ES2120431T5 - Ensayo para medir la degradacion del colageno tipo i. - Google Patents

Abstract

UN ANTICUERPO OBTENIDO DEL TELOPEPTIDO ENLAZADO EN CRUZ CARBOXITERMINAL DE COLAGENO TIPO I AISLADO DEL HUESO ANIMAL O HUMANO DESCALCIFICADO, QUE SE PUEDE UTILIZAR EN UN ENSAYO PARA DETERMINAR LA CONCENTRACION DE LA REGION TELOPEPTIDA CARBOXITERMINAL LIBERADA DE LA MOLECULA DE COLAGENO TIPO I EN UNA MUESTRA. CUANDO LA MUESTRA ES UN CUERPO LIQUIDO COMO POR EJEMPLO SUERO U ORINA, EL PRODUCTO DE DEGRADACION MEDIDO SE RESISTE A SEGUIR DEGRADANDOSE, PUESTO QUE CONTIENE UN ENLACE EN CRUZ INTERMOLECULAR MULTIVALENTE Y POR TANTO SE PUEDE ENCONTRAR EN EL LIQUIDO DEL CUERPO. EL ENSAYO SE PUEDE UTILIZAR PARA EVALUAR LA DEGRADACION DEL COLAGENO TIPO I, EL CONSTITUYENTE ORGANICO PRINCIPAL DE LA MATRIZ OSEA.

Description

Ensayo para medir la degradación del colágeno tipo I.

Esta invención se refiere a un ensayo para medir la degradación del colágeno tipo I y evaluar de esta forma la tasa de reabsorción ósea, y un estuche (kit) adecuado para llevar a cabo dicho ensayo.

El colágeno tipo I es el tipo del colágeno más abundante en el cuerpo humano. Se encuentra junto con otros tipos del colágeno en los tejidos conectivos blandos, pero también forma el armazón del hueso mineralizado, donde es prácticamente el único tipo del colágeno presente y donde representa aproximadamente el 90% del material orgánico total. El colágeno tipo I se encuentra también en los huesos de los vertebrados no humanos.

A lo largo de la vida, el hueso es un tejido metabólicamente activo. Los procesos de síntesis de nueva matriz y renovación de la matriz existente están, por regla general, estrechamente asociados uno a otro tanto en lo que se refiere al espacio como al tiempo. En los estados de enfermedad, este equilibrio puede verse alterado; v.g., en la osteoporosis, la reabsorción ósea excede a largo plazo de la síntesis, lo que conduce a una masa ósea disminuida. De forma similar, la artritis reumatoide y diversos carcinomas con metástasis óseas inducen destrucción local de hueso.

El documento WO 88/08980 describe la preparación del telopéptido aminoterminal del colágeno tipo III.

El documento EP-A-171176 describe una composición para reparar defectos óseos por la utilización de suspensiones que contienen telopéptido purificado, colágeno fibrilar de piel reconstituido o polvo del colágeno óseo, o una mezcla de los mismos. El polvo del colágeno óseo se puede preparar por limpieza, congelación, pulverización y desmineralización de hueso; separación de la materia orgánica residual y digestión de la misma utilizando enzimas proteolíticas tales como la tripsina. El polvo del colágeno óseo resultante retiene aparentemente la arquitectura molecular original del colágeno óseo y está exento de telopéptidos.

La cantidad del colágeno tipo I sintetizado se puede estimar basándose en un método de ensayo para el propéptido carboxiterminal del procolágeno tipo I, que se realiza sobre muestras de sangre. La degradación del colágeno se ha evaluado durante mucho tiempo determinando la excreción urinaria de hidroxiprolina. Sin embargo, este método es tedioso, necesita recogida de la orina de 24 horas, y no es específico para un tipo del colágeno particular.

El documento WO 89/04491 describe un método para ensayar las tasas de reabsorción ósea que consiste en cuantificar la concentración de fragmentos de péptidos específicos que tienen reticulaciones de 3-hidroxipiridinio derivadas del colágeno óseo hallado en un fluido corporal. El método utiliza anticuerpos producidos contra fragmentos de péptido aislados de la orina de pacientes con la enfermedad de Paget. El fragmento de péptido que inicialmente se creía era el telopéptido carboxiterminal del colágeno tipo I, se encontró más tarde que no era una estructura covalente in vivo. El método evalúa reticulaciones de piridinolina derivada del colágeno en orina. A pesar de algunas ventajas sobre el ensayo de la hidroxiprolina, este método comparte sus principales inconvenientes. Hay necesidad de un método específico para determinar la degradación del colágeno tipo I basado en muestras de suero.

La presente invención proporciona un método de este tipo que es rápido y sencillo de llevar a cabo.

Se ha encontrado que, en el curso de la degradación del colágeno óseo, cuando se forman diversos fragmentos diferentes, se libera un cierto fragmento reticulado que es resistente a la degradación ulterior y mantiene intacta su estructura inmunoquímica. Por esta razón aparece en la circulación en una forma que puede medirse cuantitativamente con facilidad utilizando un inmunoensayo. Este extremo no helicoidal carboxiterminal de la molécula del colágeno tipo I, la llamada región telopeptídica, que participa en las reticulaciones multivalentes intermoleculares en una matriz insoluble del colágeno, se puede ensayar por métodos inmunológicos, v.g. por un radioinmunoensayo, y proporciona información significativa sobre la degradación del colágeno tipo I.

Este descubrimiento se puede utilizar en cualquier método de inmunoensayo conocido empleando un anticuerpo específico para el telopéptido carboxiterminal del colágeno tipo I que puede obtenerse a partir de hueso de un ser humano u otro animal vertebrado. Así pues, la invención proporciona un método para ensayar un producto de degradación del colágeno tipo I, que comprende poner en contacto en cualquier orden (i) una muestra que se sabe o se sospecha contiene este producto; (ii) un anticuerpo específico para el telopéptido carboxiterminal del colágeno tipo I que puede obtenerse a partir de hueso de un ser humano u otro animal vertebrado; y (iii) un marcador; en condiciones tales que el marcador se llegue a fijar en una cantidad que depende de la cantidad de producto de degradación del colágeno tipo I presente en dicha muestra, y ensayar luego el marcador fijado y/o no fijado como medida de la presencia o nivel de producto de degradación del colágeno tipo I presente en dicha muestra.

Un método de este tipo sería útil para evaluar la degradación del colágeno en vertebrados tanto humanos como no humanos. Por ejemplo, en los seres humanos, se pueden diagnosticar o controlar los estados de enfermedad asociados con un trastorno de la síntesis o renovación de la matriz ósea. En vertebrados no humanos, tales como roedores, cánidos, bovinos y felinos, se pueden hacer valoraciones similares que pueden tener utilidad en ciencia veterinaria o en la evaluación de productos farmacéuticos.

El inmunoensayo necesita la utilización de un anticuerpo específico para el telopéptido carboxiterminal del colágeno tipo I. Un anticuerpo adecuado es uno que se ha producido contra el telopéptido reticulado carboxiterminal del colágeno tipo I que puede obtenerse a partir de hueso de un ser humano u otro animal vertebrado, y que es proporcionado por la presente invención. El telopéptido utilizado para producir el anticuerpo se puede obtener a partir de hueso de un vertebrado humano o no humano. En la exposición más detallada que sigue, el colágeno a que se hace referencia es colágeno humano, pero se apreciará que la doctrina puede aplicarse adecuadamente al colágeno de cualquier vertebrado.

El telopéptido reticulado utilizado como antígeno para producir el anticuerpo puede aislarse de colágeno óseo. Como se ha indicado anteriormente, el fragmento reticulado del telopéptido es resistente a la degradación ulterior y por lo tanto es una elección adecuada como antígeno para producir el anticuerpo.

La presente invención proporciona también un procedimiento para aislar el telopéptido reticulado carboxiterminal del colágeno tipo I que comprende someter tejido óseo insoluble descalcificado a desnaturalización, y cromatografía utilizando una pluralidad de pasos de separación en fase inversa con cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), llevándose a cabo al menos dos de los pasos de la separación a pH diferente.

Cuando las moléculas del colágeno tipo I se ensamblan en fibras de colágeno, se forman reticulaciones intermoleculares entre la región del telopéptido carboxiterminal de una molécula y un sitio particular dentro de la mitad aminoterminal de la región helicoidal triple de otra molécula. Estas reticulaciones jóvenes maduran lentamente en reticulaciones multivalentes, que en el colágeno óseo tienen la estructura química de piridinolina o deshidropiridinolina y que se derivan de dos hidroxilisinas o de lisina o sus aldehídos en los telopéptidos carboxiterminales y una hidroxilisina residen en la región helicoidal (aminoácido número 87 contado a partir del terminal amino). Las estructuras de piridinolina de este tipo tienen una fluorescencia característica, gracias a la cual se pueden identificar fácilmente los péptidos que contienen piridinolina. Estas reticulaciones multivalentes hacen que el colágeno sea insoluble en los procedimientos de extracción ordinarios con soluciones neutras o ácidas. Los péptidos que están unidos todavía por tales reticulaciones se pueden aislar después de someter el tejido óseo insoluble descalcificado que contiene principalmente colágeno tipo I reticulado después de la desnaturalización a una digestión completa con una enzima proteolítica tal como tripsina o colagenasa bacteriana. Los péptidos reticulados liberados se purifican luego por métodos cromatográficos utilizando preferiblemente una pluralidad de pasos de separación en fase inversa por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

La región del telopéptido reticulado aislado acoplada a una proteína no afín, v.g. albúmina, o moléculas del colágeno tipo I intactas, aisladas en forma soluble a partir de extractos de tejido salinos o ácidos, se puede utilizar luego para producir un anticuerpo específico, v.g. por inmunización de un animal adecuado utilizando métodos bien conocidos en la técnica; véase, por ejemplo, "Immunochemistry of the Extracellular Matrix", ed. H Furthmayr, CRC Press, Boca Raton, EE.UU., 1982, y especialmente los artículos de Furthmayr pp 143-178, Linsenmayer et al, pp 179-198 y Timpl et al, pp 199-235. Un anticuerpo telopeptídico del colágeno tipo I muy específico se produce óptimamente por la inyección subcutánea del colágeno tipo I en animales de laboratorio, p. ej. conejos en el caso de anticuerpos policlonales y ratones para anticuerpos monoclonales, en presencia de un adyuvante adecuado. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal y de tipo IgG o IgM.

El anticuerpo producido por el método anterior es específico para la región del telopéptido carboxiterminal, esté reticulada o no. El telopéptido medido en el ensayo de una muestra de suero está reticulado, ya que el telopéptido no reticulado no es resistente contra la degradación posterior en el curso de la renovación del colágeno tipo I y por consiguiente no se puede encontrar en el suero. Sin embargo, la naturaleza de la reticulación no es crítica, dado que un péptido aislado del colágeno tipo I de tejido blando que contiene otro tipo de reticulación (derivada de lisina/hidroxilisina e incluso de histidina) puede ser detectado por un anticuerpo obtenido por el proceso descrito anteriormente. También se puede utilizar el mismo anticuerpo para medir moléculas del colágeno tipo I solubles (v.g. en el curso de experimentos de cultivo celular, etc) que contienen la región telopeptídica, pero no están reticuladas. Este tipo de situaciones no se encuentran con muestras de suero, pero pueden aparecer cuando se ensayan otros fluidos fisiológicos o tisulares (líquido ascítico, secreciones de heridas, etc).

El inmunoensayo propiamente dicho puede llevarse a cabo utilizando cualquier método, pero preferiblemente un método heterogéneo que incluye un paso de separación de fases, tal como uno conocido por las iniciales RIA, ELISA, FIA, TR-FIA, EIA e IRMA.

Preferiblemente, el ensayo se lleva a cabo en forma de radioinmunoensayo utilizando telopéptido de colágeno tipo I carboxiterminal reticulado humano aislado, y un anticuerpo específico para el mismo. El telopéptido se marca con un radionucleido, preferiblemente yodo 125, utilizando por ejemplo el método de la cloramina T, separándose el yodo libre por medio de un cartucho de fase inversa desechable. También se pueden utilizar otros métodos de marcación que utilizan marcadores enzimáticos o fluorescentes, v.g. europio. Se han descrito en la bibliografía técnicas conocidas que pueden utilizarse en el inmunoensayo, v.g. en el libro "Immunochemistry of the Extracellular Matrix" mencionado anteriormente. Por ejemplo, en un método, se ponen en contacto con el anticuerpo un propéptido carboxiterminal del colágeno tipo I reticulado marcado y la muestra, el complejo antígeno-anticuerpo así formado se separa del material inicial no complejado y se ensaya el marcador complejado o no complejado. La separación del complejo antígeno-anticuerpo se puede facilitar poniendo en contacto el complejo antígeno-anticuerpo con un segundo anticuerpo específico para el primer anticuerpo y separando el complejo antígeno-anticuerpo-anticuerpo de los materiales iniciales no complejados.

El método de inmunoensayo de la invención permite la determinación de productos de degradación del colágeno tipo I en suero humano u otros fluidos corporales. La concentración del telopéptido reticulado en suero normal es aproximadamente 1,5 a 4,2 microgramos/litro y está incrementada, v.g. en pacientes de carcinoma prostático o de mama con metástasis osteolíticas, que pueden tener un aumento de hasta 20 veces en la concentración de los productos de degradación del colágeno tipo I. El método de ensayo es capaz de detectar 0,5 microgramos/litro del telopéptido reticulado.

Los Ejemplos siguientes ilustran la invención.

Ejemplo I Preparación de telopéptido carboxiterminal reticulado del colágeno tipo I a partir de hueso humano o hueso de animales experimentales, y producción de un anticuerpo específico contra el mismo

En primer lugar, se aísla colágeno tipo I insolubilizado a partir de hueso humano o de un animal experimental (v.g. rata, cobayo, perro, bovino). En el caso del hueso humano, se obtienen rodajas de un cm del hueso femoral a partir de la cabeza del fémur extirpada durante la cirugía facultativa de reemplazamiento de la articulación de la cadera. En el caso de animales experimentales, el hueso femoral se prepara después de decapitación del animal. Los huesos se extraen con acetona para eliminar la grasa presente en la médula ósea. Después de secarlas al aire, las rodajas se dividen en trozos más pequeños y por último se pulverizan en nitrógeno líquido utilizando un molino de minerales (Raetsch AG, Alemania). Se extraen las proteínas no colagenosas a +4ºC durante 24 h con guanidina/HCl 4 M en tampón Tris/HCl 50 mM, de pH 7,4, que contiene inhibidores de proteasa (ácido aminocaprónico 0,1 M, benzamidina /HCl 5 mM y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM). Después de la extracción, el polvo de hueso se lava varias veces con agua destilada para eliminar las trazas del tampón de extracción. Se desmineraliza luego el polvo de hueso todavía mineralizado por extracción a +4ºC con EDTA 0,5 M ajustado a pH 7,4 y que contiene urea 6 M. La extracción se repite dos veces. El residuo insoluble se recoge por centrifugación (15.000 x g durante 30 mis) y se lava varias veces con agua destilada para eliminar las trazas del tampón de extracción. Después de ello, se liofiliza el residuo. Se puede obtener aproximadamente un g del colágeno insoluble a partir de una rodaja de un cm de fémur humano.

Para la preparación de péptidos de degradación se suspenden 2 g del colágeno óseo insoluble en 100 ml de bicarbonato amónico 0,2 M y se desnaturaliza a +70ºC durante 30 min. Después de rebajar la temperatura de la solución hasta +37ºC, se digiere el material a +37ºC durante 8 h con colagenasa bacteriana (grado CLSPA, Worthington, EE.UU.) utilizando 10 mg de la enzima. Después de una nueva desnaturalización (30 min a +70ºC) se añade más enzima (10 mg) y la mezcla se incuba a +37ºC durante otras 12 h. Después de la digestión, se centrifuga la mezcla (15000 x g durante 30 min) para eliminar el material insoluble no digerido. Se ajusta luego el sobrenadante a pH 2,5 con HCl concentrado, y se añade isopropanol hasta la concentración final del 20%. Esta mezcla (aproximadamente 100 ml) se hace pasar luego en porciones de 5 ml a través de un cartucho preparativo Sep-Pak® C_{18}. El telopéptido carboxiterminal reticulado del colágeno tipo I se fija al cartucho del cual se separa con 3 ml de isopropanol al 50% en ácido acético 0,1 M. Se liofiliza luego el producto eluido hasta sequedad. Se obtiene una mezcla que contiene aproximadamente 40 mg de péptidos a partir de 2 g del colágeno insoluble.

La purificación del telopéptido carboxiterminal reticulado del colágeno tipo I se lleva a cabo utilizando dos pasos diferentes de fase inversa en cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). La mezcla de péptidos liofilizada se disuelve primeramente en ácido trifluoroacético al 0,1% y se aplica a una columna de fase inversa C_{18} (Vydac® 218TP1010). Los péptidos fijados se eluyen con concentraciones crecientes de isopropanol (10-70%, 0-45 min). Se observa el producto eluido en cuanto a la fluorescencia característica de las reticulaciones de piridinolina (excitación 295 nm, emisión 395 nm). Se recoge y liofiliza el pico del péptido fluorescente que contiene el telopéptido carboxiterminal reticulado del colágeno tipo I. Se disuelve luego el péptido (que contiene todavía una cantidad relativamente pequeña de otros péptidos contaminantes) en acetato amónico 50 mM, pH 7,4, y se aplica a una columna C_{18} en fase inversa de pH estable (Vydac® 228TP104). El péptido fijado se eluye con concentraciones crecientes de acetonitrilo (0-90%, 0-45 min). El producto eluido se controla en cuanto a fluorescencia como anteriormente, y el telopéptido carboxiterminal reticulado del colágeno tipo I, ahora homogéneo, se recoge y liofiliza. Se verifican el origen y la identidad del péptido por secuenciación de los aminoácidos N-terminales. Se pueden obtener las secuencias siguientes para el péptido humano reticulado derivado de dos telopéptidos carboxiterminales de cadenas \alpha1 del colágeno tipo I y una región de la parte helicoidal de cualquiera de las cadenas \alpha1 o \alpha2 del colágeno tipo I:

1

donde Hyp es hidroxiprolina, Hylys es hidroxilisina y 100 indica la posición de la reticulación.

Dependiendo de la enzima utilizada para liberar el péptido y variando también entre diferentes preparaciones, las secuencias de partida pueden ser varios aminoácidos más largas o más cortas. Sin embargo, esto no afecta al ensayo, dado que los determinantes inmunológicos medidos se encuentran alrededor de la reticulación (marcado 100) en la región del telopéptido de la cadena \alpha1.

El antisuero específico para el telopéptido carboxiterminal se puede obtener inmunizando conejos con 0,1 mg del telopéptido reticulado purificado, solubilizado en 1 ml de NH_{4}HCO_{3} 0,2 M y mezclado junto con 1 ml de adyuvante completo de Freund. Una parte alícuota de dos ml de la suspensión se administra intradérmicamente en el lomo de un conejo en 50 puntos diferentes. Después de 3 semanas se administra una inyección similar de refuerzo y, después de ensayar el antisuero en cuanto a fijación de antígeno marcado radiactivamente, se repite en caso necesario. Cuando se inmunizan ratones, se administra sólo 0,1 ml de una suspensión similar en el lomo de un ratón. Después de tres semanas se administra una inyección similar de refuerzo y se administra otra intraperitonealmente unos días antes de extirpar el bazo para producción de hibridoma.

Ejemplo II Comportamiento del tipo de equilibrio del radioinmuno-ensayo

Se marcan cinco microgramos del telopéptido carboxiterminal reticulado del colágeno tipo I producido como se describe en el Ejemplo I con 1 milicurie de yodo 125 utilizando cloramina T (5 microgramos). Se elimina el yodo libre después de acidificar la solución con ácido acético 0,1 M, con un cartucho preparativo Sep-Pak® C_{18}. El péptido marcado se eluye del cartucho con isopropanol al 50% en ácido acético 0,1 M.

Se preparan curvas de fijación de anticuerpo con 50.000 cómputos de radiactividad por minuto del telopéptido reticulado marcado. La concentración de telopéptido en una muestra desconocida de suero o de otros fluidos corporales se determina en el ensayo de inhibición radioinmune siguiente. Una cantidad del antisuero ensayada con anterioridad se incuba con la muestra desconocida y 50.000 cómputos por minuto del trazador durante 2 horas a +37ºC. Se añade luego un segundo anticuerpo contra gammaglobulina de conejo en (NH_{4})_{2}SO_{4} 1,2 M y, después de 30 min de incubación a +4ºC, el antígeno fijado en el complejo inmune se separa de la solución por centrifugación. La actividad de inhibición de la muestra desconocida se compara con la actividad de las concentraciones estándar del telopéptido carboxiterminal reticulado no marcado del colágeno tipo I.

Claims (15)

1. Un método para ensayar un producto de degradación del colágeno tipo I, que comprende poner en contacto en cualquier orden (i) una muestra que se sabe o se sospecha contiene dicho producto; (ii) un anticuerpo específico para el telopéptido carboxiterminal del colágeno tipo I que puede obtenerse a partir de hueso de un ser humano u otro animal vertebrado; y (iii) un marcador; en condiciones tales que el marcador llega a fijarse en una cantidad que depende de la cantidad de producto de degradación del colágeno tipo I en dicha muestra y ensayar luego el marcador fijado y/o no fijado para determinar la presencia o nivel del producto de degradación del colágeno tipo I en dicha muestra.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se produce contra el telopéptido reticulado carboxiterminal del colágeno tipo I.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el anticuerpo monoclonal se fija específicamente a un péptido que tiene la secuencia

2

donde Hyp es hidroxiprolina, Hylys es hidroxilisina y 100 indica la posición de la reticulación.

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el telopéptido carboxiterminal del colágeno tipo I marcado y la muestra se ponen ambos en contacto con dicho anticuerpo, se separa el complejo antígeno-anticuerpo así formado de los materiales de partida que no se han complejado, y se ensaya el marcador complejado o el no complejado.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el complejo antígeno-anticuerpo se pone en contacto con un segundo anticuerpo que es un anticuerpo para el primer anticuerpo, y el complejo antígeno-anticuerpo-anticuerpo así formado se separa de los materiales de partida no complejados.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el marcador es un marcador radiactivo, enzimático o fluorescente.

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el primer anticuerpo o, si está presente, el segundo anticuerpo se fija a un soporte sólido, y el complejo antígeno-anticuerpo o antígeno-anticuerpo-anticuerpo formado se separa del medio, en el que tiene lugar el contacto por separación de dicho soporte sólido.

9. Un procedimiento para aislar el telopéptido reticulado carboxiterminal del colágeno tipo I, que comprende someter tejido óseo insoluble descalcificado a desnaturalización, y cromatografía utilizando una pluralidad de pasos de separación en fase inversa por cromatografía líquida de alta resolución, realizándose al menos dos de los pasos de cromatografía a diferente pH.

10. Utilización de un anticuerpo específico para el telopéptido carboxiterminal del colágeno tipo I que puede obtenerse del hueso de un ser humano u otro animal vertebrado, en ensayos para determinar la presencia o nivel de un producto de degradación del colágeno tipo I, en una muestra que se sabe o se sospecha contiene dicho producto de degradación.

11. Un estuche adecuado para utilización en la realización de un método de ensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende un anticuerpo específico para el telopéptido carboxiterminal del colágeno tipo I y un marcador.

12. Un estuche adecuado para utilización en la realización de un método de ensayo de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende un primer anticuerpo que es específico para dicho telopéptido carboxiterminal del colágeno tipo I, un segundo anticuerpo que es un anticuerpo para el primer anticuerpo, y un soporte sólido al que se fija el primer o segundo anticuerpo.

13. Un anticuerpo producido contra el telopéptido reticulado carboxiterminal del colágeno tipo I, que puede obtenerse a partir de hueso de un ser humano o un vertebrado no humano.

14. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 13, que es un anticuerpo monoclonal específico para un telopéptido carboxiterminal del colágeno tipo I.

15. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 13, que es un anticuerpo monoclonal que se fija específicamente a un péptido que tiene la secuencia

3

donde Hyp es hidroxiprolina, Hylys es hidroxilisina y 100 indica la posición de la reticulación.