EP2234497A2 - Bakteriophagenpräparation und verwendung - Google Patents

Bakteriophagenpräparation und verwendung

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Publication number
EP2234497A2
EP2234497A2 EP09701705A EP09701705A EP2234497A2 EP 2234497 A2 EP2234497 A2 EP 2234497A2 EP 09701705 A EP09701705 A EP 09701705A EP 09701705 A EP09701705 A EP 09701705A EP 2234497 A2 EP2234497 A2 EP 2234497A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
bacteriophage
preparation
species
bacteriophage preparation
preparation according
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP09701705A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Neithard Dahlen
Gabriele Ruppert-Seipp
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Innovations- Transfert Uphoff & Co KG GmbH
Innovations Transfer Uphoff GmbH and Co KG
Original Assignee
Innovations- Transfert Uphoff & Co KG GmbH
Innovations Transfer Uphoff GmbH and Co KG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Innovations- Transfert Uphoff & Co KG GmbH, Innovations Transfer Uphoff GmbH and Co KG filed Critical Innovations- Transfert Uphoff & Co KG GmbH
Publication of EP2234497A2 publication Critical patent/EP2234497A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/40—Viruses, e.g. bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L26/00—Chemical aspects of, or use of materials for, wound dressings or bandages in liquid, gel or powder form
    • A61L26/0057—Ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L26/00—Chemical aspects of, or use of materials for, wound dressings or bandages in liquid, gel or powder form
    • A61L26/0061—Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A61L26/0066—Medicaments; Biocides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/00032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/00051—Methods of production or purification of viral material
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates to a bacteriophage preparation according to the preamble of claim 1 and various uses thereof.
  • EP 0 414 304 B1 describes a bacteriophage preparation of an aqueous composition of at least 100 particles / ml of a bacteriophage capable of lysing one or more types of bacteria, a nonionic surfactant and a neutral salt.
  • the bacteriophages have the well-known effect of lysing certain bacteria resistant to antibiotics.
  • the surface-active surfactant serves to improve the wetting of the surface to be treated and to solubilize and remove dirt.
  • the neutral salt primarily 0.01 to 2.0% by weight of sodium chloride, is said to improve storage stability.
  • This composition is to be used as a toothpaste, mouthwash, household cleanser against household bacteria (eg in toilet bowls) and as a skin care product against pathogenic skin bacteria.
  • EP 0 700 249 B1 describes in detail by way of examples that z. B. in the application of polyhexanide in wounds may occur a significant loss of effect, which is caused by the albumin present there;
  • albumin bovine serum albumin, BSA
  • the Gram-negative species Pseudomonas is the cause of infections in humans and animals.
  • Staphylococci as Gram-positive bacteria colonize humans depending on the nature of their skin to 20% in healthy skin and up to 100% in previously damaged skin such. Atopic dermatitis or, in particular, the presence of wounds. Furthermore, staphylococci are among the most common causes of nosocomial infections.
  • nosocomial infections account for a large proportion of all hospital-acquired complications, and therefore have a significant impact on the quality of medical and nursing care for patients.
  • the most common types of nosocomial infections in the ICU are ventilator-associated pneumonia, intra-abdominal infections following trauma, or after surgical intervention and bacteremia due to intravascular foreign bodies.
  • strains with resistance to commonly used antibiotics therefore has a special explosiveness in connection with pneumonia and sepsis, the involvement of implants and wounds with this bacterium.
  • MRSA Malignant suppression suppression suppression suppression suppression suppression suppression suppression suppression suppression suppression suppression suppression suppression suppression suppression suppression suppression suppression suppression suppression sup to sup to sup to sup to sup to sup to 60%. Intensive care units are in the foreground and the higher mortality from MRSA infections has been confirmed [Melzer M et al., Clin Infect Dis 2003; 37: 1453-1460].
  • cMRSA community-acquired MRSA
  • MRSA with reduced sensitivity to glycopeptides are still rare in Germany, as are resistance to the possible combination partners of the glycopeptides (rifampicin) about 2%, fusidic acid sodium about 2.5%).
  • GISA phenotype MRSA with resistance to glycopeptides
  • VISA vancomycin Intermediate-sensitive Staphylococcus aureus
  • VRSA vancomycin-resistant Staphylococcus aureus
  • VRE vancomycin / glycopeptide-resistant duckococci
  • penicillin-resistant pneumococci and multi-resistant Gram-negative bacteria.
  • Bacteriophages are known as a potential alternative to both antibiotic MRSA therapy and antiseptic decontamination of MRSA carriers. Their lytic phenomenon was first described in 1915 by Twort and independently in 1917 by d 1 Herelle. Advances in molecular genetics have allowed bacteriophages to be identified as viruses. These specifically infect only one bacterial species at a time by injecting their DNA into the bacterial cell. Then they completely reverse the bacterial metabolism to the intracellular re-synthesis of up to 200 new phages and release this next generation during bacterial cell disintegration.
  • the DNA of the phage is only integrated into the bacterial genome (temperate phages), inherited as part of the bacterial division, and virulent again only under special environmental conditions.
  • phage therapy was first used in 1921 [Bruynoghe R & Maisin J, La Presse Medicale 1921, 1195-1193], in which infected surgical wounds healed within 48 hours. In the subsequent World War I years, due to lack of antibiotics or due to Sulfonamide resistance in postoperative wound infections bacteriophages used.
  • US 2002/0001590 A1 describes selected bacteriophages of the family Myoviridae, especially the species Twort, which can effectively inhibit or kill MRSA strains.
  • the phages are used in aqueous solution or a buffer or in a polymer matrix.
  • nosocomial infections also affects hospital staff, who, without being sick themselves, carrier and thus propagator of bacteria. Furthermore, this problem also relates to medical devices and furnishings that may be populated with bacteria, including multidrug-resistant strains. This can also affect the entire hospital building.
  • the primary aim of the invention is therefore to provide a bacteriophage preparation which is suitable for use against At least one bacterial strain, preferably against all known multidrug-resistant bacterial strains, highly effective, has a good storability and can be distributed well over surfaces to be treated, including hard to reach places.
  • a further object of the invention is to provide a bacteriophage preparation for the preparation of a medicament for therapeutic or preventive antibacterial application, which is particularly applicable for use in wounds and wound areas, in the nasopharynx, in the skin and Schleimheut Scheme, urogenital area and in the area of the eye is.
  • a further object of the invention is to provide a disinfectant which is suitable for antibacterial applications and which is suitable, for example, for disinfecting the hands of doctors and clinical staff, but also for disinfecting objects.
  • the function of the surface-active substance is, on the one hand, to enable the penetration or penetration of the bacteriophages into the bacteria on the skin, in wounds or other inaccessible body sites and cavities (eg nasopharynx, urogenital space) or on inaccessible surfaces, such as rough surfaces or narrow gaps.
  • This achieves a drastic and, compared with the state of the art, more effective reduction of the bacteria.
  • the surfactant particularly a cationic surfactant such as polyhexanide has been shown.
  • alkaline buffer solution set forth in claim 1 which has been found to not only make bacteriophages in alkaline media more storable compared to neutral or acidic pHs (ie with lower activity losses ), but in the Al kaiischen range with a pH greater than 7.5 pH, z. B. in combination with polyhexanide, also have a much higher efficacy against the lysie- renden bacteria.
  • the bacteria are either killed by locally high concentrations of polyhexanide in the short term or inhibited by the polyhexanide at very low concentrations and then lysed by the bacteriophages.
  • the bactericidal success of bacteriophages depends on whether they find a suitable receptor on the bacterial surface.
  • the combination of bacteriophages with surfactants, enzymes, alcohols, cleaning agents such as alginates and low-frequency ultrasound has proven to be positive. These combination partners improve the possibility of penetration of both the antiseptic inhibitors and the bacteriophages to the bacterial or, in the case of low-frequency ultrasound, the achievement of their specific receptors by mechanical / mechano-acoustic action.
  • the bacteriophage Since antimicrobial substances in very low concentrations achieve an inhibitory effect but not a killing effect, the bacteriophage is enabled to use the inhibited bacterial cells for propagation and finally to lyse them.
  • a further improvement of the effect is obtained in that the bacteriophage is heated to an elevated temperature before or currency rend of coating, which is preferably in the range between 2O 0 C and 45 0 C.
  • bacteria in particular Colonization of the skin, mucosa, orifices, cavities or wounds and other inaccessible parts of the body, eg. B. antibiotic-resistant bacteria such as methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), drastically reduced.
  • MRSA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • a cationic surfactant is preferably used.
  • Other antiseptic substances, cleansing substances, alcohols and / or enzymes can also be used.
  • bacteriophage pool which has at least one species-specific bacteriophoric population with at least one polyvalent bacteriophage strain which acts specifically against the colonizing bacteria.
  • bacteriophages can be used as bacteriophage pool, which are effective against the respective different types of bacteria.
  • the bacteriophage populations preferably consist of non-genetically modified bacteriophages. Highly preferred are naturally occurring bacteriophages. On the other hand, of course, genetically modified bacteriophages can be used.
  • the "bacteriophage pool” can also be used to combine bacteriophage po- pulation, which is then effective against various bacterial species.
  • Iyctic bacteriophages Iyctic bacteriophages, lysogenic bacteriophages, which later turn into the lytic cycle, and non-lytic bacteriophages that produce substances that harm the bacteria are considered suitable for the bacteriophage pool.
  • Highly preferred are lytically active bacteriophages.
  • Bacteriophages can be obtained from hospital effluents in a manner known to those skilled in the art and tested for efficacy against at least one bacterial reference strain, preferably against one each from 5 to 20 bacterial reference strains with the dripping test and / or the plaque-forming unit test.
  • the preferably lytic bacteriophages are cultured in suitable bacteria, preferably the species Staphylococcus and Pseudomonas.
  • suitable bacteria preferably the species Staphylococcus and Pseudomonas.
  • the resulting lysates are further treated according to the known methods to make a bacteriophage pool
  • the lysates may be purified by known methods such as ultrafiltration and or ultracentrifugation to meet these requirements.
  • the bacteriophages or other dosage forms according to the invention can be packaged in ampoules or other containers.
  • the approximate bacteriophage titre of the package can be determined by determining the predilution suitable for lysing a certain number of bacteria of a test strain.
  • bacteriophage pools are prepared with at least 10 3 pfu, preferably 10 6 to 10 10 pfu, more preferably 10 7 to 10 9 pfu specific acting bacteriophages.
  • the bacteriophages are used in the context of Lysis tests with suitable reference strains of different bacterial species tested.
  • the bacteriophage pool is stabilized by combinations of buffering salts in the alkaline pH range, with pH values between 7.5 and 9.5 being possible, but preference is given to pH 8 to pH 9.5, more preferably pH 8.2 to pH -9.
  • the bacteriophage pool is used in conjunction with at least one surfactant.
  • Suitable surfactants include, but are not limited to, surfactants, alcohols, antiseptics and disinfectants, cleaning actives, enzymes, preservatives, low frequency ultrasound, and / or combinations thereof.
  • Suitable surfactants are preferably amphoteric surfactants such as sultaines or betaines.
  • betaines are preferably used with alkyl chains of 5 to 21 C atoms, preferably 10 to 15 C atoms, more preferably 11 to 13 C atoms. Strongly preferred are undecylenic acid amidopropyl betaine and cocamidopropyl betaine.
  • the surfactants are used for combination with bacteriophages in a concentration of 0.001 to 10.0 wt .-%, preferably 0.003 to 5.0 wt .-%, more preferably 0.005 to 2.0 wt .-%, more preferably 0.005 to 0.1 wt .-% added.
  • Suitable alcohols are water-soluble alcohols, preferably C 1 - to C 4 -alcohols. Highly preferred are ethanol, isopropanol and n-propanol. The alcohols are thereby added to the combination with bacteriophages in a concentration of 0.1 to 25.0 wt .-%, more preferably 1.0 to 10 wt .-%.
  • the suitable antiseptic, disinfectants and preservatives are preferred are particularly tissue-compatible substances, particular preference is given to biguanides, bisperidines, phenoxyethanol, quaternary ammonium compounds, tosylchloramide sodium and combinations thereof.
  • biguanides particularly preferred are polyhexamethyl biguanide (polyhexanide) and chlorhexidine.
  • bisperidines octenidine dihydrochloride is particularly preferred.
  • quaternary ammonium compounds particular preference is given to benzalkonium chloride.
  • the antiseptic, disinfectant and preservatives are added in the phage preparation in a concentration of 0.000001 to 1.0 wt .-%.
  • the biguanides are preferably used in a concentration of 0.000001 to 1.0% by weight, more preferably 0.000001 to 0.3% by weight.
  • the bisperidines are preferably used in a concentration of 0.01 to 5.0 wt .-%, more preferably 0.5 to 2.0 wt .-%.
  • Phenoxyethanol is preferably used in a concentration of 0.05 to 5.0 wt .-%, more preferably 0.5 to 2.0 wt .-%.
  • the quaternary ammonium compounds are preferably used in a concentration of 0.01 to 10% by weight, more preferably 0.05 to 1.0% by weight.
  • Tosylchloramid sodium (Ph Eur 4, "chloramine T") more preferably 0.001 to 1 wt .-%, preferably 0.01 to 0.5 wt .-% used.
  • enzymes and alginates are used as cleansing agents with the bacteriophage pool individually or jointly.
  • Preferred enzymes are the trypsin, the collagenases NB 1 and NB 4, the pancreatin as well as streptotase, urokinase and lipoxidase.
  • the enzymes are added to the bacteriophage pool in the following concentration: Lipoxidase, 0.01 to 1, 0 mg / ml, preferably 1, Omg / ml
  • Trypsin 0.2 to 4 mg / ml, preferably 2 mg / ml
  • Streptase 5,000 to 100,000 IU / ml, preferably 10,000 IU / ml
  • Pancreatin 0.5 to 5mg / ml preferably 2.5mg / ml
  • alginates can be added to the bacteriophage pool:
  • formulations described can be prepared by the known methods for the preparation of formulations which are used for application to surfaces as medical devices, preferably the skin and wounds.
  • Suitable application forms for the bacteriophage pool in conjunction with surface-active substances or low-frequency ultrasound are solutions, rinses, (wound) pads made of textile or plastics and gels or combinations thereof. Preference is given to sterile administration forms. The sterilization takes place here by the usual methods known to the person skilled in the art.
  • the suitable solutions are preferably aqueous solutions and may contain further active substances, in particular washing-active and antiseptic substances.
  • these solutions can be used specifically preventively for antiseptic disinfection of surfaces (e.g., in operating theaters or the intensive care unit of a clinic).
  • the suitable rinses are preferably aqueous solutions which may contain further active substances which are preferably suitable for disinfecting and which are well tolerated by the skin.
  • the rinses may contain buffered iso-osmotic solutions of appropriate pH and physiological salinity.
  • the appropriate (wound) pads can be made of textile, z. As conventional cotton gauze, or synthetic fiber materials or other swelling substances exist.
  • the suitable gels preferably include glycerol or polymers or a combination thereof.
  • the polymers are preferably derivatives of cellulose acetate, more preferably hydroxyalkyl cellulose acetate, in particular hydroxyethyl cellulose acetate and hydroxypropyl cellulose acetate, and polymers of acrylic acid, more preferably acrylic acid homopolymer which may be crosslinked with pentaerythritol allyl ether, sucrose allyl ether or propylene allyl ether (Carbomer ).
  • Suitable gels contain glycerol in a concentration of 1.0 to 10.0 wt .-%, preferably 5.0 to 8.0 wt .-% and / or polymers in a concentration of 0.1 to 10.0 wt .-%, preferably 2.0 to 6.0 wt .-%.
  • the bacterial phage preparations according to the invention in combination with surface-active substances are used for the production of a medicament for the therapeutic or preventive antibacterial application on the skin and mucous membrane, preferably in the nasopharynx and genitourinary area, in wound areas and in the area of the eye.
  • the formulations and uses of the invention are useful for eliminating bacteria such as strains of Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Pseudomonas, Enterobacter, coliforms, Klebsiella, Proteus, Listeria or Salmonella.
  • the formulations and methods are particularly suitable for the removal of antibiotic-resistant bacterial strains, preferably Staphylococcus and Pseudomonas, more preferably Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa.
  • the formulations and methods are particularly suitable for the removal of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA).
  • MRSA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • the formulations and methods for removing skin MRSA colonization preferentially serve at inaccessible sites, such as the nasopharynx or in wounds.
  • the required reference bacteriophages as well as the reference bacterial strains are taken from the strain collection.
  • a liquid sample from hospital effluents is admixed with CaCl 2 and MgCl 2 , filtered and then sterile-filtered.
  • the liquid sample is subjected to a pfu test.
  • the sterile-filtered sample is added to a log phase culture of methicillin-resistant Staphylococcus aureus which has been diluted with liquid nutrient medium.
  • the obtained phage suspensions are used in the pfu test against the bacterial strains E. coli ATCC 11229 and P. aeruginosa ATCC 15442. In this case, no lytic effect of the phage suspensions used against the control strains may be detected.
  • phage preparation from bacteriophage and surfactant pool solutions of pooled phage suspension with a final concentration of 10 7 bacteriophages / ml and 0.1 wt .-% undecylenic amidopropyl-betaine stabilized by an alkaline buffer, prepared and sterile filtered.
  • the phage preparation is tested for its effect on all relevant reference strains of Staphylococcus aureus in the pfu test. The full effectiveness of the pooled phage suspension against all relevant reference strains could be demonstrated.
  • the batch produced is tested for toxic and irritating irritations as well as for enterotoxins (a-g, h and i) as well as exfoliative toxins a and b, the toxin of Toxic shock syndrome and endotoxins.

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Abstract

Die Erfindung zeigt eine Bakteriophagenpräparation mit mindestens einem gegen mindestens einen Bakterienstamm spezifisch wirksamen Bakteriophagen in alkalischer Pufferlösung in Kombination mit mindestens einem oberflächenaktiven Mittel, das vorzugsweise ein im alkalischen Bereich zwischen pH 7,5 und pH 9,0 stabilisiertes Polyhexamethylbiguanid (Polyhexanid) ist. Weiter zeigt die Erfindung die Verwendung einer solchen Bakteriophagenpräparation zur Herstellung eines Arzneimittels, insbesondere für therapeutische, präventive und desinfizierende antibakterielle Anwendung. Schließlich zeigt die Erfindung ein Desinfektionsverfahren unter Verwendung der Bakteriophagenpräparation mit niederfrequentem Ultraschall.

Description

Bakteriophagenpräparation und Verwendung
Beschreibung
Die Erfindung betrifft eine Bakteriophagenpräparation gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruches 1 sowie verschiedene Verwendungen derselben.
Die EP 0 414 304 Bl beschreibt eine Bakteriophagenpräparation aus einer wässrigen Zusammensetzung von mindestens 100 Teilchen/ml einer zur Lyse eines oder mehrerer Typen von Bakterien fähigen Bakteri- ophagen, einem nichtionischen Tensid und einem neutralen Salz. Die Bakteriophagen haben die bekannte Wirkung, bestimmte gegen Antibiotika resistente Bakterien zu lysieren. Das Tensid als oberflächenaktive Substanz dient dazu, die Benetzung der zu behandelnden Oberfläche zu verbessern sowie Schmutz zu solubisieren und zu entfernen. Das neutrale Salz, primär 0,01 bis 2,0 Gewichts% Natriumchlorid, soll dabei die Lagerstabilität verbessern. Diese Zusammensetzung soll als Zahncreme, Mundwasser, Haushaltsreiniger gegen Haushaltsbakterien (z.B. in Toilettenschüsseln) und als Hautpflegemittel gegen pathogene Hautbakterien verwendet werden. Als mögliche weitere Zusatzstoffe werden phagenverträgli- che Duftstoffe, Aromen, Lösungsmittel, Farbstoffe, Konservierungsstoffe, Bakterizide, Adsorbentien, Füllstoffe und andere Additive vorgeschlagen, weiche gewöhnlich für eine bestimmte Anwendung verwen- det werden.
Weiterhin ist aus EP 0 700 249 Bl und DE 100 12 026 bekannt, dass Polyhexamethylbiguanid (Polyhexanid) als kationisches Tensid eine hohe, antiseptisch nutzbare Wirksamkeit bei gleichzeitig geringer To- xizität aufweist. Auf dieser Grundlage wurde im
Markt mit diesem Wirkstoff eine Vielzahl von Applikationen entwickelt, jedoch bereits in der EP 0 700 249 Bl wurde dargelegt, dass Polyhexanid gegenüber bestimmten Bakterien (speziell Pseudomonas aerugi- nosa) eine um nahezu Faktor 10 geringere Wirkung aufweist, im Vergleich z. B. zu Staphylococcus au- reus .
Auch ist bereits in EP 0 700 249 Bl ausführliche anhand von Beispielen beschrieben, dass z. B. bei der Anwendung von Polyhexanid in Wunden ein erheblicher Wirkungsverlust eintreten kann, der durch das dort vorhandene Albumin bedingt ist; eigene mikrobiologische Untersuchungen zur Albuminwirkung bestätigen einen Wirkungsverlust um den Faktor von ca. 10. Im Unterschied zu Polyhexanid zeigen aktuelle Untersuchungen [Vautz D. et al.: Lytische Wirksamkeit von MRSA- spezifischen Phagen gegenüber den 41 definierten nationalen Referenzstämmen sowie 143 klinischen MRSA- Isolaten. ZfW (2007) 5: 280- 287] , dass Albumin (Bovines Serum-Albumin, BSA) bei mit Bakteriophagen sogar eine Erhöhung der lyti- schen Aktivität um > 1 bis > 3 log-Stufen bei vergleichbaren E/T-Verhältnissen und Ausgangsbakterienkonzentrationen bewirkte. Die gram-negative Spezies Pseudomonas, besonders Pseudomonas aeruginosa, ist die Ursache für Infektionen bei Menschen und Tieren. Staphylokokken als gram-positive Bakterien besiedeln den Menschen in Abhängigkeit von der Beschaffenheit seiner Haut zu 20% bei gesunder Haut und bis zu 100% bei vorgeschädigter Haut wie z. B. atopischer Dermatitis oder insbesondere dem Vorliegen von Wunden. Weiterhin gehören Staphylokokken zu den häufigsten Erre- gern nosokomialer Infektionen.
Krankenhausinfektionen (nosokomialer Infektionen) machen einen Großteil aller im Hospital auftretenden Komplikationen aus und haben daher einen signifikanten Einfluss auf die Qualität der medizini- sehen und krankenpflegerischen Versorgung der Patienten. Die häufigsten Arten nosokomialer Infektionen auf der Intensivstation sind die beatmungs- assoziierte Pneumonie, intraabdominelle Infektionen nach einem Trauma oder nach chirurgischen Eingrif- fen und Bakteriämien durch intravasale Fremdkörper.
Das Vorkommen von Stämmen mit Resistenz gegenüber üblicherweise eingesetzten Antibiotika hat daher im Zusammenhang mit Pneumonien und Sepsis, dem Befall von Implantaten und von Wunden mit diesem Bakterium eine besondere Brisanz.
Bei Methicilin-resistenten Staphylococcus aureus
(MRSA) handelt es sich um den bedeutendsten Erreger nosokomialer Infektionen, dessen Häufigkeit seit dem ersten Auftreten im Jahr 1963 weltweit angestiegen ist und in Europa, einige Stämme auch weltweit, Verbreitung erfahren haben. In Deutschland gab es von 1995 bis 2001 einen Anstieg von -8% auf ~ 20% des Anteils von MRSA an allen S. -aureus-Isolaten. Dabei variiert die MRSA-Häufigkeit in Deutschland je nach Erhebung (EARSS; PEG; GENARS; SARI; KISS) und insbesondere bei verschiedenen Krankenhäusern sowie innerhalb eines Krankenhauses je nach Risikobereich von 0 bis 35%, in Einzelfällen bis zu 60 %. Intensivmedizinisch-chirurgische Stationen stehen dabei im Vordergrund und die höhere Mortalität durch MRSA- Infektionen ist belegt [Melzer M et al., Clin Infect Dis 2003; 37: 1453- 1460] . Weiterhin treten außerhalb der Krankenhäuser sog. Community acquired MRSA (cMRSA) auf, welche mit Pathogenitätseigenschaften wie nekrotisierenden Haut- Weichteilinfektionen und nekrotisierender Pneumonie assoziiert sind und sich vom Genotyp her grundsätzlich von den epidemischen nosokomialen MRSA unterscheiden. Seit den 1980er Jahren treten kontinuierlich klonale MRSA-Linien mit Resistenzen gegen Makrolide und Linko- samidine, Gentamicin und z. T. gegen Oxytetrazyklin auf. Nosokomial in Krankenhäusern verbreitete MRSA sind heute zu mehr als 90 % resistent gegen Fluorchi- nolone, so dass deren therapeutischer Einsatz die nicht-resistenten Staphylococcus aureus eliminiert und so einen Risikofaktor für die umfassende Besiedelung mit MRSA darstellt. Gegen Quinupristin/Dalfopristin waren 0,05% der untersuchten Isolate resistent. Während bisher alle vom NRZ für Staphylokokken aus Deutschland untersuchten MRSA gegen Linezolid empfind- lieh waren, ist auch für diesen Wirkstoff die Resistenzentwicklung absehbar. MRSA mit verminderter Empfindlichkeit gegen Glykopeptide (GISA) sind in Deutschland noch selten, ebenso Resistenzen gegen die möglichen Kombinationspartner der Glykopeptide (Rifam- picin) etwa 2%, Fusidinsäure-Natrium etwa 2,5%). Jedoch ist unter den Bedingungen des weiterhin anhaltenden Selektionsdrucks durch Glykopeptidantibiotika zu erwarten, dass sich auch MRSA mit Resistenzen gegenüber Glykopeptiden (GISA-Phänotyp) zunehmend verbrei- ten werden.
Weitere multiresistente Bakterienstämme, die an Krankenhausinfektionen beteiligt sind, sind Vancomycin- intermediär-sensible Staphylococcus aureus (VISA) - Stämme, Vancomycin-resistente Staphylococcus aureus (VRSA) -Stämme, Vancomycin/Glykopeptid-resistente Ente- rokokken (VRE, GRE) , Penicillin-resistente Pneumokokken sowie Mehrfach-resistente gramnegative Bakterien.
Neben der Infektionsbekämpfung solcher Bakterien durch Antibiotika zeigte sich innerhalb des letzten Jahrzehnts, dass es zur Prävention von Infektionen möglich und sinnvoll ist, die nicht erwünschte Bakterienflora mittels antiseptischer Präparate zu eliminieren, um einer Infektionserkrankung vorzubeugen. Diese Sanierung gesunder Bakterienträger spiegelte sich in den Begriffen Dekontamination oder Dekolonisation wieder. Hierzu kommen in der Praxis verschiedene antiseptische Wirkstoffe wie Biguanide, Bisperidine, Chlorhexidin, Benzalkoniumchlorid oder quaternäre Ammoniumverbindungen zum Einsatz.
Als potentielle Alternative sowohl zur antibiotischen MRSA-Therapie als auch zur antiseptischen Dekontamina- tion von MRSA-Trägern sind Bakteriophagen bekannt. Deren lytisches Phänomen wurde erstmals 1915 von Twort und unabhängig davon 1917 von d1 Herelle beschrieben. Durch Fortschritte in der Molekulargenetik konnten Bakteriophagen als Viren identifiziert werden. Diese infizieren spezifisch jeweils nur eine Bakterienspezies durch Injektion ihrer DNA in die Bakterienzelle. Dann stellen sie den bakteriellen Stoffwechsel vollständig auf die intrazelluläre Neusynthese von bis zu 200 neuen Phagen um und setzen diese nächste Generati- on während des Zerfalls der Bakterienzelle frei. Bei ca. 1 Promille der Bakterienzellen wird die DNA des Phagen nur in das Bakteriengenom integriert (temperen- te Phagen) , im Rahmen der bakteriellen Teilung mit vererbt und nur unter besonderen Umweltbedingungen wieder virulent. Gegenüber Staphylococcus aureus wurde die Phagenthera- pie erstmals 1921 [Bruynoghe R & Maisin J, La Presse Medicale 1921, 1195-1193] eingesetzt, wobei infizierte chirurgische Wunden innerhalb von 48 Stunden abheil- ten. In den nachfolgenden Weltkriegsjähren wurden mangels Antibiotika oder aufgrund von Sulfonamidresisten- zen bei postoperativen Wundinfektionen Bakteriophagen eingesetzt. Über spontane bakterielle Resistenzen unter Phagentherapie wurde erstmals 1943 berichtet (Lu- ria SE & Delbrück M, Genetics 1943, 28, 491-511) . Aus der Hochzeit der Antibiotikatherapie zwischen 1966 und 1996 liegen nur ca. 30 Veröffentlichungen zur Phagentherapie vor, insbesondere aus Osteuropa; Phagen wurden in Notfall-Resistenzsituationen sowie bei der Therapie und Prophylaxe postoperativer Wundinfektionen eingesetzt. Neuere Untersuchungen mit Staphylococcus aureus infizierten Mäusen belegten wiederholt im Tierversuch die Wirksamkeit der Phagentherapie (Matsuzaki et al., Journal of Infectious Diseases 2003, 187, 613- 624) .
Probleme beim Einsatz der Phagentherapie als Antibiotikaersatz ergeben sich vor allem durch die geringe Stabilität von Bakteriophagen im Körper, da diese in kurzer Zeit durch Makrophagen als Fremdkörper besei- tigt werden.
Derzeit werden zwei grundsätzlich unterschiedliche Ansätze zur Phagentherapie verfolgt: Einerseits wird versucht mittels gentechnischer Veränderungen wirksamere, möglichst omnipotent wirksame Phagentypen zu schaffen (Merril CR et al., Nature Reviews Drug Discovery 2003, 2, 489-497; Krylov VN, Russian Journal of Genetics 2001, 37, 715-730; Broxmeyer L et al . , Journal of Infectious Deseases 2002, 186, 1155-1160) . Im Gegensatz dazu steht der "klassische Therapieansatz", mit aus der Umwelt isolierten, natürlich vorkommenden Phagen, welche als Mischungen gegenüber verschiedenen Bakterienisolaten einer Spezies oder gegenüber verschiedenen Bakterienspezies wirksam sind (Barrow PA & Soothill JS, Trends in Mircobiology 1997, 5, 268-271; Soothill JS, Journal of Medical Microbiology 1992, 37, 258-261) .
In US 2002/0001590 Al werden ausgewählte Bakteriophagen der Familie Myoviridae, speziell der Spezies Twort beschrieben, die wirksam MRSA-Stämme inhibieren oder abtöten können. Die Phagen werden in wässriger Lösung oder einem Puffer oder in einer Polymermatrix eingesetzt .
Einer weiteren Untersuchung [Vautz D. et al . : Lyti- sche Wirksamkeit von MRSA-spezifischen Phagen gegenüber den 41 definierten nationalen Referenzstäm- men sowie 143 klinischen MRSA- Isolaten. ZfW (2007) 5: 280-287] lag die Fragestellung zugrunde, in welchem qualitativen Ausmaß spezifisch wirksame Phagen gegenüber dem Kollektiv aller im deutschen Nationalen Referenzzentrum des Robert Koch Instituts in Wernigerode für Staphylokokken vorhandenen 41 MRSA existierten. Bei den Phagen handelte es sich ausschließlich um Mischungen von natürlichen, d. h. gentechnisch unverändert vorkommenden Viren. Es wurden dabei Phagenlösun- gen gefunden, die spezifisch gegen alle 41 MRSA Stämme wirksam waren.
Die Problematik nosokomialer Infektionen betrifft auch Klinikpersonal, das, ohne selbst erkrankt zu sein, Träger und damit Verbreiter von Bakterien ist. Weiter betrifft diese Problematik auch medizinische Geräte und Einrichtungsgegenstände, die mit Bakterien besiedelt sein können einschließlich multiresistenter Stämme. Dies kann auch das gesamte Klinikgebäude betreffen.
Primäres Ziel der Erfindung ist es daher, eine Bakte- riophagenpräparation bereitzustellen, die gegen minde- stens einen Bakterienstamm, vorzugsweise gegen alle bekannten multiresistenten Bakterienstämme, hochwirk- sam ist, eine gute Lagerfähigkeit besitzt und sich gut über zu behandelnde Oberflächen verteilen läßt, ein- schließlich an schwer zugänglichen Stellen.
Dieses Ziel wird durch eine Bakteriophagenpräparation gemäß Anspruch 1 erreicht. Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen dieser Bakteriophagenpräparation sind in den Unteransprüchen beschrieben.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, eine Bakteriophagenpräparation zur Herstellung eines Arzneimittels für die therapeutische oder präventive antibakterielle Anwendung bereitzustellen, das insbesondere zur Anwendung in Wunden und Wundbereichen, im Nasen-Rachenraum, im Haut- und Schleimheutbereich, Urogenitalbereich und im Bereich des Auges anwendbar ist.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein für anti- bakterielle Anwendungen geeignetes Desinfektionsmittel bereitzustellen, das beispielsweise zur Desinfizierung der Hände von Ärzten und Klinikpersonal, aber auch zur Desinfizierung von Gegenständen geeignet ist.
Diese Ziele werden durch die in den Patentansprüchen 12 bis 20 angegebenen Merkmale gelöst.
Die Funktion des oberflächenaktiven Stoffes ist es, einerseits das Ein- bzw. Vordringen der Bakteriophagen zu den Bakterien auf der Haut, in Wunden oder sonstigen auch unzugänglichen Körperstelle und -höhlen (z. B. Nasen-Rachen-, Urogenital -Raum) zu ermöglichen bzw. zu beschleunigen sowie an unzu- gänglichen Oberflächen, wie z.B. rauhen Oberflächen oder engen Spalten. Damit wird eine drastische und gegenüber dem Stand der Technik effektivere Reduktion der Bakterien erreicht. Als oberflächenaktives Mittel hat sich besonders ein kationisches Tensid, wie Polyhexanid, gezeigt.
Eine gute Lagerfähigkeit und eine Steigerung der Wirksamkeit wird durch die im Anspruch 1 angegebene alkalische Pufferlösung erreicht, wobei sich gezeigt hat, daß Bakteriophagen in alkalischem MiI- lieu im Vergleich zu neutralen oder sauren pH- Werten nicht nur besser lagerungsfähig sind (d.h. mit geringeren Aktivitätsverlusten) , sondern im al- kaiischen Bereich mit einem pH-Wert größer 7,5 pH, z. B. in Kombination mit Polyhexanid, auch eine wesentlich höhere Wirksamkeit gegenüber den zu lysie- renden Bakterien aufweisen.
Sehr geringe Polyhexanid-Konzentrationen wirken ge- genüber Bakterien nur hemmend, töten diese jedoch nicht ab. Andererseits werden Bakteriophagen bei diesen Polyhexanid-Konzentrationen nicht zerstört und auch ihn ihrer Wirksamkeit nicht behindert, so dass die durch Polyhexanid gehemmten Bakterien durch die Bakteriophagen weiterhin unbeeinträchtigt lysiert werden können.
In der Anwendungspraxis werden die Bakterien somit entweder durch lokal hohe Konzentrationen vom Polyhexanid kurzfristig abgetötet oder bei sehr gerin- gen Konzentrationen durch das Polyhexanid gehemmt und dann von den Bakteriophagen lysiert.
Der bakterizide Erfolg der Bakteriophagen hängt davon ab, ob diese einen passenden Rezeptor auf der Bakterienoberfläche finden. Dabei hat sich die Kom- bination der Bakteriophagen mit Tensiden, Enzymen, Alkoholen, reinigenden Stoffen wie Alginaten und niederfrequentem Ultraschall als positiv erwiesen. Diese Kombinationspartner verbessern die Möglichkeit des Vordringens sowohl der antiseptischen Hemmstoffe als auch der Bakteriophagen zu den Bak- terien bzw. - im Falle niederfrequenten Ultraschalls - das Erreichen deren spezifischen Rezeptoren durch mechanische / mechano-akustische Einwirkung.
Da antimikrobielle Stoffe in sehr geringen Konzentrationen eine Hemmwirkung jedoch keine Abtötungs- wirkung erreichen, wird den Bakteriophagen ermöglicht, die gehemmten Bakterienzellen zur Vermehrung zu nutzen und diese abschließend zu lysieren.
Weiterhin bewirkt die Kombination von Bakteriophagen mit antimikrobiell wirkenden chemischen Substanzen bereits in gegenüber dem Stand der Technik wesentlich geringeren Konzentrationsbereich (der Hemmwirkung) , dass die bekannten Wirkungslücken antimikobieller che- mischer Stoffe durch Bakteriophagen geschlossen werden.
Weiter läßt sich feststellen, daß bei der Desinfektion eine wesentliche Wirkungsverbesserung auftritt, wenn die Bakteriophagenpräparation mit niederfrequentem Ul- traschall aufgebracht wird, der vorzugsweise im Frequenzbereich kleiner 120 kHz liegt und eine Leistung im Bereich von 0,05 bis 1,5 W/cm2 hat. Hierdurch erreicht man eine bessere Verteilung der Bakteriophagenpräparation über die zu desinfizierende Oberfläche und ein Lösen von Schmutzpartikeln, so daß die Bakteriophagen besseren Zugang zu den zu bekämpfenden Bakterien haben.
Eine weitere Verbesserung der Wirkung erhält man dadurch, daß die Bakteriophagenpräparation vor oder wäh- rend des Auftragens auf eine erhöhte Temperatur erwärmt wird, die vorzugsweise im Bereich zwischen 2O0C und 450C liegt.
Mit der vorliegenden Erfindung werden somit Besiedelungen oder Infektionen durch Bakterien, insbesondere Besiedlungen der Haut, Schleimhaut, Körperöffnungen, - höhlen oder von Wunden sowie anderen unzugänglichen Körperstellen, z. B. mit Antibiotika resistenten Bakterien wie insbesondere Methicillin-resistente Staphy- lococcus aureus (MRSA) , drastisch reduziert.
Als oberflächenwirksame Substanz wird bevorzugt ein kationisches Tensid verwendet. Auch sonstige antiseptisch wirkende Substanzen, reinigende Substanzen, Alkohole und/oder Enzyme können verwendet werden.
Bevorzugt wird ein "Bakteriophagenpool" verwendet, der dabei mindestens eine speziesspezifische Bakteriopha- genpopulation mit mindestens einem polyvalenten Bakte- riophagenstamm, welche spezifisch gegen die besiedelnden Bakterien wirkt .
Gegenüber Besiedelungen mit verschiedenen Bakterienarten können Mischungen aus Bakteriophagen als Bakteriophagenpool zur Anwendung kommen, welche gegenüber den jeweiligen verschiedenen Bakterienarten wirksam sind.
Die Bakteriophagenpopulationen bestehen bevorzugt aus nicht gentechnologisch veränderten Bakteriophagen. Stark bevorzugt sind natürlich vorkommende Bakteriophagen. Andererseits können natürlich auch gentechnologisch modifizierte Bakteriophagen eingesetzt werden.
Im "Bakteriophagenpool" können auch Bakteriophagenpo- pulation kombiniert werden, welche dann gegenüber verschiedenen Bakterienspezies wirksam sind.
Als für den "Bakteriophagenpool" geeignet gelten Iy- tisch wirksame Bakteriophagen, lysogene Bakeriophagen, die zu einem späteren Zeitpunkt in den lytischen Zy- klus übergehen, sowie nicht lytische Bakteriophagen, die Stoffe produzieren, die den Bakterien schaden. Stark bevorzugt sind lytisch wirksame Bakteriophagen. Bakteriophagen können aus Klinikabwässern auf dem Fachmann bekannte Weise gewonnen und gegen mindestens einen Bakterienreferenzstamm, bevorzugt gegen je einen von 5 bis 20 Bakterienreferenzstämmen mit dem Tropftest und/oder dem Plaque- Forming-Unit -Test auf Wirksamkeit untersucht werden.
Bevorzugt sind polyvalente Bakteriophagen, welche gegenüber verschiedenen Isolaten einer Spezies wirksam sind.
Die vorzugsweise lytisch wirksamen Bakteriophagen werden in geeigneten Bakterien, vorzugsweise der Spezies Staphylococcus und Pseudomonas kultiviert. Die resultierenden Lysate werden nach den bekannten Methoden weiter behandelt, um daraus einen Bakteri- ophagenpool
herzustellen. Dieser sollen keine lebenden Organismen, Toxine oder Bruchstücke der Bakterienzellwände mehr enthalten. Beispielsweise können die Lysate durch bekannte Verfahren wie Ultrafiltration und oder Ultrazentrifugation gereinigt werden, um diese Anforderungen zu erfüllen.
Die Bakteriophagen oder weitere erfindungsgemäße Darreichungsformen können in Ampullen oder anderen Gebinden verpackt werden. Der ungefähre Bakteri- ophagentiter des Gebindes kann durch Bestimmung der Vorverdünnung ermittelt werden, die geeignet ist, eine bestimmte Anzahl von Bakterien eines Test- Stamms zu lysieren. In einer Ausführungsform der Erfindung werden Bakteriophagenpools mit mindestens 103 pfu, bevorzugt 106 bis 1010 pfu, stark bevorzugt 107 bis 109 pfu spezifisch wirkende Bakteriophagen hergestellt .
Zur Bestimmung der Spezies-Spezifität der Bakteriophagenpools werden die Bakteriophagen im Rahmen von Lysetests mit geeigneten Referenzstämmen unterschiedlicher Bakterienspezies getestet.
Der Bakteriophagenpool wird durch Kombinationen puffernder Salze im alkalischen pH-Bereich stabilisiert, wobei pH-Werte zwischen 7,5 und 9,5 möglich sind, bevorzugt werden jedoch pH-8 bis pH-9, 5 stark bevorzugt pH-8,2 bis pH-9.
Der Bakteriophagenpool wird in Verbindung mit mindestens einer oberflächenaktiven Substanz eingesetzt. Geeignete oberflächenaktive Substanzen umfassen unter anderem Tenside, Alkohole, antiseptische und Desinfektions-Wirkstoffe, Reinigungswirkstoffe, Enzyme, Konservierungsstoffe, niederfrequente Ultraschallanwendung und / oder Kombinationen davon.
Geeignete Tenside sind bevorzugt amphotere Tenside wie Sultaine oder Betaine. Dabei finden bevorzugt Betaine Verwendung mit Alkylketten aus 5 bis 21 C- Atomen, bevorzugt 10 bis 15 C-Atomen, weiter bevorzugt 11 bis 13 C-Atomen. Stark bevorzugt sind Unde- cylensäureamidopropyl-Betain und Cocamidopropyl- Betain. Die Tenside werden dabei zur Kombination mit Bakteriophagen eingesetzt als in einer Konzentration von 0.001 bis 10.0 Gew.-%, bevorzugt 0.003 bis 5.0 Gew.-%, weiter bevorzugt 0.005 bis 2.0 Gew.-%, stark bevorzugt 0.005 bis 0.1 Gew.-% zugesetzt .
Geeignete Alkohole sind wasserlösliche Alkohole, bevorzugt Cl bis C4 -Alkohole. Stark bevorzugt sind Ethanol, iso-Propanol und n-Propanol. Die Alkohole werden dabei zur Kombination mit Bakteriophagen in einer Konzentration von 0.1 bis 25.0 Gew.-%, stark bevorzugt 1.0 bis 10 Gew.-% zugesetzt.
Bei den geeigneten antiseptischen, Desinfektions- Mitteln sowie Konservierungsstoffen handelt es sich bevorzugt um besonders gewebeverträgliche Substanzen, besonders bevorzugt sind Biguanide, Bisperidi- ne, Phenoxyεthanol, quaternäre Ammoniumverbindungen, Tosylchloramid-Natrium und Kombinationen da- von. Von den Biguaniden sind besonders bevorzugt Polyhexamethylbiguanid (Polyhexanid) und Chlorhexidin. Von den Bisperidinen ist besonders bevorzugt Octenidindihydrochlorid. Von den quaternären Ammoniumverbindungen ist besonders bevorzugt Benzalko- niumchlorid.
Die antiseptischen, Desinfektions-Mittel sowie Konservierungsstoffe werden bei der Phagenpräparation in einer Konzentration von 0.000001 bis 1.0 Gew.-% zugesetzt. Dabei werden die Biguanide bevorzugt in einer Konzentration von 0.000001 bis 1.0 Gew.-%, weiter bevorzugt 0.000001 bis 0.3 Gew-% eingesetzt. Die Bisperidine werden bevorzugt in einer Konzentration von 0.01 bis 5.0 Gew.-%, weiter bevorzugt 0.5 bis 2.0 Gew.-% eingesetzt. Phenoxyethanol wird bevorzugt in einer Konzentration von 0.05 bis 5.0 Gew.-%, weiter bevorzugt 0.5 bis 2.0 Gew.-% eingesetzt. Die quaternären Ammoniumverbindungen werden bevorzugt in einer Konzentration von 0.01 bis 10 Gew.-%, weiter bevorzugt 0.05 bis 1.0 Gew.-% einge- setzt. Tosylchloramid-Natrium (Ph Eur 4, "Chloramin T") weiter bevorzugt 0,001 bis 1 Gew.-%, bevorzugt 0.01 bis 0,5 Gew.-% eingesetzt.
Speziell bei der Wundbehandlung kommen Enzyme und Alginate als Reinigungswirkstoffe mit dem Bakteri- ophagenpool einzeln oder gemeinsam zur Anwendung.
Bevorzugte Enzyme sind das Trypsin, die Collagenasen NB 1 und NB 4, das Pancreatin sowie Strep- tase, Urokinase und Lipoxidase. Die Enzyme werden dem Bakteriophagenpool in folgenden Konzentration zugesetzt: - Lipoxidase, 0,01 bis l,0mg/ml, bevorzugt 1, Omg/ml
Trypsin, 0,2 bis 4mg/ml, bevorzugt 2mg/ml
- Streptase, 5.000 bis 100.000 IU/ml , bevorzugt 10.000 IU/ml
- Urokinase, 5.000 IU/ml
- NB lCollagenase, 1 bis 10 PZU/ml, bevorzugt 6 PZU/ml
- NB 4 Collagenase, 1 bis 10 PZU/ml, bevorzugt 6 PZU/ml
Pancreatin, 0,5 bis 5mg/ml bevorzugt 2,5mg/ml
Folgende Alginate können dem Bakteriophagenpool zugesetzt werden:
Natrium-Alginate - Natrium-Calzium-Alginate CaIzium-Alginate
Die beschriebenen Formulierungen können mit den bekannten Methoden zur Herstellung von Formulierungen hergestellt werden, die zur Anwendung auf Oberflä- chen als Medizinprodukte, bevorzugt der Haut und auf Wunden eingesetzt werden.
Niederfrequenter Ultraschall im Frequenzbereich < 12OkHz, bevorzugt 30-10OkHz, mit Leistungen zwischen 0,05 - 1,5 W/cm2 zeigte bei der Anwendung auf der Haut, Schleimhaut und Wunde additive und z. T. synergistische Wirkungseffekte in der Kombination mit Bakteriophagen und / oder Polyhexanid.
Die Applikation von therapeutischem Ultraschall von 0,8-3 MHz sub-aqualer Anwendung zur Stimulation der Wundheilung ist in der Literatur vielfach beschrieben [Radandt, R. R.: Niederfrequenter Ultraschall in der Wundheilung. Phys Med Rehab Kuror. Thieme Ver- lag Stuttgart / New York, ISSN 0940-6689 (2001) 11: 41-50] . Hieraus ist bekannt, dass Ultraschall z. B. den Wundheilungsprozess auf drei Ebenen beein- flusst, den der mechanischen Einwirkung auf die Ge- webeoberflache, er hat eine mechano-akustische Einwirkung auf dort siedelnde Mikroorganismen und zeigt thermische und nicht-thermische Effekte in tieferen Gewebeschichten.
Speziell wurde die Wirkung von Ultraschall zwischen 70 kHz und 10 MHz auf die Abtötung von Bakterien P. aeruginosa in Biofilmen in Kombination mit einem Antibiotikum (Gentamicin) in vitro untersucht [Qian Z, Sagers RD, Pitt WG. The effect of ultrasonic frequency upon enhanced killing of P. aeruginosa biofilms. Ann Biomed Eng 1997; 25,1: 69-76] . Dabei zeigte sich als Ergebnis, dass die Ultraschallbehandlung allein keine signifikante Reduktion der Mikroorganismen bewirkte. Bei der Kombination von Ultraschall und Antibiotikum wurde jedoch bei allen Frequenzen eine signifikante Wirkungssteigerung gegenüber der Kontrollgruppe (nur Antibiotikum) nachgewiesen: Es bestand eine eindeutige Korrelation zur Ultraschallfrequenz, wobei unter 70 kHz einer Wirkungssteigerung > 250% gefunden wurde ("bioaku- stischer Effekt").
Folgende Anwendungen niederfrequenten Ultraschalls können mit dem Bakteriophagenpool kombiniert werden:
Frequenzbereich < 120 kHz mit Leistungen 0,05 - 1,5 W/cm2 - Frequenzbereich < 100 kHz mit Leistungen 0,05 - 1,5 W/cm2
Frequenzbereich < 70 kHz mit Leistungen 0,05 - 1,0 W/cm2
Geeignete Applikationsformen für den Bakteriophagen- pool in Verbindung mit oberflächenaktiven Substanzen bzw. niederfrequentem Ultraschall sind dabei Lösungen, Spülungen, (Wund-) Auflagen aus Textil oder Kunststoffen sowie Gele oder Kombinationen davon. Bevorzugt sind sterile Applikationsformen. Die Ste- rilisierung erfolgt hierbei über die üblichen dem Fachmann bekannten Methoden.
Die geeigneten Lösungen sind bevorzugt wässrige Lösungen und können weitere aktive Substanzen, insbesondere waschaktive und antiseptische Substanzen enthalten. Bevorzugt können diese Lösungen spezifisch präventiv zur antiseptischen Desinfektion von Oberflächen (z.B. in Operationssälen oder der Intensivstation einer Klinik) eingesetzt werden.
Die geeigneten Spülungen sind bevorzugt wässrige Lösungen, die weitere aktive, bevorzugt zur Desinfektion geeignete, auf der Haut gut verträgliche Substanzen enthalten können. Zudem können die Spülungen gepufferte iso-osmotische Lösungen mit geeignetem pH-Wert und physiologischem Salzgehalt enthalten.
Die geeignete (Wund-) Auflagen können aus Textil, z. B. herkömmliche Baumwollgaze, oder Kunstfasermaterialien oder anderen Quellstoffen bestehen.
Die geeigneten Gele beinhalten bevorzugt Glyzerin oder Polymere oder eine Kombination davon. Die Polymere sind bevorzugt Derivate von Celluloseacetat , weiter bevorzugt Hydroxyalkylcelluloseacetat , insbesondere Hydroxyethylcelluloseacetat und Hydroxy- propylcelluloseacetat , sowie Polymere von Acrylsäu- re , weiter bevorzugt Acrylsäure-Homopolymer, das vernetzt sein kann mit Pentaerythritol-Allylether, Saccharose-Allylether oder Propylen-Allylether (Carbomer) . Geeigneten Gele enthalten Glyzerin in einer Konzentration von 1.0 bis 10.0 Gew.-%, bevorzugt 5.0 bis 8.0 Gew.-% und/oder Polymere in einer Konzentration von 0.1 bis 10.0 Gew.-%, bevorzugt 2.0 bis 6.0 Gew.-%.
Die erfindungsgemäßen Bakteriephagenpräparationen in Kombination mit oberflächenaktiven Substanzen finden Verwendung für die Herstellung eines Arzneimittels für die therapeutische oder präventive an- tibakterielle Anwendung auf der Haut und Schleimhaut, bevorzugt im Nasen-Rachen-Raum und im Urogenitalbereich, in Wundbereichen und im Bereich des Auges .
Die Formulierungen und Verwendungen der Erfindung sind geeignet zur Beseitigung von Bakterien, wie zum Beispiel Stämme von Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Pseudomonas, Enterobacter, koliforme Keime, Klebsiella, Proteus, Listeria oder Salmonella. Die Formulierungen und Verfahren sind besonders geeignet zur Beseitigung von antibiotika- resistenten Bakterienstämmen bevorzugt von Staphy- locccus und Pseudomonas, besonders bevorzugt von Staphyloccus aureus und von Pseudomonas aeruginosa. Die Formulierungen und Verfahren sind besonders stark geeignet zur Beseitigung von Methicillin- resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) . In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung dienen die Formulierungen und Verfahren zur Entfernung von MRSA-Besiedelungen der Haut bevorzugt an unzugäng- liehen Stellen, wie dem Nasen-Rachen-Raum oder in Wunden.
Die beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung werden durch das folgende Beispiel näher beschrieben. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf dieses Beispiel beschränkt. Be i spie l
zur Herstellung einer Präparation aus Bakteriophagen (hier: wirksam gegenüber Staphylococcus aureus) und (hier: einem) oberflächenaktiven Stoff:
1. Bakteriophagenisolation und -Vermehrung
Die erforderlichen Referenz -Bakteriophagen sowie die Referenz-Bakterienstämme werden der Stammsammlung entnommen.
Zur Gewinnung neuer Bakteriophagen kann eine flüs- sige Probe aus Klinikabwässern wird mit CaCl2 und MgCl2 versetzt, filtriert und anschließend sterilfiltriert. Zum Nachweis von spezifisch gegen Staphylococcus aureus lytisch wirksamen Bakteriophagen wird die flüssige Probe einem pfu-Test un- terzogen. Hierzu wird die sterilfiltrierte Probe zu jeweils einer mit Flüssignährmedium verdünnten Logphasenkultur von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus gegeben.
Zur Vermehrung der gegenüber Staphylococcus aureus spezifischen Phagen wird den Bakteriophagen in einem Schüttelerlenmeyerkolben frische Bakterienkultur des jeweiligen Referenzstammes in der Log-Phase zugeführt. Um eine Resistenzbildung zu verhindern, wird die geklärte Suspension anschließend zentrifu- giert und das Supernat sterilfiltriert. Der Vermehrungsschritt wird so lange wiederholt, bis eine Konzentration von 1010 Phagen/ml im pfu-Test erreicht ist.
Diese Vorgehensweise wir mit allen Stämmen von Staphylococcus aureus und deren jeweils spezifischen Phagen wiederholt, bis in der Mischung alle relevanten Bakteriophagen (Bakteriophagenpool) in der Konzentration von 1010/ml im pfu-Test nachweisbar sind.
2. Nachweis der Wirkspezifität
Zum Nachweis der Spezies-Spezifität werden die er- haltenen Phagensuspensionen im pfu-Test gegen die Bakterienstämme E. coli ATCC 11229 und P. aeruginosa ATCC 15442 eingesetzt. Dabei darf keine lytische Wirkung der eingesetzten Phagensuspensionen gegenüber den Kontrollstämmen nachgewiesen werden.
3. Herstellung der Präparation (Phagenpräparation)
Zur Herstellung der Phagenpräparation aus Bakteri- ophagenpool und oberflächenaktiven Stoff werden Lösungen aus gepoolter Phagensuspension mit einer Endkonzentration von 107 Bakteriophagen/ml und 0.1 Gew.-% Undecylensäureamidopropyl-Betain durch einen alkalischen Puffert stabilisiert, angesetzt und sterilfiltriert.
4. Konzentration der Bakteriophagen in der Präparation
Die Phagenpräparation wird auf deren Wirkung bezüglich aller relevanten Referenzstämme von Staphylo- coccus aureus im pfu-Test geprüft. Dabei konnte die volle Wirksamkeit der gepoolten Phagensuspension gegen alle relevanten Referenzstämme nachgewiesen werden.
5. Nebenwirkungsstudien
Die hergestellte Charge wird auf toxische und irri- tativen Reizungen ebenso untersucht wie hinsichtlich Enterotoxinen (a-g, h und i) sowie exfolanti- ven Toxinen a und b, dem Toxin des Toxicschock- Syndroms sowie Endotoxinen.

Claims

Patentansprüche
1. Bakteriophagenpräparation zur Behandlung von durch Bakterien verursachte Besiedelungen (Kon- taminationen, Kolonisationen, Infektionen und Infektionserkrankungen) ,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Präparation mindestens einen gegen mindestens einen Bakterienstamm spezifisch wirksamen Bakteriophagen in alkalischer Pufferlösung in Kombination mit mindestens einem oberflächenaktiven Mittel aufweist.
2. Bakteriophagenpräparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Bakteriophage lytisch gegenüber mindestens ein Bakterium ausgewählt aus Staphylococcus spezies, Pseudomonas spezies, Streptococcus spezies, Enterococcus spezies, Enterobacter spezies, Klebsiella spezies, Proteus Spezies, Listeria spezies und Salmonella spezies wirksam ist.
3. Bakteriophagenpräparation nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das oberflächenaktive Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus anionischen oder kationischen Tensiden, Alkoholen, Enzymen, Alginaten Desinfektionsmitteln, antiseptischen oder Konservierungsstoffen oder Kombinationen davon .
4. Bakteriophagenpräparation nach Anspruch 3, da- durch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive Mittel Polyhexamethylbiguanid (Polyhexanid) ist.
5. Bakteriophagenpräparation nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der Bak- teriophagenpräparation durch mindestens ein pufferndes Salz auf einen alkalischen Bereich zwischen pH 7 , 5 und pH 9,0 stabilisiert ist.
6. Bakteriophagenpräparation nach einem der vorangegangen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine oberflächenaktive Mittel in einer Konzentration von 0.000001 bis 20.0 Gew.-% bezogen auf die gesamte Bakteriophagenpräparation vorliegt.
7. Bakteriophagenpräparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Präparation als Lösung oder Suspension vorliegt.
8. Bakteriophagenpräparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Präparation in Gelform vorliegt.
9. Bakteriophagenpräparation nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Präparation GIy- zerin oder ein Polymer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Derivaten von Celluloseacetat und Polymeren von Acrylsäure aufweist.
10. Bakteriophagenpräparation nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass Glyzerin in einer Konzentration von 1.0 bis 10.0 Gew.-%, bezogen auf den gesamte Bakteriophagenpool vorliegt.
11. Bakteriophagenpräparation nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer in einer Konzentration von 0.1 bis 10.0 Gew.-%, bezogen auf den gesamte Bakteriophagenpool vorliegt.
12. Bakteriophagenpräparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Präparation in Textilfaser oder Kunstfaser, oder als Quellstoff vorliegt.
13. Verwendung einer Bakteriophagenpräparation nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Herstel- lung eines Arzneimittels für die therapeutische oder präventive antibakterielle Anwendung.
14. Verwendung nach Anspruch 13 zur Anwendung in Wunden und Wundbereichen.
15. Verwendung nach Anspruch 13 zur Anwendung im Nasen-Rachen-Raum.
16. Verwendung nach Anspruch 13 zur Anwendung im Haut- und Schleimhautbereich.
17. Verwendung nach Anspruch 13 zur Anwendung im Urogenitalbereich.
18. Verwendung nach Anspruch 13 zur Anwendung im Bereich des Auges.
19. Verwendung einer Bakteriophagenpräparation nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Herstellung eines Desinfektionsmittels für antibakte- rielle Anwendungen.
20. Desinfektionsverfahren gekennzeichnet durch Auftragen der Bakteriophagenpräparation nach einem der Ansprüche 1-11 mit niederfrequentem Ultraschall mit einem Frequenzbereich < 120 kHz und einer Leistungen von 0,05 - 1,5 W/cm2.
21. Desinfektionsverfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakteriophagenpräparation vor dem Auftragen auf eine Temperatur zwischen 22°C und 45°C erwärmt wird.
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