ES2079489T5

ES2079489T5 - Composicion farmaceutica que hace a celulas, que expresan antigenos mhc de clase ii, celulas dianas para celulas t citotoxicas.

Info

Publication number: ES2079489T5
Application number: ES90914564T
Authority: ES
Inventors: Terje Kalland; Gunnar Hedlung; Mikael Dohlsten; Peter Lando
Original assignee: Pharmacia AB
Current assignee: Pfizer Health AB
Priority date: 1989-09-20
Filing date: 1990-09-14
Publication date: 2004-05-16
Anticipated expiration: 2010-09-14
Also published as: DE69023635T2; EP0444186B2; ES2079489T3; JPH04505767A; JP3147237B2; SE8903100D0; EP0444186B1; DK0444186T3; WO1991004053A1; DE69023635D1; ATE130199T1; DK0444186T4; EP0444186A1; DE69023635T3

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN COMPUESTO FARMACEUTICO PARA TRATAR MALIGNIDADES Y ENFERMEDADES DEL SISTEMA INMUNOLOGICO QUE COMPRENDEN CELULAS QUE EXPRESAN ANTIGENOS MHC DE CLASE II. ESTE COMPUESTO COMPRENDE UNA SUSTANCIA QUE HACE DE DICHAS CELULAS SUPERFICIES DE EMISION PARA CELULAS T CITOTOXICAS. ESTA SUSTANCIA PUEDE SELECCIONAR A PARTIR DEL GRUPO QUE CONSTA DE ENTEROTOXINAS DE ESTAFILOCOCO, TOXOIDES, FRAGMENTOS ACTIVOS DE PEPTIDOS DE DICHAS ENTEROTOXINAS Y SUSTANCIAS QUE TIENEN EN ESENCIA EL MISMO MODO DE ACCION, TALES COMO TOXOIDES DEL SINDROME DE SHOCK TOXICO, (TSST-1), EXOPROTEINAS BACTERIANAS, TALES COMO EXOPROTEINAS DE ESTREPTOCOCO, Y PROTEINAS PRODUCIDAS MEDIANTE MICOPLASMA DE ARTRITIDE, QUE TIENE LA CAPACIDAD DE INTERACTUAR CON PARTES DEL TRC Y ESPECIFICAMENTE CON LAS CADENAS BETA V DEL MISMO.

Description

Composición farmacéutica que hace a células, que expresan antígenos MHC de clase II, células dianas para células T citotóxicas.

La presente invención se refiere a un nuevo agente y a un nuevo método para la activación de células T. Específicamente la invención se refiere a un nuevo agente y a un nuevo método para tratar ciertas formas de cánceres y procesos autoinmunes.

Fundamento de la invención

Los antígenos MHC o antígenos de trasplante, que en el hombre se denominan también antígenos HLA, juegan un papel esencial en la activación de las células T y la respuesta inmune que la acompaña. Así, por ejemplo, los antígenos proteínicos dependen de interacciones con antígenos MHC para su presentación a las células T y activación de éstas durante una respuesta inmune normal. Asimismo, la presentación de autoantígenos dependiente de MHC es de importancia capital en los procesos autoinmunes que dependen de células T.

Cierto tipo de antígenos MHC, es decir, los denominados antígenos MHC de clase II, son expresados por una diversidad de células normales bien constitucionalmente o bien después de activación (1). Entre las células tumorales, las malignidades del sistema hematopoyético expresan comúnmente moléculas de MHC de clase II. Aun cuando los antígenos MHC de clase II no están restringidos a las células tumorales, pueden constituir una diana interesante para la terapia dado que se podría prescindir de la mayor parte de las células normales.

Un potente agente capaz de eliminar células que expresan antígenos MHC de clase II puede ser útil, por consiguiente, tanto para la interrupción de procesos autoinmunes como para la destrucción de ciertas células malignas.

Sumario de la invención

Por tanto, la presente invención se refiere a un método para tratar malignidades que implican células que expresan antígenos MHC de clase II, cuyo método comprende administrar a un cuerpo vivo una composición que incluye una sustancia que hace a dichas células dianas para las células T citotóxicas, en el que la sustancia es una enterotoxina estafilocócica.

La invención comprende también una composición farmacéutica para tratar estas malignidades. La composición incluye una sustancia que hace a dichas células dianas para las células T citotóxicas en la que la sustancia es una enterotoxina estafilocócica.

La enterotoxina estafilocócica debe tener la aptitud de activar las células T citotóxicas, redirigirlas hacia antígenos MHC de la clase II con independencia de la especificidad nominal e inactivar o lisar con ello las células que expresan los antígenos MHC de clase II.

Según la invención se ha descubierto que la enterotoxina estafilocócica preferida posee la aptitud de dirigir las células T para lisar las células diana que expresan antígenos MHC de clase II. Se cree que la enterotoxina estafilocócica debe interactuar con partes del complejo receptor de células T (TCR) y más específicamente, con secuencias particulares de las cadenas beta V del receptor de células T. Preferiblemente, la enterotoxina estafilocócica se selecciona entre el grupo que consta de enterotoxinas estafilocócicas, SE:s, tales como SEA, SEB, SEC, SEC1, SEC2, SEC3, SED o SEE, fragmentos activos de toxoides o péptidos activos de estas enterotoxinas y sustancias que tienen esencialmente el mismo modo de acción, para interactuar con ciertas secuencias beta V del TCR. Podrían emplearse asimismo sustancias basadas en las estructuras anteriormente citadas, modificadas genética o químicamente. Véanse también los trabajos de Fraser, Nature, 339, 221-223 (1989) y Matthes et al., Eur. J. Immunol, 18, (1988) 1733-1737.

Un ejemplo de una sustancia que no cae dentro del alcance de la invención es la proteína A. Esta proteína procede de Staphylococcus pero tanto estructural como funcionalmente es diferente de las enterotoxinas estafilocócicas.

Las enterotoxinas estafilocócicas (SE) que son producidas por bacterias Gram-positivas, son una familia de moléculas de estructura proteínica, que son conocidas comúnmente por ocasionar envenenamiento de productos alimenticios (2). También son potentes mitógenos de células T que provocan la activación de las células T y la producción consiguiente de linfoquinas (3-5). Sin embargo, las SE a diferencia de la mayor parte de los mitógenos, dependen estrictamente de la presencia de células accesorias que expresan moléculas de antígenos de MHC de clase II (6,7).

La sustancia utilizada como entidad activa puede comprender una combinación de dos o más enterotoxinas, to-xoides, o fragmentos o péptidos activos de los mismos.

Además, se han presentado fuertes evidencias circunstanciales de que la SEA interacciona directamente con ciertas familias de receptores de células T durante su activación de linfocitos (8,9).

\newpage

Estudios en animales que se refieren a la producción de sustancias destructoras de tumores y que combaten tumores implantados, han sido descritos por Shcheglovilova et al., Exp. Onkol. (USSR) 9,28-30 (1987),11, 73-74 (1989) y 11 (1989) 54-57. Ninguna referencia ha sido hecha a antígenos MHC de clase II.

Se ha sugerido con anterioridad (documento WO-Al- 89/09619) emplear SEA para el tratamiento del cáncer. Según esta publicación, sin embargo, se utiliza SEA para el tratamiento de la sangre in vitro (fuera del cuerpo de los pacientes), y la SEA es separada antes de que las células activadas sean reinfundidas en el paciente, mientras que el descubrimiento en el que se basa la presente invención describe que la SEA y agentes funcionalmente similares pueden actuar como reticuladores bifuncionales in vitro. La activación y la conducción de células T hacia células tumorales del cuerpo pueden ser de empleo potencial para el tratamiento in vivo de determinados tipos de cánceres y enfermedades autoinmunes.

El agente según la presente invención está preferiblemente en la forma de una composición farmacéutica que comprende la sustancia, juntamente con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

La composición se administra preferiblemente, además, por vía parenteral, y por tanto debe incluir aquellos coadyuvantes que se utilizan comúnmente dentro de este campo. Así la enterotoxina o su fragmento podrían administrarse en la forma de emulsiones lipídicas, o combinarse con seroalbúmina humana o mezclas de aminoácidos. La cantidad del componente activo de la composición puede variar dentro de límites amplios, por ejemplo, 1 ng - 100 mg.

Además de la administración sistémica también es posible emplear la composición según la invención para administración local. La composición podría, por ejemplo, ser administrada localmente en una articulación artrítica.

Los estados que pueden ser tratados mediante las composiciones según la invención son diversas formas de enfermedades autoinmunes y de enfermedades tumorales, por ejemplo, linfomas y leucemias.

La invención se ilustra adicionalmente mediante los ejemplos que siguen que no deben ser interpretados como limitativos de la invención.

Ejemplos

Para determinar la citotoxicidad mediada por células dirigidas por enterotoxinas estafilocócicas (SDCC) se empleó un grupo de líneas de células T citotóxicas anti-HLA-A2 humanas, como células efectoras y la línea de células B RAJI transformadas con EBV HLA^{-}A2-DR^{+}, el mutante R.2.2 HLA-DR^{-} de la línea de células RAJI y la línea de células B BSM transformadas con EBV HLA-A2^{+}DR^{+}. Las líneas de células T específicas anti-HLA-A2 fueron establecidas a partir de cultivos primarios MLC y re-estimulaciones repetidas con células estimuladoras HLA-A2^{+} tratadas con mitomicina e IL-2 recombinante (20 unidades/ml). Estas líneas celulares T lisaban fuertemente las células diana que expresan HLA-A2 específico pero no dianas irrelevantes. El efecto de la enterotoxina estafilocócica (SE) A, B, C1 y D fue estudiado utilizando SE procedente de Tox Tech (Madison, WI., EE.UU.). Para demostrar que HLA-DR es la molécula diana en la SDCC se utilizó el grupo antes descrito de células diana y anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos a HLA-DR, MHC Clase II, W6/32 y CD 23.

Marcado con cromo e incubación de las células diana con SEA

0,75x10^{6} células dianas y 150 \muCi de ^{51}cromo (Amersham 20 Corp., Arlington Hights, Inglaterra) fueron incubadas durante 45 minutos a 37ºC en un volumen de 100 \mul. Las células fueron mantenidas en medio completo que contenía RPMI-1640 (Gibco, Paisley, GBR) suplementado con 2,8% (v/v) de NaHCO_{3} al 7,5%, piruvato de sodio al 1%,
L-glutamina 200 mM al 2%, Hepes 1M al 1%, gentamicina 10 mg/ml al 1% y suero de ternera fetal al 10% (FCS, Gibco, Paisley, GBR). Después de la incubación las células se lavaron una vez en medio completo sin suero de ternera fetal (FCS) y se incubaron 60 minutos a 37ºC, y se lavaron y resuspendieron en medio completo que contenía FCS al 10%; 5x10^{3} células dianas fueron añadidas a cada pocillo de placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo en U (Costar, Cambridge, EE.UU.).

Valoración de la citotoxicidad

Las células efectoras se añadieron a los pocillos a diversas relaciones de células efectoras/células dianas. El volumen final en cada uno de los pocillos era 200 \mul. Cada ensayo se realizó por triplicado. Las placas fueron incubadas 4 horas a 37ºC, después de lo cual el cromo liberado fue recolectado utilizando marcos de recolección SCS (Skatron, Noruega). La cantidad de ^{51}Cr fue determinada en un contador gamma (Cobra Auto-gamma, Packard). El tanto por ciento de citotoxicidad fue computado mediante la fórmula % de citotoxicidad = (X-M)/(T-M) x 100, donde X es la liberación de cromo como cpm obtenida de la muestra de ensayo, M es la liberación de cromo espontánea de las células dianas incubadas con medio, y T es la liberación de cromo total obtenida incubando las células dianas con dodecilsulfato sódico al 1%.

Resultados

Líneas de células T aloespecíficas humanas, que demostraban una especificidad exquisita para HLA-A2 mostraron fuerte citotoxicidad contra la célula diana irrelevante RAJI HLA-A2^{-}DR^{+} y citotoxicidad incrementada contra la célula diana específica BSM HLA-A2^{+}DR^{+}, cuando se añadió SEA en la valoración (Fig. 1 A-B). La citotoxicidad celular dirigida por SE y mediada por células T (SDCC) tuvo lugar a concentraciones muy bajas de SE, apreciándose el efecto máximo en 10-0,1 ng/ml y el efecto semimáximo en aproximadamente 0,01 ng/ml (Fig. 1 C). El fenómeno SDCC podía ser inducido por varias de las SE. La línea de células T 5.2 mostró reactividad selectiva hacia SEA, mientras que las líneas 5.1 y 11.2 reaccionaron con varias SE (Fig. 2 A-C). La activación de células T mediante la combinación de SEA y SEB dio como resultado un aumento aditivo de citotoxicidad para la célula diana RAJI (Fig. 2 C). Estudios de bloqueo con anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos a diferentes estructuras de la superficie celular demostraron que el mAb G8, que recientemente se ha puesto de manifiesto que interactua con un sitio de unión de SEA sobre la molécula HLA-DR, inhibía fuertemente la SDCC (Tabla 1. Experimento Nº 1). En contraposición, el mAb HB 96, que interacciona con un determinante monomórfico del MHC de Clase II, no relacionado con el epítopo de unión a SEA y el MHC de Clase 1 y el mAb CD23 no mostraban actividad inhibidora alguna (Tabla 1. Experimento Nº 1). Experimentos de preincubación con SE demostraron que la unión de SE a las células RAJI y no a la línea de células T, era un requisito previo para la inducción de SDCC contra las células RAJI (Tabla 1. Experimento No. 2). Se encontró que el mutante RJ2.2.5 negativo del MHC de Clase II de la línea de células RAJ1 era completamente resistente a la SDCC, mientras que la línea de células padre que expresa la Clase II era una diana excelente (Tabla 1. Experimento No. 3). Estas observaciones implican que la HLA-DR es la molécula diana principal en la SDCC.

Leyenda de la Figura 1. Citotoxicidad mediada por células T inducida por SEA contra células dianas RAJI y BSM. La citotoxicidad de una línea de células T aloespecíficas anti-HLA-A2 para las líneas de células linfoblastoides RAJI (HLA-A2^{-}DR^{+}) y BSM (HLA-A2^{+}DR^{+}) en presencia o ausencia de SEA, 1 ng/ml, fue examinada a varias relaciones de efector/diana en una valoración estándar de 4 horas, de liberación de ^{51}cromo, y se expresa como % de citotoxicidad específica. La Figura 1C demuestra la dosis-respuesta de SEA a concentraciones de 10^{-5} a 10^{2} ng/ml. Se añadió SEA directamente a los pocillos de microtitulación junto con células diana RAJI marcadas con ^{51}cromo y células T efectoras en las relaciones indicadas de células efectoras/células diana. La adición de SEA a las células diana en ausencia de células efectoras no dio como resultado cambio importante alguno en la liberación espontánea de ^{51}cromo.

Leyenda de la Figura 2. Inducción de SDCC mediante SEA, SEB, SEC1 Y SED. Se examinó la citotoxicidad de las líneas de células T aloespecíficas anti-HLA-A2 5.2, 5.1 y 11.21 contra células diana RAJI en presencia o ausencia de las diversas SE a la concentración de 1 ng/ml en una valoración de liberación de ^{51}cromo de 4 horas.

TABLA 1 HLA-DR es la molécula diana en SDCC

		Aditivo	% de citotoxicidad a una relación E/D^{A}
Efector	Diana	SE	mAb	A	B	C
Experimento nº 1
5.2	RAJI	-	-	1	0	0
		+	-	30	19	14
		+	HB96	31	23	16
		+	G8	8	6	3
		+	W/32	37	28	19
		+	CD23	40	27	19

Experimento nº 2
11.2	RAJI	-		2	0	0
		+		56	34	14
	RAJI/SE	-		33	28	12
11.2/SE	RAJI	-		2	0	0

Experimento nº 3
12.1	RAJI	-		3	2	3
		+		43	30	22
	R12.2.5	-		10	11	8
		+		12	9	6
	RAJI/SE	-		32	24	21
	R12.2.5/S	-		12	9	7

^{A}Citotoxicidad de líneas de células T aloespecíficas anti-HLA-A2 contra células RAJI HLA-DR^{+} y células R.2.2.5 mutantes de RAJI negativas de MHC Clase 11. Los diferentes mAb fueron añadidos a la iniciación del cultivo en una concentración óptima de 20 \mug/ml de Ig de ascitis purificada (HB 96 y W6/32) o a una dilución de ascitis de 1/300 (G8 y CD23). Se añadió a la valoración SE a 0,1 ng/ml (Experimento nº 1), 10 ng/ml (Experimento nº 2) o 1 ng/ml (Experimento nº 3). La preincubación de células diana y efectoras se llevó a cabo con SE a 1 ng/ml (Experimento nº 2: RAJI/SE y 11.2/SE) o 10 ng/ml (Experimento nº 3: RAJI/SE y R.2.2.5/SE) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron extensamente antes de utilizarlas en la valoración. La adición de SE a las diferentes células dianas no dio como resultado cambio importante alguno en la separación espontánea de ^{51}-cromo. Las relaciones de efector/diana (E/D) fueron 20:1, 10:1 y 5:1 en el Experimento nº 1 y nº 3, y 30:1, 10:1 y 3:1 en el Experimento nº 2.

Composición para inyecciones

1 ng - 100 mg de SEA (disponible de Tex Tech Madison, WI) se disuelve en 0,1 - 5 ml de PBS (Solución salina tamponada con fosfato) y opcionalmente seroalbúmina humana u otro vehículo utilizado convencionalmente.

Las inyecciones para administración son inyecciones intravenosas en bolo que incluyen 1-5 ml o infusión continua de 500 ml durante un período de 1-24 horas.

Para la demostración de efectos antitumorales in vivo de la SE se llevan a cabo los dos siguientes enfoques experimentales:

1.: 10^{6} células murinas de linfoma A20 de MHC II^{+} en 0,3 ml de solución salina se inyectan por vía subcutánea en ratones C57BI/6. Los ratones se tratan con 1 \mug de SEA en 0,5 ml de solución salina por vía intravenosa o con solución salina sola como testigo. El tratamiento se administra en forma de una dosis cada semana.. El crecimiento del tumor se siguió cada día por medida del volumen total del tumor. Los ratones sacrificaron después de 4 semanas de terapia.

2.: 10^{5} células murinas de melanoma B 16 transfectadas con MHC II^{+} en 0,3 ml de solución salina se inyectan por vía intravenosa en ratones C57B1/6. Los ratones se tratan con 1 \mug de SEA en solución salina por vía intravenosa o con solución salina solo como testigo. El tratamiento se lleva a cabo en forma de una dosis cada semana. Los ratones se sacrifican después de 3 y 4 semanas de tratamiento terapéutico y se evalúa el número de metástasis pulmonares.

Referencias

1. Guillemot, F., Auffrey, C., Orr, H.T., y Strominger, J.: MHC antigen genes en: Molecular Imunology (Harnes, B.D. y Glover, D.M. (Eds.)) pp 81-143; IRL Press, Oxford, 1988.

2. Bergdoll, M.S.: Enterotoxins en: Staphyloccoci and Staphylococcal Infections Vol. II (Easman, C.S.F. y Adlam, C. (Eds.)) pp 559-598; Acad. Press. New York, 1983.

3. Langford, M.P., Stanton, G.J., Johnson, H.M.: Biological effects of Staphylococcal enterotoxin A on human peripheral blood lymphocytes, Infect. Immun. 22:62-8, 1978.

4. Carlsson, R. Sjögren, H.O.; Kinetics of IL-2 and interferon-gamma production, expression of IL-2 receptors, and cell proliferation in human mononuclear cells exposed to staphylococcal enterotoxin A. Cell. Immunol. 96:175-181, 1985.

5. Fisher, H., Dohlsten, M., Andersson, U., Hedlund, G., Ericsson, P-E., Hansson, J., Sjögren, H.O.; Production of TNF-a and TNF-b by staphylococcal enterotoxin A activated human T cells. J. Inmunol. Methods, en prensa, 1989.

6. Fisher, H., Dohlsten, M., Lindvall, M., Sjögren, H.O., Carlsson, R.; Binding of staphylococcal enterotoxin A A to HLA-DR on B cell lines. J. Immunol. 142: 3151-3157, 1989.

7. Mollick J.A., Cook, R.G., Rich R.R.: Class II MHC staphylococcus molecules are specific receptors for staphylococcus enterotoxin A. Science 244:817-820, 1989.

8. Lando, P.A., Dohlsten, M., Kalland, T., Sjögren, H.O., Carlsson, R.: The TCR-CD3 complex is required for activation of human lymphocytes with staphylococcal enterotoxin A. Scand. J. Immunol., en prensa, 1989.

9. White, J., Herman, A., Pullen, A.M., Kubo, R., Kappler, J.W., Marrack, P.: The Vb-specific superantigen staphylococcal enterotoxin B: Stimulation of mature T cells and clonal deletion in neonatal mice. Cell 56:27-36, 1989.

Claims

1. El uso de una enterotoxina estafilocócica para la preparación de una composición farmacéutica para administración patenteral a un paciente que padece un cáncer que implica células que expresan el antígeno MHC de la clase II.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que dicha enterotoxina estafilocócica es la enterotoxina estafilocócica A.