EP3140280A1 - Derives de 4-vinyl-2cyclopentene-1-one leur preparation et leur utilisation en tant qu'agent antibiotique - Google Patents

Derives de 4-vinyl-2cyclopentene-1-one leur preparation et leur utilisation en tant qu'agent antibiotique

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EP3140280A1
EP3140280A1 EP15721221.8A EP15721221A EP3140280A1 EP 3140280 A1 EP3140280 A1 EP 3140280A1 EP 15721221 A EP15721221 A EP 15721221A EP 3140280 A1 EP3140280 A1 EP 3140280A1
Authority
EP
European Patent Office
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compound
formula
antibiotic agent
ppm
hydrogen atom
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP15721221.8A
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German (de)
English (en)
Inventor
Jamal Ouazzani
Emilie ADELIN
Géraldine LE GOFF
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
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    • C07C69/66—Esters of carboxylic acids having esterified carboxylic groups bound to acyclic carbon atoms and having any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, acyloxy, groups, groups, or in the acid moiety
    • C07C69/73—Esters of carboxylic acids having esterified carboxylic groups bound to acyclic carbon atoms and having any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, acyloxy, groups, groups, or in the acid moiety of unsaturated acids
    • C07C69/738—Esters of keto-carboxylic acids or aldehydo-carboxylic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C45/00—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds
    • C07C45/56—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds from heterocyclic compounds
    • C07C45/57—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds from heterocyclic compounds with oxygen as the only heteroatom
    • C07C45/59—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds from heterocyclic compounds with oxygen as the only heteroatom in five-membered rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
    • C07C67/475—Preparation of carboxylic acid esters by splitting of carbon-to-carbon bonds and redistribution, e.g. disproportionation or migration of groups between different molecules
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
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    • C12P5/007—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons containing one or more isoprene units, i.e. terpenes
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26—Ketones
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
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    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/06—Systems containing only non-condensed rings with a five-membered ring
    • C07C2601/10—Systems containing only non-condensed rings with a five-membered ring the ring being unsaturated

Definitions

  • the present invention relates to novel 4-vinyl-2-cyclopentene-1-one derivatives, their preparation and their use as an antibiotic agent.
  • Infectious diseases are the leading cause of morbidity and mortality worldwide. Infections involving germs that are resistant to current treatments pose a major public health problem and lead to an exorbitant excess cost of treatment estimated at 62 billion euros. In Europe, 6.2% of patients who spend more than two days in intensive care contract lung infections and 3.0% of blood infections. 70% of FDA (Food and Drug Administration) -approved antibiotics and more than 80% of known antibiotics are of natural origin. These antibiotics have mainly been isolated from microorganisms (bacteria and filamentous fungi), inexhaustible resources for the discovery of antibiotics and preferentially broad-spectrum, effective against multiple community and nosocomial infections.
  • the present application relates to a new family of antibiotic molecules of general formula (I)
  • R 1 represents a hydrogen atom or a C 1 -C 4 alkyl radical
  • R2 represents a hydroxyl or C 1 -C 4 alkoxyl radical
  • R3 and R independently of one another a hydrogen atom or an alkyl radical -C 4; their enantiomers and enantiomeric mixtures, in particular in racemic form.
  • the compound of formula (Ia) was isolated from a filamentous Trichoderma fungus, particularly the atrovirid species.
  • the Trichoderma LMA strain used has been deposited with the CNCM. This molecule has been isolated and tested under special conditions including:
  • Trichoderma in particular Trichoderma atroviride
  • In-situ capture during culture of natural molecules produced by Trichoderma Natural products, secondary metabolites. This capture of the molecules is carried out thanks to a known protocol but little used in the field and called “solid phase extraction” or SPE,
  • Trichoderma consists of a petri dish on which the microorganism has developed, spores and fragments of mycelium are recovered without distinction by scraping the surface of the agar plate with a sterile liquid, preferably the liquid culture medium.
  • the spores and mycelium are then spread or introduced into a solid or liquid microorganism culture medium, preferably liquid and preferably PDB (Potatoes Dextrose Broth) medium consisting of potato and sugar extracts, the composition of which is for example the following: potato starch 4 g / L, dextrose 20 g / L.
  • PDB Pantatoes Dextrose Broth
  • the fungal strain is cultured at a temperature of between 0 ° C. and 50 ° C., preferably between 20 ° C. and 37 ° C., and preferably at 30 ° C. with rotary stirring or with a turbine driven by a motor between 25 and 25 ° C. 300 rotations per minute, preferably at a speed of 150 rotations per minute.
  • the culture is constantly aerated either by spontaneous aeration by the oxygen contained in the ambient air, or by forced aeration by oxygen injection, for example that included in the compressed air.
  • the culture thus described can be carried out in any solid or liquid microbiological culture device known to those skilled in the art, preferably in Erlenmeyer flasks or fermenters regardless of their size or size.
  • the duration of the culture must correspond to the maximum production of the molecule, it can vary from 1 to 15 days, preferably from 3 to 7 days and preferentially another 5 days.
  • In situ capture during culture, of the natural molecules produced by Trichoderma is carried out thanks to a protocol little used in the field and called "Extraction in situ and in solid phase" or in situ SPE.
  • This protocol consists in introducing an inert solid element during the culture of the microorganism capable of trapping the molecules of interest released by the latter throughout the culture.
  • this protocol involves resins of various natures and preferentially neutral resins such as those described in the following table and preferably apolar resins composed of polystyrene-divinylbenzene copolymers (PS-DVB) of XAD type and preferentially XAD-16 resin.
  • PS-DVB polystyrene-divinylbenzene copolymers
  • XAD polystyrene-divinylbenzene copolymers
  • the resin is then introduced into the culture medium in a sterile manner, either before or after the sterilization thereof.
  • the resin is introduced into the culture medium before sterilization and then sterilized at the same time as the medium.
  • the amounts of resin vary from 1 g / l to 100 g / l, preferably from 10 g / l to 50 g / l and preferably to 30 g / l. Cut
  • the resin is recovered alone or mixed with the biomass by any separation technique between a solid matrix and a liquid container, when the Trichoderma culture lasted the time necessary for the optimal production of the compound of formula (Ia).
  • separation techniques include, without limitation, all the means and techniques of filtration, centrifugation, decantation or drying.
  • the resin alone or mixed with the biomass is recovered by spontaneous or forced filtration under vacuum, preferably on a porous filter regardless of its nature and preferably on an inert fabric.
  • the resin is subsequently treated either after separation from the biomass or mixed with the biomass.
  • the molecules captured by the resin are recovered by bringing it into contact with a solvent whatever its nature, preferably an organic solvent, and preferably dichloromethane or methanol, and several times until the recovery of all the molecules of interest.
  • the solvent having dissolved the molecules of interest is then recovered by filtration and then evaporated by various techniques known to those skilled in the art. This results in a residue that contains among others the molecule of interest of formula (Ia) mixed with other molecules produced by the microorganism, or initially present in the culture medium.
  • the presence of the molecule of interest in this mixture is confirmed by chromatographic or spectrometric analyzes known to those skilled in the art, among which the various chromatography techniques, nuclear magnetic resonance or mass spectrometry.
  • chromatographic or spectrometric analyzes known to those skilled in the art, among which the various chromatography techniques, nuclear magnetic resonance or mass spectrometry.
  • the presence of the compound of formula (Ia) is evidenced by HPLC high performance liquid chromatography coupled with detectors of PDA, DEDL and mass spectrometry type.
  • the target molecule of formula (Ia) is subsequently purified from the total residue by chromatographic techniques known to those skilled in the art, including, but not limited to, chromatography on a silica column or on a reversed phase column. atmospheric pressure or under pressure.
  • the molecule of the compound of formula (Ia) is pre-purified by chromatography on a normal silica column and then purified by preparative HPLC under the following conditions: chromatography on silica in normal phase with a mixture of heptane / ethyl acetate solvent ( 9/1) for 20 min at a flow rate of 30 mL / min, followed by preparative HPLC on a C18 reverse phase column using a linear gradient of water and acetonitrile ranging from 0% to 100% acetonitrile in 10 minutes. minutes followed by a 100% acetonitrile step for 5 minutes at a flow rate of 4 mL / min. After lyophilization, 12 mg of the compound of formula (Ia) were obtained from 8L of culture.
  • the NMR structural analyzes (FIGS. 1 to 5) correlated with data from the HR-ESI-MS (high resolution mass spectrometry) made it possible to determine the following empirical formula CgHi 0 O 4 of molecular mass 182.0574.
  • 13 C NMR ( Figure 2) shows the presence of 9 signals (49.4, 51.7, 77.7, 120.2, 133.9, 149.2, 163.4, 166.4, 205.7 ppm), the proton spectrum ( Figure 1) shows the presence of six groups. protons (2.60, 3.74, 6.17, 6.20, 6.91, 7.33 ppm).
  • the COZY spectrum (FIG. 4) shows correlations between the protons of alkenes showing the existence on the molecule of two ethylenic type unsaturations.
  • the combination of NMR data and information obtained by mass spectrometry confirms that it is a cyclopentenone type molecule hydroxylated in position 4 substituted by a linear chain of methyl acrylate type.
  • the infrared spectrum (FIG. 6) shows absorption bands that reinforce the presence of a ketone, an alcohol and double bonds.
  • MW MicroWave (microwaves)
  • Red-AI® sodium bis (2-methoxyethoxy) aluminumhybrid Reaction scheme for preparing the compound of formula (la)
  • the various compounds of formula (I) may be obtained according to the above reaction scheme by choosing the starting reaction compounds substituted correspondingly to the compounds of formula (I) to be prepared.
  • the groups R 3 and R 4 can be introduced in the first step by choosing the appropriate substituent on the chain of furfuryl alcohol (Microwave-gold Microreactor-Assisted Conversion of Furfuryl Alcohols into 4-Hydroxy-2-cyclopentenones, K. Ulbrich et al., Synlett 2010, No. 13, pp. 2037-2040) or later in the synthetic sequence, in particular to convert the hydroxy group to the corresponding alkoxy OR2.
  • the molecule of the compound of formula (Ia) is redissolved in appropriate solvents and at an appropriate concentration, preferably in dimethyl sulfoxide DMSO at a concentration of 10 mg / ml. This initial solution is then diluted according to the different biological tests to be performed. Two series of tests were carried out.
  • FIG. 7 shows that the antibiotic activity of the compound of formula (Ia) is dependent dose.
  • Figure 7 illustrates the antibiotic activity of the compound of formula (Ia) on various target pathogenic microorganisms in amounts of 1 to 100 g in comparison with chloramphenicol and gentamycin, respectively at 30 g and 10 g. It shows, for example in the case of Escherichia coli ATCC 25922, that the compound (Ia) has a much higher activity than that of chloramphenicol. In fact, the 1 g inhibition of the compound of formula (la) is equivalent to that obtained with 30 g of chloramphenicol.
  • FIG. 7 shows that, in addition to the broad spectrum of sensitive pathogenic bacteria, the molecule of the compound of formula (Ia) is effective at very low doses.
  • TLC analysis The reaction crude obtained, the fractions and the purified products were analyzed by thin layer chromatography (TLC) on gel plates. Silica 60 F 2 54 with a thickness of 0.2 mm on an aluminum support (Merck). The plates are observed under a UV lamp (at 254 and 312 nm) before being revealed by spraying a solution of ammonium molybdate ( ⁇ ) 2 ⁇ 2 ⁇ 7 (100 g / l in 10% sulfuric acid) and heating.
  • the frontal ratio is defined as the ratio between the distance traveled by the compound on the plate and the solvent front.
  • the high resolution mass spectra were performed on a mass spectrometer equipped with an atmospheric pressure ionization source (ESI) and a TOF time-of-flight type mass analyzer (LCT®, Waters).
  • ESI atmospheric pressure ionization source
  • LCDT® TOF time-of-flight type mass analyzer
  • the nuclear magnetic resonance experiments were carried out on Bruker Avance 300 and 500 units using deuterated chloroform CDCl3.
  • the chemical shifts are expressed in ppm (parts per million) and calibrated relative to the reference solvent.
  • the coupling constants are expressed in Hertz (Hz).
  • the multiplicity of signals is expressed by the following abbreviations: s (singlet), bs (wide singlet), d (doublet), dd (doublet split), t (triplet), m (multiplet), q (quadruplet).
  • the rotatory powers of the compounds were measured using a Jasco TM P1010 polarimeter equipped with Spectro Manager software.
  • Source monochromatic luminous is the D-line of sodium.
  • the experiments were carried out with a 100 mm quartz tank of 350 ⁇ , and the products were solubilized in methanol.
  • the infrared (IR) absorption spectra of the described compounds were measured on the Perkin-Elmer Spectrum 100 FT-IR spectrometer. The device is equipped with Spectrum software (version 6.3.5) from Perkin-Elmer. The compounds were prepared in solution in methanol and then dried with compressed air. The absorption bands are given in cm -1 .
  • N-Butyl lithium (1.6 M in hexane, 2.14 ml, 1.1 eq) is added to a solution of diisopropylamine (529 ⁇ l, 1.2 eq) in 10 ml of THF and maintained at -78 ° C. After 30 minutes, the methyl propiolate (277 ⁇ l, 1.0 eq) is added to the previously obtained LDA solution. The reaction is stirred for 1 h at -78 ° C. Compound 3 (660 mg, 3.1 mmol) is solubilized in 5 ml of THF at -78 ° C. and the solution is slowly added to the previously generated lithium acetylide solution. The reaction is stirred at -78 ° C for 1 hour.
  • Compound 7 was analyzed by chiral HPLC equipped with a UV detector in order to highlight the two enantiomers and to be able to separate them. (Alliance Waters 2695 HPLC chain coupled to a Waters 996 PDA detector, chiral IC Daicel Chiral 4.6 x 250 mm (5 ⁇ ) column, eluent n-Heptane / Isopropanol 80:20).
  • the present invention relates to the compounds of formula (I) or (la) for their use as an antibiotic agent in particular as a broad-spectrum antibiotic agent and in particular against gram-positive and gram-negative pathogenic bacteria that are multidrug-resistant.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition containing as active principle at least one compound of formula (I) or (la) associated with a pharmaceutically acceptable excipient, which can be determined easily according to the general knowledge of the skilled person according to the chosen route of administration.

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Abstract

La présente invention concerne un composé répondant à la formule générale (I) suivante : Formula (I), dans laquelle : R1 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle en C1 à C4; R2 représente un radical hydroxyle ou alkoxyle en C1 à C4, et R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un radical alkyle en C1 à C4; leurs énantiomères et mélanges d'énantiomères en particulier sous forme racémique.

Description

DERIVES DE 4-VINYL-2CYCLOPENTENE-1 -ONE LEUR PREPARATION ET LEUR UTILISATION EN TANT QU'AGENT ANTIBIOTIQUE
La présente invention concerne de nouveaux dérivés de 4-vinyl- 2cyclopentène-1 -one, leur préparation et leur utilisation en tant qu'agent antibiotique.
Les maladies infectieuses représentent la principale cause de morbidité et de mortalité dans le monde. Les infections impliquant des germes résistants aux traitements actuels posent un grand problème de santé publique et engendre un surcoût de traitement exorbitant estimé à 62 milliards d'euros. En Europe, 6,2 % des patients qui passent plus de deux jours en soins intensifs contractent des infections pulmonaires et 3,0 % des infections sanguines. 70 % des antibiotiques approuvés par la FDA (Food and Drug Administration, USA) et plus de 80 % des antibiotiques connus sont d'origine naturelle. Ces antibiotiques ont principalement été isolés à partir de microorganismes (bactéries et champignons filamenteux), ressources inépuisables pour la découverte d'antibiotiques et préférentiellement à large spectre, efficaces contre les infections multiples communautaires et nosocomiales.
La présente demande concerne une nouvelle famille de molécules antibiotiques de formule générale (I)
dans laquelle :
Ri représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle en Ci à C4 ; R2 représente un radical hydroxyle ou alkoxyle en Ci à C4, et
R3 et R représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un radical alkyle en Ci à C4 ; leurs énantiomères et mélanges d'énantiomères en particulier sous forme racémique.
Plus particulièrement la présente demande concerne une famille de molécules antibiotiques de formule générale (la)
(la)
Le composé de formule (la) a été isolé à partir d'un champignon filamenteux Trichoderma, en particulier de l'espèce atroviride. La souche Trichoderma LMA utilisée a fait l'objet d'un dépôt auprès de la CNCM. Cette molécule a été isolée et testée dans des conditions particulières incluant :
1 . La mise en culture de Trichoderma, en particulier de Trichoderma atroviride, 2. La capture in-situ, en cours de culture, des molécules naturelles produites par Trichoderma (produits naturels, métabolites secondaires). Cette capture des molécules est réalisée grâce à un protocole connu mais peu utilisé dans le domaine et appelé « Extraction en phase solide » ou SPE,
3. L'isolement et la purification du composé de formule (la) et l'identification de sa structure chimique,
4. La réalisation des tests biologiques pour mettre en évidence des activités antibiotiques.
La mise en culture de Trichoderma consiste à partir d'une boîte de pétri sur laquelle le microorganisme s'est développé, les spores et fragments de mycélium sont récupérés sans distinction en grattant la surface de la boîte de gélose avec un liquide stérile, préférentiellement du milieu de culture liquide.
Les spores et mycélium sont ensuite étalés ou introduits dans un milieu de culture de microorganismes solide ou liquide, préférentiellement liquide et préférentiellement le milieu PDB (Potatoes Dextrose Broth) composé d'extraits de pomme de terre et de sucre, dont la composition est par exemple la suivante : fécule de pomme de terre 4 g/L, dextrose 20 g/L. La souche fongique est cultivée à une température comprise entre 0°C et 50°C, préférentiellement entre 20°C et 37°C, et préférentiellement à 30°C sous agitation soit rotative soit grâce à une turbine entraînée par un moteur entre 25 et 300 rotations par minute, préférentiellement à une vitesse de 150 rotations par minute. La culture est constamment aérée soit par aération spontanée par l'oxygène contenu dans l'air ambiant, soit par aération forcée par injection d'oxygène par exemple celui compris dans l'air comprimé. La culture ainsi décrite peut être réalisée dans n'importe quel dispositif de culture microbiologique solide ou liquide connu de l'homme du métier, préférentiellement dans des Erlenmeyers ou dans des fermenteurs quelles que soient leurs dimensions ou leur tailles. La durée de la culture doit correspondre au maximum de production de la molécule, elle peut varier de 1 à 15 jours, préférentiellement de 3 à 7 jours et préférentiellement encore 5 jours.
La capture in situ, en cours de culture, des molécules naturelles produites par Trichoderma est réalisée grâce à un protocole peu utilisé dans le domaine et appelé « Extraction in situ et en phase solide » ou in situ SPE. Ce protocole consiste à introduire un élément solide inerte durant la culture du microorganisme capable de piéger les molécules d'intérêt libérées par ce dernier tout au long de la culture. Idéalement, ce protocole implique des résines de natures variées et préférentiellement des résines neutres comme celles décrites dans le tableau suivant et préférentiellement des résines apolaires composées de copolymères polystyrène-divinylbenzène (PS-DVB) de type XAD et préférentiellement la résine XAD-16. La résine est lavée avant utilisation avec une solution aqueuse, et récupérée soit par décantation soit par filtration. La résine est ensuite introduite dans le milieu de culture de manière stérile, soit avant, soit après la stérilisation de celui-ci. Préférentiellement, la résine est introduite dans le milieu de culture avant stérilisation puis stérilisée en même temps que le milieu. Les quantités de résine varient de 1 g/L à 100 g/L, préférentiellement entre 10 g/L et 50 g/L et préférentiellement à 30 g/L. Taille
Exemples de Surface Porosité
Matrice particule
résines (m2/g) (ml/ml)
(mm)
Ester
XAD 7-HP 450 0.43 - 0.69 1 .4
acrylique
Polystyrène
XAD 4 > 725 0.49 - 0.69 > 0.5
DVB
Polystyrène
Diaion HP-20 600 > 0.25 1 .3
DVB
Polystyrène
XAD 16 > 800 0.56 - 0.71 > 0.55
DVB
Polystyrène
Sepabeads 1000 > 0.25 1 .2
DVB
En ce qui concerne l'isolement et la purification du composé de formule (la) et l'identification de sa structure chimique, la résine est récupérée seule ou mélangée à la biomasse par toute technique de séparation entre une matrice solide et un contenant liquide, lorsque la culture de Trichoderma a duré le temps nécessaire pour la production optimale du composé de formule (la). Ces méthodes connues de l'homme du métier incluent de façon non limitative tous les moyens et techniques de filtration, centrifugation, décantation ou séchage. Préférentiellement, la résine seule ou mélangée à la biomasse est récupérée par filtration spontanée ou forcée sous vide, préférentiellement sur un filtre poreux quelle que soit sa nature et préférentiellement sur un tissu inerte.
La résine est traitée par la suite soit après sa séparation de la biomasse, soit en mélange avec la biomasse. Les molécules captées par la résine sont récupérées par mise en contact de celle-ci avec un solvant quelle que soit sa nature, de préférence un solvant organique, et de préférence le dichlorométhane ou le méthanol, et ce plusieurs fois jusqu'à la récupération de la totalité des molécules d'intérêt. Le solvant ayant dissous les molécules d'intérêt, est ensuite récupéré par filtration puis évaporé par différentes techniques connues de l'homme du métier. Il en résulte un résidu qui contient entre autres la molécule d'intérêt de formule (la) mélangée à d'autres molécules produites par le microorganisme, ou présentes initialement dans le milieu de culture. La présence de la molécule d'intérêt dans ce mélange est confirmée par des analyses chromatographiques ou spectrométriques connues de l'homme de l'art, parmi lesquelles les différentes techniques de chromatographie, la résonnance magnétique nucléaire ou la spectrométrie de masse. De préférence, la présence du composé de formule (la) est mise en évidence grâce à la chromatographie liquide haute performance HPLC couplée à des détecteurs de type PDA, DEDL et spectrométrie de masse.
La molécule cible de formule (la) est par la suite purifiée à partir du résidu total par des techniques chromatographiques connues de l'homme du métier, incluant de façon non limitative, la chromatographie sur colonne de silice ou sur colonne en phase inverse, à pression atmosphérique ou sous pression. Préférentiellement la molécule du composé de formule (la) est pré- purifiée par chromatographie sur une colonne de silice normale puis purifiée par HPLC préparative dans les conditions suivantes : chromatographie sur silice en phase normale par un mélange de solvant heptane / acétate d'éthyle (9 / 1 ) pendant 20 min à un débit de 30 mL/min, puis HPLC préparative sur une colonne en phase inverse C18 en utilisant un gradient linéaire d'eau et d'acétonitrile allant de 0 % à 100 % d'acétonitrile en 10 minutes suivi d'un palier à 100 % d'acétonitrile pendant 5 minutes à un débit de 4 mL/min. Après lyophilisation, 12 mg du composé de formule (la) ont été obtenus à partir de 8L de culture.
La structure de la molécule du composé de formule (la) a été réalisée par des méthodes spectroscopiques. Les spectres et autres données analytiques sont rapportés dans les figures annexées.
Les analyses structurales RMN (figures 1 à 5) corrélées aux données issues de l'HR-ESI-MS (spectrométrie de masse haute résolution) ont permis de déterminer la formule brute suivante CgHi0O4 de masse moléculaire 182.0574. La RMN 13C (figure 2) montre la présence de 9 signaux (49.4 ; 51 .7 ; 77.7 ; 120.2 ; 133.9 ; 149.2 ; 163.4 ; 166.4 ; 205.7 ppm), le spectre proton (figure 1 ) montre la présence de six groupes de protons (2.60 ; 3.74 ; 6.17 ; 6.20 ; 6.91 ; 7.33 ppm).
L'analyse du spectre HSQC (figure 3) corrélé au spectre 1 D 1 H et 13C montre la présence d'un groupement méthoxy à 51 .7 ppm, un groupe méthylène à 49.4 ppm et quatre groupements alcènes à 120.2 ; 133.9 ; 149.2 et 163.4 ppm. L'absence de tâches de corrélations de trois carbones permet de conclure à la présence de trois carbones quaternaires : un de type cétone à 205.4 ppm ; un de type ester ou lactone à 166.4 ppm et un de type alcool tertiaire à 77.7 ppm.
Le spectre COSY (figure 4) montre des corrélations entre les protons d'alcènes montrant l'existence sur la molécule de deux insaturations de type éthyléniques.
La structure de la molécule du composé de formule (la) est confirmée par les corrélations du spectre HMBC (figure 5) et ses interactions scalaires longues distances résumées dans le tableau ci-dessous.
La combinaison des données RMN et des informations obtenues par spectrométrie de masse confirme qu'il s'agit d'une molécule de type cyclopentènone hydroxylée en position 4 substituée par une chaîne linéaire de type acrylate de méthyle. Le spectre d'absorption UV montre un maximum à λ max = 257 nm. Le spectre infrarouge (figure 6) montre des bandes d'absorption qui confortent la présence d'une cétone, d'un alcool et des doubles liaisons. Le signe du pouvoir rotatoire mesuré pour la molécule du composé de formule (la) [a]D 20 = +42,6 (20 mg/10mL CH2CI2) a été comparé à celui de molécules ressemblantes comme la trichodénone A naturelle [OI] D20 = +56 qui possède un pouvoir rotatoire positif et une stéréochimie R confirmée par synthèse totale énantioséléctive (Tetrahedron asymetry 2000, 1 1 (371 1 -3725).
Les composés de formules (I) et (la) peuvent également être synthétisés conformément au schéma réactionnel mentionné ci-après.
MW : MicroWave (microondes)
LDA : Lithium Diisopropylamide
n-BuLi : n-ButylLithium
THF : Tetrahydrofurane
RT : Room Température (température ambiante)
PCC : Pyridinium ChloroChromate
Red-AI® : sodium bis(2-methoxyethoxy)aluminumhybride Schéma réactionnel de préparation du composé de formule (la)
Les différents composés de formule (I) pourront être obtenus conformément au schéma réactionnel ci-dessus en choisissant les composés réactionnels de départ substitués de façon correspondante aux composés de formule (I) à préparer. En particulier, les groupements R3 et R4 peuvent être introduits à la première étape en choisissant le substituant approprié sur la chaîne du furfuryl alcool (Microwave- or Microreactor- Assisted Conversion of furfuryl Alcohols into 4-Hydroxy-2-cyclopentenones, K. Ulbrich et al., Synlett 2010, N° 13, pp 2037-2040) ou ultérieurement dans la séquence synthétique, en particulier pour transformer le radical hydroxy en alcoxy correspondant OR2.
Une fois purifiée, la molécule du composé de formule (la) est redissoute dans des solvants appropriés et à une concentration appopriée, préférentiellement dans du diméthyl-sulfoxyde DMSO à la concentration de 10 mg/nnl. Cette solution initiale est ensuite diluée en fonction des différents tests biologiques à réaliser. Deux séries de tests ont été réalisées.
Des tests de cytoxicité sur une lignée de cellules cancéreuses KB (carcinome) et une lignée de cellules équivalentes non-cancéreuses MRC5. Le tableau qui suit rapporte le pourcentage d'inhibition de la croissance par la molécule du composé de formule (la) aux concentrations de 1 et 10 micromolaires. Il se dégage de ce résultat qu'aux concentrations utilisées aucune cytotoxicité n'est observée, ni vis-à-vis de cellules tumorales, ni vis-à- vis de cellules saines.
La molécule du composé de formule (la) a été engagée dans des tests antibiotiques selon la technique des zones d'inhibition, sur différentes bactéries Gram positives et Gram négatives, à la quantité de 100 g. En parallèle, des tests similaires sont réalisés avec des antibiotiques témoins avec des quantités variables selon l'antibiotique soit 10 g, soit 30 g. Zone d'inhibition Zone d'inhibition
Antibiotique de
Microorganisme pour 100 g du par les référence et
cible composé de la antibiotiques de quantité déposée
formule (la) référence (cm)
Escherichia coli Chloramphénicol
2,7 1 ,0
(ATCC 25922) (30Mg)
Klebsiella
Chloramphénicol
pneumoniae 2,9 2,5
(30Mg)
(ATCC 1001)
Enterobacter
Chloramphénicol
cloacae 1 ,2 1 ,5
(30Mg)
(ATCC 13047)
Micrococcus
Chloramphénicol
luteus 3,2 3,2
(30Mg)
(ATCC 10240)
Bacillus subtillis Gentamycine
2,7 1 ,2
(ATCC 6633) (10Mg)
Streptococcus
pneumoniae 2,0 Pénicilline (30 g) 3,5
(ATCC 49619)
Acinetobacter
Gentamycine
baumanii 3,2 0,9
(10Mg)
(ATCC 19606)
Pseudomonas
Gentamycine
aeruginosa - 1 ,3
(10Mg)
(ATCC 27853)
Staphylococcus
Gentamycine
aureus 3,0 1 ,2
(10Mg)
(ATCC 25923) La figure 7 annexée montre que l'activité antibiotique du composé de formule (la) est dose dépendante. La Figure 7 illustre l'activité antibiotique du composé de formule (la) sur différents microorganismes pathogènes cibles à des quantités de 1 à 100 g en comparaison avec le chloramphénicol et la gentamycine, respectivement à 30 g et à 10 g. Elle montre par exemple dans le cas à'Escherichia coli ATCC 25922, que le composé (la) présente une activité bien supérieure à celle du chloramphénicol. En effet, l'inhibition par 1 g du composé de formule (la) équivaut à celle obtenue avec 30 g de chloramphénicol. Les mêmes observations et conclusions peuvent être faites pour toutes les souches sensibles au composé de formule (la) comme le montre la figure 7. Ceci montre qu'en plus du large spectre de bactéries pathogènes sensibles, la molécule du composé de formule (la) est efficace à très faibles doses.
On mentionne ci-après à titre d'illustration un exemple de préparation du composé de formule la.
Exemple 1 : 1 .1 . Procédure générale
Sauf mention contraire, toutes les réactions ont été réalisées sous une atmosphère inerte d'argon, dans de la verrerie préalablement séchée à l'étuve à 120 °C.
1 .1 .1 . Solvants Le tétrahydrofurane (THF) a été distillé sous argon sur sodium/benzophénone. Le dichlorométhane (CH2CI2) a été distillé sous argon sur hydride de calcium (CaH2). Sauf indication contraire, tous les réactifs engagés sont des réactifs commerciaux de qualité « reagent-grade ».
1 .1 .2. Analyse par CCM Les bruts réactionnels obtenus, les fractions et les produits purifiés ont été analysés par chromatographie sur couche mince (CCM) sur plaques de gel de silice 60 F254 de 0.2 mm d'épaisseur sur support d'aluminium (Merck). Les plaques sont observées sous lampe UV (à 254 et 312 nm) avant d'être révélées par pulvérisation d'une solution d'ammonium molybdate (ΝΗ )2Μθ2θ7 (100g/L dans 10% acide sulfurique) et chauffage. Le rapport frontal est défini comme étant le rapport entre la distance parcourue par le composé sur la plaque et le front de solvant.
1 .1 .3. Purification
La purification des mélanges réactionnels a été réalisée par chromatographie flash sur gel de silice (Merck 60 (35-70 μιτι)). 1 .1 .4. Analyses spectroscopiques
1 .1 .4.1 Spectrométrie de Masse Haute Résolution
Les spectres de masse haute résolution ont été réalisés sur un spectromètre de masse équipé d'une source d'ionisation à pression atmosphérique (ESI) et d'un analyseur de masse de type temps de vol TOF (LCT®, Waters).
1 .1 .4.2 Résonance magnétique nucléaire (RMN)
Les expériences de résonance magnétique nucléaire ont été réalisées sur des appareils Bruker Avance 300 et 500 en utilisant le chloroforme deutérié CDCI3, Les déplacements chimiques sont exprimés en ppm (partie par million) et calibrés par rapport au solvant de référence. Les constantes de couplage sont exprimées en Hertz (Hz). La multiplicité des signaux est exprimée par les abréviations suivantes : s (singulet), bs (singulet large), d (doublet), dd (doublet dédoublé), t (triplet), m (multiplet), q (quadruplet). L'attribution des signaux des protons et des carbones a été effectuée à partir des expériences monodimensionnelles 1 D 1 H et 13C, et bidimensionnelles 2D 1 H-1 H COSY, 1 H- 13C HSQC ou HMQC, 1 H-13C HMBC, 1 H-1 H NOESY. Les spectres RMN sont traités grâce aux logiciels dédiés TopSpin (Brucker).
1 .1 .4.3 Pouvoir rotatoire
Les pouvoirs rotatoires des composés ont été mesurés à l'aide d'un polarimètre Jasco™ P1010, équipé du logiciel Spectro Manager. La source lumineuse monochromatique est la raie D de sodium. Les expériences ont été menées avec une cuve en quartz 100 mm de 350 μί, et les produits ont été solubilisés dans le méthanol.
1 .1 .4.4 Spectroscopie infrarouge
Les spectres d'absorption infrarouge (IR) des composés décrits ont été mesurés sur le spectromètre Perkin-Elmer Spectrum 100 FT-IR. L'appareil est équipé du logiciel Spectrum (version 6.3.5) de Perkin-Elmer. Les composés ont été préparés en solution dans le méthanol puis séchés à l'air comprimé. Les bandes d'absorption sont données en cm"1.
1 .2. Synthèse des composés 2 à 7
Composé 2 : 4-hydroxycyclopent-2-enone
C5H6O2
98,1 g.mol"1
Une solution d'alcool furfurylique (1 ) (3.0 ml, 34.7 mmol) dans de l'eau distillée (5 ml) est placée dans un tube pour micro-onde (CEM Discover) et chauffé en vase clos à 300 W pendant 10 minutes. Après refroidissement et décantation, la phase aqueuse est récupérée et le résidu lavé par 2 X 5 ml d'eau distillée. Les phases aqueuses sont rassemblées et lavées par extraction liquide-liquide à l'acétate d'éthyle (2 X 50 ml). La phase aqueuse est ensuite concentrée pour donner 668 mg (20%) du composé 2 sous forme d'une huile rouge orangée. Le produit obtenu ne nécessite pas de purification avant d'être engagé dans la réaction suivante (K. Ulbrich, P.Kreitmeier, O. Reeiser, Synlett. 2010, 13, 2037-2040) Rf = 0.32 (Heptane/AcOEt, 2:8)
RMN 1H (300 MHz, CDCI3) : δΗ (ppm) 7.57 (dd, 1 H, J = 2.3 Hz, J = 5.7 Hz), 6.22 (dd, 1 H, J = 1 .1 Hz, J = 5.7 Hz), 5.06-5.02 (m, 1 H), 2.77 (dd, 1 H, J = 6.1 Hz, J = 18.5 Hz), 2.27 (dd, 1 H, J = 2.1 Hz, J = 18.5 Hz).
RMN 13C (75 MHz, CDCI3) : 5C (ppm) 207.1 , 163.7, 135.0, 70.3, 44.2.
HRMS (ESI) : m/z calculée pour C5H7O2 [M+H+] 99.0446
valeur expérimentale 99.0449
Composé 3 : 4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)cyclopent-2-enone
212.1 g. mol"1
Le composé 2 (334 mg, 3.41 mmol) est solubilisé dans le dichlorométhane (6 ml). Le milieu réactionnel est ensuite maintenu à 0°C. La triéthylamine (700 μΙ, 4.78 mmol), le DMAP (33 mg, 0.27 mmol) et le chlorure de te/Î-butyldiméthylsilyl (1 .0M dans le THF, 3.75 ml) sont ensuite additionnés. La réaction est maintenue à 0°C sous agitation pendant 12 heures. Après addition d'eau distillée (10 ml), le milieu est extrait au dichlorométhane (3 X 20 ml). La phase organique est séchée sur du sulfate de sodium anhydre, puis évaporée à sec. Le brut réactionnel obtenu est purifié par chromatographie flash sur gel de silice (éluant Heptane/AcOEt, 80:20) pour donner 664 mg (92%) du composé 3 sous forme d'une huile transparente (cristaux blanc à 4°C) (K. Ulbrich, P.Kreitmeier, O. Reeiser, Synlett. 2010, 13, 2037-2040). Rf = 0.53 (Heptane/AcOEt, 3:7)
RMN 1H (300 MHz, CDCI3) : δΗ (ppm) 7.46 (dd, 1 H, J = 2.3 Hz, J = 5.7 Hz), 6.19 (dd, 1 H, J = 1 .1 Hz, J = 5.7 Hz), 5.01 -4.98 (m, 1 H), 2.71 (dd, 1 H, J = 6.1 Hz, J = 18.5 Hz), 2.25 (dd, 1 H, J = 2.2 Hz, J = 18.5 Hz), 0.91 (s, 9H), 0.14 (s, 3H), 0.13 (s, 3H).
RMN 13C (75 MHz, CDCI3) : 5C (ppm) 206.5, 163.8, 134.4, 70.9, 45.0, 25.7, 18.1 , -4.8
HRMS (ESI) : m/z calculée pour C22H4iO4Si2 [2M+H+] 425.2583
valeur expérimentale 425.2601
Composé 4 : methyl 3-(4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)-1 - hydroxycyclopent-2-en-1 -yl)propiolate
TBDMS
296.1 g. mol"
Le n-butyl lithium (1 ,6 M dans l'hexane, 2.14 ml, 1 .1 éq) est ajouté à une solution de diisopropylamine (529 μΙ, 1 .2 éq) dans 10 ml de THF et maintenue à -78°C.A bout de 30 minutes, le methyl propiolate (277 μΙ, 1 .0 éq) est ajouté à la solution de LDA préalablement obtenue. La réaction est maintenue sous agitation pendant 1 h à -78°C. Le composé 3 (660 mg, 3.1 1 mmol) est solubilisé dans 5 ml de THF à -78°C puis la solution est lentement additionnée à la solution d'acétylide de lithium préalablement générée. La réaction est maintenue sous agitation à -78°C pendant 1 heure. Après addition de 20 ml d'une solution saturée de NH CI, le mélange est extrait par 3 x 50 ml d'acétate d'éthyle. La phase organique est séchée sur du sulfate de sodium anhydre, puis évaporée à sec. Le brut réactionnel obtenu est purifié par chromatographie flash sur gel de silice (éluant Heptane/AcOEt, 80 :20) pour donner 718 mg (78%) du composé 4 sous forme d'une huile translucide jaune.
Rf = 0.44 (Heptane/AcOEt, 6:4)
RMN 1H (300 MHz, CDCI3) : δΗ (ppm) 5.99 (dd, 1 H, J = 1 .7 Hz, J = 5.4 Hz), 5.92 (d, 1 H, J = 5.5 Hz), 4.83 (t, 1 H, J = 5.4 Hz), 3.78 (s, 3H), 2.87 (dd, 1 H, J = 6.7 Hz, J = 13.6 Hz), 2.02 (dd, 1 H, J = 4.3 Hz, J = 13.7 Hz), 0.90 (s, 9H), 0.10 (s, 6H).
RMN 13C (75 MHz, CDCI3) : 5C (ppm) 153.8, 138.5, 134.7, 88.2, 75.6, 74.9, 52.8, 51 .0, 25.8, 18.0, -4.7.
HRMS (ESI) : m/z calculée pour C15H23O3S1 [M-H2O+H+] 279.1416
valeur expérimentale 279.1414
Composé 5 : (E)-methyl 3-(4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)- 1 -hydroxycyclopent-2-en-1 -yl)acrylate
TBDMS
298.2 g.mol"1 Le composé 4 (700 mg, 2.36 mmol) est solubilisé dans 20 ml de THF distillé et la solution est refroidie à -78°C. Une solution commerciale de Red-AI (3.21 M dans le toluène, 1 .54 ml, 2.0 éq) est ajouté goutte à goutte et la réaction est maintenue sous agitation à -78°C pendant 30 minutes. Après addition de 20 ml d'eau distillée, le brut réactionnel est extrait par 3 x 100 ml d'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée par 10 ml d'une solution saturée de NaHCO3, puis séchée sur du sulfate de sodium anhydre avant d'être filtrée et évaporée à sec. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie flash sur gel de silice (éluant Heptane/AcOEt, 80 :20) pour donner 668 mg (95%) du composé 5 sous forme d'une huile translucide jaune pâle. Rf = 0.63 (Heptane/AcOEt, 6:4)
RMN 1H (300 MHz, CDCI3) : δΗ (ppm) 6.84 (d, 1 H, J = 15.4 Hz), 6.09 (d, 1 H, J = 15.6 Hz), 5.97 (dd, 1 H, J = 2.0 Hz, J = 5.4 Hz), 5.77 (d, 1 H, J = 5.5 Hz), 4.80- 4.77 (m, 1 H), 3.75 (s, 3H), 2.52 (dd, 1 H, J = 6.5 Hz, J = 13.8 Hz), 1 .87 (dd, 1 H, J = 3.9 Hz, J = 13.8 Hz), 0.90 (s, 9H), 0.10 (s, 6H).
RMN 13C (75 MHz, CDCI3) : 5C (ppm) 167.4, 150.5, 137.4, 136.7, 1 18.5, 82.9, 75.3, 51 .6, 49.8, 25.8, 18.1 , -4.7.
HRMS (ESI) : m/z calculée pour C15H25O3S1 [M-H2O+H+] 281 .1573
valeur expérimentale 281 .1562 Composé 6 : (E)-methyl 3-(1 ,4-dihydroxycyclopent-2-en-1 -yl)acrylate
H
-1
184.2 g. mol Le composé 5 (650 mg, 2.18 mmol) est solubilisé dans 20 ml de THF distillé à température ambiante. Une solution commerciale de TBAF (1 M dans le THF, 4.37 ml, 2.0 éq) est ajouté goutte à goutte et la réaction est maintenue sous agitation à température ambiante pendant 2 heures. Après addition de10 ml d'une solution saturée de NaCI, le milieu réactionnel est extrait par 3 x 100 ml d'acétate d'éthyle. Les phases organiques rassemblées sont séchées sur du sulfate de sodium anhydre avant d'être filtrées et évaporées à sec. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie flash sur gel de silice (éluant Heptane/AcOEt, 80 :20) pour donner 357 mg (89%) du composé 6 sous forme d'une huile translucide. Rf = 0.41 (Heptane/AcOEt, 3:7)
RMN 1H (300 MHz, CDCI3) : δΗ (ppm) 6.87 (d, 1 H, J = 15.7 Hz), 6.09 (d, 1 H, J = 15.6 Hz), 6.09 (dd, 1 H, J = 2.0 Hz, J = 5.4 Hz), 5.84 (d, 1 H, J = 5.5 Hz), 4.85- 4.81 (m, 1 H), 3.76 (s, 3H), 2.60 (dd, 1 H, J = 6.7 Hz, J = 14.3 Hz), 1 .91 (dd, 1 H, J = 3.5 Hz, J = 14.3 Hz).
RMN 13C (75 MHz, CDCI3) : 5C (ppm) 167.1 , 150.8, 137.7, 136.9, 1 18.6, 83.0, 75.2, 51 .7, 48.9.
HRMS (ESI) : m/z calculée pour C9Hn03 [M-H2O+H+] 167.0708
valeur expérimentale 167.0700 Composé 7 : (E)-methyl 3-(1 -hydroxy-4-oxocyclopent-2-en-1 -yl)acrylate
(±)-LMA-EA-2801
CgHioO4
182.2 g.mol"1 Le composé (350 mg, 1 .92 mmol) est solubilisé dans 15 ml de CH2CI2 distillé à température ambiante, avant d'y ajouter l'acétate de sodium (313 mg, 1 .2 éq) et le chlorochromate de pyridinium (PCC, 497 mg, 1 .2 éq). La réaction est maintenue sous agitation à température ambiante pendant 1 heure. Le mélange réactionnel est filtré sur une cartouche de célite et le filtrat obtenu est évaporé à sec. Le résidu est ensuite purifié par chromatographie flash sur gel de silice (éluant Heptane/AcOEt, 60:40) pour donner 296 mg (84%) du composé 7 sous forme d'une huile translucide. Rf = 0.38 (Heptane/AcOEt, 3:7)
RMN 1H (300 MHz, CDCI3) : δΗ (ppm) 7.35 (d, 1 H, J = 5.3 Hz), 6.94 (d, 1 H, J = 15.8 Hz), 6.27 (d, 1 H, J = 5.4 Hz), 6.18 (d, 1 H, J = 15.8 Hz), 3.77 (s, 3H), 2.67 (d, 1 H, J = 12.0 Hz).
RMN 13C (75 MHz, CDCI3) : 5C (ppm) 205.0, 166.4, 162.6, 148.5, 134.6, 120.5, 78.3, 51 .9, 49.3.
HRMS (ESI) : m/z calculée pour C9H9O3 [M-H2O+H+] 165.0552
valeur expérimentale 165.0550
Séparation des énantiomères (+)-LMA-EA-2801 et (-)-LMA-EA-2801
Le composé 7 a été analysé par HPLC chirale équipée d'un détecteur UV afin de mettre en évidence les deux énantiomères et de pouvoir les séparer. (Chaîne HPLC Alliance Waters 2695 couplée à un détecteur PDA Waters 996, colonne chirale IC Daicel Chiral Technologie 4,6 x 250 mm, 5 μιτι), éluant n- Heptane/ Isopropanol 80 :20).
A partir des données analytiques, la séparation des énantiomères a ensuite été réalisée par SFC préparative.
(Chaîne Investigator II Waters équipée d'un détecteur DEDL 2420 et d'un détecteur PDA 2996, colonne chirale IC Daicel Chiral Technologie 4,6 x 250 mm, 5 μιτι), éluant CO2 supercritique/ Isopropanol/Methanol, 80 :10 :10).
Les pouvoirs rotatoires des deux énantiomères ont été mesurés et comparé à celui obtenu pour le composé optiquement pur d'origine naturelle [a]20 D (-)-LMA-EA-2801 : - 45 ,7
[a]20 D (+)-LMA-EA-2801 : + 40,9 (valeur cohérente avec celle obtenue pour le composé de formule la optiquement pur d'origine naturelle)
La présente invention concerne les composés de formule (I) ou (la) pour leur utilisation en tant qu'agent antibiotique en particulier en tant qu'agent antibiotique à large spectre et notamment à rencontre de bactéries pathogènes Gram positives et Gram négatives multirésistantes.
La présente invention concerne une composition pharmaceutique contenant à titre de principe actif au moins un composé de formule (I) ou (la) associé à un excipient pharmaceutiquement acceptable, qui pourra être déterminée aisément selon les connaissances générales de l'homme du métier en fonction de la voie d'administration retenue.

Claims

REVENDICATIONS 1 . Composé répondant à la formule générale (I) suivante :
dans laquelle :
Ri représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle en Ci à C4 ;
R2 représente un radical hydroxyle ou alkoxyle en Ci à C4, et
R3 et R représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un radical alkyle en Ci à C4 ;
leurs énantiomères et mélanges d'énantiomères en particulier sous forme racémique.
2. Composé selon la revendication 1 répondant à la formule (la) suivante
(la)
3. Procédé de préparation d'un composé de formule (I) ou (la) selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il implique la mise en œuvre des étapes opérationnelles suivantes :
i. mise en culture d'un champignon filamenteux Trichoderma en particulier de Trichoderma atroviride dans un milieu et des conditions appropriées ; ii. en cours de culture, capture in situ par extraction en phase solide d'un composé de formule (I) ou (la) ;
iii. isolement et purification du composé de formule (I) ou (la).
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'étape de capture in situ est réalisée par extraction en phase solide après introduction dans le milieu de culture d'au moins une résine neutre apolaire.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite résine est un copolymère polystyrène-divinylbenzène.
6. Procédé de préparation d'un composé de formule (I) ou (la), selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il implique la mise en œuvre des étapes illustrées dans le schéma réactionnel ci-après, les réactifs de départ étant éventuellement substitués de manière appropriée pour obtenir les composés de formule (I) avec les significations Ri à R4 telles que définies précédemment :
7. Composé de formule (I) ou (la) selon l'une des revendications 1 et 2, pour son utilisation en tant qu'agent antibiotique.
8. Composé selon la revendication 7, pour son utilisation en tant qu'agent antibiotique à large spectre.
9. Composé selon la revendication 8, pour son utilisation en tant qu'agent antibiotique à encontre de bactéries pathogènes Gram positives et Gram négatives multirésistantes.
10. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient à titre de principe actif au moins un composé de formule (I) ou (la) associé à un excipient pharmaceutiquement acceptable.
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