refers to its specific affinity for at least one marker of apoptosis or any associated pathological disorder, the specificity of the binding typically expressed by Kd and Ka constants, the Kd value for the target markers being less than 10 ⁇ M, preferably less than 1 ⁇ M.
  • cation salts of inorganic bases include sodium, sodium, calcium, magnesium, etc.
  • organic base cations include organic base cations (ethanolamine, diethanolamine, morpholine, glucamine, N-methylglucamine, N, N). -dimethylglucamine ...), anions of inorganic acids (in particular chlorides, bromides, iodides, sulphates, etc.), organic acid anions (acetate, succinate, citrate, fumarate, maleate, oxalate, trifluoroacetate). .), amino acid ions (taurine, glycine, lysine, arginine, ornithine, aspartic acid, glutamic acid ).
  • vascular disease apoptosis at atheromatous plaque areas
  • alteration of liver tissue apoptosis of the liver
  • alteration of nerve tissue nerve tissue causing brain diseases including Parkinson's disease in particular.
  • FIG. 1 represents the competition test with annexin V
  • FIG. 2 represents the measurement of the affinity of peptide LIKKPF (SEQ ID No. 11)
  • FIG. 3 represents the measurement of the affinity of peptide LIKKPF (SEQ ID No. 11) coupled to a USPIO
  • Figure 4 illustrates apoptotic cell assays performed with a USPIO-
  • FIG. 5 illustrates the affinity of a DTP A-LIKKPF product with apoptotic cells
  • FIG. 6 illustrates the dynamic tracking of the mouse apoptotic liver MRI signal with a DTPA-LIKKPF product
  • FIG. 7 shows MRI images on ApoE mice obtained with a product DTPA-LIKKPF
  • FIG. 8 represents the corresponding quantitative enhancement.
  • M molar concentration (mol / l).
  • M / z mass on charge determined by mass spectrometry.
  • ES + positive mode electrospray.
  • ES " electrospray negative mode
  • kD molecular weight unit (kiloDalton)
  • TLC thin layer chromatography
  • Z ave hydrodynamic diameter measured by PCS
  • the iron is assayed by atomic absorption spectroscopy (VARIAN AA10 Spectrophotometer) after mineralization with concentrated HCl and dilution against a standard range of ferric ions (0, 5, 10, 15 and 20 ppm).
  • Particle size Particle size:
  • T1 and T2 relaxation times were determined by standard procedures on a Minispec 120 (Broker) apparatus at 20 MHz (0.47T) and 37 ° C.
  • the longitudinal relaxation time T1 is measured using an inversion recovery sequence and the T2 transverse relaxation time is measured by a CPMG technique.
  • R1 or R2 as a function of the concentration is linear, and the slope represents the relaxivity ri (Rl / C) or r2 (R2 / C) expressed in (1 / second) x (1 / mmol / L) ie s " '.mM " ').
  • nanoparticles were prepared according to the methods described in the patent WO2004 / 058 275 (US 2004/253181) Examples 8 and 9 for the preparation of the colloidal solutions of magnetic particles and Examples 10 to 12 for the complexation of the magnetic particles by a coating gem -bisphosphonate of Example 1 of WO2004 / 058,275.
  • solution B The previous solution (solution B) is stirred at room temperature and the pH is adjusted to
  • amino PEG-NH 2 750 (O- (2-aminoethyl) -O'-methyl polyethylene glycol 750 was obtained from FLUKA®).
  • AminoPEG 350 is prepared according to the following reaction sequence according to procedures described in the literature.
  • aminoPEGs are available from suppliers:
  • the peptide (350 mg, 0.323 mmol) is dissolved in 2 ml of water and the polycarboxylated compound (NCS-Bz-DTPA 420 mg, 0.646 mmol, 2 equivalents) dissolved in water is added dropwise.
  • the pH of the reaction mixture is adjusted to 10 with NaOH solution and the solution is stirred for 48h.
  • the pH is readjusted to 7, and the solution is percolated on a column of silica RPCl 8.
  • the fractions containing the condensation product are concentrated and the ligand is complexed with one equivalent of GdCl 3 -OH 2 O (0.235 mmol) for 6 hours.
  • Step 1 5- (1,3-Dioxo-1,3-dihydro-isomol-2-yl) -2- (IAJ, 1-Oterraaza-cyclododec-1-yl) -pentanoic acid benzyl ester
  • Step 2 5- (1,3-Dioxo-1,3-dihydro-isoindol-2-yl) -2- (4,7,10-tris-ethoxycarbonylmethyl) -1,4,7-benzyl ester 1 Otetraaza-cyclododec-1-yl) pentanoic
  • Step 3 5-Amino-2- (4,7,10-tris-carboxymethyl-1,4,7,1-tetraazacyclododec-1-yl) -pentanoic acid
  • Step 4 Gadolinium complex of 5-Amino-2- (4,7,10-tris-carboxymethyl-1, 4,7, 1-Otetraaza-cyclododec-1-yP) -pentanoic acid
  • step 3 7.2 g of the compound obtained in step 3 (16 mmol) are dissolved in 70 ml of water and the pH is adjusted to 5.5 by addition of 6 N hydrochloric acid. 2.9 g of Gd are added. 2 ⁇ 3 (8 mmol), and the reaction medium is heated to 80 ° C. The pH of the solution increases steadily, and should be maintained between 5.2 and 5.7 by dropwise addition of 6 N hydrochloric acid. After two hours, the pH stabilizes at 5.7. The slight cloudiness is filtered through Whatman® filter and the filtrate is concentrated. Obtain 11.1 g of product in the form of white flakes (100% corrected yield).
  • Solvent B CH 3 CN; UV detection at 201 nm; Tr: 10 min.
  • Step 5 5- (2-Ethoxy-3,4-dioxo-cyclobut-1-enylamino) -2- (4,7,10-tris-carboxymethyl-1, 4,7, 1) gadolinium complex Otetraaza-cyclododec-1-yl) pentanoic
  • Step 1 Coupling Peptide Nos. 1, 2, 3, 4, 5, 6 or the Squarate Derivative
  • the compound obtained in Step 5 of Example 3 (100 mg, 1.35 ⁇ 10 -4 mol) is dissolved in 15 ml of aqueous Na 2 CO 3 solution pH 9.4.
  • the protected peptide (1.6 ⁇ 10 -4 mol) is introduced while maintaining the pH at 9.4 by addition of Na 2 CO 3. If the peptide is not soluble in water, a few drops of DMF are added until After 48 hours of reaction at room temperature, the medium is precipitated in an ethanol / ethyl ether mixture and the precipitate is filtered and dried.
  • step 1 The compound obtained in step 1 above is dissolved in a mixture of 10 cm 3 of TFA / TIS / H 2 O in the proportions 90/5/5. The medium is stirred for 5 hours at ambient temperature and the solvent is then evaporated off under reduced pressure. The residue is taken up in ethyl ether and the precipitate is filtered and dried. The product is then purified by HPLC preparative on a Symmetry® column with an eluent consisting of water / TFA PH 3 /
  • Example 3 210 mg of the compound obtained in step 5 of Example 3 are dissolved in 20 ml of water and the pH is adjusted to 9 with a solution of Na 2 CO 3 . 350 mg of protected peptide (peptide No. 7) are added and the pH is adjusted to 9.2. The medium is stirred at ambient temperature and then the solution is dialyzed on a 1 kD cut-off membrane for 48 h and then chromatographed on an RP-18 column (MeOH / water (50/50) mixture).
  • Peptides are synthesized on a solid phase using 2.5 equivalents of each Fmoc protected amino acid at each coupling cycle. Activation of the carboxylic acids is carried out with HATU, N-methylmorpholine in DMF. The Fmoc groups are cut by piperidine treatment (20% in DMF). After introduction of the last amino acid of the peptide sequence and cleavage of the Fmoc protecting group, the N-terminal amine of the peptide is acylated by the compound prepared in step 1 (2.5 equivalents) dissolved in CH 2 Cl 2 in the presence of HoBt and N-methylmorpholine.
  • the peptide is then released from the resin and the protective groups of the side functions are cleaved by the action of a trifluoroacetic acid / thioanisole mixture (95/5) for 30 minutes at 0 ° C. and then for 2 hours at room temperature.
  • the resin is removed and the solvent is evaporated under reduced pressure.
  • the lipopeptide is precipitated in ethyl ether.
  • the products are purified by preparative HPLC on a Vydac ODS® column, eluting with a water / acetonitrile / TFA mixture.
  • Example IL1 Peptide LIKKPF (SEQ ID No. 11)
  • the affinity of peptide LIKKPF (SEQ ID No. 11) is measured on immobilized PS (ELISA plate).
  • the peptide is incubated at increasing concentrations of 5.10 14 M to 4.2 ⁇ 10 7 M.
  • Annexin V-biotin is then added to the concentration of 5.10 10 M which corresponds to its K ⁇ j value for PS. Incubation at 37 ° C is continued for 1.5 hours.
  • Bound annexin V is detected by addition of a solution of streptavidin-HRP and then of an ABTS substrate solution containing 0.05% H 2 O 2 .
  • the DO 4 05 is measured for calculation of the IC 50 value of the peptide.
  • USPIO-LIKKPF The affinity of USPIO-LIKKPF is measured on immobilized PS (120 ⁇ g / mL). After saturation of nonspecific sites, the USPIO-LIKKPF is incubated at increasing concentrations (122 nM - 4 mM iron) for 2 hours at 37 ° C. After washing the wells, the PS-bound molecules are digested in a volume of 5 N HCl. The samples are digested in a volume of 5N HCl, 48h at 37 ° C, and the iron assay is made by Prussian Blue ( D0 6 3o).
  • In vitro MRI is performed on apoptotic cells (or controls) preincubated with USPIO-LIKKPF or nonfunctional USPIO (3 or 4 mM iron) for 2 hours at 37 ° C.
  • the apoptosis of Jurkat cells is induced by treatment with 2 ⁇ M camptothecin for 24 hours.
  • Example 113 Contrast product Gd-DTPA-LIKKPF
  • the peptides LIKKPF (SEQ ID No. 11) and FKIPKL ("scramble" peptide - mixed sequence) are grafted separately on a Gd-DTPA chelate.
  • Peptides protected by TFA on two lys are attached to the 8-amino-3,6-dioxooctanoyl linker.
  • the protected peptide is coupled to DTPA-isothiocyanate (NCS-Bz-DTPA), then the Lys are deprotected in a basic medium.
  • apoptotic Jurkat cells (2.10 6 cells / ml) are incubated in the presence of the Gd-DTPA-LIKKPF product at concentrations of 400, 200 and 100 ⁇ M in Gd. The cells are incubated for 2 hours at room temperature. After rinsing and centrifugation, the cell pellet is mineralized under acidic conditions and the amounts of Gd are measured by ICP-MS (inductively coupled plasma - mass spectrometry). The targeting efficiency of the Gd-DTPA-LIKKPF product by MRI was also evaluated on an apoptotic liver model in mice.
  • Apoptosis is induced by an iv injection (caudal vein) of anti-Fas monoclonal antibody in anesthetized Balb / c mice (Blankenberg et al., 1998, 1999, Rodriguez et al., 1996).
  • SI signal intensity
  • the SI value is also measured in a tube filled with a 2% aqueous solution of gelatin enriched with 50 ⁇ M Gd-DTPA, used as a reference product, in a region outside the image of the mouse which corresponds to the background brait.
  • the MRI protocol is as follows: (1) pre-contrast MRI starts Ihl5 after injection of anti-Fas; (2) the contrast product is injected into the femoral vein at a dose of 60 ⁇ mol Gd / kg approximately 1:45 after injection of anti-Fas; (3) several post-contrast acquisitions are made during 1h30.
  • a competition protocol is performed by injection of 100 ⁇ mol peptide / kg 10 minutes before the injection of the contrast product Gd-DTPA-LIKKPF.
  • the targeting efficacy of the Gd-DTPA-LIKKPF product was also evaluated on another model of apoptosis: the apoE ⁇ mouse, model of atherosclerosis.
  • Female C57B1 ApoE 7 " mice, approximately 15 months old, are subjected to a high cholesterol diet for 3 months prior to MRI studies, and for MRI acquisition the animals are anesthetized with pentobarbital.
  • the contrast agent Gd-DTPA- LIKKPF is injected iv at a dose of 100 ⁇ mol Gd / kg All images are acquired at the level of the abdominal aorta, especially the near-renal region which is known for the development of atheromatous plaque due to the presence of the arterial branches
  • the parameters of the RARE sequence (Rapid Acquisition with Relaxation Enhancement) are adjusted using a reference tube filled with a 1 mM solution of Gd-DTPA.
  • SI values are measured in different regions of interest (abdominal artery wall or whole liver) using OSIRIS image analysis software. The regions are first drawn on the postcontrast images, then duplicated on the pre-contrast images. The SI value is measured on all sections of images where the arterial wall and the liver are visible. Finally, the SI values obtained for serial aortic sections over a length of 3.2 - 8 mm are averaged for each animal.
  • VLGERG SEQ ID No. 5
  • LIKKPF SEQ ID No. 11
  • D-A-H-S-X7-S SEQ ID No. 2
  • X7 can be F or L
  • HG-X10-LS-XI1 (SEQ ID No. 4) and its functional equivalents, where X 10 is advantageously chosen from D or H, and X 11 is chosen from T or I.
  • the affinity (in order of magnitude) of these peptides for PS is between 10 6 and 10 9 M.
  • the highly specific peptide LIKKPF (SEQ ID No. 11) has been particularly well characterized. The specificity of interaction of the peptide with the PS is confirmed using the competition assay with Annexin V. The value IC 5 O Annexin V is equal to 1,08.10 "9 M ( Figure 1).
  • Example 11.5 LIKKPF Peptide (SEQ ID NO 11) immobilized on PS vitro test is used to calculate a value IC 5 O ( Figure 2).
  • Example II.6 USPIO-PEG-PEPTIDE P contrast medium with PEPTIDE P being LIKKPF (SEQ ID No. 11) (also referred to as USPIO-LIKKPF)
  • the USPIO-LIKKPF interaction test with the immobilized PS makes it possible to measure a K * d value of 7.85.10 8 M.
  • the interaction specificity of the USPIO-LIKKPF with the PS is checked with an annexin V competition test.
  • the IC 5 O value is equal to 4.2 ⁇ 10 7 M. (FIG. 3)
  • the grafting of the LIKKPF peptide (SEQ ID No. 11) on the Gd-DTPA contrast product makes it possible to preserve the targeting of the apoptotic cells. Indeed, the ICP-MS assay of apoptotic cells incubated with Gd-DTPA-LIKKPF proves that their concentration-dependent interaction is greater than the capture of the product by the control cells (FIG. 5). After iv injection of 60 ⁇ mol Gd / kg of product, the dynamic MRI signal monitoring of the mouse apoptotic liver (FIG. 6) shows an enhancement with Gd-DTPA-LIKKPF greater than that measured with Gd-DTPA-FKIPKL (scramble ) or non-functionalized Gd-DTPA.
  • Example IL 8 Imaging of Apoptotic Vascular Tissue
  • Gd-DTPA-LIKKPF at a dose of 100 ⁇ mol Gd / kg, can dynamically detect a higher signal enhancement than that measured with the non-grafted product (Gd-DTPA) at the level of the abdominal aorta (FIGS. 8 - RARE sequence, 27 minutes after contrast injection - MRI of serial sections of the abdominal aorta over a length of 3.2 mm).
  • Gd-DTPA non-grafted product
  • Example II.9 Apoptotic Nervous Tissue Imaging in a Model of Parkinson's Disease, USPIO-LIKKPF Product Injection
  • Immunohistochemistry and MRI are very revealing. Sick and healthy mice were studied on the 4th, 5th, 6th day of treatment, and one and three weeks after the end of MPTP treatment. Imaging shows an evolution of the signal during the treatment, the targeting being more marked on the 5th day and then decreasing after. Sections made with these non-vectorized USPIOs (without peptide) show no marked targeting.
  • the MRI location of the diseased areas corresponds to the zones containing dopaminergic neurons (immunohistochemistry: detection of dopaminergic neurons by measurement of tyrosine hydroxylase in the basal ganglia).

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Abstract

La présente invention concerne un Composé de formule générale (I) suivante : Signal-Lien-Peptide (I) dans laquelle Signal représente une entité signal; Lien, présent ou non, représente une liaison chimique et Peptide représente un peptide comprenant un peptide ciblant l'apoptose, le peptide ciblant l'apoptose étant choisi parmi les peptides de formule suivante et leurs équivalents fonctionnels: - X1-X2-X3-X4-X5-X6 (1) (SEQ ID No 1) dans laquelle X1 et X2 représentent indépendamment l'un de l'autre la leucine ou l'isoleucine, X3 et X4 représentent la lysine, X5 représente la proline et X6 représente la phénylalanine, avantageusement le peptide L-I-K-K-P-F (SEQ ID No 11) et ses équivalents fonctionnels. - D-A-H-S-X7-S (2) (SEQ ID No 2) dans laquelle X7 représente la phénylalanine ou la leucine; - P-G-D-L-X8-X9 (3) (SEQ ID No 3) dans laquelle X8 représente la serine ou la valine et X9 représente la thréonine ou l'arginine; - H-G-X10-L-S-X11 (4) (SEQ ID No 4) dans laquelle Xl0 représente l'acide aspartique ou l'histidine, et X11 représente la thréonine ou l'isoleucine; - V-L-G-E-R-G (5) (SEQ ID No 5); et les sels pharmaceutiquement acceptables de ces composés.

Description

Composés pour le diagnostique de l'apoptose
L'invention concerne de nouveaux composés de diagnostique de maladies liées à l'apoptose, leur procédé de préparation et leur utilisation en imagerie médicale.
L'apoptose, ou mort cellulaire programmée, fait référence aux mécanismes qui aboutissent au suicide des cellules eucaryotes en réponse à certains stimuli. Ce phénomène physiologique assure l'équilibre entre les cellules qui prolifèrent et celles qui doivent être naturellement éliminées. En situation pathologique, il peut être accru et avoir des conséquences dévastatrices sur le plan fonctionnel dans certains tissus. Le rôle de l'apoptose a été largement démontré dans les maladies neurodégénératives chroniques (maladie d'Alzheimer, maladie de Parkinson), dans les maladies ischémiques (infarctus du myocarde, ischémie cérébrale) et dans les pathologies inflammatoires (athérosclérose, arthrite). Inversement, l'apoptose peut jouer un rôle bénéfique lorsqu'elle conduit à la mort des cellules tumorales lors des traitements par radiothérapie ou par chimiothérapie. La détection de l'apoptose en imagerie constitue un nouvel outil diagnostique très utile pour aider les cliniciens à apprécier la sévérité d'une pathologie, à prédire le risque de survenue d'événement grave et à suivre l'efficacité des traitements grâce à une caractérisation fine des lésions. La détection de l'apoptose in vivo est difficile en raison notamment du fait que le phénomène n'est pas toujours exprimé, et qu'il est relativement bref puisqu'il se déroule sur une période de 6 à 24 heures maximum, après quoi les débris cellulaires sont éliminés par les cellules phagocytaires. L'art antérieur décrit plusieurs tentatives de mise au point d'agents de contraste destinés à cibler des cellules apoptotiques Ces agents comprennent typiquement une partie de ciblage appelée biovecteur, destinée à la reconnaissance spécifique de la cible biologique associée au mécanisme d'apoptose, et une partie de signal capable d'être détectée par les méthodes d'imagerie : imagerie optique, scintigraphie, imagerie par résonance magnétique (IRM). La partie de signal est par exemple un chélate de métal paramagnétique tel que le Gadolinium, linéaire ou macrocyclique, notamment DTPA, DTPA BMA, DTPA BOPTA, D03A, DOTA.
Concernant la partie de ciblage, la particularité des cellules apoptotiques à exposer la phosphatidylsérine (PS) sur le feuillet externe de la membrane plasmique (alors qu'elle est normalement confinée sur le feuillet interne) a conduit à chercher des biovecteurs ciblant la PS. L'externalisation de la PS survient précocement et peut donc jouer un rôle de marqueur du processus apoptotique.
Plusieurs protéines possèdent une forte affinité et une grande spécificité pour la PS. C'est en particulier de l'annexine V. Il s'agit d'une protéine endogène de 35 kDa de poids moléculaire, présente au niveau intra ou extra cellulaire. Elle a été couplée à différents groupes rapporteurs selon les modalités d'imagerie retenues. En particulier, elle a été conjuguée à des particules d'oxyde de fer superparamagnétiques (Schellenberger EA. et al., Mol. Imaging, 2002, 1 :102-107). In vitro, cet agent de contraste a permis d'obtenir une image en IRM dans des cellules Jurkat rendues apoptotiques après traitement par la camptothécine.
Actuellement, la modalité de détection de l'apoptose in vivo la plus utilisée est la scintigraphie à l'aide d'annexine V couplée au 99mTc. Dans un modèle d'athérosclérose chez le lapin soumis à une désendothélialisation de l'aorte abdominale et à un régime riche en cholestérol, le marqueur s'est accumulé massivement dans les lésions (Kolodgie FD. et al., Circulation, 2003, 108:3134-3139).
On recherche toujours une amélioration de la qualité du diagnostic in vivo à l'aide de nouveaux marqueurs très spécifiques, destinés aux modalités d'imagerie connues de l'homme du métier, notamment l'IRM, les rayons X, la scintigraphie aux rayons gamma, le scanner CT, les ultrasons, le PET, l'imagerie optique. On rappelle que dans le cas de l'IRM, un contraste est obtenu grâce à l'administration d'agents de contraste contenant des métaux paramagnétiques ou des composés superparamagnétiques qui ont un effet sur la relaxivité des protons de l'eau. Dans le cas de la scintigraphie, le contraste est obtenu par la localisation spécifique d'un composé radiopharmaceutique émettant des rayons gamma ou beta.
On cherche des composés dont la synthèse chimique n'est pas trop complexe, suffisamment stables in vivo pour une utilisation en imagerie médicale, et dont le prix de revient n'est pas trop élevé et donc en particulier des composés ne comprenant pas de biovecteur protéique telle que l'annexine, notamment pour l'IRM. On cherche aussi pour l'oncologie des produits permettant une imagerie des signes précoces d'apoptose afin notamment d'aider à sélectionner les traitements de chimiothérapie les plus efficaces. L'activité des drogues antihormonales, anti- angiogéniques et la radiothérapie dépendent principalement de l'apoptose des cellules tumorales, c'est pourquoi le suivi en imagerie de ce phénomène apportera des informations critiques pour la prise en charge des patients.
Dans les maladies ischémiques cérébrales ou cardiaques, l'apoptose survient généralement 24 à 48 heures après l'accident initial. Des médicaments anti-apoptotiques, agissant par exemple sur la voie des caspases, seraient certainement utiles s'ils pouvaient être associés à une méthode d'imagerie. Il en est de même pour l'utilisation de drogues immunosuppressives dans les cas de rejet de greffe d'organe. Il existe donc de nombreuses indications pour un agent de contraste capable de détecter efficacement les cellules apoptotiques in vivo.
Le demandeur a réussi à obtenir des composés comprenant une partie de ciblage de zones d'apoptose, efficaces non seulement in vitro mais aussi et surtout en IRM in vivo. De tels composés sont en effet difficiles à obtenir car il faut non seulement identifier un biovecteur efficace in vitro, mais obtenir un composé efficace en imagerie de diagnostique clinique humaine. C'est particulièrement le cas pour l'IRM qui est reconnue pour être une technique très demandée car sans radioactivité, mais dont la sensibilité est très nettement inférieure à celle de la médecine nucléaire.
Le composé obtenu doit à la fois avoir une affinité suffisante pour reconnaître sa cible, une forte spécificité pour être un indicateur distinctif de l'état pathologique, une stabilité appropriée pour ne pas être dégradé ou modifié in vivo ; et en plus sans que la partie de signal n'interfère de manière gênante sur ces différents paramètres (par exemple sans altérer l'affinité et la stabilité du ligand). Dans la résente demande on utilise le tableau de correspondance suivant.
Après de nombreuses tentatives, le demandeur a réussi à obtenir des composés efficaces in vivo. L'invention concerne ainsi un composé de formule générale (I) suivante :
Signal - Lien - Peptide (I) dans laquelle
Signal représente une entité signal ; Lien, présent ou non, représente une liaison chimique et
Peptide représente un peptide comprenant un peptide ciblant l'apoptose, le peptide ciblant l'apoptose étant choisi parmi les peptides de formule suivante et leurs équivalents fonctionnels:
- X1-X2-X3-X4-X5-X6 (1) (SEQ ID No 1) dans laquelle Xl et X2 représentent indépendamment l'un de l'autre la leucine ou l'isoleucine, X3 et X4 représentent la lysine, X5 représente la proline et X6 représente la phénylalanine, avantageusement le peptide L-I-K-K-P-F (SEQ ID No 11) et ses équivalents fonctionnels.
- D-A-H-S-X7-S (2) (SEQ ID No 2) dans laquelle X7 représente la phénylalanine ou la leucine ;
- P-G-D-L-X8-X9 (3) (SEQ ID No 3) dans laquelle X8 représente la serine ou la valine et X9 représente la thréonine ou l'arginine ;
- H-G-Xl 0-L-S-X11 (4) (SEQ ID No 4) dans laquelle XlO représente l'acide aspartique ou l'histidine, et XI l représente la thréonine ou l'isoleucine ; - V-L-G-E-R-G (5) (SEQ ID No 5) ; et les sels pharmaceutiquement acceptables de ces composés.
Le demandeur a en effet démontré l'affinité des peptides de formule (1) à (5) pour la PS comme cela sera décrit plus loin.
Par l'expression peptide ciblant l'apoptose, et maladie associée à l'apoptose, on entend que les composés du demandeur sont des composés capables de cibler des zones biologiques (cellules, tissus, organes ...) subissant un mécanisme d'apoptose, ce mécanisme se traduisant par une maladie liée à l'apoptose à un stade précoce ou déjà avancé. Cette information diagnostique permet alors au clinicien un traitement plus approprié, tel que l'administration d'un médicament anti-apoptose adapté au territoire biologique concerné, et le cas échéant d'éventuels diagnostiques complémentaires. Ainsi l'invention concerne des composés de formule I et leur utilisation pour le ciblage de zones
(une ou plusieurs) biologiques (cellules, tissus, organes ...) subissant un mécanisme d'apoptose.
L'expression « peptide ciblant l'apoptose » est également désignée PEPTIDE P dans la demande. Avantageusement Peptide représente un PEPTIDE P. Par l'expression LIKKPF (SEQ ID No 11) et ses équivalents fonctionnels définis on entend le peptide LIKKPF (SEQ ID No 11) dont le demandeur a démontré l'efficacité et les peptides dérivés de formule (1) X1-X2-X3-X4-X5-X6 (SEQ ID No 1), qui présentent une efficacité en imagerie semblable ou meilleure que le LIKKPF (SEQ ID No 11) (ce qui inclut les peptido-mimétiques), cette efficacité étant testée à l'aide de tests et de modèles in vivo décrits en détail dans la demande ou de modèles analogues appropriés. On citera parmi ces peptides les peptides dérivés X1-X2-X3-X4-X5-X6 (SEQ ID No 6) suivants, à la condition qu'ils présentent une efficacité en imagerie semblable ou meilleure que le LIKKPF (SEQ ID No 11) :
Xl est la leucine L ou un autre aminoacide hydrophobe alkyle substitué (isoleucine, alanine, valine),
X2 est l'isoleucine I ou un autre aminoacide hydrophobe alkyle substitué (leucine, alanine, valine),
X3 et X4 sont la lysine K ou un autre aminoacide comprenant une fonction basique (arginine, histidine, ornithine), mais préférentiellement la lysine qui est très avantageuse pour l'interaction du peptide avec sa cible X5 est la proline P
X6 est la phénylalanine F ou un autre acide aminé aromatique hydrophobe (par exemple le tryptophane, la tyrosine, l'histidine, la biphénylalanine, la naphthylalanine)
De même pour les autres peptides de formules (2) à (5), les équivalents fonctionnels sont des peptides analogues ou dérivés qui présentent une efficacité en imagerie semblable ou meilleure que celle du peptide considéré de formule (2) à (5). L'invention concerne aussi les composés de formule (I) fonctionnellement équivalents au composé de formule (I), c'est-à-dire ayant une activité in vitro et in vivo comparable à ces composés, l'affinité et la spécificité des peptides équivalents au Peptide du composé (I) étant évaluée par des méthodes de screening appropriées, telles que celle décrite dans la description détaillée. On entend par peptide comprenant au moins un peptide ciblant l'apoptose
(PEPTIDE P), un peptide présentant la séquence peptidique de reconnaissance de la cible biologique du PEPTIDE P, éventuellement flanquée en extrémité N et/ou C terminal d'un groupe chimique n'interférant pas sur cette séquence.
Dans la présente demande, on désigne le peptide ciblant l'apoptose et ses dérivés par « PEPTIDE P ».
Avantageusement les peptides suivants sont exclus des peptides P selon l'invention :
et
Ces peptides sont en particulier exclus lorsque Signal représente une nanoparticule lipidique.
On entend par entité Signal une entité chimique permettant d'obtenir un signal en imagerie médicale, en particulier : un chélate capable d'être couplé à un métal paramagnétique ou à un radionucléide, une nanoparticule métallique, notamment une nanoparticule superparamagnétique d'oxyde de fer - une nanoparticule lipidique, avantageusement sous forme d'émulsion, cette nanoparticule étant porteuse d'au moins un chélate capable d'être couplé à un métal paramagnétique (dans ce cas, le PEPTIDE P est greffé à la nanoparticule lipidique en émulsion qui est elle-même porteuse de chélates ; la liaison du peptide à la nanoparticule lipidique se fait par exemple par un groupe de liaison chimique). Dans un mode de réalisation avantageux, Signal représente une entité signal choisie parmi :
- un chélate couplé ou non à un métal paramagnétique M ou à un radionucléide,
- une nanoparticule superparamagnétique revêtue d'une couche organique, de préférence ayant un noyau en oxyde de fer et - un marqueur pour imagerie optique ;
Avantageusement les composés suivants sont exclus des composés de formule I selon la présente invention :
C'est en particulier le cas des composés de formule I dans lesquels Signal représente un chélate couplé à un radionucléide, et en particulier au radionucléide Ga68, de façon particulière dans le cadre de l'imagerie PET.
Selon un mode de réalisation, l'entité signal comprend au moins un chélate Ch (sous forme complexant un métal M). Avantageusement le chélate est couplé au métal M. Avantageusement, le métal M est un ion de métal paramagnétique, ou un radionucléide. De façon avantageuse il s'agit d'un métal paramagnétique. Le complexe formé par le chélate et le métal M est stable dans les conditions physiologiques de manière à éviter une libération non souhaitée du métal M dans l'organisme. Avantageusement le chélate ou l'entité signal comprend au moins un groupe fonctionnel permettant de relier l'entité signal avec le Lien ou directement avec le Peptide. L'invention concerne aussi les composés de formule (I) dans lesquels le chélate n'est pas complexé avec le métal. Avantageusement, Ch est un chélate linéaire choisi parmi : EDTA, DTPA diéthylènetriaminopentaacétique acide, N- [2- [bis(carboxyméthyl)amino] -3 -(4- ethoxyphenyl)propyl] -N- [2- [bis(carboxyméthyl)amino] éthyle] -L-glycine (EOB-DTPA), , des dérivés mono- ou bis-amide du DTPA, tels que N,N-bis[2- [carboxyméthyl[(méthylcarbamoyl)méthyle]amino]éthyle] glycine (DTPA-BMA), 4- carboxy-5,8,1 l-tris(carboxyméthyl)-l-phényl-2-oxa-5,8,l l-triazatridecan-13-oique acide (BOPTA).
De façon avantageuse, Ch est un chélate macrocyclique choisi parmi 1,4,7,10- tétraazacyclododécan-l,4,7,10-tétraacétique acide (DOTA), 1,4,7,10- tétraazacyclododécan-l,4,7-triacétique acide (D03A), 10-(2-hydroxypropyl)- 1,4,7, 10- tétraazacyclododécan-l,4,7-triacétique acide (HPDO3A) 2-méthyl- 1,4,7, 10- tétraazacyclododécan-l,4,7,10-tétraacétique acide (MCTA), ( alpha , alpha ', alpha ", alpha '")-tétraméthyl-l,4,7,10-tétraazacyclododécan- 1 ,4,7, 10-tétraacétique acide (DOTMA), 3,6,9,15-tétraazabicyclo[9.3.1]pentadéca-l(15),l l,13-triène-3,6,9-triacétique acide (PCTA), 1 ,4,7-triazacyclononane N,N',N44-triacétique acide (NOTA), AAZTA (décrit notamment dans WO 2006/00273 formule III page 120 et US 2006/00118830 page 2 et 89), TETA, TETMA, PDTA, et leurs dérivés benzo, LICAM, MECAM, HOPO (DE 102004062258).
Ch peut également être un dérivé de ces composés dans lesquels un ou plusieurs groupes carboxyliques sont sous forme d'un sel, ester, amide correspondant ; ou un composé correspondant dans lequel un ou plusieurs groupes carboxyliques sont remplacés par un groupe phosphonique et/ou phosphinique.
On peut aussi utiliser un chélate choisi parmi : DOTA gadofluorines, DO3A, HPDO3A, TETA, TRITA, HETA, DOTA-NHS, M4DOTA, M4DO3A, PCTA et leurs dérivés, avantageusement choisi parmi. DOTA, DTPA, DO3A, HPDO3A, TRITA, TETA, BOPTA, NOTA, PCTA, DOTMA, AAZTA, HOPO et leurs dérivés. De manière plus large, le ou les chélates formant l'entité signal pourront répondre à la formule du document WOO 1/60416 suivante :
On pourra utiliser en particulier les composés DTPA, DOTA, NOTA, DO3A, et dérivés. On citera aussi les chélates rappelés dans WO03/011115 notamment de formules suivantes:
avec X un groupe capable de coordiner un cation métallique, de préférence O-, OH, NH2, OPO3-, NHR avec R une chaîne aliphatique, Y un lien chimique.
On pourra en particulier utiliser les chélates désignés P730 du demandeur décrits dans EP 661 279 (US 5 919 432) de formule
et les chélates à squelette PCTA décrits par le demandeur notamment dans US 6 440 956, que ces chélates ou leurs intermédiaires soient porteurs ou non de chaînes hydrophiles, et en particulier de chaînes aminoalcool courtes ou longues.
avec Xl à X4 et Kl à Kl 6 des chélates ci-dessus représentant H ou une chaîne en Ci- C20, et Rl, R2, R3, R4, R5 représentant indépendamment -COOH, -P(O)(OH)2 ; et étant choisis de façon à ce que le chélate comprenne au moins une fonction capable d'être couplée à un PEPTIDE P directement ou par l'intermédiaire du Lien.
On citera aussi les chélates du document US2006/0018830 page 9 à 11 de la partie description [0150] à [0158].
Avantageusement dans le cadre de la présente invention, Ch est le DTPA ou le DOTA ou leurs dérivés.
Dans le cas de l'IRM, la relaxivité ri de ces chélates est typiquement de l'ordre de 4 à 20 s"1 mMol"1 Gd"1 à un champ de 0,5 à 1,5 T. On rappelle que la relaxivité longitudinale ri d'un produit de contraste paramagnétique donne la mesure de son efficacité magnétique et permet d'apprécier son influence sur le signal enregistré. En imagerie médicale IRM, les produits de contraste modifient le temps de relaxation des protons, et l'augmentation de la relaxivité obtenue permet d'obtenir un signal plus élevé.
On entend dans la formule I par le terme liaison chimique, un groupe de liaison ou Lien L, c'est-à-dire un groupe chimique :
- permettant de relier le SIGNAL et le ou les PEPTIDE P n'ayant pas lui-même la fonction d'entité signal qui est assurée par le Signal n'ayant pas lui-même la fonction de ciblage qui est assurée par le PEPTIDE P
Le couplage de chélates avec des biovecteurs en particulier peptidiques est décrit dans l'art antérieur, et fait généralement intervenir une liaison chimique (Lien) telle que décrite dans le document WO01/60416. La structure et la nature chimique de la liaison chimique sont définies pour permettre le couplage chimique entre la partie peptidique du PEPTIDE P et le ou les chélates utilisés, et de manière à obtenir une affinité de la partie PEPTIDE P pour sa cible et une spécificité de la reconnaissance appropriée pour l'utilisation.
Un grand nombre de Lien peuvent être utilisés, dans la mesure où ils sont capables d'interagir avec au moins un groupe fonctionnel de biovecteur et au moins un groupe fonctionnel de chélate.
Avantageusement Lien représente : a) un groupe de formule Ql - I - Q2, dans laquelle Ql et Q2 identiques ou différents représentent O, S, NH, CO2, - NHCO, CONH, NHCONH, NHCSNH, SO2NH- ou NHSO2-, et 1 représente un groupe alkyle (avantageusement en C1-C10), alcoxyalkyle
(avantageusement en C1-C10), alcényle (avantageusement en C2-CO), alcynyle (avantageusement en C2-CO), polyalkoxyalkylène, alkyle interrompu par un ou plusieurs squarate, par un ou plusieurs aryles, avantageusement phényle, ou par un ou plusieurs groupes choisis parmi -NH-, -O-, -CO-, -NH(CO)-, -(CO)NH-, - 0(CO)-, ou -(OC)O- ; b) un groupe (CH2)* (CHOn-CO-, -(CH2)JSTH-CO- avec n = 2 à 10 , (CH2CH2O)q(CH2)r-CO- , (CH2CH2O)q(CH2)r-NH-CO- avec q = 1-10 et r=2-10,
(CH2)n-CONH- , (CH2)n-CONH-PEG, (CH2)n-NH-, , avec n=l à 5 et avantageusement n=4 ou 5, HOOC-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-COOH ; HOOC-(CH2)2-CO2-(CH2)2-
OCO-(CH2)2-COOH ; HOOC-CH(OH)-CH(OH)-COOH; HOOC-(CH2)n-COOH;
NH2-(CH2)n-NH2, avec n=l-20; NH2-(CH2)n-CO2H ; NH2-CH2-(CH2-O-CH2)n-
CO2H avec n=l à 10.
Parmi les linkers avantageux, on citera en particulier ceux des exemples de la présente demande :
CH2 - phényle - NHCSNH - (CH2O) 1=1 a 3
(CH2)n - CO avec n= 1 à 5 (CH2)3 - squarate - (CH2CH2O)2(CH2)^O c) des liens décrits dans le brevet US 6 264 914, capables de réagir avec les groupes fonctionnels (du biovecteur et du chélate) amino, hydroxyle, sulfhydrile, carboxyle, carbonyle, carbohydrates, thioéthers, 2-aminoalcohols, 2-aminothiols, guanidinyle, imidazolyle, phénolique ; selon les définitions de ce document, d) certains liens décrits dans le brevet US 6 537 520 de formule - (Cr6r7)g-(W)h-(Cr6ar7a)g.-(Z)k-(W)h.-(Cr8r9)g..-(W)h..-(Cr8ar9a)g avec : g+h+g'+k+h'+g"+h"+g"' différent de O; avec les définitions identiques à celles de ce document colonne 8. e) certains liens décrits dans le document WO 02/085908 (avec les définitions identiques à celles de ce document), par exemple une chaîne linéaire ou ramifiée de liaison organique choisie parmi :
- CR6'"R7m-, - (R6'")C=C(R7'")=, -CC-, -C(O)-, -O-, -S-, -SO2-, -N(R3'")-, - (R6'")C=N-, -C(S)-, -P(O0(OR3'")-, -P(O)-(OR3'")O-, avec R'"3 un groupe capable de réagir avec un azote ou un oxygène une région cyclique (cycloalkyles divalents, hétérocycles divalents) - des polyalkylènes, polyalkylènes glycols f) des liens du document WO03/011115 pages 124- 125 g) des liens du document US 2006/0018830 (le Lien du demandeur correspondant au lien désigné N-O-P dans ce document US 2006/0018830) liens comprenant au moins un acide aminé non alpha (page 12 à 15, tableau 1 de ce document) liens comprenant au moins un acide aminé non alpha porteur d'un groupe cyclique (page 18 à 25, tableau 3 de ce document) liens ne comprenant pas d'acide aminé autres liens (page 27, 28 de ce document) Le choix de Lien (structure et taille) pourra se faire notamment de manière à contrôler notamment la charge, la lipophilie, l'hydrophilie du produit de formule (I), pour optimiser le ciblage biologique, la biodistribution. On pourra en particulier utiliser des liens biodégradables in vivo, des liens PEG ou mini-PEG.
Le choix du lien est effectué de manière à ne pas altérer de manière gênante l'efficacité du composé de formule (I) selon l'invention, un test permettant de vérifier cette efficacité in vitro et in vivo étant présentés dans la description détaillée.
Selon un autre mode de réalisation, Signal représente un marqueur pour imagerie optique (molécule fluorescente utilisée en imagerie optique). Parmi les marqueurs pour imagerie optique on citera notamment ceux de US2006/0018830 et notamment ceux cités page 11 et 12 paragraphe l.B, avec des modalités précises d'imagerie décrites colonne 33 ([0259]) au paragraphe 6 (techniques et chromophores et fluorophores décrits en détail).
Selon un autre mode de réalisation, Signal représente des quantum dots (fluorophores inorganiques comprenant des nanocristaux).
Selon un autre mode de réalisation, Signal représente une nanoparticule superparamagnétique revêtue d'une couche organique, avantageusement communément désignée SPIO ou USPIO (« ultra small particles of iron oxide »). Avantageusement, la nanoparticule comporte un noyau d'oxyde ou d'hydroxyde de fer, notamment de magnétite (Fe3θ/i), maghémite (γ-Fe2θ3). On utilisera avantageusement une nanoparticule recouverte d'un revêtement bisphosphonate, avantageusement gew-bisphosphonate, décrite dans WO2004058275, la particule et la méthode de couplage entre le peptide et la nanoparticule étant détaillées dans les exemples de la présente demande. Les nanoparticules magnétiques utilisées sont des nanoparticules acides à base d'un composé du fer, et recouvertes par une couche comprenant un ou plusieurs composés gem- bisphosphonates identiques ou différents, la couche de recouvrement de la nanoparticule ayant la formule (C) suivante :
T-L2-CH(PO3H2)2 (C) dans laquelle : • Le lien L2 représente un groupement organique reliant la fonction T à la fonction gem- bisphosphonate -CH(PO3H2)2 ;
• T représente une fonction chimique couplé au PEPTIDE P ou au Lien de la présente demande. Dans un mode de réalisation particulier T-L2 représente le Lien du composé de formule (I).
La composition se présente sous forme d'une solution aqueuse stable de nanoparticules. Dans ces compositions, le taux de complexation (de la couche avec le peptide) du composé (C) sur les particules est supérieur à 50%, avantageusement à 70%, et de préférence supérieur à 80, 90, 95%. On préfère particulièrement que les particules magnétiques acides (p) soient complexées sur au moins 90% de leurs sites protonés par des composés de formule (C). Selon une variante, une partie des fonctions T de la couche est couplée à un PEPTIDE P, et une partie des fonctions T est couplée à un composé hydrophile notamment un composé porteur de groupes hydroxyle et notamment un composé hydrophile aminoalcool désigné AAG1AA28 décrit dans WO2004058275 (exemple 8) ou un groupe PEG.
Les particules magnétiques (p) possèdent un diamètre hydrodynamique compris entre 5 et 300 nm, de préférence entre 5 et 60 nm, encore de préférence entre 5 et 30 nm. Le linker L2 permet de relier et/ou d'espacer la fonction gew-bisphosphonate et l'entité réactive T capable d'assurer le greffage covalent du PEPTIDE P (le biovecteur) sur la nanoparticule, par l'intermédiaire ou non du Lien..
A titre préféré, le lien L2 représente un groupement divalent. De préférence, le lien L2 est choisi parmi : un groupe aliphatique ; alicyclique ; alicyclique aliphatique ; aromatique ; aromatique aliphatique, lesdits groupes aliphatiques, alicycliques et aromatiques pouvant être éventuellement substitués par un groupe méthyle, hydroxy, méthoxy, acétoxy, amido, ou un atome d'halogène, avantageusement un atome de chlore, d'iode ou de brome ; un groupement -IrNHCO-I2 où Ii et I2, identiques ou différents, représentent un groupe aliphatique ; alicyclique ; aromatique ; alicyclique aliphatique ou aromatique aliphatique, lesdits groupes pouvant être éventuellement substitués par un groupe méthyle, hydroxy, méthoxy, acétoxy, amido ou un atome de chlore, d'iode ou de brome.
Selon des réalisations préférées, L2 représente un groupe aliphatique substitué ou non, et plus préférentiellement un groupe -(CH2)P -, où p est un entier de 1 à 5, ou préférentiellement un groupe -(CH2)n-NHCO-(CH2)m- où n et m représentent un nombre entier de 0 à 5.
A titre de groupes T préférés, on peut citer notamment les groupes COOH, -NH2, -NCS, - NH-NH2, -CHO, alkylpyrocarbonyle (-CO-0-CO-alk), acylazidyle (-CO-N3), iminocarbonate (-0-C(NH)-NH2), vinylsulfuryle (-S-CH=CH2), pyridyldisulfuryle, (S-S- Py), haloacétyle, maléimidyle, dichlorotriazinyle, halogène, les groupes -COOH et -NH2 étant particulièrement préférés.
De préférence, T représente un groupe -COOH ou -NH2 et L2 un groupe aliphatique substitué ou non, avantageusement un groupe -(CH2)P-, où p est un entier de 1 à 5. On préfère tout particulièrement la couche de formule (Cl) suivante
HOOC-(CH2)2-CH(PO3H2)2
Plusieurs composés de type nanoparticules d'oxyde de fer porteurs de PEPTIDE P sont décrits dans la description détaillée.
Selon un autre mode de réalisation moins avantageux, Signal représente une nanoparticule lipidique comprenant au moins un chélate. Les nanoparticules lipidiques peuvent se trouver sous la forme d'émulsion nanoparticulaire, contenant ou non des perfluorocarbones, telle que celles décrites dans les documents WO 03/062198, US 5 958 371, US 5 080 885, US 6 403 056. Les nanoparticules lipidiques peuvent être mises en suspension dans un milieu aqueux ou hydrophile. Ces nanoparticules ont un diamètre de l'ordre de 10 nm à 500 nm, notamment 20 à 250 nm. Les nanoparticules en émulsion peuvent comprendre ou être couplées avec un grand nombre de chélates, par exemple 10 000 à 100 000 chélates par nanoparticule. Les émulsions comprennent suffisamment de composés de formule (I) et donc de Peptide pour permettre la reconnaissance de la zone d'apoptose. On citera comme nanoparticules possibles des liposomes, unilamellaires ou multilamellaires, des micelles, des microgels, des gouttelettes d'huiles, des lipoprotéines, tels que HDL, LDL, IDL, VLDL, chylomicrons, des nanoparticules de fluorocarbone, des nanobulles, ou analogues dont la surface est lipophile. Avantageusement le chélate est lipophile et attaché à la membrane de la nanoparticule.
De façon avantageuse le Lien du composé de formule (I) est suffisamment lipophile pour coupler le Peptide à la membrane de la nanoparticule lipidique, le PEPTIDE P étant suffisamment exprimé à la partie externe de la nanoparticule pour la reconnaissance spécifique de la cible apoptotique. Le Lien est par exemple un groupe lipophile tel qu'une chaîne alkylène en C10-C20, cette chaîne s'insérant dans la couche lipidique de la nanoparticule et permettant ainsi d'attacher le Peptide à la nanoparticule.
De nombreux chélates rendus lipophiles pour être associés à une membrane lipidique sont décrits en détail notamment dans les documents US 6 045 821, WO90/04943, WO 2006/100305. Selon des réalisations le chélate porte une longue chaîne lipophile (phospholipide par exemple) qui vient s'insérer dans la membrane de la nanoparticule lipidique (liposome, micelle, nanoémulsion). De même le PEPTIDE P porte avantageusement une chaîne lipophile (le Lien) qui vient s'insérer dans la membrane de la nanoparticule lipidique. Selon des réalisations avantageuses, la nanoparticule lipidique inclut des perfluorocarbones tels que décrits dans US 5,958,371, l'émulsion liquide contenant des nanoparticules comportant un perfluorocarbone à point d'ébullition assez élevé (par exemple entre 50 et 90 0C) entouré d'un revêtement composé d'un lipide et/ou d'un surfactant. Le surfactant est capable de se coupler directement à un biovecteur de ciblage ou d'inclure un composé intermédiaire lié de manière covalente au biovecteur, le cas échéant à l'aide d'un agent de liaison chimique.
Différentes émulsions de perfluorocarbone sont rappelées dans le document US 6 676 963 (perfluorodecalin, perfluorooctane, perfluorodichlorooctane, bromure de perfluoro-n-octyle, perfluoroheptane, perfluorodécane, perfluorocyclohexane, perfluoromorpholine, perfluorotripropylamine, perfluorotributylamine, perfluorodiméthylcyclohexane, perfluorotriméthylcyclohexane, éther de perfluorodicyclohexyle, perfluoro-n-butyltétrahydrofurane) .
On utilise habituellement comme phospholipides formant la membrane des nanoparticules les composés suivants : phosphatidylcholine dioléoylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, distéaroylphosphatidylcholine, phosphatidyléthanolamine.
De telles compositions sont décrites par exemple dans US 5,989,520 et US 5,958,371, comme rappelé dans le document US 20040248856 qui cite notamment des composés perfluorocarbone : perfluorodecalin, perfluorooctane, perfluorodichlorooctane, bromure de perfluoro-n-octyle, perfluoroheptane et analogues.
Selon des réalisations avantageuses, on utilisera pour préparer des agents de contraste selon l'invention des méthodes et des compositions lipidiques appropriées rappelées dans US 6 010 682, notamment pour ce qui concerne la description détaillée de la composition lipidique, et de la préparation de liposomes, de micelles, d'émulsions. On rappelle que les émulsions sont des mélanges lipidiques hétérogènes obtenues de manière appropriée par agitation mécanique et/ou addition d'agents émulsifiants. Par exemple, on mélange mécaniquement les chélates rendus lipophiles à des solvants organiques tels que le chloroforme. Après évaporation du solvant, les lipides sont remis en suspension en milieu aqueux tel que PBS pour obtenir une émulsion qui subit ensuite typiquement une sonication et une microfluidisation. Les émulsions obtenues peuvent être lyophilisées avec le cas échéant utilisation d'agents anti agglutination. Pour formuler l'émulsion d'agent de contraste paramagnétique souhaité, on utilise typiquement 1 à 75% en poids de composé chélate lipophile par rapport aux ingrédients totaux de l'émulsion. La composition formant l'agent de contraste est administrée de préférence en intravasculaire, selon le patient examiné, par exemple à raison de 0, 1 mg à 1 g de composé chélate lipophile et de 1 à 50 micromoles d'ion de métal paramagnétique par kg de patient. Les compositions lipidiques obtenues sont le cas échéant formulées à l'aide d'additifs rappelés dans US 6 010 682, notamment pour une administration par injection intraveineuse. On citera notamment le dextrose, le chlorure de sodium, des antimicrobiens.
Avantageusement grâce aux compositions selon l'invention on peut obtenir une augmentation de la relaxivité par ion. On obtient typiquement les caractéristiques suivantes, pouvant varier selon les compositions précises des émulsions et leur procédé de préparation : index de polydispersité : 0,2 à 0,3
- [Gd3+] = 2 à l0 mM de préférence 3 à 7 mM concentration en particules : 50 à 100 nM - ri (InM 1S 1Gd"1) : 5 à 40, de préférence 10 à 40
- r2 (InM 1S 1Gd"1) : 20 à 40
- ri (InM 1S 1 PaHiCuIe-I) : 106 à 4xlO6 nombre de biovecteurs : 50 à 1000, notamment 100 à 300
L'invention concerne aussi ces composés de formule (I) dans laquelle le Peptide contient une séquence peptidique modifiée, mais sans altérer l'affinité et la spécificité pour la cible et l'efficacité du composé in vivo. Le PEPTIDE P est par exemple modifié en utilisant des méthodologies appropriées décrites dans l'art antérieur par exemple dans US2005100963 (colonne 20-21 paragraphes [529] à [541] dans le cas de peptides ciblant des récepteurs KDR), afin de sélectionner des composés de formule (I) efficaces :
1) substitution d'acides aminés sans altérer leur fonction, selon la méthode rappelée dans ce document pour des acides aminés hydrophobe, aromatique, acide, contenant des hydroxyles, contenant des chaînes latérales amide.
Par exemple, pour les acides aminés hydrophobes leucine Xl et isoleucine X2, on pourra tester l'utilisation d'une autre chaîne latérale aliphatique en Ci- io linéaire ou ramifiée (alkyle, alcényle, alcynyle) . On pourra ainsi tester la substitution des acides aminés Xl, X2 par d'autres acides aminés hydrophobes alkyle- substitués (alanine, leucine, isoleucine, valine, norleucine, S-2-aminobutyricacide).
Pour la proline, on utilise aussi d'autres acides aminés hydrophobes, notamment des dérivés avec une aminé secondaire.
Pour X6 (phénylalanine) on teste l'utilisation d'autres acides aminés aromatiques (tyrosine, biphénylalanine, naphthylalanine, benzothiénylalanine, et dérivés). On pourra en particulier faire le screening des dérivés du paragraphe [532] de US2005100963, notamment les dérivés substitués amino, alkylamino, dialkylamino, aza, halogènes, alcoxy, tels que la 2-,3- ou 4-aminophénylalanine, la 2-,3- ou 4-méthylphénylalanine. Pour X3 et X4 (lysine) on pourra utiliser aussi d'autres acides aminés dibasiques (arginine, histidine, ornithine) ou des dérivés de la lysine ou de ces autres acides aminés, notamment les dérivés alkyle, alcényle, aryle ; tels que des dérivés N-epsilon-isopropyle- lysine. On pourra en particulier tester les dérivés cités au paragraphe [533] de US2005100963 ;
2) substitution de liaisons amides présentes sur le squelette du polypeptide, notamment pour limiter la dégradation du peptide et/ou ajuster la flexibilité du peptide (par exemple insertion de alpha-N-méthylamide, ou d'une thioamide, remplacement d'un aminoacide par un aza aminoacide) ;
3) introduction d'acides aminés de la série D, tels que la D-alanine afin de jouer sur l'accessibilité du peptide pour sa cible du fait d'un effet de la modification stérique sur l'orientation des chaînes latérales ; 4) modifications chimiques pour ajuster la solubilité et la pharmacocinétique du composé de formule (I), par exemple en ajoutant un groupe hydrophile, ou basique, ou groupe non polaire alkyle ou aromatique, à l'aide d'une liaison à la partie C ou N terminale du peptide, ou au niveau d'une chaîne latérale d'acides aminés du peptide, notamment au niveau de la lysine qui présente une fonction aminé libre (ou d'un dérivé tel qu'un 2-,3- diaminopropionique acide) ;
5) glycosilation ;
6) autres modifications : - formation de sels : N-methylglucamine (méglumine), acétate, oxalates, ascorbates, etc - manipulation de la séquence peptidique (par exemple rétropeptide ou cyclisation).
Ainsi pour le peptide D-A-H-S-X7-S (SEQ ID No T), où avantageusement X7 est choisi parmi F ou L, on étudie aussi les peptides (SEQ ID No 7) avec : A remplacé par la leucine, l'isoleucine, la valine et dérivés H remplacé par la lysine ou l'arginine et dérivés S remplacé par la thréonine et dérivés L remplacé par l'isoleucine, la valine et dérivés.
Ainsi pour le peptide P-G-D-L-X8-X9 (SEQ ID No 3), où avantageusement X8 est choisi parmi S ou V et X9 est choisi parmi T ou R, on étudie aussi les peptides (SEQ ID No 8) avec :
L remplacé par l'isoleucine, la valine et dérivés
T remplacé par la serine R remplacé par la lysine
D remplacé par l'acide aspartique
Ainsi pour le peptide H-G-XlO-L-S-XI l (SEQ ID No 4) où avantageusement XlO est choisi parmi D ou H, et Xl 1 est choisi parmi T ou I, on étudie aussi les peptides (SEQ ID No 9) avec :
L remplacé par l'isoleucine, l'arginine, la valine et dérivés
H remplacé par la lysine ou l'arginine et dérivés
G remplacé par l'asparagine
T remplacé par la serine I remplacé par la leucine, la valine et dérivés
Ainsi pour le peptide VLGERG (SEQ ID No 5) on étudie aussi les peptides (SEQ ID No
10) avec :
V remplacé par la leucine ou l'isoleucine L remplacé par l'isoleucine, l'arginine, la valine et dérivés E remplacé par l'acide aspartique R remplacé par la lysine
Les tests biologiques décrits en détail dans la demande permettent de sélectionner des peptides efficaces équivalents ou améliorés en terme d'activité de ciblage de l'apoptose en comparaison avec les peptides exemplifiés en détail dans la présente demande.
L'invention concerne selon un autre aspect les produits de contraste pour l'IRM comprenant un composé de formule (I) tel que décrit précédemment dont l'ion de métal paramagnétique M est de nombre atomique 21-29, 42-44 ou 58,70, de préférence de gadolinium. Les métaux paramagnétiques M incluent les lanthanides de nombre atomique 58-70 et les métaux de transition de nombre atomique 21-29, 42 or 44, par exemple scandium, titane, vanadium, chrome, manganèse, fer, cobalt, nickel, cuivre, molybdène, ruthénium, cérium, praseodymium, neodymium, prométhium, samarium, europium, gadolinium, terbium, dysprosium, holmium, erbium, thulium, et ytterbium. On préfère particulièrement les éléments Gd(III), Mn(II), europium, dysprosium, avantageusement M est choisi parmi Gd, Mn, Fe, Dy et Tm. L'invention concerne selon un autre aspect les produits de contraste pour l'imagerie aux rayons X ou à la CT, comprenant un composé (I) tel que décrit précédemment dont l'ion de métal lourd M est de nombre atomique 21-31, 39-50 , 56-80, 82, 83 ou 90. L'invention concerne selon un autre aspect des produits radiopharmaceutiques, comprenant un composé de formule (I) tel que décrit précédemment dont le chélate est couplé avec un radionucléide ou un radiohalogène connu de l'homme du métier, typiquement le gadolinium, le technétium, le chrome, le gallium, l'indium, l'ytterbium, le rhénium, le lanthanium, ryttrium, le dysprosium, le cuivre ou analogue. Les radionucléides incluent les formes radioactives des éléments Sm, Ho, Y, Pm, Gd, La, Lu, Yb, Sc, Pr, Tc, Re, Ru, Rh, Pd, Pt, Cu, Au, Ga, In, Sn, Cr, Pb, notamment 99Tc, 117Sn,
H l1 I-n, 97- Rτ)u, 67/ G-.a, 68/ G-.a, 89 ZVr, 177T Lu, 47C Sc, 105- Rr>-hi ; 188- Rr>e, 60^ Cu, 62^ Cu, (A1 C^u, 67^ Cu, 90Λ Yr, 159/ G-.d A, 149Pr, 166Ho ; Le 68Ga est le moins avantageux dans le cadre de la présente invention. La préparation de composés utilisables comme radiopharmaceutiques notamment en utilisant le technétium 99Tc est rappelée dans US 2006/0018830 page 32 paragraphe 4, ces techniques étant décrites dans ce document pour des composés comprenant un chélate couplé à un peptide de ciblage de la gastrine. Pour des indications en radiothérapie, le couplage de macrocycles de type DOTA, la sélection de nucléides appropriés, la préparation des composés radiothérapeutiques est rappelée dans US 2006/0018830 colonne 35 et 36.
L'invention concerne selon un autre aspect une méthode de diagnostique et une méthode de traitement radiopharmaceutique utilisant un composé de formule (I) tel que décrit précédemment.
La présente invention concerne en outre une composition comprenant au moins un composé de formule générale (I) tel que décrit précédemment et un excipient pharmaceutiquement acceptable, avantageusement destinée à une administration par voie parentérale. Elle concerne de plus un procédé de préparation d'une telle composition comprenant l'addition d'un composé de formule générale (I) tel que défini précédemment à un milieu injectable comprenant l'excipient pharmaceutiquement acceptable.
L'invention concerne l'utilisation d'une composition selon la présente invention pour le diagnostique d'une pathologie associée à l'apoptose. Les compositions diagnostiques et radiopharmaceutiques selon l'invention peuvent être utilisées comme décrit dans les demandes US 2002/0090342, US 2002/0098149, WO 02/055111 pour des indications anticancéreuses.
L'invention concerne de plus les composés de formule générale (I) tels que définis précédemment pour leur utilisation en tant qu'agent de diagnostique de maladies associées à l'apoptose. L'invention concerne aussi l'utilisation des composés décrits précédemment pour la préparation d'une composition diagnostique ou radiopharmaceutique destinée au diagnostique et/ou au traitement de maladies associées à l'apoptose, avantageusement choisies parmi les maladies neurodégénératives chroniques, les maladies ischémiques et les pathologies inflammatoires.
Elle concerne enfin l'utilisation d'un peptide ciblant l'apoptose de formules (1) à (5) telles que définies ci-dessus pour la préparation d'une composition de diagnostique de maladies associées à l'apoptose. Le cas échéant les composés de formule générale (I) du demandeur seront utilisés en tant qu'agent de diagnostique, ou en tant qu'agent de traitement thérapeutique au niveau de zones d'apoptose, ou en tant qu'agent de diagnostique et de traitement thérapeutique, ou de suivi diagnostique de l'efficacité thérapeutique. Le cas échéant le composé sera co- administré simultanément ou de manière différée avec d'autres agents diagnostiques et/ou thérapeutiques ciblant l'apoptose. L'invention concerne aussi une méthode d'imagerie comprenant la synthèse d'un composé comprenant un métal paramagnétique selon l'invention, capable de cibler une zone pathologique, son administration à un patient, l'imagerie par IRM. L'invention concerne aussi une méthode d'imagerie comprenant la synthèse d'un composé radiopharmaceutique selon l'invention, capable de cibler une zone pathologique, son administration à un patient, l'imagerie par scintigraphie gamma SPECT ou planaire, ou tomographie par émission de positrons.
Pour un diagnostique en IRM, l'administration intraveineuse par injection habituellement en solution saline, se fait typiquement à une dose d'ion métallique de 0,001 à 1,5 mmo le/kg de poids corporel, par exemple de 1 à 500 μmol Gd/kg.
Pour un diagnostique radiopharmaceutique, l'administration intraveineuse par injection habituellement en solution saline, se fait typiquement à une dose de 1 à 100 mCi pour 70 kg de poids corporel, de préférence de 5 à 50 mCi, avec une imagerie de diagnostic par exemple 30 à 180 minutes après l'injection pour le 99Tc. Pour une utilisation comme agents de contraste aux rayons X , la concentration en atome lourd est typiquement de 0,1 M à 5 M, avec des concentrations par administration intraveineuse de l'ordre de 0,5 à 1,5 mmol/kg.
L'invention concerne selon un autre aspect l'utilisation d'un composé de formule (I) tel que décrit précédemment pour la préparation d'une composition destinée à l'imagerie optique.
Des exemples d'administration de compositions pour l'imagerie médicale sont décrits dans l'art antérieur, par exemple dans le document WO 0226776 et US 2006/0018830 colonne 36 ([0282]) paragraphe 8 (dosages et additives). Des véhicules pharmaceutiquement physiologiquement acceptables permettant de former des compositions diagnostiques (produits de contraste) comprenant les composés décrits précédemment sont connus de l'art antérieur. On utilisera par exemple des sels (sodium, calcium, méglumine), des agents de contrôle du pH (acide acétique, citrique, fumarique, des antioxydants. L'invention concerne aussi un procédé de préparation de composés comprenant le couplage d'un Peptide avec au moins un chélate. Plusieurs méthodes générales de préparation de composés de formule (I) décrites dans le US2006/0018830 (Bracco) sont applicables en utilisant Peptide à la place des peptides de ces documents. Ces méthodes choisies en fonction notamment du chélate choisi sont rappelées dans 2006/0018830 colonne 37 ([0288] à ([029I]) (« gênerai préparation of compounds », et « alternative préparation of the compounds via segment coupling »), par exemple les méthodes SPPS et FMOC. L'invention concerne aussi une méthode de diagnostique ou de traitement radiopharmaceutique comprenant l'administration d'un composé (I), la réalisation d'un examen d'imagerie à l'aide d'un équipement approprié, et l'analyse des résultats. L'invention couvre sauf indication contraire, toutes les formes chirales, diastéréoisomères, racémiques, notamment cis-trans, L-D des composés de formule (I) décrits.
Le demandeur a aussi étudié les possibilités d'association d'un PEPTIDE P couplé à plusieurs chélates dans le composé de formule (I). Le demandeur a par ailleurs étudié des composés de formule (I) présentant un assemblage entre un ou plusieurs Peptides du composé de formule (I) ciblant l'apoptose, et un ou plusieurs chélates ; et de manière à ce que l'accès à la cible ne soit pas gêné malgré la présence du ou des chélates. Par exemple, le chélate est espacé du ou des PEPTIDES P par le Lien d'une taille suffisante et d'une structure chimique telles que la reconnaissance du ou des peptides par leur cible n'est pas altérée.
Parmi les associations biovecteurs (peptides ou éventuels d'autres biovecteurs) /chélates, on peut citer notamment : un peptide biovecteur central relié à plusieurs chélates identiques ou différents un chélate central relié à plusieurs peptides identiques ou différents un premier ensemble [peptide porteur de chélate(s)] couplé par l'intermédiaire d'un lien hydrophobe ou hydrophile à un second ensemble [peptide porteur de chélates(s)] , s 'écrivant par exemple :
Ch2-peptidel-Lien-peptide2-Ch2 avec Ch représentant des chélates identiques ou différents et peptide 1 et peptide2 représentant des Peptides identiques ou différents un ensemble peptide 1 -(Lien porteur de Ch)-peptide2-Ch On utilisera par exemple la méthode de construction de composés multimériques décrite dans US2005/0100963 (WO2006/031885 page 66 ligne 25 à page 69 ligne 30) dans le cas de peptides ciblant des récepteurs KDR (par exemple à l'aide de la méthode 13 des exemples : « préparation of homodimers and heterodimers »), mais en utilisant le PEPTIDE P (on remplacera par exemple les peptides des composés des figures 44 à 47 du US2005100963 par des PEPTIDES P). Le composé peut ainsi avantageusement comprendre un peptide couplé à plusieurs chélates, ou un chélate couplé à plusieurs peptides identiques ou différents. L'invention concerne aussi des composés mixtes comprenant en plus du PEPTIDE P au moins un autre biovecteur ciblant l'apoptose, le biovecteur étant soit un autre peptide soit un autre biovecteur mais non peptidique.
On pourra le cas échéant coupler la partie peptide ou la partie chélate à des groupements chimiques permettant de favoriser la biodistribution, la durée de vie du produit dans le sang.
La spécificité du produit fait référence à son affinité spécifique pour au moins un marqueur de l'apoptose ou de tout trouble pathologique associé, la spécificité de la liaison exprimée typiquement par des constantes Kd et Ka, la valeur Kd pour les marqueurs cibles étant inférieures à 10 μM, de préférence inférieure à 1 μM.
Parmi les sels pharmaceutiquement acceptables, on citera notamment des sels de cations de bases inorganiques (potassium, sodium, calcium, magnésium...), des cations de bases organiques (éthanolamine, diéthanolamine, morpholine, glucamine, N- méthylglucamine, N, N-diméthylglucamine...), des anions d'acides inorganiques (notamment des chlorures, bromures, iodures, sulfates...), des anions d'acides organiques (acétate, succinate, citrate, fumarate, maléate, oxalate, trifluoroacétate...), des ions d'acides aminés (taurine, glycine, lysine, arginine, ornithine, acide aspartique, acide glutamique...).
Le demandeur a démontré l'utilisation très avantageuse de composés incorporant des peptides selon l'invention, en particulier en IRM, pour plusieurs catégories de troubles dûs à l'apoptose : maladie vasculaire (apoptose au niveau de zones à plaques d'athérome), altération de tissus hépatiques (apoptose hépatique), altération de tissus nerveux (apoptose neuronale à l'origine de maladies cérébrales dont la maladie de Parkinson en particulier).
Il est rappelé qu'il existe un écart très important entre l'efficacité potentielle in vitro d'un biovecteur de ciblage, et son efficacité réelle in vivo une fois couplé à une entité signal. Comme illustré plus loin, le demandeur a démontré notamment l'efficacité de produits pour IRM comprenant un chélate lié au peptide P notamment LIKKPF, et de produits pour IRM de type USPIO (particule d'oxyde de fer) lié au peptide P notamment LIKKPF. Ainsi quand bien même un peptide serait connu de l'art antérieur, l'identification de son utilité dans un mécanisme d'apoptose par son ciblage en particulier de la phosphatidylsérine, parmi le nombre extrêmement important de cibles biologiques possibles, est loin d'être évidente. De plus il n'est nullement évident que cette cible biologique identifiée, des composés couplés (peptide P - entité signal) permettent de résoudre les problèmes techniques résolus par le demandeur, notamment : - la conservation de l'affinité in vivo pour le site reconnaissance biologique, malgré l'encombrement stérique et la modification possible de conformation in vivo du fait du couplage à une entité signal
- la possibilité de couplage chimique avec les entités signal ; le couplage avec les dérivés PCTA en particulier a impliqué la mise au point d'une synthèse chimique dédiée - la stabilité physico-chimique in vivo qui constitue une limitation majeure pour de nombreux peptides
- la capacité d'être reconnu en imagerie in vivo, et cela en particulier en IRM, technique dont le niveau de sensibilité est près de 1000 fois inférieur à l'imagerie PET.
Au global, il n'était donc absolument pas évident pour l'homme du métier :
- d'une part de sélectionner les peptides objet de la présente invention
- d'autre part que les produits intégrant ces peptides soient in vivo effectivement efficaces.
Dans la description détaillée qui suit, on décrit des peptides dont on a montré l'efficacité avec des variantes de réalisation sur différentes entités signal (PARTIE I) et les résultats biologiques (PARTIE II),
La figure 1 représente le test de compétition avec l'annexine V
La figure 2 représente la mesure de l'affinité du peptide LIKKPF (SEQ ID No 11)
La figure 3 représente la mesure de l'affinité du peptide LIKKPF (SEQ ID No 11) couplé à un USPIO
La figure 4 illustre des tests sur cellules apoptotiques réalisés avec un produit USPIO-
LIKKPF
La figure 5 illustre l'affinité d'un produit DTP A-LIKKPF avec les cellules apoptotiques La figure 6 illustre le suivi dynamique du signal IRM du foie apoptotique de souris avec un produit DTPA-LIKKPF
La figure 7 montre des images IRM sur souris ApoE obtenues avec un produit DTPA- LIKKPF, la figure 8 représente le rehaussement quantitatif correspondant
EXEMPLES PARTIE I : préparation des composés incluant des PEPTIDES P.
Généralités
M : concentration molaire (mol/1). M/z : masse sur charge déterminée par spectrométrie de masse.
ES+ : électrospray mode positif. ES" : électrospray mode négatif. kD : unité de masse moléculaire (kiloDalton) CCM : Chromatographie sur Couche Mince Z ave : diamètre hydrodynamique mesuré par PCS
Dosage du Fer total:
Le fer est dosé par spectroscopie d'absorption atomique (Spectrophotomètre VARIAN AAlO) après minéralisation par HCl concentré et dilution par rapport à une gamme étalon d'ions ferrique (0, 5, 10, 15 et 20 ppm) Taille des particules :
Diamètre hydrodynamique de la particule greffée (Z ave) :
Déterminé par PCS (appareil Malvern 4700, laser 488 nm à 90°) sur un échantillon dilué à ~ 1 millimolaire avec de l'eau PPI filtrée sur 0.22 μm.
PCS = Photon Corrélation Spectroscopy = Technique par Diffusion de Lumière Dynamique - Référence : R. Pecora dans J. ofNano. Res. (2000), 2, p 123-131. Analyses structurales :
Par spectroscopie de masse (appareil MICROMASS VG Quattro II) avec une source Electrospray. Mesures de relaxivité : Les temps de relaxation Tl et T2 ont été déterminés par des procédures standards sur un appareil Minispec 120 (Broker) à 20 Mhz (0,47T) et 37°C . Le temps de relaxation longitudinal Tl est mesuré en utilisant une séquence d'Inversion Récupération et le temps de relaxation transverse T2 est mesuré par une technique CPMG. Les vitesses de relaxation Rl (=1/T1) et R2 (=1/T2) ont été calculées pour différentes concentrations en métal total ( variant de 0,1.10" à 1.10" mole/L) en solution aqueuse à 37°C. La corrélation entre Rl ou R2 en fonction de la concentration est linéaire, et la pente représente la relaxivité ri (Rl/C) ou r2 (R2/C) exprimées en (1 / seconde) x (1/ mmol/L) soit (s"'.mM"').
Les nanoparticules ont été préparées selon les méthodes décrites dans le brevet WO2004/058 275 (US 2004/253181) exemples 8 et 9 pour la préparation des solutions colloïdales de particules magnétiques et exemples 10 à 12 pour la complexation des particules magnétiques par un revêtement gem-bisphosphonate de l'exemple 1 de WO2004/058 275.
Exemple 1 : Couplage des peptides sur la particule d'oxyde de fer
(produit PEG - USPIO - PEPTIDE P)
Les séquences peptidiques d'intérêt sont présentées dans le tableau suivant :
Couplage du peptide:
30 ml de nanoparticules, [Fe] = 0,338 mol sont ultrafiltrés et agités à température ambiante, le pH est égal à 7,29. Le peptide N°2 (LIKKPF (SEQ ID No 11) ), protégé sous forme de trifluoroacétamide sur les fonctions aminés latérales des lysines, est dissout dans 1 ml d'eau (26,6 mg) et la solution obtenue est ajoutée progressivement en même temps que l'EDCI (25 mg). En fin d'ajout le pH est égal à 6,55. Le mélange est agité une nuit à température ambiante. Le pH est ajusté à 7 avec NaOH (0,1 N) et la solution est filtrée sur 0,22 μm (filtres Durapore Millipore) puis ultrafiltrée sur une membrane de 30 kD (éliminer ~ 1 1 de filtrat). Volume final 30 ml (solution A). Les peptides 1, 3, 4, 5, 6 et 7 sont couplés selon le même mode opératoire.
Couplage de I 'aminé hydrophile
24 ml de la solution obtenue précédemment (solution A) sont agités à température ambiante et une solution de 1,88g de l'aminé polyhydroxylée (préparée selon le mode opératoire décrit dans le brevet EP 0 922 700 Al) est ajoutée dans 5 ml d'eau. Le pH est ajusté à 8 avec une solution d'HCl et 600 mg d'EDCI sont introduits à température ambiante. Le milieu est agité une nuit, le pH est ajusté à 7,5 et la solution est filtrée sur filtre de porosité 0,22μ puis ultrafiltrée sur une membrane de 30 kD. Volume final 20 ml
(solution B).
Déprotection des Lysines :
La solution précédente (solution B) est agitée à température ambiante et le pH est ajusté à
10 avec une solution de NaOH. Après 6h d'agitation, la solution est filtrée sur filtre de porosité 0,22 μ puis ultrafiltrée sur une membrane de 14 kD.
Couplage des aminés polyéthylèneglycol, PEG-NH2
L'amino PEG-NH2 750 ( O-(2-aminoéthyl)-O'-méthylpolyéthylèneglycol 750 est obtenu chez FLUKA®). L'aminoPEG 350 est préparé selon la séquence réactionnelle suivante selon des modes opératoires décrits dans la littérature.
Les aminoPEG suivants sont disponibles chez les fournisseurs :
24 ml de la solution USPIO-peptide protégé (solution A) sont agités à température ambiante et une solution de PEG 750-NH2 (1,57 g) dans 5 ml d'eau est ajoutée. Le pH est ajusté à 8 avec une solution d'HCl et Ig d'EDCI est ajouté en deux portions égales. Le mélange est agité une nuit, le pH est ajusté à 7,5 et la solution est filtrée sur un filtre de 0,22μ puis ultrafiltrée sur une membrane de seuil de coupure 30 kD ; volume final 20 ml
(solution C).
Les autres aminoPEG sont couplés selon le même mode opératoire au départ de la solution A.
Caractérisation : A. PEG750 - USPIO -peptide N°2 concentration 110 mM de fer
PCS : 26 nm i2/rl (20 MHz, 37°C): 72,95/28,12 = 2,59 i2/rl (60 MHz, 37°C): 71,81/12,59 = 5,70 B. PEG2000- USPIO - peptide N°2
Concentration 20,96 mM de fer
PCS : 40 et l50 nm i2/rl (20 MHz, 37°C): 273,46/36,66 = 7,46 i2/rl (60 MHz, 37°C): 312,79/16,28 = 19,21 C. PEG350- USPIO -peptide N°2
Concentration 142,59 mM de fer PCS : 25 et 90 nm r2/rl (20 MHz, 37°C): 101,54/33,90 = 2,99 r2/rl (60 MHz, 37°C): 104,45/15,37 = 6,79
Exemple 2 : couplage des peptides sur des chélates de gadolinium
Séquence des peptides couplés :
Condensation des peptides et complexation :
A une solution de peptide dans 2 ml d'eau est ajouté goutte à goutte le composé Bz-NCS-
DTPA (Macrocyclics ®) dissous dans du DMF. Le pH du mélange réactionnel est ajusté à 10 avec une solution de NaOH et la solution est agitée pendant 48h. Le pH est ensuite ajusté à 7, et la solution est percolée sur une colonne de silice RPCl 8. Les fractions contenant le composé d'addition sont recueillies. Le ligand est ensuite complexé avec un équivalent de GdCl3.6H2O pendant 6h.
Spectres de masse ESI : Peptide N°3 -DTPAGd: [M+H]+ : 1184
Peptide N0I-DTPAGd: [M+H]+ : 1204
Relaxivités mesurées à 20 MHz (37°C) : Peptide N°3-DTPAGd: 6.7 s"'mM4 Peptide N0I-DTPAGd: 6.8 s"'mM4 Couplage d'un peptide protégé sous forme de trifluoroacétamides latérales :
Le peptide (350 mg, 0,323 mmol) est dissous dans 2 ml d'eau et le composé polycarboxylé (NCS-Bz-DTPA 420 mg, 0,646 mmol, 2 équivalents) en solution dans l'eau est ajouté goutte à goutte. Le pH du mélange réactionnel est ajusté à 10 avec une solution de NaOH et la solution est agitée pendant 48h. Le pH est réajusté à 7, et la solution est percolée sur une colonne de silice RPCl 8. Les fractions contenant le produit de condensation sont concentrées et le ligand est complexé avec un équivalent de GdCl3-OH2O (0,235 mmol) pendant 6h. Caractérisation :
Spectre de masse du complexe de gd
Relaxivité du complexe de Gd
Exemple 3 : synthèse d'un chélate bifonctionnel dérivé du DOTA
Etape 1 : Ester benzylique de l'acide 5-(l,3-Dioxo-l,3-dihvdro-isomdol-2-yl)-2- (IAJ, 1 Otétraaza-cyclododéc- 1 -yl)-pentanoïque
55 g de cyclen base (320 mmol) sont dissous dans 550 mL de CH3CN, auxquels sont ajoutés goutte à goutte 119,8 g de dérivé brome (2-Bromo-5-(l,3-dioxo-l,3-dihydro- isoindol-2-yl)-pentanoïque acide benzyle ester, 288 mmol) dissous dans 550 mL de CH3CN Le milieu est agité à température ambiante 1 nuit. Le précipité est filtré et lavé abondamment à l'acétonitrile. Obtention de 138 g de produit sous forme d'une poudre blanche (rendement corrigé 81,3 %).
CCM : CH2Cl2/ MeOH / NH4OH à 25% (80/40/3)
Révélation UV et CuSO4
Rf : 0,3
Etape 2 : Ester benzylique de l'acide 5-(l,3-Dioxo-l,3-dihydro-isoindol- 2-yl)-2-(4,7, 10-tris-éthoxycarbonylméthyl- 1 ,4,7, 1 Otétraaza-cyclododéc- 1 -yl)-pentanoïque
A une solution de 59,1 g d'ethylbromoacétate (Aldrich®, 358 mmol) dans le CH3CN (1,1 1) sont additionnées 60 g du composé obtenu à l'étape 1 (102 mmol) et 50,1 g de Na2CO3 (464 mmol). Le milieu réactionnel est chauffé à 800C sous couverture d'argon pendant une nuit. Après élimination du précipité, le filtrat est concentré et lavé abondamment au CH3CN. Le produit est cristallisé dans CH3CN par ajout goutte à goutte d'Et2O. Obtention de 89,8 g de produit sous forme d'un solide blanc (rendement corrigé 100 %). CCM : CH2Cl2 / MeOH (9/1) Révélation UV et KMnO4 , Rf : 0,4
Etape 3 : Acide 5-Amino-2-(4,7,10-tris-carboxyméthyl- 1,4,7, 1 Otétraaza- cvclododéc-1-yl) -pentanoïque
Dans le réacteur de 5 litres, on chauffe au reflux une solution de 54 g de composé obtenu à l'étape 2 (64 mmol) dans l'acide chlorhydrique 37 % (1,8 1), pendant une nuit. Après refroidissement et filtration, le filtrat est concentré et purifié sur silice silanisée (élution à l'eau). Après évaporation sous pression réduite, le produit est lavé à l'éther. Obtention de 45 g de produit sous forme d'un solide blanc. Le produit est désalifié par passage sur résine OH". On isole 30 g de produit sous forme de cristaux blancs (rendement 100 %). HPLC : Hypercarb® 5μ, 200X4.6, 250À ; Solvant A : acide sulfurique 0,037 N Solvant B : CH3CN ; Détection UV à 201 nm ; Tr : 18 min.
Etape 4 : Complexe de gadolinium de l'acide 5-Amino-2-(4,7,10-tris- carboxyméthyl- 1 ,4,7, 1 Otétraaza-cvclododéc- 1 -yP) -pentanoïque
7,2 g du composé obtenu à l'étape 3 (16 mmol) sont dissous dans 70 mL d'eau et le pH est ajusté à 5,5 par ajout d'acide chlorhydrique 6 N. On ajoute 2,9 g de Gd2θ3 (8 mmol), et on chauffe à 800C le milieu réactionnel. Le pH de la solution augmente régulièrement, et doit être maintenu entre 5,2 et 5,7 par ajout goutte à goutte d'acide chlorhydrique 6 N. Après deux heures, le pH se stabilise à 5,7. Le léger trouble est filtré sur filtre Whatman® et le filtrat est concentré. Obtention de 11,1 g de produit sous forme de paillettes blanches (rendement corrigé 100 %).
HPLC : Hypercarb® 5μ, 200X4,6, 250À ; Solvant A : acide sulfurique 0,037 N
Solvant B : CH3CN ; Détection UV à 201 nm ; Tr : 10 min.
Etape 5 : Complexe de gadolinium de l'acide 5-(2-Ethoxy-3,4-dioxo- cyclobut- 1 -énylamino)-2-(4,7, 10-tris-carboxyméthyl- 1 ,4,7, 1 Otétraaza-cvclododéc- 1 -yl)- pentanoïque
8 g de composé obtenu à l'étape 4 sont séchés par distillation azéotropique au toluène, puis mis en suspension dans 90 ml de DMSO anhydre sous couverture d'argon. 2,8 ml de
Et3N séchée sur tamis (1,7 éq) et 5 g de diéthylsquarate (Aldrich®, 2,5 éq.) sont ensuite ajoutés. Le milieu est agité à température ambiante sous couverture d'argon pendant 1 heure. Le mélange est précipité dans 600 ml d'éther. Le solide obtenu est filtré, puis lavé au dichlorométhane. Après filtration et séchage, 7,5 g d'un solide blanc (rendement de
81,5 %)sont récupérés.
HPLC : Symmetry Cl 8, 5μ, 250X4,6, 100À
A : eau TFA, pH = 2,7 ; B : CH3CN ; Détection à 201 et 254 nm ; Tr : 19,8 min.
Exemple 4 : Couplages des peptides :
Couplage des peptides protégés :
Etape 1 : Couplage des peptide N° 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou sur le dérivé squarate Le composé obtenu à l'étape 5 de l'exemple 3 (100 mg, 1,35 10'4 mole) est dissous dans 15 ml de solution aqueuse de Na2CO3 pH 9,4. Le peptide protégé (1,6 10"4 mole) est introduit en maintenant le pH à 9,4 par ajout de Na2CO3. Si le peptide n'est pas soluble dans l'eau, quelques gouttes de DMF sont ajoutées jusqu'à dissolution complète. Après 48h de réaction à température ambiante, le milieu est précipité dans un mélange éthanol/éther éthylique. Le précipité est filtré puis séché.
Etape 2 : déprotection
Le composé obtenu à l'étape 1 ci-dessus est dissout dans un mélange de 10 cm de TFA/TIS/H2O dans les proportions 90/5/5. Le milieu est agité 5h à température ambiante puis le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu est repris dans l'éther éthylique et le précipité est filtré puis séché. Le produit est ensuite purifié par HPLC préparative sur une colonne Symmetry® avec un éluant constitué d'eau/TFA PH 3/
CH3CN .
Couplage d'un peptide protégé TFA peptide n°7 :
210 mg du composé obtenu à l'étape 5 de l'exemple 3 sont dissous dans 20 ml d'eau et le pH est ajusté à 9 avec une solution de Na2CO3. 350 mg de peptide protégé (peptide N°7) sont ajoutés et le pH est ajusté à 9,2. Le milieu est agité à température ambiante puis la solution est dialysée sur une membranes de seuil de coupure 1 kD pendant 48h puis chromatographiée sur colonne RP- 18 (mélange MeOH/eau (50/50)).
Exemple 5 : Couplages de chélates dérivés du DOTA et du PCTA DOTA carboxylate:
Couplage peptidique d'un DOTA carboxylate sur un peptide protégé en présence d'EDCI et déprotection dans le TFA.
SM : ES-, M/Z=1274 avec z=l
DOTA thio-urée :
Condensation en milieu basique sur un isothiocyanate selon l'exemple 2 et déprotection dans le TFA.
PCTA carboxylate :
Couplage peptidique et déprotection dans le TFA.
SM : ES+, MIZ= 1336 avec z=l PCTA thiourée : Condensation en milieu basique sur un isothiocyanate selon l'exemple 2 et déprotection dans le TFA.
PCTA squarate :
Selon l'exemple 4 étapes 1 et 2.
Exemple 6: Préparation de lipopeptides
Etape 1 : Hexadécanoate de pentafluorophényle
A une solution constituée de 3,85 g d'acide hexadécanoique et de 2,76 g de pentafluorophénol dans 20 ml de dioxane et 8ml de DMF, sont ajoutés à 00C, 3,1g de dicyclohexylcarbodiimide (DCC) dans 20 ml de dioxane. Le mélange est agité une nuit à température ambiante puis le milieu réactionnel est filtré et la solution obtenue est évaporée sous pression réduite. L'huile ainsi récupérée est reprise dans le cyclohexane pour donner un solide blanc (5 g). Température de fusion: 42-44°C. Etape 2 : Acylation des peptides
Les peptides sont synthétisés sur phase solide en utilisant 2,5 équivalents de chaque aminoacide protégé Fmoc à chaque cycle de couplage. L'activation des acides carboxyliques est réalisée avec HATU, N-méthylmorpholine dans le DMF. Les groupements Fmoc sont coupés par traitement à la pipéridine (20% dans le DMF). Après introduction du dernier aminoacide de la séquence peptidique et coupure du groupement protecteur Fmoc, l'aminé N-terminale du peptide est acylé par le composé préparé à l'étape 1 (2,5 équivalents) dissous dans CH2Cl2 en présence de HoBt et de N- méthylmorpholine. Le peptide est ensuite libéré de la résine et les groupements protecteurs des fonctions latérales sont coupés par action d'un mélange acide trifluoroacétique/thioanisole (95/5) durant 30 minutes à 00C puis 2h à température ambiante. La résine est éliminée et le solvant est évaporé sous pression réduite. Le lipopeptide est précipité dans l'éther éthylique. Les produits sont purifiés par HPLC préparative sur colonne Vydac ODS® en éluant avec un mélange Eau/acétonitrile/TFA.
EXEMPLES PARTIE II : mise en évidence de l'efficacité de PEPTIDES P
Exemple ILl : Peptide LIKKPF (SEQ ID No 11)
L'affinité du peptide LIKKPF (SEQ ID No 11) est mesurée sur PS immobilisée (plaque ELISA). Le peptide est incubé à des concentrations croissantes de 5.10 14 M à 4,2.107 M. L'annexin V-biotine est alors ajoutée à la concentration de 5.10 10 M qui correspond à sa valeur K<j pour la PS. L'incubation à 37°C se prolonge pendant 1,5 heure. L'annexine V liée est détectée par ajout d'une solution de streptavidine-HRP, puis d'une solution de substrat ABTS contenant 0,05% d'H2θ2. La DO405 est mesurée pour calcul de la valeur IC50 du peptide.
Exemple 11.2. Produit de contraste USPIO-LIKKPF
L'affinité de l'USPIO-LIKKPF est mesurée sur PS immobilisée (120 μg/mL). Après saturation des sites non spécifiques, l'USPIO-LIKKPF est incubé à des concentrations croissantes (122 nM - 4 mM en fer) pendant 2 heures à 37°C. Après lavage des puits, les molécules liées à la PS sont digérées dans un volume de HCl 5 N. Les échantillons sont digérés dans un volume de HCl 5N, 48h à 37°C, et le dosage de fer est fait par Bleu de Prusse (D063o).
L'IRM vitro est réalisée sur des cellules apoptotiques (ou contrôles) pré- incubées avec l'USPIO-LIKKPF ou l'USPIO non fonctionnalisé (3 ou 4 mM en fer) pendant 2 heures à 37°C. L'apoptose des cellules Jurkat est induite par traitement à la camptothécine 2 μM pendant 24 heures. Après incubation avec les USPIO, les cellules marquées sont transférées dans une solution de gélatine 0,2% pour l'analyse par IRM (Broker AVANCE-200, 4,7 T, TR/TE = 3000/20 ms, 30 échos, matrice = 256 x 256, FOV = 4 cm, épaisseur de la coupe = 1 mm) dans des puits de plaque ELISA.
Exemple 113 : Produit de contraste Gd-DTPA-LIKKPF Les peptides LIKKPF (SEQ ID No 11) et FKIPKL (peptide « scramble » - séquence mélangée) sont greffés séparément sur un chélate de Gd-DTPA. Les peptides protégés par du TFA sur deux Lys sont attachés au linker 8-amino-3,6-dioxooctanoyl. Le peptide protégé est couplé au DTPA-isothiocyanate (NCS-Bz-DTPA), puis les Lys sont déprotégées dans un milieu basique. Des cellules Jurkat apoptotiques en suspension (2.106 cellules/mL) sont incubées en présence du produit Gd-DTPA-LIKKPF aux concentrations 400, 200 et 100 μM en Gd. Les cellules sont incubées 2 heures à température ambiante. Après rinçage et centrifugation, le culot cellulaire est minéralisé dans des conditions acides et les quantités de Gd sont mesurées par ICP-MS (inductively coupled plasma - mass spectrometry). L'efficacité de ciblage du produit Gd-DTPA-LIKKPF par IRM a été aussi évaluée sur un modèle de foie apoptotique chez la souris. L'apoptose est induite par une injection i.v. (veine caudale) d'anticorps monoclonal anti-Fas chez la souris Balb/c anesthésiée (Blankenberg et al., 1998, 1999 ; Rodriguez et al., 1996).
Avant l'acquisition IRM, les souris sont anesthésiées au pentobarbital. Les expériences sont réalisées à l'aide d'un spectromètre Broker de 200 MHz (4,7 T) équipé d'un aimant vertical et d'un système de mini- imagerie. Les images sont acquises à l'aide d'une séquence MSME (multi-slice-multi-echo) avec les paramètres suivants : TR/TE = 307,4 / 14,7 ms, matrice = 256, FOV = 5 cm, épaisseur de la coupe = 3 mm, 8 coupes axiales (qui couvrent complètement la région abdominale incluant les reins), TA = 5 minutes 14 secondes. Les images sont acquises avant et après l'injection des produits de contraste, jusqu'à 1,5 heure. L'intensité de signal (SI) est mesurée dans le foie. La valeur SI est aussi mesurée dans un tube rempli avec une solution aqueuse 2% de gélatine enrichie avec 50 μM Gd-DTPA, utilisé comme produit de référence, dans une région en dehors de l'image de la souris qui correspond au brait de fond. Le protocole d'IRM est le suivant : (1) l'IRM pré-contraste commence Ihl5 après l'injection d'anti-Fas ; (2) le produit de contraste est injecté dans la veine fémorale à la dose 60 μmol Gd/kg environ Ih45 après l'injection d'anti-Fas ; (3) plusieurs acquisitions post-contraste sont réalisées pendant lh30. Un protocole de compétition est réalisé par injection de 100 μmol peptide/kg 10 minutes avant l'injection du produit de contraste Gd-DTPA-LIKKPF.
L'efficacité de ciblage du produit Gd-DTPA-LIKKPF a été aussi évaluée sur un autre modèle d'apoptose : la souris apoE Λ, modèle d'athérosclérose. Des souris femelles C57B1 ApoE7" âgées environ de 15 mois sont soumises à un régime riche en cholestérol pendant 3 mois avant les études IRM. Pour l'acquisition par IRM les animaux sont anesthésiés au pentobarbital. L'agent de contraste Gd-DTPA-LIKKPF est injecté par voie i.v. à la dose de 100 μmol Gd/kg. Toutes les images sont acquises au niveau de l'aorte abdominale, en particulier la région proche du rein qui est connue pour le développement de plaques d'athérome en raison de la présence des branches artérielles. Les paramètres de la séquence RARE (Rapid Acquisition with Relaxation Enhancement) sont ajustés en utilisant un tube référence rempli d'une solution 1 mM de Gd-DTPA. Les paramètres d'acquisition d'images sont les suivants : TR = 470,9 - 1048,5 ms, TE = 4 ms, facteur RARE = 1 - 4, NEX = 4, matrice = 256 x 256, FOV = 2,3 cm, largeur spectrale = 33,33 kHz, épaisseur de la coupe = 0,8 mm, résolution spatiale = 90 μm.
Pour les deux modèles, les valeurs SI sont mesurées dans différentes régions d'intérêt (au niveau de la paroi artérielle de l'aorte abdominale ou foie entier) à l'aide du logiciel d'analyse d'image OSIRIS. Les régions sont d'abord dessinées sur les images postcontraste, puis dupliquées sur les images pré-contraste. La valeur SI est mesurée sur toutes les coupes d'images où la paroi artérielle et le foie sont visibles. Finalement, les valeurs SI obtenues pour des coupes sériées d'aorte sur une longueur de 3,2 - 8 mm sont moyennées pour chaque animal. Le ΔSNR% est calculé selon l'équation suivante : ΔSNR% = [(SIpost / SEW) - (SIpre / SDbruit)]/[SIpre / SEWd X 100 où SDbruit est la déviation standard du bruit mesuré sur une région en dehors de l'animal.
II.4 Résultats : affinité des PEPTIDES P
Le demandeur a identifié plusieurs séquences consensus :
VLGERG (SEQ ID No 5) et LIKKPF (SEQ ID No 11) D-A-H-S-X7-S (SEQ ID No 2), où X7 peut être F ou L
P-G-D-L-X8-X9 (SEQ ID No 3), où avantageusement X8 est choisi parmi S ou V et X9 est choisi parmi T ou R
H-G-XlO-L-S-XI l (SEQ ID No 4) et ses équivalents fonctionnels, où avantageusement XlO est choisi parmi D ou H, et Xl 1 est choisi parmi T ou I L'affinité (en ordre de grandeur) de ces peptides pour la PS (constante de dissociation apparente K*d) est comprise entre 10 6 etl O 9 M. Le peptide LIKKPF (SEQ ID No 11) à forte spécificité a été particulièrement bien caractérisé. La spécificité d'interaction du peptide avec la PS est confirmée à l'aide du test de compétition à l'annexine V. La valeur IC5O de l'annexine V est égale à 1,08.10"9 M (figure 1).
Exemple 11.5 Peptide LIKKPF (SEQ ID No 11) Le test vitro sur PS immobilisée permet de calculer une valeur IC5O (figure 2).
Exemple II.6. Produit de contraste USPIO-PEG-PEPTIDE P avec PEPTIDE P étant LIKKPF (SEQ ID No 11) (également désigné USPIO-LIKKPF)
Le test d'interaction de l'USPIO-LIKKPF avec la PS immobilisée permet de mesurer une valeur K*d de 7,85.10 8 M. La spécificité d'interaction de l'USPIO-LIKKPF avec la PS est vérifiée avec un test de compétition à l'annexine V. La valeur IC5O est égale à 4,2.107 M. (figure 3)
L'IRM sur cellules montre que l'USPIO-LIKKPF se lie spécifiquement aux cellules apoptotiques. En effet, l'intensité de signal IRM enregistrée avec ces cellules est plus faible que celle obtenues avec les cellules contrôles. De plus, la baisse de signal IRM induite par l'incubation avec l'USPIO-LIKKPF est plus importante que celle enregistrée avec l'USPIO non fonctionnalisé (USPIO-PEG non couplé au peptide LIKKPF (SEQ ID NO 11) ) - cf. Figure 4 (cellules apoptotiques ; la colonne gauche correspond à la concentration 3 mM, la colonne droite correspond à la concentration du Fe de 4 mM. L'ensemble de ces résultats démontre le ciblage spécifique de l'USPIO-LIKKPF pour des cellules apoptotiques.
Exemple II.7 : produit de contraste Gd-DTPA-LIKKPF
Le greffage du peptide LIKKPF (SEQ ID NO 11) sur le produit de contraste Gd-DTPA permet la conservation du ciblage des cellules apoptotiques. En effet, le dosage de ICP- MS de cellules apoptotiques incubées avec le Gd-DTPA-LIKKPF prouve que leur interaction, concentration-dépendante, est supérieure à la capture du produit par les cellules contrôles (Figure 5). Après injection i.v. de 60 μmol Gd/kg de produit, le suivi dynamique du signal IRM du foie apoptotique de souris (figure 6) montre un rehaussement avec le Gd-DTPA-LIKKPF supérieur à celui mesuré avec le Gd-DTPA-FKIPKL (scramble) ou le Gd-DTPA non fonctionnalisé. La pré- injection du peptide LIKKPF (SEQ ID NO 11) , à la dose 100 μmol/kg, bloque le rehaussement causé par le Gd-DTPA-LIKKPF ce qui témoigne de la spécificité d'interaction entre le Gd-DTPA-LIKKPF et la PS. Par ailleurs, les trois produits (Gd-DTPA-LIKKPF, Gd-DTPA-FKIPKL et Gd-DTPA) n'ont permis de n'enregistrer qu'un rehaussement partiel de signal chez la souris saine. L'ensemble de ces données prouve que le produit de contraste Gd-DTPA-LIKKPF cible spécifiquement l'apoptose in vivo via la PS.
Exemple IL 8 : Imagerie de tissu vasculaire apoptotique
Dans un modèle d'athérosclérose chez la souris (souris apoE" ), l'injection i.v. de produit
Gd-DTPA-LIKKPF, à la dose 100 μmol Gd/kg, permet de détecter de manière dynamique un rehaussement de signal supérieur à celui mesuré avec le produit non greffé (Gd-DTPA) au niveau de l'aorte abdominale (figures 7 et 8 - Séquence RARE, 27 minutes après injection de produit de contraste - IRM de coupes sériées de l'aorte abdominale sur une longueur de 3,2 mm). Ce résultat indique que le produit Gd-DTP A- LIKKPF est capable de cibler spécifiquement la plaque d'athérome, via l'interaction avec Ia PS.
Exemple II.9 : imagerie de tissus nerveux apoptotique dans un modèle de maladie de Parkinson, avec injection de produit USPIO- LIKKPF
(produit de l'exemple 1)
Des études IRM ont été réalisées sur des souris C57BI/6 traitées au MPTP (ou son métabolite le MPP+ pour les cultures cellulaires), neurotoxine induisant un syndrome parkinsonien"
En culture cellulaire la mort des neurones dopaminergiques par apoptose a été vérifiée à partir de cerveaux de rats par immunohistochimie et détection de l'activité enzymatique de la caspase 3. Pour la détection IRM en culture cellulaire, les cellules saines et traitées au MPP+ ont été mise en contact avec des USPIO-LIKKPF. Les cellules malades montrent un signal plus sombre que les autres, démontrant le ciblage du peptide sur les cellules apoptotiques. La vitesse de relaxation normalisée et la concentration en fer montrent que les cellules malades ont capté une plus grande quantité d'agent de contraste vectorisé.
L'immunohistochimie et l'IRM sont très révélatrices. Les souris malades et saines ont été étudiées au 4è, 5è, 6è jour de traitement, et une et trois semaines après la fin du traitement au MPTP. L'imagerie montre une évolution du signal au cours du traitement, le ciblage étant plus marqué au 5è jour puis diminuant après. Les coupes réalisées avec ces USPIO non vectorisés (sans peptide) ne montrent pas de ciblage marqué. La localisation IRM des zones malades correspond aux zones contenant des neurones dopaminergiques (immunohistochimie : détection des neurones dopaminergiques par mesure de la tyrosine hydroxylase au niveau des noyaux gris centraux)

Claims

REVENDICATIONS
1. Composé de formule générale (I) suivante : Signal - Lien - Peptide (I) dans laquelle
Signal représente une entité signal choisie parmi :
- un chélate couplé ou non à un métal paramagnétique M ou à un radionucléide,
- une nanoparticule superparamagnétique revêtue d'une couche organique, de préférence ayant un noyau en oxyde de fer et - un marqueur pour imagerie optique ;
Lien, présent ou non, représente une liaison chimique et
Peptide représente un peptide comprenant un peptide ciblant l'apoptose, le peptide ciblant l'apoptose étant choisi parmi les peptides de formule suivante:
- X1-X2-X3-X4-X5-X6 (1) (SEQ ID No 1) dans laquelle Xl et X2 représentent indépendamment l'un de l'autre la leucine ou l'isoleucine, X3 et X4 représentent la lysine, X5 représente la proline et X6 représente la phénylalanine, avantageusement le peptide L-I-K-K-P-F (SEQ ID No
H) ;
- D-A-H-S-X7-S (2) (SEQ ID No 2) dans laquelle X7 représente la phénylalanine ou la leucine ;
- P-G-D-L-X8-X9 (3) (SEQ ID No 3) dans laquelle X8 représente la serine ou la valine et X9 représente la thréonine ou l'arginine ;
- H-G-Xl 0-L-S-X11 (4) (SEQ ID No 4) dans laquelle XlO représente l'acide aspartique ou l'histidine, et XI l représente la thréonine ou l'isoleucine ;
- V-L-G-E-R-G (5) (SEQ ID No 5); et les sels pharmaceutiquement acceptables de ces composés, à l'exception des composés de formules suivantes :
2. Composé selon la revendication 1 dans laquelle Peptide est un peptide de formule
LIKKPF (SEQ ID No 11) .
3. Composé selon la revendication 1 ou 2 dans laquelle Signal est un chélate couplé à un métal paramagnétique M, M étant choisi parmi Gd, Mn, Fe, Dy et Tm .
4. Composé selon la revendication 1 ou 2 dans laquelle Signal est un chélate couplé au radionucléide Ga68 pour l'imagerie PET.
5. Composé selon les revendications 1 à 4 dans laquelle Signal est un chélate couplé ou non à un métal paramagnétique M ou à un radionucléide, le chélate étant choisi parmi : DOTA, DTPA, DO3A, HPDO3A, TRITA, TETA, BOPTA, NOTA, PCTA, DOTMA, AAZTA, HOPO et leurs dérivés.
6. Composé selon la revendication 1 à 5 dans laquelle Lien représente : a) un groupe de formule : Q1-1-Q2, dans laquelle Ql et Q2 identiques ou différents représentent O, S, NH, CO2, -
NHCO, CONH, NHCONH, NHCSNH, SO2NH- ou NHSO2-, et 1 représente un groupe alkyle, alcoxyalkyle, polyalkoxyalkylène, alcényle, alcynyle, alkyle interrompu par un ou plusieurs squarate, par un ou plusieurs aryles, avantageusement phényle, ou par un ou plusieurs groupes choisis parmi -NH-, -O-, -CO-, -NH(CO)-, -(CO)NH-, -0(CO)-, ou -(OC)O- ;, b) un groupe (CH2)n, (CH2)n-CO-, -(CH2)JSTH-CO- avec n = 2 à 10 , (CH2CH2O)q(CH2)r-CO- , (CH2CH2O)q(CH2)r-NH-CO- avec q = 1-10 et r=2-10,
(CH2)n-C0NH - , (CH2)n-CONH-PEG, (CH2)n-NH-, , avec n=l à 5 et avantageusement n=4 ou 5, HOOC-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-COOH ; HOOC-(CH2)2-CO2-(CH2)2-
OCO-(CH2)2-COOH ; HOOC-CH(OH)-CH(OH)-COOH; HOOC-(CH2)n-COOH; NH2-(CH2)n-NH2, avec n=l-20; NH2-(CH2)n-CO2H ; ou NH2-CH2-(CH2-O-CH2)n- CO2H avec n=l à 10.
7. Composé selon la revendication 1 ou 2 dans laquelle Signal représente une nanoparticule superparamagnétique revêtue d'une couche organique gew-bisphosphonate.
8. Composition pour imagerie médicale comprenant au moins un composé de formule générale (I) selon l'une des revendications 1 à 7 et un excipient pharmaceutiquement acceptable, avantageusement destinée à l'administration par voie parentérale.
9. Procédé de préparation de la composition selon la revendication 8 comprenant l'addition d'un composé de formule générale (I) selon l'une des revendications 1 à 7 à un milieu injectable comprenant l'excipient pharmaceutiquement acceptable .
10. Composé de formule générale (I) selon les revendications 1 à 7 pour son utilisation en tant qu'agent de diagnostique de maladies associées à l'apoptose.
11. Utilisation d'un composé (I) selon l'une des revendications 1 à 7 pour la préparation d'une composition de diagnostique de maladies associées à l'apoptose, avantageusement choisies parmi les maladies neurodégénératives chroniques, les maladies ischémiques et les pathologies inflammatoires.
12. Utilisation d'un peptide ciblant l'apoptose de formule définie dans la revendication 1, pour la préparation d'une composition de diagnostique de maladies associées à l'apoptose.
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