EP4612273A2 - Isolat de proteine vegetale extrait et ameliore via souche microbienne - Google Patents

Isolat de proteine vegetale extrait et ameliore via souche microbienne

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Publication number
EP4612273A2
EP4612273A2 EP23832964.3A EP23832964A EP4612273A2 EP 4612273 A2 EP4612273 A2 EP 4612273A2 EP 23832964 A EP23832964 A EP 23832964A EP 4612273 A2 EP4612273 A2 EP 4612273A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
suspension
protein
strain
isolate
flour
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP23832964.3A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Sophie HUCHETTE-DEFRETIN
Julien HUCHETTE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roquette Freres SA
Original Assignee
Roquette Freres SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roquette Freres SA filed Critical Roquette Freres SA
Publication of EP4612273A2 publication Critical patent/EP4612273A2/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A23J1/14—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from leguminous or other vegetable seeds; from press-cake or oil-bearing seeds
    • A23J1/148—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from leguminous or other vegetable seeds; from press-cake or oil-bearing seeds by treatment involving enzymes or microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
    • A23J3/14—Vegetable proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/185—Vegetable proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/145—Gasseri
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Definitions

  • the invention relates to the field of plant proteins, in particular protein isolates from legumes, even more particularly protein isolates from peas.
  • Human daily protein requirements are between 12 and 20% of the food ration. These proteins are provided both by products of animal origin (meat, fish, eggs, dairy products) and by products of plant origin (cereals, legumes, algae).
  • animal proteins present many disadvantages, both in terms of their allergenic potential, particularly concerning proteins derived from milk or eggs, and on the environmental level in relation to the harmful effects of intensive breeding.
  • Soya was, and remains, the first plant-based alternative to animal proteins. The use of soy nevertheless has certain disadvantages. There Soybean is more than frequently of GMO origin and obtaining its protein goes through a de-oiling stage using a solvent.
  • peas have developed significantly in Europe, mainly in France, as an alternative protein resource to animal proteins intended for animal and human food. Peas contain approximately 27% protein by weight.
  • the term “pea” is considered here in its broadest sense and includes in particular all wild varieties of “smooth pea”, and all mutant varieties of “smooth pea” and “wrinkled pea”. (“wrinkled pea”), regardless of the uses for which said varieties are generally intended (human food, animal nutrition and/or other uses). These seeds are non-GMO and do not require solvent deoiling.
  • Pea protein mainly pea globulin
  • dry processes so-called “wet” processes.
  • turbo-separation a process commonly called turbo-separation.
  • a recent alternative route consists of the use of bacterial strains in order to replace the acid-base reagents during the precipitation step, described in the article Emkani et al., 2021 (Emkani et al., Foods, 10, 549, 2021: “Pea Protein Extraction Assisted by Lactic Fermentation: Impact on Protein Profile and Thermal Properties”). If this process seems interesting, it also has two disadvantages: hydrolysis or even consumption of the protein by the strain, and the fermentation time of around 5 hours to 6 hours, which is difficult to compatible with an industrial process.
  • the present invention relates to a process for extracting plant proteins comprising the following steps:
  • step 2a adding a strain to the vegetable flour suspension of step 1, the strain being selected from the group consisting of Lactobacillus Fermentum, Lactobacillus Salivarius, Lactobacillus Delbrueckii subsp Jakobsenii, Lactobacillus Mucosae, Streptococcus Salivarius, and Enterococcus Lactis; the strain being preferentially a strain of Lactobacillus Fermentum; even more preferably the strain deposited with the CNM under the number CNCM I-5802, so as to form a seeded suspension;
  • step 2b incubating the inoculated suspension from step 2a so that the strain acidifies the inoculated suspension until a protein precipitate is formed;
  • the process according to the invention is characterized in that the vegetable flour of step 1 is in the form of a vegetable powder containing a quantity of protein greater than 1% by weight, preferably between 15% and 30% by weight, relative to the weight of powder.
  • the process according to the invention is characterized in that the vegetable flour of step 1 is an isolate or a concentrate, preferably an isolate whose protein content is greater than 80% by dry weight on dry matter of isolate.
  • the process according to the invention is characterized in that the vegetable flour of step 1 is a legume flour, preferably in that the vegetable flour is a legume flour selected from the group consisting of peas and fava beans, more preferably in that the vegetable flour is pea flour.
  • the process according to the invention is characterized in that the incubation temperature of the suspension of step 2b is between 30°C and 50°C, preferably between 35°C and 45°C. °C.
  • the process according to the invention is characterized in that the pH of the vegetable flour suspension from step 1 is rectified so as to be between 6.5 and 7.5; preferably so as to be equal to 7.0, before the implementation of step 2a.
  • the method according to the invention is characterized in that the addition of strain in step 2a is carried out so as to obtain a seeded suspension having a strain concentration of between 0.1 ⁇ 10 9 and 1.10 9 Colonies Forming Unit (CFU) per milliliter of vegetable flour suspension.
  • CFU Colonies Forming Unit
  • the process according to the invention is characterized in that the incubation of step 2b is carried out until the inoculated suspension has a pH of between 4 and 5, preferably a pH of 5.0.
  • the method according to the invention is characterized in that if at the end of step 2b, the pH of the inoculated suspension is not between 4 and 5, the 'step 2b comprises at the end of step 2b a sub-step 2b' of acidification of the inoculated suspension by adding acid, so that the seeded suspension obtained at the end of step 2b has a pH between 4 and 5, preferably between 5 and 4.5.
  • step 2b comprises, at the end of step 2b, a sub-step 2b” of additional heating to increase the flocculation yield, consisting of carrying the suspension of vegetable flour from step 2b at a temperature between 45° and 85°C.
  • step 3 comprises the following steps:
  • step 3a rectifying the pH of the seeded suspension obtained at the end of step 2b to a pH between 6 and 9, preferably a pH of 7, preferably by adding soda or lime to said suspension;
  • step 3c drying the vegetable flour suspension from step 3b until obtaining a vegetable flour isolate having a dry matter greater than 95% using an atomizer.
  • the invention also relates to a plant protein isolate capable of being obtained by the process of the invention.
  • the plant protein isolate according to the invention is characterized in that its degree of hydrolysis (or DH) is less than 10%, preferably less than 5.
  • the plant protein isolate is characterized in that the methanethiol content is reduced by more than 25%, preferably by more than 50%, compared to an isolate obtained by acidification of a suspension of vegetable flour only by adding hydrochloric acid.
  • the plant protein isolate is characterized in that its protein content is between 80% and 95% by weight, preferably between 82% and 92% by weight, preferably between 84% and 90% by weight. % by weight, preferably between 84% and 88% by weight, relative to the weight of total dry matter of the isolate.
  • the invention also relates to the use of the isolate according to the invention or obtained according to the process of the invention for industrial applications including food, nutraceutical and pharmaceutical applications.
  • the invention also relates to a microbial strain deposited with the CNCM under the number CNCM I-5802.
  • the invention also relates to a plant protein isolate characterized in that its hexanal content is less than 6000 ⁇ g/kg and its methanethiol content is less than 100 ⁇ g/kg.
  • the present invention relates to the microbial strain deposited with the CNCM under the number CNCM I-5802.
  • This particular strain was identified as belonging to the Lactobacillus Fermentum group. As will be demonstrated in the example section, this stands out in an exceptional way by allowing acidification of a medium containing vegetable proteins, preferably pea proteins, both quickly and efficiently.
  • the CNCM I-5802 strain will be mainly used for plant protein extraction processes but also for any other activity requiring rapid acidification with reduced or even non-existent protein hydrolysis. These applications will be reviewed precisely and in a non-exhaustive manner later in this description.
  • the present invention therefore relates to a process for extracting plant proteins comprising the following steps:
  • step 2a adding a strain to the vegetable flour suspension from step 1, strain being selected from the group consisting of Lactobacillus Fermentum, Lactobacillus Salivarius, Lactobacillus Delbrueckii subsp Jakobsenii, Lactobacillus Mucosae, Streptococcus Salivarius, and Enterococcus Lactis; the strain being preferentially a strain of Lactobacillus Fermentum; even more preferably the strain deposited with the CNCM under the number CNCM I-5802, so as to form a seeded suspension;
  • step 2b incubating the inoculated suspension from step 2a so that the strain acidifies the inoculated suspension until a protein precipitate is formed;
  • the first step of the process therefore consists of the use of vegetable flour.
  • plant flour means any powder of plant origin containing a quantity of protein greater than 1%, preferably between 15% and 30% by weight, relative to the weight of powder.
  • flour obtained by grinding plant seeds will be understood. These seeds may undergo pretreatment such as cleaning, sieving, thermal heating, a quenching or bleaching step, sieving (separation of seeds from stones for example). Preferably, if bleaching is carried out, the heat treatment scale will be 3 minutes at 80°C.
  • Plant seeds consist of the structure containing and protecting the plant embryo. It is often contained in a fruit which allows its dissemination or protected by an external envelope often called a shell. These will be particularly selected from the list containing legumes and cereals.
  • legume means the family of dicotyledonous plants of the Fabales order. It is one of the most important families of flowering plants, third after Orchidaceae and Asteraceae in number of species. It has approximately 765 genera bringing together more than 19 500 species.
  • Several legumes are important cultivated plants including beans, peas, fava beans, lupine, beans, chickpeas, peanuts, cultivated lentils, cultivated alfalfa, various clovers, broad beans, carob, licorice.
  • the legumes are selected from the list consisting of peas and fava beans, even more preferably peas.
  • pea being considered here in its broadest sense and including in particular all varieties of “smooth pea” and “wrinkled pea”, and all mutant varieties of “smooth pea” and “wrinkled pea”, regardless of the uses for which said varieties are generally intended (human food, animal nutrition and/or other uses).
  • the term “pea” in the present application includes the varieties of peas belonging to the genus Pisum and more particularly to the species sativum and aestivum. Said mutant varieties are in particular those called “r mutants”, “rb mutants”, “rug 3 mutants”, “rug 4 mutants”, “rug 5 mutants” and “lam mutants” as described in the article by C-L HEYDLEY and al. entitled “Developing novel pea starches” Proceedings of the Symposium of the Industrial Biochemistry and Biotechnology Group of the Biochemical Society, 1996, pp. 77-87.
  • faba bean is understood here as the group of annual plants of the species Vicia faba, belonging to the group of legumes of the family Fabaceae, subfamily Faboideae, tribe Fabeae. There are varieties Minor and Major. In the present invention, wild varieties and those obtained by genetic engineering or breeding are all excellent sources.
  • the vegetable flour will therefore be preferentially reduced to powder of finer particle size.
  • All well-known techniques of the prior art will be compatible with the process according to the invention.
  • a particular and particularly suitable example of such a knife mill is for example the SM300 marketed by the company Retsch® or a stone mill for example marketed by the company Alma®.
  • the flour thus obtained is suspended in a solvent.
  • This solvent is not intended to completely solubilize all of the same dry matter, even if this case is entirely conceivable.
  • the conditions for suspending the flour are adapted to insolubilize the non-protein compounds in order to eliminate them and thus pre-enrich the solution with proteins.
  • the solvent is water. This can nevertheless be supplemented, for example with compounds to facilitate solubilization.
  • the pH of the aqueous solvent is adjusted between 8 and 10, preferably 9. Any basic reagent such as soda or lime is possible, but potash is preferred.
  • the temperature is preferably adjusted between 2°C and 30°C, preferably between 10°C and 30°C, preferably between 15°C and 25°C, even more preferably at 20°C. This temperature is regulated throughout the extraction reaction.
  • the flour is diluted in the preferably aqueous solvent in order to obtain a suspension of between 5% and 25%, preferably between 5% and 15%, preferably between 7% and 13%, even more preferably between 9% and 11%. %, the most preferred being 10%, the percentage being expressed in weight of powder per total weight of water/powder suspension.
  • the suspension is stirred using any equipment well known to those skilled in the art, for example a tank equipped with an agitator, equipped with blades, marine propellers, or any equipment allowing effective stirring.
  • the extraction time, preferably with stirring, is between 5 and 25 minutes, preferably between 10 and 20 minutes, even more preferably 15 minutes.
  • the suspension is then centrifuged in order to eliminate insoluble non-protein compounds such as, for example, starch and/or internal fibers also called pulp in the case of legumes.
  • insoluble non-protein compounds such as, for example, starch and/or internal fibers also called pulp in the case of legumes.
  • vegetable seed flour is a material rich in proteins.
  • protein-rich material we mean any material in the form of powder, floc containing at least 25% protein by dry weight on dry matter. We can cite, in a non-limiting manner, concentrates, isolates, seeds. Preferably, the protein-rich material is in powder form.
  • the material rich in pea proteins used for step 1 is an isolate, that is to say its protein content is greater than 80%. in dry weight on dry matter.
  • isolates protein content between 50% and 80% by dry weight on dry matter
  • flour protein content less than 50% by dry weight on dry matter
  • the final dry matter of said suspension (also called “crude extract”) will preferably be between 3% and 9%, which therefore includes the values 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% and 9%.
  • the percentage is expressed in grams of dry matter per 100 grams of total weight of the protein suspension.
  • the second step of the method according to the invention comprises at least:
  • step 2a adding a strain to the vegetable flour suspension of step 1, the strain being selected from the group consisting of Lactobacillus Fermentum, Lactobacillus Salivarius, Lactobacillus Delbrueckii subsp Jakobsenii, Lactobacillus Mucosae, Streptococcus Salivarius, and Enterococcus Lactis; the strain being preferentially a strain of Lactobacillus Fermentum; even more preferably the strain deposited with the CNM under the number CNCM I-5802, so as to form a seeded suspension,
  • the second step therefore consists in particular of acidifying the pH using a strain selected from Lactobacillus Fermentum, Lactobacillus Salivarius, Lactobacillus Delbrueckii subsp Jakobsenii, Lactobacillus Mucosae, Streptococcus Salivarius, and Enterococcus Lactis; preferably from a strain of Lactobacillus Fermentum; even more preferably of the CNCM I-5802 strain.
  • a strain selected from Lactobacillus Fermentum, Lactobacillus Salivarius, Lactobacillus Delbrueckii subsp Jakobsenii, Lactobacillus Mucosae, Streptococcus Salivarius, and Enterococcus Lactis; preferably from a strain of Lactobacillus Fermentum; even more preferably of the CNCM I-5802 strain.
  • the temperature of the protein suspension is regulated between 30°C and 50°C, preferably between 35°C and 45°C, therefore including the values of 30°C, 31°C, 32° C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C and 45°C;
  • the starting pH is rectified between 6.5 and 7.5; preferably 7.0; which includes values of 6.5; 6.6; 6.7; 6.8; 6.9; 7.0; 7.1; 7.2; 7.3; 7.4 and 7.5.
  • the Skilled Person will use any well-known material and reagent.
  • CFU Colonies Forming Unit
  • the inoculate of the strain is prepared in the following manner, hereinafter referred to as “inoculate preparation method A”):
  • the strain is stored in the form of a cryoball
  • a suspension of the Lactobacillus fermentum strain CNCM I-5802 having an OD 600nm of 1 corresponds to a concentration of 3.0.10 8 CFU/mL.
  • agitation is carried out with any installation well known to those skilled in the art including an agitation axis equipped with a marine propeller.
  • the stirring speed is preferably between 200 and 400 rpm, preferably 250 and 350 rpm.
  • the pH will quickly become acidic. Monitoring of changes in pH is carried out with a suitable probe.
  • the maximum acidification speed (called Vm) expressed in pH units per min is typically between -0.030 and -0.020 pH units/min, preferably between -0.027 and -0.022 UpH/min. If the pH does not change (absence of acidification) or when the acidification speed is less than -0.020 pH units/min, it is possible to add an additional quantity of ferment in order to compensate for poor capacity at that this to acidify.
  • the target pH is the so-called isoelectric pH for the protein that we wish to flocculate. For example, for the so-called globulin fraction of pea this pH is 5. This is likely to vary depending on the targeted protein. Through this natural acidification, the protein will flocculate and coagulate.
  • an addition of an additional quantity of acid making it possible to finalize the acidification e.g. to acidify from pH 5 to pH 4.5 can be carried out at the end of step 2b (sub-step 2b’).
  • step 2b additional heating, preferably at the end of step 2b, is possible in order to increase the flocculation yield (sub-step 2b”).
  • flocculation is meant in the present invention the insolubilization of a portion of the proteins present in solution in order to be extracted. “flocculation” and “precipitation” can be used interchangeably here.
  • the heating temperature is between 45° and 85°C, therefore including the values of 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51°C, 52°C , 53°C, 54°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61°C, 62°C, 63°C, 64°C, 65 °C, 66°C, 67°C, 68°C, 69°C, 70°C, 71°C, 72°C, 73°C, 74°C, 75°C, 76°C, 77°C , 78°C, 79°C, 80°C, 81°C, 82°C, 83°C, 84°C and 85°C.
  • the protein floc obtained When the protein floc obtained is of the desired quality and quantity, it will conventionally be separated from the rest of the aqueous suspension, conventionally by static or dynamic decantation (plate centrifuge, horizontal decanters, etc.).
  • the floc thus obtained can be used such that or undergo one or more unit process steps including unit steps of purification (e.g. by chromatography, ultrafiltration), concentration (e.g. evaporation, drying), addition of chemical reagents (e.g. to adjust the pH) / enzymatic reagents (e.g. proteases) and/or heat treatment (e.g. pasteurization, HTST, sterilization).
  • unit steps of purification e.g. by chromatography, ultrafiltration
  • concentration e.g. evaporation, drying
  • chemical reagents e.g. to adjust the pH
  • enzymatic reagents e.g. proteases
  • heat treatment e.g. pasteurization, HTST, sterilization
  • a preferred example of post-treatment consists of 1) rectification at pH between 6 and 9, preferably 7 with preferential use of soda or lime, 2) heat treatment between 100°C and 160°C for 0.1 at 1s and 3) drying to a dry matter greater than 90%, preferably 95% using an atomizer.
  • the present invention also relates to the plant protein isolate obtained or capable of being obtained by isoelectric precipitation with the use of a strain selected from Lactobacillus Fermentum, Lactobacillus Salivarius, Lactobacillus Delbrueckii subsp Jakobsenii, Lactobacillus Mucosae, Streptococcus Salivarius, and Enterococcus Lactis; preferably from a strain of Lactobacillus Fermentum; even more preferably of the strain CNCM I-5802.
  • This isolate obtained by isoelectric precipitation obtained using bacterial acidification is characterized compared to the prior arts, particularly the article Emkani et al., 2021 (Emkani et al., Foods, 10, 549, 2021 ) in that its degree of hydrolysis is invariant. Without being bound by any theory, it is the selection of strains and their implementation which allows the obtaining of this unique and unequaled result until now to the best of our knowledge. The absence of protease, a presence with a lower activity and/or a speed of combined acidifying metabolism allow this result to be obtained.
  • the plant protein isolate according to the invention is preferably characterized in that its degree of hydrolysis (or DH) is less than 10%, preferably less than 5.
  • the isolate according to the invention preferably has a degree of hydrolysis (or DH) less than 10%, preferably less than 5%, including the DH of 10%, 9%, 8%, 7%, 6 %, 5%, 4%, 3%, 2% and 1%.
  • DH degree of hydrolysis
  • the degree of hydrolysis can be determined by measuring the free amino nitrogen content by the OPA method disclosed in the article Nielsen et al., 2001 (Nielsen et al., Journal of Food Science, Volume 66, Issue, Pages 642-646, 2001 “Improved Method for Determining Food Protein Degree of Hydrolysis”) in relation to the total nitrogen measured by the DUMAS method according to standard ISO 16634-2:2016.
  • the Test for measuring the degree of hydrolysis described below is particularly preferred. Its principle consists of first determining the amino nitrogen content (free NH2 functions) on the protein sample (preferably with the MEGAZYME kit (reference K-PANOPA)), then determining the protein nitrogen content (total nitrogen therefore including the free and engaged NH2 functions) of the sample, and finally to calculate the degree of hydrolysis accessible via the ratio of these two measurements.
  • amino nitrogen groups of the free amino acids in the sample react with N-acetyl-L-cysteine and Ophthaldialdehyde (OPA) to form isoindole derivatives.
  • Ophthaldialdehyde Ophthaldialdehyde
  • the amount of isoindole derivative formed during this reaction is stoichiometric with the amount of free amino nitrogen. It is the isoindole derivative which is measured by the increase in absorbance at 340 nm.
  • test portion P* of the sample to be analyzed is introduced into a 100 mL beaker. This test portion will be 0.5 to 5.0 g depending on the amino nitrogen content of the sample. Approximately 50 mL of distilled water is added, homogenized and transferred into a 100 mL volumetric flask. 5 mL of 20% sodium dodecyl sulfate (SDS) are added and made up with distilled water to reach a volume of 100 mL. Stir for 15 minutes with a magnetic stirrer at 1000 rpm. Solution No. 1 is prepared by dissolving a tablet from bottle 1 of the Megazyme kit in 3 mL of distilled water and shaking until completely dissolved. One tablet should be provided per test. Solution no. 1 is prepared extemporaneously.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • a blank, a standard and a sample are prepared directly in the spectrophotometer tanks under the following conditions:
  • each cell The contents of each cell are mixed and the absorbance measurement (A1) of the solutions is read after approximately 2 minutes using a spectrophotometer at 340 nm (spectrophotometer equipped with cells with an optical path of 1.0 cm, capable of measuring at a length of wave of 340 nm, and checked according to the operating procedure described in the manufacturer's technical manual which relates to it).
  • a spectrophotometer at 340 nm spectrophotometer equipped with cells with an optical path of 1.0 cm, capable of measuring at a length of wave of 340 nm, and checked according to the operating procedure described in the manufacturer's technical manual which relates to it).
  • the reactions are then started immediately by adding 100 ⁇ l of solution no. 2 which corresponds to the OPA solution from bottle 2 of the Megazyme kit in each spectrophotometer tank.
  • the A2 absorbance measurement of the blank, the standard and the sample is then read on the spectrophotometer at 340 nm.
  • Aech2 absorbance of the sample after addition of solution no. 2
  • Aech1 asorbance of the sample after addition of solution no. 1
  • the protein nitrogen content is determined according to the DUMAS method according to standard ISO 16634 - 2016. It is expressed as a percentage by weight relative to the weight of the product. [0080] Calculation of the degree of hydrolysis:
  • the degree of hydrolysis (DH) is calculated with the following formula:
  • the isolate obtained according to the process of the invention is also characterized by a reduced methanethiol content.
  • methanethiol content As will be exemplified in the present application, during conventional acidification for example. with hydrochloric acid we observe the synthesis of this compound resulting from the degradation of sulfur amino acids. Its presence in the ppb range is sufficient to give a so-called “rotten egg” or “hydrogen sulphide” flavor when the isolate is used to prepare ready-to-drink beverages or wet extrusion strips intended to produce meat analogues. . Without being bound by any theory, these processes, by generating significant heat, will cause a significant appearance of degradation compounds from methanethiol.
  • the process according to the invention preferably makes it possible to obtain an isolate whose methanethiol content is reduced by more than 50%, preferably by more than 25%, the reduction values potentially being 50%, 49%, 48 %, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%,
  • the process according to the invention preferably makes it possible to obtain an isolate whose methanethiol content is less than 0.1 ppb, that is to say an isolate comprising less than 0.1 ⁇ g of methanethiol per kg of isolate.
  • the process according to the invention makes it possible to obtain an isolate whose methanethiol content is less than 0.01 ppb, that is to say an isolate comprising less than 0.01 ⁇ g of methanethiol per kg of isolate.
  • the plant protein isolate according to the invention is characterized in that its protein content expressed relative to its total dry matter is preferably between 80% and 95%, preferably between 82% and 92%, preferably between 84% and 90%, preferably between 84% and 88%.
  • the invention also relates to a plant protein isolate characterized in that its hexanal content is less than 6000 ⁇ g/kg and its methanethiol content is less than 100 ⁇ g/kg.
  • hexanal (or hexanaldehyde), according to the invention is meant the organic compound of the aldehyde family, of the crude formula C6H12O, isomer of hexanone. Its CAS number is 66-25-1.
  • methanethiol (or methyl mercaptan) is meant according to the invention I organosulfur compound of chemical formula CH3SH. It is a colorless gas from the thiol family whose odor is pronounced of rotten cabbage. Its CAS number is 74-93-1.
  • the hexanal content is less than 6000 ⁇ g/kg, preferably less than 5500 ⁇ g/kg, preferably less than 5000 ⁇ g/kg, preferably less than 4500 ⁇ g/kg, preferably 4000 ⁇ g/kg, preferably 3500 ⁇ g/kg .
  • the methanethiol content is less than 120 ⁇ g/kg, preferably less than 110 ⁇ g/kg, preferably less than 100 ⁇ g/kg, preferably less than 90 ⁇ g/kg, preferably 80 ⁇ g/kg, preferably 70 ⁇ g/kg , preferably 65 ⁇ g/kg.
  • the methanethiol content could therefore be 119, 118, 117, 116, 115, 114, 113, 112, 111, 110, 109, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82,
  • the methanethiol content will be between 100 ⁇ g/kg and 50 ⁇ g/kg; preferably between 90 ⁇ g/kg and 60 ⁇ g/kg, preferably between 80 ⁇ g/kg and 60 ⁇ g/kg, even more preferably between 70 ⁇ g/kg and 60 ⁇ g/kg.
  • the plant protein isolate according to the invention is preferably characterized in that its degree of hydrolysis (or DH) is less than 10%, preferably less than 5.
  • the invention relates to the application of the plant protein isolate obtained with the use of the CNCM I-5802 strain in nutritional formulations in dairy or vegetable drinks, in yogurt-type fermented milks (brewed, at the same time). Greek, to drink) and in dairy or vegetable creams, frozen desserts or sorbets.
  • the invention concerns the application of the isolate according to the invention in biscuits, muffins, pancakes, nutritional bars (intended for specialized nutrition/slimming or sports), in breads or gluten-free breads.
  • the term “powdered nutritional formulations” means powdered formulations comprising at least, preferably only, a protein from a legume, and in particular from pea or fava bean, according to the invention, which are reconstitutable with an aqueous liquid, and which are suitable for oral administration to a human being.
  • dry blend refers to the mixing of components or ingredients to form a basic nutritional powder or, to the addition of a dry component, in powder or granule or a powder-based ingredient to form a powdered nutritional formulation.
  • the powdered food formulations and corresponding manufacturing processes of the present invention may comprise, consist of or consist essentially of the essential elements of the invention as described herein, as well as any additional or optional elements described herein or otherwise useful in nutritional formulation applications.
  • the powdered nutritional formulations of the present invention are generally in the form of flowable or substantially fluid particulate compositions, or at least particulate compositions that can be easily molded and measured using a spoon. or other similar device, wherein the compositions can easily be reconstituted by the intended user with an aqueous solution, typically water, to form a liquid nutritional formulation for immediate oral or enteral use.
  • aqueous solution typically water
  • use "immediately” generally means within about 48 hours, more typically for about 24 hours, preferably immediately after reconstitution.
  • the powdered food formulations can be formulated with all types and sufficient quantities of nutrients so as to form a food supplement, or a specialized nutritional formulation intended for use in people following a particular diet intended for sports dietetics. and slimness.
  • the nutritional powder formulation can be formulated for use: to repair the muscles after intense effort, for example in athletes, - to ensure that athletes maintain or build muscle mass, or
  • Powdered food formulations may have a caloric density adapted to the nutritional needs of the end user, although in most cases reconstituted powders comprise from about 350 to about 400 kcal/100 ml.
  • the powdered food formulations can have a protein level adapted to the nutritional needs of the end user, although in most cases, the reconstituted powders comprise from approximately 20 to approximately 91 g of protein / 100 g, including comprised of approximately 40 to approximately 65 g of protein / 100g.
  • the formulation can comprise between 20 and 95% of proteins relative to the total weight of the formulation, for example between 20-90%, 30-80%, or 40-60%.
  • the protein isolate from legumes preferably from pea or fava bean, according to the present invention can represent 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90 % or 90-100% of the total protein in the formulation, or any combination of these percentage ranges. 100% representing the ultimate preferential mode to maximize the effect of FGF19 overexpression.
  • the powdered food formulations can have a fat content adapted to the nutritional needs of the end user, although in most cases, the reconstituted powders comprise from approximately 0.5 to approximately 13 g /100 g, including from about 3 to about 7 g /100 g.
  • the formulation can comprise between 0 and 20% of lipids relative to the total weight of the formulation, for example between 0.5-15%, 1-10%, or 3-7% (in particular % by weight).
  • the powdered nutritional formulations of the present invention can be packaged and sealed in single or multi-use containers and then stored under ambient conditions for up to about 36 months or more, more typically from about 12 to about 24 month. [0105] For multi-use containers, they may be opened and covered for repeated use by the end user, provided that the covered package is then stored under ambient conditions (e.g. avoid extreme temperatures) and content used in about a month or two.
  • dairy products in the form of yogurts, dairy drinks, dairy creams, frozen desserts or sorbets.
  • Ready-to-drink protein or high-protein drinks then allow the body to benefit from a protein intake of choice, minus the calories.
  • These ready-to-drink drinks can advantageously be prepared with protein isolates from legumes, preferably from fava beans or peas, in accordance with the invention. They can also be used as the sole source of proteins, preferably because they maximize the effect of overexpression of FGF19.
  • alternative vegetable drinks to cow's milk contain on average 4.5 to 11 g of protein per 100 ml of drink, preferably of the order of 7 g of protein per 100 ml, and are very low in fiber (around 0.5 to 1 g per 100 ml).
  • the drink can include between 1 and 20% protein relative to the total weight of the drink, for example between 3-15%, or 6-8%.
  • the pea protein isolate according to the present invention can represent 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% or 90-100% of the total protein, or a any combination of these percentage ranges. Preferably, it represents at least 52%. Notably, pea protein intake is between 52 and 100% of total protein intake.
  • the pea protein intake can range from 0 to 100%, preferably from 0.01 or 0.1 to 100%.
  • the pea protein isolate according to the present invention may represent 0.1-10%, 10-20%, 20-30%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70- 80%, 80-90% or 90-100% of total protein, or any combination of these percentage ranges.
  • slimming drinks In the field of “slimming” drinks, ie intended to be used in low-calorie diets or intended for weight loss, as mentioned previously, these protein or protein-enriched drinks are not only effective for rapid weight gain. muscles. This type of drink is also very advantageous as part of a slimming diet based on protein consumption. [0117] It is known that slimming drinks are ideal for helping with weight loss. More specifically, they allow:
  • enteral nutrition is a therapeutic tube nutrition solution which is used when the digestive tract is functional and accessible but when the patient cannot eat normally or in cases of malnutrition. severe.
  • These nutritional mixtures are composed of proteins, lipids, carbohydrates, vitamins and minerals with or without fiber.
  • polymeric mixtures standard and semi-elemental mixtures (“predigested”), the latter being indicated in very specific cases (short bowel syndrome, exocrine pancreatic insufficiency, etc.):
  • hypocaloric 0.5 - 0.75 kcal/ml
  • normo or hyperprotein 0.5 - 0.75 kcal/ml
  • hypercaloric (1.25 -1.5 kcal/ml) normo or hyperprotein, with or without fiber
  • Semi-elementals are iso- or hypercaloric normo or hyperprotein mixtures, based on peptides and medium-chain triglycerides.
  • Pea protein isolates as a protein source, by their functional properties are particularly well suited to this use.
  • Example 1 Process according to the invention starting from pea flour
  • process head This set of steps leading to the raw extract is hereinafter referred to as “process head”.
  • acidification of the crude extract is then carried out according to the following protocol: Preculture
  • control is carried out in parallel under the same conditions but without strain introduced in order to check the absence of an unwanted contaminant disrupting the process
  • Vm (or average speed of acidification) was 2 pH units acidified in 110 min, i.e. -0.018 U.pH/min (expressed in pH units per min, the sign expressing acidification)
  • the VM (or Maximum Acidification Speed) was -0.027 U.pH/min recorded at 42 min of reaction at a pH of 6.24.
  • Example 2 Repeatability of Example 1:
  • Example 3 Process according to the invention starting from a pea isolate
  • the process can be applied to a pea protein isolate (e.g. Nutralys® F85M from the company Roquette) which makes it possible to simplify the process head of Example 1.
  • a pea protein isolate e.g. Nutralys® F85M from the company Roquette
  • control is carried out in parallel under the same conditions but without strain introduced in order to check the absence of an unwanted contaminant disrupting the process
  • Example 4 Process outside the invention acidification with hydrochloric acid:
  • the acidification is carried out with stirring, aiming for pH 5 with 1 N HCl.
  • the temperature applied is 60° C. and is maintained thus for 10 minutes.
  • Example 5 Process outside the invention - acidification with strains not allowing the invention to be carried out and/or obtained:
  • control is carried out in parallel under the same conditions but without strain introduced in order to check the absence of an unwanted contaminant disrupting the process.
  • Example 6 Validation on an industrial pre-pilot scale of the invention
  • the chosen raw material is produced according to the same operating mode as the process head described in Example 1, then atomized in order to stabilize it.
  • reaction process is that described in paragraph 130 but adapted to a volume of 20 liters.
  • Example 5 Characterization of the orqanovolatile composition of the samples generated: [0168] An analysis is carried out by GC/MS on several samples generated above in order to determine the different organovolatile compounds.
  • the process according to the invention reduces by at least 75% all organovolatile compounds with the exception of methylacetate (whose content is unchanged) and ethylacetate (whose concentration is tripled ) in comparison to the prior art.
  • the methanethiol content is reduced (around 15% of the prior art value).
  • Methanethiol is a compound that has a fairly low concentration, of the order of ppb, generates sulfur flavors in food products such as ready-to-drink drinks or wet protein extrudates.
  • the methanethiol is also less than 100 ⁇ g/kg, a much higher value when practicing precipitation by adding acid as practiced in the prior art.

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Abstract

L'invention concerne un procédé d'extraction de protéines végétales comprenant les étapes suivantes : 1. la mise en suspension d'une farine végétale dans un solvant préférentiellement aqueux, de sorte à obtenir une suspension de farine végétale; 2a. l'ajout d'une souche dans la suspension de farine végétale de l'étape 1, 2b. l'incubation de la suspension ensemencée de l'étape 2a de sorte à ce que la souche acidifie la suspension ensemencée jusqu'à formation d'un précipitât protéique; 3. Séparation du précipitât protéique obtenu à l'issue de l'étape 2b; ainsi qu'un isolat de protéines végétales susceptible d'être obtenu par le procédé de l'invention.

Description

Description
ISOLAT DE PROTEINE VEGETALE EXTRAIT ET AMELIORE VIA SOUCHE MICROBIENNE
Domaine technique
[0001] L’invention relève du domaine des protéines végétales, en particulier des isolats protéiques de légumineuses, encore plus particulièrement des isolats protéiques de pois.
Art antérieur
[0002] Les besoins quotidiens humains en protéines sont compris entre 12 et 20% de la ration alimentaire. Ces protéines sont fournies aussi bien par des produits d'origine animale (viandes, poissons, œufs, produits laitiers) que par des produits d’origine végétale (céréales, légumineuses, algues).
[0003] Cependant, dans les pays industrialisés, les apports en protéines sont majoritairement sous la forme de protéines d'origine animale. Or, de nombreuses études démontrent qu'une consommation excessive de protéines d'origine animale au détriment des protéines végétales est une des causes d'augmentation de cancers et maladies cardio-vasculaires.
[0004] Par ailleurs, les protéines animales présentent beaucoup de désavantages, tant sur le plan de leur potentiel allergène, concernant notamment les protéines issues du lait ou des œufs, que sur le plan environnemental en relation avec les méfaits de l'élevage intensif.
[0005] Ainsi, il existe une demande croissante des industriels pour des composés d'origine végétale possédant des propriétés nutritionnelles et fonctionnelles intéressantes sans pour autant présenter les inconvénients de composés d'origine animale.
[0006] Le soja a été, et reste, la première alternative végétale aux protéines animales. L’utilisation du soja possède néanmoins des désavantages certains. La graine de soja est plus que fréquemment d’origine OGM et l’obtention de sa protéine passe par une étape de déshuilage utilisant du solvant.
[0007] Depuis les années 70, les légumineuses à graines, dont en particulier le pois, se sont fortement développé en Europe, majoritairement en France, comme ressource protéique alternative aux protéines animales à destination de l’alimentation animale et humaine. Le pois contient environ 27 % en poids de matières protéiques. Le terme « pois » est ici considéré dans son acception la plus large et inclut en particulier toutes les variétés sauvages de « pois lisse » (« smooth pea »), et toutes les variétés mutantes de « pois lisse » et de « pois ridé » (« wrinkled pea »), et ce quelles que soient les utilisations auxquelles on destine généralement lesdites variétés (alimentation humaine, nutrition animale et/ou autres utilisations). Ces graines sont non-OGM et ne nécessitent pas de déhuilage solvanté.
[0008] La protéine de pois, majoritairement de la globuline de pois, est extraite et valorisée industriellement depuis bon nombre d’années. Plusieurs procédés existent que l’on peut catégoriser en deux grandes familles : les procédés dits « par voie sèche » et les procédés dits « par voie humide ». Les premiers consistent en la réduction granulométrique des graines de légumineuses en farine suivi par une séparation granulométrique à l’aide d’un courant d’air ascendant, procédé communément appelé turbo-séparation. Ces procédés conduisent à l’obtention de concentrats protéiques dont la richesse en protéines ne dépasse pas 60%-70%. Ces procédés ne sont pas à considérer dans le cadre de la présente invention qui s’inscrit dans le domaine des isolats dont la concentration protéique est supérieure à ces teneurs.
[0009] Concernant la seconde famille de procédés dits « par voie humide », on peut citer, comme exemple de procédé d’extraction de la protéine de pois, le brevet EP 1 400 537. Dans ce procédé, la graine est broyée en absence d’eau (procédé dit de « broyage à sec ») afin d’obtenir une farine. Cette farine sera ensuite mise en suspension dans de l’eau afin d’en extraire la protéine par précipitation. La précipitation est réalisée en ajustant le pH isoélectrique et/ou en chauffant le milieu.
[0010] De tels procédés ont plusieurs désavantages. Le premier réside dans l’utilisation de réactifs acidobasiques qui sont onéreux, nécessitent des investissements pour leur stockage et leur mise en œuvre. Ces derniers sont aussi dangereux pour l’être humain en ce que leur contact sans protections adéquates provoque des lésions importantes. Le second consiste en l’obtention d’un isolat dont l’intégrité moléculaire est affectée, ainsi que le profil organoleptique. Il est ainsi bien connu qu’un chauffage sous conditions acide va modifier de manière potentiellement importante les molécules protéiques et provoquer l’apparition de composés organovolatils issus de la dégradation lipidique. De tels composés sont par exemple l’hexanal ou le methanethiol.
[0011] Il est donc courant et fortement travaillé actuellement dans le domaine des améliorations de ces procédés remplaçant cette étape de précipitation isoélectrique avec ou sans chauffage, voire d’ajout d’étapes de procédé supplémentaires pour pallier ces effets indésirables. La première solution impose hélas l’investissement dans des techniques de filtration membranaires qui sont coûteuses et lourdes à opérer du fait du colmatage important du média filtrant. Les secondes solutions sont également beaucoup de limitations ne serait ce que du fait de l’implémentation d’étapes nouvelles à un procédé déjà complexe. On peut citer en particulier la fermentation des graines de légumineuses au préalable du procédé d’extraction cœur du brevet EP 3 071 046. Si le résultat final obtenu est intéressant, le procédé implique une fermentation lourde de plus de 24h et la génération d’eaux résiduelles excessives qu’il faudra traiter.
[0012] Une voie alternative récente consiste en l’utilisation de souches bactériennes afin de remplacer les réactifs acidobasiques lors de l’étape de précipitation, décrit dans l’article Emkani et al., 2021 (Emkani et al., Foods, 10, 549, 2021 : « Pea Protein Extraction Assisted by Lactic Fermentation: Impact on Protein Profile and Thermal Properties »). Si ce procédé semble intéressant, il possède également deux désavantages : l’hydrolyse voire la consommation de la protéine par la souche, et le temps de fermentation d’environ 5h à 6h difficilement compatible avec un procédé industriel. Dans l’article « Protein composition and nutritional aspects of pea protein fractions obtained by a modified isoelectric precipitation method using fermentation » (Emkani et al., Frontiers in Nutrition, Volume 10, 2023) il est démontré ainsi une « dégradation des protéines par les LAB en petits peptides et acides aminés, qui ont été solubilisés dans la fraction soluble (albumines) comme confirmé par la chromatographie d’exclusion stérique (SEC-HPLC). ».
[0013] Il est du mérite de la demanderesse d’avoir travaillé dans ce domaine et d’avoir découvert un ensemble de souches réalisant une acidification rapide et sans hydrolyse, c’est-à-dire sans consommation de la protéine, ainsi que d’avoir développé le procédé l’utilisant dans le but d’obtenir un isolat protéique dont les caractéristiques fonctionnelles et organoleptiques sont optimisées à un niveau jamais encore atteint. De surcroit, les souches et le procédé selon l’invention les utilisant permettent d’obtenir un isolat de protéines végétales dont les performances organoleptiques sont d’un intérêt certain pour l’industrie agroalimentaire.
[0014] L’invention sera mieux comprise dans la partie descriptive de la présente demande qui va suivre.
Description générale
[0015] La présente invention concerne un procédé d’extraction de protéines végétales comprenant les étapes suivantes :
1. la mise en suspension d’une farine végétale dans un solvant préférentiellement aqueux, de sorte à obtenir une suspension de farine végétale ;
2a. l’ajout d’une souche dans la suspension de farine végétale de l’étape 1 , la souche étant sélectionnée dans le groupe constitué par Lactobacillus Fermentum, Lactobacillus Salivarius, Lactobacillus Delbrueckii subsp Jakobsenii, Lactobacillus Mucosae, Streptococcus Salivarius, et Enterococcus Lactis ; la souche étant préférentiellement une souche de Lactobacillus Fermentum ; encore plus préférentiellement la souche déposée auprès de la CNM sous le numéro CNCM I- 5802, de sorte à former une suspension ensemencée ;
2b. l’incubation de la suspension ensemencée de l’étape 2a de sorte à ce que la souche acidifie la suspension ensemencée jusqu’à formation d’un précipitât protéique ;
3. Séparation du précipitât protéique obtenu à l’issue de l’étape 2b.
[0016] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que la farine végétale de l’étape 1 est sous la forme d’une poudre végétale contenant une quantité de protéine supérieure à 1 % en poids, préférentiellement comprise entre 15% et 30% en poids, par rapport au poids de poudre.
[0017] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que caractérisé en ce que la farine végétale de l’étape 1 est un isolat ou un concentrât, préférentiellement un isolat dont la teneur en protéines est supérieure à 80% en poids sec sur matière sèche d’isolat.
[0018] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que la farine végétale de l’étape 1 est une farine de légumineuse, préférentiellement en ce que la farine végétale est une farine de légumineuse sélectionnée dans le groupe constitué par le pois et la féverole, plus préférentiellement en ce que la farine végétale est une farine de pois.
[0019] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l’invention est caractérisé ce que la température d’incubation de la suspension de l’étape 2b est comprise entre 30°C et 50°C, préférentiellement entre 35°C et 45°C.
[0020] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que le pH de la suspension de farine végétal de l’étape 1 est rectifié de sorte à être compris entre 6,5 et 7,5 ; préférentiellement de sorte à être égal à 7,0 , avant la mise en œuvre de l’étape 2a.
[0021] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que l’ajout de souche de l’étape 2a est réalisé de sorte à obtenir une suspension ensemencée présentant une concentration de souche comprise entre 0,1.109 et 1 ,109 Colonies Formant Unité (CFU) par millilitre de suspension de farine végétale.
[0022] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que l’incubation de l’étape 2b est menée jusqu’à ce la suspension ensemencée présente un pH compris entre 4 et 5, préférentiellement un pH de 5,0.
[0023] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que ce que si à l’issue de l’étape 2b, le pH de la suspension ensemencée n’est pas compris entre 4 et 5, l’étape 2b comprend en fin d’étape 2b une sous-étape 2b’ d’acidification de la suspension ensemencée par ajout d’acide, de sorte à ce que la suspension ensemencée obtenue à l’issue de l’étape 2b présente un pH compris entre 4 et 5, de préférence compris entre 5 et 4,5.
[0024] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que l’étape 2b comprend en fin d’étape 2b une sous-étape 2b” de chauffage additionnel pour augmenter le rendement de floculation, consistant à porter la suspension de farine végétale de l’étape 2b à une température comprise entre 45° et 85°C.
[0025] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que caractérisé en ce que l’étape 3 comprend les étapes suivantes :
3a. la rectification du pH de la suspension ensemencée obtenue à l’issue de l’étape 2b à un pH compris entre 6 et 9, préférentiellement un pH de 7, préférentiellement par ajout de soude ou de chaux dans ladite suspension ;
3b. le traitement thermique de la suspension de l’étape 3a entre 100°C et 160°C pendant 0,1 à 1 s, et
3c. le séchage de la suspension de farine végétale de l’étape 3b jusqu’à obtenir un isolat de farine végétale présentant une matière sèche supérieure à 95% à l’aide d’un atomiseur.
[0026] L’invention concerne également un isolat de protéines végétales susceptible d’être obtenu par le procédé de l’invention.
[0027] Dans un mode de réalisation, l’isolat de protéines végétales selon l’invention est caractérisé en ce que son degré d’hydrolyse (ou DH) est inférieur à 10%, préférentiellement inférieur à 5.
[0028] Dans un mode de réalisation, l’isolat de protéines végétales est caractérisé en ce que teneur en methanethiol est réduite de plus de 25%, préférentiellement de plus de 50%, par rapport à un isolat obtenu par acidification d’une suspension de farine végétale uniquement par ajout d’acide chlorhydrique.
[0029] Dans un mode de réalisation, l’isolat de protéines végétales est caractérisé en ce que sa teneur en protéines comprise entre 80% et 95% en poids, préférentiellement entre 82% et 92% en poids, préférentiellement entre 84% et 90% en poids, préférentiellement entre 84% et 88% en poids, par rapport au poids de matière sèche totale de l’isolat.
[0030] L’ invention concerne également l’utilisation de l’isolat selon l’invention ou obtenu selon le procédé de l’invention pour des applications industrielles comprenant les applications alimentaires, nutraceutiques, pharmaceutiques.
[0031] L’invention concerne également une souche microbienne déposée auprès de la CNCM sous le numéro CNCM I-5802.
[0032] L’invention concerne également un isolat de protéines végétales caractérisé en ce que sa teneur en hexanal est inférieure à 6000 μg/kg et sa teneur en methanethiol est inférieure à 100 μg/kg.
[0033] L’invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée ci- dessous
Description détaillée
[0034] La présente invention concerne la souche microbienne déposée auprès de la CNCM sous le numéro CNCM I-5802.
[0035] Cette souche particulière a été identifiée comme appartenant au groupe Lactobacillus Fermentum. Comme il sera démontré dans la partie exemple, celle-ci se démarque de manière exceptionnelle en permettant une acidification d’un milieu contenant des protéines végétales, préférentiellement de pois, à la fois rapide et performante.
[0036] La souche CNCM I-5802 sera principalement utilisée pour les procédés d’extraction de protéines végétales mais également pour tout autre activité nécessitant une acidification rapide avec une hydrolyse protéique réduite voire inexistante. Ces applications seront passés en revue précisément et de manière non exhaustive plus loin dans la présente description.
La présente invention concerne donc un procédé d’extraction de protéines végétales comprenant les étapes suivantes :
1. la mise en suspension d’une farine végétale dans un solvant préférentiellement aqueux, de sorte à obtenir une suspension de farine végétale ;
2a. l’ajout d’une souche dans la suspension de farine végétale de l’étape 1 , la souche étant sélectionnée dans le groupe constitué par Lactobacillus Fermentum, Lactobacillus Salivarius, Lactobacillus Delbrueckii subsp Jakobsenii, Lactobacillus Mucosae, Streptococcus Salivarius, et Enterococcus Lactis ; la souche étant préférentiellement une souche de Lactobacillus Fermentum ; encore plus préférentiellement la souche déposée auprès de la CNCM sous le numéro CNCM I-5802, de sorte à former une suspension ensemencée ;
2b. l’incubation de la suspension ensemencée de l’étape 2a de sorte à ce que la souche acidifie la suspension ensemencée jusqu’à formation d’un précipitât protéique ;
3. Séparation du précipitât protéique obtenu à l’issue de l’étape 2b.
[0037] La première étape du procédé consiste donc en la mise en œuvre d’une farine végétale.
[0038] Par « farine végétale » on entend au sens de l’invention toute poudre d’origine végétale contenant une quantité de protéine supérieure à 1 %, préférentiellement comprise entre 15% et 30% en poids, par rapport au poids de poudre.
[0039] En particulier, on entendra au sens de l’invention la farine obtenue par broyage des graines végétales. Ces graines pourront subir un prétraitement tels qu’un nettoyage, un tamisage, un chauffage thermique, une étape de trempe ou de blanchiment, de tamisage (séparation des graines des cailloux par exemple). De manière préférée, si un blanchiment est effectué, le barème du traitement thermique sera de 3 minutes à 80°C.
[0040] Les graines végétales consistent en la structure contenant et protégeant l'embryon végétal. Elle est souvent contenue dans un fruit qui permet sa dissémination ou protégée par une enveloppe externe souvent appelée coque. Celles-ci seront particulièrement sélectionnées dans la liste contenant les légumineuses, les céréales.
[0041] Par « légumineuse », on entend au sens de la présente invention la famille de plantes dicotylédones de l'ordre des Fabales. C'est l'une des plus importantes familles de plantes à fleurs, la troisième après les Orchidaceae et les Asteraceae par le nombre d'espèces. Elle compte environ 765 genres regroupant plus de 19 500 espèces. Plusieurs légumineuses sont d'importantes plantes cultivées parmi lesquelles les haricots, les pois, la féverole, le lupin, le haricot, le pois chiche, l'arachide, la lentille cultivée, la luzerne cultivée, différents trèfles, les fèves, le caroubier, la réglisse.
[0042] De manière préférée, les légumineuses sont sélectionnées parmi la liste constituée du pois et de la féverole, encore plus préférentiellement du pois.
[0043] Le terme « pois » étant ici considéré dans son acception la plus large et incluant en particulier toutes les variétés de « pois lisse » (« smooth pea ») et « de pois ridés » (« wrinkled pea »), et toutes les variétés mutantes de « pois lisse » et de « pois ridé » et ce, quelles que soient les utilisations auxquelles on destine généralement lesdites variétés (alimentation humaine, nutrition animale et/ou autres utilisations). Le terme « pois » dans la présente demande inclut les variétés de pois appartenant au genre Pisum et plus particulièrement aux espèces sativum et aestivum. Lesdites variétés mutantes sont notamment celles dénommées « mutants r », « mutants rb », « mutants rug 3 », « mutants rug 4 », « mutants rug 5 » et « mutants lam » tels que décrits dans l’article de C-L HEYDLEY et al. intitulé « Developing novel pea starches » Proceedings of the Symposium of the Industrial Biochemistry and Biotechnology Group of the Biochemical Society, 1996, pp. 77-87.
[0044] Le terme « féverole » s’entend ici par le groupe des plantes annuelles de l'espèce Vicia faba, appartenant au groupe des légumineuses de la famille des Fabaceae, sous-famille des Faboideae, tribu des Fabeae. On distingue les variétés Minor et Major. Dans la présente invention, les variétés sauvages et celles obtenues par génie génétique ou sélection variétales sont toutes d’excellentes sources.
[0045] La farine végétale va donc être préférentiellement réduite en poudre de granulométrie plus fine. Toutes techniques bien connues de l’art antérieur sera compatible avec le procédé selon l’invention. On peut citer par exemple les moulins à couteaux. Un exemple particulier et particulièrement approprié d’un tel moulin à couteaux est par exemple le SM300 commercialisé par la société Retsch® ou un moulin à pierre par exemple commercialisé par la société Alma®.
[0046] La farine ainsi obtenue est mise en suspension dans un solvant. Ce solvant ne vise pas à solubiliser complètement l’intégralité de la même matière sèche, même si ce cas est tout à fait concevable. Dans un mode préféré, les conditions de mise en suspension de la farine sont adaptées pour insolubiliser les composés non protéiques afin de les éliminer et ainsi pré-enrichir la solution en protéines.
[0047] De manière préférée, le solvant est de l’eau. Celle-ci peut néanmoins être additivée, par exemple avec des composés permettant de faciliter la solubilisation.
[0048] De manière préférée, le pH du solvant aqueux est ajusté entre 8 et 10, préférentiellement 9. Tout réactif basique tel que la soude, la chaux, est envisageable, mais la potasse est préférée. La température est préférentiellement ajustée entre 2°C et 30°C, préférentiellement entre 10°C et 30°C, préférentiellement entre 15°C et 25°C, encore plus préférentiellement à 20°C. Cette température est régulée tout au long de la réaction d’extraction.
[0049] La farine est délayée dans le solvant préférentiellement aqueux afin d’obtenir une suspension comprise entre 5% et 25%, préférentiellement entre 5% et 15%, préférentiellement entre 7% et 13%, encore plus préférentiellement entre 9% et 11%, le plus préféré étant 10%, le pourcentage étant exprimé en poids de poudre par poids total de suspension eau/poudre. La suspension est agitée à l’aide de tout appareillage bien connu de l’Homme du métier, par exemple une cuve équipée d’un agitateur, équipé de pales, d’hélices marines, ou de tout équipement permettant une agitation efficace. Le temps d’extraction, préférentiellement sous agitation, est compris entre 5 et 25 minutes, préférentiellement entre 10 et 20 minutes, encore plus préférentiellement 15 minutes.
[0050] De manière préférée, la suspension est ensuite centrifugée afin d’éliminer les composés non protéiques insolubles comme par exemples l’amidon et/ou les fibres internes appelées aussi pulpe dans le cas des légumineuses.
[0051] Dans un mode alternatif, la farine de graines végétales est une matière riche en protéines. Par « matière riche en protéine » on entend toute matière sous forme de poudre, floc contenant au moins 25% de protéines en poids sec sur matière sèche. On peut citer de manière non limitative les concentrats, les isolats, les graines. De préférence, la matière riche en protéine est sous forme de poudre.
[0052] De manière préférée, la matière riche en protéines de pois utilisée pour l’étape 1 est un isolat, c’est-à-dire que sa teneur en protéines est supérieure à 80% en poids sec sur matière sèche. L’utilisation de concentrats (teneur protéique comprise entre 50% et 80% en poids sec sur matière sèche) voire de farine (teneur protéique inférieure à 50% en poids sec sur matière sèche) peut également être envisagée mais l’isolat est préféré.
[0053] L’obtention de matière riche en protéines de pois est aisée avec les procédés classiques de l’art bien connus de l’homme du métier. On citera par exemple les procédés décrits dans les demandes de brevet EP 1 909 593 ou FR 2018052261 de la demanderesse. Le principe de base de ces procédés (mise en suspension de farine de pois dans de l’eau par broyage humide ou sec, élimination des parties insolubles telles qu’amidon et fibres internes par centrifugation, précipitation isoélectrique de la protéine d’intérêt) est classique désormais et propose très aisément une protéine adaptée.
[0054] Quel que soit le procédé mis en œuvre pour obtenir la suspension de protéines végétales (par ex. simplement en ajoutant de l’eau à un isolat de protéine de pois ou bien en partant de la farine de pois et en éliminant fibres internes et amidon), la matière sèche finale de ladite suspension (aussi appelée « extrait brut ») sera préférentiellement comprise entre 3% et 9%, ce qui inclut donc les valeurs 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% et 9%. Le pourcentage s’exprime en grammes de matière sèche pour 100 grammes de poids total de la suspension protéique.
[0055] La seconde étape du procédé selon l’invention comprend au moins :
2a. l’ajout d’une souche dans la suspension de farine végétale de l’étape 1 , la souche étant sélectionnée dans le groupe constitué par Lactobacillus Fermentum, Lactobacillus Salivarius, Lactobacillus Delbrueckii subsp Jakobsenii, Lactobacillus Mucosae, Streptococcus Salivarius, et Enterococcus Lactis ; la souche étant préférentiellement une souche de Lactobacillus Fermentum ; encore plus préférentiellement la souche déposée auprès de la CNM sous le numéro CNCM I- 5802, de sorte à former une suspension ensemencée,
2b. l’incubation de la suspension ensemencée de l’étape 2a de sorte à ce que la souche acidifie la suspension ensemencée jusqu’à formation d’un précipitât protéique. [0056] La deuxième étape consiste donc notamment en l’acidification du pH à l’aide d’une souche sélectionnée entre Lactobacillus Fermentum, Lactobacillus Salivarius, Lactobacillus Delbrueckii subsp Jakobsenii, Lactobacillus Mucosae, Streptococcus Salivarius, et Enterococcus Lactis ; préférentiellement d’une souche de Lactobacillus Fermentum ; encore plus préférentiellement de la souche CNCM I-5802.
[0057] De manière préférentielle, la température de la suspension de protéines est régulée entre 30°C et 50°C, préférentiellement entre 35°C et 45°C, incluant donc les valeurs de 30°C, 31 °C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41 °C, 42°C, 43°C, 44°C et 45°C ;
[0058] De manière préférentielle, le pH de départ est rectifié entre 6,5 et 7,5 ; préférentiellement 7,0 ; ce qui inclue les valeurs de 6,5 ; 6,6 ; 6,7 ; 6,8 ; 6,9 ; 7,0 ; 7,1 ; 7,2 ; 7,3 ; 7,4 et 7,5. Pour ce faire, la Personne du Métier utilisera tout matériel et tout réactif bien connu.
[0059] La souche séléctionnée parmi Lactobacillus Fermentum, Lactobacillus Salivarius, Lactobacillus Delbrueckii subsp Jakobsenii, Lactobacillus Mucosae, Streptococcus Salivarius, et Enterococcus Lactis ; préférentiellement Lactobacillus Fermentum ; encore plus préférentiellement la souche CNCM I-5802 ; est ensuite de préférence introduite à une concentration comprise entre 0,1.109 et 1.109 CFU (signifiant Colonies Formant Unité) par millilitre de suspension.
[0060] De manière préférée, l’inoculat de la souche est préparé de la manière suivante, désignée ci-après « méthode de préparation d’inoculat A »):
- La souche est stockée sous forme de cryobille
- Ensemencement d’un Erlenmeyer de 2L avec 500 mL de milieu MRS avec 1 bille provenant d’un cryobille de la souche.
- Incubation de 18 à 24h dans un incubateur en anaérobie, sous une température de 37°C +/- 1°C et agitation de80 tr/min
- Transférer le contenu de l’Erlenmeyer dans un pot de centrifugation
- Centrifuger à 3000g pendant 10minutes
- Eliminer le surnageant
- Remettre en suspension le culot avec de l’eau physiologique - Recommencer 2 fois les étapes de centrifugation / lavage
- Après la dernière centrifugation, reprendre le culot dans 10mL d’eau physiologique
- Conserver la suspension ainsi obtenue dans la glace ou à 4°C en attendant sa mise en œuvre
- Réalisation de la droite de corrélation entre D.O. 600nm et CFU/ml. On obtient celle-ci en réalisant plusieurs dilutions de raison 10 de la suspension bactérienne, puis en mesurant à la fois la D.O. 600nm et en réalisant le dénombrement en CFU/ml. Tracer la courbe CFU/ml = f( D.O. 600 nm). On peut ainsi obtenir par régression linéaire le coefficient de corrélation entre D.O. 600nm et le nombre de CFU/ml permettant de calculer l’un à partir de l’autre.
- Réaliser une mesure de D.0.600nm à l’aide d’un spectrophotomètre sur la suspension stockée à 4°C (Si besoin de diluer pour obtenir la mesure, les dilutions des suspensions cellulaires se feront dans le Tween 0,3% car la biomasse à tendance à coller sur les parois des tubes de dilution)
- Déterminer le volume d’inoculum à introduire dans un volume donné d’extrait brut protéique pour atteindre la concentration comprise entre 0,1.109 et 1.109 CFU (signifiant Colonies Formant Unité) par millilitre de suspension.
[0061] De manière préférée et afin d’exemplifier, une suspension de la souche Lactobacillus fermentum CNCM I-5802 ayant une D.O 600nm de 1 correspond à une concentration de 3,0.108 CFU/mL.
[0062] Après introduction de l’inoculum bactérien dans l’extrait brut protéique, une agitation est réalisée avec toute installation bien connue de la Personne du Métier incluant un axe d’agitation équipé d’hélice marine. La vitesse d’agitation est préférentiellement comprise entre 200 et 400 tr/min, préférentiellement 250 et 350 tr/min.
[0063] Le pH va rapidement s’acidifier. Un suivi de l’évolution du pH est réalisé avec une sonde adéquate. La vitesse maximale d’acidification (baptisée Vm) exprimée en unités de pH par min est typiquement comprise entre - 0,030 et -0,020 unités de pH/min, préférentiellement entre -0,027 et -0,022 UpH/min. Si le pH n’évolue pas (absence d’acidification) ou quand la vitesse d’acidification est inférieure à -0,020 unités de pH/min, il est possible d’ajouter une quantité supplémentaire de ferment afin de pallier une mauvaise capacité à celle-ci à acidifier. [0064] Le pH cible est celui dit isoélectrique pour la protéine que l’on souhaite floculer. Par exemple, pour la fraction dite globuline du pois ce pH est de 5. Celui-ci est susceptible de varier selon la protéine ciblée. Par cette acidification naturelle, la protéine va donc floculer, coaguler.
[0065] De manière préférentielle, un ajout d’une quantité additionnelle d’acide permettant de finaliser l’acidification, par ex. pour acidifier de pH 5 à pH 4,5 peut être réalisé en fin d’étape 2b (sous-étape 2b’).
[0066] De manière préférentielle, un chauffage additionnel, de préférence en fin d’étape 2b est possible afin d’augmenter le rendement de floculation (sous-étape 2b”). Par « floculation » on entend dans la présente invention l’insolubilisation d’une partie des protéines présentes en solution afin d’être extraites. « floculation » et « précipitation » peuvent être ici utilisés de manière interchangeable. La température de chauffage est comprise entre 45° et 85°C, incluant donc les valeurs de 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51 °C, 52°C, 53°C, 54°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61 °C, 62°C, 63°C, 64°C, 65°C, 66°C, 67°C, 68°C, 69°C, 70°C, 71 °C, 72°C, 73°C, 74°C, 75°C, 76°C, 77°C, 78°C, 79°C, 80°C, 81 °C, 82°C, 83°C, 84°C et 85°C.
[0067] Quand le floc de protéines obtenu est de qualité et en quantité désirées, on va classiquement le séparer du reste de la suspension aqueuse, classiquement par décantation statique ou dynamique (centrifugueuse à assiette, décanteuses horizontales, ...).
[0068] Le floc ainsi obtenu peut être mis en œuvre tel que ou subir une ou plusieurs étapes unitaires de procédé incluant des étapes unitaires de purification (par ex. par chromatographie, ultrafiltration), de concentration (e.g. évaporation, séchage), d’ajout de réactifs chimiques (par ex. pour ajuster le pH) / enzymatiques (par ex. protéases) et/ou de traitement thermique (e.g. pasteurisation, HTST, stérilisation).
[0069] Un exemple préféré de post traitement consiste en 1 ) une rectification à pH compris entre 6 et 9, préférentiellement 7 avec utilisation préférentielle de soude ou de chaux, 2) traitement thermique entre 100°C et 160°C pendant 0,1 à 1s et 3) séchage à un matière sèche supérieure à 90%, préférentiellement à 95% à l’aide d’un atomiseur. [0070] La présente invention concerne également l’isolat de protéines végétales obtenu ou susceptible d’être obtenu par précipitation isoélectrique avec utilisation d’une souche sélectionnée entre Lactobacillus Fermentum, Lactobacillus Salivarius, Lactobacillus Delbrueckii subsp Jakobsenii, Lactobacillus Mucosae, Streptococcus Salivarius, et Enterococcus Lactis ; préférentiellement d’une souche de Lactobacillus Fermentum ; encore plus préférentiellement de la souche CNCM I- 5802.
[0071] Cet isolat obtenu par précipitation isoélectrique obtenu à l’aide d’une acidification bactérienne se caractérise par rapport aux arts antérieurs dont particulièrement l’article Emkani et al., 2021 (Emkani et al., Foods, 10, 549, 2021 ) en ce que son degré d’hydrolyse est invarié. Sans être lié par une quelconque théorie, c’est la sélection des souches et leur mise en œuvre qui permet l’obtention de ce résultat unique et inégalé jusqu’ici à notre meilleure connaissance. L’absence de protéase, une présence avec une activité moindre et/ou une vitesse de métabolisme acidifiant combiné permettent l’obtention de ce résultat.
[0072] L’isolat de protéines végétales selon l’invention est de préférence caractérisé en ce que son degré d’hydrolyse (ou DH) est inférieur à 10%, préférentiellement inférieur à 5.
[0073] L’isolat selon l’invention présente de préférence un degré d’hydrolyse (ou DH) inférieur à 10%, préférentiellement inférieur à 5%, incluant le DH de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% et 1 %.
[0074] Le degré d’hydrolyse peut être déterminé en mesurant la teneur en azote aminé libre par la méthode OPA divulguée dans l’article Nielsen et al., 2001 (Nielsen ét al., Journal of Food Science, Volume66, Issue , Pages 642-646, 2001 « Improved Method for Determining Food Protein Degree of Hydrolysis ») par rapport à l’azote total mesuré par la méthode de DUMAS selon la norme ISO 16634-2:2016.
[0075] Le Test de mesure du degré d’hydrolyse décrit ci-après est particulièrement préféré. Son principe consiste à déterminer tout d’abord la teneur en azote aminé (fonctions NH2 libre) sur l’échantillon de protéines (préférentiellement avec le kit MEGAZYME (référence K-PANOPA)), puis de déterminer la teneur en azote protéique (azote total incluant donc les fonctions NH2 libres et engagées) de l’échantillon, et enfin de calculer le degré d’hydrolyse accessible via le ratio de ces deux mesures.
[0076] Détermination de la teneur en azote aminé :
[0077] Les groupes « azote aminé » des acides aminés libres de l’échantillon réagissent avec le N-acétyl-L-cystéine et l’Ophthaldialdéhyde (OPA) pour former des dérivés d’isoindole.
La quantité de dérivé d’isoindole formée au cours de cette réaction est stoechiométrique avec la quantité d’azote aminé libre. C’est le dérivé d’isoindole qui est mesuré par l’augmentation de l’absorbance à 340 nm.
Dans un bêcher de 100 mL, on introduit une prise d’essai P*, exactement pesée, de l’échantillon à analyser. Cette prise d’essai sera de 0,5 à 5,0 g en fonction de la teneur en azote aminé de l’échantillon. On ajoute environ 50 mL d’eau distillée, on homogénéise et on transvase dans une fiole jaugée de 100 mL. On ajoute 5 mL de dodécyle sulfate de sodium (SDS) à 20% et on complète avec de l’eau distillée pour atteindre un volume de 100 mL. On agite pendant 15 minutes avec un agitateur magnétique à 1000 rpm. On prépare une solution n°1 en dissolvant un comprimé du flacon 1 du kit Megazyme dans 3 mL d’eau distillée et on agite jusqu'à dissolution complète. Il faut prévoir un comprimé par essai. La solution n°1 est préparée extemporanément.
On prépare un blanc, un standard et un échantillon directement dans les cuves du spectrophotomètre dans les conditions suivantes :
-blanc : introduire 3,00 ml de la solution n°1 et 50 μl d’eau distillée
-standard : introduire 3,00 ml de la solution n°1 et 50 μl du flacon 3 du kit Megazyme -échantillon : introduire 3,00 ml de la solution n°1 et 50 μl de la préparation de l’échantillon.
On mélange le contenu de chaque cuve et on lit la mesure d’absorbance (A1 ) des solutions après 2 mn environ au spectrophotomètre à 340 nm (spectrophotomètre équipé de cuves de 1,0 cm de trajet optique, pouvant mesurer à une longueur d’onde de 340 nm, et vérifié selon le mode opératoire décrit dans le manuel technique du constructeur qui s’y rapporte).
On amorce ensuite les réactions immédiatement en ajoutant 100 μl de la solution n°2 qui correspond à la solution d’OPA du flacon 2 du kit Megazyme dans chaque cuve de spectrophotomètre.
On mélange le contenu de chaque cuve et on les place environ 20 minutes dans l’obscurité.
On lit ensuite la mesure d’absorbance A2 du blanc, du standard et de l’échantillon au spectrophotomètre à 340 nm.
La teneur en azote aminé libre, exprimée en pourcentage en poids par rapport au poids du produit, est donnée par la formule suivante :
[Math.1]
[Math .2] où :
ΔAech =Aech2 - Aech1
ΔAblc =Ablc2 - Ablc1
Aech2 = absorbance de l’échantillon après ajout de la solution n°2
Aech1 = asorbance de l’échantillon après ajout de la solution n°1
Ablc2 = absorbance du blanc après ajout de la solution n°2
Ablc1 = absorbance du blanc après ajout de la solution n°1
V = volume de la fiole m = masse de la prise d’essai en g
6803 = coefficient d’extinction du dérivé d’isoindole à 340 nm (en L. mol-1. cm-1).
14,01 = masse molaire de l’azote (en g. mol-1)
3,15 = volume final dans la cuve (en mL)
0,05 = prise d’essai dans la cuve (en mL)
[0078] Détermination de la teneur en azote protéique :
[0079] La teneur d’azote protéique est déterminée selon la méthode de DUMAS selon la norme ISO 16634 - 2016. Elle est exprimée en pourcentage en poids par rapport au poids du produit. [0080] Calcul du degré d’hydrolyse :
Le degré d’hydrolyse (DH) est calculé avec la formule suivante:
[Math.3]
L’isolat obtenu selon le procédé de l’invention est également caractérisé par une teneur en methanethiol réduite. Comme il sera exemplifié dans la présente demande, lors d’une acidification classique par ex. avec de l’acide chlorhydrique on observe la synthèse de ce composé issu de la dégradation des acides aminés soufrés. Sa présence de l’ordre du ppb suffit à donner une flaveur dite « œuf pourri » ou « hydrogène sulfuré » lorsque l’isolat est utilisé pour préparer des boissons prêtes à boire ou des bandes d’extrusions humides destinées à produire des analogues de viande. Sans être lié par une quelconque théorie, ces procédés en générant une chaleur importante vont provoquer une apparition importante de composés de dégradations issus du méthanethiol. Le procédé selon l’invention permet de préférence l’obtention d’un isolat dont la teneur en methanethiol est réduite de plus de 50%, préférentiellement de plus de 25%, les valeurs de réductions étant potentiellement de 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31 %, 30%, 29%,
28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21 %, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%,
14% 13% 12%, 11% 10%, 9%, 8% 7%, 6%, 5%, 4% 3%, 2% ou 1%. Le procédé selon l’invention permet de préférence l’obtention d’un isolat dont la teneur en methanethiol est inférieure à 0,1 ppb, c’est-à-dire d’un isolat comprenant moins de 0,1 μg de methanethiol par kg d’isolat. Préférentiellement, le procédé selon l’invention permet l’obtention d’un isolat dont la teneur en methanethiol est inférieure à 0,01 ppb, c’est-à-dire d’un isolat comprenant moins de 0,01 μg de methanethiol par kg d’isolat. Plus préférentiellement encore, le procédé selon l’invention permet l’obtention d’un isolat dont la teneur en methanethiol est inférieure à 0,001 ppb, ou autrement dit dont la teneur est inférieur à 1 ppt (partie part trillion ; 1 ppt = 1 ng/kg, c’est-à-dire d’un isolat comprenant moins de 0,01 μg de methanethiol par kg d’isolat
[0081] L’isolat de protéines végétales selon l’invention est caractérisé en ce que sa teneur en protéines exprimées par rapport à sa matière sèche totale est de préférence comprise entre 80% et 95%, préférentiellement entre 82% et 92%, préférentiellement entre 84% et 90%, préférentiellement entre 84% et 88%.
[0082] L’invention concerne également un isolat de protéines végétales caractérisé en ce que sa teneur en hexanal est inférieure à 6000 μg/kg et sa teneur en methanethiol est inférieure à 100 μg/kg.
[0083] Par « hexanal » (ou hexanaldéhyde), on entend selon l’invention le composé organique de la famille des aldéhydes, de formule brute C6H12O, isomère de l'hexanone. Son numéro CAS est 66-25-1 .
[0084] Par « methanethiol » ( ou méthylmercaptan) on entend selon l’invention I composé organosulfuré de formule chimique CH3SH. C'est un gaz incolore de la famille des thiols dont l'odeur rappelle celle du chou pourri. Son numéro CAS est 74-93-1 .
[0085] L’impact des composés volatils dans le profil aromatique des protéines de pois est bien connu depuis des décennies, en particulier l’hexanal. Si l’hexanal est important, d’autres composés volatils sont également importants à contrôler. Récemment, le méthanethiol a été mis en évidence comme principal important conduisant à des arômes de soufre (voir « Characterization of odor-active compounds of various pea preparations by GC-MS, GC-O, and their correlation with sensory attributes » (Zhogoleva & al., Future Foods, volume 8, disponible en ligne en juin 2023).
[0086] Le dosage de ces composés est classiquement réalisé à l’aide d’une chromatographie en phase gaz, équipée d’un spectrophotomêtre de masse. De nombreux protocoles existent, et la personne du métier saura trouver & adapter afin de quantifier ces composés. Un protocole particulièrement préféré est décrit au paragraphe 168 de la présente demande.
[0087] La teneur en hexanal est inférieure à 6000 μg/kg, préférentiellement inférieure à 5500 μg/kg, préférentiellement inférieure à 5000 μg/kg, préférentiellement inférieure à 4500 μg/kg, préférentiellement 4000 μg/kg, préférentiellement 3500 μg/kg. [0088] La teneur en methanethiol est inférieure à 120 μg/kg, préférentiellement inférieure à 110 μg/kg, préférentiellement inférieure à 100 μg/kg, préférentiellement inférieure à 90 μg/kg, préférentiellement 80 μg/kg, préférentiellement 70 μg/kg, préférentiellement 65 μg/kg. La teneur en methanethiol pourra donc être de 119, 118, 117, 116, 115, 114, 113, 112, 111 , 110, 109, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101 , 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91 , 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82,
81 , 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71 , 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61 , 60,
59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51 , 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41 , 40, 39, 38,
37, 36, 35, 34, 33, 32, 31 , 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21 , 20, 19, 18, 17, 16,
15, 14, 13, 12, 11 , 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 μg/kg ainsi que l’ensemble des sous- gammes formées avec ces valeurs comme bornes. Par exemple, la teneur en methanethiol sera comprise entre 100 μg/kg et 50 μg/kg ; préférentiellement entre 90 μg/kg et 60 μg/kg, préférentiellement entre 80 μg/kg et 60 μg/kg, encore plus préférentiellement entre 70 μg/kg et 60 μg/kg.
[0089] L’isolat de protéines végétales selon l’invention est de préférence caractérisé en ce que son degré d’hydrolyse (ou DH) est inférieur à 10%, préférentiellement inférieur à 5.
[0090] Également, l’invention concerne l’application de l’isolat de protéines végétales obtenu avec utilisation de la souche CNCM I-5802 dans des formulations nutritionnelles en boissons laitières ou végétales, en laits fermentés de type yaourts (brassés, à la grecque, à boire) et en crèmes laitières ou végétales, desserts glacés ou sorbets.
[0091] Tout d’abord, l’invention concerne l’application de l’isolat selon l’invention en biscuits, muffins, pancakes, barres nutritionnelles (destinés à la nutrition spécialisée / minceur ou sportif), en pains ou pains sans gluten enrichis en protéines, en petites céréales obtenues par cuisson extrusion (« crisps ») hyperprotéinés, où l’on recherche plus particulièrement des solutions hyperprotéinées sans impact négatif sur le procédé de préparation ou la texture des préparations ou produits finis.
[0092] Au sens de l’invention, on entend par « formulations nutritionnelles en poudre », des formulations en poudre comprenant au moins, préférentiellement uniquement, une protéine de légumineuse, et en particulier de pois ou de féverolle, selon l’invention, qui sont reconstituables avec un liquide aqueux, et qui conviennent pour l'administration orale à un être humain.
[0093] L'expression « mélange à sec » tel qu'utilisé ici, sauf indication contraire, se réfère au mélange des composants ou des ingrédients pour former une poudre nutritionnelle de base ou, à l'addition d'un composant sec, en poudre ou granulé ou d'un ingrédient à base poudre pour former une formulation nutritionnelle en poudre.
[0094] Tous les pourcentages, parties et rapports, tel qu'utilisé ici, se rapportent au poids de la formulation totale, sauf indication contraire.
[0095] Les formulations alimentaires en poudre et les procédés de fabrication correspondant de la présente invention peuvent comprendre, consister ou consister essentiellement en les éléments essentiels de l'invention telle que décrite ici, ainsi que tout élément supplémentaire ou facultatif décrit ici ou autrement utiles dans les applications de la formulation nutritionnelle.
[0096] Les formulations nutritionnelles en poudre de la présente invention sont généralement sous la forme de compositions particulaires aptes à l'écoulement ou sensiblement fluides, ou au moins des compositions particulaires qui peuvent être facilement moulées et mesurées à l'aide d'une cuillère ou d'un autre dispositif similaire, dans lequel les compositions peuvent facilement être reconstitués par l'utilisateur prévu avec une solution aqueuse, typiquement de l'eau, pour former une formulation nutritionnelle liquide pour utilisation orale ou entérale immédiate. Dans ce contexte, l'utilisation « immédiatement » signifie généralement dans environ 48 heures, plus typiquement pendant environ 24 heures, de préférence juste après la reconstitution.
[0097] Les formulations alimentaires en poudre peuvent être formulées avec tous types et quantités de nutriments suffisantes de manière à former un complément alimentaire, ou une formulation nutritionnelle spécialisée destinée à être utilisée chez les personnes suivant un régime alimentaire particulier destiné à la diététique du sport et de la minceur.
[0098] Dans des exemples de réalisations, la formulation nutritionnelle en poudre peut être formulée pour une utilisation : pour réparer les muscles après un effort intense, par exemple chez le sportif, - pour assurer chez le sportif le maintien ou la construction de la masse musculaire, ou
- comme substitut de repas par des personnes désirant perdre du poids via un effet satiétogène.
[0099] Les formulations alimentaires en poudre peuvent avoir une densité calorique adaptée aux besoins nutritionnels de l'utilisateur final, bien que dans la plupart des cas, les poudres reconstituées comprennent d'environ 350 à environ 400 kcal / 100 ml.
[0100] Les formulations alimentaires en poudre peuvent présenter un taux protéique adapté aux besoins nutritionnels de l'utilisateur final, bien que dans la plupart des cas, les poudres reconstituées comprennent d'environ 20 à environ 91 g de protéines / 100 g, y compris d'environ 40 à environ 65 g de protéines / 100g.
[0101] Ainsi, la formulation peut comprendre entre 20 et 95 % de protéines par rapport au poids total de la formulation, par exemple entre 20-90%, 30-80%, ou 40- 60%.
[0102] Par exemple, l’isolat de protéines de légumineuses, préférentiellement de pois ou de féverolle, selon la présente invention peut représenter 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% ou 90-100% de la protéine totale de la formulation, ou une quelconque combinaison de ces gammes de pourcentages. 100% représentant le mode préférentiel ultime afin de maximiser l’effet de surexpression du FGF19.
[0103] Par ailleurs, les formulations alimentaires en poudre peuvent présenter un taux de matière grasse adapté aux besoins nutritionnels de l'utilisateur final, bien que dans la plupart des cas, les poudres reconstituées comprennent d'environ 0,5 à environ 13 g /100 g, y compris d'environ 3 à environ 7 g /100 g. Ainsi, la formulation peut comprendre entre 0 et 20 % de lipides par rapport au poids totale de la formulation, par exemple entre 0,5-15%, 1-10%, ou 3-7% (en particulier % en poids).
[0104] Les formulations nutritionnelles en poudre de la présente invention peuvent être emballées et scellées dans des conteneurs simples ou multi-usage, puis stockées dans des conditions ambiantes jusqu'à environ 36 mois ou plus, plus typiquement d'environ 12 à environ 24 mois. [0105] Pour multi-utilisation des conteneurs, ils peuvent être ouverts et couverts pour une utilisation répétée par l'utilisateur final, à condition que le paquet recouvert soit ensuite stocké dans des conditions ambiantes (par exemple, éviter les températures extrêmes) et les contenus utilisés dans environ un mois ou deux.
[0106] Les domaines d’applications des formulations nutritionnelles selon l’invention sont notamment :
- la nutrition diététique (sport, minceur),
- la nutrition clinique (sous forme de boisson, de crème dessert ou de poche entérale),
- les produits laitiers (sous forme de yaourts, boissons laitières, crèmes laitières, desserts glacés ou sorbets).
- les produits de biscuiterie, produits de pâtisserie, produits de panification et produits céréaliers hyperprotéinés.
[0107] Dans le domaine du sport, il est connu que les protéines participent à l'entretien et à la croissance du muscle. L’apport en protéines est également important pour les athlètes qui pratiquent la musculation ou le renforcement musculaire.
[0108] Ces protéines doivent être équilibrées en termes de profil en acide aminés et doivent respecter les recommandations de la FAO/WHO. Leur digestibilité est un facteur important allant d’une rapide digestibilité à une plus lente digestibilité en fonction du moment de l’apport en protéines.
[0109] Les boissons protéinées ou hyperprotéinées prêtes à boire permettent alors de faire bénéficier l’organisme d'un apport protéique de choix, les calories en moins.
[0110] Ces boissons hyperprotéinées doivent :
- être riches en protéines, pauvres en glucides et en graisses ;
- avoir bon goût ;
- être conçues pour aider à perdre du poids, en stimulant la perte de graisse et en aidant à la récupération musculaire ;
- être satiétogènes ;
- permettre de faire face aux fringales, sans sucres ni graisses ajoutées ;
- présenter un contenu équilibré en acides aminés essentiels, en fibres, en vitamines et minéraux ;
- être hypocaloriques.
[0111] Ces boissons prêtes-à-boire peuvent être avantageusement préparées avec les isolats de protéines de légumineuses, préférentiellement de féveroles ou de pois, conformément à l’invention. Elles peuvent être d’ailleurs utilisées comme seule source de protéines, de manière préférée car maximisant l’effet de surexpression du FGF19.
[0112] Par exemple, les boissons végétales alternatives au lait de vache, contiennent en moyenne de 4,5 à 11 g de protéines pour 100 ml de boisson, de préférence de l’ordre de 7 g de protéines pour 100 ml, et sont très pauvres en fibres (de l’ordre de 0,5 à 1 g pour 100 ml).
[0113] Ainsi, la boisson peut comprendre entre 1 et 20 % de protéines par rapport au poids totale de la boisson, par exemple entre 3-15%, ou 6-8%.
[0114] Par exemple, l’isolat de protéines de pois selon la présente invention peut représenter 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% ou 90-100% de la protéine totale, ou une quelconque combinaison de ces gammes de pourcentages. De préférence, il représente au moins 52 %. Notamment, l’apport en protéines de pois est compris entre 52 et 100 % de l’apport en protéines totales.
[0115] Pour les boissons prêtes à boire, l’apport en protéines de pois peut aller de 0 à 100%, de préférence de 0,01 ou 0,1 à 100 %. Par exemple, l’isolat de protéines de pois selon la présente invention peut représenter 0,1-10%, 10-20%, 20-30%, 40- 50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% ou 90-100% de la protéine totale, ou une quelconque combinaison de ces gammes de pourcentages.
[0116] Dans le domaine des boissons « minceur », i.e. destinées à être utilisées dans des régimes hypocaloriques ou destinées à la perte de poids, comme mentionné précédemment, ces boissons protéinées ou enrichies en protéines ne sont pas uniquement efficaces pour une prise rapide de muscles. Ce type de boisson est également très avantageux dans le cadre d'un régime minceur basé sur la consommation de protéines. [0117] Il est connu que les boissons minceurs sont idéales pour aider à la perte de poids. Elles permettent plus particulièrement de :
- procurer un effet de satiété
- protéger les muscles et de tonifier le corps, évitant la reprise de poids.
[0118] Comme pour les boissons « sport », ces boissons minceurs présentent :
- un contenu équilibré en acides aminés essentiels, en fibres, en vitamines et minéraux
- un contenu réduit en sucres, en matières grasses et en calories.
[0119] C’est ainsi que les boissons protéinées sont en effet d'une grande efficacité pour perdre rapidement quelques kilos. Ces préparations riches en protéines réduisent ou stoppent simplement la sensation de faim chez la personne qui en consomme. En prenant par exemple une telle boisson, l'utilisateur peut réduire de manière considérable la quantité de nourriture à consommer, et permettre une perte de pois rapide (dans le cadre d’un processus de substitut de repas pour contrôle du poids, ou substitut de la ration journalière totale pour contrôle du poids).
[0120] En nutrition clinique, il est connu que la nutrition entérale est une solution thérapeutique de nutrition par sonde qui est utilisée lorsque le tube digestif est fonctionnel et accessible mais lorsque le patient ne peut s’alimenter normalement ou encore dans les cas de dénutrition sévère.
[0121] Cette technique permet d’apporter directement les nutriments dans le tube digestif. Elle remplace, de manière totale ou partielle, l’alimentation orale traditionnelle par des formules nutritives « complètes » apportant l’ensemble des nutriments nécessaires à l’organisme.
[0122] Ces formules sont généralement conditionnées dans des poches souples (en PVC) et administrées au moyen de sondes naso-gastriques ou, gastrostomies, naso-jéjunale, naso-duodénale, jéjunostomie.
[0123] Ces mélanges nutritionnels sont composés de protéines, lipides, glucides, vitamines et minéraux avec ou sans fibres.
[0124] On distingue plusieurs catégories : les mélanges polymériques (standards) et les mélanges semi-élémentaires («prédigérés»), ces derniers étant indiqués dans des cas bien spécifiques (syndrome du grêle court, insuffisance pancréatique exocrine, etc.) :
- Mélanges polymériques
- hypocaloriques (0,5 - 0,75 kcal /ml), normo ou hyperprotéinés, avec ou sans fibres
- isocaloriques (1 kcal / ml), normo ou hyperprotéinés, avec ou sans fibres
- hypercaloriques (1 ,25 -1 ,5 kcal / ml) normo ou hyperprotéinés, avec ou sans fibres
- formules spécifiques (troubles du métabolisme glycémique, insuffisance respiratoire).
[0125] Les semi-élémentaires sont des mélanges iso ou hypercaloriques normo ou hyperprotéinés, à base de peptides et de triglycérides à chaînes moyennes.
[0126] Les isolats de protéines de pois, comme source de protéines, par leurs propriétés fonctionnelles sont particulièrement bien adaptés à cet usage.
[0127] Par ailleurs, ils permettent de préserver les mêmes propriétés que les protéines de lait, et ce pour un coût moindre.
[0128] L’ invention sera mieux comprise avec les exemples suivants qui n’ont pour but que de mieux faire comprendre celle-ci. Ceux-ci n’ont aucune portée limitative.
Exemples
[0129] Exemple 1 : Procédé selon l’invention partant d’une farine de pois
[0130] Délayage de 2 kg (exprimé en masse commerciale) de farine de pois lisse jaune (85% de matière sèche et 28% de protéine N6,25 en poids sec) avec de l’eau déminéralisée (20°C). La suspension obtenue est homogénéisée pendant 30 minutes à l’aide d’un agitateur de paillasse de marque RAYNERI équipé d’une turbine de dispersion. La suspension ainsi obtenue est centrifugée à 1000g pendant 5 minutes dans une centrifugeuse labo BECKMAN. On récupère environ 7 kg de surnageant à 7% de matière sèche (MS) après élimination du culot contenant la partie insoluble majoritairement un mélange fibres/amidon. Le surnageant ainsi obtenu est appelé « extrait brut » est normalisé en rectifiant sa matière sèche à 6%.
[0131] Cet ensemble d’étape menant à l’extrait brut est désigné ci-après « tête de procédé ». [0132] L’acidification de l’extrait brut est ensuite réalisée selon le protocole suivant : Préculture
- Souche : CNCM I-5802
- Inoculum : 1 cryobille
- Milieu : MRS broth (Man Rogosa Sharpe), prêt à l’emploi, Sigma ref.69966
- Incubation pendant 24h à 37°C
- La biomasse obtenue est concentrée, lavée 3 fois avec de l’eau physiologique à 4°C
- On calcule la quantité à ajouter à 900ml d’extrait brut à 6% MS pour obtenir une concentration cellulaire de 109 CFU/mL selon la méthode de préparation d’inoculat A décrite ci-avant (DO=1 <-> 3.108 CFU/mL)
Culture :
- Fermenteur de 2L DasGip®.
- Volume réactionnel : 900mL d’extrait brut à 4°C
- L’agitation est régulée à 300 rpm, la température 40°C
- Rectification du pH à 7 afin de le normaliser avant ensemencement
- Ensemencement du fermenteur avec la quantité de préculture permettant d’obtenir la concentration cellulaire de 109 CFU/mL calculée en fin d’étape de préculture.
- Suivi de l’évolution du pH à l’aide du pH mètre du Dasgip® (acidification naturelle de l’extrait par la souche)
- On réalise un témoin en parallèle dans les mêmes conditions mais sans souche introduite afin de contrôler l’absence d’un contaminant non désiré perturbant le procédé
[0133] Les paramètres de la réaction d’acidification sont les suivants :
- Témoin :
- Le témoin est resté à pH 7 sans s’acidifier ce qui valide l’absence de contaminant
- En présence de la souche :
- Le temps d’acidification pour atteindre pH 5 était de 110 min
- La Vm (ou Vitesse moyenne d’acidification) était de 2 unités de pH acidifiée en 110min soit -0,018 U.pH/min (exprimée Unités de pH par min, le signe exprimant une acidification) -La VM (ou Vitesse Maximum d’acidification) était de -0,027 U.pH/min relevée à 42 min de réaction à un pH de 6,24.
[0134] On note que le temps de fermentation est très court comparé à l’enseignement de Emkani et al., 2021 (Emkani et al., Foods, 10, 549, 2021 ) qui décrit un temps de fermentation entre 350 et 500 min selon les souches, soit plus de 3 fois plus long qu’avec la souche CNCM I-5802.
[0135] La suspension en fin d’acidification est centrifugée à 1000g pendant 5 min sous 6°C. Le surnageant (qui peut être conservé pour analyse) est éliminé et remplacé par une même quantité d’eau déminéralisée stérile. On agite la suspension ainsi obtenue pour l’homogénéiser et rectifier le pH à 7. Après 15 min d’agitation et contrôle visuel de la bonne homogénéité, la suspension est lyophilisée pour analyse sous la référence « Exemple 1 selon l’invention »
[0136] Exemple 2 : Répétabilité de l’Exemple 1 :
[0137] Le principe est ici de reproduire à partir de la même farine de pois, trois fois le même procédé que celui décrit dans l’Exemple 1 .
[0138] Les paramètres de la réaction d’acidification sont résumés dans le Tableau 1 suivant :
[Tableau 1]
[0139] Les suspensions en fin d’acidification sont centrifugées à 1000g pendant 5 min sous 6°C. Le surnageant (qui peut être conservé pour analyse) est éliminé et remplacé par une même quantité d’eau déminéralisée stérile. On agite la suspension ainsi obtenue pour l’homogénéiser et rectifier le pH à 7. Après 15 min d’agitation et contrôle visuel de la bonne homogénéité, la suspension est lyophilisée pour analyse sous la référence « Exemple 2.1/2.2./2.3 selon l’invention ». [0140] Exemple 3 - Procédé selon l’invention partant d’un isolat de pois
[0141] Le procédé peut être appliquée sur un isolat de protéine de pois (p.ex. le Nutralys® F85M de la société Roquette) ce qui permet de simplifier la tête de procédé de l’Exemple 1 . On réalise juste une suspension titrant 6% de matière sèche avec l’isolat de protéine de pois et de l’eau potable.
[0142] L’acidification de la suspension est ensuite réalisée selon le protocole suivant :
Préculture
- Souche : CNCM I-5802
- Inoculum : 1 cryobille
- Milieu : MRS broth (Man Rogosa Sharpe), prêt à l’emploi, Sigma ref.69966
- Incubation pendant 24h à 37°C
- La biomasse obtenue est concentrée, lavée 3 fois avec de l’eau physiologique à 4°C
- On calcule la quantité à ajouter à 900ml d’extrait brut à 6% pour obtenir une concentration cellulaire de 109 CFU/mL selon la méthode de préparation d’inoculat décrite ci-avant A (DO=1 <-> 3.1 Op8 CFU/mL) Culture :
- Fermenteur de 2L DasGip®.
- Volume réactionnel : 900mL d’extrait brut à 4°C
- L’agitation est régulée à 300rpm, la température 40°C
- Rectification du pH à 7 sans régulation (acidification naturelle réalisée par la souche).
- Suivi de l’évolution du pH à l’aide du pH mètre du Dasgip®
- On réalise un témoin en parallèle dans les mêmes conditions mais sans souche introduite afin de contrôler l’absence d’un contaminant non désiré perturbant le procédé
[0143] Exemple 4 : Procédé hors invention acidification avec de l’acide chlorhydrique :
[0144] Ce procédé est réalisé afin de générer un floc protéique représentant celui obtenu par le procédé classique de l’art antérieur. [0145] La tête du procédé est la même que celle de l’Exemple 1 afin de générer un extrait brut titrant 6% de M.S.
[0146] L’ acidification est réalisée sous agitation en visant pH 5 avec HCl 1 N. La température appliquée est de 60°C et est maintenue ainsi pendant 10 minutes.
[0147] La suspension en fin d’acidification est centrifugée à 1000g pendant 5 min sous 6°C. Le surnageant (qui peut être conservé pour analyse) est éliminé et remplacé par une même quantité d’eau déminéralisée stérile. On agite la suspension ainsi obtenue pour l’homogénéiser et rectifier le pH à 7. Après 15 min d’agitation et contrôle visuel de la bonne homogénéité, la suspension est lyophilisée pour analyse sous la référence « Exemple 4 hors invention - acidification HCl»
[0148] Exemple 5 : Procédé hors invention - acidification avec souches ne permettant pas de réaliser et/ou obtenir l’invention :
[0149] Le but est ici de démontrer l’importance des souches utilisées. Le protocole est quasi identique à celui décrit dans l’Exemple 1 .
[0150] Délayage de 2 kg (exprimé en masse commerciale) de farine de pois lisse jaune (85% de matière sèche et 28% de protéine N6,25 en poids sec) avec de l’eau déminéralisée (20°C). La suspension obtenue est homogénéisée pendant 30 minutes à l’aide d’un agitateur de paillasse de marque RAYNERI équipé d’une turbine de dispersion. La suspension ainsi obtenue est centrifugée à 1000g pendant 5 minutes dans une centrifugeuse labo BECKMAN. On récupère environ 7 kg de surnageant à 7% de matière après élimination du culot contenant la partie insoluble majoritairement un mélange fibres/amidon. Le surnageant ainsi obtenu est appelé « extrait brut » est normalisé en rectifiant sa matière sèche à 6%.
[0151] L’acidification de l’extrait brut est ensuite réalisée selon le protocole suivant :
Préculture
- Souche : plusieurs souches sont comparées, la liste sera présentée dans le tableau ci-dessous
- Inoculum : 1 cryobille
- Milieu : MRS broth (Man Rogosa Sharpe), prêt à l’emploi, Sigma ref.69966
- Incubation pendant 24h à 37°C - La biomasse obtenue est concentrée, lavée 3 fois avec de l’eau physiologique à 4°C
- On calcule la quantité à ajouter à 900ml d’extrait brut à 6% pour obtenir une concentration cellulaire de 109 CFU/mL selon la méthode de préparation d’inoculat A décrite ci-avant (DO=1 <-> 3.10p8 CFU/mL)
Culture :
- Fermenteur de 2L DasGip®.
- Volume réactionnel : 900mL d’extrait brut à 4°C
- L’agitation est régulée à 300rpm, la température 40°C - Rectification du pH à 7 sans régulation (acidification naturelle réalisée par la souche).
- Suivi de l’évolution du pH à l’aide du pH mètre du Dasgip®
- On réalise un témoin en parallèle dans les mêmes conditions mais sans souche introduite afin de contrôler l’absence d’un contaminant non désiré perturbant le procédé.
[0152] Les paramètres de la réaction d’acidification sont les suivants sont les suivants :
[0153] [Tableau 2] [0154] Il est clair que seules les souches recommandées pour réaliser l’invention (en gras) permettent d’obtenir une acidification à pH 5 dans un temps inférieur à 130 min. Ceci est un avantage indéniable pour un procédé industriel.
[0155] Pour compléter ce tableau, on réalise plusieurs analyses dont l’analyse des composés organovolatils par CPG/MS (dont le méthanethiol) ainsi qu’une mesure du degré d’hydrolyse.
[0156] On réalise aussi un bilan massique de récupération du floc protéique obtenu à l’aide des souches recommandées pour l’invention (en gras). Celui-ci est calculé à partir 1 ) de la quantité de matière sèche mise en œuvre dans l’extrait brut et 2) la quantité de matière sèche obtenue dans le floc. Le ratio des deux (2/1 ) permet d’obtenir un rendement d’extraction. On se compare l’exemple 4 (acidification avec HCL). Le tableau 3 ci-dessous synthétise les résultats :
[Tableau 3]
Sd pour déviation standard ou « standard deviation » en anglais.
[0157] Exemple 6 : Validation à l’échelle pré-pilote industrielle de l’invention
[0158] Pour faciliter la mise en œuvre de ces essais mais aussi assurer une comparaison stricte des scenarios, la matière première choisie est produite en produite selon un même mode opératoire que la tête de procédé décrite à l’Exemple 1 , puis atomisée afin de la stabiliser.
[0159] Tableau 4 : Caractéristiques physico-chimiques de l’extrait brut atomisé
[Tableau 4]
[0160] Quatre essais comparatifs et leur prototypes associés sont décrits Error!
Reference source not found.. Ils ont été conduits selon le déroulement suivant :
- Réhydratation de l’extrait brut atomisé à 6% de M.S.
- Acidification dans un fermenteur de 20I Biolaffite :
. Pour les trois essais « fermentation », le procédé réactionnel est celui décrit au paragraphe 130 mais adapté à un volume de 20 litres.
. Pour le témoin « HCl », introduction d’HCI afin de rectifier le pH à 5
- Les différentes acidifications sont suivies d’une étape de chauffage destinée à précipiter les protéines encore potentiellement en solution :
. Continu : zone tubulaire d’échange avec comme paramètres : préchauffage 35°C. chambrage 74°C pdt 10 secondes - refroidissement 65°C
Batch : cuve réactionnelle dont chauffage et agitation sont régulées - 60°C - 30 min
- Post-traitement du moût :
. Centrifugation 4000G
. Récupération du sédiment
. Redispersion avec de l’eau pour suspension 15% MS
. Rectification pH7
. Traitement HTST (préchauffe 50°C / chauffe 130°C 2s / flash 75°C)
. Atomisation (T°C entrée air = 200°C / T°C sortie air = 90°C)
[0161] Le Tableau 5 ci-dessous résume les différents essais : [0162] [Tableau 5]
[0163] L’idée ici est de valider que le procédé selon l’invention fonctionne à un stade pré-pilote de 20 litres et l’effet d’une combinaison avec un chauffage permettant d’augmenter le rendement de précipitation. [0164] On pratique des analyses biochimiques et physicochimiques qui sont résumées dans le Tableau 6 ci-dessous :
[0165] [Tableau s]
[0166] Il est intéressant comparativement à l’article de Emkani et al, 2021 (Emkani et al., Foods, 10, 549, 2021 ) de constater qu’en pratiquant le procédé selon l’invention, le degré d’hydrolyse est inchangé. Il n’y a donc pas d’hydrolyse et le produit est ainsi intact, inchangé de ce point de vue à l’opposé de Emkani et al, 2021 (Emkani et al., Foods, 10, 549, 2021 ). Ce point est particulièrement important lorsque des étapes additionnelles d’extrusion sont réalisées. En effet, une étape d’extrusion réalisée sur une protéine hydrolysée fonctionne moins bien.
[0167] Exemple 5 : Caractérisation de la composition orqanovolatile des échantillons générés : [0168] Une analyse est réalisée par CPG/MS sur plusieurs échantillons générés ci-dessus afin de déterminer les différents composés organovolatils.
On compare les « Echantillons 1 » (selon l’invention) et « Echantillons 4 » (témoin art antérieur - acidification HCl). Les résultats sont présentés dans le Tableau 7 : [0169] [Tableau 7]
[0170] On s’aperçoit aisément que le procédé selon l’invention réduit au moins de 75% l’ensemble des composés organovolatils à l’exception du methylacetate (dont la teneur est inchangée) et l’ethylacetate (dont la concentration est triplée) en comparaison à l’art antérieur. En particulier, la teneur en methanethiol est réduite (environ 15% de la valeur de l’art antérieur). Le methanethiol est un composé qui a une concentration assez faible, de l’ordre du ppb, génère des flaveurs soufrées dans des produits alimentaires tels que des boissons prêtes à boire ou des extrudats humides de protéines.
[0171] On réalise une quantification précise du méthanethiol à l’aide du protocole suivant :
- Après ajout d’étalons internes (hexanal-d12 et diméthylsufide-d6), une aliquote de chaque échantillon a été diluée dans de l’eau puis soumise à une micro-extraction en phase solide (SPME). La désorption a été effectuée dans l’injecteur du chromatographe. - Les analyses ont été effectuées par couplage chromatographie phase gazeuse - spectrométrie de masse (GC-MS) selon les conditions opératoires suivantes : o Chromatographe : Shimadzu 2010 o Colonne chromatographique : PDMS o Injection : Splitless / Split o Spectromètre de masse : Shimadzu QP2010+ o Méthode d’ionisation : Impact électronique (70 eV) o Mode de détection : Scan
- L’identification et la quantification de l’hexanal et du méthanethiol sont basées sur un étalonnage à 1 point avec ces mêmes composés de référence.
[0172] Les résultats obtenus sont les suivants :
[0173] On constate qu’en pratiquant l’invention, la teneur en hexanal est deux fois inférieure par rapport à l’art antérieur.
[0174] Le methanethiol est également inférieur à 100 μg/kg, valeur bien supérieure en pratiquant la précipitation par ajout d’acide telle que pratiquée dans l’art antérieur.

Claims

Revendications [Revendication 1] Procédé d’extraction de protéines végétales comprenant les étapes suivantes :
1. la mise en suspension d’une farine végétale dans un solvant préférentiellement aqueux, de sorte à obtenir une suspension de farine végétale ;
2a. l’ajout d’une souche dans la suspension de farine végétale de l’étape 1 , la souche étant sélectionnée dans le groupe constitué par Lactobacillus Fermentum, Lactobacillus Salivarius, Lactobacillus Delbrueckii subsp Jakobsenii, Lactobacillus Mucosae, Streptococcus Salivarius, et Enterococcus Lactis ; la souche de Lactobacillus étant préférentiellement une souche de Lactobacillus Fermentum ; encore plus préférentiellement la souche déposée auprès de la CNCM sous le numéro CNCM I-5802, de sorte à former une suspension ensemencée ;
2b. l’incubation de la suspension ensemencée de l’étape 2a de sorte à ce que la souche acidifie la suspension ensemencée jusqu’à formation d’un précipitât protéique ;
3. Séparation du précipitât protéique obtenu à l’issue de l’étape 2b.
[Revendication 2] Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la farine végétale de l’étape 1 est sous la forme d’une poudre végétale contenant une quantité de protéine supérieure à 1 % en poids, préférentiellement comprise entre 15% et 30% en poids, par rapport au poids de poudre.
[Revendication 3] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que la farine végétale de l’étape 1 est un isolat ou un concentrât, préférentiellement un isolat dont la teneur en protéines est supérieure à 80% en poids sec sur matière sèche d’isolat.
[Revendication 4] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la farine végétale de l’étape 1 est une farine de légumineuse, préférentiellement en ce que la farine végétale est une farine de légumineuse sélectionnée dans le groupe constitué par le pois et la féverole, plus préférentiellement en ce que la farine végétale est une farine de pois.
[Revendication 5] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que la température d’incubation de la suspension de l’étape 2b est comprise entre 30°C et 50°C, préférentiellement entre 35°C et 45°C.
[Revendication 6] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que le pH de la suspension de farine végétal de l’étape 1 est rectifié de sorte à être compris entre 6,5 et 7,5 ; préférentiellement de sorte à être égal à 7,0 , avant la mise en œuvre de l’étape 2a.
[Revendication 7] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que l’ajout de souche de l’étape 2a est réalisé de sorte à obtenir une suspension ensemencée présentant une concentration de souche dudit Lactobacillus comprise entre 0,1.109 et 1.109 Colonies Formant Unité (CFU) par millilitre de suspension de farine végétale.
[Revendication 8] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que l’incubation de l’étape 2b est menée jusqu’à ce la suspension ensemencée présente un pH compris entre 4 et 5, préférentiellement un pH de 5,0.
[Revendication 9] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que si à l’issue de l’étape 2b, le pH de la suspension ensemencée n’est pas compris entre 4 et 5, l’étape 2b comprend en fin d’étape 2b une sous- étape 2b’ d’acidification de la suspension ensemencée par ajout d’acide, de sorte à ce que la suspension ensemencée obtenue à l’issue de l’étape 2b présente un pH compris entre 4 et 5, de préférence compris entre 5 et 4,5.
[Revendication 10] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 9 caractérisé en ce que l’étape 2b comprend en fin d’étape 2b une sous-étape 2b” de chauffage additionnel pour augmenter le rendement de floculation, consistant à porter la suspension de farine végétale de l’étape 2b à une température comprise entre 45° et 85°C.
[Revendication 11] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que l’étape 3 comprend les étapes suivantes :
3a. la rectification du pH de la suspension ensemencée obtenue à l’issue de l’étape 2b à un pH compris entre 6 et 9, préférentiellement un pH de 7, préférentiellement par ajout de soude ou de chaux dans ladite suspension ;
3b. le traitement thermique de la suspension de l’étape 3a entre 100°C et 160°C pendant 0,1 à 1 s, et
3c. le séchage de la suspension de farine végétale de l’étape 3b jusqu’à obtenir un isolat de farine végétale présentant une matière sèche supérieure à 95% à l’aide d’un atomiseur.
[Revendication 12] Isolat de protéines végétales susceptible d’être obtenu par le procédé de l’une quelconque des revendications 1 à 11 .
[Revendication 13] Isolat de protéines végétales selon la revendication 12 caractérisé en ce que son degré d’hydrolyse (ou DH) est inférieur à 10%, préférentiellement inférieur à 5.
[Revendication 14] Isolat de protéines végétales selon l’une quelconque des revendications 12 ou 13 caractérisé en ce que teneur en methanethiol est réduite de plus de 25%, préférentiellement de plus de 50%, par rapport à un isolat obtenu par acidification d’une suspension de farine végétale uniquement par ajout d’acide chlorhydrique.
[Revendication 15] Isolat de protéines végétales selon l’une quelconque des revendications 12 à 14 caractérisé en ce que sa teneur en protéines comprise entre 80% et 95% en poids, préférentiellement entre 82% et 92% en poids, préférentiellement entre 84% et 90% en poids, préférentiellement entre 84% et 88% en poids, par rapport au poids de matière sèche totale de l’isolat.
[Revendication 16] Isolat de protéines végétales caractérisé en ce que sa teneur en hexanal est inférieure à 6000 μg/kg et sa teneur en methanethiol est inférieure à 100 μg/kg.
[Revendication 17] Isolat de protéines végétales selon revendication 16 caractérisé en ce que la teneur en hexanal est inférieure à 5500 μg/kg, préférentiellement inférieure à 5000 μg/kg, préférentiellement inférieure à 4500 μg/kg, préférentiellement 4000 μg/kg, préférentiellement 3500 μg/kg.
[Revendication 18] Isolat de protéines végétales selon les revendications 16 ou 17 caractérisé en ce que la teneur en methanethiol est inférieure à 120 μg/kg, préférentiellement inférieure à 110 μg/kg, préférentiellement inférieure à 100 μg/kg, préférentiellement inférieure à 90 μg/kg, préférentiellement 80 μg/kg, préférentiellement 70 μg/kg, préférentiellement 65 μg/kg.
[Revendication 19] Utilisation de l’isolat selon l’une quelconque des revendications 12 à 18 ou obtenu selon l’une quelconque des revendications 1 à 11 pour des applications industrielles comprenant les applications alimentaires, nutraceutiques, pharmaceutiques.
[Revendication 20] Souche microbienne déposée auprès de la CNCM sous le numéro CNCM I-5802.
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