ES2143996T5 - Antigenos peptidicos del hcv y procedimiento para la determinacion del hcv. - Google Patents

Antigenos peptidicos del hcv y procedimiento para la determinacion del hcv. Download PDF

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Abstract

SE DESCRIBEN NUEVOS ANTIGENOS DE PEPTIDOS HCV. ESTOS ANTIGENOS DE PEPTIDOS SON APROPIADOS PARA DETERMINAR ANTICUERPOS HCV COMO INMUNOGENOS PARA LA PRODUCCION DE ANTICUERPOS FRENTE A HCV Y COMO VACUNA PARA PRODUCIR VACUNAS FRENTE A HCV.

Description

Antígenos peptídicos del HCV y procedimiento para la determinación del HCV.
El invento concierne a nuevos antígenos peptídicos del HCV, a un procedimiento para la preparación de estos antígenos peptídicos, así como a un procedimiento para la determinación del HCV mediando utilización de los antígenos peptídicos.
La aparición de los virus de la hepatitis en ausencia de marcadores serológicos de los agentes hepatotropos hasta ahora conocidos (p. ej. virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis -, virus de la citomegalia y virus de Epstein-Barr) se designa como hepatitis no-A, no-B (hepatitis NANB). La hepatitis NANB se clasifica a su vez en hepatitis no-A no-B transmitida por vía parenteral y esporádicamente y en hepatitis no-A, no-B transmitida por vía enteral. Para la hepatitis NANB transmitida por vía parenteral y esporádicamente se aisló hace poco tiempo el agente causante, el virus de la hepatitis C (HCV) (Choo Q.-L. y colaboradores, Science 244 (1989) 359-362 y Kuo, G. y colaboradores, Science 244 (1989) 362-364).
El HCV es en todo el mundo una importante causa de la hepatitis NANB y es transmitido por sangre o productos sanguíneos en estado contaminado, transfusiones de sangre o mediante un contacto personal íntimo.
La secuencia de aminoácidos de la proteína vírica del HCV se conoce por los documentos de solicitudes de patente europea EP-A-0.318.216, EP-A-0.363.025, EP-A-388.232 y EP-A-0.396.748. El genoma del HCV tiene una longitud de 10.862 nt (nucleótidos). Las proteínas que resultan por traducción poseen una longitud total de aproximadamente 3.000 aminoácidos. Las proteínas se pueden clasificar en proteínas estructurales (proteínas de envoltura y de núcleo) y proteínas no estructurales (NS1-NS5).
La determinación de un HCV se efectúa convenientemente detectando mediante ensayos inmunológicos anticuerpos contra el HCV en líquidos corporales. Para tales ensayos inmunológicos se necesitan por lo tanto partícipes en la fijación para anticuerpos anti-HCV.
Así, es conocido utilizar en ensayos inmunológicos por ejemplo la proteína del HCV C 100-3 no estructural como partícipe en la fijación (ensayos de ABBOTT LABORATORIES, EE.UU. y ORTHO DIAGNOSTICS SYSTEMS INC., EE.UU.; Science 244 (1989) 359-364; Van der Poel C. L. y colaboradores Lancet 337 (1991) 317; Alter H.J. J. Gastroent. Hepatol. (suplemento) 1990, 78).
Una desventaja de este ensayo consiste en que como antígeno se utiliza una proteína recombinante. Las proteínas, a causa de su propensión a desnaturalizarse y de la solubilidad y función que se han disminuido con ello en ensayos para diagnósticos, son difíciles de manipular. También la magnitud de la señal de medición es menor, por causa de la baja densidad de epítopos en una proteína, que en un ensayo, en el que se utiliza un antígeno peptídico de cadena corta como partícipe en la fijación del anticuerpo. Además, en el caso de utilizarse proteínas o péptidos de cadena larga como antígenos, pueden aparecer en un ensayo inmunológico en grado incrementado reactividades cruzadas y fijaciones inespecíficas de anticuerpos. Las reacciones con proteínas son además de ello con frecuencia controladas por difusión, lo cual se opone a los cortos tiempos deseados para ensayos inmunológicos. Además, la preparación de una proteína que se pueda emplear para el diagnóstico, en cantidad y calidad suficientes, es larga y está vinculada con grandes costos. Los péptidos son fácilmente accesibles por síntesis y constituyen moléculas definidas.
Por consiguiente, es ventajoso utilizar, en un ensayo inmunológico en cuanto a anticuerpos anti-HCV, antígenos peptídicos con una cadena lo más corta que sea posible, que constituyan solamente segmentos de las proteínas totales. Uno de tales procedimientos inmunológicos ha sido descrito por Okamoto (Japan J. Exp. Met. 60 (1990) 223-234). Sin embargo, se ha mostrado que el antígeno peptídico de cadena corta allí descrito (secuencia 9), que procede de la región de núcleo, no es suficientemente sensible para el HCV.
Otros antígenos peptídicos del HCV están descritos en la solicitud de patente alemana P 42 09 215.9.
Es misión del presente invento poner a disposición antígenos peptídicos, que sean específicos para anticuerpos anti-HCV y resulten apropiados para ensayos inmunológicos en cuanto a anticuerpos anti-HCV.
El problema planteado por esta misión se resuelve mediante los antígenos peptídicos con las siguientes secuencias
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peptídicos con las siguientes secuencias
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o antígenos peptídicos que constituyen secuencias parciales de estos antígenos peptídicos, con una longitud de por lo menos cuatro, preferiblemente de por lo menos siete aminoácidos.
El epítopo existente en la secuencia X no pudo ser encontrado sin necesidad de más medidas. Para ello, era necesario poner en contacto correspondientes péptidos en estado de solución con anticuerpos contra el HCV y a continuación detectar los complejos inmunitarios formados. Esto se realizaba por biotinilación de los péptidos e inmovilización de los complejos junto a una fase sólida revestida con estreptavidina. Los péptidos descubiertos son también especialmente apropiados para los inmunoanálisis que utilizan una complejación en solución. El epítopo se halla inmediatamente en el extremo terminal de C detrás del péptido descrito como SEQ. ID. NO. 16 en el documento de solicitud de patente mundial WO 93/01210 y se encuentra en el extremo terminal de N en la región de núcleo.
Apropiadas secuencias parciales están representadas en los protocolos de secuencias.
Secuencias parciales especialmente preferidas son:
a partir de la secuencia 7A1:
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a partir de la secuencia NS5/1:
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a partir de la secuencia X:
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Se prefieren especialmente las secuencias parciales cuya longitud es como máximo de 9 aminoácidos, especialmente las sustancias NS4/3 y NS5/1b. Un antígeno peptídico especialmente preferido es el NS5/1.
A partir de la secuencia X la SEQ. ID. NO. 26 reconoce a todos los sueros investigados, mientras que la SEQ. ID. NO. 25 es el antígeno reactivo (señal más alta).
La realización de una detección de anticuerpos anti-HCV se efectúa de acuerdo con los métodos que resultan habituales para un experto en la materia. Otro objeto del invento es por lo tanto un procedimiento para la determinación de anticuerpos anti-HCV, que está caracterizado porque la muestra se incuba con por lo menos un antígeno peptídico tomado entre el grupo de las secuencias SEQ. ID. NO. 1-11, 20 y 22-28 o antígenos peptídicos, que constituyen secuencias parciales de estos antígenos peptídicos con una longitud de aminoácidos de por lo menos cuatro, preferiblemente de por lo menos 7, aminoácidos, y en condiciones que hacen posible la formación de un complejo entre un anticuerpo y un antígeno, se determina la cantidad del anticuerpo anti-HCV que se ha fijado al antígeno peptídico.
En tal caso, los antígenos peptídicos conformes al invento se emplean preferiblemente en un margen de concentraciones de 1-1.000 ng/ml, de un modo especialmente preferido de 20-250 ng/ml.
Conforme al invento se utiliza preferiblemente una combinación de por lo menos dos de los antígenos peptídicos conformes al invento o de las secuencias parciales de ellos. Es especialmente preferido combinar por lo menos un antígeno peptídico con las secuencias SEQ. ID. NO. 1-11, 20 y 22-28 o secuencias parciales de ellos con por lo menos un antígeno peptídico tomado entre el grupo de las secuencias SEQ. ID. NO. 12-19 o secuencias parciales de ellos.
Las secuencias SEQ. ID. NO: 12-19 y su preparación se describen en la solicitud de patente alemana P 42 09 215.9, cuyo contenido es objeto de la divulgación de la presente solicitud de patente.
La combinación de los antígenos se puede efectuar por ejemplo utilizando varios antígenos peptídicos individuales, o uniendo entre sí antígenos peptídicos por medio de enlaces covalentes, convenientemente a través de un puente de aminoácidos, que se diferencia de las secuencias de aminoácidos presentes de modo natural en proteínas del HCV, o de un enlazador peptídico.
Son especialmente preferidas las siguientes combinaciones de los antígenos:
Secuencia 4a, 6e, 6b, 2e, 2g, NS4/3, NS5/1 (combinación 1)
Secuencia 4a, 6e, 6b, 2e, 2g, NS4/3 (combinación 2)
Secuencia 4a, 2g, 2e, 6c, NS4/3, NS5/1 (combinación 3)
Secuencia 4a, 6e, 6b, 2e, 2g, NS4/3a, NSA/3b, NS5/1b (combinación 4)
Secuencia 4a, 6e, 6b, 2e, 2g, NS4/3, NS5/1, 9c (combinación 5)
Secuencia 4a, 2g, NS4/3, 2e, 6c, NS5/1, 9c (combinación 6)
Secuencia 4a, 6, 2e, 2g, 7A1, NS5/1 (combinación 7)
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Las siguientes secuencias se describen en la solicitud alemana P 42 09 215.9:
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En estas combinaciones, los antígenos se utilizan preferiblemente en las siguientes cantidades:
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Preferiblemente, los antígenos se emplean individualmente, sin enlace covalente unos con otros, o enlazados covalentemente unos con otros mediando utilización de un enlazador peptídico.
Por causa de la sensibilidad aumentada que es necesaria en el caso del parámetro de infección por HCV, se utilizan preferiblemente para la detección inmunoanálisis heterogéneos. Estos ensayos heterogéneos permiten etapas de lavado que reducen considerablemente el fondo para la señal de medición, con lo cual se aumenta la sensibilidad.
Por ejemplo, la determinación puede efectuarse a través de un inmunoanálisis radiológico, un inmunoanálisis enzimático o mediante inmunofluorescencia. Usualmente se inmoviliza para ello el antígeno peptídico. La muestra, que debe ser investigada en cuanto a anticuerpos anti-HCV, se añade y el anticuerpo fijado al antígeno se determina a través de un anticuerpo anti-inmunoglobulina humana marcado. La inmovilización del antígeno peptídico conforme al invento puede efectuarse por adsorción, por enlaces covalentes o a través de un par de fijación biológica tal como el de biotina y estreptavidina, el de un anticuerpo y un antígeno, o el de un azúcar y una lectina. En tal caso el antígeno peptídico se enlaza covalentemente a estos partícipes.
Los antígenos peptídicos conformes al invento pueden ser inmovilizados para inmunoanálisis preferiblemente de acuerdo con métodos que resultan corrientes para un experto en la materia, por ejemplo esferas (beads), tubitos de material sintético o placas de microtitulación (preferiblemente de poliestireno o copolímeros de poliestireno). Esto se efectúa preferiblemente adsorbiendo el antígeno peptídico inespecíficamente junto a la superficie o fijándolo covalentemente a superficies funcionalizadas o activadas. La adsorción inespecífica se puede mejorar uniendo el antígeno peptídico con una proteína para formar un conjugado y utilizando éste conjugado para la adsorción (compárese p. ej. el documento de solicitud de patente europea EP-A-0.269.092). La fijación puede efectuarse también a través de un anticuerpo inmovilizado. Para ello, el antígeno peptídico debería ser modificado de manera tal que el epítopo no sea bloqueado mediante la fijación del anticuerpo, p. ej. por formación de un conjugado de un péptido y una proteína.
La conjugación del antígeno peptídico con los partícipes en la fijación se efectúa preferiblemente a través de un espaciador. Este espaciador contiene convenientemente 10-50, preferiblemente 10-30 átomos, y es también preferiblemente una molécula esencialmente lineal. Ejemplos de éste son espaciadores a base de cadenas de alquilo, poliéter o poliamida. En una forma de realización especialmente preferida, un antígeno peptídico con una longitud de 4-9 aminoácidos es fijado al soporte a través de un espaciador lineal de 10-30 átomos. Caso de que tenga que utilizarse un espaciador a base de aminoácidos, éste consta convenientemente de aminoácidos que no corresponden a la sucesión de secuencia en el entorno inmediato del antígeno peptídico en el gen del HCV.
En una forma preferida de realización, el antígeno peptídico conforme al invento es fijado covalente a biotina, efectuándose la inmovilización a través de una fase sólida de avidina/estreptavidina.
Son apropiados asimismo los procedimientos de determinación en los que la detección no se efectúa a través de un anticuerpo marcado sino a través de otro antígeno peptídico marcado adicional, que presenta una de las secuencias mostradas en SEQ. ID. NO. 1-20 ó 22-28 o una secuencia parcial de éstas.
La preparación de los antígenos peptídicos conformes al invento es posible según los métodos para la síntesis de péptidos que resultan corrientes para un experto en la materia. Otro objeto del invento es por lo tanto un procedimiento para la preparación del antígeno peptídico conforme al invento, el cual consiste en que el aminoácido que forma el extremo terminal de C se fija a un soporte, el antígeno peptídico se constituye escalonadamente a partir del extremo terminal de C y a continuación se separa del soporte.
En particular, para ello un aminoácido se une por ejemplo a través de su grupo carboxi a un polímero insoluble, fácilmente filtrable, y luego la cadena peptídica se constituye escalonadamente a partir del extremo terminal de C. Para esta finalidad, un aminoácido protegido en N se lleva a reacción con una agrupación reactiva de la resina artificial. Desde el aminoácido anclado covalentemente a la partícula de soporte se elimina el grupo protector de N y el polímero amino-acílico resultante se hace reaccionar con el siguiente aminoácido protegido en N. Desde el dipéptido fijado covalentemente a la resina de soporte se elimina el grupo protector de N\alpha y el resultante polímero amino-acílico se hace reaccionar con el siguiente aminoácido protegido en N. Todos los reactivos y productos acompañantes (impurezas) en exceso se eliminan mediante una sencilla filtración. Si la deseada secuencia peptídica se prepara de esta manera, se rompe la fijación covalente entre el aminoácido terminal de C y la agrupación de anclaje del soporte polímero. El soporte insoluble se elimina mediante una sencilla filtración desde el péptido que ahora se encuentra en el estado de solución. El péptido se purifica mediante métodos de cromatografía.
Por ejemplo, los antígenos peptídicos conformes al invento se pueden preparar de acuerdo con Merrifield, JACS 85 (1964) 2.146. Una biotinilación eventualmente necesaria se puede efectuar por ejemplo de acuerdo con PNAS USA 80 (1983) 4.045. Un preferido agente de biotinilación para ello es el éster N-hidroxi-succinimídico de ácido biotinil-amino-caproico.
Un procedimiento preferido para la preparación de antígenos peptídicos biotinilados es la introducción del radical de biotina por el extremo terminal de N durante una síntesis en fase sólida del antígeno peptídico.
Este procedimiento se emplea preferiblemente en el caso de que el antígeno peptídico contenga varios grupos amino de \varepsilon-lisina, que no deben de ser biotinilados. Este es el caso por ejemplo cuando se emplea N-\alpha-Fmoc-N-\varepsilon-biotinil-amino-caproil-lisina, N-\alpha-Fmoc-N-\varepsilon-biotinil-lisina o, al realizarse la biotinilación de los aminoácidos terminales de N, biotina, ácido biotinil-amino-caproico o dimetoxi-tritil-biotina con un reactivo de activación tal como por ejemplo diciclohexil-carbodiimida o como un éster activo.
En otra preferida forma de realización, se inmoviliza un anticuerpo para detección que está dirigido por ejemplo contra la parte Fc de la IgG humana. Preferiblemente, se utiliza para ello un anticuerpo monoclonal. El antígeno peptídico se encuentra entonces en el estado de solución. El anticuerpo (analito) que se ha de detectar y también todos los otros anticuerpos del líquido de muestra son fijados por el anticuerpo de pared. El anticuerpo fijado puede fijar entonces al analito, que puede ser detectado con un apropiado sistema de detección, p. ej. competitivamente con un conjugado de un antígeno peptídico y una enzima.
Con los antígenos peptídicos conformes al invento es también posible, mediante los procedimientos de inmunización que son corrientes para un experto en la materia, obtener anticuerpos con los que se puede detectar el virus propiamente dicho en un ensayo inmunológico.
Otro objeto del invento es por lo tanto un procedimiento para la preparación de anticuerpos, que está caracterizado porque se inmuniza a un animal mamífero con un péptido conforme al invento, que está fijado eventualmente a un soporte, y se obtienen los anticuerpos de acuerdo con procedimientos conocidos p. ej. a partir del suero o del bazo.
En una forma de realización preferida, se fusionan linfocitos B de los animales inmunizados, en presencia de agentes transformadores, con una línea celular apropiada, la línea celular, que produce los anticuerpos deseados, se clona y cultiva, y a partir de las células o del material sobrenadante de cultivo se obtienen los anticuerpos monoclonales.
Con este anticuerpo es posible determinar directamente virus del HCV. Otro objeto del invento es por lo tanto un procedimiento para la determinación de virus del HCV, que está caracterizado porque la muestra se incuba con un anticuerpo conforme al invento en condiciones tales que permiten una formación de un complejo de un antígeno y un anticuerpo, y se determina la cantidad del complejo formado de un anticuerpo y un antígeno.
Otro objeto del invento es un procedimiento para la preparación de vacunas mediando utilización de los antígenos peptídicos conformes al invento, así como una vacuna para el tratamiento de infecciones por HCV, que contienen como inmunógeno por lo menos un antígeno peptídico eventualmente fijado a un soporte, con la secuencia mostrada en SEQ. ID. NO. 1-11, 20 y 22-28 o secuencias parciales de éstas, en una dosis farmacológicamente eficaz y en una formulación farmacéuticamente aceptable.
La preparación de estas vacunas se puede llevar a cabo de acuerdo con los métodos conocidos. Sin embargo, preferiblemente, los antígenos peptídicos se liofilizan primeramente y a continuación se suspenden eventualmente mediando adición de sustancias adyuvantes.
La vacunación con la vacuna conforme al invento o con combinaciones de vacunas se puede efectuar mediante los métodos que resultan corrientes para un experto en la materia, por ejemplo por vía intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea e intranasal.
Para la administración intramuscular o subcutánea, la vacuna puede ser suspendida por ejemplo en una solución fisiológica de cloruro de sodio. Para la aplicación por vía intranasal o intraocular, la vacuna se puede utilizar por ejemplo en forma de una fase para proyección o de una solución acuosa. Para administración local, por ejemplo oral, con frecuencia es necesario proteger a los inmunógenos provisionalmente contra la desactivación, por ejemplo contra enzimas proteolíticas en la cavidad bucal o en el estómago. Tal protección transitoria puede efectuarse por ejemplo mediante encapsulación de los inmunógenos. Esta encapsulación puede efectuarse por ejemplo mediante revestimiento con un agente protector (microencapsulación) o, en el caso de embeberse un gran número de inmunógenos conformes al invento, en un soporte protector (macroencapsulación).
El material para encapsulación puede ser semipermeable o en el caso de su incorporación en un cuerpo humano o animal puede ser hecho semipermeable. Usualmente, para la encapsulación se utiliza como soporte una sustancia biológicamente degradable.
Es asimismo objeto del invento un procedimiento inmunológico para la determinación de sueros infecciosos del HCV mediante uno o varios antígenos peptídicos, empleándose un antígeno peptídico procedente del epítopo NS4 terminal de carboxilo del HCV, especialmente en el exterior de C-100-3. Como especialmente reactivo se ha manifestado el péptido con la SEQ. ID. NO. 6. Se designan como sueros infecciosos los sueros en los que es detectable también un ARN del HCV. Esto puede realizarse por ejemplo mediante reacción en cadena de polimerasa. A estos antígenos peptídicos pertenecen especialmente los que contienen una secuencia de aminoácidos, que se diferencia en no más de un aminoácido con respecto de la SEQ. ID. NO. 6, y que están acortados en no más de tres aminoácidos con respecto de la SEQ. ID. NO; 6 o están prolongados en no más de 25 aminoácidos, o son exactamente de la misma longitud.
Los siguientes Ejemplos y protocolos de secuencias explican el invento adicionalmente.
\newpage
En los protocolos de secuencias significan:
\vskip1.000000\baselineskip
18
Ejemplo 1 Síntesis de H-SRRFAQALPVWARPD-OH (NS5/1)
El péptido se preparó mediante síntesis en fase sólida con Fmoc (fluorenil-metoxi-carbonilo). Las reacciones se llevaron a cabo en un sintetizador de péptidos Labortec (Suiza) SP 640. Las reacciones de acoplamiento se llevaron a cabo en relación con el derivado de Fmoc-aminoácido con 2,4 equivalentes de diciclohexil-carbodiimida y 2,2 equivalentes de N-hidroxi-benzotriazol durante 90 minutos. Como medio de reacción pasó a emplearse dimetil-formamida. El grupo Fmoc fue separado mediante piperidina al 20% en DMF en el transcurso de 10 y 20 minutos. Pasaron a emplearse 2,0 equivalentes de los siguientes derivados de aminoácidos: Pro, Arg (con el grupo protector PMC (pentametil-cromano)), Ser (con el grupo protector terc.-butilo), Trp, Asp (con el grupo protector éster terc.-butílico), Phe, Ala, Gln, Leu y Val. Las reacciones de acoplamiento se repitieron con la mitad de los reactivos. El éxito del acoplamiento se comprobó mediante el ensayo de Kaiser (Anal. Biochemistry 34 (1970) 595), la carga con resina se determinó mediante absorción de UV del grupo de fulveno puesto en libertad después de cada separación con piperidina. El péptido se sintetizó en presencia de 5 g de resina de Wang (mezcla de poliestireno y 1% de divinilbenceno) con una carga de 0,50 mmol/g (JACS 95 (1973) 1.328). Después de la síntesis, el grado de carga ascendía todavía a 0,39 mmol/g.
La liberación del péptido se efectuó con 200 ml de ácido trifluoroacético, 200 ml de diclorometano, 10 ml de etanoditiol, 10 ml de m-cresol, 5 ml de sulfuro de etilo y metilo y 5 ml de agua en el transcurso de 30 minutos a la temperatura ambiente. La solución de separación se concentró múltiples veces con tolueno y luego el péptido se precipitó con dietil-éter.
Para la eliminación de los agentes de depuración (scavenger) y otras pequeñas moléculas, el material en bruto se purificó a través de una columna con Sephadex G10. Después de liofilización se obtuvieron 2,4 g de un material con una pureza de 31% (según RP-HPLC = cromatografía de líquido de alto rendimiento en fase inversa). Con el fin de llevar el material a la pureza final de > 95 %, se cargaron 250 mg del péptido a través de una columna de RP-HPLC preparativa (de 40 mm x 250 mm) con material de C18 (5 micrómetros, 300 Angström) y con un gradiente de una mezcla de agua y ácido trifluoroacético a una mezcla de acetonitrilo y ácido trifluoroacético. Después de liofilización resultaron 48 mg de un material de color blanco al 95,2% (según HPLC). La identidad del material se comprobó mediante FAB-MS (espectro de masas con bombardeo por átomos rápidos).
Ejemplo 2
Para la biotinilación del antígeno peptídico del Ejemplo 1, se disolvió 1 equivalente molar concentrado lo más que resultó posible (la solubilidad es dependiente de la secuencia de aminoácidos) en un tampón de fosfato de potasio saturado con argón (0,1 mol/l, pH 8,0) y se mezcló con 3 equivalentes del éster N-hidroxi-succinimídico de ácido D-biotinil-\varepsilon-amino-caproico disuelto en dimetil-formamida saturada con argón (solución de 1 \mumol de reactivo en 5 \mul de DMF).
La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas a la temperatura ambiente bajo argón mediando control constante por medio de RP-HPLC analítica. Cuando estaba presente < 5% de educto (producto de partida), la tanda de reacción se vertió directamente sobre una columna de RP-HPLC preparativa y el material del producto se purificó durante un gradiente de mezcla de 0,1% de ácido trifluoroacético y agua a mezcla de 0,1% de ácido trifluoroacético y acetonitrilo (pendiente: desde 0% hasta 100% en 90 minutos). El material del producto se obtuvo por concentración y liofilización de las fracciones del producto. Los rendimientos estaban situados entre 40% y 90%. Como técnica analítica sirvieron para la pureza HPLC, HPCE y TLC, para la identidad LSI-MS (pico molar) y TLC con reactivos de tinción específicos (p-dimetilamino-cinamaldehído sobre biotina) y la determinación del contenido a través de un microanálisis (en nitrógeno).
Ejemplo 3
Se determinan anticuerpos del HCV en un análisis inmunológico en emparedado de 2 etapas. Para la detección, los reactivos se utilizan con la siguiente composición:
Reactivo 1
Combinaciones 1-6 de los antígenos peptídicos, antígenos peptídicos biotinilados o antígenos peptídicos a solas.
\quad
40 mmol/l de tampón fosfato de pH 7,0,
\quad
0,9% en peso de NaCl,
\quad
10% en volumen de suero bovino.
Reactivo 2
20 mU/ml de un conjugado de un anticuerpo monoclonal contra inmunoglobulina humana (de cordero) y peroxidasa
\quad
40 mmol/l de tampón fosfato de pH 7,0,
\quad
0,05% en peso de Tween® 20,
\quad
0,2% de albúmina de suero bovino,
\quad
0,2% de IgG bovina.
En un tubito de poliestireno revestido con estreptavidina (producido según el Ejemplo 1 del documento EP-A-0.344.578) se incuban durante 1 hora a la temperatura ambiente 1 ml del Reactivo 1 y 10 \mul de la muestra. A continuación se lava tres veces con agua corriente y se incuba con 1 ml del reactivo durante una hora a la temperatura ambiente. A continuación se lava tres veces con agua corriente. Para la reacción de detección se añade 1 ml de ABTS® (sal de diamonio de 2,2'-azino-di-[3-etil-benzotiazolina-sulfonato(6)], 1,9 mmol/l, en un tampón de fosfato y citrato 100 mmol/l de pH 4,4 con perborato de sodio 3,2 mmol/l). Después de 60 min se mide la extinción fotométricamente a 420 nm. Los resultados los muestran las Tablas I, II y III.
Aclaraciones acerca de las Tablas
-/+: negativo/positivo (El corte para una señal positiva en el ELISA es definido como la extinción media a 420 nm más 3 desviaciones típicas de un colectivo de 10 sueros testigos negativos. Las muestras se midieron con una dilución de muestra de 1:250).
Como concentraciones de antígenos se utilizaron:
a) como único antígeno en el ensayo
19
b) en las combinaciones
20
21
TABLA II
22
TABLA III
23 
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Ejemplo 4
En un estudio con muestras clínicas se encontraron con una PCR 9 sueros infecciosos y se investigaron adicionalmente mediante un inmunoanálisis. De éstas, se reconocieron 2 con una mezcla habitual de antígenos (c22-3, c33c, c100-3). El péptido 7A1 conduce al reconocimiento de un suero adicional.
TABLA IV
Nº de la muestra PCR Antígenos de HCV (c22-3, c33c, c100-3) 7A1
1 +/+ - -
2 +/+ - +
3 +/+ +++ +++
4 +/+ - -
5 +/+ ++ +++
6 +/+ - -
7 +/+ - -
8 +/+ - -
9 +/+ - -
Ejemplo 5
Entre 2.000 donantes de sangre se detectaron 5 sueros infecciosos con el péptido 7A1. De éstos son reconocidos solamente 2 con una mezcla habitual de antígenos (c22-3, c33c, c100-3)
TABLA V
Nº de la muestra PCR Antígenos de HCV (c22-3, c33c, c100-3) 7A1
1 +/+ +++ ++-
2 +/+ +++ +++
3 +/- - +
4 +/- - +/-
5 +/- - ++-
Ejemplo 6 Epítopo en la región de núcleo
En lo que sigue se describe un nuevo antígeno dominante del HCV en la región de núcleo. Este antígeno no pudo ser encontrado mediante métodos clásicos, sino solamente mediando utilización de péptidos biotinilados análogamente al Ejemplo 2 y ensayo de la capacidad de los péptidos biotinilados individuales para formar complejos inmunitarios con anticuerpos procedentes de sueros, que de modo comprobable son positivos para HCV. Estos péptidos son especialmente útiles para todos los procedimientos en los que se utilizan antígenos peptídicos solubles, pero lo son menos en procedimientos en los que se utilizan antígenos peptídicos fijados directamente a una fase sólida.
La secuencia más larga es la del antígeno X (SEQ. ID. NO. 28). La secuencia más corta y más reactiva es la D2 (SEQ. ID. NO. 26). El antígeno más reactivo (señal más alta en el inmunoanálisis según el Ejemplo 3) es la D1 (SEQ. ID. NO. 25). Una reactividad residual la presenta también la D3 (SEQ. ID. NO. 27). Las secuencias fueron ensayadas mediante 26 sueros positivos para HCV y presentaron con todas una manifiesta reacción (24 unidades > 500 mE, una > 300 mE y una > 150 mE), pero ninguna presentó reacción con el suero negativo (70 mE). Además, se ensayaron los antígenos B3 (SEQ. ID. NO. 21), B4 (SEQ. ID. NO. 22), B5 (SEQ. ID. NO. 23) y B6 (SEQ. ID. NO. 24) y se midió su dependencia con respecto de la magnitud de la señal con respecto de la concentración de antígenos. De ello resultan unas concentraciones típicas de empleo de los antígenos B4 hasta B6 de 150-200 \mum/ml en ensayos análogos a los del Ejemplo 3. El B3 no es reactivo.
Los resultados del ensayo de los nuevos péptidos mencionados están contenidos en las Tablas VI y VII. Se utilizaron en cada caso 50 ng del antígeno en 100 \mul de un tampón de incubación. Los sueros son diluidos a 1:60. Las reactividades significan:
+ : 70-140 mE,
\mas{2}
: 40-500 mE, 
\mas{3}
: > 500 mE TABLA VI
26
TABLA VII
27 
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Boehringer Mannheim Gmbh
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Sandhofer Str. 116
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
LOCALIDAD: Mannheim
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: DE (Alemania)
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
NÚMERO DE CÓDIGO POSTAL: 68298
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: 0621 759 4348
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
TELEFAX: 0621 759 4457
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA SOLICITUD: Antígenos peptídicos del HCV y procedimiento para la determinación de HCV
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE LAS SECUENCIAS: 28
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
SOPORTE DE DATOS: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATORIO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SISTEMA LÓGICO-SOFTWARE: PatentIn Release nº1.0, versión nº1.25 (EPA)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Asp Gly Val Arg Leu His Arg Phe Ala Pro Pro Cys Lys Pro Leu}
\sac{Leu Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu His Gln Trp Ile Ser Ser Glu Cys Thr Thr Pro Cys Ser Gly Ser}
\sac{Trp Leu Arg Asp Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Arg Arg Phe Ala Gln Ala Leu Pro Val Trp Ala Arg Pro Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Lys Val Val Ile Leu Gly Ser Phe Asp Pro Leu Val Ala Glu Glu}
\sac{Asp Glu Arg Glu Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Ser His Ile Thr Ala Glu Ala Ala Gly Arg Arg Leu Ala Arg Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Arg Gly Asn His Val Ser Pro Thr His Tyr Val Pro Glu Ser Asp}
\sac{Ala Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Val Ser Pro Thr His Tyr Val Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Ser Pro Thr His Tyr Val Pro Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Val Ser Pro Thr His Tyr Val Pro Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Leu Pro Val Trp Ala Arg Pro Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ala Gln Ala Leu Pro Val Trp Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Asn Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Phe Pro Gly Gly GLy Gln Ile Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Gln His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gly Val Gly Ile Tyr Leu Leu Pro Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro GLy Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Tyr Leu Leu Pro Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Leu Leu Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Gly Pro Arg Leu}
\sac{Gly}

Claims (15)

1. Antígenos peptídicos del HCV con las secuencias de aminoácidos SEQ. ID. NO: 6-9 o con secuencias parciales de éstas que tienen una longitud de por lo menos 4 aminoácidos.
2. Antígenos peptídicos del HCV según la reivindicación 1 con secuencias parciales que tienen una longitud de como máximo 9 aminoácidos.
3. Combinación de antígenos peptídicos del HCV a base de
SEQ. ID. NO: 12, 14, 13, 15, 16, 9, 3 ó
SEQ. ID. NO: 12, 14, 13, 15, 16, 9 ó
SEQ. ID. NO: 12, 16, 15, 17, 9, 3 ó
SEQ. ID. NO: 12, 14, 13, 15, 16, 7, 8, 11 ó
SEQ. ID. NO: 12, 14, 13, 15, 16, 9, 3, 18 ó
SEQ. ID. NO: 12, 16, 9, 15, 17, 3, 18 ó
SEQ. ID. NO: 12, 19, 15, 16, 6, 3.
4. Procedimiento para la preparación de antígenos peptídicos según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el aminoácido que forma el extremo terminal de C se fija a un soporte, el antígeno peptídico se constituye escalonadamente a partir del extremo terminal de C y a continuación se separa con respecto del soporte.
5. Procedimiento para la determinación de anticuerpos del HCV, caracterizado porque la muestra se incuba con una combinación de por lo menos dos antígenos peptídicos tomados entre el grupo formado por SEQ. ID. NO: 6 y 28, o antígenos peptídicos que constituyen secuencias parciales de estos antígenos peptídicos con una longitud de por lo menos 4 aminoácidos, y se determina la cantidad del anticuerpo de HCV fijado al antígeno peptídico, en condiciones que hacen posible la formación de un complejo de un anticuerpo y un antígeno.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque la combinación contiene adicionalmente por lo menos un antígeno del HCV tomado entre el grupo formado por SEQ. ID. NO: 12-19.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque como combinaciones se utilizan las de
SEQ. ID. NO: 12, 14, 13, 15, 16, 9, 3 ó
SEQ. ID. NO: 12, 14, 13, 15, 16, 9 ó
SEQ. ID. NO: 12, 16, 15, 17, 9, 3 ó
SEQ. ID. NO: 12, 14, 13, 15, 16, 7, 8, 11 ó
SEQ. ID. NO: 12, 14, 13, 15, 16, 9, 3, 18 ó
SEQ. ID. NO: 12, 16, 9, 15, 17, 3, 18 ó
SEQ. ID. NO: 12, 19, 15, 16, 6, 3.
8. Procedimiento para la preparación de anticuerpos contra antígenos del HCV, caracterizado porque se inmuniza a un animal mamífero con un antígeno peptídico, fijado eventualmente a un soporte, de SEQ. ID. NO: 6, o una secuencia parcial de ésta con una longitud de por lo menos 4 aminoácidos, se obtienen anticuerpos policlonales o se inmortalizan células de estos animales, que producen anticuerpos, para dar líneas celulares, y a partir de estas líneas celulares se obtienen los anticuerpos monoclonales.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque como antígenos peptídicos que constituyen secuencias parciales, se utilizan las SEQ. ID. NO: 7-9.
10. Procedimiento para la determinación de virus de HCV, caracterizado porque la muestra se incuba con un anticuerpo según la reivindicación 8 o 9, en condiciones que permiten una fijación a un complejo de anticuerpo, y se determina la cantidad del complejo formado de anticuerpo y antígeno.
\newpage
11. Vacuna para el tratamiento de infecciones por HCV, que contienen por lo menos un antígeno peptídico eventualmente unido a un soporte de SEQ. ID. NO: 6 o antígenos peptídicos que constituyen secuencias parciales de este antígeno peptídico con una longitud de por lo menos 4 aminoácidos en calidad de inmunógeno, en una dosis farmacológicamente eficaz y en una formulación farmacéuticamente aceptable.
12. Vacuna, caracterizada porque como antígenos peptídicos se utilizan las secuencias
SEQ. ID. NO: 12, 14, 13, 15, 16, 9, 3 ó
SEQ. ID. NO: 12, 14, 13, 15, 16, 9 ó
SEQ. ID. NO: 12, 16, 15, 17, 9, 3 ó
SEQ. ID. NO: 12, 14, 13, 15, 16, 7, 8, 11 ó
SEQ. ID. NO: 12, 14, 13, 15, 16, 9, 3, 18 ó
SEQ. ID. NO: 12, 16, 9, 15, 17, 3, 18 ó
SEQ. ID. NO: 12, 19, 15, 16, 6, 3.
13. Procedimiento para la preparación de vacunas mediando utilización del antígeno peptídico SEQ. ID. NO.: 6 o antígenos peptídicos que constituyen secuencias parciales de estos antígenos peptídicos con una longitud de por lo menos 4 aminoácidos, en calidad de inmunógenos.
14. Procedimiento inmunológico para la determinación de sueros infecciosos del HCV, mediante uno o varios antígenos peptídicos, caracterizado porque como antígeno peptídico se emplea un péptido según las reivindicaciones 1 a 3, procedente del epítopo NS4 terminal de carboxilo del HCV.
15. Antígenos según la reivindicación 1, caracterizados porque a la secuencia de aminoácidos están fijados radicales que no son específicos para el HCV, preferiblemente radicales de biotina, y/o secuencias de aminoácidos que no son específicas para el HCV.
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