EP2195612A2 - Fluoreszenzlichtmikroskopisches messen einer probe mit rotverschobenen stokes-linien - Google Patents

Fluoreszenzlichtmikroskopisches messen einer probe mit rotverschobenen stokes-linien

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Publication number
EP2195612A2
EP2195612A2 EP08837241A EP08837241A EP2195612A2 EP 2195612 A2 EP2195612 A2 EP 2195612A2 EP 08837241 A EP08837241 A EP 08837241A EP 08837241 A EP08837241 A EP 08837241A EP 2195612 A2 EP2195612 A2 EP 2195612A2
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
light
wavelength
optical fiber
pulses
fluorescence
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08837241A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Stefan W. Hell
Brian Rankin
Robert Kellner
Jaydev Jethwa
Thorsten Staudt
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Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
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Filing date
Publication date
Application filed by Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV filed Critical Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Publication of EP2195612A2 publication Critical patent/EP2195612A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
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    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
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    • G01N2021/653—Coherent methods [CARS]
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    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01S—DEVICES USING THE PROCESS OF LIGHT AMPLIFICATION BY STIMULATED EMISSION OF RADIATION [LASER] TO AMPLIFY OR GENERATE LIGHT; DEVICES USING STIMULATED EMISSION OF ELECTROMAGNETIC RADIATION IN WAVE RANGES OTHER THAN OPTICAL
    • H01S3/00—Lasers, i.e. devices using stimulated emission of electromagnetic radiation in the infrared, visible or ultraviolet wave range
    • H01S3/30—Lasers, i.e. devices using stimulated emission of electromagnetic radiation in the infrared, visible or ultraviolet wave range using scattering effects, e.g. stimulated Brillouin or Raman effects
    • H01S3/302—Lasers, i.e. devices using stimulated emission of electromagnetic radiation in the infrared, visible or ultraviolet wave range using scattering effects, e.g. stimulated Brillouin or Raman effects in an optical fibre

Definitions

  • the invention relates to a method for fluorescence light microscopic measurement of a sample having the features of the preamble of independent claim 1 and to a fluorescence light microscope having the features of the preamble of independent claim 16.
  • fluorescence light microscopy In fluorescence light microscopy, light of different wavelengths is required in order to excite different fluorescent dyes for fluorescence in order to deliberately deplete different fluorescent dyes (for example in STED fluorescence microscopy) in order to convert different fluorescent dyes into a dark state in a targeted manner (for example in US Pat GSD fluorescence light microscopy) or on the one hand to excite the same dye in overlapping, but different spatial areas on the one hand to fluorescence and on the other hand by stimulated emission again to de-excite or in a dark state.
  • STED fluorescence microscopy in order to deliberately deplete different fluorescent dyes
  • a targeted manner for example in US Pat GSD fluorescence light microscopy
  • several different monochromatic light sources can be used to provide the light of different wavelengths.
  • the monochromatic light sources suitable for this purpose are generally high-quality lasers since the light is required in high-intensity pulses, correspondingly constructed fluorescent light microscopes are very costly. For some wavelengths, it is fundamentally difficult to find suitable lasers of sufficient quality. It is known from DE 10 2005 020 003 A1, inter alia, to use a gas laser as light source in fluorescence light microscopy, which has a plurality of usable emission lines or at least can be tuned to a plurality of emission lines. However, gas lasers are expensive to buy and expensive to operate. In addition, the emission lines that can be used with a gas laser at best cover a small spectral range so far that all absorption lines of possible fluorescent dyes having a good cross-section that fall within this spectral range can be addressed.
  • a fluorescent light microscope is known in which light of a certain wavelength is provided for transferring a fluorescent dye in a sample from one state to another state by light of a different wavelength from a laser, in particular a mode-locked titanium sapphire Laser, which emits at 800 nm wavelength, is coupled into an optical element that distributes the intensity of the coupled light of a wavelength to a continuous spectrum having smaller and larger wavelengths than the coupled light and which is referred to as supercontinuum.
  • the optical element may, for example, be an optical fiber fiber tapering over a length of 30 mm to 90 mm in cross-section (a so-called “tapered fiber”), which has a total length of 1 m, or a microstructured optical fiber with photonic band gap (US Pat. "photonic band gap”), which is also called photonic crystal fiber ("photonic crystal fiber”).
  • a photonic crystal fiber the photonic band gap is created by a honeycomb-like microstructure around a very small fiber core of only about 2 microns in diameter.
  • the typical length of a photonic crystal fiber (PCF) is 38 cm.
  • a spectral distribution in the form of a supercontinuum makes it possible to select light of any wavelength for transferring a fluorescent dye from one state to another from the supercontinuum.
  • the available light power at each wavelength of the supercontinuum is extremely reduced compared to the output power of the exciting laser.
  • a considerable effort is required to provide a supercontinuum with an at least approximately homogeneous intensity distribution and in particular a temporally stable intensity distribution.
  • the development of corresponding fluorescent light microscopes from the patent application of the idea to commercial products took more than five years.
  • the corresponding fluorescent light microscopes are expensive, which is, inter alia, the titanium sapphire laser with the necessary output power and the PCF used in the commercial product.
  • DE 103 47 712 A1 discloses a light source for fluorescence microscopy, including STED microscopy, in which the wavelength can be influenced by means of a photonic fiber or an optical parametric oscillator (OPO).
  • OPO optical parametric oscillator
  • the desired wavelength is generated by a non-linear-optical 3-wave frequency conversion process in which the irradiated frequency of the pump wave is split into two frequencies (signal and idler).
  • a Raman amplifier arrangement based on a standard single-mode fiber is known in which Stokes waves are generated by means of stimulated Raman scattering of a high-power optical pump signal in order to amplify an incoming optical signal.
  • EP 1 662 296 A1 describes a device with which incident light is spectrally split based on dispersion and polarization effects. This device is also proposed as a light source for use in STED microscopy, wherein light is separated from an incident laser beam of such a wavelength that corresponds exactly to the wavelength of the fluorescent light of interest from a sample, so that this light for stimulation by stimulated emission particularly suitable while the remaining light of the laser beam is used as the excitation light.
  • WO 03/016781 A2 a device for generating light in a desired wavelength range is known, with which the excitation of a sample in an even smaller range than in STED microscopy should be possible.
  • the light emission of the device is based on photoinduced excitation of surface plasmons of a metal layer.
  • the invention is based on the object, a method for fluorescence light microscopic measurement of a sample having the features of the preamble of the independent claim
  • Claim 16 show, in which without great and costly effort and without - A -
  • Stability problems light of different wavelengths is available to convert different fluorescent dyes from one state to another state.
  • the object is achieved by a method for fluorescence light microscopic measurement of a sample having the features of independent claim 1 and by a fluorescent light microscope having the features of independent claim 16.
  • the dependent claims 2 to 15 relate to preferred embodiments of the new method, while the dependent claims 17 to 30 are directed to preferred embodiments of the new fluorescent light microscope.
  • the optical fiber is selected and the light is coupled into the optical fiber with such intensity that stimulates Raman scattering in the optical fiber to such an extent that the light spectrum adjacent to a line of the coupled wavelength is at least has a redshifted Stokes line whose intensity half-width is less than half its distance to the line of the light spectrum adjacent to it in the blue; and the particular wavelength for transferring the fluorescent dye is selected from one of the red-shifted Stokes lines.
  • the new method utilizes the effect of stimulated Raman scattering in an optical fiber which, with intensity of the coupled light tuned to the length of the optical fiber, results in the formation of red-shifted Stokes lines adjacent to the line of injected light. At least in the new method, such a Stokes line is generated, wherein the number of Stokes lines increases with increasing intensity of the coupled-in light and increasing length of the optical fiber.
  • the Stokes lines with the largest wavelengths, that is, the most red-shifted Stokes lines are less sharply formed. However, even the most red-shifted Stokes line has such a low half-width that over a small wavelength range of a few nanometers it comprises a high percentage of the intensity of the coupled-in light.
  • the most red-shifted Stokes line between this and the line of the Coupled light lying further Stokes lines are sharper. Each of them meets the criterion given above in terms of their full width at half maximum and, over a band of a few nanometers, provides a few percent of the intensity of the injected light.
  • the distance of the red-shifted Stokes lines from each other or to the line of the coupled-in light is 10-20 nm, typically 12-15 nm, when the wavelength of the coupled-in light is about 500 nm. The exact value depends on the material and structure of the optical fiber and the wavelength of the injected light.
  • the Stokes lines are so close together that any fluorescent dye whose relevant absorption line falls between the wavelength of the injected light and the wavelength of the most red-shifted Stokes line can be served with one or even more of the Stokes lines.
  • a large portion of the intensity of the coupled-in light is stably available over a small wavelength range within the half-width of the Stokes lines, that is, well discriminable, the position of the Stokes lines and their relative intensity component on the light spectrum being stable without special measures would have to be taken.
  • Advantages of the new method are not present until there are several Stokes lines in the light spectrum emerging from the optical fiber. Already a single Stokes line next to the line of the coupled light doubles the possibilities of using light from the emerging light spectrum.
  • red-shifted Stokes lines can be generated at regular intervals by means of stimulated Raman scattering in a single mode fiber.
  • Agrawal, Ch. 8: Stimulated Raman Scattering (Agrawal, Govind P., Nonlinear Fiber Optics, 2nd ed., San Diego, CaNf., 1995).
  • Stimulated Raman Scattering (Agrawal, Govind P., Nonlinear Fiber Optics, 2nd ed., San Diego, CaNf., 1995).
  • fluorescent light microscopes have been developed at great expense, in which a light spectrum is generated with a supercontinuum.
  • the new method has significant advantages in providing a much higher light intensity at the wavelengths of each Stokes line.
  • the supposed absence of light with wavelengths between the individual Stokes lines or between the first Stokes line and the line of the coupled-in light is of no greater importance because the lines are sufficiently close to one another. Added to this are the stability of the position of the Stokes lines and their relative intensity. Retrospective, it is therefore It is surprising why, in practical development, the well-known effect of stimulated Raman scattering as the basis for a light source with several wavelengths in fluorescence light microscopy has been completely ignored.
  • the optical fiber does not have to be a complex microstructured or locally strongly tapered fiber in the new method. Rather, it is preferably a conventional single mode fiber with at least approximately constant diameter or at least no pronounced local taper and no microstructure around a fiber core of minimum diameter.
  • the single mode fiber used in the new method is comparatively long. This is especially true when several or even many red-shifted Stokes lines are to be generated in order to provide light over a wider spectral range for the transfer of fluorescent dyes from one state to another state.
  • the single-mode fiber may have a cut-off wavelength that is not far on the blue side, e.g. B. less than 70 nm, away from the wavelength of the injected light.
  • the minimum length of a conventional single-mode fiber in the new process is 9 m. In order to obtain several redshifted Stokes lines, however, a minimum length of 19 m is preferred. In order for the number of usable redshifted Stokes lines to be on the order of 10, a single mode fiber length of about 30 meters or more is useful. With 10 red-shifted Stokes lines, a wavelength range of about 150 nm is covered by the entire light spectrum at the output of the single-mode fiber, which has the wavelength of the coupled-in light as a further line.
  • the optical fiber in the new process is a microstructured fiber, its length should be kept as short as possible, since such optical fibers have a very high length-dependent attenuation unlike conventional single-mode fiber.
  • the optical fiber is still a microstructured fiber in the new process, it is preferred to use a gas-filled hollow core in which the choice of gas or its composition in the hollow core allows the redshift, ie the Stokes line, to be influenced.
  • a gas-filled hollow core in which the choice of gas or its composition in the hollow core allows the redshift, ie the Stokes line, to be influenced.
  • it can be used to produce only one Stokes line, for which a comparatively short length is sufficient.
  • the two-line light spectrum emerging from the microstructured fiber can then be coupled into a conventional single-mode fiber to form additional red-shifted Stokes lines to each of these lines.
  • the intensity of the light of the other wavelength coupled into the optical fiber should be at least 50 watts peak power, which may be sufficient for the formation of a Stokes line. To generate several or even many Stokes lines, the intensity should reach 500 watts and preferably at least 1000 watts peak power.
  • the peak power value required to produce a given number of Stokes lines for a given optical fiber also depends on the diameter of the optical fiber. This determines, together with the peak power, the intensity of the coupled-in light in the optical fiber.
  • pulses of 0.5-5 ns duration are coupled into the optical fiber.
  • the duration of the pulses of the coupled-in light in the new method corresponds approximately to the duration of the pulses of the light emerging from the single-mode fiber.
  • Pulses of 0.5-5 ns duration, especially pulses of 1-3 ns duration are of particular interest for the transfer of fluorescence dyes between two states in fluorescence light microscopy, if such transfers are to be driven to saturation, which is the case on several occasions.
  • the light spectrum in the novel process may be at least 5, preferably at least 7, and most preferably at least 10 redshifted Stokes lines. Even with even more red-shifted Stokes lines, each of these Stokes lines has an intensity component of several percent of the intensity of the coupled-in light.
  • the Stokes lines are red-shifted. That is, they have a longer wavelength than the light coupled into the optical fiber. In other words, the other wavelength of the injected light should be at the blue end of the visible spectrum.
  • the other wavelength of the injected light should be at the blue end of the visible spectrum.
  • Such frequency-doubled lasers can be constructed as low-cost solid-state lasers due to the laser fundamental frequency in the range of 1 ⁇ m.
  • the light of the other wavelength can be provided in particular with a so-called microchip laser.
  • This is a low-cost available solid-state laser type, which may be, for example, a frequency-doubled Nd: YAG laser.
  • a frequency doubled Nd: YAG laser typically has an emission wavelength of 532 nm
  • microchip lasers that emit at other wavelengths in a range of 450-600 nm, especially in a range between 500 and 550 nm. This can be used to influence the position of the individual redshifted Stokes lines.
  • Microchip lasers are particularly well suited for emission of pulses of about 1-3 ns duration. This represents an optimum duration of the pulses for use in high-resolution fluorescence light microscopy.
  • the pulse repetition rate in a conventional microchip laser can be slightly lower at 1-100 KHz than is desirable for fluorescence light microscopy, where a pulse repetition rate in the megahertz range is preferred. However, a pulse repetition rate of 1 MHz can also be achieved with microchip lasers of sufficient peak power.
  • Another possibility is to divide the emerging from the optical fiber light pulses of one, for the transfer of the respective fluorescent dye from its one in its other state required wavelength and merge staggered again. The person skilled in the art, the necessary techniques for this are known. This includes spectrally fanning out a single Stokes line and part of the spectral ones Delaying components prior to recombining the spectral components by half the time interval of the pulses.
  • Another way to increase the pulse repetition rate of the light of interest at one wavelength, which has one wavelength of tolerance, is to couple different non-simultaneous light pulses of different wavelengths into the same or other optical fiber and Stokes lines from the different light pulses as light pulses of one wavelength for transferring the fluorescent dye from one state to the other state. If the two different wavelengths, with which the non-simultaneous light pulses are coupled into the optical fiber, the distance of the Stokes lines, even light pulses of exactly one wavelength can be generated in this way with increased repetition rate of the pulses. However, if the Stokes lines are produced in different single-mode fibers, they must at least slightly differ in wavelength in order to be aligned with the same polarization on a matching optical axis can.
  • an excitation light source in particular a laser diode, which provides excitation light for the respective fluorescent dye in synchronism with the non-pulses of the one wavelength with which the fluorescent dye is locally de-excitation-triggered, this can occur when coupling not coincident light pulses of different wavelengths
  • the same or other optical fiber (s) take place without these non-simultaneous light pulses must be synchronized with each other, because a laser diode can be clocked easily in the high megahertz range.
  • the two light sources for the non-simultaneous light pulses of different wavelengths can therefore travel freely relative to each other.
  • the invention can also be used in conventional fluorescence light microscopy, but also in other techniques of fluorescence light microscopy with an increase in spatial resolution by switching of fluorescent dyes between different states, such as, for example, GSD fluorescence light microscopy and RESOLFT fluorescent light microscopy.
  • a particularly interesting field of application of the new method is the so-called Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), in which fluorescence lifetime images of the sample in the time or frequency domain are generated from the fluorescent light from the sample.
  • FLIM Fluorescence Lifetime Imaging
  • the new method easily provides excitation light of various, sufficiently finely graded wavelengths to operate Fluorescence Lifetime Imaging on a variety of colors.
  • the optical fiber is selected and the laser couples light into the optical fiber at such an intensity that Raman scattering is stimulated in the optical fiber to such an extent that the light spectrum has at least one red-shifted Stokes line in addition to the coupled wavelength whose intensity half-width is less than half its distance from the line of the light spectrum adjacent to it in the blue; and the wavelength-selective means, but the light of the particular wavelength for transferring the fluorescent dye from one of the red-shifted Stokes lines.
  • a frequency increaser combining different light pulses to increase the pulse repetition rate of light of the one wavelength of interest may have a dispersive optical element for this combination.
  • suitable dispersive optical elements include prisms and prism arrays.
  • acousto-optic filters which are used in the reverse direction in order to bring together light pulses of only slightly different wavelengths on one optical axis are particularly preferred.
  • Fig. 1 schematically shows the structure of a first embodiment of a fluorescent light microscope according to the present invention.
  • Fig. 2 shows a spectrum of light available in the fluorescent light microscope of Fig. 1.
  • FIG. 3 shows a schematic representation of another embodiment of a fluorescence light microscope according to the invention.
  • FIG. 4 shows the parts of a fluorescence light microscope according to the invention which are essential for a variant of the fluorescence light microscope according to FIG. 3.
  • the fluorescence light microscope 1 outlined in FIG. 1 is used for fluorescence light microscopic measurement of a sample 2 in which a structure of interest is labeled with a fluorescent dye.
  • the fluorescent dye is excited with excitation light 3 by a laser diode 4 in the focal region of an objective 5 to fluorescence.
  • Fluorescence light 6 emitted therefrom by the fluorescent dye from the focus region is detected in a spatially resolving manner by a detector 7, that is to say in association with a specific location of the sample 2.
  • the fluorescent dye in the sample 2 is deoxidized.
  • the wavelength of the depletion light 8 is greater than the wavelength of light 10 of a laser 15 formed as a microchip laser 11, which is coupled into an optical fiber 13 in the form of spaced-apart pulses.
  • the microchip laser 11 is a frequency doubled laser 15, which emits in the blue region of the visible spectrum.
  • One of the Stokes lines is selected with a wavelength-selective element 14 and forms the de-excitation light 8.
  • FIG. 2 outlines the light spectrum 17 emerging from the single-mode fiber 12 in the fluorescence light microscope 1.
  • this light spectrum 17 was produced by irradiating pulses of a wavelength of 532 nm (frequency-doubled Nd: YAG) and a pulse duration of 1.5 ns and a pulse repetition rate of 7 kHz at 2OmW average power and 1.9 kW peak power in a standard single-mode optical fiber ( Schaefter and Kirchhoff, cut-off wavelength approx. 470 nm, mode field diameter (core diameter) approx. 5 ⁇ m, numerical aperture 0.1 1, polarization-preserving panda fiber) of 30 m length.
  • the light spectrum 17 has a first line 18 of the light 10 coupled into the single-mode fiber 12 at the wavelength 532 nm, at which the microchip laser 1 1 emitted. This is followed by a plurality of red-shifted Stokes lines 19 to 28, each comprising a few percent of the total intensity of the light spectrum 17. Although the most red-shifted Stokes lines 26 to 28 have an increasing half-width. However, they also cover several percent of the total intensity of the light spectrum 17 over a range of a few nanometers.
  • the distance 29 between the red-shifted Stokes lines 19 to 28 and the first red-shifted Stokes lines 19 in relation to the line 18 is about 12-15 nm in each case. That is, in the fluorescent light microscope of FIG. 1, the de-excitation light 8 can be detected in steps of 12-15 nm over the entire region of the spectrum 17 be adjusted in terms of its wavelength. In this case, because each of the Stokes lines has a half-width 30, which is smaller than half the distance 29, with the selected Stokes line large portions of the intensity of the light 10 from the laser 1 1 is used for the excitation light 8. In a conventional Mikrochiplaser 1 1, these proportions are so large that they can be split to double the rate of the pulses of the laser 11 and directed at a time offset to the sample 2.
  • FIG. 3 outlines another way of increasing the rate of the pulses of depletion light 8 versus the rate of pulses of a single microchip laser 11.
  • two microchip lasers 1 1 'and 1 1 are provided here, which emit light 10' or 10" with different wavelengths.
  • the light 10 'or 10 "of both microchip lasers 1 1' and 1 1" is connected to a beam splitter 31, the z. B. may be formed as an acousto-optical filter 32, merged on an optical axis and coupled into the single-mode fiber 12.
  • the distance of the wavelength of the light 10 'from the wavelength of the light 10 is about the same as the distance between the Stokes lines 19 to 28 shown in FIG.
  • the de-excitation light 8 has a doubled pulse rate behind the wavelength-selective element 14, which here is a narrow-band color filter 34.
  • the laser diode 4, which controls the excitation light 8 is thereby triggered as a function of both microchip lasers 1 1 'and 11 ", which can travel freely relative to one another, that is, they need not be synchronized with one another.
  • the fluorescent light microscope 1 according to FIG. 3 uses only one single-mode fiber 12 for increasing the pulse rate of the pulses of the depletion light 8
  • the subsequent to the phase filter 9 part of the fluorescent light microscope of FIG. 4 is not shown and corresponds to FIG. LIST OF REFERENCE NUMBERS

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Abstract

Zum fluoreszenzlichtmikroskopischen Messen einer Probe (2) wird ein Fluoreszenzfarbstoff in der Probe (2) mit Licht (8) einer bestimmter Wellenlänge von einem Zustand in einen anderen Zustand überführt, wobei Licht (10) einer anderen Wellenlänge mit einer solchen Intensität in eine derart ausgewählte Lichtleiterfaser (13) eingekoppelt wird, dass in der Lichtleiterfaser (13) Raman-Streuung in solchem Ausmaß stimuliert wird, dass ein aus der Lichtleiterfaser (13) austretendes Lichtspektrum neben der eingekoppelten Wellenlänge mindestens eine rotverschobene Stokes-Linien (19 bis 28) aufweist, deren Intensitätshalbwertsbreite kleiner als ihr halber Abstand zu der er ihr im Blauen benachbarten Linie (18 bis 28) des Lichtspektrums (17) ist, und wobei die eine Wellenlänge aus einer der rotverschobenen Stokes-Linien (19 bis 28) ausgewählt wird; und Fluoreszenzlicht (6) von der Probe (2) wird ortsauflösend gemessen.

Description

FLUORESZENZLICHTMIKROSKOPISCHES MESSEN EINER PROBE MIT ROTVERSCHOBENEN STOKES-LINIEN
TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum fluoreszenzlichtmikroskopischen Messen einer Probe mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 sowie auf ein Fluoreszenzlichtmikroskop mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 16.
STAND DER TECHNIK
In der Fluoreszenzlichtmikroskopie wird Licht verschiedener Wellenlängen benötigt, um unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe zur Fluoreszenz anzuregen, um unterschiedliche Fluores- zenzfarbstoffe gezielt wieder abzuregen (zum Beispiel in der STED-Fluoreszenzlicht- mikroskopie), um unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe gezielt in einen Dunkelzustand zu überführen (zum Beispiel in der GSD-Fluoreszenzlichtmikroskopie) oder um denselben Farbstoff in einander überdeckenden, aber unterschiedlichen räumlichen Bereichen einerseits zur Fluoreszenz anzuregen und andererseits durch stimulierte Emission wieder abzuregen oder in einen Dunkelzustand zu überführen. Um diese Anforderungen zu erfüllen, können mehrere verschiedene monochromatische Lichtquellen eingesetzt werden, um das Licht mit den unterschiedlichen Wellenlängen bereitzustellen. Weil es sich bei den hierfür geeigneten monochromatischen Lichtquellen in aller Regel um Laser hoher Qualität handelt, da das Licht in Pulsen hoher Intensität benötigt wird, sind entsprechend aufgebaute Fluoreszenzlichtmikroskope sehr kostspielig. Für einige Wellenlängen ist es auch grundsätzlich schwierig geeignete Laser ausreichender Qualität zu finden. Unter anderem aus der DE 10 2005 020 003 A1 ist es bekannt, einen Gaslaser als Lichtquelle bei der Fluoreszenzlichtmikroskopie einzusetzen, der mehrere nutzbare Emissionslinien aufweist oder zumindest auf mehrere Emissionslinien abstimmbar ist. Gaslaser sind jedoch kostspielig in der Anschaffung und aufwändig im Betrieb. Zudem decken die bei einem Gaslaser nutzbaren Emissionslinien allenfalls einen kleinen Spektralbereich soweit ab, dass alle in diesen Spektralbereich fallenden Absorptionslinien möglicher Fluoreszenzfarbstoffe mit gutem Wirkungsquerschnitt angesprochen werden können.
Aus dem US-Patent 6,710,918 ist ein Fluoreszenzlichtmikroskop bekannt, bei dem Licht einer bestimmten Wellenlänge zum Überführen eines Fluoreszenzfarbstoffs in einer Probe von einem Zustand in einen anderen Zustand dadurch bereitgestellt wird, dass Licht einer anderen Wellenlänge von einem Laser, insbesondere einem modengekoppelten Titanium-Saphir-Laser, der bei 800 nm Wellenlänge emittiert, in ein optisches Element eingekoppelt wird, das die Intensität des eingekoppelten Lichts einer Wellenlänge auf ein kontinuierliches Spektrum verteilt, welches kleinere und größere Wellenlängen als das eingekoppelte Licht aufweist und welches als Superkontinuum bezeichnet wird. Das optische Element kann dabei zum Beispiel eine sich über eine Länge von 30 mm bis 90 mm im Querschnitt stark verjüngende Lichtleiterfaser sein (eine sogenannte "tapered Fiber"), die eine Gesamtlänge von 1 m aufweist, oder eine mikrostrukturierte optische Faser mit photonischer Bandlücke ("photonic Band Gap"), die auch als photonische Kristallfaser ("photonic Crystal Fiber") bezeichnet wird. Bei einer photonic Crystal Fiber wird die photonische Bandlücke durch eine bienenwabenartige Mikrostruktur um einen sehr kleinen Faserkern von nur etwa 2 μm Durchmesser erzeugt. Die typische Länge einer photonic Crystal Fiber (PCF) beträgt 38 cm. Eine spektrale Verteilung in Form eines Superkontinuums ermöglicht es zwar, Licht jeder beliebigen Wellenlänge für das Überführen eines Fluoreszenzfarbstoffs von einem Zustand in einen anderen aus dem Superkontinuum zu selektieren. Die bei jeder einzelnen Wellenlänge des Superkontinuums zur Verfügung stehende Lichtleistung ist jedoch gegenüber der Ausgangsleistung des anregenden Lasers extrem reduziert. Zudem ist ein erheblicher Aufwand erforderlich, um ein Superkontinuum mit einer zumindest annähernd homogenen Intensitätsverteilung und insbesondere einer zeitlich stabilen Intensitätsverteilung bereitzustellen. So hat die Entwicklung entsprechender Fluoreszenzlicht- mikroskope von der Patentanmeldung der Idee bis zu kommerziellen Produkten mehr als fünf Jahre gedauert. Zudem sind die entsprechenden Fluoreszenzlichtmikroskope kostspielig, was unter anderem an dem Titan-Saphir-Laser mit der notwendigen Ausgangsleistung und den im kommerziellen Produkt eingesetzten PCF liegt. Aus der DE 103 47 712 A1 ist eine Lichtquelle für die Fluoreszenzmikroskopie, einschließlich der STED-Mikroskopie, bekannt, bei der die Wellenlänge mittels einer photonischen Faser oder eines optisch-parametrischen Oszillators (OPO) beeinflusst werden kann. Bei einem OPO wird die gewünschte Wellenlänge durch einen nicht linear-optischen 3-Wellen-Frequenzkonversions- prozess generiert, bei dem die eingestrahlte Frequenz der Pumpwelle in zwei Frequenzen (Signal und Idler) aufgespalten wird.
Aus der DE 100 12 881 A1 ist eine Raman-Verstärkeranordnung auf Basis einer Standard- Einmodenfaser bekannt, bei der mittels stimulierter Raman-Streuung eines leistungsstarken optischen Pumpsignals Stokeswellen erzeugt werden, um ein einlaufendes optisches Signal zu verstärken.
In der EP 1 662 296 A1 wird eine Vorrichtung beschrieben, mit der einfallendes Licht basierend auf Dispersions- und Polarisations-Effekten spektral aufgespalten wird. Diese Vorrichtung wird auch als Lichtquelle zur Anwendung in der STED-Mikroskopie vorgeschlagen, wobei von einem einfallenden Laserstrahl Licht einer solchen Wellenlänge abgetrennt wird, die der Wellenlänge des interessierenden Fluoreszenzlichts von einer Probe genau entspricht, so dass dieses Licht zur Abregung durch stimulierte Emission besonders geeignet ist, während das verbleibende Licht des Laserstrahls als Anregungslicht verwendet wird.
Aus der WO 03/016781 A2 ist eine Vorrichtung zur Erzeugung von Licht in einem gewünschten Wellenlängenbereich bekannt, mit der die Anregung einer Probe in einem noch kleineren Bereich als bei der STED-Mikroskopie möglich sein soll. Dabei basiert die Lichtemission der Vorrichtung auf photoinduzierter Anregung von Oberflächenplasmonen einer Metallschicht.
AUFGABE DER ERFINDUNG
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum fluoreszenzlichtmikroskopischen Messen einer Probe mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs
1 und ein Fluoreszenzlichtmikroskop mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen
Patentanspruchs 16 aufzuzeigen, bei denen ohne großen und kostspieligen Aufwand und ohne - A -
Stabilitätsprobleme Licht unterschiedlicher Wellenlängen zur Verfügung steht, um unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe von einem Zustand in einen anderen Zustand zu überführen.
LÖSUNG
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein Verfahren zum fluoreszenzlichtmikroskopischen Messen einer Probe mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 und durch ein Fluoreszenzlichtmikroskop mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 16 gelöst. Die abhängigen Patentansprüche 2 bis 15 betreffen bevorzugte Ausführungsformen des neuen Verfahrens, während die abhängigen Patentansprüche 17 bis 30 auf bevorzugte Ausführungsformen des neuen Fluoreszenzlichtmikroskops gerichtet sind.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bei dem neuen Verfahren zum fluoreszenzlichtmikroskopischen Messen einer Probe wird die Lichtleiterfaser derart ausgewählt und wird das Licht mit einer solchen Intensität in die Lichtleiterfaser eingekoppelt, dass in der Lichtleiterfaser Raman-Streuung in solchem Ausmaß stimuliert wird, dass das Lichtspektrum neben einer Linie der eingekoppelten Wellenlänge mindestens eine rotverschobene Stokes-Linien aufweist, deren Intensitätshalbwertsbreite kleiner als ihr halber Abstand zu der er ihr im Blauen benachbarten Linie des Lichtspektrums ist; und die bestimmte Wellenlänge zum Überführen des Fluoreszenzfarbstoffs wird aus einer der rotverschobenen Stokes-Linien ausgewählt.
Bei dem neuen Verfahren wird der Effekt der stimulierten Raman-Streuung in einer Lichtleiterfaser ausgenutzt, der bei auf die Länge der Lichtleiterfaser abgestimmter Intensität des eingekoppelten Lichts zur Ausbildung rotverschobener Stokes-Linien neben der Linie des eingekoppelten Lichts führt. Mindestens wird bei dem neuen Verfahren eine solche Stokes-Linie erzeugt, wobei die Anzahl der Stokes-Linien mit zunehmender Intensität des eingekoppelten Lichts und zunehmender Länge der Lichtleiterfaser ansteigt. Die Stokes-Linien mit den größten Wellenlängen, das heißt die am weitesten rotverschobenen Stokes-Linien sind zwar weniger scharf ausgebildet. Selbst die am weitesten rotverschobene Stokes-Linie weist aber in eine so geringe Halbwertsbreite auf, dass sie über einen kleinen Wellenlängenbereich von wenigen Nanometern einen hohen prozentualen Anteil der Intensität des eingekoppelten Lichts umfasst. Die zwischen dieser am weitesten rotverschobenen Stokes-Linie und der Linie des einge- koppelten Lichts liegenden weiteren Stokes-Linien sind schärfer. Jede von ihnen erfüllt das oben angegebene Kriterium in Bezug auf Ihre Halbwertsbreite, und weist über ein Band von wenigen Nanometern stehen einige Prozent der Intensität des eingekoppelten Lichts zur Verfügung. Dabei liegt der Abstand der rotverschobenen Stokes-Linien untereinander bzw. zu der Linie des eingekoppelten Lichts bei 10-20 nm, typischerweise bei 12-15 nm, wenn die Wellenlänge des eingekoppelten Lichts bei etwa 500 nm liegt. Der genaue Wert hängt von dem Material und Aufbau der Lichtleiterfaser sowie der Wellenlänge des eingekoppelten Lichts ab. Die Stokes-Linien liegen damit so dicht nebeneinander, dass jeder Fluoreszenzfarbstoff, dessen relevante Absorptionslinie zwischen die Wellenlänge des eingekoppelten Lichts und die Wellenlänge der am stärksten rotverschobenen Stokes-Linie fällt, mit einer oder sogar mehreren der Stokes-Linien bedient werden kann. Hierfür steht über einem kleinen Wellenlängenbereich innerhalb der Halbwertsbreite der Stokes-Linien, das heißt gut diskriminierbar, ein großer Anteil der Intensität des eingekoppelten Lichts stabil zur Verfügung, wobei die Lage der Stokes-Linien und ihr relativer Intensitätsanteil an dem Lichtspektrum stabil ist, ohne dass hierfür besondere Maßnahmen getroffen werden müssten. Vorteile des neuen Verfahrens sind aber nicht erst vorhanden, wenn im Lichtspektrum, das aus der Lichtleiterfaser austritt, mehrere Stokes-Linien vorliegen. Bereits eine einzige Stokes-Linie neben der Linie des eingekoppelten Lichts verdoppelt die Verwendungsmöglichkeiten von Licht aus dem austretenden Lichtspektrum.
Dass sich mittels stimulierter Raman-Streuung in einer Single Mode Faser rotverschobene Stokes-Linien in regelmäßigen Abständen erzeugen lassen, ist grundsätzlich bekannt. Eine Übersicht über die Effekte stimulierter Raman-Streuung ist zum Beispiel zu finden bei Agrawal, Ch. 8: Stimulated Raman Scattering (Agrawal, Govind P., Nonlinear Fiber Optics, 2. ed., San Diego, CaNf., 1995). Trotz dieses seit Jahrzehnten bekannten Effekts ist bislang keine Anwendung auf dem Gebiet der Fluoreszenzlichtmikroskopie erfolgt. Stattdessen sind, wie eingangs berichtet, mit großem Aufwand Fluoreszenzlichtmikroskope entwickelt worden, bei denen ein Lichtspektrum mit einem Superkontinuum erzeugt wird. Diesem Stand der Technik gegenüber weist das neue Verfahren jedoch erhebliche Vorteile auf, indem es bei den Wellenlängen jeder Stokes-Linie eine viel höhere Lichtintensität bereitstellt. Das vermeintliche Fehlen von Licht mit Wellenlängen zwischen den einzelnen Stokes-Linien bzw. zwischen der ersten Stokes-Linie und der Linie des eingekoppelten Lichts ist demgegenüber ohne größere Bedeutung, weil die Linien ausreichend dicht beieinander liegen. Hinzu kommen die Stabilität der Lage der Stokes-Linien und ihrer relativen Intensität. Retrospektiv ist es daher verwunderlich, warum in der praktischen Entwicklung der bekannte Effekt der stimulierten Raman-Streuung als Basis für eine Lichtquelle mit mehreren Wellenlängen in der Fluoreszenzlichtmikroskopie gänzlich übergangen wurde.
Auch die Lichtleiterfaser muss bei dem neuen Verfahren keine aufwändige mikrostrukturierte oder sich lokal stark verjüngende Faser sein. Vielmehr handelt es sich vorzugsweise um eine herkömmliche Single Mode Faser mit zumindest annähernd konstantem Durchmesser oder jedenfalls keiner ausgeprägten lokalen Verjüngung und ohne Mikrostruktur um einen Faserkern minimalen Durchmessers. Dafür ist die bei dem neuen Verfahren eingesetzte Single Mode Faser vergleichsweise lang. Dies gilt insbesondere dann, wenn mehrere oder gar viele rot- verschobene Stokes-Linien erzeugt werden sollen, um Licht über einen größeren Spektralbereich für das Überführen von Fluoreszenzfarbstoffen von einem Zustand in einen anderen Zustand zur Verfügung zu stellen. Die Single Mode Faser kann eine Abschneidewellenlänge (cut off Wellenlänge) aufweisen, die auf der blauen Seite nicht weit, z. B. weniger als 70 nm, von der Wellenlänge des eingekoppelten Lichts entfernt liegt.
Konkret beträgt die Mindestlänge einer herkömmlichen Single Mode Faser bei dem neuen Verfahren 9 m. Um mehrere rotverschobene Stokes-Linien zu erhalten, ist jedoch eine Mindestlänge von 19 m bevorzugt. Damit die Anzahl der nutzbaren rotverschobenen Stokes- Linien eine Größenordnung von 10 erreichen kann, ist eine Länge der Single Mode Faser von ungefähr 30 m oder mehr sinnvoll. Mit 10 rotverschobenen Stokes-Linien wird durch das gesamte Lichtspektrum am Ausgang der Single Mode Faser, das die Wellenlänge des eingekoppelten Lichts als weitere Linie aufweist, ein Wellenlängenbereich von etwa 150 nm abgedeckt.
Wenn die Lichtleiterfaser bei dem neuen Verfahren eine mikrostrukturierte Faser ist, sollte ihre Länge jedoch so kurz wie möglich gehalten werden, da derartige Lichtleiterfasern im Gegensatz zu herkömmlichen Single Mode Faser eine sehr hohe längenabhängige Dämpfung aufweisen.
Wenn die Lichtleiterfaser bei dem neuen Verfahren dennoch eine mikrostrukturierte Faser ist, ist eine solche mit einem gasgefüllten Hohlkern bevorzugt, bei der die Wahl des Gases bzw. seiner Zusammensetzung in dem Hohlkern eine Einflussnahme auf die Rotverschiebung, d. h. den Abstand der Stokes-Linien erlaubt. Um die hohe Dämpfung einer mikrostrukturierten Faser mit gasgefülltem Hohlkern zu begrenzen, kann sie zur Erzeugung nur einer Stokes-Linie genutzt werden, wofür eine vergleichsweise geringe Länge ausreicht. Das aus der mikrostrukturierten Faser austretende Lichtspektrum aus zwei Linien kann anschließend in eine herkömmliche Single Mode Faser eingekoppelt werden, um zu jeder dieser Linien zusätzliche rotverschobene Stokes-Linien auszubilden.
Die Intensität des Lichts der anderen Wellenlänge, das in die Lichtleiterfaser eingekoppelt wird, sollte mindestens 50 Watt Spitzenleistung (peak power) betragen, was für die Ausbildung einer Stokes-Linie ausreichend sein kann. Um mehrere oder gar viele Stokes-Linien zu erzeugen sollte die Intensität 500 Watt und vorzugsweise mindestens 1000 Watt Spitzenleistung erreichen. Der bei einer bestimmten Lichtleiterfaser für das Erzeugen einer bestimmten Anzahl von Stokes-Linien erforderliche Wert der Spitzenleistung hängt auch vom Durchmesser der Lichtleiterfaser ab. Dieser bestimmt zusammen mit der Spitzenleistung die Intensität des eingekoppelten Lichts in der Lichtleiterfaser.
Besonders günstige Verhältnisse stellen sich dann ein, wenn das Licht der anderen Wellenlänge in Pulsen von 0,5-5 ns Dauer in die Lichtleiterfaser eingekoppelt wird. Bei längeren Pulsen besteht die Gefahr, dass stimulierte Brillouin-Streuung in der Lichtleiterfaser dominiert. Auch bei kürzeren Pulsen geht der Effekt der Ausbildung stabiler Stokes-Linien durch die stimulierte Raman-Streuung zurück. Die Dauer der Pulse des eingekoppelten Lichts entspricht bei dem neuen Verfahren etwa auch der Dauer der Pulse des aus der Single Mode Faser austretenden Lichts. Pulse von 0,5-5 ns Dauer, insbesondere Pulse von 1-3 ns Dauer sind für das Überführen von Fluoreszenzfarbstoffen zwischen zwei Zuständen in der Fluoreszenzlichtmikroskopie von besonderem Interesse, wenn solche Transfers bis zur Sättigung getrieben werden sollen, was verschiedentlich der Fall ist.
Wie bereits angesprochen wurde, kann ein Lichtspektrum mit mehreren oder gar möglichst vielen rotverschobenen Stokes-Linien erwünscht sein. Konkret kann das Lichtspektrum bei dem neuen Verfahren mindestens 5, vorzugsweise mindestens 7 und am meisten bevorzugt mindestens 10 rotverschobene Stokes-Linien aufweisen. Auch bei noch mehr rotverschobenen Stokes-Linien entfällt auf jede dieser Stokes-Linien ein Intensitätsanteil von mehreren Prozent der Intensität des eingekoppelten Lichts. Bei dem neuen Verfahren sind die Stokes-Linien rotverschoben. Das heißt, sie weisen eine größere Wellenlänge als das in die Lichtleiterfaser eingekoppelte Licht auf. Mit anderen Worten sollte die andere Wellenlänge des eingekoppelten Lichts am blauen Ende des sichtbaren Spektrums liegen. Es gibt zwar Gaslaser, die in diesem Bereich emittieren. Besonders günstig ist es aber, wenn die andere Wellenlänge durch Frequenzverdopplung einer Lasergrundfrequenz bereitgestellt wird. Derartige frequenzverdoppelte Laser können aufgrund der Lasergrundfrequenz im Bereich von 1 μm als kostengünstige Festkörperlaser aufgebaut werden. So kann das Licht der anderen Wellenlänge insbesondere mit einem sogenannten Mikrochiplaser bereitgestellt werden. Hierbei handelt es sich um einen kostengünstig verfügbaren Festkörperlasertyp, bei dem es sich beispielsweise um einen frequenzverdoppelten Nd:YAG-Laser handeln kann. Während ein frequenzverdoppelter Nd:YAG-Laser üblicher weise eine Emissionswellenlänge von 532 nm aufweist, gibt es auch Mikrochiplaser, die bei anderen Wellenlängen in einem Bereich von 450-600 nm, insbesondere in einem Bereich zwischen 500 und 550 nm emittieren. Damit kann Einfluss auf die Lage der einzelnen rotverschobenen Stokes-Linien genommen werden. Geht man von einem konstanten Abstand der rotverschobenen Stokes-Linien von etwa 12-15 nm aus, so können mit zwei wechselweise eingesetzten Halbleiterlasern, deren Emissionswellenlängen um etwa 6-7 nm auseinanderfallen, Stokes-Linien im Abstand von etwa 6-7 nm erzeugt werden. Mit drei verschiedenen Mikrochiplasern, deren Emissionswellenlängen etwa 4-5 nm auseinanderfallen, können ent- sprechend Stokes-Linien im Abstand von 4-5 nm über den gesamten Wellenlängenbereich des Lichtspektrums am Ausgang der Single Mode Faser bereitgestellt werden.
Mikrochiplaser sind zur Emission von Pulsen einer Dauer von etwa 1-3 ns besonders gut geeignet. Dies stellt eine optimale Dauer der Pulse für den Einsatz in der hochauflösenden Fluoreszenzlichtmikroskopie dar. Die Pulswiederholungsrate bei einem herkömmlichen Mikrochiplaser kann mit 1-100 KHz etwas niedriger liegen, als dies für die Fluoreszenzlichtmikroskopie erwünscht ist, wo eine Pulswiederholungsrate im Megaherzbereich bevorzugt ist. Eine Pulswiederholungsrate von 1 MHz ist aber auch bei Mikrochiplasern ausreichender Spitzenleistung realisierbar. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die aus der Lichtleiterfaser austretenden Lichtpulse der einen, für das Überführen des jeweiligen Fluoreszenzfarbstoffs von seinem einen in seinen anderen Zustand benötigten Wellenlänge zu teilen und zeitlich versetzt wieder zusammenzuführen. Dem Fachmann sind die hierfür notwendigen Techniken bekannt. Hierzu zählt es, eine einzelne Stokes-Linie spektral aufzufächern und einen Teil der spektralen Bestandteile vor dem Wiederzusammenführen der spektralen Bestandteile um einen halben zeitlichen Abstand der Pulse zu verzögern.
Eine weitere Möglichkeit, die Pulswiederholungsrate des Lichts der interessierenden einen Wellenlänge zu erhöhen, wobei diese eine Wellenlänge eine gewisse Toleranzbreite aufweist, besteht darin, verschiedene, nicht zeitgleiche Lichtpulse unterschiedlicher Wellenlängen in dieselben oder andere Lichtleiterfaser einzukoppeln und Stokes-Linien von den verschiedenen Lichtpulsen als Lichtpulse der einen Wellenlänge zum Überführen des Fluoreszenzfarbstoffs von dem einen Zustand in den anderen Zustand zu nutzen. Wenn die beiden unterschiedlichen Wellenlängen, mit denen die nicht zeitgleichen Lichtpulse in die Lichtleiterfaser eingekoppelt werden, den Abstand der Stokes-Linien aufweisen, können auf diese Weise sogar Lichtpulse genau einer Wellenlänge mit erhöhter Wiederholungsrate der Pulse erzeugt werden. Wenn die Stokes-Linien jedoch in unterschiedlichen Single Mode Fasern erzeugt werden, müssen sie sich in der Wellenlänge zumindest etwas unterscheiden, um bei gleicher Polarisation auf eine übereinstimmende optische Achse ausgerichtet werden zu können.
Wenn dann die neuen Verfahren eine Anregungslichtquelle, insbesondere eine Laserdiode, die Anregungslicht für den jeweiligen Fluoreszenzfarbstoff bereitstellt, synchron zu den Nichtpulsen der einen Wellenlänge, mit denen der Fluoreszenzfarbstoff lokal wieder abgeregt wird, getriggert wird, kann dies beim Einkoppeln nicht zeitgleicher Lichtpulse unterschiedlicher Wellenlänge in dieselbe oder andere Lichtleiterfaser(n) erfolgen, ohne dass diese nicht zeitgleichen Lichtpulse untereinander synchronisiert werden müssen, weil eine Laserdiode ohne weiteres im hohen Megaherzbereich getaktet werden kann. Die beiden Lichtquellen für die nicht zeitgleichen Lichtpulse unterschiedlicher Wellenlänge können daher relativ zueinander freilaufen.
Während im letzten Absatz bereits eine Anwendung des neuen Verfahrens bei der STED- Fluoreszenzlichtmikroskopie angedeutet wurde, kann die Erfindung auch bei herkömmlicher Fluoreszenzlichtmikroskopie, aber auch bei anderen Techniken der Fluoreszenzlichtmikroskopie mit Erhöhung der Ortsauflösung durch Schalten von Fluoreszenzfarbstoffen zwischen verschiedenen Zuständen, wie beispielsweise GSD-Fluoreszenzlichtmikroskopie und RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopie angewandt werden. Ein besonders interessantes Anwendungsgebiet des neuen Verfahrens ist das so genannte Fluorescence Lifetime lmaging (FLIM), bei dem aus dem Fluoreszenzlicht von der Probe Fluoreszenzlebensdauerabbildungen der Probe im Zeit- oder Frequenzbereich generiert werden. Das neue Verfahren stellt auf einfache Weise Anregungslicht verschiedener, ausreichend fein abgestufter Wellenlängen zur Verfügung, um das Fluorescence Lifetime Imaging bei verschiedenen Farben zu betreiben.
Bei einem erfindungsgemäßen Fluoreszenzlichtmikroskop ist die Lichtleiterfaser derart ausgewählt und koppelt der Laser Licht mit einer solchen Intensität in die Lichtleiterfaser ein, dass in der Lichtleiterfaser Raman-Streuung in solchem Ausmaß stimuliert wird, dass das Lichtspektrum neben der eingekoppelten Wellenlänge mindestens eine rotverschobene Stokes- Linien aufweist, deren Intensitätshalbwertsbreite kleiner als ihr halber Abstand zu der ihr im Blauen benachbarten Linie des Lichtspektrums ist; und die wellenlängenselektiven Mittel sondern das Licht mit der bestimmten Wellenlänge zum Überführen des Fluoreszenzfarbstoffs aus einer der rotverschobenen Stokes-Linien aus. Einzelheiten der neuen Vorrichtung ergeben sich aus den angehängten Ansprüchen in Verbindung mit den voranstehenden Erläuterungen des neuen Verfahrens.
Erwähnenswert ist jedoch, dass eine Frequenzerhöhungseinrichtung, die verschiedene Lichtpulse zusammenführt, um die Pulswiederholungsrate des Lichts der interessierenden einen Wellenlänge zu erhöhen, für diese Zusammenführung ein dispersives optisches Element aufweisen kann. Beispiele für geeignete dispersive optische Elemente umfassen Prismen und Prismenanordnungen. Besonders bevorzugt sind jedoch akustooptische Filter, die in Umkehrrichtung verwendet werden, um Lichtpulse nur geringfügig unterschiedlicher Wellenlängen auf einer optischen Achse zusammen zu führen.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibungseinleitung genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile zwingend von erfindungsgemäßen Ausführungsformen erzielt werden müssen. Weitere Merkmale sind den
Zeichnungen - insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung - zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen der Erfindung entfallen.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
Im Folgenden wird die Erfindung anhand in den Figuren dargestellter bevorzugter Ausführungsbeispiele weiter erläutert und beschrieben.
Fig. 1 zeigt schematisch den Aufbau einer ersten Ausführungsform eines Fluoreszenzlichtmikroskops gemäß der vorliegenden Erfindung.
Fig. 2 zeigt ein Lichtspektrum, das bei dem Fluoreszenzlichtmikroskop gemäß Fig. 1 zur Verfügung steht.
Fig. 3 zeigt eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Fluoreszenzlicht- mikroskops in schematischer Darstellung, und
Fig. 4 zeigt die für eine Variante des Fluoreszenzlichtmikroskops gemäß Fig. 3 wesentlichen Teile eines erfindungsgemäßen Fluoreszenzlichtmikroskops.
FIGURENBESCHREIBUNG
Das in Fig. 1 skizzierte Fluoreszenzlichtmikroskop 1 dient zum fluoreszenzlichtmikroskopischen Messen einer Probe 2, in der eine interessierende Struktur mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist. Der Fluoreszenzfarbstoff wird mit Anregungslicht 3 von einer Laserdiode 4 im Fokusbereich eines Objektivs 5 zu Fluoreszenz angeregt. Daraufhin von dem Fluoreszenzfarbstoff aus dem Fokusbereich emittiertes Fluoreszenzlicht 6 wird mit einem Detektor 7 ortsauflösend, das heißt unter Zuordnung zu einem bestimmten Ort der Probe 2 detektiert. Um die Abmessungen des Orts der Probe 2, aus dem das Fluoreszenzlicht 6 stammen kann, unter die Beugungsgrenze abzusenken, wird der Fluoreszenzfarbstoff in der Probe 2 mit Abregungs- licht 8 einer von dem Anregungslicht 3 abweichenden Wellenlänge außerhalb eines interessierenden Messpunkts durch stimulierte Emission wieder abgeregt, wobei mit einem Phasenfilter 9 aus dem Abregungslicht 8 ein Interferenzmuster ausgebildet wird, das an der Stelle des interessierenden Messpunkts eine Nullstelle und darum herum eine Intensität aufweist, mit der die stimulierte Emission des Fluoreszenzfarbstoffs bis zur Sättigung getrieben wird. Die Wellenlänge des Abregungslichts 8 ist größer als die Wellenlänge von Licht 10 eines als Mikrochiplaser 11 ausgebildeten Lasers 15, das in eine Lichtleiterfaser 13 in Form voneinander beabstandeter Pulse eingekoppelt wird. Dabei ist der Mikrochiplaser 11 ein frequenzverdoppelter Laser 15, der im blauen Bereich des sichtbaren Spektrums emittiert. Die hohe Lichtintensität in der Lichtleiterfaser 13, die eine herkömmliche Single Mode Faser 12 mit über ihrer Länge konstantem Durchmesser ist, führt zu stimulierter Raman-Streuung mit Ausbildung mehrerer rotverschobener Stokes-Linien in einem Lichtspektrum, das aus der Single Mode Faser 12 austritt. Eine der Stokes-Linien wird mit einem wellenlängenselektiven Element 14 selektiert und bildet das Abregungslicht 8 aus.
Fig. 2 skizziert das Lichtspektrum 17, das bei dem Fluoreszenzlichtmikroskop 1 aus der Single Mode Faser 12 austritt. Dieses Lichtspektrum 17 entstand konkret durch Einstrahlen von Pulsen einer Wellenlänge von 532nm (frequenzverdoppelter Nd:YAG) und einer Pulsdauer von 1 ,5 ns sowie einer Pulswiederholungsrate von 7 kHz bei 2OmW mittlerer Leistung und 1 ,9 kW Spitzenleistung in eine Standard Single Mode Glasfaser (Schaefter und Kirchhoff, cut-off Wellenlänge ca. 470 nm, Modenfelddurchmesser (Kerndurchmesser) ca. 5 μm, numerische Apertur 0,1 1 , polarisationserhaltende Panda-Faser) von 30 m Länge. Die Einkoppeleffizienz, d. h. die transmittierte Gesamtleistung, betrug 50%. Ähnliche Spektren entstanden mit Single Mode Glasfasern der Firma Thorlabs (cut-off Wellenlänge 480 nm). Das Lichtspektrum 17 weist eine erste Linie 18 des in die Single Mode Faser 12 eingekoppelten Lichts 10 bei der Wellenlänge 532 nm auf, mit der der Mikrochiplaser 1 1 emittierte. Hieran schließt sich eine Vielzahl von rotverschobenen Stokes-Linien 19 bis 28 an, die jeweils einige Prozent der Gesamtintensität des Lichtspektrums 17 umfassen. Die am weitesten rotverschobenen Stokes- Linien 26 bis 28 weisen zwar eine zunehmende Halbwertsbreite auf. Auch sie umfassen aber über einen Bereich von wenigen Nanometern mehrere Prozent der Gesamtintensität des Lichtspektrums 17. Der Abstand 29 der rotverschobenen Stokes-Linien 19 bis 28 untereinander und der ersten rotverschobenen Stokes-Linien 19 gegenüber der Linie 18 beträgt jeweils etwa 12-15 nm. Das heißt, bei dem Fluoreszenzlichtmikroskop gemäß Fig. 1 kann das Abregungslicht 8 in Schritten von 12-15 nm über den gesamten Bereich des Spektrums 17 hinweg bezüglich seiner Wellenlänge eingestellt werden. Dabei werden, weil jede der Stokes- Linien eine Halbwertsbreite 30 aufweist, die kleiner als der halbe Abstand 29 ist, mit der gewählten Stokes-Linie große Anteile der Intensität des Lichts 10 von dem Laser 1 1 für das Anregungslicht 8 genutzt. Bei einem herkömmlichen Mikrochiplaser 1 1 sind diese Anteile so groß, dass sie zur Verdopplung der Rate der Pulse des Lasers 11 noch aufgespaltet und unter zeitlichem Versatz auf die Probe 2 gerichtet werden können.
Fig. 3 skizziert eine andere Möglichkeit, die Rate der Pulse des Abregungslichts 8 gegenüber der Rate der Pulse eines einzelnen Mikrochiplasers 1 1 zu erhöhen. Hierzu sind hier zwei Mikrochiplaser 1 1' und 1 1" vorgesehen, die Licht 10' bzw. 10" mit unterschiedlicher Wellenlänge emittieren. Das Licht 10' bzw. 10" von beiden Mikrochiplasern 1 1' und 1 1" wird mit einem Strahlteiler 31 , der z. B. als akustooptisches Filter 32 ausgebildet sein kann, auf eine optische Achse zusammengeführt und in die Single Mode Faser 12 eingekoppelt. Dabei ist der Abstand der Wellenlänge des Lichts 10' von der Wellenlänge des Lichts 10" ungefähr so groß wie der Abstand zwischen den Stokes-Linien 19 bis 28 gemäß Fig. 2, so dass zu jeder Stokes-Linie in dem Lichtspektrum, das durch das Licht 10' ausgelöst wird, eine Stokes-Linie gleicher Wellenlänge in dem Lichtspektrum existiert, das durch das Licht 10" ausgelöst wird. Wenn die beiden Laser 11 ' und 11 " dann ihre Pulse zu unterschiedlichen Zeitpunkten emittieren, weist das Abregungslicht 8 hinter dem wellenlängenselektiven Element 14, das hier ein schmal- bandiges Farbfilter 34 ist, eine verdoppelte Pulsrate auf. Die Laserdiode 4, die das Anregungs- licht 8 gibt, wird dabei in Abhängigkeit von beiden Mikrochiplasern 1 1 ' und 11 " getriggert, die relativ zueinander freilaufen können, das heißt untereinander nicht synchronisiert sein müssen.
Während das Fluoreszenzlichtmikroskop 1 gemäß Fig. 3 nur eine Single Mode Faser 12 bei der Erhöhung der Pulsrate der Pulse des Abregungslichts 8 einsetzt, sind hierfür gemäß Fig. 4 zwei Single Mode Fasern 12' und 12" vorgesehen, in denen jeweils das Licht 10' bzw. 10" von einem der Mikrochiplaser 1 1' bzw. 1 1" ein Lichtspektrum mit Stokes-Linien ausbildet. Dabei werden die beiden Lichtspektren durch den Strahlteiler 31 , der hier auch das wellenlängenselektive Element 14 ausbildet, so zusammengeführt, dass zwei Stokes-Linien mit leicht unterschiedlichen, aber doch gemeinsam als Abregungslicht 8 verwendbaren Stokes-Linien auf einer gemeinsamen optischen Achse austreten. Der sich an das Phasenfilter 9 anschließende Teil des Fluoreszenzlichtmikroskops gemäß Fig. 4 ist nicht dargestellt und entspricht Fig. 3. BEZUGSZEICHENLISTE
Fluoreszenzlichtmikroskop 31 Strahlteiler
Probe 32 akustooptisches Filter
Anregungslicht 33 Linse
Laserdiode 34 Farbfilter
Objektiv
Fluoreszenzlicht
Detektor
Abregungslicht
Phasenfilter
Licht
Mikrochiplaser
Single Mode Faser
Lichtleiterfaser wellenlängeselektives Element
Laser
Strahlteiler
Lichtspektrum
Linie
Stokes-Linie
Stokes-Linie
Stokes-Linie
Stokes-Linie
Stokes-Linie
Stokes-Linie
Stokes-Linie
Stokes-Linie
Stokes-Linie
Stokes-Linie
Abstand
Halbwertsbreite

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zum fluoreszenzlichtmikroskopischen Messen einer Probe, - wobei ein Fluoreszenzfarbstoff in der Probe mit Licht einer bestimmter Wellenlänge von einem Zustand in einen anderen Zustand überführt wird, - wobei Licht einer anderen Wellenlänge mit einer solchen Mindestintensität in eine Lichtleiterfaser eingekoppelt wird, dass aufgrund eines nichtlinearen Effekts ein Lichtspektrum mit gegenüber der anderen Wellenlänge verschobenen Wellen- längen aus der Lichtleiterfaser austritt, und - wobei das Licht mit der bestimmten Wellenlänge aus dem Lichtspektrum ausgesondert wird, und - wobei Fluoreszenzlicht von der Probe ortsauflösend gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtleiterfaser (13) derart ausgewählt wird und dass das Licht (10) der anderen Wellenlänge mit einer solchen Intensität in die Lichtleiterfaser (13) einge- koppelt wird, dass in der Lichtleiterfaser (13) Raman-Streuung in solchem Ausmaß stimuliert wird, dass das Lichtspektrum (17) neben einer Linie (18) der eingekoppelten Wellenlänge mindestens eine rotverschobene Stokes-Linie (19 bis 28) aufweist, deren Intensitätshalbwerts- breite kleiner als ihr halber Abstand zu der er ihr im Blauen benachbarten Linie (18 bis 28) des Lichtspektrums (17) ist, und dass die bestimmte Wellenlänge aus einer der rotverschobenen Stokes-Linien (19 bis 28) ausgewählt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Licht (10) der anderen Wellenlänge in eine mikrostrukturlose und verjüngungsfreie Single Mode Faser (12) einer Länge von mindestens 9 m eingekoppelt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Länge der Single Mode Faser (12) mindestens 19 m, vorzugsweise mindestens 30 m beträgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Licht (10) der anderen Wellenlänge in eine mikrostrukturierte Faser mit einem gasgefüllten Hohlkern eingekoppelt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Licht (10) der anderen Wellenlänge bevor es in die Single Mode Faser (12) eingekoppelt wird, durch eine mikrostrukturierte Faser mit einem gasgefüllten Hohlkern geführt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität des Lichts (10) der anderen Wellenlänge mindestens 50 W Spitzenleistung, vorzugsweise mindestens 400 Watt Spitzenleistung, am meisten bevorzugt mindestens 1000 Watt Spitzenleistung beträgt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Licht (10) der anderen Wellenlänge in Pulsen von 0,5 bis 5 ns Dauer, vorzugsweise in Pulsen von 1 bis 3 ns Dauer in die Lichtleiterfaser (13) eingekoppelt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Lichtspektrum (17) mindestens 2, vorzugsweise mindestens 5, mehr bevorzugt mindestens 7 und am meisten bevorzugt mindestens 10 rotverschobene Stokes-Linien (19 bis 28) umfasst.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die andere Wellenlänge durch Frequenzverdopplung einer Lasergrundfrequenz bereitgestellt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Licht (10) der anderen Wellenlänge mit einem Mikrochiplaser (1 1 ) bereitgestellt wird.
1 1. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die andere Wellenlänge in einem Bereich zwischen 450 und 600 nm, vorzugsweise in einem Bereich zwischen 500 und 550 nm liegt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass aus der Lichtleiterfaser (13) austretende Lichtpulse der einen Wellenlänge geteilt und zeitlich versetzt wieder zusammengeführt werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass verschiedene, nicht zeitgleiche Lichtpulse unterschiedlicher Wellenlängen in dieselbe oder andere Lichtleiterfaser(n) (13, 13', 13") eingekoppelt werden und dass Stokes-Linien (19 bis 28) von den verschiedenen Lichtpulsen als Lichtpulse der einen Wellenlänge zum Überführen des Fluoreszenzfarbstoffs von dem einen Zustand in den anderen Zustand genutzt werden.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass eine Anregungs- lichtquelle, insbesondere eine Laserdiode (4), die Anregungslicht (3) für den Fluoreszenz- farbstoff bereitstellt, synchron zu den Lichtpulsen der einen Wellenlänge, mit denen der Fluoreszenzfarbstoff lokal wieder abgeregt wird, getriggert wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass aus dem Fluoreszenzlicht (6) von der Probe (2) eine Fluoreszenzlebensdauerabbildung der Probe generiert wird.
16. Fluoreszenzlichtmikroskop, mit: - einer Lichtquelle, die Licht einer bestimmter Wellenlänge bereitstellt, um einen Fluoreszenzfarbstoff in einer zu untersuchenden Probe von einem Zustand in einen anderen Zustand zu überführen, - wobei die Lichtquelle einen Laser, eine Lichtleiterfaser und wellenlängenselektive Mittel aufweist, - wobei der Laser Licht einer anderen Wellenlänge mit einer solchen Mindestintensität in die Lichtleiterfaser einkoppelt, dass aufgrund eines nichtlinearen Effekts ein Lichtspektrum mit gegenüber der anderen Wellenlänge verschobenen Wellenlängen aus der Lichtleiterfaser austritt, und - wobei die wellenlängenselektiven Mittel das Licht mit der bestimmten Wellenlänge aus dem Lichtspektrum aussondern, und - einem Detektor, der Fluoreszenzlicht von der Probe ortsauflösend misst, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtleiterfaser (13) derart ausgewählt ist und dass der Laser (15) das Licht (10) der anderen Wellenlänge mit einer solchen Intensität in die Lichtleiterfaser (13) eingekoppelt, dass in der Lichtleiterfaser (13) Raman-Streuung in solchem Ausmaß stimuliert wird, dass das Lichtspektrum (17) neben der eingekoppelten Wellenlänge mindestens eine rotverschobene Stokes-Linien (19 bis 28) aufweist, deren Intensitäts- halbwertsbreite kleiner als ihr halber Abstand zu der er ihr im Blauen benachbarten Linie (18 bis 28) des Lichtspektrums (17) ist, und dass die wellenlängenselektiven Mittel das Licht mit der bestimmten Wellenlänge aus einer der rotverschobenen Stokes-Linien (19 bis 28) aussondern.
17. Fluoreszenzlichtmikroskop nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtleiterfaser (13) eine mikrostrukturlose und verjüngungsfreie Single Mode Faser (12) einer Länge von mindestens 9 m ist.
18. Fluoreszenzlichtmikroskop nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Länge der Single Mode Faser (12) mindestens 19 m, vorzugsweise mindestens 30 m beträgt.
19. Fluoreszenzlichtmikroskop nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtleiterfaser (13) eine mikrostrukturierte Faser mit einem gasgefüllten Hohlkern ist.
20. Fluoreszenzlichtmikroskop nach einem der Ansprüche 17 und 18, dadurch gekenn- zeichnet, dass der Single Mode Faser (12) eine mikrostrukturierte Faser mit einem gasgefüllten Hohlkern vorgeschaltet ist.
21 . Fluoreszenzlichtmikroskop nach einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekenn- zeichnet, dass der Laser (15) das Licht (10) der anderen Wellenlänge in Pulsen von mindestens 50 W Spitzenleistung, vorzugsweise mindestens 150 Watt Spitzenleistung, am meisten bevorzugt mindestens 450 Watt Spitzenleistung in die Lichtleiterfaser (13) einkoppelt.
22. Fluoreszenzlichtmikroskop nach einem der Ansprüche 16 bis 21 , dadurch gekenn- zeichnet, dass der Laser (15) das Licht (10) der anderen Wellenlänge in Pulsen von 0,5 bis 5 ns Dauer, vorzugsweise in Pulsen von 1 bis 3 ns Dauer in die Lichtleiterfaser (13) einkoppelt.
23. Fluoreszenzlichtmikroskop nach einem der Ansprüche 16 bis 22, dadurch gekenn- zeichnet, dass das Lichtspektrum (17) mindestens 2, vorzugsweise mindestens 5, mehr bevorzugt mindestens 7 und am meisten bevorzugt mindestens 10 rotverschobene Stokes- Linien (19 bis 28) umfasst.
24. Fluoreszenzlichtmikroskop nach einem der Ansprüche 16 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass der Laser (15) ein frequenzverdoppelter Laser ist.
25. Fluoreszenzlichtmikroskop nach einem der Ansprüche 16 bis 24, dadurch gekenn- zeichnet, dass der Laser (15) ein Mikrochiplaser (1 1 ) ist.
26. Fluoreszenzlichtmikroskop nach einem der Ansprüche 16 bis 25, dadurch gekenn- zeichnet, dass die andere Wellenlänge in einem Bereich zwischen 450 und 600 nm, vorzugsweise in einem Bereich zwischen 500 und 550 nm liegt.
27. Fluoreszenzlichtmikroskop nach einem der Ansprüche 16 bis 26, dadurch gekenn- zeichnet, dass eine Frequenzerhöhungseinrichtung vorgesehen ist, die aus der Lichtleiterfaser (13) austretende Lichtpulse der einen Wellenlänge teilt und zeitlich versetzt wieder zusammenführt.
28. Fluoreszenzlichtmikroskop nach einem der Ansprüche 16 bis 26, dadurch gekenn- zeichnet, dass eine Frequenzerhöhungseinrichtung vorgesehen ist, die verschiedene, nicht zeitgleiche Lichtpulse unterschiedlicher Wellenlängen in dieselbe oder andere Lichtleiterfaser(n) (13, 13', 13") einkoppelt und benachbarte Stokes-Linien (19 bis 28) von den verschiedenen Lichtpulsen als Lichtpulse der einen Wellenlänge zusammenführt.
29. Fluoreszenzlichtmikroskop nach einem der Ansprüche 27 bis 28, dadurch gekenn- zeichnet, dass die Frequenzerhöhungseinrichtung ein dispersives optisches Element, insbesondere ein akustooptisches Filter (32), zum Zusammenführen der Lichtpulse aufweist.
30. Fluoreszenzlichtmikroskop nach Anspruch 26 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass eine Anregungslichtquelle, insbesondere eine Laserdiode (4), vorgesehen ist, die Anregungs- licht (3) für den Fluoreszenzfarbstoff bereitstellt und die synchron zu den Lichtpulsen der einen Wellenlänge, mit denen der Fluoreszenzfarbstoff lokal wieder abgeregt wird, getriggert ist.
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE202009007250U1 (de) 2009-05-20 2009-11-26 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Feldveränderungsmittel zur Erzeugung komplementärer Lichtintensitätsmuster
DE102009056058B4 (de) * 2009-11-25 2021-08-12 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Vorrichtung zur Erzeugung von Anregungsstrahlung für selbstkalibrierende faseroptische Raman-Sensoren, Messeinrichtung zum Erfassen der Temperatur eines Messobjekts und Raman-Sensoranordnung
DE102010037190B4 (de) * 2010-08-27 2015-11-26 Leica Microsystems Cms Gmbh Vorrichtung zum zeitlichen Verschieben von Weißlichtlaserpulsen
FR2966292B1 (fr) * 2010-10-18 2013-01-18 Centre Nat Rech Scient Methode et dispositif d'emission laser pour l'analyse spectroscopique d'un echantillon
JP2012237714A (ja) * 2011-05-13 2012-12-06 Sony Corp 非線形ラマン分光装置、顕微分光装置及び顕微分光イメージング装置
CN102564642B (zh) * 2012-02-21 2013-08-07 中国计量学院 融合拉曼放大效应的光纤拉曼频移器的全分布光纤传感器
KR20150088879A (ko) * 2012-11-28 2015-08-03 트러스티스 오브 프린스턴 유니버시티 코히렌트성 반 스토크스 라만 분광법을 사용하는 검출 시스템 및 방법
DE202013006817U1 (de) * 2013-07-30 2014-10-31 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Gepulste Laserlichtquelle für die Fluoreszenzanregung
JP6103008B2 (ja) * 2015-09-09 2017-03-29 ソニー株式会社 非線形ラマン分光装置、顕微分光装置及び顕微分光イメージング装置
JP6729878B2 (ja) * 2016-04-05 2020-07-29 ウシオ電機株式会社 多光子励起用スーパーコンティニウム光生成光源、多光子励起用スーパーコンティニウム光生成方法、多光子励起蛍光顕微鏡及び多光子励起方法
DE102021128556A1 (de) 2021-11-03 2023-05-04 Amphos GmbH STED-Mikroskop
DE102021005684A1 (de) 2021-11-16 2023-05-17 Jörn Volkher Wochnowski STED-Verfahren mit Hohllichtwellenleitern

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5491344A (en) * 1993-12-01 1996-02-13 Tufts University Method and system for examining the composition of a fluid or solid sample using fluorescence and/or absorption spectroscopy
JP3390755B2 (ja) * 1998-09-29 2003-03-31 科学技術振興事業団 波長可変短パルス光発生装置及び方法
DE10012881B4 (de) * 2000-03-16 2008-09-04 Nokia Siemens Networks Gmbh & Co.Kg Ramanverstärkeranordnung
US7190705B2 (en) * 2000-05-23 2007-03-13 Imra America. Inc. Pulsed laser sources
US6885683B1 (en) * 2000-05-23 2005-04-26 Imra America, Inc. Modular, high energy, widely-tunable ultrafast fiber source
DE20122791U1 (de) 2000-06-17 2007-11-29 Leica Microsystems Cms Gmbh Scanmikroskop
US6818907B2 (en) * 2000-10-17 2004-11-16 The President And Fellows Of Harvard College Surface plasmon enhanced illumination system
AU2002246261A1 (en) * 2001-04-11 2002-10-28 University Of Southampton Sources of, and methods for generating, optical pulses
ATE539330T1 (de) * 2001-07-03 2012-01-15 Harvard College Mikroskopische vorrichtung und verfahren mittels polarisierter kohärenter anti-stokes- ramanstreuung
EP1288705A3 (de) * 2001-08-28 2005-03-02 Nippon Telegraph and Telephone Corporation Wellenlängenverstimmbare Pulslichtquelle
US7224518B2 (en) * 2003-02-25 2007-05-29 Toptica Photonics Ag Fiber-optic amplification of light pulses
DE102004009068B4 (de) * 2003-02-25 2007-05-24 Toptica Photonics Ag Faseroptische Verstärkung von Lichtimpulsen
US7064824B2 (en) * 2003-04-13 2006-06-20 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. High spatial resoulution imaging and modification of structures
JP2005084266A (ja) * 2003-09-05 2005-03-31 Kawasaki Heavy Ind Ltd 光制御装置および光制御方法
DE10347712A1 (de) * 2003-10-14 2005-05-12 Leica Microsystems Rastermikroskop
US8040929B2 (en) * 2004-03-25 2011-10-18 Imra America, Inc. Optical parametric amplification, optical parametric generation, and optical pumping in optical fibers systems
DE102005020003B4 (de) 2005-04-27 2007-10-11 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Fluoreszenzmikroskop

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2009047189A3 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20100187438A1 (en) 2010-07-29
WO2009047189A2 (de) 2009-04-16
WO2009047189A3 (de) 2009-09-03
DE102007048135A1 (de) 2009-04-16
DE102007048135B4 (de) 2012-02-16
JP2011503525A (ja) 2011-01-27
US8039815B2 (en) 2011-10-18

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