ES2140471T5 - Mejoras en la embriogenesis somatica. - Google Patents

Abstract

CULTIVOS EN SUSPENSION DE EMBRIONES SOMATICOS Y CULTIVOS EN SUSPENSION DE MASAS PROEMBRIOGENICAS (PEMS), COMPRENDIENDO EMBRIONES SOMATICOS Y PEMS QUE TIENEN NIVELES PLOIDICA Y SUSTANCIALMENTE SIMILARES, PLANTAS DERIVADAS DE LOS MISMOS, Y METODOS PARA OBTENER TALES EMBRIONES SOMATICOS.

Description

Mejoras en la embriogénesis somática.

La presente invención se relaciona con métodos de embriogénesis somática mejorados, adecuados para regenerar plantas enteras a partir de cultivos de tejido y, de manera más específica, se relaciona con métodos mejorados para la obtención de embriones somáticos por medio de embriogénesis somática utilizando medios líquidos per se.

Antecedentes de la invención

La comercialización de un proceso para hacer un uso efectivo de la embriogénesis somática se considera deseable y económicamente más atractivo que, por ejemplo, la clonación organogénica debido al potencial de rendimientos superiores de plantas durante intervalos de tiempo comparativamente cortos.

Se sabe que ciertas células vegetales tienen el potencial de diferenciarse en plantas enteras cuando se cultivan en medios de cultivo de tejido vegetal apropiados. Normalmente, tales medios comprenden sales inorgánicas, una fuente de carbono tal como sacarosa, inositol, tiamina y similares. Ejemplos de medios de cultivo para tejido vegetal utilizados generalmente son aquellos de Murashige y Skoog (medio MS), Lindsmaier y Skoog, Gamborg (medio B5) y similares.

La composición de tales medios de cultivo para tejido vegetal se puede modificar para optimizar el crecimiento de la célula vegetal particular utilizada. Casi todas las células vegetales requieren hormonas vegetales, por ejemplo, auxinas o compuestos parecidos a las auxinas, tales como ácido indolacético, ácido indolbutírico, ácido naftalenacético o 2,4-D y/o una citocinina tal como benciladenina, zeatina, cinetina y similares. Con el fin de asegurar un crecimiento óptimo también puede ser ventajoso agregar vitaminas tales como ácido nicotínico, piridoxina y otros componentes tales como leche de coco, hidrolizados de caseína y similares.

En el pasado, la formación de embriones somáticos verdaderos ha requerido el uso de material de callo, el cual comprende conglomerados no diferenciados de células que tienen vacuolas muy grandes y más pequeñas, células redondas que tienen vacuolas más pequeñas, como el material de fase de crecimiento primario a partir del cual se pueden derivar después los embriones somáticos. Sin embargo, el uso de tal material como material de partida en la embriogénesis somática tiene muchos inconvenientes y ha demostrado ser de un uso limitado en la obtención de grandes cantidades de plantas que tienen un fenotipo sustancialmente similar y/o que son sustancialmente uniformes con respecto al nivel de ploidía. Las plantas que se originan de callo tienen una tendencia a mostrar variación somaclonal y/o falta de uniformidad con respecto al nivel de ploidía [(Chaleff R.S. (1983) Science 219:676-682; Larkin P.J. (1987) Iowa State Journal of Research 61(4):393-434; De Klerk G-J (1990) Acta Bot. Neerl. 39(2):129-144; Karp A. & Bright S.W.J. (1985) Oxford Surveys of Plant Molecular & Cell Biology 2:199-234; Custers J.B.M. et al (1990) Acta Bot. Neerl. 39(2):153-161 (cucumis sativos L.); Kysely W. et al (1987) Plant cell Repports 6:305-308 (pisum sativum L.); Ezura H. (1992) Plant Science 85:209-213 (cucumis melo); y Kiviharju E. et al (1992) Plant Cell, Tissue, and Organ Culture 28:187-194 (Cyclamen persicum Mill)].

Ejemplos conocidos de solicitudes de patente hacen uso del material de callo en la embriogénesis somática. Un ejemplo, la WO 90/01058 de Plant Genetic Inc. describe el uso de material de callo para adquirir embriones somáticos al tiempo que investiga el efecto del uso de una amplia gama de auxinas sintéticas. El material de callo se forma o se hace crecer a partir de material de explante adecuado durante muchas semanas de cultivo y/o subcultivo en medios sólidos. Después se inicia la embriogénesis somática mediante la transferencia de tejido de callo a un medio que contiene una hormona vegetal tal como 2,4-D o un análogo de la misma. No se hace mención acerca del nivel de ploidía de los embriones somáticos, o del nivel de ploidía de las plantas obtenidas. Aunque el uso de material de callo en la embriogénesis somática puede ser útil para obtener plantas en las cuales la obtención de variantes somaclonales puede ser interesante para enriquecer un depósito genético disponible, es de poca utilidad para los comerciantes o criadores de semillas quienes simplemente desean obtener números comerciales de plantas que tengan sustancialmente todas ellas el mismo genotipo.

Durzan y Gupta (en: "Biotechnology and Agriculture", ed. A. Mizrahi, 1988, Alan R. Liestre, New York, pp 53-81) informan de la embriogénesis somática y de la poliembriogénesis en coníferas, implicando a masas suspensoras de embriones (ESMs).

Se sabe que las líneas de células de zanahoria han sido clonadas a partir de micro-racimos compuestos de células meristemáticas y estudiadas respecto a su capacidad para producir embriones. (P.Coutos - Thevenot et al, Plant Cell Reports (1990) 8:605-608).

Los autores informan del uso de una suspensión de células inicial a partir de hipocótilos de zanahoria común (cepas S1) en un medio de cultivo de tejido vegetal constituido por la auxina 2,4-D, aislamiento de los racimos de células por filtración, resuspensión de los racimos celulares en medios de cultivo de tejido vegetal que comprenden 2,4-D para incrementar la densidad de población de los racimos, transferencia de las colonias celulares desde los racimos aislados a una placa Petri que comprende medio de cultivo de tejido vegetal sólido que contiene 2,4-D y bacto-agar al 1% para inducir la formación de colonias celulares y deposición de las mismas en un segundo medio sólido que contiene 2,4-D y bacto-agar al 1% alrededor de un callo de cepa nutriente S1, disociación de cada colonia de células en medio de cultivo de tejido vegetal que contiene 2,4-D y subcultivo de los cultivos así obtenidos en medio de cultivo de tejido vegetal que contiene 2,4-D. El posterior análisis de las líneas celulares obtenidas de acuerdo con este proceso revela que 13 de 40 líneas celulares eran embriogénicas, pero la mayor parte de estas líneas pierden su potencial embriogénico con el tiempo. Solo una línea celular tenía un potencial embriogénico constante durante un período más largo. De acuerdo con el análisis por citometría de flujo esta última línea era diploide.

La presente invención proporciona un método para obtener embriones somáticos en cultivo en suspensión que es técnicamente sencillo. Entre otras cosas, no requiere la deposición de líneas celulares alrededor de un callo nutriente. El método de la invención permite en consecuencia la producción de embriones somáticos a escala comercial. Los embriones somáticos de acuerdo con la invención pueden ser usados para proporcionar cantidades comerciales de plantas que tienen sustancialmente el mismo genotipo.

Hasta ahora, la embriogénesis somática ha sido considerada como una herramienta potencialmente poderosa en la obtención de plantas; sin embargo, la imposibilidad de utilizar la embriogénesis somática a partir de material de callo ha impedido la explotación con éxito de dicha tecnología.

Ahora se ha encontrado de manera sorprendente que se pueden obtener cantidades comerciales de verdaderos embriones somáticos a través del uso de técnicas de cultivo líquido per se y sin necesidad de utilizar medios sólidos y/o tejido de callo. También se ha encontrado que es posible incrementar la biomasa de PEM en medios líquidos y por lo tanto la capacidad para producir embriones somáticos en cantidades comerciales a partir de la misma. Usando tales técnicas de cultivo líquido se evita la necesidad de utilizar pasos de cultivo con callo/subcultivo con callo y se proporciona, por primera vez, un medio para obtener poblaciones de embriones somáticos que son uniformes con respecto al nivel de ploidía.

La presente invención proporciona un método para obtener embriones somáticos por vía de embriogénesis el cual reduce de manera sustancial o elimina el riesgo de obtener variantes somaclonales.

La invención proporciona un medio más fiable para obtener embriones somáticos verdaderos en cantidades comerciales a partir de material de explante el cual no se basa en el uso de tejido de callo y/o uso de medios sólidos como elementos esenciales de dichos medios.

Estos y otros objetos de la invención serán evidentes a partir de la lectura de la siguiente descripción y ejemplos.

Descripción detallada

La invención proporciona un método de obtención de embriones somáticos en suspensión (cultivo) de acuerdo con la reivindicación 1.

El material de explante usado puede ser de especies de plantas dicotiledóneas o monocotiledóneas. De manera preferible, el material de explante se deriva de una especie de planta dicotiledónea. Habitualmente, los embriones somáticos se derivan de masas pro-embriogénicas (PEMs), cuyas estructuras son morfológicamente diferentes del material de callo y que también se conocen como grupos meristemáticos. Las PEMs tienen el mismo nivel de ploidía o niveles de ploidía que el material de explante del cual se derivan. Por lo tanto, cuando el material de explante que comprende células diploides y tetraploides se toma de una planta diploide, las PEMs diploides y tetraploides resultantes del mismo pueden ser separadas por tamizado, clasificación celular o similar antes de cultivo adicional en medio líquido.

Las PEMs comprenden tejido vegetal de crecimiento sustancialmente diferenciado y pueden ser consideradas como precursores de embriones somáticos verdaderos. Bajo el microscopio óptico (aumento de x40 a x100), las PEMs aparecen como conglomerados de pequeñas células redondas, ricas en citoplasma, que comprenden vacuolas pequeñas. Como tales, las PEMs de la presente invención se pueden considerar como sustancialmente idénticas en términos genéticos respecto a las células parentales de las plantas de las cuales se derivan y finalmente dan lugar a verdaderos embriones somáticos, cuyos embriones son reconocibles por ser bipolares, es decir, tener la capacidad de dar lugar a raíces y brotes a partir de tejidos meristemáticos de raíz y brote. Por lo tanto, un embrión somático verdadero viable también es uno que puede dar lugar a por lo menos una plántula que es idéntica, hablando genéticamente, al material de explante progenitor celular del cual se deriva, cuando se somete a tratamientos adicionales apropiados como los usados normalmente en la técnica.

El material de tejido vegetal adecuado para su uso en el método de la invención es material de explante el cual se puede obtener a partir de cualquier órgano vegetal o parte del mismo, u otro tejido vegetal diferenciado de manera adecuada, por ejemplo protoplastos. Tal tejido se puede seleccionar del grupo que comprende el tallo, hojas, pétalos, sección del hipocótilo, meristema apical, o varios, embrión zigótico per se, tubérculo, haz vascular, periciclo, filamento antérico y similares. De manera alternativa, un material de explante adecuado puede ser el embrión somático per se. El tejido vegetal se puede tomar de cualquier especie vegetal de interés e incluye tejido vegetal seleccionado de plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas. Una selección de tipos de plantas de interés se puede encontrar en the Handbook for Seedling Evaluation, J.Bekendam and R. Grob, ISTA, Zurich, Suiza 1979, en las páginas 28-29 y ejemplificados además en el índice, páginas 122-126, incorporado en la presente como referencia. Los tipos de plantas preferidas incluyen aquellas seleccionadas del grupo que comprenden Cyclamen o Ciclamino, Cucurbitáceas, Lycopersicons, de manera preferible Tomates de mesa o comestibles, Alliums, Begonias, Betas, Primulas, Brassicas, Capsicums, Cichoriums, Gerberas, Impatients, Lactucas, Oryzas, Pelargoniums, Petunias, Violas, y Zeas. De manera más preferida son los tipos de plantas seleccionados del grupo que comprende Cyclamens, o Ciclamino, Cucurbits o Cucurbitáceas, Betas tales como Beta vulgaris (remolachas), Brassicas tales como B. oleracea o B. napus, Violas, Pelargoniums y Capsicums.

El medio de cultivo de tejido vegetal líquido adecuado para su uso en el método de la invención puede ser cualquier medio de cultivo de tejido vegetal líquido que sea adecuado para inducir y/o promover la embriogénesis. Ejemplos de medios básicos utilizados comúnmente en la técnica incluyen el medio B5 de Gamborg (B5), el medio de Murashige y Skoog (MS) y variantes de los mismos.

La presente invención contempla la adición de una cantidad suficiente de auxina capaz de inducir la formación de PEM al medio de cultivo líquido adecuado que contiene el explante u otro material de partida adecuado en una fase de inducción inicial, y, después de tal fase de inducción inicial, el uso de otro medio de cultivo líquido adecuado capaz de promover el crecimiento y multiplicación de PEM, en el cual la concentración o concentraciones de auxinas son reconstituidas a intervalos adecuados. En consecuencia, es ventajoso controlar la concentración de auxina en el transcurso del tiempo utilizado, por ejemplo, técnicas de HPLC convencionales conocidas para asegurar que la etapa de desarrollo de la suspensión se fije en el nivel PEM. También es importante no agregar demasiadas auxinas al medio de cultivo de tejido vegetal para evitar posibles efectos tóxicos secundarios de las auxinas pero manteniendo las PEMs en un estado viable.

El medio de cultivo de tejido vegetal líquido para el crecimiento y multiplicación de PEM puede ser un medio de cultivo de tejido vegetal de fase de inducción inicial en el cual la concentración de auxina y/u otros componentes esenciales simplemente se reponen a intervalos adecuados, de modo que puedan tener lugar las fases de inducción y promoción de la embriogénesis somática; el medio de fase de inducción inicial también puede ser sustituido por medio de cultivo de tejido vegetal fresco que contenga las concentraciones de auxinas apropiadas a intervalos adecuados, con lo que el medio de cultivo de tejido vegetal líquido puede ser igual o diferente al medio de cultivo de tejido vegetal líquido apropiado, pero diferente, utilizado inicialmente. Por lo tanto, se puede apreciar que el medio o tipos de medios de cultivo de tejido vegetal reales utilizados no es crítico para la invención, con la condición de que sean líquidos y capaces de ser utilizados para la inducción y/o promoción de formación PEM en presencia de la concentración de auxina apropiada.

También se puede apreciar fácilmente que la concentración necesaria de auxina variará de una a otra especie vegetal y puede variar de una a otra variedad vegetal. El tipo y concentración de auxina que proporciona los resultados óptimos para una variedad dada, se puede determinar por pruebas convencionales. Dependiendo de la variedad vegetal, puede ser ventajoso utilizar una mezcla de auxinas. Ejemplos de auxinas y compuestos de tipo auxina adecuados para su uso en el método de la invención incluyen ácido indolacético, ácido indolbutírico, ácido naftalenacético y mezclas de los mismos. El nivel de auxina se mantiene de modo que la concentración promueva el crecimiento y formación de PEMs.

Con preferencia, la concentración de auxina se mantiene en 0,1 mg/l a 30 mg/l aproximadamente, dependiendo del número de PEM o biomasa de las especies vegetales de interés. Una mezcla adecuada de auxinas puede incluir NAA y 2,4-D en concentraciones apropiadas. La concentración de auxina efectiva de ácido naftalenacético (NAA) generalmente se encuentra en el intervalo de 0-20 mg/l aproximadamente y la de 2,4-D en el intervalo de 0,1 mg/l hasta 10 mg/l aproximadamente, dependiendo de las especies vegetales de interés. Por ejemplo, las PEMs de cyclamen o ciclamino no requieren la presencia de NAA, pero requieren la presencia de 2,4-D en una concentración inicial de 5-10 mg/l aproximadamente; se ha encontrado que las PEMs de lycopersicon requieren NAA en una concentración inicial de 20 mg/l y de 2,4-D en una concentración inicial de 1 mg/l.

Dependiendo de la variedad vegetal y del medio de cultivo de tejido vegetal utilizado, puede ser ventajoso agregar una cantidad no fitotóxica de citocinina al medio que contiene auxina para facilitar la captación de auxina.

Los pasos i) y ii) de la reivindicación 1 se pueden llevar a cabo, por ejemplo, como sigue:

Se coloca material de explante en un medio líquido adecuado, tal como el medio B5 o el medio MS que contiene una auxina o una mezcla de auxina a una concentración de 0,1 mg/l a 30 mg/l aproximadamente, dependiendo de las especies de interés, y la cual es efectiva para inducir la formación de PEM. El material de explante se cultiva a una densidad adecuada de 0,01 gramos de peso fresco/litro a 100 gramo de peso fresco/litro de cultivo aproximadamente, con preferencia de 1 gramo de peso fresco/litro a 10 gramos de peso fresco/litro aproximadamente para un período de tiempo medido en semanas, tiempo durante el cual aparecen las PEMs. El período de tiempo puede encontrarse entre 2 semanas y 14 semanas o más aproximadamente, de manera típica entre 4 semanas y 8 semanas aproximadamente, dependiendo de las especies vegetales de interés. Generalmente, las PEMs obtenidasse separan del cultivo de material de explante inicial, por ejemplo, a través de dilución del medio o reemplazo del medio y cultivo adicional en el mismo o en un medio líquido reciente similar.

Las PEM obtenidas son capaces de entrar en una fase de crecimiento o multiplicación inmediatamente bajo las condiciones ambientales iguales o similares a las requeridas para la inducción de formación de PEM. Por conveniencia, esta fase se refiere como fase de multiplicación en la presente invención, puesto que se incrementa de forma controlada el número de PEM o la biomasa de PEM y se observa que crecen.

Después de observar la inducción de formación de PEM, el medio de cultivo de tejido vegetal líquido se controla de modo que se mantiene la concentración de auxina a un nivel suficiente para promover el crecimiento y multiplicación de PEM sin desarrollo significativo de PEM. La fase de multiplicación puede involucrar el subcultivo a diluciones regulares del medio de cultivo de tejido vegetal líquido seleccionado de modo que los niveles de auxina se controlen a un nivel suficiente para promover la multiplicación de PEM durante un intervalo de tiempo adecuado. De manera alternativa, las PEMs se pueden separar del cultivo de material de explante inicial y se colocan en un medio de cultivo de tejido vegetal que contiene auxina y simplemente se permite que se multipliquen hasta una biomasa de PEM deseada mediante la utilización de un sistema de cultivo de alimentación por lotes o continua. Normalmente, esto involucra mantener la concentración de auxina por encima del nivel de 0,1 mg/l aproximadamente durante un período de tiempo. El período de tiempo para la fase de multiplicación se puede medir en años, dependiendo de cuantas PEMs se requieren para convertirlas en embriones somáticos verdaderos; sin embargo, a menudo la fase de multiplicación se mide en meses o semanas, tal como entre 2 y 30 semanas aproximadamente, dependiendo de la cantidad de biomasa PEM requerida. Una vez en la fase de multiplicación, las PEMs se pueden recoger en cualquier momento para su colocación en un medio de cultivo de tejido vegetal sustancialmente exento de auxina en el que pueden ser procesadas para desarrollarse en embriones somáticos verdaderos. Esto puede involucrar la separación por tamizado como se describe en la presente, es decir, la selección de fracciones de PEM de un cierto tamaño que pueden pasar a través de tamices de dimensiones adecuadas (por ejemplo, un tamiz con un tamaño de poro de 150 \mum) pero que quedan retenidas en un tamiz de dimensiones más pequeñas (por ejemplo, un tamiz con un tamaño de poro de 100 mm).

De manera ventajosa, la formación y multiplicación de PEM es influida por la adición de una fuente de energía de carbono adecuada, de manera conveniente un carbohidrato soluble tal como sacarosa, glucosa o rafinosa, al medio de cultivo de tejido vegetal líquido.

Las concentraciones típicas de carbohidratos se encuentran en el intervalo de 15 g/l a 90 g/l, de manera preferible de 20 g/l a 60 g/l del medio de cultivo de tejido vegetal.

La fase de multiplicación se puede efectuar en matraces o en un biorreactor. Los biorreactores son conocidos en la técnica de cultivo de suspensiones celulares para la producción de metabolitos celulares secundarios; sin embargo, el uso de biorreactores para el cultivo de PEM no ha sido descrito hasta la fecha. Se ha encontrado que los biorreactores pueden ser útiles en la producción de cantidades muy grandes de PEMs en intervalos de tiempo relativamente cortos.

Por conveniencia, los volúmenes de células empacadas procedentes de cultivos en suspensión de PEM se inoculan en un medio adecuado que contiene una cantidad suficiente de una fuente de energía de carbono adecuada tal como, por ejemplo, sacarosa, glucosa y rafinosa entre 15 g/l y 90 g/l o más aproximadamente, de manera preferible entre 20 g/l y 60 g/l aproximadamente, dependiendo de las especies de interés de PEM, en un biorreactor adecuado. Preil W. y Beck A. [(1991) Acta Horticulturae 289, Plant Technology: 179-192] describen la embriogénesis somática en biorreactores utilizando vibromezcladores; sin embargo, no hay indicación en ese estudio de que se lleve a cabo la formación y multiplicación de PEM previas al desarrollo de PEMs a embriones somáticos. Se ha encontrado que el uso de vibromezcladores en biorreactores en cultivos en suspensión de PEM incrementa de manera significativa la duración de vida de las PEMs en el tiempo, ayuda a incrementar la biomasa de PEM, reduce la pérdida de biomasa de PEM y evita la aglomeración de PEMs. Un vibromezclador equipado con una placa mezcladora perforada o disco de agitación (suministrado por Applikon BV, Los Países Bajos y Chemap AG, Suiza, respectivamente) situado en un plano fijo en un biorreactor y dejando que vibre sustancialmente en ese plano fijo, se ha traducido en la mezcla o agitación de los cultivos en suspensión de PEM sin pérdida significativa en la biomasa de PEM.

De manera preferible, el vibromezclador se hace vibrar en un plano sustancialmente vertical. Una frecuencia de operación típica de un vibromezclador para su uso en el método de la invención es de 50 Hz; la amplitud de manera conveniente está en el orden de \pm6 mm o menos. Una vez que se alcanza la biomasa de PEM que es capaz de dar lugar al número deseado de embriones somáticos, las PEMs se pueden poner en contacto con un medio de cultivo de tejido vegetal líquido sustancialmente exento de auxina en el cual sean capaces de desarrollarse a embriones somáticos.

De manera ventajosa se airea la suspensión de PEM. Esto se puede efectuar de una manera conocida per se. Cuando se utiliza un vibromezclador, el aire puede ser por ejemplo rociado en el reactor vibromezclador utilizando un dispositivo de rociado poroso.

Se deduce de lo anterior y de los ejemplos que las condiciones óptimas para los diversos parámetros tales como el tipo y concentración de las auxinas, la presencia de una citocinina, la fuente de energía (carbohidratos), la frecuencia de agitación o vibración, el suministro de oxígeno y la intensidad y longitud de onda de la luz variarán dependiendo del material vegetal utilizado. Tales condiciones óptimas se pueden determinar utilizando pruebas convencionales (como se ilustra en los ejemplos).

Los pasos subsecuentes iii) y iv) del método para obtener embriones somáticos de acuerdo con la invención, se pueden llevar a cabo como sigue:

Se puede lograr la promoción del desarrollo de PEM a embriones somáticos colocando las PEMs en un medio de cultivo de tejido vegetal exento de auxina. Las PEMs viables son capaces de desarrollarse a embriones somáticos. Antes de la transferencia en un medio exento de auxina, las PEMs se tamizan de manera ventajosa, por ejemplo, a través de una malla de nylon, para seleccionar la fracción de tamaño de PEM que genere de manera más eficiente los embriones somáticos deseados. Un contenido demasiado elevado en PEMs no viables inhibirá la formación de embriones somáticos. En general, es deseable utilizar PEMs que comprenden por lo menos 5%, de manera preferible por lo menos 10%, de manera más preferible por lo menos 15% de PEMs viables. La fracción de tamaño óptimo se puede determinar por pruebas de tamizado convencionales.

Las PEMs de un tamaño seleccionado se pueden recoger, por ejemplo, por tamizado u otro medio de clasificación por tamaños de la técnica. Los expertos en el tema apreciarán que el tamaño de las PEMs dimensionadas de manera deseable (por ejemplo, la fracción de PEM que tiene un contenido elevado en PEMs viables) variará de una especie a otra como se detalla en la presente.

Una fracción tamizada de PEMs es una que se obtiene pasando las PEMs a través de un medio de filtración tal como mallas de red de tamaño de poro conocido, por ejemplo, una malla de nylon, con el fin de obtener PEMs dentro de un intervalo de tamaños dado. Las PEMs pueden ser de cualquier tamaño de hasta 1 mm de diámetro aproximadamente, dependiendo de la especie vegetal; sin embargo, los agregados de PEMs pueden ser de hasta 5 mm de diámetro. En términos generales, el tamaño deseable de las PEMs individuales es del orden de\mum. Se ha encontrado que el tamaño de las PEMs es crítico para la obtención de embriones somáticos individuales derivados de las mismas. De manera preferible, una fracción de PEM recogida es aquella en la que cada PEM de la misma es capaz de dar lugar a un embrión somático bajo condiciones apropiadas. De manera natural, el tamaño de las fracciones de PEMs tamizadas viables particulares varía de una especie vegetal a otra. Por ejemplo, la fracción de PEM más útil para el pepino es una en la que el tamaño de las PEMs se encuentra entre 100\mum y 150 \mum aproximadamente; la fracción de PEMs para cyclamen o ciclamino es 150 \mum a 300 \mum aproximadamente. Por adelantado, la fracción de PEM es aquella en la cual cada PEM es capaz de dar lugar a por lo menos un embrión somático, de manera preferible a un solo embrión somático.

El medio de cultivo de tejido vegetal líquido sustancialmente exento de auxina es aquel capaz de permitir que se desarrollen las PEMs a embriones somáticos. Por lo tanto, se considera que el medio de cultivo de tejido vegetal líquido sustancialmente exento de auxina puede ser un medio de cultivo de tejido vegetal agotado en auxina en donde pueden estar presentes niveles residuales de auxina pero cuyos niveles de auxina, en caso de haberlos, no interfieren de manera sustancial con el desarrollo de las PEMs a embriones somáticos, o puede ser un medio de cultivo de tejido vegetal exento de auxina. Naturalmente, los expertos en el tema apreciarán que el medio de cultivo de tejido vegetal sustancialmente exento de auxina se puede colocar en un matraz o en un biorreactor adecuado, por ejemplo, uno equipado con un vibromezclador, dependiendo de cuantos embriones somáticos se deseen. Después, los embriones somáticos obtenidos se pueden convertir en plantas utilizando métodos conocidos en la técnica. Por lo tanto, controlando la biomasa de PEM es posible obtener grandes cantidades de embriones somáticos en cantidades comerciales.

El medio exento de auxina comprende de manera conveniente una fuente de energía de carbohidrato soluble, en una concentración de 15 g/l a 90 g/l, de manera preferible de 20 g/l a 60 g/l. Las fuentes de energía de carbohidratos adecuadas incluyen sacarosa, glucosa y rafinosa.

Las cantidades de embriones somáticos comerciales pueden variar en valor desde algunos cientos (por ejemplo 500) a varios millones (por ejemplo 3000000) o más, dependiendo de las necesidades del cliente. Por ejemplo, si hay un pedido de aproximadamente 200000 plantas, la multiplicación de PEM se continúa hasta que se obtiene una biomasa de PEM que es sustancialmente capaz de dar lugar a aproximadamente 200000 embriones somáticos. Después, tales PEMs se ponen en contacto con un medio de cultivo de tejido vegetal líquido exento de auxina en el que puedan desarrollarse a embriones somáticos.

Una vez que se desarrollan los embriones somáticos verdaderos en el medio de cultivo de tejido vegetal sustancialmente exento de auxina, aquellos pueden ser separados del medio de cultivo de tejido vegetal exento de auxina y convertidos en plantas utilizando técnicas conocidas en general en este campo.

Los embriones somáticos se separan de manera conveniente de las PEMs no viables antes de su uso comercial. Esto se puede realizar de una manera conocida per se. Las PEMs no viables en general son más pequeñas que los embriones somáticos. Por ejemplo, los embriones somáticos se pueden aislar manualmente, por tamizado o por clasificación celular.

El método de la invención proporciona lotes de embriones somáticos constituidos por embriones somáticos que tienen sustancialmente el mismo nivel de ploidía. Los lotes de embriones somáticos pueden comprender entre varios cientos a decenas de miles o más, dependiendo de las necesidades comerciales. De manera preferible, los lotes de embriones somáticos comprenden embriones somáticos sustancialmente diploides o embriones somáticos sustancialmente tetraploides. Un lote de embriones somáticos simplemente puede ser una suspensión de embriones somáticos de la cual se han drenado los medios líquidos y en donde los embriones somáticos se colocan en un recipiente adecuado. El ambiente del recipiente puede tener una humedad relativa elevada, por ejemplo de 100%, y se puede mantener a una temperatura fría adecuada por encima de 0ºC, hasta aproximadamente 15ºC. Los embriones somáticos almacenados de esta manera se pueden mantener hasta 4 días aproximadamente. De manera alternativa, los embriones somáticos se pueden someter a un proceso de desecación, congelado, sedimentación, encapsulado en un gel y similares.

El método de la invención proporciona además cultivos en suspensión de embriones somáticos diferentes de Daucus, que comprenden embriones somáticos que tienen de manera sustancial, en su totalidad, el mismo nivel de ploidía. Los embriones somáticos preferidos son diploides o tetraploides. Los embriones somáticos se derivan de material de explante dicotiledóneo o monocotiledóneo.

Ahora siguen ejemplos que ilustran la invención. Debe entenderse que los ejemplos no se consideran como limitativos del alcance de la invención de manera alguna.

Ejemplo 1 Inicio de cultivos de células embriogénicas de Cyclamen y embriones somáticos así obtenidos

Semillas de Cyclamen, variedad "Concerto Scarlet" (Sluis y Groot) se esterilizan en la superficie con etanol al 70% (durante 2 minutos) y con una solución de hipoclorito de sodio al 1,5% (durante 45 minutos), después se lavan cuidadosamente con agua estéril (tres veces). Las semillas son germinadas en papel húmedo entre 2 y 4 semanas a 23ºC, y los tubérculos que brotan se utilizan como material de explante. Se cultivan tres tubérculos en 10 ml de medio B5 básico (suministrado comercialmente por Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Los Países Bajos), suplementado con 20 g/l de sacarosa, 10 mg/l de 2,4-D, 10 mg/l de myo-inositol, 1,0 mg/l de ácido nicotínico, 1,0 mg/l de clorhidrato de piridoxina, 10 mg/l de clorhidrato de tiamina en un agitador giratorio (agitador giro-rotatorio G10, New Brunswick Scientific, Edison, N.J. EUA) a 100 rpm en la oscuridad, a 23ºC. Después de 7 días el medio se sustituye por medio fresco o reciente. Después de 7 días más, el cultivo se diluye (cinco veces) hasta un volumen de 10 ml con medio fresco. Después de 7 días más las médulas centrales que comprenden haces vasculares y el periciclo del material de explante del tubérculo del cultivo diluido, se separan del material de explante del tubérculo y se subcultivan por separado del resto de los tubérculos en 25 ml de medio B5 básico suplementado con 20 g/l de sacarosa, 100 mg/l de myo-inositol, 1,0 mg/l de ácido nicotínico, 1,0 mg/l de clorhidrato de piridoxina, 10 mg/l de clorhidrato de tiamina, 5 mg/l de 2,4-D y 1 mg/l de cinetina.

Los subcultivos se diluyen semanalmente dos veces, durante 4 semanas. Las masas pro-embriogénicas aparecen a las 4 semanas aproximadamente. Las PEMs se multiplican por subcultivo adicional como se describe anteriormente durante un período de 2 semanas. Las PEMs son capaces de desarrollarse a embriones somáticos verdaderos, viables, mediante cultivo adicional en medio B5 exento de auxina y citocinina, suplementado con 20 g/l de sacarosa, 100 mg/l de myo-inositol, 1,0 mg/l de ácido nicotínico, 1,0 mg/l de clorhidrato de piridoxina y 10 mg/l de clorhidrato de tiamina.

Ejemplo 2 Inicio de cultivos en suspensión de células embriogénicas de Cyclamen y embriones somáticos así obtenidos

Semillas de Cyclamen (variedad Concerto Scharlaken Othello, de Zaadunie BV) son esterilizadas en la superficie con etanol al 70% (durante 2 minutos) y una solución de hipoclorito de sodio al 1% (durante 45 minutos) y se lavan cuidadosamente con agua estéril (3x). Las semillas se germinan en papel húmedo en períodos entre dos y cinco semanas en la oscuridad a 23ºC. Los tubérculos brotados se utilizan como material de explante y se cortan en dos a ocho piezas. El nivel de ploidía del material de explante se mide de acuerdo con las enseñanzas de De Laat A.A.M. et al (1987) Plant Breeding 99:303-307, y se encuentra que es diploide.

El material de explante de tres tubérculos se cultiva en 10 ml de medio B5 básico (Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Países Bajos) suplementado con sacarosa a 20 g/l, ácido 2,4-diclorofenoxiacético a 5 mg/l, y cinetina a 1 mg/l en un matraz de 50 ml sobre un sacudidor giratorio (100 rpm) en la oscuridad y a una temperatura de 23ºC. Todos los matraces se cubren con papel de aluminio. Después de una semana, el cultivo se diluye cinco veces con medio B5 básico suplementado con 20 g/l de sacarosa, 5 mg/l de 2,4-D, 100 mg/l de myo-inositol, 1,0 mg/l de ácido nicotínico, 1,0 mg/l de clorhidrato de piridoxina, 10 mg/l de clorhidrato de tiamina y 1 mg/l de cinetina hasta un volumen de 50 ml en un matraz de 250 ml. Después de dos semanas más, el cultivo contiene PEMs las cuales se separan del resto del cultivo con una pipeta que tiene una boquilla ancha, y se cultivan de manera separada. Las PEMs se identifican visualmente como amontonamientos o aglomeraciones de células que consisten esencialmente de células citoplasmáticas, redondas, pequeñas. En esta etapa, las PEMs se identifican ya sea como amontonamientos únicos de células o como un grupo de amontonamiento de células unidas entre sí. Los cultivos se subcultivan cada dos semanas al inocular 1 ml de células empacadas en medio B5 básico suplementado con 20 g/l de sacarosa, 5 mg/l de 2,4-D, 100 mg/l de myo-inositol, 1,0 mg/l de ácido nicotínico, 1,0 mg/l de clorhidrato de piridoxina, 10 mg/l de clorhidrato de tiamina y 1 mg/l de cinetina hasta un volumen final de 50 ml, en un matraz de 250 ml utilizando una pipeta que tiene una boquilla ancha. El volumen de células empacadas (PCV), es decir, la masa celular total después de la centrifugación para PCV_{inicial} y PCV_{final} se determina por centrifugación de muestras de cultivos durante 2 minutos a 700 x g. La línea de células embriogénicas generalmente crece con un tiempo de duplicación entre 4 y 6 días aproximadamente calculado a partir de las mediciones de PCV_{inicial} y PCV_{final} utilizando la fórmula de Schlegel, H.G. (1981) Allgemeine Microbiologie, Tieme, Stuttgart, página 190. La línea celular embriogénica obtenida de esta manera se mantiene durante por lo menos 45 semanas y es genéticamente estable, es decir, el nivel de ploidía es diploide, el mismo que el del material de explante original.

Las PEMs se seleccionan por tamizado del cultivo de PEM a través de mallas de nylon que tienen un tamaño de poros de 250 \mum y 100 \mum, respectivamente. A los ocho días después del subcultivo, se obtiene el número más elevado de PEMs/ml. Esta fracción da lugar al desarrollo de embriones óptimo y al número más elevado de embriones por PCV del cultivo de PEM. El número de PEMs tamizadas generalmente varía de 1000 a 5000 PEMs/ml de PCV.

Después del tamizado, las PEMs se lavan y se inoculan en el medio de desarrollo, es decir, medio MS o B5 suplementado con sacarosa o glucosa hasta una concentración de 174 mM. Se cultivan de 25 a 50 PEMs/ml en un matraz sellado con papel de aluminio y nescofilm (Band Chemicals Ind. LTD, Japón). Después de tres a cuatro semanas se forman embriones en forma de torpedos los cuales recuerdan a los embriones cigóticos. Utilizando este método se producen 250000 embriones. Usando técnicas de análisis de citometría de flujo como describen De Laat A.M.M. supra, en una muestra aleatoria del cultivo de embriones, se determina el contenido en ADN de 500 embriones somáticos. Se encuentra que todos los embriones son diploides.

La conversión, (es decir, la germinación) de los embriones de Cyclamen comprende la formación de tubérculos seguido por la formación de raíces adventicias y se induce por cultivo de los embriones en un medio líquido, es decir, medio MS o B5 que tiene un contenido de glucosa o sacarosa de aproximadamente 116 mM o 58 mM, respectivamente. La formación de tubérculos se define como el desarrollo a partir del hipocótilo de una estructura tuberosa o parecida a tubérculo. El desarrollo adicional del cotiledón que forma la primera hoja puede presentarse ya sea en medio líquido o en medio sólido tal como perlita, tierra esterilizada y similares.

Los embriones convertidos se siembran directamente en perlita o tierra para macetas, bajo condiciones estériles (en presencia de una fuente de carbono) o bajo condiciones no estériles (sin que se agregue carbono) y muestran formación de cotiledones después de dos a cuatro semanas en la oscuridad, de 18ºa 20ºC. Se utiliza una humedad relativa elevada, de aproximadamente 90%. Más del 90% de los embriones se convierten a la fase del cotiledón bajo condiciones estériles. Una vez que el cotiledón aparece, las plántulas resultantes se colocan a la luz y se endurecen antes de ser transferidas a un invernadero.

Ejemplo 3 Inicio de los cultivos de células embriogénicas de tomate

Semillas de tomate variedad "Manhattan" (Sluis y Groot) se esterilizan en la superficie con etanol al 70% (durante 2 minutos) y una solución de hipoclorito de sodio al 1,5% durante 15 minutos, después se lavan cuidadosamente con agua estéril (tres veces). Las semillas se hacen germinar en papel húmedo durante 3 días a una temperatura de 23ºC. Se recogen las plántulas completas y cada plántula se corta en 4 piezas las cuales después se utilizan como material de explante. Se cortan 10 plántulas de esta manera y se incuban en 15 ml de medio básico B5 (suministrado comercialmente por Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Países Bajos), suplementado con sacarosa a 20 g/l, 20 mg/l de NAA, 1 mg/l de 2,4-D,1 mg/l de cinetina, 100 mg/l de myo-inositol, 1 mg/l de ácido nicotínico, 1 mg/l de clorhidrato de piridoxina y 10 mg/l de clorhidrato de tiamina en un agitador giratorio a 100 rpm a 23ºC bajo un período de luz de 16 horas y 8 horas de oscuridad, cíclico. El medio de cultivo se controla para verificar la concentración de auxina utilizando técnicas HPLC ya conocidas. Una vez que la concentración de auxina disminuye por debajo de 0,1 mg/l después de aproximadamente 7 días, se agrega 15 ml de medio básico B5 reciente o fresco (suministrado comercialmente por Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Países Bajos), suplementado con sacarosa a 20 g/l, 20 mg/l de NAA, 1,0 mg/l de 2,4-D, 1 mg/l de cinetina, 100 mg/l de myo-inositol, 1 mg/l de ácido nicotínico, 1 mg/l de clorhidrato de piridoxina y 10 mg/l de clorhidrato de tiamina, hasta constituir un volumen de 30 ml de cultivo. Este cultivo se subcultiva cada 4-

\hbox{7}

días permitiendo que el material de explante y las células sedimenten durante 15 minutos y renovando el cultivo al extraer 15 ml de medio utilizado y sustituirlo con 15 ml de medio fresco o reciente. Después de aproximadamente 4-7 semanas desde el cultivo inicial del material de explante, se observan las masas pro-embriogénicas (PEMs). Las PEMs se multiplican mediante subcultivo adicional como se describe anteriormente durante un período de 2 semanas. Las PEMs se subcultivan de manera adicional en medio B5 básico exento de auxina y suplementado como anteriormente, excluyendo NAA, 2,4-D y cinetina, y se observan embriones somáticos verdaderos. Ejemplo 4 Inicio de cultivos de células embriogénicas de tomate

Semillas de tomate variedad "Majorca" (Sluis y Groot) se esterilizan en la superficie con etanol al 70% (durante 2 minutos) y una solución al 1,5% de hipoclorito de sodio durante 15 minutos, después se lavan cuidadosamente con agua estéril (tres veces). Las semillas se hacen germinar en papel humedecido durante 7 días a temperatura de 23ºC en la oscuridad. Se recogen los cotiledones y se cortan en piezas las cuales se utilizan como material de explante. Así, se cortan 6 cotiledones de 3 plántulas y se incuban en 15 ml de medio líquido A (véase Tabla 1) suplementado con
4 mg/l 2,4-D y 0,5,mg/l de cinetina en un agitador giratorio a 100 rpm a 23ºC en la oscuridad. Después de 14 días, se agregan 35 ml de medio A fresco (véase Tabla 1) que incluye hormonas como se describe anteriormente. El cultivo se subcultiva cada 14 días diluyendo dos veces en medio A fresco (véase Tabla 1), suplementado con hormonas como anteriormente. Aproximadamente a las 4 semanas después del cultivo inicial del material de explante, se observan las PEMs. Las PEMs se multiplican por subcultivo adicional como se describe anteriormente.

TABLA 1 Composición del medio A

Macroelementos
	g/l
NH_{4}NO_{3}	1,20
(NH_{4})_{2}SO_{4}	0,66
KH_{2}PO_{4}	0,55
KNO_{3}	1,01
MgCl_{2}.6H_{2}0	0,30
CaCl_{2}	0,22
Acido Cítrico	0,5
Sacarosa	20
Microelementos	2 ml de solución madre/l
Vitaminas Gamborg B5 (1mg/l)	1ml de solución madre/l
pH ajustado a 5,8 utilizando KOH (1 M).
Microelementos (Solución madre)
	g/l
FeSO_{4}.7H_{2}O	6,9
CuSO_{4}.5H_{2}O	0,65
CoCl_{2}.6H_{2}O	0,12
MnCl_{2}.4H_{2}O	2,97
NaMoO_{4}.2H_{2}O	0,24
KI	0,041
HBO_{3}	1,5
ZnSO_{4}.7H_{2}O	4,3
NiSO_{4}.6H_{2}O	0,39
Acido Cítrico	2
pH = 2,3
g24
Vitaminas Gamborg B5 (Duchefa); solución madre suplementada con:
myo-Inositol	100 g/l
Acido nicotínico	1 g/l
Clorhidrato de tiamina	1 g/l

Ejemplo 5 Inicio de cultivos en suspensión de células embriogénicas de pepino y embriones somáticos así obtenidos

Semillas de Cyclamen, variedad "Pandorex" (Sluis y Groot) se esterilizan en la superficie con una solución de etanol al 70% (durante 2 minutos) y una solución de hipoclorito de sodio al 1% (durante 45 minutos), después se lavan cuidadosamente con agua estéril (tres veces). Las semillas de pepino se hacen germinar en papel humedecido durante 2 días a 23ºC. Las radículas brotadas de las semillas se utilizan como material de explante. Se cultivan 15 radículas en 10 ml de medio MS líquido básico más vitaminas (suministrado comercialmente por Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Países Bajos) suplementado con sacarosa a 20 g/l, 2 mg/l de 2,4-D y 1 mg/l de cinetina en un agitador giratorio a 100 rpm en la oscuridad, a una temperatura de 23ºC. El medio de cultivo se controla para determinar la concentración de auxina utilizando técnicas HPLC conocidas. Después de que la concentración de auxina disminuye a
< 0,1 mg/l, después de aproximadamente 5 días, el cultivo se diluye cinco veces hasta 50 ml de medio MS líquido básico más vitaminas (suministrado comercialmente por Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Países Bajos) suplementado con sacarosa a 20 g/l, 2 mg/l de 2,4-D y 1 mg/l de cinetina. Los subcultivos se subcultivan cada quince días diluyendo el cultivo dos veces con medio MS líquido básico más vitaminas (suministrado comercialmente por Duchefa
Biochemie BV, Haarlem, Países Bajos) suplementado con sacarosa a 20 g/l, 2 mg/l de 2,4-D y 1 mg/l de cinetina. Ocho semanas después aparecen las masas pro-embriogénicas.

Los subcultivos de PEM después se subcultivan de manera adicional inoculando 0,4 ml de volumen celular empacado en 50 ml cada dos semanas en medio A (de la Tabla 1) suplementado con 10 mg/l de 2,4-D, y 0,5 mg/l de cinetina. El tiempo de duplicación de la línea de células de pepino es de aproximadamente 2,7 días, determinado utilizando la fórmula de Schlegel (supra). Se seleccionan las PEMs mediante tamizado del cultivo a través de mallas de nylon de tamaños de poro de 150 \mum y 100 \mum, respectivamente, para PEMs entre 100-150 \mum de tamaño. La fracción de 100-150 \mum produce el número de más grande de embriones somáticos individuales por PCV del cultivo de PEM. Las PEMs de esta línea celular son diploides o tetraploides. La relación entre las células diploides y tetraploides permanece constante en el tiempo, durante dos años en el medio A líquido suplementado con 10 mg/l de 2,4-D, y 0,5 mg/l de cinetina, medido por el método de De Laat A.A.A. et al supra. Las PEMs producen plantas diploides así como tetraploides. La relación medida de diploidía: tetraploidía se refleja en las PEMs así como en las plantas.

Las PEMs se desarrollan a embriones somáticos verdaderos mediante cultivo de las PEMs en medio MS exento de auxina y citocina, suplementado con sacarosa a 20 g y ABA 5 \muM.

Ejemplo 6 Manipulación de líneas celulares embriogénicas de pepino para obtener cultivos en suspensión 100% diploides o 100% tetraploides

La suspensión del Ejemplo 5 consiste en PEMs diploides y tetraploides la cual da lugar al desarrollo de embriones con los mismos niveles de ploidía.

Las PEMs individuales de aproximadamente 2 mm de diámetro se extraen de una suspensión celular de 13 semanas de edad iniciada de acuerdo con el método del Ejemplo 5. La medición de las PEMs individuales para determinar el nivel de ploidía al seguir el método de De Laat et al. (1987) Plant Breeding 99, 303-307 muestra que las PEMs son 100% diploides o 100% tetraploides. El cultivo adicional de PEMs individuales durante un período de quince semanas (es decir, subcultivos realizados cada quince días) en medio líquido M5 básico como se describe en el Ejemplo 5 da lugar a líneas celulares que consisten en células 100% diploides o 100% tetraploides, determinado utilizando el método de De Laat et al supra. Las PEMs diploides den lugar a embriones diploides y plantas diploides. Las PEMs tetraploides dan lugar a embriones tetraploides y plantas tetraploides.

Ejemplo 7 Manipulación de líneas celulares embriogénicas de pepino para obtener cultivos en suspensión 100% diploides o 100% tetraploides

Plantas de pepino, variedad "Pandorex" (Sluis y Groot) se hacen crecer bajo condiciones estériles utilizando el método del Ejemplo 3. Se utilizan ovarios de aproximadamente 1 cm de tamaño como explantes. La medición del nivel de ploidía siguiendo el método de De Laat et al supra muestra que el explante es completamente diploide. Aproximadamente la mitad de la fruta se corta en pedazos de aproximadamente 0,5 mm de espesor y se cultiva en 10 ml de medio MS líquido básico más vitaminas (suministrado comercialmente por Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Países Bajos) suplementado con 20 g/l de sacarosa, 2 mg/l de 2,4-D y 1 mg/l de cinetina en un agitador giratorio a 100 rpm en la oscuridad, a una temperatura de 23ºC. El medio de cultivo se controla para detectar la concentración de auxina utilizando técnicas HPLC conocidas. Después de que la concentración de auxina disminuye a < 0,1 mg/l, después de aproximadamente 5 días, el cultivo se diluye cinco veces a 50 ml con medio MS líquido básico más vitaminas (suministrado comercialmente por Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Países Bajos) suplementado con 20 g/l de sacarosa, 2 mg/l de 2,4-D y 1 mg/l de cinetina. Los cultivos se subcultivan cada quince días mediante la dilución del cultivo dos veces con medio MS suplementado como anteriormente.

A las 8 semanas después aparece la masa pro-embriogénica. Los cultivos de PEM se subcultivan como se describe en el Ejemplo 5, en el medio A (de la Tabla 1), suplementado con 10 mg/l de 2,4-D y 0,5 mg/l de cinetina. Se inoculan 0,4 ml del volumen celular empacado en 50 ml de medio A suplementado con 10 mg/l de 2,4-D y 0,5 mg/l de cinetina. El tiempo de duplicación de la línea celular de pepino es de aproximadamente 2,7 días en el medio A (Tabla 1) determinado utilizando la fórmula de Schlegel (supra). Se determina el nivel de ploidía de la suspensión de PEM siguiendo el método de De Laat et al supra y se encuentra que es diploide. Se seleccionan las PEMs mediante tamizado del cultivo a través de una malla de nylon para PEM entre 100-150 \mum de tamaño. Se desarrollan las PEMs a embriones somáticos verdaderos mediante el cultivo de las PEMs seleccionadas en medio MS exento de auxina y citocinina suplementado con 20 g/l de sacarosa. Utilizando este método, se producen 200000 embriones en 4 semanas a partir del cultivo de PEM. El nivel de ploidía de 500 embriones somáticos seleccionados de manera aleatoria, es en su totalidad diploide utilizando el método de De Laat et al supra.

Ejemplo 8 Mantenimiento de suspensiones de PEM estables con respecto al nivel de ploidía

Se hacen crecer suspensiones de PEM de pepino en medio A (Tabla 1) suplementado con 10 mg/l de 2,4-D y 0,5 mg/l de cinetina. Durante el subcultivo los macroelementos y microelementos se mantienen en exceso en cada paso del subcultivo respecto a los requerimientos de la PEM, de modo que no se presentan disminuciones de estos elementos durante el intervalo de subcultivo (es decir, 2 semanas). Los niveles de auxina (es decir, 10 mg/l de 2,4-D) se mantienen del mismo modo. Se agregan cinetina (es decir, 0,5 mg/l) al medio al comienzo del subcultivo y se permite que disminuya del medio durante cuatro días. El control de la concentración de auxina durante el tiempo utilizando técnicas HPLC conocidas asegura que el estado de desarrollo de la suspensión se fije en el nivel de PEM. Se mantienen suspensiones de PEM diploides embriogénicas hasta 2 años en medio A (Tabla 1) suplementado con 10 mg/l de 2,4-D, y 0,5 mg/l de cinetina, y mostrando un nivel de ploidía estable. Las suspensiones de PEM tetraploides embriogénicas se mantienen durante 6 meses mostrando un nivel de ploidía estable. Este nivel de ploidía se mantiene hasta que se inicia el desarrollo del embrión.

Ejemplo 9 Inicio de cultivos en suspensión de PEMs embriogénicas de remolacha y embriones somáticos así obtenidos

Semillas de remolacha (Hilleshog AB, Suecia) se esterilizan en la superficie con una solución de etanol al 70% (durante 2 minutos) y una solución de hipoclorito de sodio al 1,5% (durante 45 minutos), después se lavan cuidadosamente con agua estéril (tres veces). Las semillas de remolacha se hacen germinar en papel humedecido durante 7 a 14 días a 23ºC. Las cotiledones de las semillas germinadas se utilizan como material de explante. Se cultivan 6 cotiledones en 10 ml de medio A líquido(Tabla 1) suplementado con 10 mg/l de 2,4-D y 0,5 mg/l de cinetina en un agitador giratorio a 100 rpm en la oscuridad a una temperatura de 23ºC. El cultivo se diluye cinco veces con medio A líquido (Tabla 1) suplementado con 10 mg/l de 2,4-D, y 0,5 mg/l de cinetina en 50 ml después de una o dos semanas. Los cultivos se subcultivan cada quince días por dilución del cultivo dos veces con medio A (Tabla 1) suplementado como anteriormente, o mediante sustitución del medio con medio A fresco suplementado como se describe anteriormente. Después de 4 a 6 semanas aparecen los embriones somáticos en el tejido de explante. Los embriones son separados del explante y cultivados de manera separada. Cuatro semanas después, los embriones cultivados producen PEMs. Los cultivos de PEM se subcultivan de manera adicional mediante reposición con medio A de la Tabla 1 suplementado con 10 mg/l de 2,4-D y 0,5 mg/l de cinetina.

Se recogen las PEMs mediante tamizado de la suspensión de PEM primero en una malla de nylon que tiene un tamaño de poro de 500 \mum, y después en una malla de nylon que tiene un tamaño de poro de 100 \mum. La fracción de PEMs de 100-500 \mum generalmente da lugar a embriones somáticos predominantemente solos. Las PEMs se cultivan en medio A exento de auxina y citocinina, suplementado como anteriormente, y se desarrollan a embriones somáticos verdaderos.

Ejemplo 10 Inicio de cultivos en suspensión de PEMs embriogénicas de pimiento

Semillas de pimiento (variedad Gedeon of Sluis en Groot) se esterilizan en la superficie con una solución de etanol al 70% (durante 2 minutos) y una solución de hipoclorito de sodio al 1,5% (durante 45 minutos), después se lavan cuidadosamente con agua estéril (tres veces). Las semillas de pimiento se hacen germinar en papel humedecido durante 7 a 14 días a 23ºC. Las cotiledones de las semillas germinadas se utilizan como material de explante. Se cultivan 6 cotiledones en 10 ml de medio A líquido (Tabla 1) suplementado con 10 mg/l de 2,4-D en un agitador giratorio a 100 rpm en la oscuridad a una temperatura de 23ºC. El cultivo se diluye cinco veces hasta 50 ml después de 2 semanas. Los cultivos se subcultivan cada quince días diluyendo el cultivo dos veces como se describe anteriormente o sustituyendo el medio con medio A líquido fresco (Tabla 1) suplementado con 10 mg/l de 2,4-D. Después de 2 a 4 semanas los embriones aparecen en los bordes cortados del explante. Los embriones son tomados explante y retirados del cultivo y subcultivados en medio A líquido (Tabla 1) suplementado con 4 mg/l de 2,4-D y 0,5 mg/l de Zeatin. Cuatro semanas después, aparecen las masas pro-embriogénicas. Las PEMs se multiplican por subcultivo adicional como se describe anteriormente. Se recogen las PEMs mediante tamizado de la suspensión como se describe en el Ejemplo 5. La fracción de 100-500 \mum da lugar a embriones somáticos predominantemente solos. Las PEMs se cultivan en medio A exento de auxina y citocinina (Tabla 1).

Ejemplo 11 Inicio de cultivos en suspensión de PEMs embriogénicas de Viola y embriones somáticos así obtenidos

Semillas de Viola (variedad Delta violeta de Sluis en Groot) se esterilizan en la superficie con una solución de etanol al 70% (durante 2 minutos) y una solución de hipoclorito de sodio al 1,5% (durante 30 minutos), después se lavan cuidadosamente con agua estéril (tres veces). Las semillas de viola se hacen germinar en papel humedecido durante 7 a 14 días a 23ºC. Las cotiledones de las semillas germinadas se utilizan como material de explante. Se cultivan 6 cotiledones en 10 ml de medio A líquido (Tabla 1) suplementado con 4 mg/l de 2,4-D y 0,1 mg/l de cinetina en un agitador giratorio a 100 rpm en la oscuridad a una temperatura de 23ºC. El cultivo se diluye cinco veces con medio A líquido (Tabla 1) suplementado con 4 mg/l de 2,4-D, y 0,1 mg/l de cinetina hasta 50 ml después de dos semanas. Los cultivos se subcultivan cada quince días diluyendo el cultivo dos veces o sustituyendo el medio con medio A líquido fresco (Tabla 1) suplementado con 4 mg/l de 2,4-D y 0,1 mg/l de cinetina. Después de 8 a 10 semanas, aparecen las masas pro-embriogénicas. Las PEMs se multiplican mediante subcultivo adicional como se describe anteriormente. Las PEMs se recogen por tamizado de la suspensión como se describe en el Ejemplo 5, excepto que los tamaños de poro de la malla de nylon utilizada son de 50 \mum y de 250 \mum. Las PEMs se cultivan en medio A exento de auxina y citocinina (Tabla 1) suplementado como anteriormente y se desarrollan a embriones somáticos individuales.

Ejemplo 12 Inicio de cultivos en suspensión de PEMs embriogénicas de Pelargonio

Semillas de pelargonio (variedad Pulsar rojo de Sluis en Groot) se esterilizan en la superficie con una solución de etanol al 70% (durante 2 minutos) y una solución de hipoclorito de sodio al 1,5% (durante 30 minutos), después se lavan cuidadosamente con agua estéril (tres veces). Las semillas de pelargonio se hacen germinar en papel humedecido durante 7 a 14 días a 23ºC. Los cotiledones de las semillas germinadas se utilizan como material de explante. Se cultivan 6 cotiledones en 10 ml de medio A líquido (Tabla 1) suplementado con 4 mg/l de 2,4-D y 0,1 mg/l de cinetina en un agitador giratorio a 100 rpm en la oscuridad a una temperatura de 23ºC. El cultivo se diluye cinco veces con medio A líquido (Tabla 1) suplementado con 4 mg/l de 2,4-D y 0,1 mg/l de cinetina hasta 50 ml después de una semana. Los cultivos se subcultivan cada quince días diluyendo el cultivo dos veces con medio A líquido (Tabla 1) suplementado con 4 mg/l de 2,4-D y 0,1 mg/l de cinetina o sustituyendo el medio con medio A fresco suplementado como se describe anteriormente.

Después de 4 a 6 semanas aparecen las masas pro-embriogénicas. Las PEMs se multiplican por subcultivo adicional como se describe anteriormente. Las PEMs se recolectan por tamizado de la suspensión como se describe en el Ejemplo 5, excepto que el tamaño de poro de la malla de nylon utilizada es de 250 \mum y de 50 \mum. La fracción de PEMs de
50-250 \mum da lugar a embriones somáticos predominantemente solos. Las PEMs se cultivan en medio A (Tabla 1) exento de auxina y citocinina, y se desarrollan a embriones somáticos individuales.

Ejemplo 13 Multiplicación de la biomasa de PEM en biorreactores

Se recogen 4 x 8 ml de PCV de los cultivos en suspensión de PEM de pepino subcultivados como se describe en el Ejemplo 5 y se inoculan 4 biorreactores (Applikon Dependable Instruments B.V.) constituidos de dos biorreactores convencionales de 2 l a los que se les ha colocado impulsores, y dos biorreactores a los que se les ha colocado vibromezcladores suministrados comercialmente por Chemap AG, conteniendo cada uno 1 l de medio A (Tabla 1) suplementado con 10 mg/l de 2,4-D, y 0,5 mg/l de cinetina. Se rocía aire dentro de los reactores con vibromezclador por vía un dispositivo de rociado poroso de 15 \mum localizado en el extremo del eje del vibrador colocado hacia el fondo de la cámara del reactor. La concentración de oxígeno disuelto en uno de los reactores del vibromezclador se determina en 40%, y en el otro en 97% siguiendo técnicas convencionales conocidas. Los vibromezcladores colocados verticalmente se hacen funcionar a una frecuencia de 50 Hz y una amplitud máxima de \pm 6 mm. Los vibromezcladores se colocan de modo que el movimiento vibratorio sea en el plano vertical y el movimiento horizontal se mantenga en un mínimo. Los discos de agitación se ajustan en el extremo del eje del vibrador de modo que el fluido se dirige en un circuito de corriente que extrae la suspensión celular desde la periferia del recipiente del reactor hacia la base y después hacia arriba.

Se rocía aire dentro de los biorreactores convencionales en el fondo del biorreactor por vía de un tubo de rociado equipado con un rociador poroso de 15 \mum. Se determina la concentración de oxígeno disuelto como anteriormente a concentraciones de 40% y 97%, respectivamente. La velocidad de agitación del impulsor se mantiene en 150 rpm \pm 50 rpm aproximadamente.

Seis días después de la inoculación, se determina el tiempo de duplicación, se tamizan las PEMs a partir de la suspensión de PEM y se determinan las PEMs/ml de PCV como se describe en el Ejemplo 5.

El uso de vibromezcladores da lugar a números mayores de PEMs por unidad de volumen (Tabla 2; Figura 1).

TABLA 2

Aparato	Tiempo de Duplicación (días)	PEMs/ml de PCV
Impulsor	2,3	200
(40% DO_{2})^{(1)}
Impulsor	2,7	620
(97% DO_{2})
Vibromezclador	2,8	2284
(40% DO_{2})
Vibromezclador	3,3	3710
(97% DO_{2})
(1) DO_{2} = Oxígeno disuelto

Ejemplo 14 Multiplicación de biomasa de PEM en biorreactores con vibromezclador

Se recogen 2 x 8 ml de PCV a partir de los cultivos en suspensión de PEM de pepino subcultivados como se describe en el Ejemplo 3 y se inoculan en 2 biorreactores con vibromezclador (Applikon Dependable Instruments B.V.) que comprenden dos biorreactores de 2 l a los que se les ha colocado vibromezcladores suministrados comercialmente por Chemap AG. Un biorreactor contiene 1 l de medio A (Tabla 1) suplementado con 10 mg/l de 2,4-D, y 0,5 mg/l de cinetina, el otro también contiene 1 l de medio A suplementado como anteriormente con la excepción de que la concentración de sacarosa es de 55 g/l. Se rocía aire dentro de los reactores con vibromezclador por vía de un dispositivo de rociado poroso de 15 \mum localizado en el extremo del eje del vibrador cerca de la base de la cámara del reactor. Se determina la concentración de oxígeno disuelto a 97% siguiendo técnicas conocidas. Los vibromezcladores se hacen funcionar a una frecuencia de 50 Hz y una amplitud máxima de \pm 6 mm. Los vibromezcladores se colocan de modo que el movimiento vibratorio sea en el plano vertical mientras que el movimiento lateral u horizontal se mantiene en un mínimo. Se colocan discos de agitación en el extremo del eje del vibrador de modo que el fluido fluye en un circuito de corriente que extrae la suspensión celular desde la periferia del recipiente de reacción hacia la base y después hacia arriba.

Seis días después de la inoculación, se determina el tiempo de duplicación, se tamizan las PEMs a partir de la suspensión de PEM y se determinan las PEMs/ml de PCV como en el Ejemplo 5. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 3.

TABLA 3

Aparato	Tiempo de Duplicación (Días)	PEMs/ml de PCV
	(Días)
Vibromezclador	3,3	2284
(97%, 20 g/l de sacarosa)
Vibromezclador	2,9	6000
(97%, 55 g/l de sacarosa)

Ejemplo 15 Comparación de la viabilidad de PEMs en el tiempo en biorreactores con agitadores versus biorreactores con vibromezclador.

Se recogen 3 x 8 ml de PCV a partir de los cultivos de suspensión de PEM de pepino subcultivados como se describe en el Ejemplo 5 y se inoculan en 3 biorreactores (Applikon Dependable Instruments B.V.) constituidos por un biorreactor de 2 l convencional equipado con un impulsor y que contiene 1 l de medio A (Tabla 1), suplementado con 10 mg/l de 2,4-D, y 0,5 mg/l de cinetina, y por dos biorreactores equipados con vibromezcladores suministrados comercialmente por Chemap AG, conteniendo uno de ellos 1 l de medio A suplementado como anteriormente y conteniendo el otro también 1 l de medio A suplementado como anteriormente con la excepción de que la concentración de sacarosa es a 55 g/l.

Se rocía aire dentro del reactor con vibromezclador por vía de un dispositivo de rociado poroso de 15 \mum localizado en el extremo del eje del vibrador hacia el fondo de la cámara del reactor. La concentración de oxígeno disuelto en el reactor con vibromezclador se determina en 97% siguiendo técnicas conocidas. El vibromezclador se opera a una frecuencia de 50 Hz y una amplitud máxima de \pm 6 mm. El vibromezclador se coloca de modo que el movimiento vibratorio sea en el plano vertical y el movimiento vibratorio horizontal se mantenga en un mínimo. El disco de agitación se ajusta en el extremo del eje del vibrador de modo que el fluido fluye en un circuito de corriente que extrae la suspensión celular desde la periferia del recipiente del reactor hacia la base y después hacia arriba.

Se rocía aire al interior del biorreactor convencional, en el fondo del biorreactor, por vía de un tubo de rociado equipado con un rociador poroso de 15 \mum. Se determina concentración de oxígeno disuelto como anteriormente en una concentración de 97%. La velocidad de agitación del impulsor se mantiene en aproximadamente 150 rpm \pm 50 rpm.

Se determinan las PEMs/ml de PCV al inicio del cultivo y se determina el tiempo de duplicación a los 6 y 14 días como se describe en el Ejemplo 5.

Los resultados muestran que el número de PEMs en un biorreactor agitado disminuye de manera significativa durante el tiempo, mientras que el número de PEMs en un vibromezclador permanece casi constante en el tiempo a una concentración de sacarosa de 20 g/l. Se muestra que las cantidades de PEMs se incrementan hasta tres veces en los siguientes 6 días a una concentración de sacarosa de 55 g/l (Tabla 4).

TABLA 4

Aparato	PEMs/ml de PCV
	Día 0	Día 6	Día 14
Impulsor	2300	800	40
(97%, 20 g/l de sacarosa)
Vibromezclador	2300	2300	2280
(97%, 20 g/l de sacarosa)
Vibromezclador	2300	6000	6000
(97%, 55 g/l de sacarosa)

Ejemplo 16 Desarrollo de PEMs a embriones somáticos en fase de torpedo en biorreactores

Se recogen 2 x 100000 PEMs tamizados de los cultivos en suspensión de PEM de pepino subcultivados como se describe en el Ejemplo 15 (55 g/l de sacarosa en vb/97% DO_{2}) y se inoculan en 2 biorreactores (Applikon Dependable Instruments B.V.) constituidos por un biorreactor de 2 l convencional al que se le ha colocado un impulsor, y por un biorreactor al que se le ha colocado un vibromezclador suministrado comercialmente por Chemap AG, conteniendo cada uno 1 l de medio MS que contiene 20 g/l de sacarosa, y ABA a una concentración de 5,0 \muM. Se rocía oxígeno dentro del reactor con vibromezclador por vía de un dispositivo de rociado poroso de 15 \mum localizado en el extremo del eje del vibrador colocado cerca de la base de la cámara del reactor. La concentración de oxígeno en el reactor vibromezclador se determina en 97% siguiendo técnicas conocidas. El vibromezclador se opera a una frecuencia de 50 Hz y una amplitud mínima de \pm 6 mm. El vibromezclador se coloca de modo que el movimiento de vibración sea en el plano vertical y el movimiento horizontal se mantenga en un mínimo. El disco de agitación se ajusta en un extremo del eje del vibrador de modo que el fluido fluye en un circuito de corriente que extrae las PEMs de la periferia del recipiente de reacción hacia la base y después hacia arriba.

Se rocía oxígeno dentro del biorreactor convencional, en el fondo del biorreactor, por vía de un tubo de rociado colocado con un rociador poroso de 15 \mum. Se determina concentración de oxígeno disuelto como anteriormente en una concentración inicial de 97% y se permite que disminuya durante 7 días a 30% \pm 5%. En el día 8, la concentración de oxígeno disuelto se vuelve a establecer en 97% y se mantiene a ese nivel. La velocidad de agitación del impulsor se mantiene en aproximadamente 190 rpm \pm 15 rpm.

El biorreactor convencional tiene una eficiencia en el desarrollo de embriones somáticos de la fase torpedo desde las PEMs hasta el crecimiento completo, comprendida entre 10-15%. El biorreactor con vibromezclador tiene una eficiencia en el desarrollo de embriones somáticos de la fase torpedo desde las PEMs hasta el crecimiento completo, mayor del 20%. Los embriones somáticos en la fase torpedo utilizables son aquellos que dan lugar a plantas con apariencia normal.

Ejemplo 17 Estabilidad morfológica de plantas de cyclamen derivadas de embriones somáticos

Los embriones somáticos de cyclamen derivados del híbrido F1 del Ejemplo 2 se convierten en plántulas al colocar los embriones somáticos en tierra para macetas. Después de la formación de la primera hoja, las plántulas son transferidas a un invernadero y se dejan crecer hasta su madurez. Las plantas se hacen crecer a la siguiente fase de floración. El examen morfológico de las plantas en florecimiento no revela anormalidades en las plantas. No se observa variación somaclonal debida a diferencias genéticas en plantas.

Ejemplo 18 Variación somaclonal genética en plantas de pepino derivadas de embriones somáticos

Los embriones somáticos del Ejemplo 6 derivados de las plantas híbridas F1 se convierten a plantas en tacos Sorbarod (Baumgartner papier, Suiza) y se hacen crecer a plantas que tienen fruto. Se determina el nivel de ploidía mediante el método de De Laat A.A. et al supra, en 80 plantas. Todas las plantas tienen el mismo nivel de ploidía y no se observan diferencias debidas a variación somaclonal genética.

Ejemplo 19 Conversión de embriones somáticos de pepino a plantas.

Las PEMs de pepino se multiplican en biorreactores equipados con vibromezcladores a bajas intensidades de luz, se tamizan (100-150\mum) y se inoculan dentro de matraces Erlenmeyer a una densidad de 5000 PEMs/50 ml de medio MS suplementado con 20 g/l de sacarosa y 5\muM de ABA. Las PEMs se dividen en dos (2) lotes los cuales se desarrollan de manera adicional en la luz y en la oscuridad hasta embriones somáticos.

Los embriones somáticos de ambos lotes se convierten en plantas a la luz. Los resultados muestran que la eficiencia de conversión para embriones somáticos en plantas para embriones somáticos derivados de PEMs cultivadas en la oscuridad es mayor en comparación con los embriones somáticos desarrollados en la luz (Tabla 5).

TABLA 5

régimen de condición de luz	conversión total desde la fase
	torpedo a la planta [%]
luz	28,6
oscuridad	62,7

Ejemplo 20 Tamaño del agregado de PEM en relación a la formación de torpedos individuales adecuados para la conversión a plantas

Una suspensión de PEM de 9 días de edad obtenida como se describe en el Ejemplo 5 anterior, utilizando medio suplementado con 10 mg/l de 2,4-D y 0,5 mg/l de cinetina (a una concentración de PEM de 50 ml de PCV/1), se tamiza en mallas de nylon en tres momentos separados para obtener tres fracciones de PEM de tamaño diferente: 100-150 \mum, 150-200 \mum y 200-250 \mum. El desarrollo de embriones se realiza a concentraciones de PEM iniciales de aproximadamente 25-50 PEMs/ml en medio MS que contiene ABA 3 \muM. Después de 9 días de desarrollo del cultivo, se determina el número de embriones en la fase torpedo bajo microscopio óptico. El número de torpedos individuales se determina en relación al número de torpedos múltiples. La relación de torpedos/PEM es de 5-15%. La fracción < 100 \mum de tamaño no contiene PEMs. Los resultados se muestran en la Tabla 6.

TABLA 6

Tamaño de la fracción	% de torpedos individuales
tamizada (\mum)	como un porcentaje del total
100-150	85
150-200	20
200-250	5

Los embriones individuales se separan de la fracción de tamaño de 100-150 \mum de manera manual, y se convierten a plantas individuales.

Claims (18)

1. Un método para obtener embriones somáticos en cultivo en suspensión, caracterizado porque comprende:

i) Cultivar material de explante diferente de callo y distinto de Daucus en contacto con un medio de cultivo de tejido vegetal líquido que comprende una cantidad efectiva de una auxina o mezcla de auxinas suficiente para promover la inducción de la formación de masa pro-embriogénica (PEM);

ii) Multiplicar el número de PEMs obtenidas en i) mediante cultivo de dichas PEMs en contacto con un medio líquido adecuado que contiene auxina;

iii) Recoger las PEMs obtenidas en ii) y ponerlas en contacto con un medio líquido sustancialmente exento de auxina, para inducir la formación de embriones somáticos; y

iv) Recoger embriones somáticos derivados de los embriones inducidos de la etapa iii), en donde dichos embriones somáticos tienen el mismo nivel de ploidía que el material de explante diferente de callo en cultivo en suspensión.

2. Un método según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende utilizar en el paso iii), PEMs de una fracción de tamaño seleccionada rica en PEMs viable.

3. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el medio líquido comprende además una fuente de energía de carbohidrato en una concentración de entre 15 g/l y 90 g/l aproximadamente.

4. Un método según la reivindicación 3, caracterizado porque la concentración de fuente de energía de carbohidrato se encuentra entre 20 g/l y 60 g/l aproximadamente.

5. Un método según la reivindicación 3 o 4, caracterizado porque la fuente de energía de carbohidratos se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, glucosa y rafinosa.

6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la suspensión de PEM que contiene auxina se hace vibrar en un vibromezclador.

7. Un método según la reivindicación 6, caracterizado porque el vibromezclador se hace vibrar en un plano sustancialmente vertical.

8. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el material de explante diferente de callo se deriva de protoplastos, tallos, hojas, pétalos, sección del hipocótilo, meristema apical, embrión zigótico per se, tubérculo, haz vascular, periciclo, ovarios o filamentos de la antera.

9. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el material de explante diferente de callo es dicotiledóneo.

10. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el material de explante diferente de callo es monocotiledóneo.

11. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el nivel de ploidía es diploide.

12. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el nivel de ploidía es tetraploide.

13. Uso de una PEM como la producida en la reivindicación 1 para establecer cultivos en suspensión de embriones somáticos que comprenden embriones somáticos que son uniformes con respecto al nivel de ploidía colocando las PEMs en un medio de cultivo de tejido vegetal sustancialmente libre de auxina.

14. Uso según la reivindicación 13, caracterizado porque el cultivo en suspensión comprende embriones somáticos diploides.

15. Uso según la reivindicación 13, caracterizado porque el cultivo en suspensión comprende embriones somáticos tetraploides.

16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque el cultivo en suspensión comprende embriones somáticos que se derivan de PEMs generadas a partir de material de explante dicotiledóneo o monocotiledóneo, diferente de callo.

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17. Un método para la producción de una planta, caracterizado porque comprende hacer crecer un embrión somático, como el obtenido por un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, a una planta que es idéntica, en términos genéticos, al material de explante celular progenitor del cual se deriva.

18. Un método según la reivindicación 17, caracterizado porque los embriones somáticos se seleccionan del grupo que consiste de Cyclamens, Cucurbits, Lycopersicons, Alliums, Begonias, Betas, Primulas, Brassicas, Capsicums, Cichoriums, Gerberas, Impatients, Lactucas, Oryzas, Pelargoniums, Petunias, Violas, y Zeas.