JPH0692969B2 - 免疫的測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は免疫的測定方法、さらに詳しくは、抗原または
抗体を定量的に測定するのに好適な免疫的測定方法に関
するものである。

〔従来の技術〕

従来、体液成分たとえば、イムノグロブリンG.A.M,捕体
C3,C4,CRP,RF等の測定方法として、多量の検体を処理す
る方法としてコンピューターを内蔵した自動分析装置を
用いて行う比濁法、ラテックス比濁法、レーザー光散乱
法等の測定方法がある。

これらの方法は、溶液中での抗原抗体反応による光学的
性質の変化を、透過光又は散乱光の変化としてとらえ、
これを、その都度予め濃度既知の標準物質を測定するこ
とにより作成されている検量線との比較において濃度を
決定する方法である。

この自動分析装置を用いて測定を行う従来方法の操作手
順をさらに具体的に述べると以下の通りである。即ち、 測定する試薬（検体）をキュベット等の容器に入れ、
自動分析装置にセットし適温（37℃）にインキュベート
する。

標準物質を用いて検量線を作成する。

−１ 測定項目に対応して、装置内蔵のROM又はパソ
コンに入力されている検量線の所定の計算式、例えば、
Ｙ＝Ax＋B/xを呼び出す。

−２ 標準物質の測定により上記パラメーターＡ及び
Ｂの値を決定する。

−３ 上記決定したパラメーターＡ及びＢに基づき上
記計算式により検量線を完成する。

検体を測定し、その抗原または抗体の濃度を上記検量
線を用いて決定する。

そして、上記従来の方法においては、一回の連続的測定
（多量の検体を測定する場合は、１日に400〜500検体に
ついての連続的測定が行われる。）が終了し、翌日乃至
一週間程度後に新たに測定を行う際には、測定開始前に
その都度検量線を新たに作成してから測定することが必
須とされている。

これを、試薬メーカーとユーザーとの役割分担について
見れば、次のようになる。

（試薬メーカー） 試薬の製造 グラフ等で検量線を作成し、この検量線に対応する計
算式、例えば、Ｙ＝Ax＋B/xを決定する。そして、この
計算式がユーザーに知らされる。

（ユーザー） 検体の測定開始前に最初に濃度既知の標準物質の測定
を行い、その測定結果により、前記計算式のパラメータ
ーの値を決定し前記計算式による検量線を完成する。

上記完成した検量線に基づき、検体の一回の連続的測
定を行う。

新たに測定を開始する毎に上記及びをくりかえし
て検体の測定を行う。

これらの従来の方法は、キャリブレーションシステムと
いわれる測定方式であって、少数の検体の測定を行う場
合や、緊急性のある検体の測定においては、その都度検
量線を作成する点が非常に問題となるものである。ま
た、測定開始前に、毎回標準物質を測定して検量線を作
成するため試薬の効率的使用が困難である。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って本発明の目的は前記検体の新たな測定に際し、そ
の都度検量線を作成することなく試薬調製時に作成され
た検量線又は試薬調製時に導かれたパラメーターに基づ
き検体測定時に作成された検量線を用いて被検物の濃度
を計算する免疫的測定方法を提供することである。

また本発明の目的は非連続的な検体中の被検物の濃度を
効率的に測定する免疫的測定方法を提供する。

更にまた本発明は免疫的測定方法の新規なシステムを提
供する。

本発明の更に詳しい目的は以下の説明から自ら明らかに
なるであろう。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明の最大の特徴は抗原又は抗体を固定化したラテッ
クス試薬を用いた抗原抗体反応によって生ずる免疫複合
体による濁度の変化から、透過光の減少又は散乱光の増
加信号の一定時間後の値、あるいは最大速度又は最大加
速度の値を基準として検量線を作成し、該検量線を用い
て被検物の濃度を測定する反復濃度測定方法において、
前記ラテックス試薬としてその平均粒子径（Ｄ）が0.1
〜0.5μｍ、ラテックス粒子の平均粒子径（ｄ）に対す
るラテックス試薬の平均粒子径（Ｄ）の比（D/d）が1.3
〜3.0、ゼータ電位が−20mV〜10mVの範囲且つ吸光度が
光路長10mmで0.5〜1.5の範囲にあるものを用い、試薬調
製後の試薬保証期間内における該測定を非連続的に実施
する際の新たな測定に際し、測定開始前にその都度濃度
既知の標準物質を用いて検量線を作成することなく、試
薬調製時に作成された検量線又は試薬調製時に導かれた
パラメーターに基づき検体測定時に作成された検量線に
より、被検物の濃度を計算することを特徴とする免疫的
測定方法である。

本発明の免疫的測定方法の測定手順を、既に従来技術に
おける自動分析装置を用いた免疫的測定方法でのべた操
作手順と対比した形で説明すると、次の通りである。

測定する試薬をキュベット等の容器に入れ、自動分析
装置にセットし適温（37℃）にインキュベートする。

検量線を作成する。

−１ 測定項目に対応して、装置内蔵のROM又はパソ
コンに入力されている検量線の所定の計算式、例えば、
Ｙ＝Ax＋B/xを呼び出す。

−２ 試薬キットに添付された磁気媒体に記録されて
いるパラメーター、例えばＡ及びＢ、の値を入力するこ
とにより検量線を完成する。

検体を測定し、抗原又は抗体の濃度を決定する。

そして、上記本発明の方法においては、同一ロットの試
薬についてのパラメータは同一であるから、試薬調製後
の保証期間内は、同一ロットの試薬を使用しての非連続
的な反復的測定に際し、前記従来方法における如き測定
開始前にその都度濃度既知の標準血清を用いて検量線を
作成する操作は行わず、試薬調製時に作成された上記検
量線により、被検物の濃度の測定が行われることとな
る。また上記検量線の作成は前記試薬調製時に必らずし
も作成する必要はなく、前記パラメーターのみを試薬調
製時に決定しておき、このパラメーターに基づき測定時
に作成してもよい。

これを試薬メーカーとユーザー側との役割分担について
見れば、次のようになる。

（試薬メーカー） 試薬の製造 検量線の作成 濃度既知の標準物質を使用しての検量線の作成を行う。
即ち、 測定項目に対応した検量線の計算式、例えば、Ｙ＝Ax＋
B/xを作成しコンピューターに入力する。

また、試薬に対応するパラメーター、例えばＡ及びＢの
決定も行う。

前記作成した検量線又はパラメーターに関する情報の
記録を行う。

前記記録媒体としては、次のようなものである。

i.磁気カード;ICカード；パンチカード等のカード類 ii.磁気テープ；カセットテープ等のテープ類 iii.フロッピーディスク iv.グラフ用紙 なお、記録媒体がグラフ用紙の場合は計算式のコンピュ
ーター入力は行わない。

（ユーザー） 試薬メーカーが試薬製造時に検量線が作成されていな
いときは予め決定したパラメーターを入力することによ
って、その試薬に対応した検量線を完成する。

検体を非連続的に測定し、その都度新たな検量線を作
成せず上記予め作成された検量線を用いて被検物の濃度
を決める。

この本発明の方法は、ノンキャリブレーションシステム
といわれる方式であって、これを更にくわしく述べれ
ば、試薬調製時に作成された検量線とは、溶液中での抗
原抗体反応による光の透過率の減少又は散乱の増加を測
定する方法において、被検物に対する抗体又は抗原で感
作されたラテックスよりなる測定試薬を調製した際にこ
の試薬と濃度既知の被検物とを反応させ被検物と濁度及
び又は濁度の増加の関係を１つ又は複数の直線あるいは
曲線を単独又は組み合わせて作成したものである。上記
検量線は試薬調製時に完成させるのが最も一般的である
が、検量線を決めるための上記直線あるいは曲線の式だ
けを予め決定しておき直線あるいは曲線の係数となるパ
ラメーターを別に用意し、検体測定時に該パラメーター
から検量線を完成させてもよい。この検量線をあらかじ
めグラフ上に記録しておいた場合には、これを用いて日
常の非連続的な被検物の測定に際しても、毎回濃度既知
の標準物質を用いるこなく測定が出来る。また前記の検
量線又はパラメーターは、前記のように磁気カード、IC
カード等のカード類；フロッピーディスク；カセットテ
ープ、磁気テープ等のテープ類の記録媒体に記録しコン
ピューターの利用により濃度既知の標準物質を用いるこ
となく被検物濃度を計算できる。

上記記録媒体に記録される情報を検量線にするのか或い
は検量線を作成するためのパラメーターにするのかは必
要に応じて決定すればよいが一般には記録媒体の記録の
ための容量で決定される。例えばカード類を記録媒体と
するときは記録容量が一般に少ないので上記パラメータ
ーを記録媒体に記録するのが好ましい。記録媒体の記録
容量が多いもの例えばフロッピーディスク、テープ類を
使用するときは検量線を記録するのが好ましい。

詳しく説明すれば上記検量線は、被検物濃度をｙとし、
濁度の変化を表わす値をｘとすると、一般的な関数の型
ｙ＝ｆ（ｘ）（ここでｆ（ｘ）＝a₁xn＋a₂xn^-1……an₊₁
又はａ▲^′ _１▼logx又はea▲^″ _１▼ｘ等）で近似するこ
とができる。一般に例えば試薬製造時に行なった被検物
濃度の濁度の変化を表わす値との関係を近似する式のパ
ラメーター（定数項）を最小二乗法を用いて決定する。
このパラメーターを前記関数の定数とすれば検量線を定
めることが出来る。上記検量線又はパラメーターと関数
の型（a₁xn…an₊₁又はａ▲^′ _１▼logxまたはea▲^″ _１▼
ｘ等）を記録媒体に記録する。

上記パラメーターが記録媒体に記録されているときは、
濃度未知の検体を測定する前に或いは該測定後に該パラ
メーターを用いて検量線を作成する必要がある。

未知濃度の検体は試薬と反応させることによって濁度が
変化する。この濁度の変化を測定することにより、前記
検量線を用いて被検物の濃度を算出出来る。一般には前
記検量線をコンピューターにインプットし、更に上記濁
度の測定値又は濁度の変化量をインプットするとき、被
検物の濃度が算出出来るプログラムをコンピューターに
入力すると好ましい。該プログラムは特に工夫する必要
はなく通常当該分野で利用されているものをそのまま使
用すればよい。

本発明で用いるラテックス試薬は使用期間内にわたって
安定なものを調製又は選択して使用するものであり、前
記ラテックス試薬はその平均粒子径（Ｄ）が0.1〜0.5μ
ｍで且つラテックス粒子の平均粒子径（ｄ）に対するラ
テックス試薬の平均粒子径（Ｄ）の比（D/d）が1.3〜3.
0の範囲でかつゼータ電位−20mV〜10mVの範囲でさらに
吸光度が光路長10mmで0.5〜1.5の範囲にある長期間安定
なラテックス試薬を用いる。上記ラテックス粒子の種類
は抗原抗体反応に使用されるものが種々知られていて本
発明にあってもこれらの公知のラテックス粒子が特に限
定されず使用出来る。特に好適に使用されるものを例示
すると例えばポリスチレン，スチレン−ブタジエン共重
合体，スチレン−メタクリル酸共重合体，ポリメチルメ
タアクリレート，ポリグリシジルメタクリレート，アク
ロイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体
の様な乳化重合により得られる有機高分子ラテックス，
あるいはシリカ，シリカ−アルミナ，アルミナの様な無
機酸化物又は該無機酸化物等にシランカップリング処理
等の操作で官能基を導入した無機粒子等である。

本発明に於いて使用する抗体又は抗原は、特に限定的で
なく、公知のものが使用できる。好適に使用される代表
的なものを例示すれば、例えば、変性ガンマグロブリ
ン，抗核因子，ヒトアルブミン，抗ヒトアルブミン抗
体，イムノグロブリンＧ（IgG），抗ヒトIgG抗体，イム
ノグロブリンＡ（IgA），抗ヒトIgA抗体，イムノグロブ
リンＭ（IgM），抗ヒトIgM抗体，抗ヒトIgE抗体，スト
レプトリジンO,ストレプトキナーゼ，ヒアルロニダー
ゼ,C−反応性蛋白（CRP），抗ヒトCRP抗体，アルファ−
フエトプロティン（AFP）、抗AFP抗体，癌胎児性抗原
（CEA），抗ヒトCEA抗体，ヒト絨毛性ゴナドトロピン
（HCG），抗HCG抗体，抗エストロゲン抗体，抗インシュ
リン抗体,B型肝炎表面抗原（HBs），抗HBs抗体，梅毒ト
レポネマ抗原，風疹抗原，インフルエンザ抗原，補体C₁
q,抗C₁q抗体，抗C₅抗体、抗C₄抗体，抗トランスフエリ
ン抗体，等である。

本発明において抗原抗体反応によって生ずる免疫複合体
による濁度又は濁度の変化を測定する装置は特に限定さ
れず公知のものが使用出来る。一般には分光光度計、光
散乱光度計、濁度計等が好適に使用出来る。特に透過光
の減少を測定出来る分光光度計が好適である。一般には
透過光を測定する場合においては、特定の波長が選択で
き試薬と検体を混合する撹拌機構を有し、特定の温度に
セルと試薬を保温でき、検体添加の信号を受信後、抗原
抗体反応の生成による透過光信号の変化を連続的に追跡
できるものであれば良い。更に、この信号の変化から１
次微分、２次微分の信号を出力できる回路を有すること
が望ましい。

本発明の測定方法に使用する具体的な測定装置のブロッ
ク図を第１図に示す。光源１による光束は先ず分光素子
２に照射され、ここで特定波長の光が選択された後、あ
らかじめ反応試薬が封入された反応キュベット３に照射
される。反応キュベット３を透過した光は光検出器５に
より受光されて電気的信号に変換される。この透過光量
にもとずく電気的信号は増幅器６により増幅され、１つ
は直接コンピューター８により演算処理されて抗原ある
いは抗体の濃度が算出され、データ表示部10に表示され
る。また、平行して電気的信号は微分回路７により微分
処理、すなわち透過光量の変化速度（dA/dt）が求めら
れ、コンピューター８により演算処理され、抗原あるい
は抗体の濃度が算出されてデータ表示部10に表示され
る。

さらに、本発明を実施するにあたり検量線に必要な情報
を入力する入力装置９、反応キュベット３の撹拌機構
４、及び検体分注機構11より装置は構成される。

光源１は例えば通常のタングステンランプを使用するこ
とができ、反応キュベット３は例えば内径7mmの透明な
ガラスあるいは合成樹脂（例えばポリスチレン）製のキ
ュベットでよい。

分光素子２は通常の干渉フィルターを使用することがで
き、本発明に供される測定波長は抗原−抗体反応の方式
により最適なものを選ぶことができる。また、光検出器
５は通常のフォトセルでよく、検量線に必要な情報を入
力する入力装置９は例えば磁気カードリーダー、カセッ
トテープレコーダー、ディスクドライブユニット、バー
コードリーダーなどが使用できる。

そして、本発明の測定方法は、以下に説明するモノテス
ト試薬を使用した測定方法において特に有効である。す
なわち、 モノテスト試薬は、１検体分の試薬を分注してあり、試
薬の容器が実質的に光を通すことのできる透明あるいは
半透明のプラスチック製例えばポリスチレン，ポリメチ
ルメタクリレート，ポリ塩化ビニル，ポリプロピレン等
を材質とした或いはガラス製の試験管及び光学測定用セ
ルを兼用しているため、ユーザーは試験管及び光学測定
用セルを別に準備する必要がなく、試薬は分注済である
ため器具（ピペット類）も不必要である。更に、ディス
ポーザブルであるため使用後は廃棄し、試験管やセルの
洗浄の必要がない。また、試薬の充填は管理された製造
工程により行われるため、分注誤差が小さく再現性の良
い成績が得られる。そして、緊急に持ち込まれた検体に
対しても必要な測定回数の試薬を準備するだけでよく、
また、試薬を取り違えることも起こりにくい。

上記のように、モノテスト試薬は小数の検体の処理に非
常に適しているものである。しかし、このモノテスト試
薬を用いて測定をする場合において、既に述べた従来の
測定方法による場合、ユーザーは測定日毎に検量線を作
成するため数本の標準液を測定しなければならない。そ
して、このような測定日毎の標準液の測定は、１日に多
量の検体を処理する施設では、大きな負担とはならない
が、１日に数本の未知試料しか測定しないような場合に
は、それがかなりの負担となり、上記のモノテスト試薬
による測定のメリットを十分に活かすことができないも
のである。

これに対し、本発明の測定方法においては、ユーザーは
試薬調製後の試薬の保証期間内、例えば、６カ月間の内
の反復的測定においては、その都度検量線作成のために
標準物質の測定を行う必要がないから、モノテスト試薬
による測定のメリットをフルに活かすことが可能となる
ものである。

なお、本発明の免疫的測定方法に用いるキットは、上記
試薬、特に好ましくはモノテスト試薬、と上記のように
試薬調製時に作成された検量線又は検量線を完成するた
めのパラメーターが記録された記録媒体、例えば前記カ
ード類、テープ類又はフロッピーディスク等とを適宜組
み合わせることにより作成される。

本発明の免疫的測定方法をシステマティックに説明する
と下記の通りである。

先ず抗原抗体反応によって生ずる免疫複合体による濁度
の変化から、透過光の減少又は散乱光の増加信号の一定
時間後の値、あるいは最大速度又は最大加速度の値を基
準として検量線又は該検量線を作成するためのパラメー
ターを決定する検量線測定部を必要とする。この検量線
測定部では被検物の濃度既知の試薬にもとづき前記した
ように或いは後述する実施例で示すように、被検物濃度
ｙと抗原抗体反応に伴う濁度の変化を表わす値ｘとの間
の関数ｙ＝ｆ（ｘ）を決定する。同時に上記ｆ（ｘ）に
関する数式の定数（パラメーター）については一般に最
小二乗法を用いて決定する。上記検量線測定部に於いて
作成する検量線又は検量線を作成するためのパラメータ
ーは検体中の被検物の濃度を算出するための唯一の検量
線又は該検量線を作成するためのパラメーターとなるも
のであるから最も重要な操作部となる。

上記検量線測定部で作成された検量線又はパラメーター
は記録媒体に記録されて保管され、例えば試薬メーカー
からユーザーへ伝達される。上記記録媒体は保管、伝達
及び取扱いの容易性から一般には前記カード類，テープ
類，フロッピーディスク等を用いるのが好適である。

上記検量線又はパラメーターが記録された記録媒体から
これらの情報はコンピューターを内蔵する分析装置のコ
ンピューターに供給され演算部にインプットされる。該
情報がパラメーターである場合は、該パラメーターから
検量線を作成する必要がある。従って該パラメーターを
記録媒体の情報とするときは、同時にまたは別に検量線
を作成する関数式をコンピューターに予め又は同時に入
力し、コンピューターによって検量線を作成するのが好
ましい。上記演算部では検体中の被検物の抗原抗体反応
によって生ずる濁度又は濁度の変化を測定する検体測定
部から伝達される濁度又は濁度の変化に基づき前記検量
線を使用して被検物の濃度を算出し、アウトプットする
ようにすればよい。該演算部で、インプット情報からア
ウトプット条項を算出するために利用するプログラムは
特に特徴的なものではなく当該分野の自動分析装置など
で利用されている公知のもの或いは公知のものを必要に
応じてアレンジしたものを使用すればよい。

上記演算部へのインプット情報として必要な要素の１つ
は検体中の被検物が試薬と抗原抗体反応を生起するとき
に生ずる濁度又は濁度の変化である。かかる情報は前記
添付図面で説明した検体測定部によって測定される。該
検体測定部での操作は前記した通り、検体中の被検物と
試薬との抗原抗体反応によって生ずる濁度又は濁度の変
化を光検出器でキャッチし、その情報を利用するのが一
般的である。

上記説明から明らかなように本発明は、検量線測定部、
記録部、検体測定部及び演算部を機能的に結びつけた免
疫的測定システムとして著しく価値を有するものであ
る。

本発明を更に詳しく説明するために以下実施例を挙げて
説明するが本発明はこれらの実施例にのみ限定されるも
のではない。

〔実施例〕

実施例１ （１） リウマチ因子測定試薬の調製 平均粒子径0.178μｍのポリスチレンラテックス粒子を
ホウ酸緩衝液（0.1M PH8.2,NaCl0.05M,以下BBSと略す）
で希釈しラテックス濃度が１重量％の懸濁液を調製す
る。次いで60℃で10分間加熱処理したヒトIgGをBBSによ
り希釈しその濃度を1mg/mlに調整する。上記ラテックス
懸濁液１容に加熱変性ヒト溶液１容をラテックス試薬の
平均粒子径Ｄがラテックス粒子の平均粒子径ｄに対して
D/d＝1.3〜3.0になるようパーティクルアナライザーで
分析しつつ撹拌速度を調節しながら添加し、次いで撹拌
下２時間放置した。次いでこれを遠心分離し、上清を除
去した後、沈澱をウシ血清アルブミンを0.05重量％の濃
度で添加したBBSで再分散しラテックス濃度を0.03重量
％に調整し、リウマチ因子測定試薬を得た。パーティク
ルアナライザーで分析した結果、ラテックス試薬の平均
粒子径は0.240μｍであった。また、LASER ZEE Model 5
01（PEN KEM 社製）でゼーター電位を測定した結果、−
2.5±0.2mV（BBS中）であった。ラテックス試薬の吸光
度は1.25（光路長10mm,580nm）であった。

（２） 測定方法 日立製作所U-3200型自記分光光度計の測光部に温度調節
器及びマグネット式撹拌装置を取り付けた装置により吸
光度を測定した。光路長10mmのガラス製光学セルに円筒
状の撹拌子を入れ、次いで（１）で得たリチウム因子測
定用試薬1980μｌを分注し、測光部に挿入し、37℃に保
温した。

次いで、該撹拌装置によりリウマチ因子測定用試薬を撹
拌しつつ、被検液20μｌを添加した。添加と同時に吸光
度の測定を開始した。吸光度の測定は、580nmの波長の
光線を用いて行なった。なお、撹拌は被検液添加後３秒
で停止した。

（３） 検量線の作成 リウマチ因子濃度1600IU/mlであるリウマチ患者血清の
プール血清を生理食塩水で希釈しリウマチ因子濃度5,1
0,20,40,80,100,200,500,1000IU/mlの被検液を得た。
（２）の測定条件下で上記９種の被検液及びBBSにつき
吸光度を各５回測定した。

得られた吸光度のうち、被検液添加後１分後と５分後の
吸光度より一定間隔時間に対する吸光度の差を得た。こ
の結果を第１表に示す。

第１表の結果から吸光度の差の平均値を縦軸Ｙとし、添
加被検液中のリウマチ因子濃度を横軸Ｘとした時、試薬
作成後７日目では に良好に近似できた。

（式１）の検量線のパラメーター を磁気カードに磁気カード書き込み装置を用いて書き込
んだ。

（４） 未知試料の測定 検量線のパラメーターを書き込んだ磁気カードをコンピ
ューターに接続された磁気カード読み取り装置によりパ
ラメーターＡ及びＢをコンピューターに入力し、 を計算するプログラムを完成させた。

リウマチ因子濃度未知の血清を（２）の測定方法で測定
したところ試薬作成後７日目では、（式１）の検量線に
より59.0IU/ml濃度と計算された。同一の試薬を４℃で1
2カ月保存した後に同様にして測定し、（式１）の検量
線を用いてコンピューターで計算すると56.9U/mlであっ
た。

従って、試薬調製時（試薬調製後７日目）に作成した検
量線を用いることにより、12カ月後にも正確な測定がで
きる。

なお、４℃,12カ月保存後の試薬の平均粒子径は0.24μ
ｍ、ゼーター電位は−2.3±0.2mVで吸光度は1.26であっ
た。

実施例２ （１） Ｃ−反応性蛋白質測定試薬の調製 平均直径0.123μｍのポリスチレンラテックス粒子を塩
化アンモニウム−アンモニア緩衝液（pH＝8.0）で希釈
しラテックス濃度が１重量％の懸濁液を調製する。次い
でＣ−反応性蛋白質（以下CRPと略す）をヤギに免疫し
て得た抗CRP血清より塩析処理により分画した抗CRPヤギ
IgG分画を塩化アンモニウム−アンモニア緩衝液（pH＝
8.0）で希釈し、蛋白濃度2mg/mlの溶液を調製する。上
記ラテックス懸濁液１容に抗CRPヤギIgG分画の溶液１容
を実施例１と同様に撹拌速度を調節しつつ加え37℃で２
時間撹拌下反応させた。次いで遠心分離し、上清を除去
した後沈澱をウシ血清アルブミンを0.05重量％の濃度で
添加した塩化アンモニウム−アンモニア緩衝液（pH＝8.
0）で再分散しラテックス濃度を0.05重量％に調製し、C
RP測定試薬を得た。

パーティクルアナライザーで分析した結果、ラテックス
試薬の平均粒子径は0.213μｍであった。またゼーター
電位は−2.0±0.2mV（塩化アンモニウム−アンモニア緩
衝液中）で吸光度は1.30であった。

（２） 測定方法 試薬1990μｌと被検液10μｌを用いる以外は実施例１と
同様にして測定した。

（３） 検量線の作成 CRP濃度240mg/dlの精製CRP溶液をCRPを吸収処理して実
質的にCRPを含まない状態としたCRP不含血清により希釈
し、CRP濃度が0.10,0.25,0.50,1.0,2.5,5.0,10,15,20,3
0,40,60mg/dlの被検液を得た。

（２）の測定条件下で上記12種の被検液及び塩化アンモ
ニウム−アンモニア緩衝液につき吸光度を各５回測定し
た。

得られた吸光度のうち、被検液添加後１分後と５分後の
吸光度より一定間隔時間に対する吸光度の差を得た。吸
光度の差の平均値をＸとし、添加被検液中のCRP濃度を
Ｙとした時、10mg/dl以下の範囲で Ｙ＝exp（1.011 InX ＋3.204） （式２） に良好に近似できた。

（式２）の検量線をフロッピーディスクに入力した。

（４） 未知試料の測定 （式２）の検量線を記録したフロッピーディスクをコン
ピューターに入力し、（式２）により未知試料の濃度を
計算するプログラムを完成させた。

CRP濃度未知の血清を（２）を測定方法で経時的に測定
し、得られた吸光度（ｘ）を、試薬調製時に作成した検
量線（式２）に入力して濃度をコンピューターで計算す
ると以下の如くであった。

試薬作成後７日目 4.3mg/dl ３ケ月後 4.3 〃 ６ケ月後 4.1 〃 ９ケ月後 4.1 〃 12ケ月後 4.0 〃 従って、試薬調製時（試薬調製後７日目）に作成した検
量線を用いることにより、12カ月後にも正確な測定がで
きる。（試薬の保存温度:4℃） なお４℃,12カ月保存後の試薬の平均粒子径は0.214μｍ
で、ゼーター電位は−2.1±0.3mV、吸光度は1.31であっ
た。

実施例３ （１） リウマチ因子測定試薬の調製 実施例１で調製した試薬を円筒状の撹拌子を含む光路長
10mmのポリスチレン製光学セルに1980μｌづつ分注し、
接着剤付きアルミ箔で密栓することにより、モノテスト
試薬を調製した。

（２） 測定方法 第１図のブロック図に示す機能を有する装置を用いて測
定した。リウマチ因子測定用モノテスト試薬（３）を測
光部に挿入し、37℃に加温した。次いで撹拌装置（４）
により試薬を撹拌しつつ、被検液20μｌを検体分注器
（11）を用いて添加した。添加と同時に吸光度の測定を
開始した。吸光度の測定は、タングステンランプ（１）
の日色光を分光素子（２）で分光して580nmの波長の光
線を用いて行なった。なお、撹拌は被検液添加後３秒で
停止した。

（３） 検量線の作成 検量線は実施例１の（３）と同様の操作で作成した。吸
光度の差の平均値をＹ、添加被検液中のリウマチ因子濃
度をＸとした時、試薬調製時の検量線は に良好に近似できた。

（式３）の検量線のパラメーター を磁気カードに磁気カード書き込み装置を用いて書き込
んだ。

（４） 未知試料の測定 検量線のパラメーターを書き込んだ磁気カードを入力装
置（９）によりコンピューター（８）に入力し、 を計算するプログラムを完成させた。

リウマチ因子濃度未知の血清を試薬調製時に作成した検
量線を用いて（２）の方法に従い経時的に測定したとこ
ろ、濃度が以下の如くデータ表示部（10）に各々表示さ
れた。

試 薬 調 製 時 59.0 IU/ml 試薬保存３ヶ月 59.2 IU/ml 〃 ６ヶ月 58.9 IU/ml 〃 ９ヶ月 57.3 IU/ml 〃 12ヶ月 57.7 IU/ml 従って、モノテスト試薬を用いて試薬調製時に作成した
検量線で十分信頼性のある測定が可能である。（試薬の
保存温度:4℃） 実施例４ （１） 抗ストレプトリジンＯ抗体価（ASO）測定試薬
の調製 平均粒子径0.123μｍのポリスチレンラテックス粒子を
ホウ酸緩衝液（0.1M pH8.2,NaCl0.15M,以下BBSと略す）
で希釈し、ラテックス濃度が１重量％の懸濁液を調製す
る。β−溶血性連鎖球菌の培養上清を常法に従って分画
精製し、ストレプトリジンＯ（SLO）を得る。得られたS
LOの溶血活性は12,000U/mlであった。次いでSLO溶液をB
BSで10倍希釈する。上記ラテックス懸濁液１容とSLO希
釈溶液１容をラテックス試薬の平均粒子径Ｄがラテック
ス粒子の平均粒子径ｄに対してD/d＝1.3〜3.0になるよ
うに実施例１と同様にして撹拌速度を調節しつつ混合
し、37℃で２時間撹拌下に反応した。さらに、45℃で30
分間撹拌下に加熱処理した。次いで遠心分離し、上清を
除去した後沈澱を0.05重量％のウシ血清アルブミンを含
むBBSにラテックス濃度が0.05重量％になるように調製
してASO試薬を得た。

パーティクルアナライザーで分析した結果、ラテックス
試薬の平均粒子径は0.257μｍであった。またゼーター
電位は−1.5±0.1mV（BBS中）で吸光度は1.42（光長路1
0mm,波長580nm）であった。

該ASO試薬を円筒状の撹拌子を含む光路長10mmのガラス
製キュベットに990μｌづつ分注し、水蒸気，液が漏れ
ないようにパラフィルムで密栓して、モノテスト試薬を
調製した。

（２） 測定方法 第１図のブロック図に示す機能を有する装置を用いて測
定した。ASOモノテスト試薬（３）を測光部に挿入し、3
7℃に加温した。次いで撹拌装置（４）により試薬を撹
拌しつつ、被検液10μｌを検体分注器（11）を用いて添
加した。添加と同時に濁度の測定を開始した。濁度の測
定は分光素子（２）を用いることなく、タングステンラ
ンプ（１）の光線を用いて行なった。なお、撹拌は被検
液添加後５秒で停止した。また、濁度は積分球濁度計SE
P−PT−501D（日本精密光学社製）を用いて、散乱光強
度／透過光強度として測定した。

（３） 検量線の作成 ASO濃度が4000IU/mlである溶連菌感染症患者血清を生理
食塩水で希釈し、ASO濃度10,40,160,640,1280,2560IU/m
lの被検液を得た。（２）の測定条件下で上記６種類の
被検液及びBBSについて濁度を各５回測定した。

得られた濁度のうち、被検液添加約１分後と５分後の濁
度の変化量の平均値をＹとし、添加被検液中のASO濃度
をＸとした時、試薬調製時の検量線は Ｙ＝6.25×10^-4X＋0.215 （式４） に良好に近似できた。（式４）の検量線のパラメーター
（Ａ＝6.25×10^-4,B＝0.215）を磁気カードに磁気カー
ド書き込み装置を用いて書き込んだ。

（４） 未知試料の測定 検量線のパラメーターを書き込んだ磁気カードを入力装
置（９）によりコンピューター（８）に入力し、Ｙ＝6.
25×^-4X＋0.215を計算するプログラムを完成させた。

ASO濃度未知の血清を試薬調製時に作成した検量線を用
いて（２）の方法に従って経時的に測定したところ、濃
度は次の如くなった。

試 薬 調 製 時 337.1 IU/ml 試薬保存６ケ月 329.8 IU/ml 〃 12ケ月 327.1 IU/ml 従って、モノテスト試薬を用いて試薬調製時に作成した
検量線で十分信頼性のある測定が可能である（試薬の保
存温度,6℃）。

なお、６℃、,12カ月保存後の試薬の平均粒子径は0.259
μｍで、ゼーター電位は−1.7±0.2mV,吸光度は1.46で
あった。

〔発明の効果〕

本発明により、従来の比濁法の実施において、必要とさ
れていた、測定開始前にその都度、濃度既知の標準物質
を用いて検量線を作成することなく、試薬の保証期間内
において未知試料の測定を反復的に行なうことができ、
測定時の検量線作成のための操作の煩雑性が解消され、
また、試薬の節約がもたらされた。さらに、本発明は検
体数の少ない測定、特に、モノテスト試薬を使用する測
定においてきわめて有効である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の測定方法を実施する装置のブロック図
である。 １……光源、２……分光素子、３……反応キュベット
（またはセル）、４……撹拌機構、５……光検出器、６
……増幅器、７……微分回路、８……コンピューター、
９……入力装置、10……データー表示部、11……検体分
注機構。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 守永 賢司 東京都町田市忠生１−25−10 桂荘内 (72)発明者 高橋 洋二 神奈川県相模原市大野台１−６−39 須山 方 (72)発明者 三谷 勝男 神奈川県藤沢市鵠沼神明２−12−21

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】抗原又は抗体を固定化したラテックス試薬
   を用いた抗原抗体反応によって生ずる免疫複合体による
   濁度の変化から透過光の減少又は散乱光の増加信号の一
   定時間後の値、あるいは最大速度又は最大加速度の値を
   基準として検量線を作成し、該検量線を用いて検体中の
   被検物の濃度を測定する反復濃度測定方法において、前
   記ラテックス試薬としてその平均粒子径（Ｄ）が0.1〜
   0.5μｍ、ラテックス粒子の平均粒子径（ｄ）に対する
   ラテックス試薬の平均粒子径（Ｄ）の比（D/d）が1.3〜
   3.0、ゼータ電位が−20mV〜10mVの範囲且つ吸光度が光
   路長10mmで0.5〜1.5の範囲にあるものを用い、試薬調製
   後の試薬保証期間内における該測定を非連続的に実施す
   る際の新たな測定に際し、測定開始前にその都度濃度既
   知の標準物質を用いて検量線を作成することなく、試薬
   調製時に作成された検量線又は試薬調製時に導かれたパ
   ラメーターに基づき検体測定時に作成された検量線によ
   り、被検物の濃度を計算することを特徴とする免疫的測
   定方法。