EP3847238A1 - Nouveau traitement de la mucite - Google Patents

Nouveau traitement de la mucite

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Publication number
EP3847238A1
EP3847238A1 EP19765152.4A EP19765152A EP3847238A1 EP 3847238 A1 EP3847238 A1 EP 3847238A1 EP 19765152 A EP19765152 A EP 19765152A EP 3847238 A1 EP3847238 A1 EP 3847238A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
mucositis
freudenreichii
composition
propionibacterium
use according
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP19765152.4A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Gwénaël Jan
Yves Le Loir
Florence VALENCE
Vasco Ariston DE CARVALHO AZEVEDO
Rodrigo DIAS DE OLIVEIRA CARVALHO
Fillipe Luiz ROSA DO CARMO
Barbara Fernandes CORDEIRO
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universidade Federal de Minas Gerais
Institut Superieur Des Sciences Agronomiques Agroalimentaires Horticoles Et Du Paysage
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Original Assignee
Universidade Federal de Minas Gerais
Institut Superieur Des Sciences Agronomiques Agroalimentaires Horticoles Et Du Paysage
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Publication of EP3847238A1 publication Critical patent/EP3847238A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K2035/11—Medicinal preparations comprising living procariotic cells
    • A61K2035/115—Probiotics

Definitions

  • the present invention relates to mucositis and, in particular, to the prevention or treatment of its two components, which are inflammation of the epithelial tissue and alteration of the tight junctions (shingles occludens) within this epithelial tissue.
  • Mucositis is a pathology defined by the presence of inflammatory and / or ulcerative lesions of the oral and / or gastrointestinal tract. If its occurrence may be the result of an infectious disease, an immune deficiency or even drug toxicity, its appearance generally results from the follow-up of anti-cancer therapy. Thus, if 20 to 40% of patients undergoing chemotherapy are victims, it is present in more than 80% of patients undergoing high-dose chemotherapy and in almost all patients suffering from head or neck cancer following radiotherapy.
  • mucositis can be dramatic since, in addition to the undernutrition it can cause in the patient, its occurrence often leads to modify, even sometimes to interrupt, the patient's anti-cancer treatment protocol, thereby impacting the chances of success of it.
  • amifostine cytoprotective
  • loperamide Anti -diarrheal
  • mucositis including activated carbon, anti-inflammatory drugs such as budesonide, balsalazide or celecoxib, cytoprotectors such as sodium folinate, antibiotics including cefixime, levofloxacin, metronidazole or neomycin, growth factors of epithelial cells such as palifermin.
  • anti-inflammatory drugs such as budesonide, balsalazide or celecoxib
  • cytoprotectors such as sodium folinate
  • antibiotics including cefixime, levofloxacin, metronidazole or neomycin
  • growth factors of epithelial cells such as palifermin.
  • mucositis and, more specifically, its two components which are 1) inflammation of the epithelial tissue and 2) alteration of the tight junctions of the epithelial tissue. It should also be noted that it precisely results from this double component, the ineffectiveness of anti-inflammatory drugs to treat mucositis and to allow the return to normal epithelial tissue.
  • the inventors have now demonstrated that various bacterial strains belonging to the genus Propionibacterium exhibited, in addition to an anti-inflammatory action, an action of consolidation of tight junctions within the epithelial tissue.
  • a first subject of the invention relates to a composition
  • a composition comprising at least one bacterial strain belonging to the genus Propionibacterium for use in the treatment or prevention of mucositis in a subject, preferably for the treatment or prevention of damage to tight junctions of epithelial tissue associated with mucositis.
  • Figure 1 shows the relative expression, determined by RT-PCR, of the genes coding for different cytokines, namely interleukin 10 (A), interleukin 8 (B), interferon alpha (C) and TNF alpha (D), in HT-29 cells brought into contact with Lipopolysaccharides (LPS) and / or with the strain Propionibacterium freudenreichii 129 Wild Type (WT) or with the deleted mutant strain Propionibacterium freudenheimii 129 AslpB (AslpB). These measurements were carried out in triplicate on three independent cultures by conditions. The means and standard deviations are therefore calculated on 9 measurements by condition. The asterisks represent the significant statistical difference between the strains: * p ⁇ 0.05; ** r ⁇ 0.01; *** r ⁇ 0.001; **** p ⁇ 0.000l.
  • Figure 2 shows the absolute number and frequency of CD4 + RORDT + cells (A) and CD4 + FOXP3 + cells (B) in the spleen of mice suffering from mucositis induced by injection of 5-FU (the control group underwent injection of saline), and having received a treatment based on water, YEL medium, the bacterium Propionibacterium freudenreichii Wild-type (WT), or the mutant deleted strain Propionibacterium freudenreichii AslpB (AslpB). Frequencies were measured by flow cytometry. The means and standard deviations were calculated on the basis of 5 mice per group). The asterisks represent the significant statistical difference between the strains: * p ⁇ 0.05; ** r ⁇ 0.01; *** r ⁇ 0.001; **** p ⁇ 0.000l.
  • Figure 3 shows the assay of different cytokines by ELISA in mice suffering from mucositis induced by an injection of 5-FU (the control group was injected with saline), and having received a water-based treatment , YEL medium, the bacteria Propionibacterium freudenreichii wild-type (WT), or the deleted mutant strain Propionibacterium freudenreichii AslpB (AslpB).
  • the cytokines studied are F Interleukin-10 ( Figure 3A), F Interleukin-12 (Figure 3B), Interleukin-1B ( Figure 3C).
  • the IL-10 / IL-12 ratio is presented in Figure 3D.
  • the means and standard deviations were calculated on the basis of triplicate measurements on 3 independent replicates of ileums of 6 animals per group.
  • the asterisks represent the significant statistical difference between the strains: * p ⁇ 0.05; ** r ⁇ 0.01; *** r ⁇ 0.001; **** p ⁇ 0.000l.
  • Figure 4 shows the relative level of expression of Claudine 1 mRNA, measured by RT-PCR, in mice suffering from mucositis induced by an injection of 5-FU (the control group was injected with saline solution), and having received a treatment based on water, YEL medium, the bacteria Propionibacterium freudenreichii Wild-type (WT), or the deleted mutant strain Propionibacterium freudenreichii AslpB (AslpB).
  • WT the bacteria Propionibacterium freudenreichii Wild-type
  • AslpB the deleted mutant strain Propionibacterium freudenreichii AslpB
  • Figure 5 shows sections of mouse ileum suffering from mucositis induced by an injection of 5-FU (the control group was injected with saline), and having received a treatment based on water, medium YEL, from the bacteria Propionibacterium freudenreichii Wild-type (WT), or from the deleted mutant strain Propionibacterium freudenreichii AslpB (AslpB) ( Figure 5B).
  • the ileum sections are stained with hematoxylin and eosin, and correspond to a 20x objective magnification.
  • the scale bar corresponds to 100 pm. Their histological scores associated with inflammation are shown in Figure 5A. The means and standard deviations were calculated on the basis of 18 sections of ileum per group (3 independent ileum sections of 6 mice per group). The asterisks represent the significant statistical difference between the strains: * p ⁇ 0.05; ** r ⁇ 0.01; *** r ⁇ 0.001; **** p ⁇ 0.000l.
  • FIG. 6 shows the height of the villi (FIG. 6A), the ratio of the villus height / depth of the crypts (FIG. 6B) and the granular density of the Paneth cells (FIG. 6C) of the ileum of mice suffering from mucositis induced by an injection of 5-FU (the control group was injected with saline), and having received water-based treatment, of YEL medium, of the bacteria Propionibacterium freudenheimii Wild-type (WT), or of the deleted mutant strain Propionibacterium freudenreichii AslpB (AslpB).
  • the microscopic morphometric analysis of the granules of Paneth cells was carried out on the basis of 10 images of ileum at 40 ⁇ objective magnification. The means and standard deviations were calculated on the basis of 18 sections of ileum per group (3 independent ileum sections of 6 mice per group). The asterisks represent the significant statistical difference between the strains: * p ⁇ 0.05; ** r ⁇ 0.01; *** r ⁇ 0.001; **** p ⁇ 0.000l.
  • FIG. 7 represents the intestinal permeability measured 72 hours after induction of mucositis.
  • the radioactivity of DTPA-TC99m was measured in the blood of the mice.
  • the means and standard deviations were calculated on the basis of an independent measurement for 5 mice per group.
  • the asterisks represent the significant statistical difference between the strains: * p ⁇ 0.05; ** r ⁇ 0.01; *** r ⁇ 0.001; **** p ⁇ 0.000l.
  • FIG. 8 represents the weight loss observed in mice after induction of mucositis by injection of 5-LU on the different groups of mice.
  • the means and standard deviations were calculated on the basis of 18 sections of ileum per group (3 independent ileum sections of 6 mice per group).
  • the asterisks represent the significant statistical difference between the strains: * p ⁇ 0.05; ** r ⁇ 0.01; *** r ⁇ 0.001; **** p ⁇ 0.000l.
  • said at least one bacterial strain belonging to the genus Propionibacterium is envisaged as a probiotic.
  • probiotic is meant, within the meaning of the present invention, living or dead microorganisms which, administered in sufficient quantity to a host, animal in particular, have a beneficial effect on the health of the host.
  • the bacterial strain belonging to the genus Propionibacterium can be administered to humans or animals without risk to their health, which constitutes an undeniable advantage.
  • bacterial strain belonging to the genus Propionibacterium is meant a bacterial strain chosen from the group comprising P. freudenreichii, P. thoenii, P. jensenii and P. acidipropionici, preferably the bacterial strain belonging to the genus Propionibacterium belongs to the species P. freudenreichii.
  • This bacterial strain advantageously expresses the SlpB protein (surface layer protein B), preferably it expresses an SlpB protein of the species P. freudenreichii.
  • protein SlpB of the species P. freudenreichii mention may be made of the proteins having the accession numbers WP_051733954.1 (SEQ id no. 1), WP_055345346.l (SEQ id no. 2), CEG94741 .1 (SEQ id n ° 3), SCQ66536.1 (SEQ id n ° 4), SBT28366.1, WP_097850726.l (SEQ id n ° 5), WP_060760754.l (SEQ id n ° 6), and WP_060763255. l (SEQ id n ° 7).
  • mucositis means a pathology defined by the presence of inflammatory and / or ulcerative lesions of the oral and / or gastrointestinal tract.
  • the mucositis is a gastrointestinal mucositis.
  • the use according to the invention is aimed at treating or preventing the alteration of the tight junctions of the epithelial tissue associated with mucositis.
  • subject is meant, within the meaning of the present invention, an animal, preferably a mammal, and even more preferably a human. Note that it corresponds more particularly to a subject who is under the blow or will be the subject of a treatment by radiotherapy or chemotherapy.
  • the strain of the invention can be used in combination with one or more other probiotic species for the preparation of probiotic compositions. They can be used in the form of whole bacteria, living or not, and also in the form of a bacterial lysate, or in the form of bacterial fractions.
  • the composition of the invention comprises at least 10 6 , preferably at least 10 7 , and at most 5 ⁇ 10 10 bacteria belonging to the genus Propionibacterium per ml.
  • the composition volume is at least one ml.
  • the administration of the composition according to the invention can go up to 500 ml or even a liter.
  • composition of the invention comprises one or more acceptable excipients.
  • excipient is meant, within the meaning of the present invention, any substance, other than the active principle of the probiotic composition, intended to confer on said probiotic composition particular physical, chemical or taste characteristics and not interacting with the active principle .
  • Said excipients may be of natural origin or of synthetic origin.
  • acceptable excipients include: sugars such as sucrose, glucose, fructose, palatinose, trehalose, lactose and xylose; polyols such as sorbitol, xylitol, erythritol, and lactitol; emulsifiers such as sucrose esters of fatty acids, glycerol esters of fatty acids and lecithin; thickeners and stabilizers such as carrageenan, xanthan gum, guar gum, pectin and locust bean gum; acidifiers such as citric acid, lactic acid and malic acid; fruit juices such as lemon juice, orange juice and berry juice; vitamins such as vitamin A, vitamin B, vitamin C, vitamin D and vitamin E; and minerals such as calcium, iron, manganese and zinc.
  • sugars such as sucrose, glucose, fructose, palatinose, trehalose, lactose and xylose
  • polyols such as sorbito
  • the composition of the invention is in a form which can be administered orally.
  • Such compositions can take the form of capsules, tablets, powders, pastilles, granules, soft capsules, reconstitutable powders, suspensions, gels, frozen compositions, oral liquid preparations or even conventional food products. .
  • the composition of the invention is in the form of a capsule.
  • Tablets and capsules for oral administration may be single-dose and may contain one or more acceptable excipients such as binders, fillers, lubricants, wetting agents or even disintegrating agents.
  • the tablets can be coated by methods well known in the pharmaceutical field.
  • Liquid oral preparations can for example be in the form of aqueous or oily suspensions, solutions, emulsions, syrups or even elixirs in the form of dehydrated products which can be reconstituted with water or any other acceptable vehicle.
  • Such liquid preparations can contain commonly used additives such as suspending agents, emulsifiers, non-aqueous vehicles, preservatives and optionally flavorings and / or colorings.
  • composition of the invention is in the form of a food product or a food supplement.
  • food product and “conventional food product”, is meant, within the meaning of the present invention, any substance or product, having been transformed, partially transformed or unprocessed and intended to be ingested by humans or animals.
  • Food products can be of animal, vegetable or mineral origin. Food products provide the body with the energy and nutrients it needs to function.
  • the food product according to the invention can be a liquid, therefore a drink, or a solid.
  • dietary supplement is meant, within the meaning of the present invention, any product containing nutrients beneficial to health and which are added to the normal diet of humans or animals.
  • Food supplements contain, but are not limited to, vitamins, minerals, amino acids, enzymes and probiotics.
  • composition of the invention can be in the form of a dairy product, for example based on cow's milk, goat's milk or else sheep's milk, which can be in liquid, solid or powder form (milk, fermented milk , butter, cheese, cream, etc.).
  • prevent and “prevention” is meant, within the meaning of the present invention, to avoid the appearance of a disease, a disorder or one or more signs and / or symptoms of a disease or a trouble.
  • treating and “treatment” is meant, within the meaning of the present invention, improving or remedying a disease, a disorder or one or more signs and / or symptoms of a disease or a disorder.
  • the invention also includes a method of preventing and / or treating mucositis, comprising a step of administering to a subject a therapeutically effective amount of at least one bacterial strain of Propionibacterium freudenreichii.
  • terapéuticaally effective amount is meant, within the meaning of the present invention, the minimum amount necessary for obtaining the effect expected by the administration of such a strain or of such a composition.
  • the composition of the invention comprises at least 10 6 , preferably at least 10 7 , and at most 5 ⁇ 10 10 bacteria belonging to the genus Propionibacterium per ml.
  • the wild strain P. freudenreichii CIRM-BIA 129 (WT) and the mutant strain P. freudenreichii CIRM-BIA 129AslpB (CBl29AslpB) (do Carmo et al., 2017) were cultivated at 30 ° C. in a YEL culture medium comprising yeast extract and lactate.
  • the mutant CBl29AslpB strain the YEL culture medium is supplemented with chloramphenicol (10 pg.mL-1). The growth of P.
  • freudenreichii strains is then monitored using a spectrophotometer, following the optical density of the cultures at 650 nm (OD650nm) and also by determining the number of units capable of forming colonies (CLUs) by culturing a given volume. of seeded YEL medium.
  • HT-29 cells were cultured in a T-25 flask until confluence (10 6 cells / ml). The culture medium was then renewed with a culture medium without antibiotic and the cells (a million cells per well) were or were not co-incubated for 7 h with a medium comprising or not lipopolysaccharide (LPS) at 100 ng / ml and in presence or absence of bacteria (10 million bacteria per well) of the wild strain WT or of the mutant strain CBl29AslpB (YEL medium alone was used as a control).
  • LPS lipopolysaccharide
  • RNAs were then isolated using the reagent TRIZOL (INVITROGEN AMBION) according to the manufacturer's recommendations.
  • the complementary DNAs were then synthesized using the QSCRIPT CDNA SYNTHESIS kit (QUANTA BIOSCIENCES), again following the manufacturer's instructions.
  • the determination of the expression of different cellular genes was then carried out by real-time PCR, using gene-specific probes, on a CLX96 system (BIO-RAD) and the quantification of the mRNA level of the targeted genes was carried out using the CFX ManagerTM software. For information, the levels of expression of RNA were normalized compared to the level of expression of GAPDH and actin.
  • mice used female BALB / c mice with an age between 6 and 8 weeks, which were maintained in a temperature-controlled atmosphere and with normal access to water and food.
  • mice had continuous access for 10 days to food comprising either YEL culture medium or a culture of propionibacteria on the same YEL culture medium, containing either 10 9 CFU / ml of bacteria from the wild strain P. freudenreichii, or of the mutant strain P. freudenreichii CBl29AslpB.
  • the mice then received a single intraperitoneal injection of 5-FU (300 mg / kg) on day 11 before being finally euthanized on day 14.
  • 5-FU 300 mg / kg
  • mice received an injection of saline solution (NaCl 0.9%).
  • T cell subpopulations in the spleen of mice is measured by flow cytometry. 10 6 cells are isolated from the mouse spleen and resuspended in a PBS solution comprising 0.2% BSA and 0.1% NaN 3 pH 7.4. To label cell surface antigens, cells are incubated with CD4 monoclonal antibodies (GK 1.5 APC EBIOSCIENCE) for 30 minutes at 4 ° C.
  • the cells are then fixed and permeabilized using the FIXATION / PERMEABILIZATION WORKING SOLUTION (EBIOSCIENCE) for 1 hour before incubation with ALEXA FLUOR 488 RAT ANTI-MOUSE FOXP3 (BD PHARMINGEN) or PE MOUSE ANTI-MOUSE RORyT (BD PHARMINGEN) antibodies. ) for 30 minutes at 4 ° C. After washing, the cells are sorted using a FACS CALIBUR cytometer (BECTON DICKINSON). The T cells are first isolated on the basis of the CD4-positive labeling, then the RORyT-positive and FOXP3-positive cells are selected and counted.
  • EBIOSCIENCE FIXATION / PERMEABILIZATION WORKING SOLUTION
  • ALEXA FLUOR 488 RAT ANTI-MOUSE FOXP3 BD PHARMINGEN
  • PE MOUSE ANTI-MOUSE RORyT BD PHARMINGEN
  • the RORyT-positive and FOXP3-positive T cells are involved in chronic inflammatory bowel disease such as ulcerative colitis or Crohn's disease. It is possible that after consumption of P. freudenreichii AslpB, naive T cells begin to express RORyT and induce a pro-inflammatory response via the Thl7 / IL-l7A pathway. Interleukin 17A can modulate activation and recruitment of neutrophils in the ileum. Furthermore, the mutant strain P. freudenheimii AslpB induces an increase in the CD4 + Foxp3 + regulatory T cell subpopulation.
  • CD4 + regulatory T cells are very abundant in the intestinal mucosa, and their proliferation appears to be part of a mechanism to control inflammation mediated by Th17 effector cells.
  • Propionibacterium freudenreichii AslpB induces the production of pro-inflammatory Thl7 cells in the spleen of mice, unlike the strain Propionibacterium freudenreichii WT.
  • cytokine uptake was revealed with biotinylated monoclonal antibodies directed against these specific cytokines according to the manufacturer's instructions.
  • freudenreichii prevents the induction of the expression of the pro-inflammatory cytokines IL-12 and IL-1 b, in the mice affected by mucositis, compared to the control (YEL medium), as shown Figures 3B and 3C.
  • FIG. 3D shows that a treatment comprising the wild strain P. freudenreichii WT significantly increases the IL-10 / IL-12 ratio in mice with mucositis, unlike a treatment comprising the mutant strain P. freudenreichii AslpB, which is characteristic of a decrease in inflammation.
  • RNALATER AMBION
  • DNase I DNase I
  • a histological inflammation score is determined based on the measurement of the three major histological changes induced by mucositis: (i) intensity of infiltration of mononuclear and polynuclear cells into the lamina propria, (ii) presence of ulcers and erosion, and (iii) alteration of the structure of the mucosa.
  • a score is assigned according to the severity of tissue damage: (0) no damage; (1) weak; (2) average; (3) severe.
  • a morphometric analysis is also carried out on the basis of the analysis of ten images of the ileum of each mouse.
  • the granular density of Paneth cells is determined by evaluation of the intracellular volume occupied by the secretory granules.
  • the size of the villi and the depth of the crypts is measured from the tip of the villus to the base of the adjacent crypt, which allows the calculation of a ratio of villus size / depth of the crypts.
  • results show, in the control group, clear changes in the morphological structure of the ileum with an increase / thickening of the submucosal layer and of the muscular layer, an increase in the number of inflammatory cells. and decreased / shortened villi, thinner epithelium, and increased number of mononuclear or polynuclear inflammatory cells infiltrated into the lamina propria (Ligure 5).
  • Consumption of the wild strain P. freudenheimii reduces both the infiltration of inflammatory cells and damage to the intestinal mucosa (in particular by partially preventing the decrease in villi), which induces a lower histological score than the negative controls, which the mutant strain P. freudenheimii CB 129AslpB does not do.
  • Intestinal permeability is measured 72 h after induction of mucositis at 5 FU.
  • the effect of a probiotic intake on the weight loss caused by mucositis following the administration of 5-FU in mice is studied.
  • the weight of the mice is measured before and after the injection of 5-FU.
  • the results demonstrate the possible use of a bacterial strain belonging to the genus Propionibacterium for the treatment or prevention of mucositis in a human subject.

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Abstract

La présente invention est relative au domaine des probiotiques. Plus particulièrement, la présente invention porte sur une composition comprenant au moins une souche bactérienne appartenant au genre Propionibacterium pour une utilisation dans le traitement ou la prévention de la mucite chez un sujet, de préférence pour le traitement ou la prévention de l'altération des jonctions serrées du tissu épithélial associée à la mucite.

Description

DESCRIPTION
Titre : NOUVEAU TRAITEMENT DE LA MUCITE DOMAINE DE L’INVENTION
La présente invention se rapporte à la mucite et, notamment, à la prévention ou au traitement de ses deux composantes que sont l’inflammation du tissu épithélial et l’altération des jonctions serrées ( zona occludens) au sein de ce tissu épithélial.
ART ANTERIEUR
La mucite est une pathologie définie par la présence de lésions inflammatoires et/ou ulcératives du tractus oral et/ou gastro-intestinal. Si sa survenue peut être la résultante d’une maladie infectieuse, d’une déficience immunitaire ou encore d’une toxicité médicamenteuse, son apparition résulte en général du suivi d’une thérapie anti-cancéreuse. Ainsi, si 20 à 40% des patients suivant une chimiothérapie en sont victime, elle est présente chez plus de 80% des patients suivant une chimiothérapie à haute dose et chez presque tous les patients soufrant d’un cancer tête ou cou suivant une radiothérapie.
Cette apparition de la mucite est étroitement associée à une disfonction et à la mort des cellules épithéliales, avec une implication des cellules endothéliales. Si les mécanismes inducteurs diffèrent entre mucite induite par chimiothérapie ou par radiothérapie, les étapes subséquentes montrent des similarités. La séquence d’évènements implique ainsi consécutivement l’apparition d’espèces réactives de l’oxygène, une mortalité cellulaire dite clonogénique (avec une perte de la capacité proliférative), la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires suivie d’une apoptose des cellules épithéliales et endothéliales, l’altération des jonctions serrées ( zona occludens) au sein des tissus épithéliaux et enfin la formation d’ulcères.
Les conséquences d’une mucite peuvent être dramatiques puisque, outre la dénutrition qu’elle peut entraîner chez le patient, sa survenue amène souvent à modifier, voir parfois à interrompre, le protocole de traitement anti-cancéreux du patient, impactant de ce fait les chances de succès de celui-ci. Les solutions de traitement de la mucite disponibles pour le praticien sont décrites dans LALLA et a/.,(MASCC=ISOO Clinical Practice Guidelines for the Management of Mucositis Secondary to Cancer Therapy », Cancer, vol.120(10), p: 1453-1461, 2014) et sont peu nombreuses.
Ainsi, et pour le traitement de la mucosité gastro-intestinale, il est possible d’utiliser a) une administration intraveineuse d’amifostine (cytoprotecteur) pour essayer de prévenir son apparition chez des patients soumis à radiothérapie ou encore b) du lopéramide (Anti-diarrhéique) pour éviter au moins la survenue de diarrhée chez des patients sous chimiothérapie standard ou haute dose.
Maintenant, et du fait d’effets secondaires ou de résultats contradictoires, différents autres agents ne peuvent bénéficier d’aucune recommandation en lien avec le traitement de la mucite parmi lesquels le charbon actif, les anti-inflammatoires tels que le budésonide, le balsalazide ou le célécoxib, des cytoprotecteurs tel que le folinate de sodium, des antibiotiques parmi lesquels la cefixime, la lévofloxacine, le métronidazole ou la néomycine, des facteurs de croissance des cellules épithéliales comme la palifermine.
De toute évidence, il est difficile de traiter la mucite et, plus spécifiquement, ses deux composantes que sont 1) l’inflammation du tissu épithélial et 2) l’altération des jonctions serrées du tissu épithélial. Il est d’ailleurs à noter qu’il résulte précisément de cette double composante, l’inefficacité des anti-inflammatoires à traiter la mucite et à permettre le retour à un tissu épithélial normal.
Il existe donc un besoin de disposer d’un nouveau moyen de prévenir et/ou de traiter la mucite, notamment gastro-intestinale, qui soit à même de traiter ses deux composantes, à savoir capables de 1) réduire l’inflammation et 2) de restaurer les jonctions serrées. SOMMAIRE DE L’INVENTION
Les inventeurs ont maintenant mis en évidence que différentes souches bactériennes appartenant au genre Propionibacterium présentaient, outre une action anti-inflammatoire, une action de consolidation des jonctions serrées au sein du tissu épithélial.
Partant de cette observation d’une action potentielle sur les deux composantes de la mucite, les inventeurs ont donc testés rutilisation de ces souches sur une mucite chimio-induite. Il a résulté de ces expérimentations une très nette amélioration de l’état des sujets traités. L’analyse du mécanisme d’action associé a en outre permis de montrer que la protéine SlpB joue un rôle central dans cette action sur les deux composantes de la mucite.
Certes, l’utilisation de probiotiques en vue de traiter certains symptômes de la mucite avait été suggérée avec l’utilisation d’espèces du genre Lactobacillus pour la prévention des seules diarrhées chez des patients sous radiothérapies et chimiothérapies avec des complications pelviennes (CIORBA et al., Curr Opin Support Palliai Care, vol.9(2), p: 157-162, 2015). Maintenant, cette publication montrait que, même pour ce cadre restreint et bien distinct de l’invention, il existait une très grande variabilité. Ainsi, si des bactéries du genre Lactobacillus s’étaient montrées efficaces, cela n’avait pas été le cas des bactéries du genre Bifidobacterium. De surcroît, cette efficacité avait montré une importante variabilité inter-espèce, voir même inter-souche, la souche Lactobacillus rhamnosus GG s’étant montré particulièrement efficace. Finalement, rien ne laissait présager que, à la différence des composants anti-inflammatoires testés jusqu’alors, des souches bactériennes du genre Propionibacterium pouvaient être utilisées non pas pour la prévention des diarrhées chez des patients sous radiothérapies et chimiothérapies avec des complications pelviennes, mais bien pour prévenir ou traiter avec succès un sujet souffrant de mucite.
En conséquence, un premier objet de l’invention porte sur une composition comprenant au moins une souche bactérienne appartenant au genre Propionibacterium pour une utilisation dans le traitement ou la prévention de la mucite chez un sujet, de préférence pour le traitement ou la prévention de l’altération des jonctions serrées du tissu épithélial associée à la mucite.
DESCRIPTION DES FIGURES
La figure 1 présente l’expression relative, déterminée par RT-PCR, des gènes codant pour différentes cytokines, à savoir l’interleukine 10 (A), l’interleukine 8 (B), l’interféron alpha (C) et le TNF alpha (D), dans des cellules HT-29 mise en contact avec des Lipopolysaccharides (LPS) et/ou avec la souche Propionibacterium freudenreichii 129 Wild Type (WT) ou avec la souche mutante délétée Propionibacterium freudenreichii 129 AslpB (AslpB). Ces mesures ont été effectuées en triplicat sur trois cultures indépendantes par conditions. Les moyennes et déviations standards sont donc calculées sur 9 mesures par condition. Les astérisques représentent la différence statistique significative entre les souches : * p<0,05 ; ** r<0,01 ; *** r<0,001 ; **** p<0,000l.
La figure 2 présente le nombre absolu et la fréquence des cellules CD4+ RORDT+ (A) et des cellules CD4+ FOXP3+ (B) dans la rate de souris souffrant d’une mucite induite par une injection de 5-FU (le groupe contrôle a subi une injection de solution saline), et ayant reçu un traitement à base d’eau, de milieu YEL, de la bactérie Propionibacterium freudenreichii Wild-type (WT), ou de la souche mutante délétée Propionibacterium freudenreichii AslpB (AslpB). Les fréquences ont été mesurées par cytométrie en flux. Les moyennes et déviations standards ont été calculées sur la base de 5 souris par groupes). Les astérisques représentent la différence statistique significative entre les souches : * p<0,05 ; ** r<0,01 ; *** r<0,001 ; **** p<0,000l.
La figure 3 présente le dosage de différentes cytokines par ELISA chez des souris souffrant d’une mucite induite par une injection de 5-FU (le groupe contrôle a subi une injection de solution saline), et ayant reçu un traitement à base d’eau, de milieu YEL, de la bactérie Propionibacterium freudenreichii wild-type (WT), ou de la souche mutante délétée Propionibacterium freudenreichii AslpB (AslpB). Les cytokines étudiées sont F Interleukine- 10 (Figure 3A), F Interleukine- 12 (Figure 3B), l’Interleukine- 1B (Figure 3C). De plus, le ratio IL-10/IL-12 est présenté en figure 3D. Les moyennes et déviations standards ont été calculées sur la base de mesures en triplicats sur 3 réplicats indépendants d’iléons de 6 animaux par groupes. Les astérisques représentent la différence statistique significative entre les souches : * p<0,05 ; ** r<0,01 ; *** r<0,001 ; **** p<0,000l.
La figure 4 présente le niveau relatif d’expression de l’ARNm de la Claudine 1, mesuré par RT-PCR, chez des souris souffrant d’une mucite induite par une injection de 5-FU (le groupe contrôle a subi une injection de solution saline), et ayant reçu un traitement à base d’eau, de milieu YEL, de la bactérie Propionibacterium freudenreichii Wild-type (WT), ou de la souche mutante délétée Propionibacterium freudenreichii AslpB (AslpB). Les moyennes et déviations standards ont été calculées sur la base de mesures en triplicats sur 3 réplicats indépendants d’iléons de 6 animaux par groupes. Les astérisques représentent la différence statistique significative entre les souches : * p<0,05 ; ** r<0,01 ; *** r<0,001 ; **** p<0,000l. La figure 5 présente des coupes d’iléons de souris souffrant d’une mucite induite par une injection de 5-FU (le groupe contrôle a subi une injection de solution saline), et ayant reçu un traitement à base d’eau, de milieu YEL, de la bactérie Propionibacterium freudenreichii Wild-type (WT), ou de la souche mutante délétée Propionibacterium freudenreichii AslpB (AslpB) (Figure 5B). Les coupes d’iléons sont colorées à l’hématoxyline et à l’éosine, et correspondent à un grossissement objectif x20. La barre d’échelle correspond à 100 pm. Leurs scores histologiques associés à l’inflammation sont présentés en Figure 5A. Les moyennes et déviations standards ont été calculées sur la base de 18 sections d’iléons par groupes (3 sections d’iléons indépendantes de 6 souris par groupes). Les astérisques représentent la différence statistique significative entre les souches : * p<0,05 ; ** r<0,01 ; *** r<0,001 ; **** p<0,000l.
La figure 6 présente la hauteur des villosités (Figure 6A), le rapport hauteur des villosités / profondeur des cryptes (Figure 6B) et la densité granulaire des cellules de Paneth (Figure 6C) d’iléons de souris souffrant d’une mucite induite par une injection de 5-FU (le groupe contrôle a subi une injection de solution saline), et ayant reçu un traitement à base d’eau, de milieu YEL, de la bactérie Propionibacterium freudenreichii Wild-type (WT), ou de la souche mutante délétée Propionibacterium freudenreichii AslpB (AslpB). L’analyse morphométrique microscopique des granules des cellules de Paneth a été réalisée sur la base de 10 images d’iléons à un grossissement objectif x40. Les moyennes et déviations standards ont été calculées sur la base de 18 sections d’iléons par groupes (3 sections d’iléons indépendantes de 6 souris par groupes). Les astérisques représentent la différence statistique significative entre les souches : * p<0,05 ; ** r<0,01 ; *** r<0,001 ; **** p<0,000l.
La figure 7 représente la perméabilité intestinale mesurée 72 h après induction d’une mucite. La radioactivité du DTPA-TC99m a été mesurée dans le sang des souris. Les moyennes et déviations standards ont été calculées sur la base d’une mesure indépendante pour 5 souris par groupes. Les astérisques représentent la différence statistique significative entre les souches : * p<0,05 ; ** r<0,01 ; *** r<0,001 ; **** p<0,000l.
La figure 8 représente la perte de poids observée chez les souris après induction d’une mucite par injection de 5-LU sur les différents groupes de souris. Les moyennes et déviations standards ont été calculées sur la base de 18 sections d’iléons par groupes (3 sections d’iléons indépendantes de 6 souris par groupes). Les astérisques représentent la différence statistique significative entre les souches : * p<0,05 ; ** r<0,01 ; *** r<0,001 ; **** p<0,000l.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
Dans le cadre de l’utilisation selon l’invention, ladite au moins une souche bactérienne appartenant au genre Propionibacterium, est envisagée comme un probiotique.
Par "probiotique", on entend, au sens de la présente invention, des microorganismes vivants ou morts qui, administrés en quantité suffisante à un hôte, animal notamment, ont un effet bénéfique sur la santé de l’hôte. Dans le cadre de 1’ uti 1 i sation selon l’invention, la souche bactérienne appartenant au genre Propionibacterium peut être administrée à l’homme ou à l’animal sans risque pour sa santé ce qui constitue un avantage indéniable.
Par souche bactérienne appartenant au genre Propionibacterium, on entend une souche bactérienne choisie dans le groupe comprenant P. freudenreichii, P. thoenii, P. jensenii et P. acidipropionici, de préférence la souche bactérienne appartenant au genre Propionibacterium appartient à l’espèce P. freudenreichii.
Cette souche bactérienne exprime avantageusement la protéine SlpB (surface layer protein B), de préférence elle exprime une protéine SlpB de l’espèce P. freudenreichii.
A titre d’exemple de protéine SlpB de l’espèce P. freudenreichii , on peut citer les protéines présentant les numéros d’accession WP_051733954.1 (SEQ id n°l), WP_055345346.l (SEQ id n°2), CEG94741.1 (SEQ id n°3), SCQ66536.1 (SEQ id n°4), SBT28366.1, WP_097850726.l (SEQ id n°5), WP_060760754.l (SEQ id n°6), et WP_060763255.l (SEQ id n°7).
Par « mucite », on entend une pathologie définie par la présence de lésions inflammatoires et/ou ulcératives du tractus oral et/ou gastro-intestinal. De préférence, la mucite est une mucite gastro-intestinale.
De préférence encore, l’utilisation selon l’invention vise le traitement ou la prévention de l’altération des jonctions serrées du tissu épithélial associée à la mucite.
Par « sujet », on entend, au sens de la présente invention, un animal, de manière préférée un mammifère, et de manière encore préférée un humain. A noter qu’il correspond plus particulièrement à un sujet qui est sous le coup ou va faire l’objet d’un traitement par radiothérapie ou par chimiothérapie.
De manière préférée, la souche de l’invention peut être utilisée en association avec une ou plusieurs autres espèces probiotiques pour la préparation des compositions probiotiques. Elles peuvent être utilisées sous forme de bactéries entières vivantes ou non, et aussi sous forme de lysat bactérien, ou sous forme de fractions bactériennes.
Selon un mode de réalisation préféré, la composition de l’invention comprend au moins 106, de préférence au moins 107, et au plus 5xl010 bactéries appartenant au genre Propionibacterium par mL.
Avantageusement, le volume de composition est d’au moins un mL. Maintenant, l’administration de la composition selon l’invention peut aller jusqu’à 500 mL voir même un litre.
De manière préférée, la composition de l’invention comprend un ou plusieurs excipients acceptables.
Par « excipient » on entend, au sens de la présente invention toute substance, autre que le principe actif de la composition probiotique, destinée à conférer à ladite composition probiotique des caractéristiques physiques, chimiques ou gustatives particulières et n’interagissant pas avec le principe actif. Lesdits excipients peuvent être d’origine naturelle ou d’origine synthétique.
Un homme du métier sera à même, au regard de ses connaissances, d’identifier un excipient acceptable pour une composition probiotique. Des exemples d’excipients acceptables incluent : des sucres tels que le saccharose, le glucose, le fructose, le palatinose, le tréhalose, le lactose et le xylose ; des polyols tels que le sorbitol, le xylitol, l’érythritol, et le lactitol ; des émulsifiants tels que les esters de saccharose d’acides gras, les esters de glycérol d’acides gras et la lécithine ; des épaississants et stabilisants tels que le carraghénane, la gomme de xanthane, la gomme de guar, la pectine et la gomme de caroube ; des acidifiants tels que l’acide citrique, l’acide lactique et l’acide malique ; des jus de fruits tels que le jus de citron, le jus d’orange et des jus de baies ; des vitamines telles que la vitamine A, la vitamine B, la vitamine C, la vitamine D et la vitamine E ; et des minéraux tels que le calcium, le fer le manganèse et le zinc.
Selon un autre mode de réalisation préféré, la composition de l’invention se présente sous une forme administrable par voie orale. De telles compositions peuvent prendre la forme de gélules, de comprimés, de poudres, de pastilles, de granules, de capsules molles, de poudres reconstituables, de suspensions, de gels, de compositions surgelées, de préparations liquides orales ou encore de produits alimentaires conventionnels.
De préférence, la composition de l’invention se présente sous la forme d’une gélule.
Les comprimés et les gélules à administration orale peuvent être unidoses et peuvent contenir un ou plusieurs excipients acceptables tels que des liants, des agents de remplissage, des lubrifiants, des agents mouillant ou encore des agents désintégrant. Les comprimés peuvent être enrobés par des méthodes bien connues dans le domaine pharmaceutique .
Les préparations orales liquides peuvent par exemple être sous la forme de suspensions aqueuses ou huileuses, de solutions, d’émulsions, de sirops ou encore d’élixirs sous la forme de produits déshydratés reconstituables avec de l’eau ou tout autre véhicule acceptable. De telles préparations liquides peuvent contenir des additifs communément utilisés tels que des agents de suspension, des émulsifiants, des véhicules non aqueux, des conservateurs et éventuellement des arômes et/ou des colorants.
Alternativement, la composition de l’invention se présente sous la forme d’un produit alimentaire ou un complément alimentaire.
Par « produit alimentaire » et « produit alimentaire conventionnel », on entend, au sens de la présente invention, toute substance ou produit, ayant été transformé, partiellement transformé ou non transformé et destiné à être ingéré par l’homme ou l’animal. Les produits alimentaires peuvent être d’origine animale, végétale ou minérale. Les produits alimentaires apportent à l’organisme l’énergie et les nutriments nécessaires à son fonctionnement. Le produit alimentaire selon l’invention peut être un liquide, donc une boisson, ou solide.
Par « complément alimentaire », on entend, au sens de la présente invention, tout produit contenant des nutriments bénéfiques pour la santé et qui sont ajoutés au régime alimentaire normal des être humains ou des animaux. Les compléments alimentaires contiennent, mais sans s’y limiter, des vitamines, des minéraux, des acides aminés, des enzymes et des probiotiques.
La composition de l’invention peut se présenter sous la forme d’un produit laitier, par exemple à base de lait de vache, de chèvre ou encore de brebis, qui peut être sous forme liquide, solide ou de poudre (lait, lait fermenté, beurre, fromage, crème, etc.).
Par « prévenir » et « prévention » on entend, au sens de la présente invention, éviter l'apparition d'une maladie, d'un trouble ou d'un ou plusieurs signes et/ou symptômes d’une maladie ou d’un trouble.
Par « traiter » et « traitement » on entend, au sens de la présente invention, améliorer ou remédier à une maladie, un trouble ou à un ou plusieurs signes et/ou symptômes d’une maladie ou d’un trouble.
L’invention comprend également une méthode de prévention et/ou de traitement de la mucite, comprenant une étape d’administration à un sujet d’une quantité thérapeutiquement efficace d’au moins une souche bactérienne de Propionibacterium freudenreichii.
Par « quantité thérapeutiquement efficace », on entend, au sens de la présente invention, la quantité minimale nécessaire à l’obtention de l’effet attendu par l’administration d’une telle souche ou d’une telle composition.
Selon un mode de réalisation préféré, la composition de l’invention comprend au moins 106, de préférence au moins 107, et au plus 5xl010 bactéries appartenant au genre Propionibacterium par mL.
Maintenant, les différents modes de réalisation préférés de la méthode selon l’invention sont les mêmes que pour l’utilisation selon l’invention.
Les exemples qui suivent sont fournis à titre d’illustration et ne sauraient limiter la portée de la présente invention. EXEMPLES
1. Etude de l’effet anti-inflammatoire de Propionibacterium freudenreichii
a. Etude in vitro de l’effet anti-inflammatoire et pro-jonctions serrées de Propionibacterium freudenreichii sur des cellules intestinales HT-29 présentant une inflammation induite par LPS
La souche sauvage P. freudenreichii CIRM-BIA 129 (WT) et la souche mutante P. freudenreichii CIRM-BIA l29AslpB (CBl29AslpB) (do Carmo et al., 2017) ont été cultivées à 30°C dans un milieu de culture YEL comprenant un extrait de levure et du lactate. Pour la souche mutante CBl29AslpB, le milieu de culture YEL est supplémenté avec du chloramphénicol (10 pg.mL-l). La croissance des souches de P. freudenreichii est alors suivie au spectrophotomètre en suivant la densité optique des cultures à 650 nm (OD650nm) et également en déterminant le nombre d’unités capables de former des colonies (CLUs) en mettant en culture un volume donné de milieu YEL ensemencé.
Dans le but de déterminer leur activité potentielle sur le tissu intestinal, ces deux souches bactériennes ont été mises en contact avec des cellules épithéliales intestinales humaines de la lignée HT-29.
Pour ce faire, des cellules HT-29 ont été cultivées en flasque T-25 jusqu’à confluence (106 cellules/mL). Le milieu de culture a ensuite été renouvelé avec un milieu de culture sans antibiotique et les cellules (un million de cellules par puits) ont été coincubées ou non pendant 7h avec un milieu comprenant ou non du lipopolysaccharide (LPS) à lOOng/mL et en présence ou non de de bactéries (10 millions de bactéries par puits) de la souche sauvage WT ou de la souche mutante CBl29AslpB (du milieu YEL seul a été utilisé à titre de contrôle).
Après une co-culture de 7 heures, les ARN cellulaires ont ensuite été isolés en utilisant le réactif TRIZOL (INVITROGEN AMBION) en suivant les recommandations du fabricant. Sur la base de ces ARN cellulaires, les ADN complémentaires ont ensuite été synthétisés en utilisant le kit QSCRIPT CDNA SYNTHESIS (QUANTA BIOSCIENCES) en suivant, là encore, les instructions du fabricant. La détermination de l’expression de différents gènes cellulaires a alors été réalisée par PCR en temps réel, à l’aide de sondes gène-spécifiques, sur un système CLX96 (BIO-RAD) et la quantification du niveau d’ARNm des gènes ciblés a été effectuée en utilisant le logiciel CFX ManagerTM. Pour information, les niveaux d’expression des ARN ont été normalisés par rapport au niveau d’expression de la GAPDH et de l’actine.
Les résultats ont mis en évidence une forte induction de l’expression de l’interleukine 10 dans les cellules HT-29 en réponse à la co-incubation avec P. freudenreichii CIRM-BIA 129 (WT) et en l’absence de LPS, laquelle cytokine a une forte activité immunomodulatrice (Figure 1A). A noter que cette induction est absente en présence de la souche mutante CBl29AslpB. La protéine SlpB est donc critique pour cette induction.
De même, les résultats mettent en évidence une forte induction de cytokines pro inflammatoires IL-8 (Figure 1B ; expression relative de l’ARNm : 11,36 ± 2,56 ; de manière significative p < 0,0001), IFN-a (Figure 1C) et TNF-a (Figure 1D) en présence de LPS ou de LPS avec la souche mutante CBl29AslpB. En parallèle, le niveau d’expression de ces cytokines dans des cellules HT-29 en présence de LPS est quasi- normal en présence de la souche sauvage de P. freudenreichii WT.
A noter que les résultats ont montré également et de façon inattendue que l’expression de la Claudine- 1, laquelle protéine est critique en ce qui concerne la structuration des jonctions serrées, est augmentée pour les cellules cultivées en présence de la souche sauvage. b. Etude in vivo de l’impact de Propionibacterium freudenreichii sur les sous-populations des lymphocytes T chez la souris
Pour tester cette hypothèse, les inventeurs ont utilisé des souris femelles BALB/c présentant un âge compris entre 6 et 8 semaines, qui ont été maintenues dans une atmosphère à température contrôlée et avec un accès normal à l’eau et à la nourriture.
Pour le traitement, les souris ont eu accès en continu et pendant 10 jours à une nourriture comprenant soit du milieu de culture YEL, soit une culture de propionibactéries sur le même milieu de culture YEL, contenant soit 109 CFU/mL de bactéries de la souche sauvage P. freudenreichii , soit de la souche mutante P. freudenreichii CBl29AslpB. Pour ensuite induire une mucite, les souris ont ensuite reçu une injection intrapéritonéale unique de 5-FU (300 mg/kg) au jour 11 avant d’être finalement euthanasiées au jour 14. A titre de contrôle, un groupe de souris a reçu une injection de solution saline (NaCl 0,9%).
La répartition des sous-populations de lymphocyte T dans la rate des souris est mesurée par cytométrie en flux. 106 cellules sont isolées de la rate des souris et resuspendues dans une solution de PBS comprenant 0,2 % de BSA et 0,1 % de NaN3 pH7,4. Pour marquer les antigènes de surface cellulaires, les cellules sont incubées avec des anticorps monoclonaux CD4 (GK 1,5 APC EBIOSCIENCE) pendant 30 minutes à 4°C. Les cellules sont ensuite fixées et perméabilisées à l’aide de la FIXATION/PERMEABILIZATION WORKING SOLUTION (EBIOSCIENCE) pendant lh avant incubation avec des anticorps ALEXA FLUOR 488 RAT ANTI- MOUSE FOXP3 (BD PHARMINGEN) ou PE MOUSE ANTI-MOUSE RORyT (BD PHARMINGEN) pendant 30 minutes à 4°C. Après lavage, les cellules sont triées à l’aide d’un cytomètre FACS CALIBUR (BECTON DICKINSON). Les cellules T sont d’abord isolées sur la base du marquage CD4-positif, puis les cellules RORyT-positive et FOXP3-positive sont sélectionnées et comptées.
Comme le montre la figure 2, la consommation de P. freudenreichii AslpB entraîne une augmentation significative de la fréquence des cellules T RORyT-positive et FOXP3-positive. Cette augmentation n’est pas observée lors de la consommation de Propionibacterium freudenreichii WT.
Les cellules T RORyT-positive et FOXP3-positive sont impliquées dans les maladies chroniques inflammatoires de l’intestin telles que la rectocolite hémorragique ou la maladie de Crohn. Il est possible qu’ après consommation de P. freudenreichii AslpB, les cellules T naïves commencent à exprimer RORyT et induisant une réponse pro-inflammatoire via la voie Thl7/IL-l7A. L’interleukine 17A peut moduler l’activation et le recrutement des neutrophiles dans l’iléon. Par ailleurs, la souche mutante P. freudenreichii AslpB induit l’accroissement de la sous population de cellules T régulatrices CD4+ Foxp3+. Les cellules T régulatrices CD4+ exprimant Foxp3 sont très abondantes dans la muqueuse intestinale, et leur prolifération semble être partie d’un mécanisme visant à contrôler l’inflammation médiée par les cellules effectrices Thl7. Ainsi, Propionibacterium freudenreichii AslpB induit la production de cellules pro-inflammatoire Thl7 dans la rate des souris, contrairement à la souche Propionibacterium freudenreichii WT.
c. Etude in vivo de l’impact de Propionibacterium freudenreichii sur la production de cytokines dans l’iléon chez la souris
Pour déterminer l’expression des cytokines par ELISA, les iléons ont été collectés, pesés et homogénéisés dans une solution de PBS comprenant 0,05% de TWEEN-20, 0,1 mM de chlorure de benzéthonium, 0,1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyl, 10 mM d’EDTA et 20 U d’aprotinine. Après homogénéisation du matériel, les échantillons ont été centrifugés à 3 000g pendant 10 minutes et le surnageant a alors été collecté pour effectuer les mesures de cytokines par la méthode ELISA. Ces surnageants ont été additionnés à des plaques de microtitration préalablement enduites d’anticorps dirigés contre l’IL-l0, l’IL-l2 ou 1’P-Ib. Après incubation sur la nuit, la fixation de cytokines a été révélée avec des anticorps monoclonaux biotinylés dirigés contre ces cytokines spécifiques selon les instructions du fabricant.
Les résultats de la quantification des cytokines par ELISA sont présentés en figure 3.
Les résultats ont montré que, hors du traitement 5-FU, la consommation de la souche sauvage P. freudenreichii augmente la production d’IL-lO comme observé en culture sur les cellules HT-29, ce que ne permet pas la souche mutante P. freudenreichii CBl29AslpB (Figure 3 A). Suite au traitement 5-FU des animaux, lequel traitement induit normalement une mucite, une augmentation de l’expression de l’IL-l2 et l’IL-lB est observée, ce qui est révélateur de l’état inflammatoire de l’iléon. La consommation de la souche sauvage P. freudenreichii prévient l’induction de l’expression des cytokines pro-inflammatoires IL- 12 et IL- 1 b, chez les souris atteintes de mucite, par rapport au contrôle (YEL medium), comme le montre les figure 3B et 3C.
Enfin, la figure 3D montre qu’un traitement comprenant la souche sauvage P. freudenreichii WT augmente significativement le ratio IL-10/IL-12 chez les souris atteintes de mucite, contrairement à un traitement comprenant la souche mutante P. freudenreichii AslpB, ce qui est caractéristique d’une diminution de l’inflammation.
En conséquence, les résultats montrent une action immunosuppressive de la souche sauvage de P. freudenreichii en conditions normales de culture et une action anti-inflammatoire de celle-ci en conditions inflammatoires. A noter que ces actions sont médiées de toute évidence par la protéine SlpB, puisqu’elles sont absentes de la souche mutante CB129AslpB. Enfin, les inventeurs ont mis en évidence que, de façon inattendue, la souche sauvage de P. freudenreichii induisait l’expression de la Claudine 1 et contribuerait vraisemblablement à renforcer les jonctions serrées du tissu épithélial. Dès lors, et au regard des deux composantes de la mucite que sont 1) l’inflammation du tissu épithélial et 2) l’altération des jonctions serrées au sein de ce même tissu épithélial, cette découverte place la souche sauvage de P. freudenreichii comme un candidat idéal pour le traitement et/ou la prévention de la mucite.
2. Etude de l’effet pro-jonctions serrées de Propionibacterium freudenreichii sur la muqueuse de l’iléon chez la souris traitée au 5-FU
a. Etude in vivo de l’impact de Propionibacterium freudenreichii sur
l’expression des gènes pro-jonctions serrées dans l’iléon chez la souris
Pour déterminer l’expression de différents gènes dans l’iléon, de petits fragments (1 cm) de ceux-ci ont également été collectés et stockés dans du RNALATER (AMBION) à -80°C avant extraction de l’ARN. L’ARN total a ensuite été extrait avec un kit RNEASY (QIAGEN) et l’ADN génomique résiduel a été digéré et éliminé en utilisant la DNase I. Les ADN complémentaires correspondants ont ensuite été synthétisés en utilisant le kit HIGH CAPACITY CDNA REVERSE TRANSCRIPTION KIT (APPLIED BIOSYSTEMS) selon les recommandations du fabricant. Enfin, une PCR quantitative a été réalisée en utilisant le mélange ITAQ UNIVERSAL SYBR GREEN (BIORAD) et des amorces spécifiques des gènes à analyser sur un système ABI PRISM 7900 HT (APPLIED BIOSYSTEM) selon les recommandations du fabricant une fois encore.
Comme pour les cellules HT-29, les résultats ont confirmé, là encore, l’augmentation significative du niveau d’expression de la claudine-l (voir figure 4) uniquement chez les souris injectées par du 5-FU et ayant consommées de la souche sauvage P. freudenreichii, laquelle augmentation suggère un renforcement des jonctions serrées du tissu épithélial chez ces souris. b. Etude in vivo de l’impact de P ropionibacterium freudenreichii sur
l’histologie de la muqueuse de l’iléon
Pour analyser cette fois la morphologie de l’iléon dans les différents groupes de souris, la portion distale de l’iléon a été prélevée pour chaque groupe et lavée avec une solution de PBS avant fixation dans une solution de 4% de paraformaldéhyde. Le matériel est alors incorporé dans de la paraffine. Enfin, des coupes de 4m m sont réalisées pour analyse histologique. Les échantillons sont notamment colorés à l’aide d’hématoxyline et d’éosine. Un score d’inflammation histologique est déterminé sur la base de la mesure des trois changements histologiques majeurs induits par la mucite : (i) intensité de l’infiltration des cellules mononucléaires et polynucléaires dans la lamina propria , (ii) présence d’ulcérations et d’érosion, et (iii) altération de la structure de la muqueuse. Un score est attribué suivant la sévérité des lésions tissulaires : (0) pas de lésions ; (1) faible ; (2) moyenne ; (3) sévère. Une analyse morphométrique est également réalisée sur la base de l’analyse de dix images de l’iléon de chaque souris. La densité granulaire des cellules de Paneth est déterminée par évaluation du volume intracellulaire occupé par les granules sécrétoires. La taille des villosités et la profondeur des cryptes est mesurée depuis la pointe de la villosité jusqu’à la base de la crypte adjacente, ce qui permet le calcul d’un ratio taille des villosités / profondeur des cryptes.
Les résultats (présentés en figure 5) montrent, dans le groupe témoin, des changements clairs de la structure morphologique de l’iléon avec une augmentation / épaississement de la couche sous-muqueuse et de la couche musculaire, une augmentation du nombre de cellules inflammatoires et diminution / raccourcissement des villosités, un amincissement de l’épithélium et une augmentation du nombre de cellules inflammatoires mononucléaires ou polynucléaires infiltrées dans la lamina propria (Ligure 5). La consommation de la souche sauvage P. freudenreichii réduit, elle, tout à la fois les infiltrations de cellules inflammatoires et les altérations de la muqueuse intestinale (notamment en prévenant partiellement la diminution des villosités), ce qui induit un score histologique plus faible que les contrôles négatifs, ce que ne fait pas la souche mutante P. freudenreichii CB 129AslpB.
D’autre part, on observe chez les souris traitées au 5-FU une réduction de la hauteur des villosités, laquelle est limitée significativement par la consommation de P. freudenreichii WT (114 pm ± 17,92 ; p>0,000l) (Figure 6A). Un tel effet sur la réduction de la hauteur des villosités n’est pas observé avec une consommation de P. freudenreichii AslpB.
Ainsi, la consommation de P. freudenreichii WT préserve l’architecture des villosités en augmentant leur hauteur et le ratio taille des villosités / profondeur des cryptes chez les souris traitées au 5-FU (Figure 6A et 6B).
Concernant la densité granulaire des cellules de Paneth, celle-ci est réduite lors d’une mucite induite par injection de 5-FU. Maintenant, la consommation de P. freudenreichii WT permet de limiter cette réduction (Figure 6C).
Les résultats montrent donc que la consommation de Propionibacterium feudenreichii WT améliore la préservation de la muqueuse de l’iléon de souris atteintes de mucite causée par le 5-FU. c. Etude in vivo de l’impact de Propionibacterium freudenreichii sur la perméabilité intestinale
La perméabilité intestinale est mesurée 72 h après induction d’une mucite au 5- FU. Les souris reçoivent par gavage 0,1 mL d’acide diethylene triamine penta acétique (DTPA) marqué avec 18,5 MBq de Technetium 99m. 4h après le gavage, le sang est collecté et la radioactivité est mesurée, pour permettre le calcul d’un pourcentage de dose par gramme de sang selon l’équation : %dose/g de sang = (cpm en g de sang /cpm standard) x 100 cpm. (cpm = coup de radioactivité par minute).
Les résultats montrent que l’injection de 5-LU induit une forte augmentation de la perméabilité intestinale (Ligure 7). Maintenant, la consommation de P. freudenreichii WT limite cette augmentation de manière significative (p > 0,01). A noter que ceci n’est pas observé lors de la consommation de P. freudenreichii AslpB.
Ainsi, la consommation de Propionibacterium freudenreichii WT prévient la perméabilité intestinale chez des souris atteintes de mucite causée par le 5-FU. d. Etude in vivo de l’impact de Propionibacterium freudenreichii sur le poids de la souris traité au 5-FU
L’effet d’un apport en probiotique sur la perte de poids causée par la mucite suivant l’administration de 5-FU chez la souris est étudié. Le poids des souris est mesuré avant et après l’injection de 5-FU.
Les résultats sont présentés en figure 8. Une réduction de poids significative est observée chez les souris ayant subi une injection de 5-FU (figure xxA). Maintenant, les résultats montrent que la consommation de P. freudenreichii WT a limité significativement cette perte de poids (perte de 13 % ± 1,15) par rapport aux contrôles négatifs (perte de 20,94 % ± 3,21). Maintenant, la consommation de P. freudendenreichii AslpB ne permet pas une telle limitation de la perte de poids (19,34 % ± 2,58 comparé au groupe P. freudenreichii WT, p < 0,05).
En conséquence, les résultats établissent que la souche sauvage P. freudenreichii est capable d’agir sur les deux composantes de la mucite, laquelle action est médiée de toute évidence par la protéine SlpB.
Finalement, cette activité est confirmée par le suivi du poids des souris qui montre que la consommation de la souche sauvage P. freudenreichii permet de diminuer significativement la perte de poids des animaux injectés avec du 5-FU, alors que le mutant n’a pas cet effet protecteur.
En conclusion, les résultats démontrent la possible utilisation d’une souche bactérienne appartenant au genre Propionibacterium pour le traitement ou la prévention de la mucite chez un sujet humain.

Claims

REVENDICATIONS
1. Une composition comprenant au moins une souche bactérienne appartenant au genre Propionibacterium pour une utilisation dans le traitement ou la prévention de la mucite chez un sujet.
2. La composition pour une utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce qu’elle vise le traitement ou la prévention de l’altération des jonctions serrées du tissu épithélial associée à la mucite.
3. La composition pour une utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la souche bactérienne appartenant au genre Propionibacterium, est choisie dans le groupe comprenant P. freudenreichii, P. thoenii, P. jensenii et P. acidipropionici.
4. La composition pour une utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la souche bactérienne appartenant au genre Propionibacterium exprime la protéine SlpB (surface layer protein B), de préférence une protéine SlpB de l’espèce P. freudenreichii.
5. La composition pour une utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la souche bactérienne appartenant au genre Propionibacterium, appartient à l’espèce Propionibacterium. freudenreichii.
6. La composition pour une utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la mucite est une mucite gastro-intestinale.
7. La composition pour une utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le sujet est un mammifère, de préférence un humain.
8. La composition pour une utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que ledit sujet est sous le coup ou va faire l’objet d’un traitement par radiothérapie ou par chimiothérapie.
9. La composition pour une utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que ladite au moins une souche bactérienne appartenant au genre Propionibacterium est vivante ou non.
10. La composition pour une utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que ladite composition comprend au moins 106, de préférence au moins 10 , et au plus 5x10 bactéries appartenant au genre Propionibacterium par mL.
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