ES2099714T5 - Procedimiento de tratamiento endoproteolitico de las proteinas (precursores) y de produccion microbiologica de proteinas. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE BASA EN EL DESCUBRIMIENTO DE QUE LA FURINA PERTENECE A LA FAMILIA DE LAS ENZIMAS ENDOPROTEOLITICAMENTE ACTIVAS Y SE REFIERE A UN PROCESO PARA LA DIVISION IN VITRO DE UNA PROTEINA A BASE DE TRATAR LA PROTEINA ANTE LA PRESENCIA DE IONES DE CA (AL CUADRADO) + CON FURINA O CON UNA ENZIMA TIPO FURINA, O CON UN FRAGMENTO ENDOPROTEOLITICAMENTE ACTIVO, UNA PROTEINA DE FUSION O DERIVATIVA DE LA FURINA O DE LA ENZIMA TIPO FURINA. LA INVENCION SE PUEDE UTILIZAR PARA LA PRODUCCION (MICRO)BIOLOGICA DE UNA PROTEINA A BASE DE CULTIVAR CELULAS QUE HAN PASADO POR UNA INGENIERIA GENETICA QUE EXPRESAN UNA PROFORMA DE LA PROTEINA ASI COMO FURINA O UNA ENZIMA TIPO FURINA Y DE SEPARAR LA PROTEINA FORMADA. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UNA COMPOSICION FARMACEUTICA QUE CONTIENE UNO O MAS PORTADORES, DILUYENTES O ADYUVANTES FARMACEUTICAMENTE ACEPTABLES ASI COMO UNA CANTIDAD ENDOPROTEOLITICAMENTE ACTIVA DE FURINA O DE UNA ENZIMA TIPO FURINA, O UN FRAGMENTO O DERIVADO DE FURINA O DE UNA ENZIMA TIPO FURINA QUE TIENE UNA ACTIVIDAD ENDOPROTEOLITICA.

Description

Procedimiento de tratamiento endoproteolítico de las proteínas (precursores) y de producción microbiológica de proteínas.

La invención se refiere a un procedimiento in vitro para la producción (microbiológica) de una proteína y para la fragmentación "in vitro" de una proteína, en particular de una proteína precursora mediante el procesamiento de la proteína con un enzima endoproteolíticamente activo.

La invención que aquí se describe es el resultado de un estudio posterior respecto al posible significado fisiológico de la furina, una proteína humana que se describe en la solicitud de patente Europea EP-A-0246709, que es el producto de la expresión del gen fur que se sitúa en la parte superior del genoma del protooncogén humano fes/fps. La solicitud de patente a la que se hace referencia y otras publicaciones realizadas por el mismo grupo de investigación (Roebroek y otros, Molec.Biol.Rep. 11, 1986, 117-125; Roebroek y otros., EMBO J. 5, 1986, 2197-2202; y Schalken y otros., J. Clin. Invest 80,1987, 1545-1549), muestran que basándose en los datos limitados de ADN entonces disponibles, no se pudo determinar la función del producto del gen fur. Lo que se pudo determinar fue que la furina es probablemente una proteína asociada a la membrana que posee una función en la cual ciertas estructuras de reconocimiento juegan un papel. Se observó también entonces que el gen fur, se expresa como un ARNm de 4,5 kb en el hígado, riñón, bazo, timo y cerebro, mientras que la expresión en el tejido pulmonar es muy débil; en carcinomas pulmonares de células no pequeñas, por otra parte, se encontró que tenía lugar una expresión incrementada, a partir de la cual se sugirió que el gen fur tenía utilidad como marcador tumoral.

En el marco de la investigación anterior, se ha determinado mientras tanto la secuencia nucleótida completa de un fragmento de ADN genómico de alrededor de 21 pares de kb que el gen fur contiene (Van den Ouweland y otros., Nucl. Acids Res. 17, 1989, 7101-7102), mientras que la secuencia nucleótida del correspondiente fur cADN, también se ha determinado (Van den Ouweland y otros., Nucl. Acids Res 18, 1990, 664). Basándose en ello, es posible ahora caracterizar completamente el gen fur, a ambos niveles, el de la estructura de organización genómica y el de las secuencias codificantes. A partir de éstas, puede deducirse también la secuencia aminoácida de la furina.

Un análisis computacional de esta secuencia aminoácida ha revelado sorprendentemente ahora que la furina es muy similar a las proteasas del tipo de la subtilisina que son codificadas en las levaduras por el gen KEX1 de Kluyveromyces lactis y el gen KEX2 de Saccharomyces cerevisiae, y que la furina es evidentemente la forma eucariótica más evolucionada de estas endoproteasas (encontrada en el hombre y en animales tales como mono, gato, ratón, rata, pollo y Drosophila). Se ha encontrado, más específicamente, que la furina exhibe cierto grado de homología con el dominio catalítico de las subtilisinas bacterianas que aquí se describen (alrededor de 20 enzimas), tales como la termitasa de Thermoactinomyces vulgaris y la subtilisina BPN' de Bacillus amyloliquefaciens, y exhibe una gran homología con las proteasas del tipo de la subtilisina, tales el producto de expresión del gen KEX1 de la levadura Kluyveromyces lactis y el producto de expresión del gen KEX2 de la levadura Saccharomyces cerevisiae. La furina, que contiene 794 aminoácidos, exhibe en el dominio de los aminoácidos 97 a 577, una homología en conjunto de alrededor del 80,0% con los aminoácidos 123-584 del producto de expresión del gen KEX1 mencionado (es decir, el 41,6% de aminoácidos idénticos y el 38,3% de sustituyentes conservadores), y una homología en conjunto de alrededor del 78,9% con los aminoácidos 134-597 del producto de expresión de dicho gen KEX2 (es decir, 39,4% de aminoácidos idénticos y 39,5% de sustitutos conservadores). Estas regiones de aminoácidos de las proteasas de las levaduras incluyen los dominios catalíticos de tipo subtilisina. El dominio tipo subtilisina de la furina está situado en un fragmento aminoterminal de la furina que comprende los aminoácidos 108-464.

Respecto a las proteasas del tipo subtilisina, se hace referencia a las siguientes publicaciones: Tanguy-Rougeau y otros, FEBS Letters 234, 1988, 464-470; Mizuno y otros, Biochem. Biophys. Res Commun, 156, 1988, 246-254; Meloun y otros, FEBS Letters 183, 1985, 195-200; Marklan y otros., J. Biol. Chem. 242, 1967, 5198-5211; Mizuno y otros, Biochem. Biophys. Res. Commun. 159, 1989, 305-311; Bathurst y otros, Science 235, 1987, 348-350; Thomas y otros, Science 241, 1988, 226-230; Foster y otros, Biochemistry 29, 1990, 347-354; Fuller y otros, PNAS USA 86, 1989, 1434-1438; Julius y otros, Cell 37, 1984, 1075-1089; Bourbonnais y otros, J. Biol. Chem. 263, 1988, 15342-15347; Cosman y otros, Dev. Biol. Stand 69, 1988,9-13; Schubert Wright y otros, Nature 221, 1969, 235-242; Cunningham y otros, Yeast 5, 1989, 25-33; Davidson y otros, Nature 333, 1988, 93-96.

La solicitud de patente Europea EP 0 319 944 A2 muestra un método para la producción de proteínas de interés mediante la tecnología del ADN recombinante en una célula huésped eucariota, que comprende la introducción en dicha célula huésped eucariota de una primera secuencia de ADN que codifica la proteína de interés y la introducción en dicha célula huésped de al menos una secuencia adicional de ADN que codifica una proteína que procesa o estabiliza la proteína de interés. El gen KEX2 de la levadura se menciona como un ejemplo de esta última secuencia.

Tal como se muestra en las publicaciones mencionadas anteriormente, es especialmente el producto de la expresión del gen KEX2 de las especies de la levadura Saccharomyces cerevisiae el que ha sido bien estudiado y caracterizado. Es una endopeptidasa asociada a la membrana, dependiente de los iones calcio, con una especificidad enzimática para los residuos pares de aminoácidos básicos; las proteínas sustrato se fragmentan por este enzima en el sitio carboxílico de los pares de aminoácidos básicos que contienen arginina, cuyo enzima se define aquí como una endopeptidasa de "restricción"(por analogía con la nomenclatura de las endonucleasas de restricción en las que una secuencia nucleótida dada determina la fragmentación del ADN). La localización del enzima se encuentra probablemente en una estructura del aparato de Golgi. El dominio de tipo subtilisina y las secuencias de activación del Ca^{2+} se encuentran en la parte aminoterminal de la proteína. En la levadura Saccharomyces cerevisiae, la endopeptidasa está implicada en el procesamiento proteolítico de los precursores de toxinas asesinas y del factor alfa de emparejamiento de la feromona, es decir, de las toxinas pro-asesinas y del factor pro-alfa. Posteriormente, se encuentra que la endopeptidasa es capaz de fragmentar correctamente el precursor prepro-opiomelanocortina del péptido neuroendocina del ratón, después de introducirla en ciertas progenies celulares mutantes de mamífero con un procesamiento proteolítico alterado, así como que es capaz de procesar la proalbúmina a albúmina madura y es capaz de procesar el precursor de la proteína C plasmática.

En el marco de las similitudes establecidas entre las endopeptidasas anteriormente conocidas y la furina, se postula que ésta es una endopeptidasa de restricción que puede utilizarse para el procesamiento de las proteínas, más específicamente, el procesamiento de proteínas precursoras de hormonas polipeptídicas, factores de crecimiento, toxinas, enzimas, u otros tipos de proteínas biológicamente importantes. A este respecto, son concebibles aplicaciones in vitro por una parte, e in vivo, por otra, incluyendo una aplicación dentro del marco de un tratamiento terapéutico. Para tales aplicaciones, la furina humana puede ser más apropiada que las endopeptidasas anteriormente conocidas de origen no humano, o más generalmente, una "furina" animal puede ser más apropiada que una endopeptidasa de organismos más inferiores. Lo mismo se aplica a análogos o sustancias emparentadas de la furina no aislados todavía, que pertenecen a una familia más amplia de enzimas endoproteolíticos de restricción de los cuales la furina es el primer representante que se ha encontrado. Los diversos miembros de esta familia exhibirán un parecido estructural acusado, aunque la homología secuencial puede ser bastante baja, posiblemente inferior a una homología del 50%. En esta familia, será posible distinguir varios tipos enzimáticos, tal como un grupo de enzimas de tipo furina implicados en el procesamiento de proteínas constitutivamente secretadas y un grupo de enzimas de tipo furina implicados en el procesamiento de proteínas cuya secreción está regulada (secreción mediante gránulos secretorios). Es posible que cada uno de estos enzimas tipo furina se exprese de forma característica en un número limitado de tipos celulares en los cuales el enzima es activo como enzima de procesamiento. También es concebible un grado limitado de solapamiento entre la distribución celular y tisular de estos enzimas, y podría ser muy bien responsable del conocido fenómeno del procesamiento diferencial de los precursores, que depende del tipo celular.

Las proteínas PC1 y PC2 de la pituitaria que se describen recientemente por Seidah y otros, DNA and Cell Bio, 9, 1990, 415-424, constituyen ejemplos de tales enzimas de tipo furina.

Mediante las técnicas del ADN recombinante, es posible obtener grandes cantidades de la proteína furina. En los procariotas, el gen fur puede expresarse como una proteína de fusión con la beta-galactosidasa (sistema vectorial pUR) o con la antranilato sintetasa (sistema vectorial pATH). Otra posibilidad es la síntesis de la proteína de fusión glutatión-S-transferasa-furina (pGEX). La ventaja de este enfoque es que la furina puede separarse mediante la trombina. La furina puede sintetizarse también como tal en los procariotas situando el cADN de la forma correcta detrás de un promotor apropiado. Los sistemas vectoriales pUR y pATH se han descrito en la solicitud de patente Europea a la que antes se ha hecho alusión aquí. pGEX está disponible comercialmente. Utilizando el potente promotor de SV40, el fur cADN puede expresarse en células eucarióticas apropiadas. Con respecto a la glicosilación de la proteína, se prefiere este enfoque para ciertos fines.

La furina puede purificarse mediante técnicas bioquímicas normales en presencia de inhibidores de la proteasa. La furina es activa en un medio relativamente ácido con un pH de 5,5 como ocurre en los gránulos secretorios, pero la proteína mantiene su actividad también a un pH de 7,5. Debido a esto, puede utilizarse in vitro un tampón de acetato sódico 0,2 M (pH 5,5) o un tampón de Tris-HCl (7,0). La actividad del enzima furina depende de la presencia de iones Ca^{2+.} Para la actividad del enzima in vitro, se ha encontrado óptima una concentración de calcio de 2-5 mM. La presencia de quelatos metálicos tales EDTA inhibirá de forma importante la actividad de la furina. Posteriormente, la presencia de iones metálicos pesados tales como Zn^{2+,} Hg^{2+} y Cu^{2+}, debe evitarse. La sustancia o-fenantrolina une metales pesados excepto Ca^{2+}, y por tanto no ejerce efecto adverso sobre la actividad enzimática de la furina. Concentraciones bajas de fluoruro de fenilmetil sulfonilo (PMSF) y de diisopropil fluorofosfato (DPF) hasta 5 mM, no tienen efecto inhibitorio. A concentraciones mayores de PMSF, la función enzimática se inhibe. Una incubación in vitro durante dos horas a 37ºC es suficiente para el procesamiento de la proteína que va a ser fragmentada.

La presente invención se refiere a un procedimiento para el procesamiento endoproteolítico de una proteína, tratándola con un enzima endoproteolíticamente activo, en el que dicho enzima endoproteolíticamente activo es la furina o un fragmento endoproteolíticamente activo, derivado o proteína de fusión de la furina.

La furina puede utilizarse para el procesamiento endoproteolítico de varias proteínas. Esto hace posible, por ejemplo, que las proteínas precursoras producidas in vitro sean fragmentadas específicamente, para formar preparados biológicamente activos que pueden utilizarse como agentes adicionales para el tratamiento de enfermedades en las que los precursores no se fragmentan, o lo hacen en grado insuficiente. Generalmente hablando, puede decirse que la furina es apropiada para el procesamiento de proteínas biológicamente importantes.

La furina se aplica también posteriormente en la producción comercial de todo tipo de sustancias biológicamente activas (es decir, otros enzimas) si el procesamiento constituye una fase de la producción.

La actividad proteolítica se mantiene cuando la región carboxiterminal conteniendo allí el dominio transmembranal, se ha separado. En vez del enzima completo de la furina o del enzima de tipo furina, se puede utilizar entonces, según la invención, un fragmento del enzima que contiene todavía la parte responsable de la actividad proteolítica. Un fragmento apropiado, es, por ejemplo, el fragmento de furina compuesto por los aminoácidos 108-464.

La actividad de la furina o de su fragmento endoproteolíticamente activo, puede manipularse ulteriormente introduciendo mutaciones. La invención abarca por consiguiente a los derivados de la furina que muestren todavía actividad endoproteolítica.

La furina o el fragmento o derivado de la furina que posee actividad endoproteolítica que se utiliza en la invención, se ha obtenido a partir de células procarióticas o eucarióticas que mediante la ingeniería genética, con el ADN o el ARN recombinantes, han adquirido la capacidad de expresar la furina, el fragmento o derivado de la furina, en forma o no de una proteína de fusión, mientras que en el caso de que la furina, el fragmento o derivado de la furina, se produzcan por las células como una proteína de fusión, la proteína de fusión se ha procesado para separar la furina, el fragmento o derivado de la furina, a partir de la proteína de fusión.

Otra posibilidad, sin embargo, se refiere a que el origen de la furina sean células que por naturaleza son capaces de producir la furina, por ejemplo, una progenie celular tumoral apropiada.

La invención se refiere posteriormente a un procedimiento para la fragmentación in vitro de una proteína, tratándola con un enzima endoproteolíticamente activo, en el cual, de acuerdo con la presente invención, la proteína se trate en presencia de iones Ca^{2+} con furina, o un fragmento endoproteolíticamente activo, un derivado o una proteína de fusión de la furina como enzima endoproteolíticamente activo.

El tratamiento se llevará a cabo comúnmente al pH fisiológico y a la temperaturas habituales, es decir, a un pH del orden de 4-9 y a una temperatura de aproximadamente 37ºC.

Preferentemente, el tratamiento se realiza a un pH de 5-7,5, más preferentemente a 5,5-7,0.

También, según la invención, es preferible que el tratamiento se realice a una temperatura de 20-50ºC, más preferentemente a 30-40ºC.

Posteriormente, según la invención, es preferible que el tratamiento se lleve a cabo a una concentración de calcio de 1-10 mM, más preferentemente a 2-5 mM.

Según una forma de realización particularmente preferida de la invención, el tratamiento se lleva a cabo en presencia de o-fenantrolina o de una sustancia equivalente para unir metales pesados distintos que el calcio.

El procedimiento según la invención comprende el tratamiento de un sustrato que va a procesarse como tal con furina como tal, es decir, furina en forma aislada o purificada, pero comprende también un tratamiento con o en el interior de células, en particular de células de mamífero sometidas a técnicas de ingeniería genética, en las cuales se expresa la furina. Preferentemente, estas son células de mamífero cuidadosamente escogidas y sometidas a técnicas de ingeniería genética (tales como células COS-1, células CHO y células endoteliales) con niveles altos de expresión de dos genes, el fur y uno que codifica el sustrato que va a procesarse. Como bien saben los expertos en la materia, puede potenciarse intensamente la expresión, mediante amplificación génica o utilizando promotores potentes. La invención abarca incluso aplicaciones que implican animales transgénicos y por tanto no se limita a la producción proteica in vitro y a procedimientos de fragmentación de proteínas.

Un modo de realización preferido de la invención consiste en un procedimiento para la producción (micro)biológica de una proteína mediante cultivo de células sometidas a técnicas de ingeniería genética que expresan una pro-forma de la proteína así como la furina, y aislando posiblemente la proteína formada. Con este propósito, pueden utilizarse células tanto procarióticas como eucarióticas, pero se prefieren las células de los eucariotas superiores. Por ejemplo, pueden utilizarse las células de levadura o mejor todavía, las células vegetales. Se prefiere particularmente, sin embargo, utilizar células de mamíferos transformados genéticamente.

La expresión "pro-forma" da a entender una forma de la proteína que debería o puede convertirse en la proteína deseada mediante procesamiento. Puede consistir en una pro-forma natural o prepro-forma de la proteína, pero también en una pro-forma sintética que es el resultado de una construcción de ADN recombinante, en la que el gen que codifica la proteína deseada está precedido por una señal añadida o secuencia líder.

Respecto a los sustratos que deben procesarse, pueden servir como sustrato generalmente hablando, las proteínas con residuos pareados de aminoácidos básicos. La presencia adicional de un residuo aminoácido básico en la posición -4 respecto al sitio de fragmentación (es decir, 4 posiciones antes del sitio de fragmentación), dará lugar a una eficiencia más elevada. Se mencionan los ejemplos siguientes como sustratos posibles para el procesamiento mediante la furina sin que se pretenda que sea completo: precursores codificados por la familia génica de los factores de diferenciación y crecimiento \beta(TGF-\beta) (tales como TGF-\beta1, TGF-\beta2, TGF-\beta3, TGF-\beta4, TGF-\beta5, activina, inhibina, producto génico Vg1 del Xenopus, laevis, Sustancia Inhibidora de Muller (MIS), complejo genético decapentapéptido de embriones de Drosophila y proteína morfogenética de hueso), véase Sporn y Roberts, Anal. N. Y. Acad. Sci. 593, 1990, 1-6), precursores de factores de crecimiento, tales como el Factor de Crecimiento Nervioso \beta (\beta-NGF) y la insulina, precursores de factores de coagulación, tales como el Factor de Willebrand, proteína C, Factor IX y Factor X, hormonas y neuropéptidos tales como la Proopiomelanocortina, Proencefalina, Prodinorfina, Provasopresina, Prooxitocina, ProCRF (factor liberador de córticotropina), ProGRF (factor de liberación de hormona del crecimiento), Prosomatostatina, Proglucagon, Procalcitonina, ProCGRP (péptido relacionado con el gen de la calcitonina), ProVIP (péptido intestinal vasoactivo), Procaerulina y ProELH (hormona de la puesta de huevos), interleucinas, interferones y factores hematopoyéticos.

La invención puede también aplicarse a proteínas que no necesiten por ellas mismas procesamiento endoproteolítico. Ejemplos son construcciones de genes en las cuales, por razones de buen procesamiento (glicosilación) o purificación preparada (secreción), una secuencia que codifica la proteína deseada se une a una secuencia siñalética apropiada, tal como se ha propuesto anteriormente, por ejemplo, para la producción de eritropoyetina en las células de la levadura por Elliot y otros, Gene 79, 1989, 167-180. En esta publicación, se describe una construcción génica de la región líder del factor prepro-alpha situado antes de la secuencia de la eritropoyetina. El procesamiento del precursor sintético resultante se realiza en las células de levadura por el producto del gen KEX2 allí presente.

Se proporcionará una ilustración posterior de la invención respecto de las figuras acompañantes, en las que:

La figura 1 muestra la secuencia aminoácida (en código de una letra) de la furina, que consta de 794 aminoácidos;

La figura 2 muestra esquemáticamente el gen de la furina, cADN y proteína.

a.

Organización genómica de parte del gen fur. El exon 1 (alrededor de 120 pares de bases) está localizado a 7,2 kb por encima del exon 2. El asterisco por encima del axon 2 indica la posición del códon de iniciación, y la flecha por encima del extremo del exon 16 el códon de detención. Las secuencias no codificantes están representadas por zonas negras. B = BamHI; E = EcoRI; K = Kpnl; S = Sall; P = Pstl; X = Xbal.

b.

Distribución esquemática de exones en el cADN de fur.

c.

Localización putativa de los distintos dominios proteicos en la furina. El exon más grande (exon 16) codifica casi completo el dominio rico en Cys el dominio de transmembrana y el dominio citoplásmico. Los exones 2-12 codifican los presuntos dominios prepro y catalíticos, con codones para los residuos de sitio activo Asp46 (D), His87 (H) y Ser261 (S) en los exones 5,7 y 10, respectivamente. Esta distribución intron/exon es del mismo grado de complejidad que la observada en la familia tripsina de las serinas proteasas. Las flechas verticales indican pares de residuos básicos (Arg-Arg, Lys-Arg) que son sitios de autoprocesamiento potencial: los pares de residuos aminoácidos básicos Arg310-Lys311 y Arg341-Lys342 están implicados posiblemente en la fragmentación proteolítica. El extremo N de la proteína madura se supone que empieza en el residuo aminoácidos 108 por detrás directamente del triplete de sitios de fragmentación potencial (Lys-Arg-Arg-Thr-Lys-Arg), porque se ha encontrado que un residuo de arginina (Arg104) en posición -4 respecto al sitio de fragmentación propuesto potencia la eficiencia de la fragmentación.

Las regiones en las cuales las secuencias aminoácidas de la furina, Kex1 (Kluyveromyces lactis) y Kex2 (Saccharomyces cerevisiae) exhiben semejanza, incluyen partes del dominio prepro, del dominio catalítico completo (47% de identidad en 322 residuos) y del dominio medio completo (26-31% en 138 residuos). No existe semejanza significativa en los dominios transmembranales y citoplásmicos, mientras que el dominio rico en Cys no está presente en las dos proteínas de las levaduras.

La figura 3 muestra una comparación de las secuencias aminoácidas de la furina humana (hfur), proteasa Kex1 (Kex1), proteasa Kex2 (Kex2), termitasa (ther), subtilisina Carlsberg (subc) y subtilisina BPN' (subB).

A mano derecha, se da la numeración de los residuos aminoácidos a partir del extremo N putativo de los enzimas maduros, y para la furina, también a lo largo de la parte superior. Probablemente, la furina posee un segmento prepro de 107 residuos que termina con la secuencia Lys-Arg-Arg-Thr-Lys-Arg, la cual tiene tres sitios de fragmentación potencial para autoactivación.

Residuos idénticos (\triangledown) y sustituciones conservadoras (.) en la totalidad de las seis secuencias: residuos idénticos (:) en al menos cuatro secuencias. Los pares de residuos básicos en la furina Kex1 y Kex2, se indican en letras minúsculas. La alineación secuencial se toma a partir de una alineación múltiple de más de 20 miembros de la familia subtilisina de las serina proteasas y de una superposición de las estructuras tridimensionales de la termitasa, subtilisina Carlsberg y subtilisina BPN' determinadas mediante cristalografía de rayos X. Esta superposición de las tres estructuras tridimensionales conduce a un núcleo consensual extendido, tal como se muestra por las franjas continuas, con distancias de menos de 1,5 \ring{A} entre átomos C\alpha topológicamente equivalentes. Los elementos estructurales secundarios comunes a la totalidad de las tres proteínas se indican como (\alpha) \alpha-hélice, (\beta)\beta-lámina, (t) \beta-espiral y (s) vuelta.

Los residuos que se sabe están implicados en la unión del sustrato o del inhibidor en la termitasa, subtilisina Carlsberg y subtilisina BPN' mediante interacciones de la cadena principal o de la secundaria, están marcados con asterisco. Los residuos esenciales del sitio activo (D, H y S) y de la cavidad del oxianión (N) están subrayados. Los bucles que corresponden a los sitios de unión más intensos del ión Ca en la termitasa se indican por <== Ca ==>.

Los límites de los exones que codifican secuencias del presunto dominio catalítico de la furina, se localizan por detrás de los residuos 17, 60, 86, 115, 173, 244, 278, 311 y 352.

La figura 4 muestra un modelo esquemático del dominio catalítico de la furina. El modelo se basa en un esquema acintado de la subtilisina. El sitio activo, que consta de los residuos Asp 46, His 87 y Ser 261, está situado en el centro de la parte superior. La extensión del extremo C (sombreada) que contiene dominios adicionales empieza en el lado opuesto del dominio catalítico.

Las posiciones predichas de 8 inserciones cortas (negro continuo), que incluyen un extremo N extendido, respecto de la subtilisina, se aprecian situadas en bucles superficiales y en conexiones entre elementos estructurales secundarios conservados de \alpha-hélices y \beta-láminas.

Las posiciones predichas de dos iones cálcicos estabilizantes, Ca1 y Ca2, como en la termitasa, se indican mediante esferas sombreadas en los bucles externos 98-105 y 68-77, respectivamente. Todos los grupos carboxilos de la cadena lateral que son necesarios para la coordinación de estos dos iones cálcicos como en la termitasa, están también presentes en la furina en residuos equivalentes topológicamente en estos bucles; además, Asp8 y Asp55 están presentes para coordinar Ca1 como en la termitasa y subtilisina, donde en posiciones topológicamente equivalentes Gln o Asp son los ligandos.

Se muestran en líneas de puntos las uniones bisulfuro predichas Cys104-Cys253 y Cys196-Cys226 (o Cys 198-Cys226).

Se muestran grupos negativamente cargados de la cadena lateral sobre el sitio de unión del sustrato (parte superior) de la molécula de furina como pies ahorquillados y corresponden a los residuos 46, 47, 84, 121, 123, 126, 150, 151, 152, 192, 194, 199, 241, 248 y 255. La mayoría de estas cargas no están presentes en posiciones equivalentes en las subtilisinas y en la termitasa. Muchos de estos residuos negativamente cargados podrían interaccionar directamente con residuos básicos pares en el sustrato, pues se localizan probablemente en o cerca de las bolsas de unión P1 y P2 para la lisina y/o la arginina.

El modelo descrito para el dominio catalítico de la furina, se aplica también a las proteasas Kex1 y Kex2, ya que esencialmente todos los elementos importantes que se han descrito anteriormente, están presentes en las tres proteínas.

La figura 5 muestra esquemáticamente la organización estructural de prepro-vWF del Factor von Willebrand de tipo salvaje (parte superior) y de prepro-vWFgly763 del mutante vWFgly763 (parte inferior). Los dominios homólogos internos se indican mediante recuadros abiertos; A1, A2 y A3 representan un dominio triple; B expresa los dominios homólogos B1, B2 y B3; C1 y C2 representan un dominio duplicado; D1, D2, D3 y D4 representan cuatro dominios repetidos, y D' representa un dominio parcialmente duplicado. La línea continua indica las secuencias aminoácidas restantes. La parte aminoterminal contiene un péptido señal de 22 residuos de aminoácidos. El sitio de fragmentación después del residuo de arginina es la posición 763, que consta de un par de residuos de aminoácidos básicos, está marcado con una flecha. Se proporciona la secuencia nucleótida de la región del ADN de alrededor del sitio de fragmentación, y la secuencia aminoácida que se deduce, se presenta en notación de una letra. La mutación puntual en pro-vWFgly763 está marcada con un asterisco.

Se facilitará a continuación un ejemplo de un procedimiento según la invención, en el cual la actividad endoproteolítica de la furina se utiliza en el procesamiento del precursor del factor de von Willebrand (pro-vWF) como sustrato. Respecto a la estructura de prepro, pro y vWF maduro, se hace referencia a Verweij y otros., EMBO J. 5, 1986, 1839-1847, y Verweij y otros., J. Biol. Chem 263, 1988, 7921-7924. Pro-vWF consta de un propolipéptido (741 residuos aminoácidos) y, en el extremo C, vWF maduro (2050 residuos de aminoácidos). Tal como se explica en las publicaciones anteriores, el vWF maduro se forma a partir de pro-vWF mediante procesamiento proteolítico cercano a los pares de aminoácidos básicos Lys762-Arg763, y las células COS-1 constituyen un huésped apropiado para la síntesis de vWF secretado constitutivamente tras transfección del cADN completo de prepro-vWF. La actividad de la furina en el procedimiento endoproteolítico, se ensayó para ambos, el pro-vWF, y el mutante pro-vWFgly763 descrito por Voorberg y otros, EMBO J. 9, 1990, 797-803. El ADN que codifica este mutante pro-vWFgly763 contiene una guanosina en vez de una adenosina en la posición 2407 del cADN de longitud total del prepro-vWF. Como resultado de esta mutación, el sitio de fragmentación Lys762-Arg763 del propolipéptido, es reemplazado por Lys762 y Gly763 en la proteína mutante precursora pro-vWF.

Ejemplos Identificación de los productos de la traducción codificados por la totalidad del fur cADN transfectado a las células COS-1

Para caracterizar posteriormente el producto del gen fur, la furina, se llevaron a cabo experimentos para sintetizar esta proteína en las células eucariotas bajo el control del último promotor del SV40 y utilizar este material en un intento por elucidar su función. Para identificar los productos de la traducción del gen fur, se seleccionó un enfoque inmunológico. Un antisuero policlonal producido en conejos, frente a una proteína híbrida de furina recombinante, tal como se describe en "Materiales y Métodos", se utilizó en análisis de transferencia Western de proteínas en lisados totales de bacterias transformadas con pMJ109, pMJ119 o pEW1 ADN. El antisuero policlonal reconoció \beta-gal-\Deltafurina1, 336trpE-AS-\Deltafurina1 y GST-\Deltafurina2, respectivamente. En experimentos de control, el antisuero no reaccionó con la cadena polipeptídica codificada por trpE de la antranilato sintetasa o la glutation-S-transferasa. Utilizando este antisuero, se llevó a cabo un análisis de transferencia Western para detectar las proteínas codificadas por el gen fur en las células COS1 transfectadas con pSVLfur. Basándose en los datos de la secuencia nucleótida del cADN fur, puede esperarse la síntesis de un primer producto de traducción con un peso molecular calculado de 87 kDa. Se detectaron dos proteínas con pesos moleculares aparentes de alrededor de 90 y 100 kDa, respectivamente, en células COS-1 transfectadas, comparándolas con células COS-1 no transfectadas (resultados que no se muestran).

La presencia de dos formas de la furina en las células COS-1 transfectadas con pSVLfur ADN, indica que la furina se somete a modificación post-traduccional. Es posible que la proteína de 100 kDa sea una forma glicosilada del producto primario de alrededor de 90 kDa. Sin embargo, es también tentador especular que el polipéptido de 100 kDa represente la pro-forma, mientras que el polipéptido de 90 kDa representa la furina madura, generada mediante (auto)procesamiento proteolítico de la unión peptídica entre los residuos 107 y 108.

Se hace notar que las células COS-1 no transfectadas contienen también pequeñas cantidades de material inmunorreactivo con pesos moleculares aparentes de 90, 60 y 40 kDa. Aunque la identidad de estas proteínas está por establecer, se concibe que la proteína de 90 kDa represente una cantidad escasa de furina endógena.

Los datos indican que las secuencias genéticas fur transfectadas, se transcriben verdaderamente y se traducen, haciendo posible ensayar la función biológica de los productos fur.

Actividad procesadora proproteica de la furina

En los experimentos de transfección con 10 \mug de pSVLvWF ADN, la proteína precursora pro-vWF de 360 kDa, y la proteína vWF madura de 260 kDa, se encontraron en virtualmente idénticas proporciones en el medio condicionado. La formación del vWF maduro en las células obtenidas mediante transfección, se atribuye a un procesamiento por la furina endógena, la cual se expresa en las células COS-1 tal como se muestra mediante el análisis de transferencia Northern del ARNm aislado de las células COS-1 y mediante análisis de inmunoprecipitación con un suero policlonal de conejo anti-furina.

En experimentos similares de transfección de células COS-1 con 10 \mug de pSVLvWFgly763 ADN, se encontró que pro-vWFgly763 se formó y secretó constitutivamente en el medio de cultivo como una proteína de 360 kDa. No existió procesamiento endoproteolítico a vWF madura (260 kDa).

Se encontró idéntico resultado cuando se llevó a cabo una cotransfección de 5 \mug de pSVLvWFgly763 ADN y 5 \mug de pSVLfur ADN. No se observó procesamiento de pro-vWFgly763 a vWF madura.

Por otra parte, cuando células COS-1 se cotransfectaron con 5 \mug de pSVLvWF ADN y 5 \mug de pSVLfur ADN, se encontró un procesamiento completo de pro-vWF a vWF madura.

Materiales y métodos Clonación molecular

pSVLfur contiene un fragmento fur cADN de una longitud completa de 4,1 kb, que empieza 117 nucleótidos por encima del codon de inicio ATG y finaliza 21 nucleótidos por debajo del sitio de adición poly-A clonado en el sitio EcoRI de pSVL (Wells y otros, Nucl. Acids Res 11, 1983, 7911-7925). En pSVLfur, la expresión de las secuencias de fur cADN está bajo el control del último promotor de SV40. pMJ109 consta de un fragmento Smal/Smal de 2,2 kb de fur cADN humano clonado molecularmente en el sitio HindIII del plásmido pUR291; el fur cADN de 2,2 kb, abarca la región carboxiterminal de la furina, la cual en pMJ109 se fusiona en fase con las secuencias que codifican la \beta-galactosidasa (\beta-gal) utilizando la región polienlace construida justamente delante del codón de detención en lacZ. pMJ119 contiene el mismo fragmento fur cADN de 2,2 kb pero aquí clonado molecularmente en el sitio Smal del plásmido pATH1 lo cual tiene como resultado la fusión en fase de las secuencias de la furina a los 336 primeros residuos aminoácidos de la porción codificada por trpE de la antranilato sintetasa (336trp E-AS). Finalmente, en caso de pEW1, un fragmento BgIII/EcoRI de 3,5 kb de fur cADN se clona en pGEX-3X y se fusiona en fase con la glutation -S-transferasa (GST).

Tras inducción apropiada de la síntesis proteica en bacterias transformadas con pMJ109, pMJ119 o pEW1, se observó la producción de relativamente grandes cantidades de \beta-gal-\Deltafurina1 (peso molecular 170 kDa), 336trpE-AS-\Deltafurina1 (peso molecular 90 kDa) y GST-\Deltafurina2 (peso molecular 100 kDa), respectivamente.

Preparación de anticuerpos policlonales antifurina e inmunotransferencia

Anticuerpos policlonales antifurina de produjeron en conejos contra la proteína híbrida \beta-gal-\Deltafurina1 sintetizada en bacterias transformadas mediante pMJ109. Para las inmunizaciones, se utilizaron preparados de la proteína híbrida parcialmente purificada. Tras fraccionamiento por tamaños de las proteínas bacterianas mediante SDS-PAGE, se separó la región del gel que contenía proteína híbrida y el contenido proteico se retiró electroforéticamente. Se llevaron a cabo experimentos de transferencia Western con extractos de células COS-1 transfectadas, de la manera siguiente. Células COS-1 transfectadas con 10 \mug de pSVLfur ADN, se conservaron 48 horas después de la transfección en un medio libre de suero. Entonces, las células se lavaron dos veces con 10 mM de fosfato sódico (pH 7,4), 0,14 M de NaCl, lisándose entonces en "tampón de inmunoprecipitación (IPB)" que constaba de 10 mM de Tris-HCl (pH 7,8), 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, Nonidet P-40 al 1% (vol/vol), 10 mM de benzamidina, 5 mM de etilmaleimida y 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF). Una parte alícuota del extracto celular se llevó bajo condiciones reductoras a un gel SDS-poliacrilamida al 8% (peso/vol) y, posteriormente, las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa (Schleider y Schuell). Se realizó la detección de la furina mediante incubación de los "borrones" con el suero de conejo antifurina descrito anteriormente.

Transfección del ADN, radiomarcado de las células y análisis de inmunoprecipitación

Células COS-1 renales de mono se cultivaron en medio mínimo modificado de Iscove, suplementado con suero de ternera fetal (10% vol/vol) y antibióticos [penicilina (10,0 U/ml)y estreptomicina (100 \mug/ml)]. Tras veinticuatro horas de la siembra, las células semi-confluentes se transfectaron con 20 \mug de ADN en 2 ml de medio mínimo modificado de Iscove, suplementado con 200 \mug/ml de DEAE-dextrano. El procedimiento de transfección utilizado incluyó un shock de cloroquina (Luthman y Magnusson, Nucl. Acids Res. 11, 1983, 1295-1308). Después de la transfección, las células se conservaron en el medio anteriormente descrito durante 48 horas. Antes del radiomarcado, se eliminó el medio y las células se incubaron durante 1 hora en medio RPMI, al que le faltaba metionina. Posteriormente, las células ser marcaron durante 4 horas en presencia de metionina (^{35}S) (50 \muCi/ml, actividad específica > 800 Ci/mmol), seguido por un tratamiento de 14 horas con metionina no marcada (concentración final de 1 mM).Después de centrifugación durante 5 minutos a 13000 x g, los medios de cultivo marcados se ajustaron a 1 x IPB. Se llevó a cabo el preaclaramiento de los medios incubándolos dos veces con gelatina Sepharosa y, posteriormente, con complejos preformados de suero preinmune de conejo con Proteína A-Sepharosa. Se llevó a cabo la inmunoprecipitación de las proteínas relacionadas con el vWF radiomarcado mediante complejos preformados de una preparación IgG, derivada de anti-vWF de conejo (Dakopatts, Glostrup, Dinamarca) con Proteína A-Sepharosa. Se lavaron extensivamente los inmunoprecipitados con IPB y se obtuvo el sedimento mediante un gradiente de sacarosa al 10-20% (peso/vol) discontinuo, disuelto en IPB suplementado con desoxicolato al 0,5% y 10 mM de Tris-HCl (pH 7,8), respectivamente. Los inmunoprecipitados se analizaron bajo condiciones reductoras sobre un gel de SDS-poliacrilamida al 5%.

Claims (8)

1. Procedimiento in vitro para el procesamiento endoproteolítico de una proteína, tratándola con un enzima endoproteolíticamente activo, en el que dicho enzima endoproteolíticamente activo es la furina, o un fragmento endoproteolíticamente activo, derivado o proteína de fusión de la furina.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que dicha proteína se fragmenta in vitro tratándola con el enzima endoproteolíticamente activo en presencia de iones de Ca^{2+.}

3. Procedimiento, según la reivindicación 2, en el cual el tratamiento se lleva a cabo a un pH de 5-7,5, preferentemente 5,5-7,0.

4. Procedimiento, según la reivindicación 2 ó 3, en el cual el tratamiento se lleva a cabo a una concentración de calcio de 1-10 mM, preferentemente a 2-5 mM.

5. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en el que el tratamiento se lleva a cabo en presencia de o-fenantrolina o de un agente equivalente de fijación de iones metálicos distintos al calcio.

6. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en el cual el tratamiento se lleva a cabo a una temperatura de 20-50ºC, preferentemente de 30-40ºC.

7. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en el que el tratamiento se aplica a una proteína precursora de una hormona polipeptídica, un factor de crecimiento, una toxina, un enzima, o cualquier otro tipo de proteína biológicamente activa.

8. Célula eucariota que contiene ADN derivado de ADN recombinante que codifica la furina y capaz de expresar la furina.