EP4680760A2 - Verfahren zur herstellung einer wässerigen lösung enthaltend d-psicose - Google Patents

Verfahren zur herstellung einer wässerigen lösung enthaltend d-psicose

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EP4680760A2
EP4680760A2 EP24710783.2A EP24710783A EP4680760A2 EP 4680760 A2 EP4680760 A2 EP 4680760A2 EP 24710783 A EP24710783 A EP 24710783A EP 4680760 A2 EP4680760 A2 EP 4680760A2
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EP
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seq
acid sequence
amino acid
nucleic acid
psicose
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EP24710783.2A
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English (en)
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Nicole STAUNIG
Maria Dupont
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Annikki GmbH
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Annikki GmbH
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    • C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
    • C12Y501/03—Racemaces and epimerases (5.1) acting on carbohydrates and derivatives (5.1.3)

Definitions

  • the present invention relates to a process for preparing an aqueous solution containing D-psicose.
  • the monosaccharide D-psicose also known as D-allulose, is a ketohexose that is rarely found in nature (Zhang et al., 2016). It has been detected in the leaves of rosemary willows (Itea sp.) (Hough & Stacey, 1966), but is also found in processed foods such as confectionery and seasoning sauces, where it is formed from D-fructose, its Ca epimer, under the influence of heat (Oshima et al., 2006).
  • D-psicose is interesting for the food industry due to its sweet taste. Compared to sucrose, D-psicose has a relative sweetening power of 70%, but has a low energy content (0.2 kcal/g), which corresponds to a calorie reduction of about 95% (relative to sucrose) (Jiang et al., 2020).
  • D-psicose is recognized as a Generally Recognized as Safe (GRAS) sweetener by the US Food and Drug Administration (FDA), but is not yet approved in the EU (Ahmed et al., 2022).
  • GRAS Generally Recognized as Safe
  • D-psicose also has positive effects on lipid metabolism and carbohydrate metabolism (e.g. antidiabetic) and has anti-inflammatory and antioxidant effects (Zhang et al., 2016; Jiang et al., 2020; Chen et al., 2022).
  • D-psicose Due to its low natural occurrence, D-psicose is largely produced synthetically (chemically or biotechnologically).
  • D-fructose to D-psicose can be carried out by boiling in pyridine under reflux followed by removal of the other hexoses by yeast fermentation, but only 6.8% of the theoretical yield of D-psicose is achieved (Doner, 1979).
  • Another method involves the epimerization of D-fructose with molybdate ions as catalyst, whereby only 0.5% of the D-fructose is converted to D-psicose (Bilik & Tihlärik, 1974).
  • Ketose 3-epimerases can be divided into three groups depending on their substrate specificity: 1) D-tagatose 3-epimerase (DTE), 2) D-psicose 3-epimerase (DPE) or D-allulose 3-epimerase (DAE), and 3) L-ribulose 3-epimerase (LRE) (Zhang et al., 2016; Jiang et al., 2020).
  • DTE D-tagatose 3-epimerase
  • DPE D-psicose 3-epimerase
  • DAE D-allulose 3-epimerase
  • LRE L-ribulose 3-epimerase
  • the equilibrium during epimerization can be influenced not only by temperature or pH, but also by the addition of (toxic) borate. Due to the preferential formation of a D-psicose-borate complex, the equilibrium is shifted towards D-psicose (Kim et al., 2008; Lim et al., 2009).
  • EP 3643786 A2 and US 11028420 B2 describe the chromatographic separation of the D-psicose-borate complex using simulated moving bed (SMB) chromatography.
  • EP 3395952 Bl and US 10550414 B2 disclose that the conversion during epimerization using DPE can be increased to up to 67% with the addition of sodium aluminate and up to 52% with potassium iodate (comparison: 25% without the addition of aluminate or iodate).
  • Zhu et al. presented a system consisting of two enzymes (exo-inulase from Bacillus velezenis and DAE from Ruminococcus sp.) that can convert inulin from Helianthus tuberosus L. (Jerusalem artichoke) into a syrup consisting of D-glucose, D-fructose and D-psicose (1:3:1).
  • Li et al. (2021a) used a system consisting of invertase, D-glucose isomerase and immobilized DAE from Pirellula sp.
  • SH-Sr6A to convert sucrose, D-glucose and D-fructose (from fruit juices) into D-psicose. 16 - 19% D-psicose (based on the total carbohydrate content) could be enriched in the juices.
  • Patel et al. (2018) used a Smt3-DPE (fusion protein) immobilized on magnetic iron oxide nanoparticles to produce D-psicose from D-fructose in fruit pomace washing solutions.
  • the immobilized epimerase was able to convert 20% of the D-fructose and was separated with a magnet after completion of the reaction.
  • the D-fructose/D-psicose mixtures resulting from the epimerization of D-fructose can be separated either by chromatographic methods or by the "biological method” (fermentation of the excess D-fructose to e.g. ethanol) (Jiang et al., 2020).
  • US 2021/0189441 Al describes the separation of a D-fructose/D-psicose mixture, whereby the D-fructose is converted into L-lactic acid by a probiotic microorganism (Lactobacillus or Saccharomyces).
  • EP 3423460 Bl describes a process for purifying a D-fructose/D-psicose mixture and for obtaining highly pure D-psicose.
  • EP 3553069 Al and Van Duc Long et al. (2009) describe a method for separating D-psicose and D-fructose based on SMB chromatography open.
  • D-psicose via the epimerase route has the following disadvantages: 1) position of the equilibrium on the side of D-fructose, 2) addition of (partly toxic) metal ions as cofactors for many epimerases, 3) low activity and long-term stability of the epimerases and 4) complex separation of the product mixture.
  • thermodynamically unfavorable epimerization is to use enzyme cascades with phosphorylated intermediates.
  • the last step, dephosphorylation, is irreversible and thus drives the cascade (Li et al., 2021b).
  • a cascade described in almost identical form by Li et al. (2021b) as well as in US 11168342 B2 and US 10907182 B2 has D-glucose-l-phosphate (G1P) as the central intermediate.
  • G1P is first converted to D-glucose-6-phosphate (G6P) by phosphoglucomutase and then further to D-frucose-6-phosphate (F6P) by glucose-6-phosphate isomerase.
  • F6P is then epimerized to D-psicose-6-phosphate by D-allulose-6-phosphate epimerase, which is then dephosphorylated to D-psicose by D-allulose-6-phosphate phosphatase.
  • G1P can be produced directly by the action of phosphorylases on maltose and amylodextrins (obtained by the hydrolysis of starch), cellodextrins (obtained by the hydrolysis of cellulose) or sucrose using phosphate. Since the terminal sugar monomers of the oligo- and polysaccharides cannot be phosphorylated by the corresponding phosphorylases, the polyphosphate glucokinase (D-glucose G6P) or polyphosphate fructokinase (D-fructose F6P), whereby additional polyphosphates must be added as a phosphate source to increase the yields (US 11168342 B2; US 10907182 B2). Starch serves as the substrate for the cascade of Li et al. (2021b), which is converted to D-psicose with yields of 79% (at 50 g/l substrate concentration; reaction time 24 h).
  • WO 2016/201110 Al describes a method for producing D-psicose from dihydroxyacetone and D-glyceraldehyde using fructose-6-phosphate aldolase and DTE (intermediate D-fructose).
  • Xiao et al. coupled the epimerization of D-fructose with the conversion of D-psicose to D-psicose-l-phosphate using L-rhamnulose kinase (using adenosine triphosphate (ATP)) to shift the equilibrium of epimerization. Subsequent cleavage of the phosphate group by an acid phosphatase yields D-psicose (99% conversion of 20 mM D-fructose). However, ATP must be regenerated with a polyphosphate kinase with the addition of polyphosphate (Xiao et al., 2019).
  • a major disadvantage of routes with phosphorylated intermediates is the use of expensive, energy-rich phosphate compounds such as polyphosphate or ATP in stoichiometric amounts to introduce the phosphate groups.
  • energy-rich phosphate compounds such as polyphosphate or ATP in stoichiometric amounts to introduce the phosphate groups.
  • phosphorylases By using phosphorylases, this problem can be overcome. can be partially bypassed, but terminal monosaccharides cannot be phosphorylated without the aid of high-energy phosphate compounds.
  • the remaining phosphate compounds and phosphate ions must be removed after the reaction has ended.
  • the unfavorable equilibrium of the epimerization of D-fructose to D-psicose can also be favorably influenced by downstream redox reactions.
  • DTE ribitol dehydrogenase
  • FDH formate dehydrogenase
  • D-fructose can be converted in vitro to the sugar alcohol allitol (Takeshita et al., 2000).
  • Allitol can then be converted back to D-psicose through an oxidation step.
  • This can be achieved microbially, for example, with Enterobacter aerogenes IK7 (complete oxidation of 100 g/l allitol in 24 h) or Bacillus pallidus Y25 (48% conversion of 50 g/l allitol in 48 h) (Gullapalli et al., 2007; Poonperm et al., 2007).
  • the achiral sugar alcohol allitol forms an interface between the D- and L-hexoses in the so-called Izumoring strategy for the bioproduction of rare sugars (Izumori, 2006; Hassanin et al., 2017). Thus, it can also serve as a precursor for the production of other rare monosaccharides.
  • the interior of the cells provides a suitable microenvironment for the enzymes and also allows cofactor regeneration (NAD(P) + /NAD(P)H),
  • a working group led by Wang et al. (2022, 2023) is also working on the enzymatic biotransformation of sugars, investigating the biotransformations in vitro and in vivo.
  • the aim is to develop an economical production method that can be carried out on an industrial scale.
  • the object is achieved according to the invention by forming a first D-psicose from D-fructose, which is dissolved in an aqueous solution, by treating it with an epimerase in vitro, after which the first D-psicose is reduced to allitol by treating it with a corresponding NAD(P)H-dependent oxidoreductase in vitro and, after deactivation and/or ultrafiltration of the epimerase, is treated with a corresponding NAD(P) + -dependent oxidoreductase to form D-psicose, after which the deactivated epimerase and the oxidoreductases are removed.
  • it is also possible to immobilize it on or in a carrier material and to filter it out of the aqueous solution together with the carrier.
  • the process according to the invention is therefore not carried out by fermentation, but the enzymes are contained as such in the aqueous solution. According to the invention, the process is therefore carried out in vitro.
  • NAD(P) + -dependent oxidoreductase for the formation of D-psicose from allitol comprises an amino acid sequence which is selected from the group consisting of: i) an amino acid sequence which has an identity to SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10 or SEQ ID No. 12 of at least 80%, ii) an amino acid sequence which is encoded by a nucleic acid which has an identity to SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9 or SEQ ID No.
  • nucleic acid 11 of at least 80%, and iii) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid which binds under stringent conditions to a nucleic acid molecule having the nucleic acid sequence SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9 or SEQ ID No. 11, or a functional fragment thereof.
  • a "functional fragment" of this NAD(P) + -dependent oxidoreductase comprises an N-terminally and/or C-terminally truncated variant of the oxidoreductase having the amino acid sequence SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10 or SEQ ID No. 12, which has at least 50%, preferably at least 60%, even more preferably at least 70%, even more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, enzyme activity compared to the non-truncated oxidoreductase.
  • a preferred variant of the process according to the invention consists in that the oxidized cofactor NAD(P) + formed by the reduction of D-psicose to allitol is reduced by means of an alcohol dehydrogenase (ADH) and a secondary alcohol to form a ketone, wherein the secondary alcohol is preferably D-glucose or 2-propanol (isopropanol).
  • ADH alcohol dehydrogenase
  • 2-Propanol is a very cheap hydrogen donor for the regeneration of NAD(P)H and the oxidation product acetone is easily separated due to its volatility (Xu et al., 2021).
  • Acetone recovered from the exhaust gas stream can be hydrogenated back to 2-propanol using heterogeneous catalysis (Al-Rabiah et al., 2022), either in the gas phase or in solution, present as 2-propanol/acetone/water mixtures or as acetone/water mixtures, whereby hydrogen from sustainable sources (“green hydrogen”) could be increasingly used in the future.
  • heterogeneous catalysis Al-Rabiah et al., 2022
  • the oxidized cofactor NAD(P) + formed by the reduction is reduced by means of a glucose dehydrogenase and D-glucose to form D-gluconate.
  • a glucose dehydrogenase to regenerate NAD(P)H is particularly advantageous because in the course of the reduction of NAD(P) + D-gluconate is formed from D-glucose, which can be obtained from the reaction mixture and used in a wide variety of areas (e.g. in metal pickling agents, in medicines and as a stabilizer in foodstuffs, etc.).
  • glucose dehydrogenase makes it possible to use a mixture comprising D-fructose and D-glucose as a substrate for the production of allitol or D-psicose without additional D-glucose being added to the reaction mixture and without D-glucose being isomerized to D-fructose beforehand.
  • Mixtures of D-fructose and D-glucose can be produced, for example, by hydrolysis of sucrose.
  • a glucose dehydrogenase derived from Priestia megaterium and comprising an amino acid sequence available under the NCBI accession number MDQ0804260.1 is particularly preferred.
  • a further preferred variant of the process according to the invention comprises the use of a formate dehydrogenase (FDH) to regenerate the oxidized cofactor NAD(P) + produced by the reduction by means of a formate dehydrogenase and formate (eg sodium formate) with the formation of CO2.
  • FDH formate dehydrogenase
  • a further preferred variant of the process according to the invention is characterized in that it is carried out as a one-pot reaction without isolation of intermediate products.
  • the enzymes are preferably used as a lysate of the corresponding cells that produce them.
  • the enzymes are expressed individually in suitable E. co// production strains. This allows the enzyme ratios to be optimized and this is thus independent of the expression level in the overall construct compared to Wang et al. (2023).
  • the enzymes (epimerase and reductase and/or dehydrogenase) of the first step (D-fructose allitol) are deactivated by heat and/or removed by ultrafiltration to prevent the formation of byproducts by the enzymes. Without the appropriate treatment, much of the D-psicose produced by the oxidation would be converted back to D-fructose by the epimerase.
  • NAD nicotinamide-based cofactors
  • the particularly preferred concentration of D-fructose is 50 - 250 g/l.
  • the particularly preferred temperature range for the first step is between 25 and 45 °C, and for the second step (oxidation) between 20 and 30 °C.
  • the preferred pH range for both steps is between 7 and 8.5.
  • the enzymes are present in a suspension and/or in the homogenate and/or in the lysate of the corresponding cells that produce them, with lysates being particularly preferred.
  • suspension means a suspension of resting cells. These are harvested after cultivation (separated from the nutrient medium) and used as a paste or suspended in a suitable buffer system. In contrast to fermentative processes, which also work with whole cells, the resting cells can no longer grow due to the lack of carbon sources and nutrients, but only serve to convert substrates (Lin & Tao, 2017).
  • Homogenate in this context means a physically and/or chemically treated suspension (e.g. treated by pressure, lysozyme or ultrasound), whereby the cell components are released from the cells. A lysate is obtained when the insoluble cell components of the homogenate are removed, for example by filtration or centrifugation (see Production of enzymes & Preparation of lysates for details).
  • the enzymes can also be modified at the N-terminus with a water-soluble polymer such as polyethylene glycol, immobilized in or on a solid matrix, or be part of a fusion protein.
  • a water-soluble polymer such as polyethylene glycol
  • the enzymes can be in powder form, in lyophilized or spray-dried form.
  • D-psicose is particularly preferably present in an aqueous solution, from which solid D-psicose can be obtained, for example, by spray drying (US 2019/0315790 Al; Kawakami et al., 2013; Kawakami et al., 2014).
  • the D-psicose is present in a syrup, the syrup being prepared by concentrating the filtrate described above or by dissolving crystalline D-psicose, which can be prepared by the process according to the invention, in water.
  • the syrup according to the invention preferably has a total solids content of about 50% by weight to about 90% by weight.
  • the D-psicose content in the syrup according to the invention is about 80% by weight to about 99% by weight based on the dry substance.
  • a further aspect of the present invention relates to a syrup comprising D-psicose, which can be prepared by the process according to the invention.
  • a syrup comprising D-psicose, which can be prepared by the process according to the invention.
  • only enzymes from the enzyme groups epimerases and oxidoreductases are used for the conversion of the starting material, with one or more of these enzymes being selected from each of these groups.
  • the epimerase used in the process can originate from one of the groups EC 5.1.3.30 (D-psicose-3-epimerase) or EC 5.1.3.31 (D-tagatose-3-epimerase/L-ribulose-3-epimerase), the former being particularly preferred.
  • the enzymes used for the reduction of D-psicose and the oxidation of allitol belong to the group of oxidoreductases (see Table 1 for details).
  • the alcohol dehydrogenase (ADH) used for cofactor regeneration can come from one of the groups EC 1.1.1.1 (NAD-dependent ADH) and EC 1.1.1.2 (NADP-dependent ADH).
  • the NAD(P)-dependent alcohol dehydrogenase for cofactor regeneration preferably comprises or consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of: i) an amino acid sequence having an identity to SEQ ID No. 18 of at least 80%, ii) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid having an identity to SEQ ID No. 17 of at least 80%, and iii) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid that binds under stringent conditions to a nucleic acid molecule having the nucleic acid sequence SEQ ID No. 17.
  • Particularly suitable for cofactor regeneration in general is an alcohol dehydrogenase whose amino acid sequence is at least 80% identical to SEQ ID No. 18 or which is encoded by a nucleic acid which has an identity to SEQ ID No. 17 of at least 80% or binds under stringent conditions to a nucleic acid molecule with the nucleic acid sequence SEQ ID No. 17, or a functional fragment of this alcohol dehydrogenase.
  • a "functional fragment" of the alcohol dehydrogenase comprises an N-terminally and/or C-terminally truncated variant of the alcohol dehydrogenase with the amino acid sequence SEQ ID No.
  • the alcohol dehydrogenase for cofactor regeneration mentioned here preferably comprises an amino acid sequence which has an identity to SEQ ID No. 18 of at least 80%, even more preferably 85%, even more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 98%, even more preferably 99%, in particular 100%.
  • the alcohol dehydrogenase according to the invention for cofactor regeneration particularly preferably comprises the amino acid sequence SEQ ID No. 18 or consists of this.
  • the alcohol dehydrogenase for cofactor regeneration preferably comprises an amino acid sequence which is encoded by a nucleic acid which has an identity to SEQ ID No. 17 of at least 80%, even more preferably 85%, even more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 98%, even more preferably 99%, in particular 100%.
  • the nucleic acid which comprises the inventive Alcohol dehydrogenase for cofactor regeneration encodes or consists of the nucleic acid sequence SEQ ID No. 17.
  • a further aspect of the present invention relates to the use of an alcohol dehydrogenase for cofactor regeneration, wherein the alcohol dehydrogenase comprises or consists of an amino acid sequence which is selected from the group consisting of: i) an amino acid sequence which has an identity to SEQ ID No. 18 of at least 80%, ii) an amino acid sequence which is encoded by a nucleic acid which has an identity to SEQ ID No. 17 of at least 80%, and iii) an amino acid sequence which is encoded by a nucleic acid which binds under stringent conditions to a nucleic acid molecule having the nucleic acid sequence SEQ ID No. 17, or a functional fragment thereof.
  • the alcohol dehydrogenases disclosed here can be used for the regeneration of NAD(P) + or NAD(P)H, ie for the reduction of NAD(P) + or for the oxidation of NAD(P)H, in a wide variety of enzymatic reactions.
  • the use of the alcohol dehydrogenases according to the invention is particularly preferred in the cofactor regeneration of NAD(P) + , which is formed during the reduction of D-psicose to allitol by means of an NAD(P)H-dependent oxidoreductase.
  • the cofactor NAD(P) + which is formed during the reduction of D-psicose to allitol, is reduced to NAD(P)H by means of formate and a formate dehydrogenase with the formation of CO2 (cofactor regeneration).
  • a formate dehydrogenase which comprises or consists of the amino acid sequence SEQ ID No. 2, or a functional fragment of this formate dehydrogenase.
  • the formate dehydrogenase preferably used is preferably encoded by the nucleic acid sequence SEQ ID No. 1.
  • a "functional fragment" of the formate dehydrogenase comprises an N-terminally and/or C-terminally truncated variant of the formate dehydrogenase with the amino acid sequence SEQ ID No.
  • the formate dehydrogenase used for cofactor regeneration comprises an amino acid sequence which is selected from the group consisting of: i) an amino acid sequence which has an identity to SEQ ID No. 2 of at least 80%, ii) an amino acid sequence which is encoded by a nucleic acid which has an identity to SEQ ID No. 1 of at least 80%, and (iii) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid which binds under stringent conditions to a nucleic acid molecule having the nucleic acid sequence SEQ ID No. 1, or a functional fragment thereof.
  • the formate dehydrogenase preferably comprises an amino acid sequence which has an identity to SEQ ID No. 2 of at least 80%, more preferably 85%, more preferably 90%, more preferably 95%, more preferably 98%, more preferably 99%, in particular 100%.
  • the formate dehydrogenase preferably comprises an amino acid sequence encoded by a nucleic acid having an identity to SEQ ID No. 1 of at least 80%, more preferably 85%, more preferably 90%, more preferably 95%, more preferably 98%, more preferably 99%, in particular 100%.
  • a further aspect of the present invention relates to the use of a formate dehydrogenase for cofactor regeneration or a functional fragment thereof, wherein the formate dehydrogenase comprises or consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of: i) an amino acid sequence having an identity to SEQ ID No. 2 of at least 80%, ii) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid having an identity to SEQ ID No. 1 of at least 80%, and iii) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid that binds under stringent conditions to a nucleic acid molecule having the nucleic acid sequence SEQ ID No. 1.
  • the glucose dehydrogenase (GDH) used for cofactor regeneration can come from one of the groups EC 1.1.1.47 (glucose-l-dehydrogenase), EC 1.1.1.118 (glucose-l-dehydrogenase (NAD + )), EC 1.1.1.119 (glucose-l-dehydrogenase (NADP + )) or EC 1.1.1.360 (glucose/galactose-l-dehydrogenase).
  • the NAD(P)-dependent glucose dehydrogenase for cofactor regeneration preferably comprises or consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of: i) an amino acid sequence having an identity to SEQ ID No. 20 of at least 80%, ii) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid having at least 80% identity to SEQ ID NO: 19, and iii) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid that binds under stringent conditions to a nucleic acid molecule having the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 19.
  • glucose dehydrogenase whose amino acid sequence is at least 80% identical to SEQ ID No. 20 or which is encoded by a nucleic acid which has an identity to SEQ ID No. 19 of at least 80% or binds under stringent conditions to a nucleic acid molecule with the nucleic acid sequence SEQ ID No. 19, or a functional fragment of this glucose dehydrogenase.
  • a "functional fragment" of the glucose dehydrogenase comprises an N-terminal and/or C-terminal truncated variant of the glucose dehydrogenase with the amino acid sequence SEQ ID No.
  • the glucose dehydrogenase for cofactor regeneration mentioned here preferably comprises an amino acid sequence which has an identity to SEQ ID No. 20 of at least 80%, even more preferably 85%, even more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 98%, even more preferably 99%, in particular 100%.
  • the glucose dehydrogenase according to the invention for cofactor regeneration particularly preferably comprises the amino acid sequence SEQ ID No. 20 or consists of this.
  • the glucose dehydrogenase for cofactor regeneration preferably comprises an amino acid sequence which is encoded by a nucleic acid which has an identity to SEQ ID No. 19 of at least 80%, even more preferably 85%, even more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 98%, even more preferably 99%, in particular 100%.
  • the nucleic acid which encodes the glucose dehydrogenase for cofactor regeneration according to the invention comprises or consists of the nucleic acid sequence SEQ ID No. 19.
  • a further aspect of the present invention relates to the use of a glucose dehydrogenase for cofactor regeneration, wherein the glucose dehydrogenase comprises or consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of: i) an amino acid sequence having an identity to SEQ ID No. 20 of at least 80%, ii) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid having an identity to SEQ ID No. 19 of at least 80%, and iii) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid that binds under stringent conditions to a nucleic acid molecule having the nucleic acid sequence SEQ ID No. 19, or a functional fragment thereof.
  • the NAD(P)H oxidase used for cofactor regeneration can originate from one of the groups EC 1.6.3.1 (NAD(P)H oxidase (H 2 O 2 -forming)), EC 1.6.3.2 (NAD(P)H oxidase (H 2 O-forming)), EC 1.6.3.3 (NADH oxidase (H 2 O 2 -forming)) and EC 1.6.3.4 (NADH oxidase (H 2 O-forming)), with the H 2 O-forming classes being particularly preferred.
  • a particularly preferred H 2 O-forming NAD(P)H oxidase preferably comprises or consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of: i) an amino acid sequence having at least 80% identity to SEQ ID No. 14 or SEQ ID No. 16, ii) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid having at least 80% identity to SEQ ID No. 13 or SEQ ID No. 15, and iii) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid which binds under stringent conditions to a nucleic acid molecule having the nucleic acid sequence SEQ ID No. 13 or SEQ ID No. 15, or a functional fragment thereof.
  • a "functional fragment" of this NAD(P)H oxidase comprises an N-terminally and/or C-terminally truncated variant of the NAD(P)H oxidase having the amino acid sequence SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10 or SEQ ID No. 12, which has at least 50%, preferably at least 60%, even more preferably at least 70%, even more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, enzyme activity compared to the non-truncated NAD(P)H oxidase.
  • the preferably used F O-forming NAD(P)H oxidase preferably comprises or consists of an amino acid sequence which has an identity to SEQ ID No. 16 or SEQ ID No. 14 of at least 80%, even more preferably 85%, even more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 98%, even more preferably 99%, in particular 100%.
  • the F O-forming NAD(P)H oxidase particularly preferably comprises or consists of the amino acid sequence SEQ ID No. 16 or SEQ ID No. 14.
  • the F O-forming NAD(P)H oxidase preferably comprises an amino acid sequence encoded by a nucleic acid having an identity to SEQ ID No. 15 or SEQ ID No. 13 of at least 80%, more preferably 85%, more preferably 90%, more preferably 95%, more preferably 98%, more preferably 99%, in particular 100%.
  • the nucleic acid encoding the F O-forming NAD(P)H oxidase comprises or consists of the nucleic acid sequence SEQ ID No. 15 or SEQ ID No. 13.
  • a further aspect of the present invention relates to the use of a F O-forming NAD(P)H oxidase for cofactor regeneration (NAD(P)H to NAD(P) + ), which comprises or consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of: i) an amino acid sequence having an identity to SEQ ID No. 16 or SEQ ID No. 14 of at least 80%, ii) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid having an identity to SEQ ID No. 15 or SEQ ID No. 13 of at least 80%, and iii) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid that binds under stringent conditions to a nucleic acid molecule having the nucleic acid sequence SEQ ID No. 15 or SEQ ID No. 13, or a functional fragment thereof.
  • the enzymatic strategy presented here in combination with cofactor regeneration enables a biocatalytic, environmentally friendly and highly efficient production process for the production of D-psicose.
  • the NAD(P)H-dependent oxidoreductase for reducing the first D-psicose to allitol preferably comprises or consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of: i) an amino acid sequence having an identity to SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 10 or SEQ ID No. 12 of at least 80%, ii) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid having an identity to SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 9 or SEQ ID No.
  • nucleic acid 11 of at least 80%, and iii) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid that binds under stringent conditions to a nucleic acid molecule having the nucleic acid sequence SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 9 or SEQ ID No. 11.
  • Particularly suitable for reducing the first D-psicose to allitol or D-psicose to allitol in general is an oxidoreductase whose amino acid sequence is at least 80% identical to SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 10 or SEQ ID No. 12 or which is encoded by a nucleic acid which has an identity to SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 9 or SEQ ID No. 11 of at least 80% or which binds under stringent conditions to a nucleic acid molecule with the nucleic acid sequence SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 9 or SEQ ID No. 11.
  • This oxidoreductase can also, surprisingly, be used to oxidize allitol to D-psicose.
  • the NAD(P) + -dependent oxidoreductase for the formation of D-psicose from allitol preferably comprises or consists of an amino acid sequence which is selected from the group consisting of: i) an amino acid sequence which has an identity to SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10 or SEQ ID No. 12 of at least 80%, ii) an amino acid sequence which is encoded by a nucleic acid which has an identity to SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9 or SEQ ID No.
  • the oxidoreductases mentioned here for the reduction of D-psicose to allitol and/or for the oxidation of allitol to D-psicose preferably comprise an amino acid sequence which has an identity to SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10 or SEQ ID No. 12 of at least 80%, even more preferably of 85%, even more preferably of 90%, even more preferably of 95%, even more preferably of 98%, even more preferably of 99%, in particular of 100%.
  • the oxidoreductase according to the invention for the reduction of D-psicose to allitol and/or for the oxidation of allitol to D-psicose comprises the amino acid sequence SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 10 or SEQ. ID No. 12 or consists of this
  • the oxidoreductase for the oxidation of allitol to D-psicose comprises one of the amino acid sequences SEQ ID No. 6 or SEQ ID No. 8 or consists of this.
  • the oxidoreductases for reducing D-psicose to allitol and/or for oxidizing allitol to D-psicose preferably comprise an amino acid sequence encoded by a nucleic acid having an identity to SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9 or SEQ ID No. 11 of at least 80%, more preferably 85%, more preferably 90%, more preferably 95%, more preferably 98%, more preferably 99%, in particular 100%.
  • the nucleic acid which encodes the oxidoreductase according to the invention for the reduction of D-psicose to allitol and/or for the oxidation of allitol to D-psicose comprises or consists of the nucleic acid sequence SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 9 or SEQ ID No. 11, and which encodes the oxidoreductase for the oxidation of allitol to D-psicose comprises or consists of the nucleic acid sequence SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 7.
  • identity refers to the percentage of identical nucleotide or amino acid matches between at least two nucleotide or amino acid sequences aligned using a standardized algorithm. Such an algorithm can, in a standardized and reproducible manner, insert gaps in the compared sequences to optimize the alignment between two sequences, thus achieving a more meaningful comparison of the two sequences.
  • Percent identity between sequences can be determined using one or more computer algorithms or programs known in the art or described herein.
  • the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., 1990) provided by the National Center for Biotechnology Information (NCBI) is used to determine identity.
  • the BLAST suite of software includes several programs, including a tool called "BLAST 2 Sequences” which is used for direct pairwise comparison of two nucleotide or amino acid sequences. "BLAST 2 Sequences” can also be accessed and used interactively on the Internet via the NCBI World Wide Web site.
  • the oxidoreductases for reducing D-psicose to allitol and/or for oxidizing allitol to D-psicose preferably comprise an amino acid sequence encoded by a nucleic acid that binds under stringent conditions to a nucleic acid molecule having the nucleic acid sequence SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 or SEQ ID NO:11.
  • stringent conditions refer to conditions under which so-called specific hybrids, but not non-specific hybrids, are formed.
  • stringent conditions comprise hybridization in 6xSSC (sodium chloride/sodium citrate) at 45°C and then washing with 0.2 to 1xSSC, 0.1% SDS at 50 to 65°C; or such conditions may include hybridization in 1xSSC at 65 to 70°C and then washing with 0.3xSSC at 65 to 70°C.
  • Hybridization may be carried out by conventionally known methods such as those described by J. Sambrook et al. in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989).
  • One aspect of the present invention relates to the use of an oxidoreductase for reducing D-psicose to allitol and/or for oxidizing allitol to D-psicose, wherein the oxidoreductase comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of: i) an amino acid sequence having an identity to SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 10 or SEQ ID No. 12 of at least 80%, ii) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid having an identity to SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 9 or SEQ ID No.
  • nucleic acid 11 of at least 80%, and iii) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid that binds under stringent conditions to a nucleic acid molecule having the nucleic acid sequence SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 9 or SEQ ID No. 11.
  • a further aspect of the present invention relates to the use of an oxidoreductase for the oxidation of allitol to D-psicose, wherein the oxidoreductase comprises an amino acid sequence which is selected from the group consisting of: i) an amino acid sequence which has an identity to SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10 or SEQ ID No. 12 of at least 80%, ii) an amino acid sequence which is encoded by a nucleic acid which has an identity to SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9 or SEQ ID No.
  • nucleic acid 11 of at least 80%, and (iii) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid that binds under stringent conditions to a nucleic acid molecule having the nucleic acid sequence SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9 or SEQ ID No. 11.
  • the oxidoreductases according to the invention require appropriate cofactors, as mentioned above.
  • D-Psicose was purchased from TCI and Hunan Garden Naturals Inc. (China), allitol was from TCI, D-fructose, NADPH tetrasodium salt, and methanol were from PanReac AppliChem (ITW Reagents), D-glucose, sodium gluconate, IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside) were from Sigma-Aldrich, potassium dihydrogen phosphate, di-potassium hydrogen phosphate, NAD + , NADH disodium salt, NADP + - disodium salt, and sodium dodecyl sulfate (SDS) were from Carl Roth, and triethanolamine (TEA) was from Chem-Lab NV.
  • the gene to be expressed was first amplified in a PCR using the genomic DNA or its synthetic equivalent adapted to the codon usage of E. coli as a template together with specific oligonucleotides that additionally carry recognition sequences for restriction endonucleases and isolated from the reaction mixture. After nucleic acid digestion with the restriction enzymes Sphl and Hindlll, the gene fragment coding for the target enzyme was ligated into the backbone of the expression vector pQE70-Kan cut with Sphl and Hindlll. The ligation product was transformed into chemically competent E. coli cells ToplOF and the resulting colonies were used for plasmid isolation and restriction analysis.
  • the result of the cloning step was verified by restriction enzyme digestion and DNA sequencing.
  • the resulting construct carries the target gene under the IPTG-inducible T5 promoter.
  • the resulting expression plasmid was transformed into the competent expression cells RB791. After 24 h of incubation at 37 °C, the resulting colonies were inoculated into LB medium for expression tests.
  • the cell pellet prepared according to the above procedure was weighed into a suitable container and mixed with buffer and lysozyme (final concentration 0.5 mg/ml) (e.g. triethanolamine (TEA) - HCl) and dissolved with stirring.
  • buffer and lysozyme final concentration 0.5 mg/ml
  • the mass fraction of biomass is usually 20%, the rest is made up of the buffer.
  • the resulting homogenate was centrifuged for 10 min at 4 °C and 16000 rpm (Eppendorf Centrifuge 5417R) to separate the insoluble cell fragments and obtain the lysate.
  • a Dionex ICS6000 system with AS-AP autosampler was used to quantify D-gluconic acid/D-gluconate using HPAEC (High Performance Anion Exchange Chromatography). The measurement was carried out using conductivity detection (CD) coupled to a Dionex AERS 500 electrolytically regenerated suppressor in external water mode.
  • CD conductivity detection
  • a Dionex lonPac ASll-HC-4pm column with a corresponding pre-column and a NaOH gradient was used to separate the analytes.
  • the mobile phase was also pretreated with a Dionex ATC Anion Trap Column.
  • Enzyme activities in the lysates were determined using a Shimadzu UV-1900 spectrophotometer. The formation or consumption of NAD(P)H was monitored at a wavelength of 340 nm via the change in absorption. The measurements were carried out with 0.2 mM cofactor (NAD(P) + or NAD(P)H). For this purpose, 20 ⁇ l of a 10 mM stock solution of the cofactor was placed in a cuvette (Greiner bio-one semi-micro cuvette made of polystyrene) and the desired pH value was adjusted with 100 mM TEA-HCl buffer (870 ⁇ l).
  • the reaction was carried out in a Labfors 5 table bioreactor (Infors AG). A glass reactor (volume 3.4 l) with a stirrer and pH electrode was used as the vessel. The pH was controlled by adding 1M NaOH or 1M H2SO4.
  • samples were continuously taken from the reactor solution and analyzed as follows: 100 ⁇ l of the reactor solution were mixed with 200 ⁇ l of methanol and incubated in the Eppendorf Thermomixer at 60 °C and 1200 rpm for 15 min. The sample was briefly centrifuged centrifuged, mixed with 700 pl deionized water, vortexed and then centrifuged for 5 min at max. g. 200 pl of the supernatant were transferred to an HPLC vial with insert and measured by HPLC (RI detection).
  • the entire reactor contents were then heated to 70 °C for 60 min (deactivation of D-psicose-3-epimerase) and after cooling to 24 °C, 25 ml of xylitol dehydrogenase lysate, 10 kU NADH oxidase lysate and 10 ml of a 10 mM NAD + solution were added.
  • the filtrate was concentrated to a syrup with a D-psicose concentration of 520 g/l using a rotary evaporator, whereby any remaining acetone and 2-propanol were also separated.
  • Example 1 shows that the epimerase can be denatured by heat (in a one-pot process) and that the resulting precipitate does not interfere with the further reaction.
  • the reaction was carried out in a Multifors table bioreactor (Infors AG).
  • a glass reactor (volume 1 1) with a stirrer and pH electrode was used as the vessel.
  • the pH was controlled by adding SM NaOH or IM H2SO4. Initially, 17.5 g D-fructose and 17.5 g D-glucose (final concentration 50 g/l each), 217.8 ml deionized water and 26.5 ml of a 500 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) were placed in the reactor and brought to 35 °C while stirring.
  • samples were continuously taken from the reactor solution and analyzed as follows: 100 ⁇ l of the reactor solution were mixed with 200 ⁇ l of methanol and incubated in the Eppendorf Thermomixer at 60 °C and 1200 rpm for 15 min. The sample was briefly centrifuged in a centrifuge, mixed with 700 ⁇ l of deionized water, vortexed and then centrifuged for 5 min at max. g. 200 ⁇ l of the supernatant were transferred to an HPLC vial with insert and measured using HPLC (RI detection). For the HPAEC measurements (conductivity detection), the clear supernatant was diluted 1:250.
  • the entire reactor content was then heated to 70 °C for 60 min (deactivation of D-psicose-3-epimerase) and after cooling to 30 °C, 17.5 ml of xylitol dehydrogenase lysate, 7 kU NADH oxidase lysate and 3.5 ml of a 10 mM NAD + solution were added.
  • the reactor contents were heated to 70 °C, the pH was adjusted to 4 and stirred for 30 min at 70 °C.
  • the enzymes were filtered off through a glass frit (P3).
  • the reaction was carried out in a Multifors table bioreactor (Infors AG).
  • a glass reactor (volume 1 1) with a stirrer and pH electrode was used as the vessel.
  • the pH was controlled by adding 5M NaOH or 6M H2SO4. Initially, 70 ml of a D-fructose solution (500 g/l), 26.3 ml of deionized water and 43.8 ml of 8 M sodium formate were placed in the reactor and brought to 37 °C while stirring.
  • samples were continuously taken from the reactor solution and analyzed as follows: 100 ⁇ l of the reactor solution were mixed with 200 ⁇ l of methanol and incubated in the Eppendorf Thermomixer at 60 °C and 1200 rpm for 15 min. The sample was briefly centrifuged in a centrifuge, mixed with 700 ⁇ l of deionized water, vortexed and then centrifuged for 5 min at max. g. 200 ⁇ l of the supernatant was transferred to an HPLC vial with insert and measured using HPLC (RI detection).
  • the entire reactor content was then heated to 70 °C for 60 min (deactivation of D-psicose-3-epimerase) and after cooling to 24 °C, 25 ml of xylitol dehydrogenase lysate, 10 kll of NADH oxidase lysate and 10 ml of a 10 mM NAD + solution were added.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer wässerigen Lösung enthaltend D-Psicose, indem aus D-Fructose, welche in einer wässerigen Lösung gelöst vorliegt, durch Behandeln mit einer Epimerase in vitro eine erste D-Psicose gebildet wird, wonach die erste D-Psicose durch Behandeln mit einer entsprechenden NAD(P)H-abhängigen Oxidoreduktase in vitro zu Allitol reduziert und nach Deaktivierung und/oder Ultrafiltration der Epimerase zur Bildung von D-Psicose mit einer entsprechenden NAD(P)+-abhängigen Oxidoreduktase behandelt wird, wonach die deaktivierte Epimerase und die Oxidoreduktasen entfernt werden.

Description

Verfahren zur Herstellung einer wässerigen Lösung enthaltend D-Psicose
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer wässerigen Lösung enthaltend D-Psicose.
Hintergrund der Erfindung
D-Psicose
Das Monosaccharid D-Psicose, auch bekannt als D-Allulose, ist eine in der Natur selten vorkommende Ketohexose (Zhang et al., 2016). Sie konnte unter anderem in den Blättern von Rosmarinweiden (Itea sp.) nachgewiesen werden (Hough & Stacey, 1966), findet sich aber auch in verarbeiteten Lebensmitteln wie Konfekt und Gewürzsaucen, wo sie unter Einwirkung von Hitze aus D-Fructose, ihrem Ca-Epimer, entsteht (Oshima et al., 2006).
D-Psicose ist aufgrund ihres süßen Geschmacks für die Lebensmittelindustrie interessant. Im Vergleich zur Saccharose weist D-Psicose eine relative Süßkraft von 70% auf, besitzt aber einen niedrigen Energiegehalt (0,2 kcal/g), was einer Kalorien-Reduktion von etwa 95% (bezogen auf Saccharose) gleichkommt (Jiang et al., 2020).
In den USA ist D-Psicose von der US-amerikanischen Lebensmittelaufsicht Food and Drug Administration (FDA) als Generally Recognized as Safe (GRAS)-Süßungsmittel anerkannt, in der EU jedoch noch nicht zugelassen (Ahmed et al., 2022).
Darüber hinaus hat D-Psicose auch positive Effekte auf den Lipid-Stoffwechsel sowie den Kohlenhydrat- Stoffwechsel (z.B. antidiabetisch) und wirkt entzündungshemmend und antioxidativ (Zhang et al., 2016; Jiang et al., 2020; Chen et al., 2022).
Aufgrund des geringen natürlichen Vorkommens wird D-Psicose weitgehend synthetisch (chemisch oder biotechnologisch) hergestellt.
Die Epimerisierung von D-Fructose zu D-Psicose kann durch Kochen in Pyridin unter Rückfluss mit anschließender Entfernung der anderen Hexosen durch Hefe-Fermentation durchgeführt werden, wobei allerdings nur 6,8 % der theoretischen Ausbeute an D-Psicose erreicht werden (Doner, 1979). Eine andere Methode beinhaltet die Epimerisierung von D-Fructose mit Molybdat-Ionen als Katalysator, wobei nur 0,5% der D-Fructose zu D-Psicose umgesetzt werden (Bilik & Tihlärik, 1974).
Die ineffizienten chemischen Syntheserouten wurden mittlerweile durch effizientere biotechnologische Verfahren ersetzt. Izumori et al. beschrieben 1993 eine Ketose-3-Epimerase aus Pseudomonas cichorii ST-24 zur Herstellung von D-Psicose aus D-Fructose (Izumori et al., 1993), welche auch patentiert wurde (EP 0592202 Bl). Ketose-3-Epimerasen lassen sich je nach Substratspezifität in drei Gruppen einteilen: 1) D-Tagatose-3-Epimerase (DTE), 2) D-Psicose-3-Epimerase (DPE) oder D-Allulose-3-Epimerase (DAE) und 3) L-Ribulose-3-Epimerase (LRE) (Zhang et al., 2016; Jiang et al., 2020).
Die Umsetzung von D-Fructose zu D-Psicose mittels Ketose-3-Epimerasen läuft jedoch nicht vollständig ab, vielmehr bildet sich ein Gleichgewichtsverhältnis zwischen beiden Epimeren aus. Je nach Reaktionsbedingungen (Temperatur zwischen 40 und 70 °C, pH-Wert zwischen 6 und 11) liegt dieses zwischen 80:20 und 62,5:37,5 (D-Fructose : D-Psicose). Viele der Epimerasen benötigen außerdem ein zweiwertiges Metailion wie Mn2+ oder Co2+ (toxisch) als Kofaktor (Zhang et al., 2016; Jiang et al., 2020).
Das Gleichgewicht bei der Epimerisierung kann nicht nur durch Temperatur oder pH-Wert beeinflusst werden, sondern auch durch die Zugabe von (toxischem) Borat. Bedingt durch die bevorzugte Ausbildung eines D-Psicose-Borat-Komplexes wird das Gleichgewicht zur D-Psicose hin verschoben (Kim et al., 2008; Lim et al., 2009). EP 3643786 A2 und US 11028420 B2 beschreiben die chromatographische Auftrennung des D-Psicose-Borat-Komplexes mittels Simulated Moving Bed- (SMB)- Chromatographie. EP 3395952 Bl und US 10550414 B2 legen offen, dass die Konversion bei der Epimerisierung mittels DPE bei Zusatz von Natriumaluminat auf bis zu 67 % und bei Kaliumiodat auf bis zu 52% erhöht werden kann (Vergleich: 25% ohne Zusatz von Aluminat oder lodat).
Zhu et al. (2020) präsentierten ein System bestehend aus zwei Enzymen (exo-lnulase aus Bacillus velezenis und DAE aus Ruminococcus sp.), mit dem Inulin aus Helianthus tuberosus L. (Topinambur) in ein Sirup bestehend aus D-Glucose, D-Fructose und D-Psicose (1:3:1) umgewandelt werden kann. Li et al. (2021a) verwendeten ein System bestehend aus Invertase, D-Glucose-Isomerase und immobilisierter DAE aus Pirellula sp. SH-Sr6A, um Saccharose, D-Glucose und D-Fructose (aus Fruchtsäften) in D-Psicose umzuwandeln. Es konnten 16 - 19% D-Psicose (bezogen auf den Gesamtgehalt der Kohlenhydrate) in den Säften angereichert werden.
Juneja et al. (2019) analysierten in einer Studie die technoökonomischen Aspekte eines modifizierten Corn-Dry-Grind-Prozesses, bei dem aus gemahlenem Mais zusätzlich zu Ethanol durch Einsatz eines modifizierten Hefestammes auch D-Psicose gebildet wird (durch Expression einer DPE). Die Autoren errechneten, dass aus einer Tonne Mais 390,4 I Ethanol und 75,3 kg D-Psicose gewonnen werden können und dass der minimale Verkaufspreis für die nach dem beschriebenen Verfahren erzeugte D-Psicose bei 1,29 US$/kg liegt (im Vergleich zum Marktpreis von 10 - 20 US$/kg im Jahr 2018). WO 2020/057560 Al sowie WO 2020/057561 Al beschreiben die Herstellung von D-Psicose aus Stärke mittels Saccharifizierung, enzymatischer Isomerisierung und Epimerisierung. Patel et al. (2018) verwendeten eine auf magnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln immobilisierte Smt3- DPE (Fusionsprotein) zur Herstellung von D-Psicose aus D-Fructose aus Obst-Trester-Waschlösungen. Die immobilisierte Epimerase konnte 20% der D-Fructose umsetzen und wurde nach Beendigung der Reaktion mit einem Magneten abgetrennt.
Yang et al. (2018) transferierten das DPE-Gen aus Agrobacterium tumefaciens in das thermotolerante Bakterium Kluyveromyces marxianus. So konnten in 12 h bei 55 °C aus 750 g/l D-Fructose 190 g/l D-Psicose hergestellt werden und die verbliebene D-Fructose wurde von K. marxianus zu Ethanol fermentiert. Dedania et al. (2020) immobilisierten DPE aus A. tumefaciens auf Titandioxid- Nanopartikeln und konnten damit 36% der D-Fructose zu D-Psicose umsetzen. Darüber hinaus konnte das immobilisierte Enzym bis zu neunmal wiederverwendet werden.
Die bei der Epimerisierung von D-Fructose entstehenden D-Fructose/D-Psicose-Mischungen können entweder durch chromatographische Verfahren oder durch die „biologische Methode" (Fermentation der überschüssigen D-Fructose zu z.B. Ethanol) getrennt werden (Jiang et al., 2020). In US 2021/0189441 Al wird die Trennung einer D-Fructose/D-Psicose-Mischung beschrieben, wobei die D-Fructose durch einen probiotischen Mikroorganismus (Lactobacillus oder Saccharomyces) in L-Milchsäure umgewandelt wird. EP 3423460 Bl beschreibt ein Verfahren zur Aufreinigung einer D-Fructose/D-Psicose-Mischung und zur Gewinnung hochreiner D-Psicose. EP 3553069 Al sowie Van Duc Long et al. (2009) legen eine Methode zur Trennung von D-Psicose und D-Fructose basierend auf SMB-Chromatographie offen.
Die Herstellung von D-Psicose über die Epimerase-Route hat allerdings folgende Nachteile: 1) Lage des Gleichgewichts aufseiten der D-Fructose, 2) Zusatz von (zum Teil toxischen) Metallionen als Kofaktoren für viele Epimerasen, 3) niedrige Aktivität und Langzeitstabilität der Epimerasen und 4) aufwendige Trennung des Produktgemisches.
Eine Möglichkeit zur Umgehung der thermodynamisch ungünstigen Epimerisierung sind Enzym- Kaskaden mit phosphorylierten Intermediaten. Der letzte Schritt, die Dephosphorylierung, ist irreversibel und treibt somit die Kaskade an (Li et al., 2021b).
Eine Kaskade, die in nahezu identischer Form sowohl von Li et al. (2021b) als auch im US 11168342 B2 und im US 10907182 B2 beschrieben wird, weist D-Glucose-l-phosphat (G1P) als zentrales Intermediat auf. G1P wird mittels Phosphoglucomutase zuerst zu D-Glucose-6-phosphat (G6P) und dann weiter mittels Glucose-6-phosphat-lsomerase zu D-Frucose-6-phosphat (F6P) umgewandelt. F6P wird danach mittels D-Allulose-6-phosphat-Epimerase zu D-Psicose-6-phosphat epimerisiert, welches anschließend mit D-Allulose-6-phosphat-Phosphatase zur D-Psicose dephosphoryliert wird. G1P kann beispielsweise durch die Einwirkung von Phosphorylasen auf z.B. Maltose und Amylodextrine (erhalten durch die Hydrolyse von Stärke), Cellodextrine (erhalten durch die Hydrolyse von Cellulose) oder Saccharose unter Verbrauch von Phosphat direkt hergestellt werden. Da die endständigen Zuckermonomere der Oligo- und Polysaccharide von den entsprechenden Phosphorylasen nicht phosphoryliert werden können, muss auf die Polyphosphat-Glucokinase (D-Glucose G6P) oder Polyphosphat-Fructokinase (D-Fructose F6P) zurückgegriffen werden, wobei noch zusätzlich Polyphosphate als Phosphat-Quelle zugesetzt werden müssen, um die Ausbeuten zu steigern (US 11168342 B2; US 10907182 B2). Als Substrat für die Kaskade von Li et al. (2021b) dient Stärke, welche zu D-Psicose mit Ausbeuten von 79% (bei 50 g/l Substrat-Konzentration; Reaktionszeit 24 h) umgewandelt wird.
Wang et al. (2020) entwickelten zur Herstellung von D-Psicose ebenfalls eine enzymatische Kaskade ausgehend von Stärke, welche allerdings über mehrere Schritte zu Glyceraldehyd-3-phosphat und Dihydroxyacetonphosphat umgesetzt wird. Dihydroxyacetonphosphat wird mit D-Glyceraldehyd unter Einwirkung von L-Fuculose-l-phosphat-Aldolase (FucA) zu D-Psicose-l-phosphat umgewandelt, welches mittels Phosphatase zu D-Psicose dephosphoryliert wird (95 % Ausbeute bei einem Titer von 15,2 mM). Glyceraldehyd-3-phosphat wird weiter zu 2-Deoxy-D-ribose umgesetzt (Wang et al., 2020).
Auch eine Enzymkaskade ausgehend von Glycerin ist in der Literatur beschrieben. Dieses wird zu Dihydroxyacetonphosphat (Phosphorylierung von Glycerin mit einer sauren Phosphatase und nachfolgende Oxidation mit einer Glycerinphosphat-Oxidase) und D-Glyceraldehyd (Oxidation von Glycerin mit Alditol-Oxidase) umgesetzt, welche wiederum als Substrat für eine Aldolase (wie z.B. FucA) dienen. Nach Abspaltung der Phosphatgruppe wird eine Mischung aus D-Sorbose und D-Psicose erhalten, die chromatographisch getrennt werden kann (Li et al., 2020). WO 2016/201110 Al wiederum beschreibt eine Methode zur Herstellung von D-Psicose aus Dihydroxyaceton und D-Glyceraldehyd mittels Fructose-6-phosphat-Aldolase und DTE (Zwischenprodukt D-Fructose).
Xiao et al. koppelten die Epimerisierung von D-Fructose mit der Umwandlung der D-Psicose zu D-Psicose-l-phosphat mittels L-Rhamnulose-Kinase (unter Verbrauch von Adenosintriphosphat (ATP)), um das Gleichgewicht der Epimerisierung zu verschieben. Durch nachfolgende Abspaltung der Phosphat-Gruppe durch eine saure Phosphatase wird D-Psicose erhalten (99% Umsatz von 20 mM D-Fructose). ATP muss allerdings unter Zusatz von Polyphosphat mit einer Polyphosphat-Kinase regeneriert werden (Xiao et al., 2019).
Ein großer Nachteil der Routen mit phosphorylierten Intermediaten ist der Einsatz von teuren, energiereichen Phosphat-Verbindungen wie Polyphosphat oder ATP in stöchiometrischen Mengen zur Einführung der Phosphat-Gruppen. Durch die Verwendung von Phosphorylasen kann dieses Problem zum Teil umgangen werden, jedoch können endständige Monosaccharide nicht ohne Zuhilfenahme von energiereichen Phosphat-Verbindungen phosphoryliert werden. Außerdem müssen die verbliebenen Phosphat-Verbindungen und Phosphat-Ionen nach Beendigung der Reaktion entfernt werden.
Auch Fermentationsprozesse zur Herstellung von D-Psicose sind bekannt. Zhang et al. (2021) präsentierten einen Fermentationsprozess basierend auf der Kokultivierung von engineerten Bacillus subtilis und Escherichia coli zur gemeinsamen Produktion von D-Psicose (Titer 11,7 g/l; Umsatz: 69,5%) und dem Enzym Lipase. In US 2017/0298400 Al wird die Expression von DPE (z.B. aus Agrobacterium tumefaciens) in verschiedenen Mikroorganismen beschrieben. EP 3088515 Bl und US 9701953 B2 beschreiben einen D-Psicose produzierenden Ensifer adhaerens-Stamm. In EP 2470668 Bl wird die Immobilisierung eines GRAS-Mikroorganismus (Corynebacterium glutamicum KCCM 11046) mit exprimierter DPE auf einem Natriumalginat-Träger offengelegt.
Allitol als Intermediat
Die unvorteilhafte Lage des Gleichgewichts der Epimerisierung von D-Fructose zu D-Psicose kann auch durch nachgeschaltete Redoxreaktionen günstig beeinflusst werden. Durch Kombination einer DTE mit einer Ribitol-Dehydrogenase (RDH; EC 1.1.1.56) und Formiat-Dehydrogenase (FDH; als Regenerationsenzym für den Kofaktor Nicotinamidadenindinukleotid NADH) kann D-Fructose in vitro zum Zuckeralkohol Allitol umgewandelt werden (Takeshita et al., 2000).
Durch einen Oxidationsschritt kann Allitol im Anschluss wieder zu D-Psicose umgesetzt werden. Dies kann beispielsweise mikrobiell mit Enterobacter aerogenes IK7 (vollständige Oxidation von 100 g/l Allitol in 24 h) oder Bacillus pallidus Y25 (48% Umsatz von 50 g/l Allitol in 48 h) bewerkstelligt werden (Gullapalli et al., 2007; Poonperm et al., 2007).
Der achirale Zuckeralkohol Allitol bildet aufgrund seiner Symmetrie eine Schnittstelle zwischen den D- und L-Hexosen in der sogenannten Izumoring-Strategie zur Bioproduktion von seltenen Zuckern (Izumori, 2006; Hassanin et al., 2017). Somit kann er auch als Vorstufe zur Herstellung von weiteren seltenen Monosacchariden dienen.
Die theoretischen Abhandlungen von Hold et al. (2009) und Siedentop et al. (2021) thematisieren die Optimierung von Enzymkaskaden. Es wird beschrieben, dass dazu alle Komponenten und eine Vielzahl an Parametern berücksichtigt werden müssen, vor allem Parameter des Kaskaden-Designs, der Enzyme selbst, der Reaktionsbedingungen und des -milieus und auch des Prozess-Designs, wobei sich ein Erfolg nicht voraussagen lässt. Eine konkrete Synthese von D-Psicose wird nicht erwähnt. Chen et al. (2022) wenden sich zur Herstellung von D-Psicose dem fermentativen Weg über Ganzzellen- Biokatalysatoren („in vivo") zu und kommen zum Schluss, dass nur dieser Weg das Potential hat, durch verschiedenste Optimierungen in Zukunft wirtschaftlich und im industriellen Maßstab D-Psicose herstellen zu können. Die Vorteile der Ganzzellen-Biokatalysatoren liegen auf der Hand:
(1) Zellen, die die Enzyme in ihrem Inneren enthalten, sind leichter zugänglich als die Enzyme als solche, deren Reinigung oft arbeitsaufwendig ist,
(2) das Innere der Zellen bietet eine geeignete Mikroumgebung für die Enzyme und ermöglicht auch eine Kofaktor-Regenerierung (NAD(P)+/NAD(P)H),
(3) die Zellwände und Membranen schützen die Enzyme gegen das Milieu des Reaktionsmediums, und
(4) die Ko-Lokalisierung multipler Enzyme innerhalb der Zelle begünstigt die lokalen Enzym- Konzentrationen und verringert die Diffusion von Zwischenprodukten in Kaskaden- Reaktionen.
Die Autoren sehen daher in „mikrobiellen Zellfabriken" die besten Chancen, D-Psicose großtechnisch herstellen zu können, sodass auch der normale Konsument in naher Zukunft in den Genuss dieses seltenen Zuckers kommen wird können.
Eine Arbeitsgruppe um Wang et al. (2022, 2023) beschäftigt sich ebenso mit der enzymatischen Biotransformation von Zuckern, wobei sie die Biotransformationen in vitro und in vivo untersuchen. Ziel ist, eine wirtschaftliche Herstellungsmethode zu entwickeln, die im industriellen Maßstab durchgeführt werden kann.
Für die Herstellung von D-Psicose aus D-Fructose beschreiben Wang et al. (2023) ein in vivo Verfahren bestehend aus zwei E. co//-Ganzzell-Biokatalysatoren, wobei im ersten Schritt (Umsetzung von D- Fructose zu Allitol) E. co//-Zellen, welche eine DPE aus Clostridiales, eine RDH aus Providentia alcalifaciens, eine FDH aus Starkeya sowie eine weitere DPE aus Rhizobium straminoryzae beinhalteten, verwendet werden. Auf diese Weise wurde D-Fructose (500 mM = 90 g/l) innerhalb von 12 h bei 37 °C und pH 6 unter Einsatz von 1000 mM Natrium-Formiat (zwei Äquivalente bezogen auf D-Fructose) zu 452 mM Allitol umwandelt (Umsatz 90,4%). Als Nebenprodukt entstand ca. 30 mM D- Sorbitol. Die Zellen wurden durch Zentrifugation abgetrennt und ausgetretene Proteine im Allitol- haltigen Überstand wurden durch Hitzeeinwirkung deaktiviert. Danach wurden E. co//-Zellen, welche eine RDH aus Rubrivivax sp. und eine NADH-Oxidase aus Streptococcus pyogenes beinhalteten, zur Allitol-Lösung zugesetzt. Allitol (452 mM) wurde innerhalb von 24 h bei pH 7 zu D-Psicose (450 mM). Wang et al. (2023) beschreiben ferner, dass die Umsetzungsrate von 90% ihres Wissens nach die höchste, je gelungene Umsetzungsrate zur Herstellung von D-Psicose aus D-Fructose ist und kündigen weiters an, den in vivo Weg noch weiter optimieren zu wollen, da die theoretische Umsetzungsrate des vorgeschlagenen, zweistufigen Prozesses bei 100% liegt. Ein Nachteil des Verfahrens nach Wang et al. ist die Bildung des Nebenproduktes D-Sorbitol, welches durch Reduktion von D-Fructose gebildet wird.
Hier setzt nun die Aufgabe der vorliegenden Erfindung an und setzt sich zum Ziel, den zweistufigen Prozess zur Bildung von D-Psicose aus D-Fructose weiter zu verbessern und ein Verfahren zur Herstellung von wässerigen Lösungen enthaltend D-Psicose zur Verfügung zu stellen, welches insbesondere auch im Eintopf-Verfahren durchgeführt werden kann.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst, indem aus D-Fructose, welche in einer wässerigen Lösung gelöst vorliegt, durch Behandeln mit einer Epimerase in vitro eine erste D-Psicose gebildet wird, wonach die erste D-Psicose durch Behandeln mit einer entsprechenden NAD(P)H-abhängigen Oxidoreduktase in vitro zu Allitol reduziert und nach Deaktivierung und/oder Ultrafiltration der Epimerase zur Bildung von D-Psicose mit einer entsprechenden NAD(P)+-abhängigen Oxidoreduktase behandelt wird, wonach die deaktivierte Epimerase und die Oxidoreduktasen entfernt werden. Es ist auch möglich, statt der Deaktivierung der Epimerase diese auf oder in einem Trägermaterial zu immobilisieren und gemeinsam mit dem Träger aus der wässerigen Lösung abzufiltrieren.
Es hat sich überraschend gezeigt, dass im erfindungsgemäßen Verfahren praktisch kein unerwünschtes D-Sorbitol gebildet wird und dass sogar die Ausbeute an D-Psicose auf einfache Weise weiter Richtung 100% gesteigert werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird somit nicht fermentativ durchgeführt, sondern die Enzyme sind als solche in der wässerigen Lösung enthalten. Erfindungsgemäß wird also in vitro gearbeitet.
Eine bevorzugte Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die NAD(P)+-abhängige Oxidoreduktase zur Bildung von D-Psicose aus Allitol eine Aminosäuresequenz umfasst, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 10 oder SEQ ID Nr. 12 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 11 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 3, SEQ. ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 11 bindet, oder ein funktionelles Fragment davon.
Ein „funktionelles Fragment" dieser NAD(P)+-abhängigen Oxidoreduktase umfasst eine N-terminal und/oder C-terminal trunkierte Variante der Oxidoreduktase mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 10 oder SEQ ID Nr. 12, die zumindest 50%, vorzugsweise zumindest 60%, noch mehr bevorzugt zumindest 70%, noch mehr bevorzugt zumindest 80%, noch mehr bevorzugt zumindest 90%, noch mehr bevorzugt zumindest 95%, Enzymaktivität im Vergleich zur nicht trunkierten Oxidoreduktase aufweist.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist in der beiliegenden Figur schematisch dargestellt.
Eine bevorzugte Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass der durch die Reduktion von D-Psicose zu Allitol entstandene oxidierte Kofaktor NAD(P)+ mittels einer Alkoholdehydrogenase (ADH) und einem sekundären Alkohol unter Bildung eines Ketons reduziert wird, wobei der sekundäre Alkohol bevorzugt D-Glucose oder 2-Propanol (Isopropanol) ist. 2-Propanol ist ein sehr günstiger Wasserstoff-Donor zur Regeneration von NAD(P)H und das Oxidationsprodukt Aceton ist aufgrund seiner Flüchtigkeit leicht abtrennbar (Xu et al., 2021). Aus dem Abgasstrom gewonnenes Aceton kann heterogen-katalytisch wieder zu 2-Propanol hydriert werden (Al-Rabiah et al., 2022), entweder in der Gasphase oder in Lösung, vorliegend als 2-Propanol/Aceton/Wasser- Mischungen oder als Aceton/Wasser-Mischungen, wobei in Zukunft vermehrt auf Wasserstoff aus nachhaltigen Quellen („grüner Wasserstoff") gesetzt werden könnte.
Die Regeneration des Kofaktors mittels ADH ist z.B. aus der EP 2812439 Bl vorbekannt oder von Xu et al. (2021) beschrieben.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der durch die Reduktion entstandene oxidierte Kofaktor NAD(P)+ mittels einer Glucose-Dehydrogenase und D-Glucose unter Bildung von D-Gluconat reduziert. Der Einsatz einer Glucose-Dehydrogenase zur Regeneration von NAD(P)H ist besonders vorteilhaft, da im Zuge der Reduktion von NAD(P)+ aus D-Glucose D-Gluconat gebildet wird, welches aus der Reaktionsmischung gewonnen und in verschiedensten Bereichen eingesetzt werden kann (z.B. in Metallbeizmittel, in Medikamenten und als Stabilisator in Lebensmitteln usw.). Zudem ermöglicht die Verwendung von Glucose-Dehydrogenase ein Gemisch umfassend D-Fructose und D-Glucose als Substrat zur Herstellung von Allitol bzw. D-Psicose einzusetzen, ohne dass zusätzliche D-Glucose der Reaktionsmischung zugesetzt wird und ohne dass D-Glucose zuvor in D-Fructose isomerisiert wird. Gemische aus D-Fructose und D-Glucose können beispielsweise durch Hydrolyse von Saccharose hergestellt werden. Besonders bevorzugt wird eine Glucose-Dehydrogenase eingesetzt, die von Priestia megaterium stammt und die eine Aminosäuresequenz umfasst, die unter der NCBI-Zugangsnummer MDQ0804260.1 erhältlich ist.
Eine weitere bevorzugte Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die Verwendung einer Formiat-Dehydrogenase (FDH) zur Regeneration des durch die Reduktion entstandenen oxidierten Kofaktors NAD(P)+ mittels einer Formiat-Dehydrogenase und Formiat (z.B. Natrium-Formiat) unter Bildung von CO2.
Eine weitere bevorzugte Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass es als Eintopf-Reaktion ohne Isolierung von Zwischenprodukten durchgeführt wird.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die Enzyme vorzugsweise als Lysat der entsprechenden, sie bildenden Zellen eingesetzt. Im Gegensatz zu dem von Wang et al. (2023) beschriebenen Verfahren, das auf E. co//-Ganzzellen-Biokatalysatoren mit koexprimierten rekombinanten Enzymen beruht, werden die Enzyme einzeln in geeigneten E. co//-Produktionsstämmen exprimiert. Das erlaubt eine Optimierung der Enzymverhältnisse zueinander und dieses ist somit unabhängig vom Expressionslevel im Gesamtkonstrukt im Vergleich zu Wang et al. (2023).
Vor der Ausführung des letzten Schritts (Oxidation) werden die Enzyme (Epimerase und Reduktase und/oder Dehydrogenase) des ersten Schritts (D-Fructose Allitol) durch Hitzeeinwirkung deaktiviert und/oder durch Ultrafiltration entfernt, um die Bildung von Nebenprodukten durch die Enzyme zu verhindern. Ohne die entsprechende Behandlung würde ein Großteil der durch die Oxidation entstandenen D-Psicose von der Epimerase wieder zu D-Fructose umgewandelt.
Die Regeneration der Nicotinamid-basierenden Kofaktoren (NAD oder NADP) erfolgt im Falle der Reduktion der D-Psicose zu Allitol mit einer NAD(P)-abhängigen Alkoholdehydrogenase, Glucose- Dehydrogenase oder Formiat-Dehydrogenase und im Falle der Oxidationsreaktionen (zweiter Schritt) mit einer HjO-bildenden NAD(P)H-Oxidase.
Die besonders bevorzugte Konzentration von D-Fructose beträgt 50 - 250 g/l.
Der besonders bevorzugte Temperaturbereich für den ersten Schritt (Epimerisierung und Reduktion) liegt zwischen 25 und 45 °C, für den zweiten Schritt (Oxidation) zwischen 20 und 30 °C.
Der besonders bevorzugte pH-Bereich beider Schritte liegt zwischen 7 und 8,5. Bei einer weiteren, bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens liegen die Enzyme in einer Suspension und/oder im Homogenat und/oder im Lysat der entsprechenden, sie bildenden Zellen vor, wobei Lysate besonders bevorzugt sind.
Suspension bedeutet in diesem Kontext eine Suspension von resting cells. Diese werden nach der Kultivierung geerntet (vom Nährmedium abgetrennt) und als Paste verwendet oder in einem geeigneten Puffersystem suspendiert. Im Gegensatz zu fermentativen Verfahren, bei denen auch mit ganzen Zellen gearbeitet wird, können die resting cells aufgrund des nicht Vorhandensein von Kohlenstoff-Quellen und Nährstoffen nicht mehr wachsen, sondern dienen nur der Umsetzung von Substraten (Lin & Tao, 2017). Homogenat steht in diesem Kontext für eine physikalisch und/oder chemisch behandelte Suspension (z.B. mittels Druckes, Lysozym oder Ultraschall behandelt), wobei die Zellbestandteile aus den Zellen freigesetzt werden. Ein Lysat wird erhalten, wenn die unlöslichen Zellbestandteile des Homogenats beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugation entfernt werden (siehe Produktion der Enzyme & Herstellung der Lysate für Details).
In einer weiteren Variante können die Enzyme auch mit einem wasserlöslichen Polymer wie Polyethylenglycol am N-Terminus modifiziert, in oder auf einer festen Matrix immobilisiert oder Teil eines Fusionsproteins sein.
In einer weiteren Variante können die Enzyme in Pulverform, in lyophilisierter oder sprühgetrockneter Form vorliegen.
D-Psicose liegt nach Abtrennung der Enzyme besonders bevorzugt in einer wässrigen Lösung vor, aus welcher feste D-Psicose beispielsweise durch Sprühtrocknung gewonnen werden kann (US 2019/0315790 Al; Kawakami et al., 2013; Kawakami et al., 2014).
Aufgrund der hohen Reinheit der erhaltenen Lösung ist es möglich, das Filtrat aufzukonzentrieren und die D-Psicose in kristalliner Form oder in Form eines Sirups zu erhalten.
In einer weiteren bevorzugten Variante liegt die D-Psicose in einem Sirup vor, wobei der Sirup durch Aufkonzentration des oben beschriebenen Filtrats oder durch Lösen von kristalliner D-Psicose, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbar ist, in Wasser. Der erfindungsgemäße Sirup weist vorzugsweise einen Gesamtfeststoffgehalt von etwa 50 Gew.-% bis etwa 90 Gew.-% auf. Der D-Psicose- Gehalt im erfindungsgemäßen Sirup beträgt etwa 80 Gew.-% bis etwa 99 Gew.-% bezogen auf die Trockensubstanz.
Dementsprechend betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung einen Sirup umfassend D- Psicose, welche mit dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbar ist. In einer besonders bevorzugten Ausführung des Verfahrens werden für die Konversion des Startmaterials nur Enzyme aus den Enzymgruppen Epimerasen und Oxidoreduktasen verwendet, wobei eines oder mehrere dieser Enzyme aus jeder dieser Gruppen ausgewählt werden.
Die im Verfahren verwendete Epimerase kann aus einer der Gruppen EC 5.1.3.30 (D-Psicose-3- Epimerase) oder EC 5.1.3.31 (D-Tagatose-3-Epimerase/L-Ribulose-3-Epimerase) stammen, wobei die erstgenannte besonders bevorzugt ist.
Die zur Reduktion von D-Psicose und zur Oxidation von Allitol verwendeten Enzyme stammen aus der Gruppe der Oxidoreduktasen (siehe Tabelle 1 für Details).
Die zur Kofaktor-Regeneration eingesetzte Alkoholdehydrogenase (ADH) kann aus einer der Gruppen EC 1.1.1.1 (NAD-abhängige ADH) und EC 1.1.1.2 (NADP-abhängige ADH) stammen.
Die NAD(P)-abhängige Alkoholdehydrogenase zur Kofaktor-Regeneration umfasst oder besteht vorzugsweise aus einer Aminosäuresequenz, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 18 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 17 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 17 bindet.
Besonders geeignet zur Kofaktor-Regeneration im Allgemeinen ist eine Alkoholdehydrogenase, deren Aminosäuresequenz mindestens 80% ident zu SEQ ID Nr. 18 ist bzw. welche durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 17 von mindestens 80% aufweist bzw. unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 17 bindet, oder ein funktionelles Fragment dieser Alkoholdehydrogenase. Ein „funktionelles Fragment" der Alkoholdehydrogenase umfasst eine N-terminal und/oder C-terminal trunkierte Variante der Alkoholdehydrogenase mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 18, die zumindest 50%, vorzugsweise zumindest 60%, noch mehr bevorzugt zumindest 70%, noch mehr bevorzugt zumindest 80%, noch mehr bevorzugt zumindest 90%, noch mehr bevorzugt zumindest 95%, Enzymaktivität im Vergleich zur nicht trunkierten Alkoholdehydrogenase aufweist.
SEQ ID Nr. 17: ATGAAAGCTGCAGTTGTGGAACAATTTAAAAAGCCGTTACAAGTGAAAGAAGTGGAAAAACCTAAGAT CTCATACGGGGAAGTATTAGTGCGCATCAAAGCGTGTGGGGTATGCCATACAGACTTGCATGCCGCAC ATGGCGACTGGCCTGTAAAGCCTAAACTGCCTCTCATTCCTGGCCATGAAGGCGTCGGTGTAATTGAAG AAGTAGGTCCTGGGGTAACACATTTAAAAGTTGGAGATCGCGTAGGTATCCCTTGGCTTTATTCGGCGT GCGGTCATTGTGACTATTGCTTAAGCGGACAAGAAACATTATGCGAACGTCAACAAAACGCTGGCTATT CCGTCGATGGTGGTTATGCTGAATATTGCCGTGCTGCAGCCGATTATGTCGTAAAAATTCCTGATAACTT ATCGTTTGAAGAAGCCGCTCCAATCTTTTGCGCTGGTGTAACAACATATAAAGCGCTCAAAGTAACAGG CGCAAAACCAGGTGAATGGGTAGCCATTTACGGTATCGGCGGGCTTGGACATGTCGCAGTCCAATACG CAAAGGCGATGGGGTTAAACGTCGTTGCTGTCGATTTAGGTGATGAAAAACTTGAGCTTGCTAAACAA CTTGGTGCAGATCTTGTCGTCAATCCGAAACATGATGATGCAGCACAATGGATAAAAGAAAAAGTGGG CGGTGTGCATGCGACTGTCGTCACAGCTGTTTCAAAAGCCGCGTTCGAATCAGCCTACAAATCCATTCG TCGCGGTGGTGCTTGCGTACTCGTCGGATTACCGCCGGAAGAAATACCTATTCCAATTTTCGATACAGT ATTAAATGGAGTAAAAATTATTGGTTCTATCGTTGGTACGCGCAAAGACTTACAAGAGGCACTTCAATT TGCAGCAGAAGGAAAAGTAAAAACAATTGTCGAAGTGCAACCGCTTGAAAACATTAACGACGTATTCG ATCGTATGTTAAAAGGGCAAATTAACGGCCGCGTCGTGTTAAAAGTAGATTAA
SEQ. ID Nr. 18:
M KAAVVEQFKKPLQVKEVEKPKISYGEVLVRIKACGVCHTDLHAAHGDWPVKPKLPLIPGHEGVGVIEEV GPGVTHLKVGDRVGIPWLYSACGHCDYCLSGQETLCERQQNAGYSVDGGYAEYCRAAADYVVKIPDNLS FEEAAPIFCAGVTTYKALKVTGAKPGEWVAIYGIGGLGHVAVQYAKAMGLNVVAVDLGDEKLELAKQLG ADLVVNPKHDDAAQWIKEKVGGVHATVVTAVSKAAFESAYKSIRRGGACVLVGLPPEEIPIPIFDTVLNGV KIIGSIVGTRKDLQEALQFAAEGKVKTIVEVQPLENINDVFDRM LKGQINGRVVLKVD
Die hier angeführte Alkoholdehydrogenase zur Kofaktor-Regeneration umfasst vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ. ID Nr. 18 von mindestens 80%, noch mehr bevorzugt von 85%, noch mehr bevorzugt von 90%, noch mehr bevorzugt von 95%, noch mehr bevorzugt von 98%, noch mehr bevorzugt von 99%, insbesondere von 100%, aufweist. Besonders bevorzugt umfasst die erfindungsgemäße Alkoholdehydrogenase zur Kofaktor-Regeneration die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 18 oder besteht aus dieser.
Alternativ umfasst die Alkoholdehydrogenase zur Kofaktor-Regeneration vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 17 von mindestens 80%, noch mehr bevorzugt von 85%, noch mehr bevorzugt von 90%, noch mehr bevorzugt von 95%, noch mehr bevorzugt von 98%, noch mehr bevorzugt von 99%, insbesondere von 100%, aufweist. Besonders bevorzugt umfasst die Nukleinsäure, welche die erfindungsgemäße Alkoholdehydrogenase zur Kofaktor-Regeneration kodiert, die Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 17 oder besteht aus dieser.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer Alkoholdehydrogenase zur Kofaktor-Regeneration, wobei die Alkoholdehydrogenase eine Aminosäuresequenz umfasst oder aus dieser besteht, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ. ID Nr. 18 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 17 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 17 bindet, oder einem funktionellen Fragment davon.
Die hier offenbarten Alkoholdehydrogenasen können zur Regeneration von NAD(P)+ bzw. NAD(P)H, d.h. zur Reduktion von NAD(P)+ bzw. zur Oxidation von NAD(P)H, in verschiedensten enzymatischen Reaktionen eingesetzt werden. Besonders bevorzugt ist der Einsatz der erfindungsgemäßen Alkoholdehydrogenasen bei der Kofaktor-Regeneration von NAD(P)+, welches bei der Reduktion von D-Psicose zu Allitol mittels einer NAD(P)H-abhängigen Oxidoreduktase entsteht.
Der bei der Reduktion von D-Psicose zu Allitol entstehende Kofaktor NAD(P)+ wird mittels Formiat und einer Formiat-Dehydrogenase unter Bildung von CO2 zu NAD(P)H reduziert (Kofaktor-Regeneration).
Besonders bevorzugt wird eine Formiat-Dehydrogenase eingesetzt, welche die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 umfasst oder daraus besteht, oder ein funktionelles Fragment dieser Formiat- Dehydrogenase. Die bevorzugt eingesetzte Formiat-Dehydrogenase wird vorzugsweise durch die Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 1 kodiert. Ein „funktionelles Fragment" der Formiat-Dehydrogenase umfasst eine N-terminal und/oder C-terminal trunkierte Variante der Formiat-Dehydrogenase mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2, die zumindest 50%, vorzugsweise zumindest 60%, noch mehr bevorzugt zumindest 70%, noch mehr bevorzugt zumindest 80%, noch mehr bevorzugt zumindest 90%, noch mehr bevorzugt zumindest 95%, Enzymaktivität im Vergleich zur nicht trunkierten Formiat- Dehydrogenase aufweist.
SEQ ID Nr. 1: ATGGCGAAAATACTTTGCGTTCTCTATGACGATCCGGTCGACGGCTACCCGAAGACCTATGCGCGCG
ACGACCTGCCGAAGATCGACCACTATCCGGGCGGGCAGACGCTGCCCACGCCCAAGGCGATCGACTT CACGCCGGGCGCGCTGCTCGGCTCGGTCTCCGGCGAGCTCGGCCTGCGCAAATACCTGGAAGCCAAC GGCCATACCTTCGTCGTCACCTCCGATAAGGACGGCCCGGATTCGGTGTTCGAGAGGGAACTCGTCG ACGCCGACGTGGTGATCTCGCAGCCCTTCTGGCCGGCCTATCTGACGCCCGAGCGCATCGCCAAGGC GAAGAACCTGAAGCTCGCGCTCACCGCCGGCATCGGCTCCGATCATGTCGATCTTCAGTCAGCTATCG ACCGTGGCATCACTGTGGCCGAAGTCACATATTGCAACTCGATCAGCGTCGCCGAGCACGTGGTGAT GATGATCCTCGGCCTGGTACGAAACTACATTCCCTCGCATGACTGGGCGCGCAAGGGCGGCTGGAAC ATAGCCGACTGCGTAGAGCACTCCTACGACCTCGAGGGCATGACCGTCGGCTCGGTGGCCGCCGGCC GCATCGGCCTCGCCGTGCTGCGCCGCCTCGCGCCGTTCGACGTGAAGCTGCACTATACCGACCGCCA CCGTCTGCCAGAAGCGGTCGAGAAGGAGCTGGGCCTCGTCTGGCACGATACCCGCGAGGACATGTA CCCGCATTGCGACGTGGTCACGCTCAACGTGCCGCTGCACCCCGAAACCGAGCACATGATCAATGAC GAGACGCTGAAGCTGTTCAAGCGCGGCGCCTATATCGTCAACACCGCCCGCGGCAAGCTCGCCGACC GCGACGCCATCGTCCGCGCGATCGAGAGCGGGCAGCTCGCGGGCTATGCCGGCGACGTGTGGTTCC CGCAGCCGGCTCCGAAGGACCACCCCTGGCGCACCATGAAGTGGGAAGGCATGACGCCGCACATCT CCGGCACCTCGCTCTCTGCCCAGGCGCGCTACGCGGCGGGCACGCGCGAGATCCTCGAATGCTTCTT CGAGGGCCGGCCGATCCGCGACGAGTACCTGATCGTGCAGGGCGGCGCGCTCGCCGGCACCGGCGC GCATTCCTACTCGAAGGGCAATGCGACCGGCGGTTCGGAAGAGGCCGCGAAGTTCAAGAAGGCTGG CTGA
SEQ. ID Nr. 2:
MAKILCVLYDDPVDGYPKTYARDDLPKIDHYPGGQTLPTPKAIDFTPGALLGSVSGELGLRKYLEANGHTFV VTSDKDGPDSVFERELVDADVVISQPFWPAYLTPERIAKAKNLKLALTAGIGSDHVDLQSAIDRGITVAEVT YCNSISVAEHVVMM ILGLVRNYIPSHDWARKGGWNIADCVEHSYDLEGMTVGSVAAGRIGLAVLRRLAP FDVKLHYTDRHRLPEAVEKELGLVWHDTREDMYPHCDVVTLNVPLHPETEHM INDETLKLFKRGAYIVNT ARGKLADRDAIVRAIESGQLAGYAGDVWFPQPAPKDHPWRTMKWEGMTPHISGTSLSAQARYAAGTR EILECFFEGRPIRDEYLIVQGGALAGTGAHSYSKGNATGGSEEAAKFKKAG
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die zur Kofaktor-Regeneration eingesetzte Formiat-Dehydrogenase eine Aminosäuresequenz, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ. ID Nr. 2 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 1 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 1 bindet, oder einem funktionellen Fragment davon.
Die Formiat-Dehydrogenase umfasst vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ. ID Nr. 2 von mindestens 80%, noch mehr bevorzugt von 85%, noch mehr bevorzugt von 90%, noch mehr bevorzugt von 95%, noch mehr bevorzugt von 98%, noch mehr bevorzugt von 99%, insbesondere von 100%, aufweist.
Alternativ umfasst die Formiat-Dehydrogenase vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 1 von mindestens 80%, noch mehr bevorzugt von 85%, noch mehr bevorzugt von 90%, noch mehr bevorzugt von 95%, noch mehr bevorzugt von 98%, noch mehr bevorzugt von 99%, insbesondere von 100%, aufweist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer Formiat-Dehydrogenase zur Kofaktor-Regeneration oder ein funktionelles Fragment davon, wobei die Formiat-Dehydrogenase eine Aminosäuresequenz umfasst oder aus dieser besteht, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 2 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 1 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 1 bindet.
Die zur Kofaktor-Regeneration eingesetzte Glucose-Dehydrogenase (GDH) kann aus einer der Gruppen EC 1.1.1.47 (Glucose-l-dehydrogenase), EC 1.1.1.118 (Glucose-l-dehydrogenase (NAD+)), EC 1.1.1.119 (Glucose-l-dehydrogenase (NADP+)) oder EC 1.1.1.360 (Glucose/Galactose-l-dehydrogenase) stammen.
Die NAD(P)-abhängige Glucose-Dehydrogenase zur Kofaktor-Regeneration umfasst oder besteht vorzugsweise aus einer Aminosäuresequenz, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 20 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 19 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID Nr. 19 bindet.
Besonders geeignet zur Kofaktor-Regeneration im Allgemeinen ist eine Glucose-Dehydrogenase, deren Aminosäuresequenz mindestens 80% ident zu SEQ ID Nr. 20 ist bzw. welche durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 19 von mindestens 80% aufweist bzw. unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 19 bindet, oder ein funktionelles Fragment dieser Glucose-Dehydrogenase. Ein „funktionelles Fragment" der Glucose- Dehydrogenase umfasst eine N-terminal und/oder C-terminal trunkierte Variante der Glucose- Dehydrogenase mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 18, die zumindest 50%, vorzugsweise zumindest 60%, noch mehr bevorzugt zumindest 70%, noch mehr bevorzugt zumindest 80%, noch mehr bevorzugt zumindest 90%, noch mehr bevorzugt zumindest 95%, Enzymaktivität, im Vergleich zur nicht trunkierten Glucose-Dehydrogenase aufweist.
SEQ ID Nr. 19:
ATGTATACAGATTTAAAAGATAAAGTAGTTGTAATTACAGGTGGATCAACAGGTTTAGGACGCGCAA TGGCTGTTCGTTTCGGTCAAGAAGAAGCAAAAGTTGTTATTAACTATTACAACAATGAAGAAGAAGCT TTAGATGCGAAAAAAGAAGTAGAAGAAGCAGGCGGACAAGCAATCATCGTTCAAGGCGACGTAACA AAAGAAGAAGATGTTGTAAACCTTGTTCAAACAGCTATTAAAGAATTCGGTACATTAGACGTTATGAT TAATAACGCTGGTGTTGAAAACCCAGTTCCTTCTCATGAGTTATCTTTAGACAACTGGAATAAAGTTAT TGATACAAACTTAACAGGTGCATTCTTAGGAAGCCGTGAAGCAATCAAATATTTTGTTGAAAACGACA TTAAAGGAAACGTTATTAACATGTCTAGTGTTCATGAAATGATTCCTTGGCCATTATTTGTTCATTACG CAGCAAGTAAAGGCGGTATGAAACTAATGACGGAAACATTGGCTCTTGAATATGCGCCAAAAGGTAT CCGCGTAAATAACATTGGACCAGGTGCGATGAACACACCAATTAACGCAGAGAAATTTGCAGATCCT GTACAACGTGCAGACGTAGAAAGCATGATTCCAATGGGTTACATCGGTAAACCAGAAGAAGTAGCA GCAGTTGCAGCATTCTTAGCATCATCACAAGCAAGCTATGTAACAGGTATTACATTATTTGCTGATGG TGGTATGACGAAATACCCTTCTTTCCAAGCAGGAAGAGGCTAA
SEQ ID Nr. 20:
MYTDLKDKVVVITGGSTGLGRAMAVRFGQEEAKVVINYYNNEEEALDAKKEVEEAGGQAIIVQGDVTKEED VVNLVQTAIKEFGTLDVMINNAGVENPVPSHELSLDNWNKVIDTNLTGAFLGSREAIKYFVENDIKGNVIN MSSVHEMIPWPLFVHYAASKGGMKLMTETLALEYAPKGIRVNNIGPGAMNTPINAEKFADPVQRADVES MIPMGYIGKPEEVAAVAAFLASSQASYVTGITLFADGGMTKYPSFQAGRG
Die hier angeführte Glucose-Dehydrogenase zur Kofaktor-Regeneration umfasst vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 20 von mindestens 80%, noch mehr bevorzugt von 85%, noch mehr bevorzugt von 90%, noch mehr bevorzugt von 95%, noch mehr bevorzugt von 98%, noch mehr bevorzugt von 99%, insbesondere von 100%, aufweist. Besonders bevorzugt umfasst die erfindungsgemäße Glucose-Dehydrogenase zur Kofaktor-Regeneration die Aminosäuresequenz SEQ. ID Nr. 20 oder besteht aus dieser.
Alternativ umfasst die Glucose-Dehydrogenase zur Kofaktor-Regeneration vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 19 von mindestens 80%, noch mehr bevorzugt von 85%, noch mehr bevorzugt von 90%, noch mehr bevorzugt von 95%, noch mehr bevorzugt von 98%, noch mehr bevorzugt von 99%, insbesondere von 100%, aufweist. Besonders bevorzugt umfasst die Nukleinsäure, welche die erfindungsgemäße Glucose- Dehydrogenase zur Kofaktor-Regeneration kodiert, die Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 19 oder besteht aus dieser.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer Glucose-Dehydrogenase zur Kofaktor-Regeneration, wobei die Glucose-Dehydrogenase eine Aminosäuresequenz umfasst oder aus dieser besteht, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 20 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 19 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 19 bindet, oder einem funktionellen Fragment davon.
Die zur Kofaktor-Regeneration eingesetzte NAD(P)H-Oxidase (siehe Figur 1) kann aus einer der Gruppen EC 1.6.3.1 (NAD(P)H-Oxidase (H2O2-bildend)), EC 1.6.3.2 (NAD(P)H-Oxidase (H2O-bildend)), EC 1.6.3.3 (NADH-Oxidase (H2O2-bildend)) sowie EC 1.6.3.4 (NADH-Oxidase (H2O-bildend)) stammen, wobei die H2O-bildenden Klassen besonders bevorzugt sind.
Eine besonders bevorzugt eingesetzte H2O-bildende NAD(P)H-Oxidase umfasst oder besteht vorzugsweise aus einer Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 14 oder SEQ ID Nr. 16 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ. ID Nr. 13 oder SEQ ID Nr. 15 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 13 oder SEQ ID Nr. 15 bindet, oder einem funktionellen Fragment davon.
Ein „funktionelles Fragment" dieser NAD(P)H-Oxidase umfasst eine N-terminal und/oder C-terminal trunkierte Variante der NAD(P)H-Oxidase mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 10 oder SEQ ID Nr. 12, die zumindest 50%, vorzugsweise zumindest 60%, noch mehr bevorzugt zumindest 70%, noch mehr bevorzugt zumindest 80%, noch mehr bevorzugt zumindest 90%, noch mehr bevorzugt zumindest 95%, Enzymaktivität im Vergleich zur nicht trunkierten NAD(P)H-Oxidase aufweist.
SEQ ID Nr. 13:
ATGAGCAAAATTGTTATCGTGGGTGCAAATCATGCAGGCACCGCAGCAATTAATACCATTCTGGATAATTA TGGCAGCGAAAATGAAGTGGTTGTGTTTGATCAGAATAGCAACATTAGCTTTCTGGGTTGTGGTATGGCAC TGTGGATTGGTAAACAAATTAGCGGTCCGCAGGGTCTGTTTTATGCAGATAAAGAAAGCCTGGAAGCAAA AGGTGCCAAAATCTATATGGAAAGTCCGGTTACCGCCATTGATTATGATGCAAAACGTGTTACCGCACTGG TTAATGGTCAAGAACATGTTGAAAGCTACGAGAAACTGATTCTGGCAACCGGTAGCACCCCGATTCTGCCT CCGATTAAAGGTGCAGCCATTAAAGAAGGTAGTCGCGATTTTGAAGCAACCCTGAAAAATCTGCAGTTCGT GAAACTGTATCAGAATGCCGAAGATGTGATTAACAAACTGCAGGATAAAAGCCAGAATCTGAATCGTATT GCAGTTGTTGGTGCAGGTTATATTGGTGTTGAACTGGCAGAAGCATTTAAACGTCTGGGTAAAGAAGTGA TTCTGATTGACGTTGTTGATACCTGTCTGGCAGGTTATTATGATCAGGATCTGAGCGAAATGATGCGTCAG AATCTGGAAGATCATGGTATCGAACTGGCATTTGGTGAAACCGTTAAAGCAATTGAAGGTGATGGTAAAG TGGAACGTATTGTTACCGATAAAGCAAGCCATGATGTGGATATGGTTATTCTGGCAGTTGGTTTTCGTCCG AATACAGCACTGGGTAATGCAAAACTGAAAACCTTTCGTAATGGTGCCTTTCTGGTGGATAAAAAACAAGA AACCAGCATCCCGGATGTTTATGCAATTGGTGATTGTGCAACCGTGTATGATAATGCCATTAACGACACCA ACTATATTGCACTGGCAAGCAATGCACTGCGTAGCGGTATTGTTGCAGGTCATAATGCAGCCGGTCATAAA CTGGAAAGTCTGGGTGTTCAGGGTAGCAATGGTATTTCAATTTTTGGCCTGAATATGGTTAGCACCGGTCT GACCCAAGAAAAAGCCAAACGTTTTGGTTATAATCCGGAAGTTACCGCCTTTACCGATTTTCAGAAAGCCA GCTTTATCGAGCATGATAACTATCCGGTTACGCTGAAAATTGTGTATGACAAAGATAGCCGTCTGGTTCTG GGTGCACAGATGGCCAGCAAAGAAGATATGAGCATGGGTATTCACATGTTTAGCCTGGCCATTCAAGAGA AAGTTACCATTGAACGTCTGGCCCTGCTGGATTATTTCTTTCTGCCGCATTTTAATCAGCCGTACAACTATAT GACCAAAGCAGCACTGAAAGCCAAATAA
SEQ. ID Nr. 14:
MSKIVIVGANHAGTAAINTILDNYGSENEVVVFDQNSNISFLGCGMALWIGKQISGPQGLFYADKESLEAKGAKI
YM ESPVTAIDYDAKRVTALVNGQEHVESYEKLILATGSTPILPPIKGAAIKEGSRDFEATLKNLQFVKLYQNAEDVI
NKLQDKSQNLNRIAVVGAGYIGVELAEAFKRLGKEVILIDVVDTCLAGYYDQDLSEMM RQNLEDHGIELAFGET
VKAIEGDGKVERIVTDKASHDVDMVILAVGFRPNTALGNAKLKTFRNGAFLVDKKQETSIPDVYAIGDCATVYD
NAINDTNYIALASNALRSGIVAGHNAAGHKLESLGVQGSNGISIFGLNMVSTGLTQEKAKRFGYNPEVTAFTDF
QKASFIEHDNYPVTLKIVYDKDSRLVLGAQMASKEDMSMGIHM FSLAIQEKVTIERLALLDYFFLPHFNQPYNY MTKAALKAK
SEQ. ID Nr. 15:
ATGAAAGTAGTAGTAGTAGGCTGTACACATGCAGGAACAGCGGCAGTTAAGACGATTTTAAATGAACATC
CAGATGCATCAGTATCAGTATATGAGCGTAATGACAATGTCTCATTTCTATCTTGTGGGATTGCGTTGTATG
TTGGTGGAGTTGTGAAAGATCCTGCAGGTTTGTTTTATTCAAGTCCAGAAGAACTTGCATCAATGGGCGCG
AAAATTAACATGGAACACAATGTGAAAAATATAGATAATGAGAATAAGGTCGTAGTAATTGAGAATTTAAA
AACAGGCGAAACATTTGAAGAAAGCTATGATAAGTTGGTAATGACAACTGGATCATGGCCAATTATTCCTC
CAATTGATGGAATCAATAGTGAAAATATTCTTTTGTGTAAAAACTATAACCAAGCAAATGAAATTATTAAAG
AATCAAAAAATGCTAAAAAGATTGTCATTGTTGGTGGTGGCTATATTGGAATTGAATTAGTTGAGGCATTT
GCAGAATCTGGCAAGCAAGTGACGCTAGTTGATGGATTAGATCGTATTTTAAACAAATATTTAGATGCTGA
ATTCACTTCTGTTTTAGAGCATGATTTACAAGAAAGAGGCGTTACGCTAGCTTTAAACCAAACCGTCGAGAA
ATTTGTTGCCAATGAATCAGGTGCTGTGACAGCTGTGAAAACACCAGTTGGAGAATATGAGGCTGATTTAG
TTATTTTATGTGTTGGATTTAAACCAAATACTGATTTGTTGAAGGATAAAGTAGAGATGTTGCCAAATGGTG
CCATCGTAGTGGATGAATATATGAGAACAAGCGATGAAGCGATTTTTGCTGCTGGCGATAGTTGCGCGGTT
CATTATAATCCAACTGGAGGCTCTGCGTATATTCCGTTAGCTACAAATGCAGTTAGAATGGGAGCTTTAGTT
GGGAAAAATATTGTTTCTCCAACAGTTAAATATCGTGGCACGCAAGCAACTTCTGGTTTATATTTATTTGGT
TTTAATATAGGTTCAACCGGATTGACTGAAAATAGCGCTCCTCATTTTGGCGTAGAGGTTCGTTCAGTAGTT
GTAGAAGATAATTATCGTCCAGAGTTTATGCCGACAACAGAGAAAGTAACGATGAAATTAGTTTATGAAGT
AGGAACGAATCGGATTGTTGGAGGTCAAATCATGTCAAAATATGATGTGACACAATCTGCCAATACGTTAT
CTTTATGTGTTCAAAATAAAATGACGATTGAGGATTTGGCTTATGTAGATTTCTTCTTCCAACCTCACTTTGA TCGTCCTTGGAACTATTTAAATATTTTAGCGCAAGCAGCTGTTGAGCAAGAGCGTAAACTAGCAAAATAA
SEQ ID Nr. 16: MKVVVVGCTHAGTAAVKTILNEHPDASVSVYERNDNVSFLSCGIALYVGGVVKDPAGLFYSSPEELASMGAKIN MEHNVKNIDNENKVVVIENLKTGETFEESYDKLVMTTGSWPIIPPIDGINSENILLCKNYNQANEIIKESKNAKKIV IVGGGYIGIELVEAFAESGKQVTLVDGLDRILNKYLDAEFTSVLEHDLQERGVTLALNQTVEKFVANESGAVTAVK TPVGEYEADLVILCVGFKPNTDLLKDKVEM LPNGAIVVDEYMRTSDEAIFAAGDSCAVHYNPTGGSAYIPLATN AVRMGALVGKNIVSPTVKYRGTQATSGLYLFGFNIGSTGLTENSAPHFGVEVRSVVVEDNYRPEFMPTTEKVT MKLVYEVGTNRIVGGQIMSKYDVTQSANTLSLCVQNKMTIEDLAYVDFFFQPHFDRPWNYLNILAQAAVEQER KLAK
Die bevorzugt verwendete F O-bildende NAD(P)H-Oxidase umfasst oder besteht vorzugsweise aus einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 16 oder SEQ ID Nr. 14 von mindestens 80%, noch mehr bevorzugt von 85%, noch mehr bevorzugt von 90%, noch mehr bevorzugt von 95%, noch mehr bevorzugt von 98%, noch mehr bevorzugt von 99%, insbesondere von 100%, aufweist. Besonders bevorzugt umfasst die F O-bildende NAD(P)H-Oxidase die Aminosäuresequenz SEQ. ID Nr. 16 oder SEQ ID Nr. 14 oder besteht aus dieser.
Alternativ umfasst die F O-bildende NAD(P)H-Oxidase vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 15 oder SEQ ID Nr. 13 von mindestens 80%, noch mehr bevorzugt von 85%, noch mehr bevorzugt von 90%, noch mehr bevorzugt von 95%, noch mehr bevorzugt von 98%, noch mehr bevorzugt von 99%, insbesondere von 100%, aufweist. Besonders bevorzugt umfasst die Nukleinsäure, welche die F O-bildende NAD(P)H-Oxidase kodiert, die Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 15 oder SEQ ID Nr. 13 oder besteht aus dieser.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die die Verwendung einer F O-bildenden NAD(P)H-Oxidase zur Kofaktor-Regeneration (NAD(P)H zu NAD(P)+), welche eine Aminosäuresequenz umfasst oder daraus besteht, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 16 oder SEQ ID Nr. 14 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 15 oder SEQ ID Nr. 13 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 15 oder SEQ ID Nr. 13 bindet, oder einem funktionellen Fragment davon.
Die hier vorgestellte enzymatische Strategie in Kombination mit der Kofaktor-Regeneration ermöglicht einen biokatalytischen, umweltfreundlichen und hocheffizienten Produktionsprozess zur Herstellung von D-Psicose. Die NAD(P)H-abhängige Oxidoreduktase zur Reduktion der ersten D-Psicose zu Allitol umfasst oder besteht vorzugsweise aus einer Aminosäuresequenz, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 10 oder SEQ ID Nr. 12 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ. ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 11 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 11 bindet.
Besonders geeignet zur Reduktion der ersten D-Psicose zu Allitol bzw. D-Psicose zu Allitol im Allgemeinen ist eine Oxidoreduktase, deren Aminosäuresequenz mindestens 80% ident zu SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 10 oder SEQ ID Nr. 12 ist bzw. welche durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 11 von mindestens 80% aufweist bzw. unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 11 bindet. Diese Oxidoreduktase kann zudem überraschenderweise zur Oxidation von Allitol zu D-Psicose eingesetzt werden.
Die NAD(P)+-abhängige Oxidoreduktase zur Bildung von D-Psicose aus Allitol umfasst oder besteht vorzugsweise aus einer Aminosäuresequenz, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 10 oder SEQ ID Nr. 12 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 11 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 11 bindet.
SEQ ID Nr. 3:
ATGACACAGTCTCTTCAGGGCAAGATCGTCGCCATTACTGGCGCGGCTTCGGGCATTGGCCTCGAATGC GCCCGCTATCTCATCGAAGCTGGCGCGGTGGTCTATCTTCTGGACCGTGACGCCAAAACTCTCGAAGAC AAAACGGCAGAACTCGGCAGCCAGGCCCATGCGATCATCGTCGATCTCTTCGACTACAAAACCGTAGAT GCTGCGGTCGCGCAGATCGTTGAGGAGCAGGGCCGGATCGATGTTTTCCACGCCAACGCCGGCGCGTA TGTGGGCGGCAATGTCTGGGAAGGGGATCCCGATAGCTGGGATGCGATGCTGCACCTGAACATCAAT GCAGCTTTCCGCTCGGTCCGTGCCGTGCTGCCGCAGATGATGAAGCAGGAAAGTGGCGATATCGTCAT
GACCAGCTCGATCGCGGGCATGATCCCCATCATGGCCGAGCCGATCTACACGGCCTCGAAACATGCCG
TGCAGGCATTCGTACATACGGTGCGCCGACAGGTCGCGAAGTATGGAATTCGTGTGGGTGCAATCCAG
CCTGGTCCTGTAGTCACGCCTTTGCTGAAAGACTGGGATCAGGCCCGTCTTGAAGCCAACATCAAAGCG
GGTGCCCTGATGGAAGCCAAGGAAGTCGCCGAAGCCCTGATCTTCATCCTGACACGTTCAAAGGGTGT
CATGGTGCGGGATCTGGTCGTTCTGCCACATAACTTCGACGCCTAAGCTTAAGCGGCCGCACTCGAGCA
CCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAA
SEQ. ID Nr. 4:
MTQSLQGKIVAITGAASGIGLECARYUEAGAVVYLLDRDAKTLEDKTAELGSQAHAIIVDLFDYKTVDAAVA
QIVEEQGRIDVFHANAGAYVGGNVWEGDPDSWDAMLHLNINAAFRSVRAVLPQMMKQESGDIVMTSSI
AGMIPIMAEPIYTASKHAVQAFVHTVRRQVAKYGIRVGAIQPGPVVTPLLKDWDQARLEANIKAGALM EA
KEVAEALIFILTRSKGVMVRDLVVLPHNFDA
SEQ. ID Nr. 5:
ATGAGCACACCGGAAAATCTGAGCTTTGTGCTGCAGAAACCGTTTGATGTGAAATTTGAAGATCGTCCG
ATTCCGAAACTGAGCGATCCGTATAGCGTTAAAATTCAGGTGAAAAAAACCGGCATTTGCGGTAGTGA
TGTTCACTATTTCACCCATGGTGCAATTGGTGATTTTGTTGTTAAAGCACCGATGGTTCTGGGTCATGAA
AGCAGCGGTGTTGTTCTGGAAGTTGGTAGCGAAGTTAAAAGCCTGAAAGTTGGTGATCGTGTTGCAAT
GGAACCGGGTGTTCCGAGCCGTCATAGTGATGAGTATAAAAGCGGTCGTTATAATCTGTGTCCGCACA
TGGCATTTGCAGCAACCCCTCCGTATGATGGCACCCTGTGTAAATACTATATTCTGCCGGAAGATTTCTG
CGTTAAACTGCCGGAACATGTTAGCCTGGAAGAAGGTGCACTGGTTGAACCGCTGAGCGTTGCAGTTC
ATAGCAGCAAACTGGGTAACATTAAACCGGGTAGCCATGTTGCAATTTATGGTGCAGGTCCGGTTGGT
CTGCTGGTTGCAGCAGTTGCAAGCGCATTTGGTGCAGAAAGCGTTACCATTATTGATCTGGTTGAAAGC
CGTCTGAATCTGGCAAAAGAACTGGGTGCAACCGCAACCGTTCAGGTTGATTTTAAAGATACCCCGAA
AGAAAGCGCAGCAAAAGTTGTTGCAGCAAATAATGGCATTGCACCGGATGTTGTTATTGATGCAAGCG
GTGCAGAAGCAAGCATTAATTCAGCCATTAATGCAATTCGTCCGGGTGGCACCTATGTTCAGGTGGGTA
TGGGTAAACCGGATGTGAGCTTTCCGATTGCAACCCTGATTGGTAAAGAACTGACCGTTAAAGGTAGC
TTTCGTTATGGTTATGGTGATTATCCGCTGGCAGTTAGCCTGCTGGCAAGCGGTAAAGTTAATGTGAAA
AAACTGATCACCCATGAAGTGAAATTCGAGGATGCAGCAGAAGCATTTCAGCTGGTTCGTGATGGTAA
AGCCATTAAATGTATTATCAACGGTCCGGAATAA
SEQ ID Nr. 6:
MSTPENLSFVLQKPFDVKFEDRPIPKLSDPYSVKIQVKKTGICGSDVHYFTHGAIGDFVVKAPMVLGHESSGV
VLEVGSEVKSLKVGDRVAMEPGVPSRHSDEYKSGRYNLCPHMAFAATPPYDGTLCKYYILPEDFCVKLPEHV SLEEGALVEPLSVAVHSSKLGNIKPGSHVAIYGAGPVGLLVAAVASAFGAESVTIIDLVESRLNLAKELGATAT
VQVDFKDTPKESAAKVVAANNGIAPDVVIDASGAEASINSAINAIRPGGTYVQVGMGKPDVSFPIATLIGKE
LTVKGSFRYGYGDYPLAVSLLASGKVNVKKLITHEVKFEDAAEAFQLVRDGKAIKCIINGPE
SEQ. ID Nr. 7:
ATGAATAACAACCTGCCGAAAACCATGAAAGCAGCAGTTATGCATGGCACCCGTGAAATTAGCATTGA
AACCCTGCCGATTCCGCAGATTGATGAAAATGAAGTTCTGATCAAAGTTATGGCCGTTGGTATTTGTGG
TAGCGATCTGCACTATTACACCCAGGGTCGTATTGGTAAATACAAAGTGGAAAAACCGTTTATCCTGGG
TCATGAATGTAGCGGTGAAGTTGTTGCAATTGGTAGCGCAGTTGAACGTTTTCGTGTTGGTGATCGTGT
TGCCGTTGAACCGGGTGTTACCTGTGGTCATTGTGAAGCATGTAAAGAGGGTCGTTATAATCTGTGTCC
GGATGTTCAGTTTCTGGCAACCCCTCCGGTTGATGGTGCATTTGTTCAGTATATCAAAATGCGCCAGGA
TTTCGTTTTTCTGATTCCGAATAGCCTGAGCTATGAAGATGCAGCACTGATTGAACCGTTTAGCGTGGG
TATTCATGCAGCAACCCGTACCAAACTGCAGCCTGGTAGCACCATTGCAATTATGGGTATGGGTCCGGT
TGGTCTGATGGCAGTTGCAGCAGCAAAAGCATTTGGTGCAAGCACCATTATTGCAACCGATCTGGAAC
CGCTGCGTCTGGAAGCAGCCAAACGTATGGGTGCAACCCATGTTATTAACATTCGTGAACAGGATCCG
CTGAACGAGATTAAAAACATTACCGAAAATGTGGGTGTTGATGTTGCATGGGAAACCGCAGGTAATCC
GAAAGCACTGCAGAGCAGCCTGAGCAGCATTCGTCGTGGTGGTAAACTGGCAATTGTTGGTCTGCCGA
GCCAGAGCGATATTCCGCTGGATGTTCCGTTTATTGCCGATAATGAAATCGATATCTATGGCATCTTTCG
CTATGCAAACACCTATCCGAAAGGCATCAAATTTCTGACCAGCGGTGCAATTGATACCAAAAATCTGGT
TACCGATCGTTATCCGCTGGCAGGTACACGTGAAGCAATGGAACGTGCACTGAATTTCAAAAACGAAT
GCCTGAAAATCATCGTGTATCCGAACGAATAA
SEQ. ID Nr. 8:
MNNNLPKTMKAAVM HGTREISIETLPIPQIDENEVLIKVMAVGICGSDLHYYTQGRIGKYKVEKPFILGHECS
GEVVAIGSAVERFRVGDRVAVEPGVTCGHCEACKEGRYNLCPDVQFLATPPVDGAFVQYIKM RQDFVFLIP
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ATHVINIREQDPLNEIKNITENVGVDVAWETAGNPKALQSSLSSIRRGGKLAIVGLPSQSDIPLDVPFIADNEI
DIYGIFRYANTYPKGIKFLTSGAIDTKNLVTDRYPLAGTREAM ERALNFKNECLKIIVYPNE
SEQ ID Nr. 9:
ATGACCTCTCCTCTCCAGGGTAAGATAGCCGCCATCACGGGCGGGGCTTCGGGCATCGGCCTCGAATG
TGTCCGCCAGATCGCCGCAAGTGGTGCCACGGTTTATATTCTCGACCGCGACCATCAGGCGCTCGACAA
GGCGCGCGAAGAATTGGGCGAGCGCGTTCATACCATCGAGGTCGATCTCTTCCGTTACGAAACGGTCG
ATCGCGCCATCGAAACCATCGTGTCCGAACAAGGACGCATCGACATTCTCCATGTCAATGCGGGCGCGT
ATATCGGCGGCAATGTCTGGGAAGGCGATCCCGATAAATGGGACAAGATGCTGAATCTCAACATCAAC GCCGCCTTCCGTTCCGCCCGCGCCGTCATGCCCGCCATGATGAAGCAGAAAAGCGGCGATATCATCATG
ACAAGCTCGATCGCAGGCATCGTCCCGATCCCGGCGGAGCCGATCTACACGGCTTCCAAACATGCGGT GCAAGCCTTCGCTCACACCATACGCCGCCAGTTGGCCCCGTTCGGCATCCGCGTCGGCGCCATCCAGCC CGGCCCGGTCGTCACGCCCTTGCTCAATGATTGGGACCCCGAGCGCCTTAAAGCCAATATCGAGGCTG GCGCCATGATGCAGCCTTCTGACGTCGCCGAAGCCGTGGTTTTCATGCTGTCCCGCCGCAAGGGAACG GTAATCCGCGACTTGGTTCTGTTACCCCATTCTTTCGACGTCTAA
SEQ. ID Nr. 10:
MTSPLQGKIAAITGGASGIGLECVRQIAASGATVYILDRDHQALDKAREELGERVHTIEVDLFRYETVDRAIET IVSEQGRIDILHVNAGAYIGGNVWEGDPDKWDKM LNLNINAAFRSARAVM PAMIVIKQKSGDIIIVITSSIAGI VPIPAEPIYTASKHAVQAFAHTIRRQLAPFGIRVGAIQPGPVVTPLLNDWDPERLKANIEAGAM MQPSDVA
EAVVFMLSRRKGTVIRDLVLLPHSFDV
SEQ. ID Nr. 11:
ATGGCTATATCTCTCGAAAACAACGTAGCTGCAATTACAGGTGCCGCTTCAGGTATCGGTCTCGAATGT GCACGCACACTGATCAAAGCAGGCGCTAAAGTTGTCCTCATTGACCGAGCAGAAGATAGACTAAATCA ATTGGTCGCAGAATTAGGTGAAAATGCAATTCCATTAGTTATCGATTTAATGAAACCAGAACAAGTCGA
TGGCATGTTAGCGCGTATTATCGAAAAGGCAGGCAGATTAGATATCTTTCATGCTAATGCTGGAGCTTA CATTGGTGGGCCCGTAGCCGAAGGCGATCCCGATGTTTGGGATAAAGTCCTAAATTTAAATGTTAATGC CGCATTCCGCTGTGTTCGCGCAGTTCTACCACACTTTATCGCACAAAAGTCAGGCGATATTCTATTCACC AGCTCTATCGCTGGTATGGTTCCCGTAATTTGGGAGCCTATTTACACGGCATCAAAATTTGCGGTTCAA GCATTCGTTCATTCTACTCGCCGTCAGGTTTCTGAACACGGTGTCCGTGTTGGTGCTGTATTACCTGGTC CTGTTGTTACTGCGTTATTAGATGATTGGCCAAAAGAAAAACTTGAAGAAGCTTTAGCTAACGGTAGTT
TAATGCAACCCATTGAAGTTGCTGAGGCTGTTCTATTCATGCTGACGCGTCCAAGAAATATTACAATTCG CGATTTAGTTATTTTACCCAATAGTGTTGACCTCTAA
SEQ ID Nr. 12:
MAISLENNVAAITGAASGIGLECARTLIKAGAKVVLIDRAEDRLNQLVAELGENAIPLVIDLMKPEQVDGMLA RIIEKAGRLDIFHANAGAYIGGPVAEGDPDVWDKVLNLNVNAAFRCVRAVLPHFIAQKSGDILFTSSIAGMV PVIWEPIYTASKFAVQAFVHSTRRQVSEHGVRVGAVLPGPVVTALLDDWPKEKLEEALANGSLMQPIEVAE
AVLFMLTRPRNITIRDLVILPNSVDL
Die hier angeführten Oxidoreduktasen zur Reduktion von D-Psicose zu Allitol und/oder zur Oxidation von Allitol zu D-Psicose umfassen vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 10 oder SEQ ID Nr. 12 von mindestens 80%, noch mehr bevorzugt von 85%, noch mehr bevorzugt von 90%, noch mehr bevorzugt von 95%, noch mehr bevorzugt von 98%, noch mehr bevorzugt von 99%, insbesondere von 100%, aufweist. Besonders bevorzugt umfasst die erfindungsgemäße Oxidoreduktase zur Reduktion von D-Psicose zu Allitol und/oder zur Oxidation von Allitol zu D-Psicose die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 10 oder SEQ. ID Nr. 12 oder besteht aus dieser, die Oxidoreduktase zur Oxidation von Allitol zu D-Psicose umfasst eine der Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr. 6 oder SEQ ID Nr. 8 oder besteht aus dieser.
Alternativ umfassen die Oxidoreduktasen zur Reduktion von D-Psicose zu Allitol und/oder zur Oxidation von Allitol zu D-Psicose vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 11 von mindestens 80%, noch mehr bevorzugt von 85%, noch mehr bevorzugt von 90%, noch mehr bevorzugt von 95%, noch mehr bevorzugt von 98%, noch mehr bevorzugt von 99%, insbesondere von 100%, aufweist. Besonders bevorzugt umfasst die Nukleinsäure, welche die erfindungsgemäße Oxidoreduktase zur Reduktion von D-Psicose zu Allitol und/oder zur Oxidation von Allitol zu D-Psicose kodiert, umfasst die Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 11 oder besteht aus dieser, die Oxidoreduktase zur Oxidation von Allitol zu D-Psicose kodiert, umfasst die Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 7 oder besteht aus dieser.
Der Begriff „Identität", wie hier verwendet, bezieht sich auf den Prozentsatz der identischen Nukleotid- bzw. Aminosäureübereinstimmungen zwischen mindestens zwei, unter Verwendung eines standardisierten Algorithmus miteinander ausgerichteten Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenzen („Alignment"). Ein solcher Algorithmus kann, in einer standardisierten und reproduzierbaren Weise, Lücken („Gap") in die verglichenen Sequenzen einfügen, um das Alignment zwischen zwei Sequenzen zu optimieren, und somit einen aussagekräftigeren Vergleich der beiden Sequenzen erreichen.
Die prozentuale Identität zwischen Sequenzen kann unter Verwendung von ein oder mehreren Computeralgorithmen oder im Stand der Technik bekannten oder hierin beschriebenen Programmen bestimmt werden. Erfindungsgemäß wird zur Bestimmung der Identität das durch National Center for Biotechnology Information (NCBI) bereitgestellte Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., 1990) verwendet. Die BLAST-Software-Reihe enthält verschiedene Programme, einschließlich ein als „BLAST 2 Sequences" genanntes Werkzeug, das für den direkten paarweisen Vergleich von zwei Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenzen verwendet wird. „BLAST 2 Sequences" kann auch über die NCBI World Wide Web-Seite im Internet interaktiv abgerufen und verwendet werden. Das blastn-Programm (für Nukleotidsequenzen) verwendet als Vorgaben eine Wortlänge (W) von 11, eine Erwartung (E) von 10, M = 5, N = -4 und einen Vergleich beider Stränge. Für Aminosäuresequenzen verwendet das blastp- Programm als Vorgaben eine Wortlänge von 3 und eine Erwartung (E) von 10 und die BLOSUM62- Scoring-Matrix (Henikoff & Henikoff, 1989), Alignments (B) von 50, Erwartung (E) von 10, M = 5, N = -4.
Alternativ umfassen die Oxidoreduktasen zur Reduktion von D-Psicose zu Allitol und/oder zur Oxidation von Allitol zu D-Psicose vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 11 bindet. Wie hierin verwendet, beziehen sich die stringenten Bedingungen auf Bedingungen, unter denen sogenannte spezifische Hybride, jedoch keine unspezifischen Hybride gebildet werden. Beispielsweise umfassen die stringenten Bedingungen eine Hybridisierung in 6xSSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) bei 45 °C und dann Waschen mit 0,2 bis lxSSC, 0,1% SDS bei 50 bis 65 °C; oder derartige Bedingungen können eine Hybridisierung in lxSSC bei 65 bis 70 °C und dann Waschen mit 0,3xSSC bei 65 bis 70 °C umfassen. Die Hybridisierung kann durch herkömmlich bekannte Verfahren, wie etwa jene, die von J. Sambrook et al. in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989), beschrieben sind, durchgeführt werden.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer Oxidoreduktase zur Reduktion von D-Psicose zu Allitol und/oder zur Oxidation von Allitol zu D-Psicose, wobei die Oxidoreduktase eine Aminosäuresequenz umfasst, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 10 oder SEQ ID Nr. 12 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 11 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 11 bindet.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer Oxidoreduktase zur Oxidation von Allitol zu D-Psicose, wobei die Oxidoreduktase eine Aminosäuresequenz umfasst, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 10 oder SEQ ID Nr. 12 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 11 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 3, SEQ. ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 11 bindet.
Die erfindungsgemäßen Oxidoreduktasen benötigen je nach Reaktion (Reduktion oder Oxidation) entsprechende Kofaktoren, wie oben angeführt.
Materialien
D-Psicose wurde von TCI und Hunan Garden Naturals Inc. (China), Allitol wurde von TCI, D-Fructose, NADPH-Tetranatriumsalz, und Methanol wurden von PanReac AppliChem (ITW Reagents), D-Glucose, Natriumgluconat, IPTG (Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) wurden von Sigma-Aldrich, Kaliumdihydrogenphosphat, di-Kaliumhydrogenphosphat, NAD+, NADH-Dinatriumsalz, NADP+- Dinatriumsalz sowie Natriumdodecylsulfat (SDS) wurden von Carl Roth und Triethanolamin (TEA) wurde von Chem-Lab NV bezogen.
Produktion der Enzyme & Herstellung der Lysate
Allgemeines zur Expression von rekombinanten Enzymen in E. coli
Für die rekombinante Enzymproduktion in einem Escherichia co//-Stamm wurde zunächst das zu exprimierende Gen in einer PCR unter der Verwendung der genomischen DNA oder deren synthetisch an die Codon-Verwendung von E. coli angepasstes Äquivalent als Matrize zusammen mit spezifischen Oligonukleotiden, die zusätzlich Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen tragen, amplifiziert und aus dem Reaktionsgemisch isoliert. Nach dem Nukleinsäure-Verdau mit den Restriktionsenzymen Sphl und Hindlll wurde das für das Target-Enzym kodierende Genfragment in das mit Sphl und Hindlll geschnittene Rückgrat des Expressionsvektors pQE70-Kan ligiert. Das Ligationsprodukt wurde in chemisch kompetente E. co//-Zellen ToplOF transformiert und die entstandenen Kolonien wurden für die Plasmid-Isolierung und Restriktionsanalyse benutzt.
Das Ergebnis des Klonierungs-Schritts wurde mittels Restriktionsenzym-Verdau und DNA- Sequenzierung überprüft. Das resultierende Konstrukt trägt das Target-Gen unter dem IPTG- induzierbaren T5-Promotor.
Für die Überexpression des Enzymes in E. coli wurde das resultierende Expressionsplasmid in die kompetenten Expressionszellen RB791 transformiert. Nach 24 h Inkubation bei 37 °C wurden entstandene Kolonien für die Expressionstests in LB-Medium angeimpft.
Am nächsten Tag wurden damit Expressionskulturen mit einer optische Dichte OD550 von 0,02 angeimpft und bei 37 °C geschüttelt, bis eine OD550 von 0,3 erreicht wurde. Anschließend wurde die Temperatur auf 25 °C gesenkt und die Kulturen wurden beim Erreichen einer OD550 von 0,5 mit 0,1 mM IPTG induziert. Nach 22 h wurden die Kulturen geerntet (vom Medium mittels Zentrifugation in Form eines Zellpellets abgetrennt) und auf die Expression des rekombinanten Enzymes mit Hilfe von SDS- Gelelektrophorese und einer Aktivitätsbestimmung (Verwendung in Use-Test oder optischenzymatischer Assay) analysiert.
Herstellung von Zell-Lysaten mittels Sonifier-Aufschlusses
Zur Herstellung einer Zell-Suspension wurde das nach obigen Verfahren hergestellte Zellpellet in einem geeigneten Gefäß eingewogen und mit Puffer und Lysozym (finale Konzentration 0,5 mg/ml) versetzt (z.B. Triethanolamin (TEA) - HCl) und unter Rührung gelöst. Der Massenanteil an Biomasse beträgt üblicherweise 20%, der Rest entfällt auf den Puffer.
Zum Zell-Aufschluss wurde ein Branson Sonifier 450 verwendet. Die Suspension wurde dreimal mit je 15 Ultraschall-Stößen (Einstellungen am Gerät: Timer = 15; Duty Cycle = 50; Output Control = 3 - 5) behandelt.
Das erhaltene Homogenat wurde 10 min lang bei 4 °C und 16000 rpm zentrifugiert (Eppendorf Zentrifuge 5417R), um die unlöslichen Zellfragmente abzutrennen und das Lysat zu erhalten.
Tabelle 1. Enzymklassen und Spenderorganismen für die in den Beispielen verwendeten Enzyme (SDR = Oxidoreduktase aus Short-Chain-Dehydrogenase/Reduktase-Familie).
Analytische Methoden
High Performance Liquid Chromatography
Zur Quantifizierung von D-Psicose, D-Fructose, D-Glucose sowie Allitol mittels HPLC (High Performance Liquid Chromatography) wurde ein Agilent HPLC 1260 Infinity II Series System verwendet. Die Detektion erfolgte mittels eines Brechungsindex-Detektors (Rl-Detektion). Zur Messung wurde eine Phenomenex Rezex RPM-Monosaccharide Pb+2 (8%) Säule mit entsprechender Vorsäule verwendet und mit Reinstwasser isokratisch eluiert.
High Performance Anion Exchange Chromatography
Zur Quantifizierung von D-Gluconsäure/D-Gluconat mittels HPAEC (High Performance Anion Exchange Chromatography) wurde ein Dionex ICS6000 System mit AS-AP Autosampler verwendet. Die Messung erfolgte mittels Leitfähigkeitsdetektion (CD) gekoppelt an einen Dionex AERS 500 elektrolytisch regenerierten Suppressor im externen Wassermodus. Zur Trennung der Analyten wurde eine Dionex lonPac ASll-HC-4pm Säule mit entsprechender Vorsäule sowie einem NaOH-Gradienten verwendet. Das Laufmittel wurde zusätzlich mit einer Dionex ATC Anion Trap Column vorbehandelt.
Bestimmung von Enzym-Aktivitäten (optisch-enzymatischer Assay) Enzym-Aktivitäten in den Lysaten wurden mit einem Shimadzu UV-1900 Spektrophotometer bestimmt. Dazu wurde die Bildung oder der Verbrauch von NAD(P)H bei einer Wellenlänge von 340 nm über die Änderung der Absorption verfolgt. Die Messungen wurden mit 0,2 mM Kofaktor (NAD(P)+ oder NAD(P)H) durchgeführt. Dazu wurden 20 pl einer 10 mM Stock-Lösung des Kofaktors in einer Küvette (Greiner bio-one Semi-Micro-Küvette aus Polystyrol) vorgelegt und der gewünschte pH-Wert wurde mit 100 mM TEA-HCl-Puffer eingestellt (870 pl). 10 pl Lysat (verdünnt oder unverdünnt) und 100 pl Substrat-Lösung wurden zur Küvette zugesetzt und die Messung unmittelbar danach gestartet. Die Messungen wurden standardmäßig bei 25 °C durchgeführt. Über den Extinktionskoeffizienten von NADH/NADPH bei 340 nm (E = 6220 L mol 1 cm 1) kann die Enzym-Aktivität des Lysats in U/ml (bezogen auf das Volumen des Lysats) oder U/g (bezogen auf die zur Herstellung eingesetzte Biomasse) bestimmt werden. 1 U steht dabei für 1 pmol Substratumsatz pro Minute (1 U = 1 pmol/min = l,67-10_8 kat).
Mit den nachfolgenden Beispielen werden bevorzugte Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens noch näher beschrieben. Die in diesen Beispielen eingesetzten Lysate wurden nach den oben beschriebenen Verfahren hergestellt.
Beispiel 1
Herstellung von D-Psicose aus D-Fructose - Kofaktor-Regeneration mit ADH und 2-Propanol
Die Reaktion wurde in einem Labfors 5 Tisch-Bioreaktor (Infors AG) durchgeführt. Als Gefäß wurde ein Glasreaktor (Volumen 3,4 I) mit aufgesetztem Rührwerk und pH-Elektrode verwendet. Die pH- Kontrolle erfolgte durch die Zudosierung von IM NaOH oder IM H2SO4.
Zu Beginn wurden 50 ml einer D-Fructose-Lösung (500 g/l), 246,1 ml deionisiertes Wasser sowie 96 ml eines 200 mM TEA-HCl-Puffers (pH 8) im Reaktor vorgelegt und unter Rühren auf 35 °C gebracht.
Zum Start der Reaktion wurden 25 ml D-Psicose-3-Epimerase-Lysat zugesetzt. Danach wurden 25 ml SDR I-Lysat, 4 kU Alkoholdehydrogenase-Lysat, 10 ml einer 10 mM NAD+-Lösung sowie 40 ml 2-Propanol eingebracht.
Während des Betriebs wurden laufend Proben von der Reaktorlösung genommen, die folgendermaßen analysiert wurden: 100 pl der Reaktorlösung wurden mit 200 pl Methanol versetzt und im Eppendorf Thermomixer bei 60 °C und 1200 rpm für 15 min inkubiert. Die Probe wurde in einer Zentrifuge kurz zentrifugiert, mit 700 pl deionisiertem Wasser versetzt, gevortext und anschließend für 5 min bei max. g zentrifugiert. 200 pl des Überstands wurden in ein HPLC-Vial mit Insert überführt und mittels HPLC (Rl-Detektion) vermessen.
Nach 23 h Laufzeit wurden 15 ml, nach 50 h wurden 20 ml und nach 77 h wurden 15 ml 2-Propanol nachdosiert.
Nach 74 h wurden 5 ml D-Psicose-3-Epimerase-Lysat, nach 77 h wurden 15 ml SDR I-Lysat und 2,4 kll Alkoholdehydrogenase-Lysat zugegeben.
Nach 97 h wurden 94% der D-Fructose (50 g/l) zu Allitol umgesetzt.
Danach wurde der gesamte Reaktorinhalt für 60 min auf 70 °C erhitzt (Deaktivierung der D-Psicose-3- Epimerase) und nach Abkühlen auf 24 °C wurden 25 ml Xylitol-Dehydrogenase-Lysat, 10 kU NADH- Oxidase-Lysat sowie 10 ml einer 10 mM NAD+-Lösung zugesetzt.
Allitol wurde innerhalb von 3 h vollständig zu D-Psicose oxidiert. Der Reaktorinhalt wurde auf 70 °C erhitzt, der pH-Wert auf 4 eingestellt und für 30 min bei 70 °C gerührt. Die Enzyme wurden über eine Glasfritte (P3) abfiltriert.
Auf diese Weise konnten 94% der D-Fructose zu D-Psicose umgesetzt werden. D-Sorbitol konnte nicht detektiert werden.
Das Filtrat wurde zu einem Sirup mit einer D-Psicose-Konzentration von 520 g/l am Rotationsverdampfer aufkonzentriert, wobei auch noch vorhandenes Aceton und 2-Propanol abgetrennt wurden.
Das Beispiel 1 zeigt, dass die Epimerase durch Hitzeeinwirkung (im Eintopf-Verfahren) denaturiert werden kann und der entstandene Niederschlag die weitere Reaktionsführung nicht stört.
Beispiel 2
Herstellung von D-Psicose aus D-Fructose - Kofaktor-Regeneration mit GDH und D-Glucose
Die Reaktion wurde in einem Multifors Tisch-Bioreaktor (Infors AG) durchgeführt. Als Gefäß wurde ein Glasreaktor (Volumen 1 1) mit aufgesetztem Rührwerk und pH-Elektrode verwendet. Die pH-Kontrolle erfolgte durch die Zudosierung von SM NaOH oder IM H2SO4. Zu Beginn wurden 17,5 g D-Fructose und 17,5 g D-Glucose (finale Konzentration je 50 g/l), 217,8 ml deionisiertes Wasser sowie 26,5 ml eines 500 mM Kaliumphosphat-Puffers (pH 7,5) im Reaktor vorgelegt und unter Rühren auf 35 °C gebracht.
Zum Start der Reaktion wurden 17,5 ml D-Psicose-3-Epimerase-Lysat zugesetzt. Danach wurden 24,5 ml SDR I-Lysat, 0,4 kll Glucose-Dehydrogenase-Lysat sowie 3,5 ml einer 10 mM NAD+-Lösung eingebracht.
Während des Betriebs wurden laufend Proben von der Reaktorlösung genommen, die folgendermaßen analysiert wurden: 100 pl der Reaktorlösung wurden mit 200 pl Methanol versetzt und im Eppendorf Thermomixer bei 60 °C und 1200 rpm für 15 min inkubiert. Die Probe wurde in einer Zentrifuge kurz zentrifugiert, mit 700 pl deionisiertem Wasser versetzt, gevortext und anschließend für 5 min bei max. g zentrifugiert. 200 pl des Überstands wurden in ein HPLC-Vial mit Insert überführt und mittels HPLC (Rl-Detektion) vermessen. Für die HPAEC-Messungen (Leitfähigkeitsdetektion) wurde der klare Überstand 1:250 verdünnt.
Nach 16 h konnten im Reaktor nur mehr Allitol und D-Gluconat detektiert werden.
Danach wurde der gesamte Reaktorinhalt für 60 min auf 70 °C erhitzt (Deaktivierung der D-Psicose-3- Epimerase) und nach Abkühlen auf 30 °C wurden 17,5 ml Xylitol-Dehydrogenase-Lysat, 7 kU NADH- Oxidase-Lysat sowie 3,5 ml einer 10 mM NAD+-Lösung zugesetzt.
Allitol wurde innerhalb von 27 h vollständig zu D-Psicose oxidiert.
Auf diese Weise konnten 17,5 g D-Fructose zu 100% zu D-Psicose (17,8 g in Lösung) oxidiert werden. D-Sorbitol und D-Fructose konnten in der erhaltenen Lösung nicht detektiert werden.
Der Reaktorinhalt wurde auf 70 °C erhitzt, der pH-Wert auf 4 eingestellt und für 30 min bei 70 °C gerührt. Die Enzyme wurden über eine Glasfritte (P3) abfiltriert.
Beispiel 3
Herstellung von D-Psicose aus D-Fructose - Kofaktor-Regeneration mit FDH und Natrium-Formiat
Die Reaktion wurde in einem Multifors Tisch-Bioreaktor (Infors AG) durchgeführt. Als Gefäß wurde ein Glasreaktor (Volumen 1 1) mit aufgesetztem Rührwerk und pH-Elektrode verwendet. Die pH-Kontrolle erfolgte durch die Zudosierung von 5M NaOH oder 6M H2SO4. Zu Beginn wurden 70 ml einer D-Fructose-Lösung (500 g/l), 26,3 ml deionisiertes Wasser sowie 43,8 ml einer 8 M Natrium-Formiat im Reaktor vorgelegt und unter Rühren auf 37 °C gebracht.
Zum Start der Reaktion wurden 25 ml D-Psicose-3-Epimerase-Lysat zugesetzt. Danach wurden 35 ml SDR I-Lysat, 7 kll Formiat-Dehydrogenase-Lysat sowie 17,5 ml einer 10 mM NAD+-Lösung eingebracht.
Während des Betriebs wurden laufend Proben von der Reaktorlösung genommen, die folgendermaßen analysiert wurden: 100 pl der Reaktorlösung wurden mit 200 pl Methanol versetzt und im Eppendorf Thermomixer bei 60 °C und 1200 rpm für 15 min inkubiert. Die Probe wurde in einer Zentrifuge kurz zentrifugiert, mit 700 pl deionisiertem Wasser versetzt, gevortext und anschließend für 5 min bei max. g zentrifugiert. 200 pl des Überstands wurden in ein HPLC-Vial mit Insert überführt und mittels HPLC (Rl-Detektion) vermessen.
Nach 40 h wurden 95% der D-Fructose (100 g/l) zu Allitol umgesetzt.
Danach wurde der gesamte Reaktorinhalt für 60 min auf 70 °C erhitzt (Deaktivierung der D-Psicose-3- Epimerase) und nach Abkühlen auf 24 °C wurden 25 ml Xylitol-Dehydrogenase-Lysat, 10 kll NADH- Oxidase-Lysat sowie 10 ml einer 10 mM NAD+-Lösung zugesetzt.
Allitol wurde innerhalb von 4 h vollständig zu D-Psicose oxidiert. Der Reaktorinhalt wurde auf 70 °C erhitzt, der pH-Wert auf 4 eingestellt und für 30 min bei 70 °C gerührt. Die Enzyme wurden über eine Glasfritte (P3) abfiltriert.
Auf diese Weise konnten 97% der D-Fructose zu D-Psicose umgesetzt werden. In der Reaktionslösung wurden noch Spuren von D-Fructose detektiert, jedoch kein D-Sorbitol.
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung einer wässerigen Lösung enthaltend D-Psicose, indem aus D-Fructose, welche in einer wässerigen Lösung gelöst vorliegt, durch Behandeln mit einer Epimerase in vitro eine erste D-Psicose gebildet wird, wonach die erste D-Psicose durch Behandeln mit einer entsprechenden NAD(P)H-abhängigen Oxidoreduktase in vitro zu Allitol reduziert und nach Deaktivierung und/oder Ultrafiltration der Epimerase zur Bildung von D-Psicose mit einer entsprechenden NAD(P)+-abhängigen Oxidoreduktase behandelt wird, wonach die deaktivierte Epimerase und die Oxidoreduktasen entfernt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die NAD(P)+-abhängige Oxidoreduktase zur Bildung von D-Psicose aus Allitol eine Aminosäuresequenz umfasst, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 10 oder SEQ ID Nr. 12 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 11 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 11 bindet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der durch die Reduktion entstandene oxidierte Kofaktor NAD(P)+ mittels einer Alkoholdehydrogenase und einem sekundären Alkohol unter Bildung eines Ketons reduziert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der sekundäre Alkohol D-Glucose oder 2-Propanol ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es als Eintopf- Reaktion ohne Isolierung von Zwischenprodukten durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme als Lysat der entsprechenden, sie bildenden Zellen vorliegen.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die NAD(P)H- abhängige Oxidoreduktase zur Reduktion der ersten D-Psicose zu Allitol eine Aminosäuresequenz umfasst, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 10 oder SEQ ID Nr. 12 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ. ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 11 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 11 bindet.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Alkoholdehydrogenase eine Aminosäuresequenz umfasst oder aus dieser besteht, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 18 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 17 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 17 bindet.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der durch die Reduktion entstandene oxidierte Kofaktor NAD(P)+ mittels einer Glucose-Dehydrogenase und D-Glucose unter Bildung von D-Gluconat reduziert wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Glucose-Dehydrogenase eine Aminosäuresequenz umfasst oder aus dieser besteht, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 20 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 19 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 19 bindet.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der durch die Reduktion entstandene oxidierte Kofaktor NAD(P)+ mittels einer Formiat-Dehydrogenase und Formiat unter Bildung von CO2 reduziert wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Formiat-Dehydrogenase eine Aminosäuresequenz umfasst oder aus dieser besteht, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 2 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ. ID Nr. 1 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 1 bindet.
13. Verwendung einer wässerigen Lösung herstellbar durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines Sirups enthaltend D-Psicose.
14. Verwendung einer Oxidoreduktase zur Bildung von D-Psicose aus Allitol, dadurch gekennzeichnet, dass die Oxidoreduktase eine Aminosäuresequenz umfasst, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 10 oder SEQ ID Nr. 12 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 11 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9 oder SEQ ID Nr. 11 bindet.
15. Verwendung einer Alkoholdehydrogenase zur Kofaktor-Regeneration, wobei die Alkoholdehydrogenase eine Aminosäuresequenz umfasst oder aus dieser besteht, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 18 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 17 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 17 bindet.
16. Verwendung einer Glucose-Dehydrogenase zur Kofaktor-Regeneration, wobei die Glucose- Dehydrogenase eine Aminosäuresequenz umfasst oder aus dieser besteht, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 20 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ. ID Nr. 19 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 19 bindet.
17. Verwendung einer Formiat-Dehydrogenase zur Kofaktor-Regeneration, wobei die Formiat- Dehydrogenase eine Aminosäuresequenz umfasst oder aus dieser besteht, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 2 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 1 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 1 bindet.
18. Verwendung einer F O-bildenden NAD(P)H-Oxidase zur Kofaktor-Regeneration, welche eine Aminosäuresequenz umfasst oder daraus besteht, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einer Aminosäuresequenz, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 14 oder SEQ ID Nr. 16 von mindestens 80% aufweist, ii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die eine Identität zu SEQ ID Nr. 13 oder SEQ ID Nr. 15 von mindestens 80% aufweist, und iii) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 13 oder SEQ ID Nr. 15 bindet.
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