ES2041967T4 - Metodo para determinar la presencia de cadenas ligeras libres en muestras de orina, complejo de preparaciones para la realizacion del metodo y reactivo correspondiente. - Google Patents
Metodo para determinar la presencia de cadenas ligeras libres en muestras de orina, complejo de preparaciones para la realizacion del metodo y reactivo correspondiente.Info
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Abstract
PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE CADENAS LUMINICAS LIBRES (PROTEINA BENCE JONES) EN LA ORINA, SE PROPONE UN METODO QUE EXIGE HACER REACCIONAR LA MUESTRA CON UN REACTIVO ANTISUERO ANTI CADENA LUMINICA LIBRE, DONDE LA PRESENCIA DE DICHAS CADENAS SE PONE DE MANIFIESTO POR LA TURBIDEZ DE LA MUESTRA QUE REACCIONA. POR COMPARACION CON LA TURBIDEZ DE CALIBRADORES QUE TIENEN CONCENTRACIONES PREDETERMINADAS ES POSIBLE ENCONTRAR LOS VALORES DEL ANALISIS CUANTITATIVO. UN EQUIPO PARA REALIZAR EL ANALISIS INCLUYE REACTIVO ANTISUERO ANTI CADENA LUMINICA LIBRE, CALIBRADOR Y REACTIVO SIN ANTISUERO.
Description
Método para determinar la presencia de cadenas
ligeras libres en muestras de orina, complejo de preparaciones para
la realización del método y reactivo correspondiente.
Es conocido que una inmunoglobulina está
constituida, esquemáticamente, por dos cadenas pesadas y por dos
cadenas ligeras. La determinación de la presencia de las cadenas
ligeras libres, también denominadas proteínas por
Bence-Jones, en la orina es de gran interés desde el
punto de vista de los diagnósticos.
Las cadenas ligeras libres están presentes en
trazas en el suero de individuos normales pero están prácticamente
ausentes en la orina. La presencia de dichas cadenas ligeras en la
orina es una indicación de la existencia de un estado patológico,
particularmente de naturaleza inmunológica.
Realmente, la presencia de cadenas ligeras libres
en la orina hace presuponer su aumento anómalo en el suero del
individuo pero, dado su bajo peso molecular, las cadenas ligeras
libres atraviesan el filtro glomerular y no persisten en la sangre.
Por ello es necesario realizar una investigación indirecta que
determine su presencia en la orina.
La presencia de cadenas ligeras libres en la
orina, que es consecuencia de su aumento en la sangre, está asociada
con patologías inmunológicas que pueden resumirse como (a) la
presencia de cadenas ligeras libres monoclonales, es decir
enfermedades inmunoproliferantes tales como mieloma múltiple,
mieloma micromolecular, macroglobulinemia de Waldenstrom, leucemia
linfática crónica y amiloidosis primitiva; y (b) la presencia de
cadenas ligeras libres policlonales, es decir enfermedades
hiperinmunológicas tales como lupus eritematoso sistémico, artritis
reumatoidea aguda y amiloidosis secundaria.
Los métodos de diagnosis basados en la
determinación de las cadenas ligeras libres en la orina son de gran
interés pero actualmente están bloqueados por las dificultades de
realización de una investigación de este género. Actualmente el
método más ampliamente utilizado requiere el análisis
electroforético de la orina concentrada.
Esta técnica exige necesariamente una
concentración de la muestra debido al porcentaje relativamente
pequeño de cadenas ligeras libres en el líquido orgánico incluso con
estados patológicos graves del individuo. El examen electroforético
de la muestra no concentrada origina una sensibilidad
inaceptablemente baja y la consiguiente falta de fiabilidad. El
tiempo necesario para la concentración se añade, sin embargo, al
tiempo necesario para el análisis electroforético, con las
desventajas obvias. El análisis realizado en las muestras
concentradas eleva indudablemente la fiabilidad de los resultados
pero sin embargo no logra una certitud razonable. En las muestras
que resultan ser sospechosas bajo electroforesis es por ello muy
aconsejable realizar ensayos de inmunofijación o de
inmunoelectroforesis, cuya complejidad y coste son conocidos, para
lograr niveles realmente satisfactorios de sensibilidad y por lo
tanto fiabilidad de los resultados de análisis.
Un método diferente de detectar la presencia de
cadenas ligeras libres en muestras de orina se describe en Scand. J.
Clin. Lab. Invest. 1984, 44(2), 173-6 que
revela la medida turbidimétrica de proteínas de
Bence-Jones con antisueros de anticadenas ligeras.
Este documento enseña a concentrar las proteínas de
Bence-Jones a partir de la orina y no da ninguna
indicación de la cantidad relativa de los antisueros de anticadenas
ligeras. Sin embargo este documento de la técnica anterior evalúa
este tipo de resultados de medida en un artefacto provocado por
diferentes formas poliméricas de cadenas ligeras.
El Journal of Immunological Methods 39 (4),
355-362 (1980) describe también la medida
turbidimétrica pero sólo de kappa- y de lambda-IgG
del suero y con dos anticuerpos monoclonales diferentes.
La patente EP-A-0
044 219 revela el análisis de kappa- y de lambda-IgG
por medio de la precipitación con dos anticuerpos monoclonales
específicos para con dos sitios antígenos específicos de la IgG.
El análisis de las proteínas de
Bence-Jones realizado por métodos normales distintos
del análisis turbidimétrico se describe, por ejemplo, en la patente
US-A-3 907 502.
El objetivo de la invención es proponer un método
de determinación cualitativa y cuantitativa de la presencia de
cadenas ligeras libres en la orina que pueda realizarse fácilmente
en tiempos extraordinariamente cortos y con un alto grado de
sensibilidad, especialmente en comparación con los tiempos
necesarios en los procedimientos de análisis utilizados
actualmente.
Además, es un objetivo de la invención hacer
disponible para el usuario un complejo o conjunto de substancias en
forma de kit adecuadas para poner en práctica el método propuesto de
diagnóstico.
La invención se basa en la observación de que una
reacción de antígeno-anticuerpo es utilizable para
la determinación de la presencia de las cadenas ligeras libres en la
orina sin una previa concentración, conduciendo a valores de
turbidez que permiten determinar la presencia de tales cadenas con
una fiabilidad cualitativa y cuantitativa importantes. En particular
la invención propone un método de diagnóstico basado en la
determinación de la concentración de cadenas ligeras en la orina que
comprende las fases de (a) centrifugación de la muestra de orina y
separación del sobrenadante, (b) adición a la muestra de un reactivo
antisuero de anticadenas ligeras libres que trabaja con un exceso de
anticuerpos, y (c) determinación de la turbidez de la muestra
reaccionada.
En particular, si se requiere una determinación
cuantitativa el método preconiza la adición del reactivo antisuero a
una muestra de calibrado que contiene cadenas ligeras libres en una
cantidad predeterminada para obtener curvas de calibrado para el
proceso de análisis cuantitativo por comparación de turbideces.
El antisuero de anticadenas ligeras puede
obtenerse por medio de cualquiera de los procesos conocidos para
esta finalidad, en general a partir de un animal inmunizado con
cadenas ligeras libres.
Se conocen dos tipos de cadena ligera,
denominados convencionalmente "kappa" y "lambda", que
pueden utilizarse para la inmunización de animales a fin de obtener
los correspondientes antisueros.
Un antisuero de este tipo reacciona con todos los
sitios antígenos de la cadena ligera incluyendo los que pueden
definirse como "ocultos", cuando la cadena ligera está unida a
la cadena pesada. Este antisuero muestra entonces tanto las cadenas
ligeras unidas como las cadenas ligeras libres.
Es posible obtener un antisuero de anticadenas
ligeras libres por separación del mismo de los anticuerpos dirigidos
hacia los sitios antígenos no "ocultos" por la cadena ligera;
esto puede lograrse haciendo reaccionar el antisuero de anticadenas
ligeras libres con inmunoglobulinas enterizas y recuperando los
anticuerpos que no han reaccionado. Un antisuero de este tipo
reacciona sólo con cadenas ligeras libres kappa o lambda
respectivamente y no reacciona con cadenas ligeras unidas.
Para clarificar mejor las características del
método según la invención se describe a continuación una realización
práctica del mismo.
Un kit de productos necesarios para realizar el
análisis según la invención incluye típicamente los siguientes
componentes.
(a) Reactivo antisuero de anticadenas ligeras
libres compuesto por antisuero diluido, por ejemplo a
concentraciones de 20% de antisuero de anticadenas ligeras kappa
libres, 20% de antisuero de anticadenas ligeras lambda libres y 60%
de una disolución al 4% de PEG 6000 en una disolución tampón
fisiológica (PBS) (tampón fosfato a pH 7,4). Es ventajoso añadir un
conservante tal como azida sódica al 0,1%.
(b) Calibradores.
Estos pueden utilizarse como controles positivos
del proceso cualitativo y como calibradores para el proceso
cuantitativo.
Las muestras utilizadas proceden de pacientes con
mieloma micromolecular secernante. En ausencia de método alguno de
referencia en la literatura, la electroforesis se realizó en las
proteínas urinarias, observándose la presencia de una amplia banda
tipificada luego con inmunofijación como cadenas ligeras kappa y
lambda libres, acompañadas por una banda de albúmina visible al ojo
desnudo. Por ello se considera que la cantidad de proteínas totales
coincide prácticamente con la cantidad de cadenas ligeras libres. La
dosificación de las proteínas totales se realizó por medio del
método de Bradford. Las muestras se secaron por congelación con la
adición de conservante (1% de azida sódica) para diluirlas con agua
destilada para el uso y entonces con PBS para trazar la curva normal
o standard del proceso cuantitativo.
(c) Reactivo sin antisuero. La composición de
este reactivo es la misma que la del reactivo antisuero pero sin el
último y está destinado a ser utilizado en el proceso de control y
de calibrado como elemento standard de comparación.
El proceso de trabajo para la realización del
análisis según la invención puede resumirse como sigue.
Los reactivos, con y sin antisuero, se disponen a
temperatura ambiente, filtrándose el volumen de los primeros
necesario para el análisis si no estuviera límpido.
El reactivo sin antisuero se mezcla en un tubo de
ensayo con el calibrador y la substancia reaccionada resultante debe
ser límpida.
Entonces el reactivo antisuero se mezcla con el
calibrador y la substancia reaccionada debe ser turbia.
Si las lecturas no son las esperadas ello es
debido a un error de procedimiento o a una anomalía de los reactivos
y estos deben por ello descartados.
Después de la centrifugación de la muestra, se
trata con reactivo antisuero. La turbidez es un signo de la
presencia de cadenas ligeras kappa o lambda o de ambas.
Los detalles de los procesos para realizar la
reacción de antisuero-muestra no se dan aquí puesto
que son los usuales seguidos en la realización de reacciones
antígeno-anticuerpo. Es evidente que la operación se
realizará con un exceso del último y que, para muestras dudosas o
negativas, puede añadirse una cantidad adicional de orina al tubo de
ensayo de la reacción y luego determinar si dicha adición modifica
apreciablemente la turbidez.
Para la lectura instrumental de la cantidad la
curva de calibrado debe construirse repitiendo el proceso de
análisis con reactivo de antisuero sobre muestras obtenidas a partir
de disoluciones en varios porcentajes de calibrador en disolución
tampón salina.
Por ejemplo, pueden determinarse valores de
turbidez sobre disoluciones de calibrador al 20, al 40, al 60, al 80
y al 100%. Es así posible presentar en un sistema de coordenadas las
concentraciones de cadenas ligeras libres de las disoluciones de
calibrador sobre la base de la densidad óptica en comparación con el
elemento standard de comparación, midiendo con un instrumento
adecuado tal como el fotómetro Biotron Mod. 336 o el analizador
Cobas Bio (Roche).
Como se ha mencionado anteriormente, la
concentración de cadenas ligeras libres en el calibrador presentado
como secado por congelación a reconstituir por dilución en una
cantidad predeterminada de agua destilada es conocida.
Una alternativa al anterior proceso es posible
mediante el uso, no de un solo reactivo antisuero de anticadenas
ligeras libres kappa y lambda, sino de dos reactivos independientes
de anticadenas ligeras libres kappa y lambda, respectivamente. De
esta manera se obtienen resultados independientes de concentración
de los dos tipos de cadenas cuando se desea por necesidades
particulares de diagnóstico o de experimentación. No cambia nada más
en el proceso antes mencionado. En este caso es aconsejable preparar
previamente calibradores de kappa y lambda, respectivamente, para
las comprobaciones previas al proceso de análisis de las muestras y
la construcción de curvas de calibrado para el análisis
cuantitativo.
Los resultados del análisis se verificaron
realizando un examen electroforético convencional de las muestras
analizadas según la invención, obteniendo la confirmación de la
corrección de los resultados obtenidos. Las muestras que demostraron
ser negativas bajo el examen electroforético convencional
demostraron ser positivas cuando se concentraron de 10 a 50 veces
según las prácticas de los diferentes laboratorios.
La eficacia singular y sorprendente del método
viene demostrada por el hecho de que una concentración de
aproximadamente 4 mg/dl de cadenas ligeras se valoró con el mismo,
demostrando que el uso en este campo específico de la técnica de
reacción antígeno-anticuerpo ha conducido a
resultados satisfactorios para el problema de identificación de
cadenas ligeras libres en la orina.
Prácticamente el único límite del método es su
incapacidad para distinguir entre cadenas ligeras monoclonales y
policlonales que es posible utilizando análisis electroforéticos con
inmunofijación.
Sin embargo, la naturaleza positiva del análisis
para una sola de las dos cadenas ligeras, kappa o lambda puede
considerarse un signo razonablemente cierto de monoclonalidad de las
cadenas presentes en la muestra.
Pero esta limitación está ampliamente compensada
por la velocidad, la fiabilidad, la simplicidad de la realización
del método según la invención en comparación con el previamente
utilizado para esta finalidad. Sólo en las muestras que demuestren
ser positivas bajo análisis según la invención se requerirá realizar
otros análisis inmunoelectroforéticos o con inmunofijación para
determinar la naturaleza de las cadenas ligeras libres, si se
desea.
En este momento debe observarse que en este tipo
de análisis de diagnóstico la positividad debe considerarse, si no
rara, ciertamente muy infrecuente desde el punto de vista
estadístico. Así es muy útil poder disponer del método según la
invención que permite una primera selección de las muestras con una
sensibilidad y una fiabilidad muy altas del resultado debido a que
los exámenes pueden realizarse posteriormente sobre el limitado
número de muestras que demuestren ser positivas con el análisis.
Claims (10)
1. Método de determinación de la presencia de
cadenas ligeras libres en muestras no diluidas y no concentradas de
orina, que comprende las fases de (a) centrifugación de la muestra
de orina y separación del sobrenadante para la realización de la
determinación, (b) adición a la muestra de un reactivo antisuero de
anticadenas ligeras que trabaja con anticuerpos en exceso, y (c)
determinación de la turbidez de la muestra reaccionada.
2. Método según la reivindicación 1, en el cual
la muestra se hace reaccionar sucesivamente con antisueros de
anticadenas ligeras libres kappa y lambda, respectivamente.
3. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque la turbidez de la muestra reaccionada se
determina por comparación con el producto de reacción del reactivo
antisuero con un calibrador que tiene un contenido predeterminado de
cadenas ligeras libres.
4. Método según la reivindicación 3,
caracterizado porque se construye para la comparación una
curva de calibrado, determinando instrumentalmente el valor de
turbidez del producto de reacción del reactivo antisuero con
muestras constituidas por disoluciones de calibrador a varias
concentraciones.
5. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque el reactivo se obtiene por inmunización
de animales con cadenas ligeras libres.
6. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque el calibrador se obtiene a partir de la
orina de pacientes con mieloma micromolecular.
7. Complejo de productos en forma de kit para
determinar la presencia de cadenas ligeras libres en muestras de
orina no concentradas, compuesto por (a) un reactivo antisuero de
anticadenas ligeras libres, (b) un reactivo sin antisuero con una
composición substancialmente igual que la del reactivo antisuero y
(c) un calibrador compuesto por una substancia que contiene cadenas
ligeras libres a una concentración predeterminada.
8. Complejo de productos según la reivindicación
7, caracterizado porque dicho reactivo antisuero contiene
anticuerpos de anticadenas ligeras libres kappa y lambda.
9. Complejo de productos según la reivindicación
7, caracterizado porque dicho reactivo antisuero está
contenido en el complejo de productos como cantidades independientes
de antisuero de anticadena ligera kappa y antisuero de anticadena
ligera lambda.
10. Complejo de productos según la reivindicación
7, caracterizado porque dicho calibrador está compuesto por
una substancia secada por congelación a partir de la orina de
pacientes afectados de mieloma micromolecular y que debe
reconstituirse con agua destilada antes del uso.
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