ES2126576T5

ES2126576T5 - Composiciones y procedimientos con luciferasa.

Info

Publication number: ES2126576T5
Application number: ES91919421T
Authority: ES
Inventors: Keith V. Wood
Original assignee: Promega Corp
Current assignee: Promega Corp
Priority date: 1990-09-10
Filing date: 1991-09-09
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2011-09-09
Also published as: AU8858391A; US5650289A; JP2001224398A; WO1992004468A1; ATE173298T1; US5641641A; DK0553234T3; JPH06500921A; DE69130482T2; AU649289B2; EP0553234A4; EP0553234A1; GR3029352T3; DE69130482D1; EP0553234B1; US5814471A; US5283179A; EP0553234B2; DK0553234T4; ES2126576T3

Abstract

SE DESCRIBEN METODOS Y COMPOSICIONES PARA PRODUCCION LIGERA DE CINETICA MEJORADA DE ACTIVIDAD LUCIFERASA EN REACCIONES DEL ESCARABAJO LUCIFERASA-LUCIFERIN. DE AQUI, LA INVENCION PROVEE, METODOS, COMPOSICIONES Y KITS DE PRUEBA PARA MUESTRAS DE INVESTIGACION PARA LA PRESENCIA DE ESCARABAJO LUCIFERASA O, UTILIZANDO REACCION DE ESCARABAJO LUCIFERASA-LUCIFERIN, PARA LA DETERMINACION DE LA PRESENCIA DE ATP. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN AL COMPUESTO COMPLEJO DE COENZIMA, COENZIMA A, UN ESCARABAJO LUCIFERASA Y OXILUCIFERIN EN SU ESTADO DE SALIDA EN LA REACCION DE LUCIFERASA-LUCIFERIN Y EL LUCIFERIL-COA, EL TIOESTER DE COENZIMA A Y LUCIFERIN (D ENZOTIAZOLIL)-TIAZOLINA PRESENTA LAS CURVAS DE LUMINISCENCIA EN DONDE SE HACE PRESENTE UNA COMBINACION DE COA, DTT Y BSA EN EL ENSAYO REALIZADO, ESTANDO PRESENTE SOLAMENTE COA EN EL ENSAYO, Y DONDE NO EXISTEN ADICIONES AL ENSAYO O PRUEBA CONVENCIONAL. EL EFECTO COMBINADO DE COA, DTT Y BSA RESULTA EN UNA PRODUCCION TOTAL DE LUZ MAYOR QUE 15 VECES EN LA SITUACION CON NO ADICIONES.

Description

Composiciones y procedimientos con luciferasa.

Campo técnico

Esta invención se refiere generalmente a bioluminiscencia. Más particularmente, la invención concierne a procedimientos para producción mejorada de luz a partir de la actividad de la luciferasa de escarabajo y composiciones para la realización de los procedimientos. La invención es particularmente adecuada para ensayos y estuches (kits) de prueba que utilizan luciferasa como informador o marcador para cuantificación de productos o acaecimiento de ciertas reacciones bioespecíficas.

Fundamentos de la invención

El uso de moléculas informadoras o marcadores para observar cualitativa o cuantitativamente sucesos moleculares está perfectamente establecido en ensayos utilizados para diagnosis médica, para la detección de toxinas y otras substancias en ambientes industriales, y para investigación básica y aplicada en biología, biomedicina y bioquímica. Tales ensayos incluyen inmunoensayos, ensayos de hibridación de sondas de ácido nucleico, y ensayos en los cuales la producción de una molécula informadora se debe a la transcripción de un promotor particular. Moléculas informadoras o marcadores en sistemas de ensayo de este tipo han incluido isótopos radiactivos, agentes fluorescentes, enzimas y agentes quimioluminiscentes.

Entre los sistemas de ensayo, en los que se ha empleado quimioluminiscencia para observar o medir sucesos de interés, se encuentran aquéllos en los cuales se mide la actividad de una enzima bioluminiscente, una luciferasa. El uso de ensayos de luciferasa, sin embargo, no se ha extendido considerablemente debido a la brevedad y el patrón de la emisión de luz en los ensayos. Con las luciferasas de escarabajo, esta emisión implica el alcance muy rápido de una intensidad pico, es decir, un destello de luz, seguido por una atenuación más lenta, pero todavía problemáticamente rápida, hasta una intensidad de "estado estacionario", que se atenúa aún más lentamente, y que es al principio del orden de sólo aproximadamente el 10% de la intensidad pico. La brevedad de la emisión intensa de luz requiere usualmente procedimientos de laboratorio especializados, tales como inyección rápida de la enzima en una solución de substrato, para preparar la mezcla de reacción bioluminiscente en la realización del ensayo. La necesidad de medir la luz emitida durante el "destello" continúa siendo causa de problemas experimentales. Sigue siendo difícil medir con precisión dicha luz, incluso con los luminómetros actuales.

Se conocen y han sido aislados sistemas emisores de luz a partir de muchos organismos luminiscentes, que incluyen ciertas bacterias, protozoos, celentéreos, moluscos, peces, miriápodos, moscas, hongos, gusanos, crustáceos y escarabajos, en particular las luciérnagas de los géneros Photinus, Photuris, y Luciola y escarabajos de resorte del género Pyrophorus. En muchos de estos organismos, se producen oxidorreducciones catalizadas enzimáticamente en las cuales se utiliza el cambio de energía libre para excitar una molécula a un estado de energía elevado. A continuación, cuando la molécula excitada vuelve espontáneamente al estado fundamental, se emite luz visible. Esta luz emitida se denomina "bioluminiscencia".

Las luciferasas de escarabajo, en particular la procedente de la especie de luciérnaga Photinus pyralis, han servido como paradigmas para la comprensión de la bioluminiscencia desde los primeros estudios. La luciferasa de P. pyralis es una enzima que parece carecer por completo de grupos prostéticos o iones metálicos fuertemente unidos, y posee 550 aminoácidos y un peso molecular de aproximadamente 60.000 daltons; la enzima ha estado disponible para la técnica en forma cristalina desde hace muchos años. Estudios de los componentes moleculares en el mecanismo de las luciferasas de luciérnaga para la producción de bioluminiscencia han demostrado que el substrato de las enzimas es la luciferina de luciérnaga, un ácido orgánico poliheterocíclico, el ácido D-(-)-2-(6'-hidroxi-2'-benzotiazolil)-\Delta^{2}-tiazolina-4-carboxílico (denominado en lo sucesivo "luciferina" a no ser que se indique otra cosa).

La reacción catalizada por la luciferasa de escarabajo que produce bioluminiscencia (denominada en lo sucesivo simplemente "la reacción luciferasa de escarabajo-luciferina") ha sido descrita como un procedimiento en dos pasos que implica luciferina de luciérnaga, adenosina-trifosfato (ATP), y oxígeno molecular. En la reacción inicial, la luciferina y el ATP reaccionan para formar adenilato de luciferilo con eliminación de pirofosfato inorgánico, como se indica en la reacción siguiente:

E + LH_{2} + ATP + Mg^{+2} \Rightarrow E \cdot LH_{2}-AMP + PP_{i}

en la cual E es la luciferasa, LH_{2} es la luciferina, Mg^{2+} es ión magnesio, y PP_{i} es pirofosfato. El adenilato de luciferilo, LH_{2}-AMP, se mantiene fuertemente unido al sitio catalítico de la luciferasa. Cuando esta forma de la enzima se expone al oxígeno molecular, el adenilato de luciferilo unido a la enzima se oxida para producir oxiluciferina (L=O) en un estado excitado electrónicamente. La luciferina excitada oxidada emite luz al volver al estado fundamental como se indica en la reacción siguiente:

\newpage

E\cdot LH_{2}-AMP + O_{2} \Rightarrow (E \cdot L=O \cdot AMP)\text{*} + 2H^{+} + CO_{2}

\hskip7.5cm

\downarrow

E\cdot L=O\cdot AMP + luz

Se emite un cuanto de luz por cada molécula de luciferina oxidada. El estado excitado electrónicamente de la luciferina oxidada es un estado que es característico de la reacción luciferasa-luciferina de una luciferasa de escarabajo; el color (y por consiguiente, la energía) de la luz emitida en la vuelta de la luciferina oxidada al estado fundamental viene determinado por la enzima, dado que especies diferentes de escarabajos que tienen la misma luciferina emiten luz de colores diferentes.

Cuando se inicia la emisión de luz por la inyección de ATP en una mezcla de reacción que contiene luciferasa, Mg^{2+} y luciferina, en la que todos los componentes se encuentran a concentraciones de saturación o próximas a ella, se observa un rápido aumento de intensidad seguido a su vez por una rápida disminución en los primeros segundos, seguido por una atenuación ulterior que puede durar varias horas. Se ha creído que esta disminución en la velocidad de reacción es debida a la inhibición del producto.

La luciferasa se ha utilizado como medio para ensayar concentraciones muy pequeñas de ATP; una concentración tan pequeña como ATP 10^{-16} molar puede ser detectada con preparaciones de alta calidad de la enzima. La reacción luciferasa-luciferina es altamente específica para ATP. Por ejemplo, el desoxi-ATP produce menos de 2% de la luz generada por ATP, y otros nucleósido-trifosfatos producen menos de 0,1%.

El acoplamiento de la concentración de ATP con la actividad de otras enzimas ha permitido que la luciferasa se convierta en una molécula informadora bioquímica para estas otras enzimas, así como para otros compuestos.

La disponibilidad de luciferasas de escarabajo para uso como informadores en otros ensayos no representa un problema. Dichos usos se han visto limitados, sin embargo, por la cinética problemática de la emisión de luz en la reacción luciferasa-luciferina. De no ser por dicha cinética problemática, podrían haberse empleado luciferasas de escarabajo fácilmente disponibles en aplicaciones, tales como inmunoensayos, por ejemplo ensayos con inmunosorbente unido a enzima, en los cuales una enzima sirve como informador, y ensayos de hibridación de sondas de ácido nucleico, en los cuales una enzima sirve como informador.

Además de la disponibilidad de luciferasas cristalinas aisladas directamente de los órganos luminosos de los escarabajos, están disponibles ADNs complementarios codificantes de luciferasas de varias especies de escarabajo (con inclusión, entre otras, de la luciferasa de P. pyralis (luciérnaga), las cuatro isozimas de luciferasa de P. plagiophthalamus (escarabajo de resorte), la luciferasa de L. cruciata (luciérnaga) y la luciferasa de L. lateralis (de Wet et al., Molec. Cell. Biol. 7, 725-737 (1987); Masuda et al., Gene 77, 265-270 (1989); Wood et al., Science 244, 700-702 (1989); Publicación de la Solicitud de Patente Europea Nº 0.353.464). Adicionalmente, los ADNs complementarios codificantes de luciferasas de cualquier otra especie de escarabajo que produzca luciferasas pueden ser obtenidos fácilmente por los expertos utilizando técnicas conocidas (de Wet et al. Meth. Enzymol. 133, 3-14 (1986); Wood et al., Science 244, 700-702 (1989)). Una vez que se dispone del ADNc codificante de una luciferasa de escarabajo, es totalmente inmediato para los expertos preparar grandes cantidades de la luciferasa en condiciones de alta pureza por aislamiento a partir de bacterias (v.g., E. coli), levaduras, células de mamífero en cultivo, o análogos, que se han transformado para expresar el ADNc. Diversos sistemas exentos de células, que se han hecho disponibles recientemente para fabricar proteínas a partir de ácidos nucleicos que codifican las mismas, pueden utilizarse también para producir luciferasas de escarabajo.

Adicionalmente, la disponibilidad de ADNs complementarios codificantes de luciferasas de escarabajo y la posibilidad de escrutar rápidamente ADNs complementarios que codifican que catalizan la reacción luciferasa-luciferina (véase de Wet et al., Meth. Enz., supra, y Wood et al., supra) permiten también a los expertos preparar, y obtener en grandes cantidades en forma pura, luciferasas mutantes que poseen actividad en la catálisis de la producción de bioluminiscencia a través de la reacción luciferasa-luciferina. Una luciferasa mutante de este tipo tendrá una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de una luciferasa de escarabajo existente naturalmente en una o más posiciones. En la presente descripción, la expresión "luciferasa de escarabajo" comprende no solamente luciferasas que existen naturalmente en los escarabajos, sino también los mutantes, que retienen la actividad de producción de bioluminiscencia por catalizar la reacción luciferasa-luciferina, de tales luciferasas existentes naturalmente.

La fácil disponibilidad de ADNs complementarios codificantes de luciferasas de escarabajo hace posible el uso de las luciferasas como informadores en ensayos empleados para señalar, observar o medir sucesos genéticos asociados con la transcripción y la traducción, por acoplar la expresión de un ADNc de este tipo, y por consiguiente la producción de la enzima, a tales sucesos genéticos.

Así, si bien los usos potenciales de las luciferasas de escarabajo como moléculas informadoras han llegado a adquirir importancia creciente y se han hecho muy diversos, la brevedad y el patrón de la emisión de luz causada por las enzimas ha limitado su utilidad en la práctica. Sería deseable aumentar la utilidad de las luciferasas de escarabajo como informadores efectuando con ellas una producción más eficiente de luz, es decir, emisión de luz a un régimen más cercano a la continuidad, pero todavía alto.

Un enfoque que alcanzó cierta popularidad para resolver el problema de la cinética de la reacción luciferasa-luciferina y la dificultad asociada de medir con precisión la luz emitida durante el destello, consistió en utilizar diversos inhibidores de la enzima, que según se comunicó evitaban la producción del destello o prolongaban la producción de luz. Un agente de este tipo es el arseniato. El arseniato rebaja la intensidad del destello y tiende a prolongar la emisión de luz para una cantidad de ATP dada, pero reduce la sensibilidad para la detección del ATP. Si bien preparaciones de luciferasa que contienen arseniato han estado disponibles hasta fechas recientes, el uso de tales preparaciones ya no se ve favorecido. En parte, esto es debido a que la necesidad de dicho uso puede evitarse en algunas aplicaciones con el empleo de instrumentación compleja de medición de la luz.

Sin embargo, incluso con dicha instrumentación compleja, se requieren todavía procedimientos especializados de laboratorio, tales como un formato de inyección para mezclar rápidamente la enzima y el substrato. La mejora de la cinética de la producción de luz durante la reacción enzimática, a fin de evitar la necesidad de tales procedimientos especializados y complicados, expandiría notablemente la utilidad de las luciferasas como informadores.

Se ha comunicado también que cierto número de compuestos, además de las sales arseniato, afectan al patrón de producción de luz de la reacción luciferasa de escarabajo-luciferina. Se emplearon sales fosfato con el mismo propósito que las sales arseniato, pero no se han visto favorecidas, dado que la presencia requerida de ión magnesio en los sistemas de ensayo conducía la precipitación indeseable de fosfato de magnesio cuando se utilizaban sales fosfato.

Se ha comunicado que el cofactor coenzima A (CoA), afecta al patrón de la emisión de luz en la reacción luciferina-luciferasa. Airth et al., Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 27 (1958) pp. 519-522, informan que, cuando se añade CoA a una mezcla de reacción luciferina de luciérnaga-luciferasa de luciérnaga, no se produce efecto alguno en el pico inicial de intensidad luminosa, pero la luminiscencia continuará a un nivel más alto durante un período de tiempo que es proporcional a CoA total añadida. Airth et al., han demostrado que la luz total emitida es mayor en presencia de CoA que en ausencia de la misma.

Airth et al. informan también que cisteína y glutatión no estimulan la emisión de luz y, sin proporcionar detalles, que la hidroxilamina estimula y la tioetanolamina estimula ligeramente la emisión de una manera similar a CoA.

La doctrina de Airth et al. concerniente al efecto de CoA sobre la emisión de luz por la reacción luciferina, ATP y oxígeno catalizada por luciferasa de escarabajo, es dudosa. Ateniéndose al informe de Airth et al., el efecto de CoA sobre la luciferasa se explicó sobre la base de la prevención por CoA de la inhibición de la enzima por la deshidroluciferina, un compuesto que se cree es un contaminante importante de la luciferina utilizada por Airth et al., y colaboradores subsiguientes, quienes purificaban la luciferina procedente de luciérnagas. La luciferina empleada en épocas más recientes, y hoy en día, se prepara por síntesis, y como tal, está substancialmente exenta de deshidroluciferina. Preparaciones sintéticas de luciferina están contaminadas típicamente con menos de 1%, y preferiblemente menos de 0,3%, de deshidroluciferina en peso con relación a luciferina. Así, podría esperarse que la CoA no produjera efecto alguno sobre la actividad de la luciferasa con la luciferina preparada sintéticamente. La doctrina de Airth et al. y colaboradores subsiguientes sobre la estimulación de luz con luciferasas de escarabajo por CoA (y otros compuestos mencionados en la referencia de Airth et al.) ha sido ignorada completamente durante más de 30 años en esfuerzos para ampliar la aplicabilidad práctica de ensayos basados en la emisión de luz catalizada por luciferasa. Por ejemplo, la CoA no ha sido propuesta nunca como substituto para el arseniato, a pesar de la reconocida nocividad del
arseniato.

Se ha publicado que otros compuestos de sulfhidrilo contribuyen a la estabilidad de las luciferasas durante la preparación y el almacenamiento de las enzimas. La Patente de EE.UU. Nº 4.833.075 expone que el ditiotreitol (DTT) mantendrá la actividad de luciferasa a un nivel de 50% en una solución de luciferasa de Photinus pyralis envejecida que, sin el DTT, tendría solamente 10% de actividad enzimática residual en comparación con una solución de luciferasa recién preparada. La Patente de EE.UU. Nº 4.614.712 describe que, cuando la luciferasa bacteriana se ha inactivado por formación de disulfuro, la actividad enzimática puede restablecerse por la adición de DTT, \beta-mercaptoetanol (\beta-ME), u otros reactivos reductores. La Solicitud de Patente del Reino Unido Nº GB-A-2.026.156 expone el uso de reactivos reductores como reactivos de protección del grupo tiol con objeto de estabilizar los grupos sulfhidrilo reactivos de la enzima. Un enfoque similar fue considerado por Hammerstedt (Anal. Biochem. (1973) 52, p. 449-455, que utilizó \beta-ME para estabilizar la enzima suficientemente a fin de permitir el análisis automático de grandes números de muestras que contenían ATP. Aunque las luciferasas de escarabajo y las luciferasas bacterianas difieren en estructura y acción, ambas parecen tener un grupo sulfhidrilo reactivo que puede ser protegido contra la oxidación general por ciertos agentes reductores.

Sin embargo, se ha creído en la técnica que el ditiotreitol (DTT) y reactivos de tiol similares, a concentraciones superiores a aproximadamente 5 mM, inhibirían la emisión de luz catalizada por las luciferasas.

Un enfoque alternativo fue adoptado en la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº 4.246.340. Se utilizaron uno o más inhibidores competitivos de la luciferasa, tales como análogos de D-luciferina, para prolongar la producción de luz por la reacción luciferasa/luciferina y hacer así más fáciles los análisis experimentales.

A pesar del reconocimiento y el estudio de diversos aspectos de la química de las luciferasas, la técnica anterior ha aportado poco en lo que se refiere a técnicas prácticas para una producción de luz más eficiente a partir de la reacción luciferasa-luciferina con objeto de aumentar la utilidad de la luminiscencia resultante como modo de detección.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona mejoras en la cinética de la producción de luz en reacciones luciferasa de escarabajo-luciferina e implica diversos descubrimientos relativos a la química de dicha producción de luz. La cinética mejorada de la producción de luz está asociada con la química que frena o reduce la inhibición del producto luciferasa en la reacción luciferasa-luciferina y frena la inactivación de la luciferasa que se produce durante la catálisis de la reacción de producción de luz.

Los factores cinéticos mejorados son atribuibles también en parte a dos composiciones no reconocidas anteriormente: el tioéster de CoA y luciferina y el complejo de CoA, luciferasa y luciferina oxidada en su estado excitado. La presente invención abarca estas composiciones.

Se ha descubierto que la inclusión de CoA, o un reactivo de tiol tal como DTT, o ambos en una mezcla de reacción luciferasa de escarabajo-luciferina proporciona mejoras sorprendentes en la cinética de la producción de luz por la reacción y en el rendimiento total de luz de la reacción. Adicionalmente, se ha descubierto que la inclusión de CoA en una mezcla de reacción luciferasa de escarabajo-luciferina y el sometimiento posterior de la mezcla a alguna otra condición química o físico-química por la cual la intensidad pico de bioluminiscencia de la reacción se reduce en una pequeña cantidad, produce el efecto ventajoso de aumentar el rendimiento total de bioluminiscencia de la reacción. Así, la presente invención proporciona procedimientos mejorados, y composiciones y estuches de prueba para la realización de los procedimientos, destinados a utilizar la reacción luciferasa de escarabajo-luciferina, y la bioluminiscencia producida por ella, para analizar o ensayar muestras respecto a la presencia de luciferasa de escarabajo, en cuanto a sucesos genéticos en tales muestras (v.g., de células) que conduzcan a la producción de una luciferasa de escarabajo, en cuanto a la presencia de ATP, o en cuanto a sucesos químicos o bioquímicos que conduzcan a la producción de ATP. En estos procedimientos, y con estos(as) composiciones y estuches de prueba de la invención, la cinética de la producción de luz a partir de la reacción luciferasa de escarabajo-luciferina se mejora en virtud de una relación reducida de intensidad pico a rendimiento total de dicha luz y un rendimiento total incrementado de dicha luz, o en virtud de una reducción en el régimen al que disminuye la intensidad después que se ha alcanzado la intensidad pico.

Una ventaja de la presente invención es que proporciona reacciones luciferasa de escarabajo-luciferina con una cinética de producción de luz, de la cual el "destello", que ha constituido un inconveniente de reacción en la técnica anterior, se reduce significativamente pero con un rendimiento total de luz que está incrementado de modo significativo, típicamente más de 10 veces, sobre dichas reacciones de la técnica anterior. Tales mejoras en la cinética de la producción de luz y en la luz total producida en la reacción luciferasa de escarabajo-luciferina hacen que los ensayos de luciferasa, o de ATP con empleo de luciferasa, sean significativamente más sencillos y más sensibles que con los procedimientos de la técnica anterior. Por ejemplo, con los procedimientos y composiciones o estuches de prueba de la presente invención, los ensayos no requieran procedimientos especiales, tales como inyección rápida de la muestra, o equipo especial, tal como luminómetros complejos, para medir la luz emitida en el destello rápido de las reacciones luciferasa-luciferina convencionales.

De hecho, utilizando los procedimientos y composiciones o estuches de la presente invención es ahora posible que dispositivos tales como los contadores de centelleo, que están ya disponibles en los laboratorios para otros tipos de medidas, puedan emplearse ahora en ensayos que requieren medida de la luz producida en una reacción luciferasa de escarabajo-luciferina; esto podría ampliar significativamente la aplicación de dichos ensayos en ciencia y tecnología por facilitar el uso de los ensayos en laboratorios que no poseen luminómetros pero sí disponen de contadores de centelleo y otros dispositivos para medir la producción de luz. Hasta ahora, la cinética de la producción de luz a partir de la reacción luciferasa-luciferina impedía el uso de los contadores de centelleo en ensayos que precisaran medidas de dicha luz.

Con la presente invención, puede utilizarse en la práctica el potencial total de las luciferasas de escarabajo como marcadores o moléculas informadoras. Los principales aspectos de la realización proporcionada por la invención son la materia de las reivindicaciones independientes 1, 14, 27, 33, 40.

Otras ventajas y una apreciación más plena de adaptaciones específicas, variaciones de composición, y atributos físicos se alcanzarán después de un examen de la descripción detallada siguiente de la invención, considerada en asociación con las figuras de los dibujos que se adjuntan.

Breve descripción de los dibujos

La presente invención se describirá en lo sucesivo en asociación con los dibujos del apéndice, en los cuales designaciones iguales se refieren a elementos iguales en todos los casos, y en los cuales:

la figura 1 es un gráfico que compara la luminiscencia debida a la actividad de la luciferasa de escarabajo en presencia y ausencia de coenzima A;

la figura 2 es un gráfico que compara la luminiscencia debida a la actividad de la luciferasa de escarabajo en presencia y ausencia de ditiotreitol;

las figuras 3a y 3b son gráficos que ilustran el efecto de la variación en la concentración de ditiotreitol sobre la estabilidad de la luciferasa de escarabajo en ausencia de catálisis y durante la catálisis de la producción de luz por la reacción luciferasa de escarabajo-luciferina;

la figura 4 es un gráfico que compara la luminiscencia debida a la actividad de la luciferasa de escarabajo en presencia de coenzima A, en ditiotreitol y seroalbúmina bovina con la luminiscencia debida a dicha actividad en ausencia de coenzima A, ditiotreitol, y seroalbúmina bovina;

la figura 5 es un gráfico que compara la luminiscencia en un ensayo de acuerdo con la presente invención con la producida en un ensayo convencional de la técnica anterior debida a la actividad de luciferasa de escarabajo en extractos de células de mamífero en cultivo, en los cuales la luciferasa se produjo por expresión de un ADNc codificante de la enzima; y

la figura 6 es un gráfico que ilustra juntamente (1) la relación lineal entre el logaritmo de la concentración de luciferasa de escarabajo y el logaritmo de la luz producida en la reacción luciferasa de escarabajo-luciferina en ensayos realizados de acuerdo con la presente invención y (2) la sensibilidad de dichos ensayos en la detección de luciferasa de escarabajo.

La figura 7 es un gráfico que ilustra el efecto de 2-aminoetanol 36 mM y la ausencia de efecto de etanol 36 mM sobre la producción de luz de una reacción luciferasa de escarabajo-luciferina realizada en presencia de CoA.

La figura 8 es un gráfico que ilustra los efectos de diversas concentraciones de fosfato sobre la producción de luz de una reacción luciferasa de escarabajo-luciferina realizada en presencia de CoA. En el gráfico, la intensidad pico disminuye a medida que aumenta la concentración de fosfato.

Descripción detallada

En la descripción siguiente, los pasos del procedimiento se llevan a cabo y las concentraciones se miden a la temperatura ambiente (aproximadamente 20ºC a aproximadamente 25ºC) y a la presión atmosférica a no ser que se especifique otra cosa.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "luciferasa", a no ser que se especifique de otro modo, se refiere a una luciferasa de escarabajo existente naturalmente o mutante. La luciferasa, en el caso de ser existente naturalmente, puede obtenerse con facilidad por los expertos a partir del propio escarabajo, y en particular del órgano luminoso del mismo. Tanto si la luciferasa es una que existe naturalmente codo si se trata de una luciferasa mutante que posee la actividad en la reacción luciferasa-luciferina de una luciferasa existente naturalmente, se puede obtener fácilmente a partir de un cultivo de bacterias, levaduras, células de mamífero, células de insecto, células vegetales, o análogas, transformadas para expresar un ADNc codificante de la luciferasa, o a partir de un sistema in vitro exento de células para producir la luciferasa a partir de un ácido nucleico codificante de la misma. La luciferasa preferida es la de la luciérnaga Photinus pyralis.

El término "luciferina" se ha definido anteriormente.

En uno de sus aspectos, la invención es un procedimiento para detectar la presencia de una luciferasa de escarabajo en una muestra sospechosa de contener la luciferasa, que comprende (a) producir con una parte alícuota de dicha muestra una solución que comprende, en concentraciones eficaces para la actividad de la luciferasa en la reacción luciferasa-luciferina, luciferina, adenosina-trifosfato, un reactivo de tiol, y Mg^{2+}; y (b) medir la luminiscencia a partir de la solución resultante del paso (a). Este primer aspecto de la invención implica simplemente tomar una porción (es decir, una parte alícuota) de una muestra a analizar (v.g. un extracto de un cultivo de células de mamífero en cuyas células la luciferasa podría haberse expresado o no expresado si un promotor controlador de dicha expresión fuese activo, o inactivo, respectivamente), combinar la parte alícuota con una solución, en la cual la luciferasa, en caso de estar presente, será activa en la reacción luciferasa-luciferina, y que comprende un reactivo de tiol, y medir la solución (o una parte de la misma) con objeto de averiguar si se está produciendo en ella bioluminiscencia. La combinación de la parte alícuota de la muestra con una solución de este tipo implicará de manera preferible, y usualmente, una simple disolución de todos los componentes de la parte alícuota en la solución. En cualquier caso, la combinación debe ser tal que la luciferasa, en caso de estar presente en la parte alícuota, llegará a disolverse en la solución, en la que tiene lugar la reacción que constituye la base del procedimiento de ensayo. Como comprenderán los expertos, este procedimiento de la invención, al ser un procedimiento de ensayo, se realizará usualmente con controles o patrones adecuados (v.g., una muestra que deba ser analizada se analizará en paralelo con soluciones que no contengan luciferasa y con concentraciones de luciferasa conocidas) y, con patrones apropiados, el procedimiento puede adaptarse para cuantificar la concentración de la luciferasa de escarabajo en una muestra en ensayo (es decir, una muestra que deba ser analizada).

Como se indica más adelante, debido a la cinética mejorada de la producción de luz a partir de la reacción luciferasa-luciferina proporcionada por la presente invención, el procedimiento de ensayo de la invención para luciferasa puede detectar la enzima a lo largo de un intervalo de aproximadamente 10^{-18} M a aproximadamente 10^{-6} M, estando fijado el límite inferior únicamente por el ruido de fondo incluso en los mejores aparatos de detección de luz disponibles.

Las luciferasas de escarabajo son algo diferentes en los intervalos de condiciones, de pH, fuerza iónica, temperatura, concentración de ATP, concentración de ión magnesio, concentración de luciferina, y análogos, a lo largo de las cuales son activas aquéllas en la reacción luciferasa-luciferina. Sin embargo, es una cuestión sencilla para un operario experto averiguar dichos intervalos, e incluso los intervalos óptimos, para cualquier luciferasa de escarabajo particular.

Los expertos saben también que composiciones distintas de las citadas de modo específico con anterioridad estarán o pueden estar presentes en cualquier mezcla de reacción de ensayo, con objeto, por ejemplo, de mantener o incrementar la actividad de la enzima o como consecuencia de los procedimientos utilizados para obtener la parte alícuota de muestra que se somete a los procedimientos de ensayo. Así, estarán presentes típicamente agentes tampón, tales como tricina, HEPPS, HEPES, MOPS, Tris, glicilglicina, una sal de fosfato o análogos, para mantener el pH y la fuerza iónica; puede estar presente un material proteínico, tal como una seroalbúmina de mamífero (preferiblemente seroalbúmina bovina) o lactalbúmina, o una ovoalbúmina, que incrementa la actividad de las luciferasas en la región luciferasa-luciferina; pueden estar presentes EDTA o CDTA (ciclohexilenodiaminatetraacetato) o análogos, para suprimir la actividad de las proteasas o fosfatasas que contienen metales que podrían estar presentes en sistemas (v.g., células) de las cuales se extrae la luciferasa a ensayar y que podrían afectar desfavorablemente a la luciferasa o el ATP. Podrían estar presentes glicerol o etilenglicol, que estabilizan las luciferasas. Análogamente, podrían incluirse detergentes o agentes tensioactivos, en particular detergentes no iónicos, tales como los de octoxinol (v.g. vendido bajo la marca comercial "Triton X" de Rohm & Haas, tal como Triton X-100) típicamente como trazas, arrastradas a una solución utilizada en un ensayo de acuerdo con la invención, desde una solución utilizada para lisar las células de las cuales se extrae la luciferasa para el ensayo. Estarán presentes por supuesto iones de carga opuesta al magnesio; como los expertos comprenderán, las identidades químicas y concentraciones de estos iones de carga opuesta pueden variar ampliamente, dependiendo de la sal de magnesio utilizada para proporcionar el ión magnesio, el tampón empleado, el pH de la solución, la substancia (ácido o base) utilizada para ajustar el pH, y los aniones presentes en la solución procedentes de fuentes distintas de la sal de magnesio, el tampón, y el ácido o base utilizado para ajustar el pH. En un procedimiento, el ión magnesio puede suministrarse como la sal carbonato, a fin de proporcionar la concentración deseada de ión magnesio, en una solución con el tampón a utilizar (v.g., tricina), y después de ello el pH de la solución tamponada puede ajustarse por adición de un ácido fuerte, tal como ácido sulfúrico, lo cual dará como resultado la pérdida de la mayor parte del carbonato (y bicarbonato) como dióxido de carbono y el reemplazamiento de estos aniones con sulfato, bisulfato, anión de tricina, y posiblemente también otros tipos de aniones (dependiendo de otras substancias (v.g. sales de fosfato) que proporcionen aniones y puedan estar presentes en la solución). La saturación con oxígeno procedente del aire de la solución en la que se lleva a cabo el procedimiento de ensayo es suficiente para proporcionar el oxígeno molecular requerido en la reacción luciferasa-luciferina. En cualquier caso, está plenamente dentro de la destreza de las personas con experiencia ordinaria el averiguar fácilmente las concentraciones de los diversos componentes en una mezcla de reacción de ensayo, con inclusión de los componentes citados anteriormente de manera específica en la descripción del procedimiento, que son eficaces para la actividad de la luciferasa en la reacción luciferasa-luciferina. El componente que es esencial para la cinética mejorada de la producción de luz es el reactivo de tiol distinto de CoA presente en concentraciones como las citadas en las reivindicaciones.

Los reactivos de tiol utilizados en los procedimientos y composiciones de la invención son CoA o reactivos de tiol distintos de CoA. Los reactivos de tiol distintos de CoA son reactivos que tienen un grupo sulfhidrilo libre que es capaz de ser eficaz como agente reductor en una solución acuosa saturada con aire en condiciones de temperatura, pH, fuerza iónica, composición química, y análogas, en las cuales se produce la reacción luciferasa-luciferina. Entre estos reactivos se prefiere el ditiotreitol. Entre otros que pueden emplearse se encuentran \beta-mercaptoetanol (\beta-ME), 2-mercaptopropanol (cualquier enantiómero o ambos enantiómeros en cualquier combinación), 3-mercaptopropanol, 2,3-ditiopropanol, y glutatión.

Los tipos de muestras que pueden ensayarse en cuanto a una luciferasa de acuerdo con el procedimiento de la invención incluyen, entre otras, muestras que incluyen una luciferasa que haya sido utilizada como informador en un inmunoensayo o muestras que incluyen una luciferasa que haya sido utilizada como informador en un ensayo de hibridación de sondas de ácido nucleico. Como se sabe en las técnicas de inmunoensayo y de sondas de ácido nucleico, la luciferasa ensayada de acuerdo con la presente invención habrá estado unida químicamente, por cualquiera de los numerosos procedimientos conocidos en dichas técnicas, a un anticuerpo o sonda de ácido nucleico utilizado(a) en la detección de un analito en un inmunoensayo o ensayo de hibridación de sondas de ácido nucleico, respectivamente. A continuación, siguiendo también procedimientos bien conocidos, el anticuerpo o la sonda de ácido nucleico marcado(a)
con luciferasa, habrá estado combinado con una muestra a analizar, para llegar a unirse a un analito (v.g., antígeno o un anticuerpo anti-antígeno, en el caso de un inmunoensayo, o un ácido nucleico diana, en el caso de un ensayo de hibridación de sondas de ácido nucleico) que se desean detectar y que podría estar presente en la muestra y, posteriormente, anticuerpo o sonda de ácido nucleico marcado(a) con luciferasa que no hubiese llegado a fijarse al analito se habrá separado de aquél que, en su caso, hubiera llegado a fijarse. La muestra a ensayar de acuerdo con la presente invención será de luciferasa que constituya el marcador en un anticuerpo o sonda de ácido nucleico marcado(a)
con luciferasa que se fijó al analito de dicho anticuerpo o sonda. La luciferasa puede mantenerse químicamente enlazada al anticuerpo o sonda marcado(a) durante el ensayo de luciferasa de acuerdo con la presente invención o, nuevamente por procedimientos conocidos, puede haberse separado del anticuerpo o sonda de ácido nucleico marcado(a)
antes del ensayo para luciferasa de acuerdo con la presente invención. Los inmunoensayos y ensayos de hibridación de sondas de ácido nucleico, en los cuales puede utilizarse una luciferasa de escarabajo como informador o marcador, tienen muchos usos prácticos y de investigación en biología, biotecnología y medicina, con inclusión de la detección de patógenos, detección de defectos genéticos, diagnóstico de enfermedades, y análogos.

Otro tipo de muestra que puede ensayarse en cuanto a la presencia de una luciferasa de acuerdo con el procedimiento de la invención es un extracto de células en las cuales la expresión de la luciferasa se produce en respuesta a la activación de la transcripción por un promotor, u otro elemento regulador de la transcripción, enlazado a un segmento de ADN que codifica la luciferasa, o como resultado de la traducción de ARN codificante de la luciferasa. En tales células, se utilizan las luciferasas análogamente a la manera en que otras enzimas, tales como cloranfenicol-acetiltransferasa o \beta-galactosidasa, han sido utilizadas para observar sucesos genéticos tales como transcripción o regulación de la transcripción. Dichos usos de luciferasas de escarabajo son valiosos en biología molecular y biomedicina y se pueden emplear, por ejemplo, en el escrutinio de compuestos respecto a actividad terapéutica en virtud de la actividad activadora de la transcripción o represora de la transcripción en promotores particulares u otros elementos reguladores de la transcripción.

En otro de sus aspectos, la invención implica un procedimiento de detección de ATP. Este procedimiento es consecuencia del aspecto de la invención que implica el procedimiento de ensayo de luciferasa en virtud del hecho de que se requiere ATP para la producción de bioluminiscencia y difiere del procedimiento de ensayo de luciferasa únicamente en que un componente requerido en la mezcla de reacción de ensayo es una luciferasa de escarabajo, pero no ATP. El procedimiento de la invención para detectar la presencia de adenosina-trifosfato en una muestra sospechosa de contener dicho compuesto, comprende (a) producir con una parte alícuota de dicha muestra una solución que comprende una luciferasa de escarabajo, luciferina, un reactivo de tiol, y Mg^{2+}, todos ellos en concentraciones eficaces para la actividad de la luciferasa en la reacción luciferasa-luciferina; y (b) medir la luminiscencia de la solución resultante del paso (a). Como los expertos apreciarán fácilmente, por la realización de este procedimiento de la invención con patrones apropiados de concentraciones variables conocidas de ATP junto con muestras de concentración desconocida de ATP, el procedimiento puede adaptarse para la determinación de las concentraciones de ATP en las muestras de concentración desconocida. El ATP en las muestras objeto del análisis puede proceder de cualquiera de una diversidad de sucesos o reacciones bioquímicos(as), v.g., la agregación de las plaquetas de la sangre. Así, este procedimiento de la invención para ensayos de ATP puede utilizarse para observar los sucesos o reacciones que hayan producido el ATP.

Preferiblemente, en los procedimientos (y composiciones) de la invención, la luciferina que se utiliza se prepara sintéticamente; tanto CoA como un reactivo de tiol distinto de CoA se emplean o están presentes; y en las composiciones de la invención que son soluciones, el CoA está presente a una concentración comprendida entre aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 1,0 mM, y el reactivo de tiol distinto de CoA está presente a una concentración comprendida entre aproximadamente 20 mM y 100 mM.

En otro aspecto adicional, la invención implica una composición que comprende una luciferasa de escarabajo, que es capaz de catalizar la reacción luciferasa-luciferina, CoA y un reactivo de tiol distinto de CoA. Tales composiciones son preferiblemente soluciones acuosas pero pueden, por ejemplo, ser una mezcla liofilizada de componentes. Por la expresión "capaz de catalizar la reacción luciferasa-luciferina" debe entenderse que, o bien la enzima contenida en la composición como tal puede catalizar la reacción, o que la composición puede reconstituirse, disolverse, o tratarse química o físicamente de otro modo de tal manera que la enzima se vuelve activa para catalizar la reacción. Si la enzima estuviera inactivada o inhibida irreversiblemente, la misma no sería "capaz de catalizar la reacción luciferasa-luciferina". Las composiciones de acuerdo con la invención proporcionan una cinética acusadamente mejorada de la producción de luz en la reacción luciferasa-luciferina y se utilizan en ensayos de acuerdo con la invención, estuches de prueba de acuerdo con la invención, patrones en ensayos y estuches de prueba de acuerdo con la invención, y en la preparación de mezclas de ensayo y estuches de prueba de la invención, así como patrones para uso en las mezclas y los estuches. Como se describe con algún detalle en otra parte de la presente memoria descriptiva, las composiciones pueden incluir gran número de otros componentes además de los tres componentes esenciales, a saber una luciferasa de escarabajo capaz de actividad como se ha descrito, CoA y un reactivo de tiol distinto de CoA.

La invención implica también estuches de prueba para la realización de los procedimientos de ensayo de la invención. Tales estuches comprenden, en uno o más envases, habitualmente empaquetados de manera conveniente para facilitar su utilización en los ensayos, cantidades de las diversas composiciones esenciales para la realización de los ensayos de acuerdo con la invención. Así, en los estuches para realización de ensayos de luciferasa, se encontrará una composición, a la que se hace referencia como "composición de reacción luciferasa-luciferina", que comprende, además de ión magnesio, ATP y luciferina, que como es bien sabido son esenciales para la reacción, un reactivo de tiol. Dicha composición comprenderá preferiblemente CoA y un reactivo de tiol, tal como DTT, distinto de CoA, y puede comprender otros componentes, tales, por ejemplo, un intensificador proteínico de la actividad de luciferasa (v.g., seroalbúmina bovina), EDTA o CDTA, una sal de fosfato o 2-aminoetanol (véase más adelante), o un tampón para proporcionar una solución con un pH y una fuerza iónica a los cuales la reacción luciferasa de escarabajo-luciferina transcurrirá con una velocidad adecuada. La luciferina contenida en el estuche se prepara preferiblemente por síntesis. Como se ha indicado, los diversos componentes pueden combinarse, v.g. en solución o en una mezcla liofilizada, en un solo envase o en diversas combinaciones (con inclusión de envases individuales) en una pluralidad de envases. En un estuche preferido para la realización de ensayos de luciferasa en células en las cuales se expresa la luciferasa, se incluirá también una solución (o los componentes para preparar una solución) útil(es) para lisar las células en tanto que se preserva (contra la acción de diversas enzimas liberadas durante la lisis) la luciferasa que pudiera encontrarse en las células en una forma activa, o una forma que pueda volverse activa.

Los estuches de prueba para la realización de ensayos para ATP son similares a los correspondientes a la realización de ensayos de luciferasa, excepto que dichos estuches incluyen una luciferasa de escarabajo en lugar de ATP.

Los estuches de prueba de la invención pueden incluir también, como es bien conocido por los expertos, diversos controles y patrones, tales como soluciones de concentraciones conocidas de luciferasa o ATP, con inclusión de la ausencia de luciferasa o ATP (control negativo), con objeto de asegurar la fiabilidad y exactitud de los ensayos realizados utilizando los estuches, y para permitir análisis cuantitativos de muestras de los analitos (v.g., luciferasa, ATP) de los estuches.

En otro aspecto, la invención abarca una mejora en procedimientos de ensayo respecto a la presencia de substancias (v.g., ATP, substancias que den como resultado la producción de ATP, luciferasa) en una muestra, procedimientos que comprenden medir la luz producida en una reacción luciferasa de escarabajo-luciferina. La mejora comprende la realización de la reacción luciferasa-luciferina en presencia de CoA en condiciones que reducen la intensidad pico de la luz producida en la reacción en una pequeña cantidad (v.g., entre aproximadamente 3% y aproximadamente 30% con relación a la intensidad pico en ausencia de tales condiciones). Este aspecto de la invención está basado en el descubrimiento de que la alteración de las condiciones, en las cuales tiene lugar una reacción luciferasa-luciferina en presencia de CoA, de tal manera que la intensidad pico de la producción de luz por la reacción se reduzca en una pequeña cantidad, da como resultado un aumento en la luz total emitida en la reacción (es decir, tal como se mide por integración de la curva de intensidad en función del tiempo). Esto es ventajoso en el sentido de que implica el aplanamiento de la curva de intensidad en función del tiempo para la luz producida en la reacción y, por consiguiente, hace más sencilla y más exacta la medida de la producción total de luz. Por supuesto, en un conjunto de sistemas de reacción que son iguales excepto que las intensidades pico se reducen en grados diferentes, debido a que la condición empleada para reducir las intensidades pico, aunque se aplica la misma condición a cada sistema, se altera en grados diferentes, una reducción mayor en la intensidad pico requerirá que la reacción luciferasa-luciferina transcurra durante un tiempo más largo antes que se consiga un aumento en la producción total de luz (medida por integración de la curva de intensidad en función del tiempo desde la iniciación de la reacción) en comparación con la producción total del sistema en el que no se aplica la condición, con lo que no se reduce la intensidad pico; véase, v.g., la Fig. 8. Una diversidad de condiciones pueden alterarse para producir la pequeña disminución en la intensidad pico. Así, por ejemplo, pueden modificarse el pH, la fuerza iónica o la temperatura de la reacción de modos que son fácilmente averiguadas por los expertos y que varían ligeramente dependiendo de la luciferasa de escarabajo empleada en particular, de tal manera que se reduzca la intensidad pico; o pueden incluirse diversas substancias que son inhibidores de la luciferasa en concentraciones apropiadas en la solución en la que debe tener lugar la reacción luciferasa-luciferina. Entre dichas substancias se encuentran 2-aminoetanol, a una concentración comprendida entre aproximadamente 10 mM y 100 mM, y fosfato en una concentración comprendida entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 60 mM (véanse las Figs. 7 y 8). La mejora se aplica asimismo a los nuevos procedimientos de la presente invención, pudiendo incluirse v.g., 2-aminoetanol 36 mM o fosfato 25 mM en una mezcla de reacción luciferasa-luciferina en la que no sólo está presente CoA sino también un reactivo de tiol distinto de CoA.

Los mecanismos que se cree constituyen la base de la invención no se conocen por completo, y la referencia en esta memoria a tales mecanismos no debe interpretarse como limitación del alcance de la invención.

Se ha descubierto que la CoA interacciona con la enzima y la oxiluciferina excitada electrónicamente durante la catálisis de la reacción luciferasa-luciferina y, como consecuencia de esta interacción, reduce la inhibición del producto de la enzima en el curso de una reacción luciferasa-luciferina. (La oxiluciferina, a la que se hace referencia de otro modo en esta memoria como "luciferina oxidada", difiere de la luciferina en que tiene un átomo de oxígeno en lugar de hidrógeno y carboxilato en la posición 4 del anillo de tiazolina de la luciferina). Así pues, un aspecto de la presente invención es un complejo de CoA, una luciferasa de escarabajo y oxiluciferina en su estado excitado en la enzima.

La existencia de los complejos CoA-luciferasa de escarabajo-oxiluciferina excitada no había sido reconocida con anterioridad a la presente invención. Dichos complejos existen en cualquier solución en la que se encuentren juntos CoA, luciferina, ATP, oxígeno y una luciferasa de escarabajo, en una forma enzimáticamente activa, con inclusión del estado in vitro (v.g., en una solución de la luciferasa que se utilice en un ensayo) y en las células de los organismos luminosos de los escarabajos, en las cuales se genera bioluminiscencia en la reacción luciferasa-luciferina. En la presente solicitud, se pretende reivindicar el complejo CoA-enzima-oxiluciferina excitada de una luciferasa de escarabajo solamente fuera del medio en el que existe el complejo en la naturaleza, es decir, fuera de las células en las cuales existe la luciferasa en la naturaleza, en el escarabajo.

Se ha encontrado que las luciferasas de escarabajo catalizan la formación del tioéster de CoA y luciferina, luciferil-CoA. La existencia de este compuesto tampoco ha sido reconocida hasta ahora. Así pues, este tioéster constituye otro aspectos de la invención.

Análogamente al complejo de CoA-luciferasa de escarabajo-oxiluciferina excitada, el luciferil-CoA existe en cualquier solución en la cual se encuentren juntos luciferina, ATP, CoA y una luciferasa de escarabajo, en una forma enzimáticamente activa, con inclusión del estado in vitro (v.g., en una solución de la luciferasa que se esté utilizando en un ensayo) y en las células de los órganos luminosos de los escarabajos en las cuales se genera la bioluminiscencia en la reacción luciferasa-luciferina. En la presente solicitud, se pretende reivindicar el luciferil-CoA solamente fuera del medio en el cual existe el compuesto en la naturaleza, es decir, fuera de las células en las cuales existe naturalmente una luciferasa. El luciferil-CoA es un compuesto que presenta importancia en la mediación de los efectos beneficiosos de CoA sobre la cinética de la producción de luz en la reacción luciferasa de escarabajo-luciferina. La formación del tioéster está involucrada en la reducción, en presencia de CoA, de la inhibición del producto en la reacción luciferasa-luciferina.

El destino del luciferil-CoA después de su producción no está claro, pero es posible que el tioéster se mantenga complejado a la enzima y que se regenere CoA a partir del tioéster en el curso de la catálisis de la reacción luciferasa de escarabajo-luciferina.

Se cree que los reactivos de tiol, es decir, substancias tales como DTT o \beta-ME, o análogos, con grupos tiol libres que actúan como reductores, interaccionan de algún modo con las luciferasas de escarabajo, o con un producto de catálisis por las enzimas, al tiempo que catalizan la producción de luminiscencia. El efecto de dichos reactivos sobre las luciferasas, a través de esta interacción durante la catálisis, parece alcanzar la saturación a una concentración aproximadamente 10 veces a aproximadamente 100 veces mayor que la concentración a la cual se satura el efecto de CoA. Por esta interacción durante la catálisis del reactivo de tiol con la enzima o un producto de la catálisis por la enzima, el reactivo frena la inactivación de la enzima con respecto a la velocidad a la cual se produciría la inactivación en ausencia del reactivo de tiol.

La CoA no sólo es un substrato de la enzima, con un sitio de fijación específico asociado con dicha función, sino también un reactivo de tiol, con propiedades asociadas de estabilización de la actividad de la enzima. Con CoA, la situación podría ser todavía más complicada, dado que es posible que, en conexión con el frenado de la velocidad de inhibición del producto durante la reacción luciferasa-luciferina, CoA aumente la velocidad de inactivación de la enzima que tiene lugar durante la reacción. CoA, a una concentración que excede de la requerida para saturar el sitio de fijación del substrato de CoA durante la catálisis, podría frenar también entonces, al igual que otros reactivos de tiol, la velocidad de inactivación.

El efecto de CoA sobre la cinética de las reacciones luciferasa de escarabajo-luciferina se satura a concentraciones relativamente bajas de CoA, entre aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 1 mM, que es un intervalo típico para la saturación de la fijación a una enzima por un substrato.

El efecto de los reactivos de tiol distintos de CoA, sobre la cinética de las reacciones luciferasa de escarabajo-luciferina no ha sido sugerido por la técnica anterior. El efecto se satura a concentraciones comprendidas entre aproximadamente 30 mM y aproximadamente 80 mM, mucho mayores que el intervalo 1 mM - 5 mM sugerido en la técnica para proteger las proteínas contra la inactivación durante la preparación y el almacenamiento, y mucho mayores que el intervalo 0,1 mM - 1 mM para el cual se satura el efecto de CoA sobre dicha cinética. El efecto estabilizador de los reactivos de tiol no es debido simplemente a protección contra la oxidación de la enzima por regla general, como ha sido sugerido por la técnica anterior. Por encima de 5 mM, los reactivos de tiol no tienen efecto estabilizador alguno sobre la enzima en ausencia de catálisis de la reacción de bioluminiscencia, como la tendrían los reactivos si la estabilización fuera debida simplemente a protección de tipo general contra la oxidación de grupos existentes en la enzima, pero que estabilizan de hecho la enzima mientras que está teniendo lugar dicha catálisis.

Así pues, la invención proporciona composiciones de luciferasa en las cuales, en la reacción luciferasa-luciferina, los aspectos cinéticos de la producción de luz se mejoran como consecuencia de una inhibición reducida del producto o una inactivación reducida de la luciferasa. Una composición de este tipo es una solución acuosa que comprende una luciferasa de escarabajo, CoA en concentración comprendida entre aproximadamente 0,1 mM y 1,0 mM, y un reactivo de tiol distinto de CoA en concentración comprendida entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 100 mM. La composición puede comprender también otras substancias tales como ATP en concentración comprendida entre aproximadamente 0,1 mM y 1,0 mM; luciferina en concentración comprendida entre aproximadamente 0,1 mM y 1,0 mM; ión Mg^{+2} en concentración comprendida entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 15 mM; iónfosfato, 2-aminoetanol u otros compuestos reductores de la intensidad pico en concentraciones eficaces para reducir la intensidad pico en hasta aproximadamente 30%; un tampón, tal como tricina, HEPPS, HEPES, MOPS, Tris, glicilglicina, una sal fosfato, o análogos, para mantener el pH y la fuerza iónica de la solución dentro de intervalos en los cuales la luciferasa de escarabajo es activa en la reacción luciferasa-luciferina; un intensificador proteínico de la actividad de luciferasa, tal como seroalbúmina de mamífero o lactalbúmina o una ovoalbúmina, preferiblemente seroalbúmina bovina, en una concentración comprendida entre aproximadamente 10 \mug/ml y 5 mg/ml; y EDTA o CDTA en concentración comprendida entre aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 1 mM. Cualquier luciferina contenida en una composición de la invención de este tipo es preferiblemente sintética.

En otros aspectos adicionales, la invención proporciona procedimientos y estuches de prueba para la detección de ATP en muestras que se piense contienen el compuesto. Estos procedimientos y estuches de la invención están basados en la bioluminiscencia producida por una reacción luciferasa de escarabajo-luciferina y emplean composiciones por las
cuales, de acuerdo con la invención, se mejora la cinética de la producción de luz a partir de una reacción de este tipo.

En las composiciones de la invención, o utilizadas en los procedimientos de la invención, que son soluciones acuosas y en las cuales está presente luciferina, la luciferina está presente típicamente en una concentración de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 1 mM, de modo preferible aproximadamente 1 mM. Análogamente, en tales composiciones en las cuales está presente ATP, la concentración de ATP está comprendida entre aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 5 mM, de modo preferible aproximadamente 0,5 mM. Cuando está presente CoA en tales composiciones de la invención o utilizadas en la invención que son soluciones acuosas, la concentración de CoA está comprendida entre aproximadamente 0,001 mM y aproximadamente 1 mM, de modo preferible aproximadamente 1 mM. Análogamente, la concentración de DTT presente es de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 200 mM, de modo preferible aproximadamente 30 a 40 mM, y la de BSA es de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de modo preferible aproximadamente 1 mg/ml.

La luminiscencia de la reacción luciferina-luciferasa puede medirse utilizando un luminómetro comercialmente disponible, un contador de centelleo, un fotómetro fotomultiplicador o una película de emulsión fotográfica.

Para iniciar una reacción luciferasa de escarabajo-luciferina de acuerdo con la invención en una solución de reacción, la solución de reacción puede producirse por mezcla simple de (usualmente dos) soluciones o por inyección de una solución en otra con objeto de realizar una mezcla muy rápida de las dos. El uso de reactivos de tiol de acuerdo con la presente invención permite evitar la necesidad de un formato de mezcla rápida (inyección) en la mayoría de los casos.

El procedimiento de la presente invención se probó por una diversidad de experimentos diseñados para comparar la producción de luz por ensayos convencionales de luciferasa con los procedimientos de ensayo de acuerdo con la presente invención.

El efecto de CoA sobre la producción de luz se comparó con la producción de luz en su ausencia. El cofactor se añadió a la enzima antes de la mezcla. En estas pruebas, se inyectaron 100 \mul de una solución que contenía luciferina 3 mM, ATP 3 mM, con o sin CoA 3 mM en un tampón que está constituido por tricina 25 mM, Mg^{2+} 7 mM, y EDTA 1 mM en 200 \mul de una solución que contenía luciferasa 0,8 nM en el mismo tampón que se ha descrito anteriormente para la solución de luciferina. La figura 1 representa la luminiscencia de luciferasa con y sin presencia de CoA. La cantidad total de luz emitida por una reacción se estimó por integración de la intensidad de la atenuación exponencial extrapolada para tiempo infinito. Estos datos demuestran que la adición de CoA a la mezcla de ensayo produce una intensidad de luz inicial mayor con una velocidad de atenuación inicial menor, y un aumento de más de dos veces en la luminiscencia total. Dichos datos son inesperados, particularmente teniendo en cuenta el hecho de que se empleó luciferina sintética.

Se investigaron los efectos de otros reactivos que poseen grupos sulfhidrilo La figura 2 representa la curva de luminiscencia con DTT 33,3 mM presente en la mezcla de ensayo. En esta prueba, 100 \mul de una solución que contenía luciferina 3 mM, ATP 3 mM, y DTT 100 mM en el mismo tampón que se ha descrito en el párrafo inmediatamente anterior para los experimentos con CoA, se inyectaron en 200 \mul de luciferasa 0,8 nM en el mismo tampón. La curva muestra un "estado estacionario" mucho más alto, y la producción total de luz se incrementó 6,3 veces con respecto a la luz producida en ausencia de DTT. Se estudió también la preincubación de DTT con la enzima La adición de 10 mM de DTT a la enzima antes de ensayo no dio como resultado aumento significativo alguno de la producción de luz. Los resultados con otros reactivos de tiol son similares a los encontrados para DTT.

Se realizaron asimismo pruebas para estudiar el modo de acción del DTT en comparación con los efectos protectores de los tioles consignados generalmente en la técnica anterior. En estas pruebas, se prepararon dos soluciones de 1000 \mul que contenían tricina 20 mM a pH 7,8, Mg^{2+} 8 mM, EDTA 0,13 mM, ATP 0,53 mM y CoA 0,27 mM; una de las soluciones contenía también DTT 5 mM, mientras que la otra contenía DTT 40 mM. Se añadió a cada solución una parte alícuota igual de luciferasa. En diversos momentos, se retiraron 200 \mul de solución y se añadió luciferina hasta una concentración de 0,47 mM para iniciar la actividad de la enzima. La condición de las soluciones de luciferasa es la misma que las condiciones de reacción excepto que no está presente luciferina, por lo que no puede tener lugar catálisis alguna. Se midió la producción de luz durante 10 minutos. Los resultados se representan en las figuras 3a y 3b. Pueden deducirse dos conclusiones a partir de estos resultados - - en primer lugar, la estabilidad de la actividad enzimática se reduce notablemente durante la catálisis, y en segundo lugar, el aumento de la concentración de DTT por encima de 5 mM no aumenta la estabilidad de la luciferasa en ausencia de catálisis, pero sí incrementa dicha estabilidad durante la catálisis. Es probable que DTT actúe de modos diferentes sobre la enzima cuando la misma no está catalizando la reacción luciferasa-luciferina y cuando sí está teniendo lugar dicha catálisis.

Se realizaron también pruebas para estudiar los efectos de otros aditivos. Por ejemplo, BSA aumentaba la intensidad de luz aproximadamente 20%, pero no cambiaba la velocidad de atenuación. Se encontró también una intensidad de luz inicial incrementada con la adición de un agente tensioactivo no iónico, Triton X-100, pero ello fue seguido por una velocidad de atenuación incrementada. Otros agentes tensioactivos no iónicos parecían tener poco efecto sobre la actividad de la enzima.

La figura 4 representa las curvas de luminiscencia en las cuales estaba presente en el ensayo una combinación de CoA, DTT y BSA, estaba presente exclusivamente CoA en el ensayo, y no se había hecho adición alguna al ensayo convencional. Los efectos combinados de CoA, DTT y BSA dieron como resultado una producción total de luz mayor que 15 veces la producida en ausencia de adiciones.

Un resultado sorprendente del procedimiento de la presente invención es que puede conseguirse un aumento en la luminiscencia total de 15 a 17 veces durante 10 minutos en comparación con la luminiscencia en ausencia de los reactivos de tiol y el estabilizador de la enzima. El efecto combinado de estos agentes aumenta la utilizad de las luciferasas como informadores. Una producción incrementada de luz permite un procedimiento altamente sensible y rápido de detección de productos o sucesos en ciertas reacciones bioespecíficas.

La presente invención se explica más detalladamente por los ejemplos siguientes, que no deben interpretarse como limitantes del alcance de la presente invención.

Ejemplo 1

Se preparó un estuche para detectar la síntesis de luciferasa en huéspedes extraños que consistía en un reactivo de lisis y un reactivo de ensayo. El reactivo de lisis estaba constituido por Tris-fosfato 25 mM a pH 7,8, glicerol al 10% (que podría haberse reemplazado con etilenglicol), Triton X-100 al 1% (marca comercial de Rohm & Haas Corp. para un detergente no iónico que es una mezcla de octoxinol con un número medio de unidades etileniloxi (-CH_{2}CH_{2}O-) por molécula comprendido entre 9 y 10), 1 mg/ml de seroalbúmina bovina (BSA), CDTA (ciclohexilenodiaminatetraacetato) 2 mM y DTT 2 mM. El reactivo de ensayo estaba constituido por tampón de tricina 20 mM (N-tris(hidroximetil)-metil-glicina) a pH 7,8, DTT 33,3 mM, Mg^{+2} 8 mM, EDTA 0,13 mM, ATP 0,53 mM, luciferina 0,47 mM y CoA 0,27 mM.

Se obtuvo un extracto celular a partir de células NIH 3T3 que contenían el plásmido pRSVL, un plásmido que contiene un ADNc que codifica la luciferasa de la luciérnaga P. pyralis bajo control de la transcripción del 5'-LTR de ADN provírico correspondiente al genoma del virus del sarcoma de Rous. Las células se dejaron crecer hasta aproximadamente un tercio de la confluencia en una cápsula petri de 100 mm. Las células se transformaron luego con 10 \mug de ADN plasmídico utilizando el procedimiento estándar del fosfato de calcio conocido en la técnica y se dejaron crecer durante 48 horas adicionales.

Las células cultivadas se lisaron por adición de 1 ml de reactivo de lisis a la temperatura ambiente durante 2 a 5 min. Después de la lisis, los residuos celulares se separaron por centrifugación breve, aproximadamente 10 s, y el sobrenadante (es decir, la solución del extracto celular) se probó respecto a la actividad de luciferasa.

La actividad de la enzima se probó mezclando el extracto celular con reactivo de ensayo en una relación comprendida entre aproximadamente 1:5 y 1:25, de extracto celular:reactivo de ensayo. No se utilizó inyección en la realización de la mezcla.

La luminiscencia de la reacción extracto de células-luciferina de acuerdo con el ensayo de la presente invención se comparó con un ensayo convencional para actividad de luciferasa. La comparación se llevó a cabo utilizando un formato de tipo inyección para la mezcla, como se requiere en el ensayo convencional de la técnica anterior, aunque el ensayo de la presente invención no requiere un procedimiento de inyección. En estas comparaciones, se inyectaron 100 \mul de una solución que contenía CoA 0,8 mM, luciferina 1,4 mM, ATP 1,5 mM y DTT 90 mM en un tampón de tricina 20 mM, Mg^{+2} 8 mM, EDTA 0,13 mM, pH 7,8, en 220 \mul de una solución producida por mezcla de 20 \mul de extracto celular con 200 \mul de tampón (tricina 20 mM, Mg^{+2} 8 mM, EDTA 0,13 mM, pH 7,8) y se midió la luminiscencia utilizando un luminómetro estándar (v.g., un luminómetro Turner Model 20). El ensayo convencional de comparación, que es una adaptación del ensayo publicado en los primeros informes sobre luciferasa utilizada como informador de sucesos genéticos, tales como trascripción, Mol. Cell. Biol. 7, 725-737 (1987), Science 234, 856-859 (1986), consistió en inyectar 100 \mul de una solución que contenía luciferina 0,67 mM en un tampón de glicilglicina 25 mM, Mg^{+2} 12 mM, pH 7,8, en 220 ml de una solución producida por mezcla de 20 \mul de extracto celular con 200 \mul de tampón (glicilglicina 25 mM, Mg^{+2} 12 mM, pH 7,8) que tenía ATP 5,83 mM.

La figura 5 representa los resultados de estos ensayos. En los gráficos de la figura 5, se representa gráficamente la intensidad de luminiscencia en función del tiempo a partir del momento de la inyección. Los resultados demuestran que el ensayo de acuerdo con la presente invención daba lugar a un aumento de 10 veces en la producción de luz (es decir, la luminiscencia producida) respecto al ensayo convencional, cuando la producción de luz se determinó por integración de la curva de intensidad en función del tiempo desde 0 a 60 segundos, y un aumento de 17 veces en la luminiscencia producida en comparación con el ensayo convencional, cuando la producción de luz se determinó por integración de la curva de intensidad en función del tiempo desde 0 a 5 minutos. La ausencia del pico agudo de intensidad en el ensayo de acuerdo con la invención, en comparación con el ensayo convencional, se aprecia también claramente en la figura 5.

Ejemplo 2

Se preparó una solución madre de luciferasa de concentración 1 mg/ml a partir de luciferasa cristalina pura de P. pyralis en sulfato de amonio al 10% y glicerol al 10%. Las soluciones de luciferasa utilizadas para propósitos de reacción se prepararon a partir de la solución madre por diluciones consecutivas de 100 veces en el reactivo de lisis descrito en el Ejemplo 1. Se añadieron 20 \mul de cada dilución (sin inyección) a 200 \mul del reactivo de ensayo descrito en el Ejemplo 1, y se pusieron en un luminómetro estándar para medida de la emisión de luz.

La figura 6 es un gráfico del logaritmo de la luminiscencia producida (tal como se mide por integración de la intensidad de luminiscencia durante 60 segundos) en función del logaritmo de la concentración de luciferasa para las diversas muestras. La curva de la Fig. 6 muestra una linealidad excelente a lo largo de 8 órdenes de magnitud de concentración de luciferasa. La concentración de luciferasa a partir del punto de datos del gráfico de la Fig. 6 que representa la más baja de tales concentraciones es 50 veces menor que la concentración mínima de luciferasa detectable en los ensayos más sensibles de luciferasa consignados hasta ahora. Dicha alta sensibilidad se consigue con la presente invención debido al aumento de luminiscencia producido en comparación con los sistemas de la técnica anterior y la cinética "plana", que permite calcular el promedio de los efectos del ruido de fondo aleatorio en el dispositivo de medida de la luz.

En el experimento descrito en este Ejemplo, la cinética de la producción de luz para todas las concentraciones de luciferasa era prácticamente plana. Asimismo, el coeficiente de variación para las medidas a cada concentración (cinco réplicas) eran mejores que 1,5%, excepto para la concentración más baja, en la que la señal del ruido de fondo en el luminómetro era ya significativa. Este nivel de precisión es equivalente a o mejor que el consignado generalmente para los ensayos de tipo inyección de la técnica anterior.

Sobre la base de la linealidad exhibida por la curva de la figura 6, la precisión con la que podían medirse los puntos de datos para la curva, y el experimento consignado en el Ejemplo 4 acerca de una solución de luciferasa relativamente concentrada (aproximadamente 1 \muM), el intervalo práctico de concentraciones de luciferasa para los ensayos de la presente invención se extiende desde el más bajo que puede detectar una instrumentación de detección de luz con el ruido de fondo más bajo posible (que actualmente es del orden de aproximadamente 10^{-18} a 10^{-17} M, o aproximadamente 200 moléculas de la enzima en un volumen de 200 \mul de solución) hasta aproximadamente 10 \muM. La concentración de luciferasa en cualquier muestra de interés práctico estará perfectamente dentro de este intervalo.

Ejemplo 3

En este Ejemplo, se proporcionan ilustraciones del efecto ventajoso sobre la luminiscencia total de una reacción luciferasa-luciferina en presencia de CoA, de la reducción en una pequeña cantidad de la intensidad pico de luminiscencia de la reacción.

La figura 7 ilustra que la inclusión del inhibidor de luciferasa 2-aminoetanol a concentración 36 mM en una mezcla de reacción luciferasa-luciferina que incluye CoA reduce la intensidad pico de la luminiscencia en aproximadamente 12% y aumenta la producción de luminiscencia, tal como se mide por integración de la intensidad de luminiscencia durante más de aproximadamente 3 minutos desde la iniciación de la reacción.

Análogamente, la figura 8 muestra que la inclusión de fosfato, que es también inhibidor de la luciferasa, en una mezcla de reacción luciferasa-luciferina que incluye CoA, reduce la intensidad pico de luminiscencia (en un porcentaje que depende de la concentración de fosfato) pero aumenta la luminiscencia total, cuando se mide por integración de la intensidad de luminiscencia a lo largo de un período de tiempo que difiere con la concentración de iónfosfato. Concentraciones mayores de fosfato reducen las intensidades pico en mayor proporción y requieren la integración de la intensidad a lo largo de períodos de tiempo mayores para hacer evidente el aumento de luminiscencia total.

Los datos para las figuras 7 y 8 se obtuvieron utilizando los procedimientos descritos en el Ejemplo 1, comparando los ensayos de acuerdo con la invención con ensayos convencionales de la técnica anterior para luciferasa en extractos celulares, excepto que se inyectaron 100 \mul de una solución de CoA 0,8 mM, luciferina 1,4 mM, ATP 1,5 mM, Mg^{+2} 8 mM, EDTA 0,13 mM, DTT 5,5 mM, tricina 20 mM, pH 7,8, y, adicionalmente, (1) ningún otro compuesto o (2) 2-aminoetanol 110 mM, o (3) etanol 110 mM o (4) etanol 110 mM junto con fosfato de sodio 30 mM, 75 mM o 50 mM, en 220 \mul de una solución producida por mezcla de 20 \mul de extracto celular con 200 \mul de tampón (tricina 20 mM, Mg^{+2} 8 mM, EDTA 0,13 mM, pH 7,8) y se midió la luminiscencia utilizando un luminómetro estándar. Como se indica en las Figs. 7 y 8, el etanol 36 mM no tiene efecto significativo alguno sobre la producción de luminiscencia en la reacción luciferasa-luciferina en presencia de CoA.

Ejemplo 4

En este Ejemplo, se proporciona soporte para los hechos de que, en la reacción luciferasa de escarabajo-luciferina en presencia de CoA, (1) se forma luciferil-CoA, el tioéster entre el carboxilo de la luciferina y el azufre del grupo tiol de CoA, y (2) se forma también un complejo de la luciferasa con CoA y luciferina oxidada en el estado excitado.

La comparación de las secuencias de aminoácidos de luciferasas de escarabajo con las de otras proteínas revela una homología significativa, y por consiguiente ascendencia común con la enzima de origen vegetal, 4-cumarato:CoA-ligasa, y la enzima de cadena larga acil-CoA-sintetasa. Los gráficos de hidropatía (Kyte y Doolittle, J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982), que promedian 15 valores de restos para cada punto) que comparan las luciferasas con las otras dos enzimas muestran semejanzas, siendo especialmente notable la semejanza con la 4-cumarato:CoA-ligasa. Tanto la 4-cumarato:CoA-ligasa como la acil-CoA-sintetasa de cadena larga catalizan la formación de tioésteres entre CoA y los grupos carboxilo de sus substratos respectivos. Con ambas enzimas, ATP reacciona con un substrato para formar un compuesto acil-AMP intermedio en la formación del tioéster. Como se ha indicado anteriormente, la luciferasa forma análogamente luciferil-adenilato a partir de ATP y luciferina.

En los estudios realizados en los años 1950, acerca del efecto de CoA sobre la cinética de la producción de luz en la reacción luciferasa de escarabajo-luciferina, se demostró que el análogo de luciferina no oxidable, deshidroluciferina, podría formar un enlace tioéster a través de su grupo carboxilo con CoA.

Se ha encontrado ahora que la actividad de CoA, en lo que se refiere a afectar a la cinética de la producción de luz en la reacción luciferasa de escarabajo-luciferina, está mediada específicamente por su grupo tiol. La destioCoA es idéntica a CoA sin el átomo de azufre. Cuando se añadió destioCoA, en lugar de CoA, a una mezcla de reacción luciferasa-luciferina, no se produjo efecto alguno sobre la cinética de la producción de luz de la reacción. Adicionalmente, el aumento de la producción de luz en una región de este tipo causado por CoA es inhibido específicamente por destioCoA. En gráficos recíprocos del valor recíproco del aumento de la producción de luz en función del valor recíproco de la concentración de CoA, con y sin destioCoA en concentración constante, la destioCoA exhibía actividad como inhibidor competitivo de CoA. Así pues, destioCoA y CoA se fijan al mismo sitio en la luciferasa, pero destioCoA por carecer del grupo tiol, no tiene actividad alguna afín a CoA.

En los experimentos realizados para obtener los gráficos recíprocos, el tampón para los ensayos de luminiscencia era tricina 30 mM, carbonato de magnesio 8 mM, DTT 10 mM, EDTA 0,2 mM, pH 7,8. La luciferasa cristalina de P. pyralis, a 10 mg/ml en sulfato de amonio al 10% y glicerol al 50%, se diluyó 10.000 veces en el tampón suplementado con glicerol al 10% (volumen/volumen) y 1 mg/ml de seroalbúmina bovina. A continuación, para un ensayo, se mezclaron 10 \mul de la dilución de la enzima (enzima a 1 \mug/ml) con 200 \mul del tampón; la luminiscencia se inició por inyección, en los 210 \mul resultantes, de 100 \mul de tampón suplementado con luciferina 3 mM, ATP 1,5 mM, y diversas concentraciones de CoA y destioCoA (con destioCoA 3 mM: CoA 0,012 mM, 0,06 mM, y 0,3 mM; sin destioCoA: CoA 0,012 mM, 0,06 mM, 0,3 mM, y CoA 1,0 mM). La luminiscencia se midió en un luminómetro Turner Model 20.

Se ha descubierto que la presencia de CoA en una solución en la cual está produciéndose luz por una reacción luciferasa de escarabajo-luciferina, desplaza hacia una longitud de onda más corta el color de la luz que se produce. El color de esta luz está determinado por la diferencia en energía entre la luciferina oxidada en el estado excitado fijada a la enzima y la luciferina oxidada fijada a la enzima en el estado fundamental. El desplazamiento a una longitud de onda más corta significa que, como promedio entre los complejos de luciferina oxidada y luciferasa, esta diferencia de energía es incrementada por CoA. Para que se produzca dicho aumento de energía, tiene que existir un complejo de la enzima con CoA y luciferina oxidada en el estado excitado, que provoca un aumento de la fracción, con relación a la existente en ausencia de CoA, de complejos de la enzima con oxiluciferina excitada en los cuales la diferencia de energía entre la oxiluciferina en los estados excitado y fundamental es más alta. La posibilidad de que el efecto de CoA en un complejo de este tipo podría ser alterar la estructura del complejo luciferasa oxiluciferina sería consistente con la observación, expuesta anteriormente, de que las luciferasas de secuencias diferentes de aminoácidos y por consiguiente al menos de estructuras tridimensionales ligeramente diferentes, v.g., de especies diferentes de escarabajos, catalizan la producción de bioluminiscencia de colores diferentes.

El descubrimiento de que CoA rebaja la longitud de onda de la luz producida en la reacción luciferasa de escarabajo-luciferina se produjo en el experimento siguiente con luciferasa de P. pyralis. En estas comparaciones, se preparó una primera solución mezclando 250 ml de una solución que contenía CoA 0,8 mM, luciferina 1,4 mM, ATP 1,5 mM y DTT 90 mM en un tampón de tricina 20 mM, Mg^{+2} 8 mM, EDTA 0,13 mM, pH 7,8, con una solución que se había preparado mezclando 0,5 \mul de una solución de luciferasa de P. pyralis (10 mg/ml en sulfato de amonio al 10% y glicerol al 50%) con 500 \mul de tampón (tricina 20 mM, Mg^{+2} 8 mM, EDTA 0,13 mM, pH 7,8). Se preparó una segunda solución de la misma manera, pero sin CoA o DTT. Las soluciones primera y segunda se observaron a simple vista mientras que estaba produciéndose luz por la reacción luciferasa-luciferina. La primera solución era ligera, pero apreciablemente, de color más verde que la segunda solución.

Claims

1. Un procedimiento para detectar la presencia de una luciferasa de escarabajo en una muestra que se sospecha contiene la luciferasa, que comprende:

a) mezclar una parte alícuota de la muestra con una solución acuosa que comprende un reactivo de tiol distinto de CoA, luciferina, adenosina-trifosfato, y Mg^{2+}, todos ellos en concentraciones eficaces para la actividad de la luciferasa en la reacción luciferasa/luciferina, y en la cual la solución acuosa no contiene luciferasa, y

b) medir la luminiscencia de la solución resultante del paso (a), en el que la solución resultante de la etapa a) comprende reactivo de tiol distinto de CoA a una concentración por encima de 5 mM.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el cual, en la solución resultante del paso (a), el reactivo de tiol distinto de CoA se selecciona del grupo constituido por ditiotreitol, ditioeritritol, \beta-mercaptoetanol, 2-mercaptopropanol, 3-mercaptopropanol, 2,3-ditiopropanol, y glutatión.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el cual la solución resultante del paso (a) comprende CoA.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el cual la solución resultante del paso (a) comprende adicionalmente un intensificador proteínico de la actividad de luciferasa.

5. El procedimiento de la reivindicación 3, en el cual el reactivo de tiol distinto de CoA es ditiotreitol.

6. El procedimiento de la reivindicación 4, en el cual el reactivo de tiol distinto de CoA es ditiotreitol y el intensificador de la actividad de luciferasa es seroalbúmina bovina.

7. El procedimiento de la reivindicación 5, en el cual, en la solución resultante del paso (a), la concentración de CoA está comprendida entre 0,1 mM y 1,0 mM.

8. El procedimiento de la reivindicación 6, en el cual, en la solución resultante del paso (a), la concentración de CoA está comprendida entre 0,1 mM y 1,0 mM, y la concentración de seroalbúmina bovina está comprendida entre 10 \mug/ml y 5 mg/ml.

9. El procedimiento de la reivindicación 7, en el cual, en la solución resultante del paso (a), la concentración de ATP está comprendida entre 0,1 mM y 1 mM, la concentración de luciferina está comprendida entre 0,1 mM y 1 mM, y la concentración de Mg^{2+} está comprendida entre 2 mM y 15 mM.

10. El procedimiento de la reivindicación 8, en el cual, en la solución resultante del paso (a), la concentración de ATP está comprendida entre 0,1 mM y 1 mM, la concentración de luciferina está comprendida entre 0,1 mM y 1 mM, y la concentración de Mg^{2+} está comprendida entre 2 mM y 15 mM.

11. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el cual la luciferasa de escarabajo es la luciferasa de P. pyralis.

12. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-10, en el cual la concentración de ditiotreitol en la solución resultante del paso (a) está comprendida entre 30 mM y 80 mM.

13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el cual la luciferasa de escarabajo es la luciferasa de P. pyralis.

14. Uso de un reactivo de tiol distinto de CoA en una concentración comprendida entre 5 mM y 200 mM para extender la cinética de la producción de luz en una reacción luciferasa de escarabajo/luciferina, en un procedimiento para la detección de ATP en una muestra que se sospecha contiene ATP, que comprende:

(a) mezclar una parte alícuota de la muestra con una solución acuosa que comprende dicho reactivo de tiol distinto de CoA, una luciferasa de escarabajo, luciferina y Mg^{2+}, todos ellos en concentraciones eficaces para la actividad de la luciferasa en las reacciones luciferasa/luciferina, y

(b) medir la luminiscencia de la solución resultante del paso (a).

15. Uso de un reactivo de tiol de acuerdo con la reivindicación 14, en el cual, en la solución resultante de paso (a), el reactivo de tiol distinto de CoA se selecciona del grupo constituido por ditiotreitol, ditioeritritol, \beta-mercaptoetanol, 2-mercaptopropanol, 3-mercaptopropanol, 2,3-ditiopropanol, y glutatión.

16. Uso de un reactivo de tiol de acuerdo con la reivindicación 15, en el cual la solución resultante del paso (a) comprende CoA.

17. Uso de un reactivo de tiol de acuerdo con la reivindicación 16, en el cual la solución resultante del paso (a) comprende adicionalmente un intensificador proteínico de la actividad de luciferasa.

18. Uso de un reactivo de tiol de acuerdo con la reivindicación 16, en el cual el reactivo de tiol distinto de CoA es ditiotreitol.

19. Uso de un reactivo de tiol de acuerdo con la reivindicación 17, en el cual el reactivo de tiol distinto de CoA es ditiotreitol y el intensificador de la actividad de luciferasa es seroalbúmina bovina.

20. Uso de un reactivo de tiol de acuerdo con la reivindicación 18 en el cual, en la solución resultante del paso (a), la concentración de CoA está comprendida entre 0,1 mM y 1,0 mM.

21. Uso de un reactivo de tiol de acuerdo con la reivindicación 19 en el cual, en la solución resultante del paso (a), la concentración de CoA está comprendida entre 0,1 mM y 1,0 mM, y la concentración de seroalbúmina bovina está comprendida entre 10 \mug/ml y 5 mg/ml.

22. Uso de un reactivo de tiol de acuerdo con la reivindicación 20 en el cual, en la solución resultante del paso (a), la concentración de CoA está comprendida entre 0,1 mM y 1 mM, la concentración de luciferina está comprendida entre 0,1 mM y 1 mM, y la concentración de Mg^{2+} está comprendida entre 2 mM y 15 mM.

23. Uso de un reactivo de tiol de acuerdo con la reivindicación 21 en el cual, en la solución resultante del paso (a), la concentración de CoA está comprendida entre 0,1 mM y 1 mM, la concentración de luciferina está comprendida entre 0,1 mM y 1 mM, y la concentración de Mg^{2+} está comprendida entre 2 mM y 15 mM.

24. Uso de un reactivo de tiol de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14-23, en el cual la luciferasa de escarabajo es la luciferasa de P. pyralis.

25. Uso de un reactivo de tiol de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14-23, en el cual la concentración de ditiotreitol en la solución resultante del paso (a) estácomprendida entre 30 mM y 80 mM.

26. Uso de un reactivo de tiol de acuerdo con la reivindicación 25, en el cual la luciferasa de escarabajo es la luciferasa de P. pyralis.

27. Una solución acuosa que comprende una luciferasa de escarabajo, que es capaz de catalizar la reacción luciferasa-luciferina, un reactivo de tiol distinto de CoA en una concentración comprendida entre 5 mM y 200 mM, y CoA en una concentración comprendida entre 0,1 mM y 1,0 mM.

28. Una composición de acuerdo con la reivindicación 27, en la cual el reactivo de tiol distinto de CoA es ditiotreitol en una concentración comprendida entre 30 mM y 80 mM.

29. Una composición de acuerdo con la reivindicación 28, que comprende adicionalmente seroalbúmina bovina en una concentración comprendida entre 10 \mug/ml y 5 mg/ml.

30. Una composición de acuerdo con la reivindicación 29, que comprende adicionalmente 2-aminoetanol en una concentración comprendida entre 5 mM y 50 mM o iónfosfato en una concentración comprendida entre 10 mM y 60 mM.

31. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 27-30, en la cual la luciferasa de escarabajo es la luciferasa de P. pyralis.

32. Una composición de acuerdo con la reivindicación 31, que comprende adicionalmente (1) ión magnesio en una concentración comprendida entre 2 mM y 15 mM, y (2) uno cualquiera de adenosina-trifosfato, en una concentración comprendida entre 0,1 mM y 1,0 mM, y luciferina, en una concentración comprendida entre 0,1 mM y 1,0 mM, o ambos.

33. Un estuche de prueba para la realización de ensayos en cuanto a la presencia de una luciferasa de escarabajo en una muestra que se cree contiene una luciferasa de este tipo, comprendiendo dicho estuche una composición de reacción luciferasa-luciferina que es una solución acuosa que comprende un reactivo de tiol distinto de CoA en una concentración comprendida entre 5 mM y 200 mM, adenosina-trifosfato, luciferina, y Mg^{2+}, en el cual la composición de la reacción está exenta de luciferasa.

34. Un estuche de prueba de acuerdo con la reivindicación 33, en el cual la solución acuosa de la composición de reacción luciferasa-luciferina comprende un reactivo de tiol distinto de CoA en concentración comprendida entre 30 mM y 80 mM, adenosina-trifosfato en concentración comprendida entre 0,10 mM y 1,0 mM, luciferina en concentración comprendida entre 0,1 mM y 1,0 mM, e ión magnesio en concentración comprendida entre 2 mM y 15 mM.

\newpage

35. Un estuche de prueba de acuerdo con la reivindicación 34, en el cual el reactivo de tiol distinto de CoA es ditiotreitol.

36. Un estuche de prueba de acuerdo con la reivindicación 33 para la realización de ensayos en cuanto a la presencia de una luciferasa de escarabajo en una muestra de células de mamífero cultivadas que se cree contienen una luciferasa de este tipo, comprendiendo dicho estuche adicionalmente, y por separado de la composición de reacción luciferasa-luciferina, una composición para lisar dichas células, siendo dicha composición de lisis una solución acuosa con un pH y una fuerza iónica para los cuales la luciferasa es activa en la reacción luciferasa-luciferina y que comprende un detergente no iónico en una concentración comprendida entre 0,1% y 10% (peso/peso), un intensificador proteínico de la actividad de luciferasa en una concentración comprendida entre 0,1 mg/ml y 5 mg/ml, un reactivo de tiol distinto de CoA en una concentración comprendida entre 1 mM y 10 mM, y glicerol o etilenglicol en una concentración comprendida entre 1% y 50% (volumen/volumen).

37. Un estuche de prueba de acuerdo con la reivindicación 34, para la realización de ensayos en cuanto a la presencia de una luciferasa de escarabajo en una muestra de células de mamífero cultivadas que se cree contienen una luciferasa de este tipo, comprendiendo dicho estuche adicionalmente, y por separado de la composición de reacción luciferasa-luciferina, una composición para lisar dichas células, siendo dicha composición de lisis una solución acuosa con un pH y una fuerza iónica para los cuales la luciferasa es activa en la reacción luciferasa-luciferina y que comprende un detergente no iónico, que es una mezcla de octoxinol con un número medio de unidades etileniloxi por molécula comprendido entre 9 y 10, en una concentración comprendida entre 0,1% y 10% (volumen/volumen), seroalbúmina bovina en una concentración comprendida entre 0,1 mg/ml y 5 mg/ml, ditiotreitol en una concentración comprendida entre 1 mM y 10 mM, y glicerol o etilenglicol en una concentración comprendida entre 1% y 50% (volumen/volumen).

38. Un estuche de prueba de acuerdo con la reivindicación 35 para la realización de ensayos en cuanto a la presencia de una luciferasa de escarabajo en una muestra de células de mamífero cultivadas que se cree contienen una luciferasa de este tipo, comprendiendo dicho estuche adicionalmente, y por separado de la composición de reacción luciferasa-luciferina, una composición para lisar dichas células, siendo dicha composición de lisis una solución acuosa con un pH y una fuerza iónica para los cuales la luciferasa es activa en la reacción luciferasa-luciferina y que comprende un detergente no iónico, que es una mezcla de octoxinol con un número medio de unidades etileniloxi por molécula comprendido entre 9 y 10, en una concentración comprendida entre 0,1% y 10% (volumen/volumen), seroalbúmina bovina en una concentración comprendida entre 0,1 mg/ml y 5 mg/ml, ditiotreitol en una concentración comprendida entre 1 mM y 10 mM, y glicerol o etilenglicol en una concentración comprendida entre 1% y 50% (volumen/volumen).

39. Un estuche de prueba de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33-38, en el cual la luciferasa de escarabajo, que es el analito del estuche, es la luciferasa de P. pyralis.

40. Un estuche de prueba para la realización de ensayos en cuanto a la presencia de adenosina-trifosfato en una muestra que se cree contiene dicho compuesto, comprendiendo dicho estuche una solución acuosa que comprende CoA en concentración comprendida entre 0,1 mM y 1,0 mM, una luciferasa de escarabajo, un reactivo de tiol distinto de CoA en una concentración comprendida entre 30 mM y 80 mM, luciferina en concentración comprendida entre 0,1 mM y 1,0 mM, e ión magnesio en concentración comprendida entre 2 mM y 15 mM.

41. Un estuche de prueba de acuerdo con la reivindicación 40, en el cual el reactivo de tiol distinto de CoA es ditiotreitol.

42. Un estuche de prueba de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 40 ó 41, en el cual la luciferasa de escarabajo es la luciferasa de P. pyralis.