ES2148172T5 - Anticuerpos monoclonales humanizados de alta afinidad. - Google Patents

Abstract

Anticuerpo monoclonal quimérico que comprende la región constante de una inmunoglobulina humana y la región variable de un anticuerpo monoclonal ovino o un anticuerpo monoclonal de una vaca que presenta una afinidad de por lo menos 1011 l/mol.

Description

Anticuerpos monoclonales humanizados de alta afinidad.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales que tienen una elevada afinidad, y a su utilización terapéutica.

Antecedentes de la invención

Los anticuerpos monoclonales de múridos y de rata son ampliamente asequibles, pero generalmente resultan inadecuados para su utilización terapéutica en seres humanos debido a la respuesta de anticuerpos humana frente a proteínas extrañas. Con el fin de obviar este problema, se ha propuesto "humanizar" los monoclonales de roedores combinando la región variable del monoclonal con la región constante derivada de una inmunoglobulina humana. A fin de producirlos en gran escala, se puede transfectar el gen para un anticuerpo quimérico, o para otro anticuerpo, de este tipo, y expresar por medio de células del mieloma o por medio de cualquier otra línea de células del huésped.

Otra desventaja asociada a los anticuerpos de roedores es su baja especificidad y su baja afinidad. La constante de afinidad (K_{a}) de un, digamos, monoclonal de múrido puede ser de hasta 10^{10}. A menudo, la humanización reducirá el valor de K_{a}, pero se puede mantener substancialmente el valor original por elección cuidadosa de los materiales y las condiciones experimentales. Éste ha sido el enfoque a monoclonales de alta afinidad destinados a la utilización terapéutica en seres humanos.

Flynn et al., Immunology, 69 (1990) 1-7, describe la producción de un anticuerpo monoclonal ovino procedente de un "compañero" o "socio" (más comúnmente denominado partner) de fusión de un heterohibridoma de oveja/ratón frente a péptidos sintéticos del virus pie-y-boca. No se presenta dato alguno ni en lo que se refiere a la estabilidad de la línea ni en lo que se refiere a los niveles de anticuerpo secretado, aunque se advierte que las líneas producidas no tenían propiedades de neutralización/protección, o, en todo caso, muy escasas. Posibles motivos para ello se pueden reconocer como: (i) en la neutralización/protección no se ven implicados epítopos únicos, (ii) los niveles de anticuerpos en los sobrenadantes son demasiado bajos y (iii) no se ensayaron suficientes monoclonales frente a estos determinantes.

Groves et al., J. Endocrinol., 126 (1990) 217-222, describen un monoclonal ovino de elevada afinidad, estable, contra la progesterona tras la fusión con el mieloma NS1 de múridos, aunque se realizó una fusión paralela con su partner de fusión, que dio lugar a eficacias de fusión más elevadas que las células NS1. Esta línea particular ha sido estable por espacio de 28 meses y secreta 5-10 \mug/10^{6} células/24 horas. Ello está de acuerdo con el trabajo anteriormente reportado por Groves et al., Res. Vet. Sci., 43 (1987) 253-256, donde una fusión NS1 x oveja, similar, dio como resultado dos líneas de células: una cesó de secretar al cabo de dos meses, pero la otra produjo 2,5 ng/ml a la confluencia, 4 meses después de la fusión, después de cuatro etapas de subclonación.

El documento WO 91/09966 está en el estado de la técnica anterior de acuerdo con el Artículo 54(3) de la EPC. Dicho documento da a conocer una cadena pesada de anticuerpo injertada con CDR que tiene un dominio de región variable que comprende regiones enlazantes de marcos aceptores y antígenos donantes, en posiciones específicas. Los anticuerpos injertados con CDR son, preferentemente, anticuerpos humanizados que tienen marcos aceptores no humanos. Los anticuerpos se derivan generalmente de roedores.

Sumario de la invención

Un anticuerpo monoclonal quimérico de acuerdo con la presente invención, comprende un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1. Además, con el propósito de producir tal anticuerpo, el nuevo ADN heterólogo comprende un gen quimérico que incluye el ADN de la región variable, que codifica las cadenas pesada y ligera del anticuerpo monoclonal ovino o de vaca y la región constante del ADN humano. La invención proporciona asimismo un fragmento de anticuerpo según la reivindicación 5.

Un anticuerpo de la invención se puede producir por técnicas análogas a las que se conocen para la producción y la quimerización de monoclonales de múridos. Sin embargo, el producto puede tener una afinidad mucho más elevada.

Descripción de la invención

Para producir anticuerpos de acuerdo con la presente invención se pueden aplicar diversas técnicas. El producto es predominantemente de origen humano, de manera que se puede utilizar satisfactoriamente en un método de terapia practicado en un ser humano.

Un anticuerpo entero comprende cadenas pesadas y ligeras, y regiones constantes y variables. Las regiones variables comprenden un marco variable y regiones hipervariables dentro de las que están situados los sitios de unión a los antígenos. La invención incluye dentro de su alcance los fragmentos de anticuerpo, que son los fragmentos F(ab')_{2} o Fab, con la condición de que por lo menos parte de los mismos se derive de una inmunoglobulina humana.

Más específicamente, un anticuerpo entero "quimérico" de la invención comprende la región variable de un anticuerpo de elevada afinidad y la región constante de una inmunoglobulina humana. En todos los casos, el producto es una combinación de las secuencias del anticuerpo de elevada afinidad y del anticuerpo humano.

Un producto de la invención se puede preparar por un proceso que implica esencialmente tres etapas. En primer lugar, un animal adecuado se inmuniza utilizando un antígeno y se obtienen células B que secretan un anticuerpo a este antígeno. En segundo lugar se obtienen los anticuerpos monoclonales de elevada afinidad y los genes que los codifican. En tercer lugar, estos anticuerpos se quimerizan.

El animal que se somete a la inmunización no es un roedor, sino que se escoge un mamífero que dé anticuerpos de afinidad más elevada. Son animales adecuados las vacas y, para los propósitos de una ilustración adicional, las ovejas. La inmunización de ovejas da una buena respuesta inmunogénica a una variedad de antígenos. El tamaño y la longevidad de estos animales significan que se les puede administrar antígeno por varias vías de administración y a lo largo de un período de tiempo más largo que a los roedores.

Tal como se ilustra más adelante, en el Ejemplo 1, el anticuerpo monoclonal de elevada afinidad se puede obtener por medio de la tecnología clásica del hibridoma, que comprende la fusión de las células B que secretan anticuerpos ovinos o de vaca, de elevada afinidad, con células del mieloma, y por selección de los hibridomas resultantes. Alternativamente, las células B procedentes de las especies relevantes se pueden sembrar aparte, seleccionar y amplificar, por ejemplo utilizando la reacción de la cadena de polimerasa, y también se puede utilizar la recuperación de fagos para obtener el ARNm procedente de linfocitos seleccionados, y así los genes del anticuerpo.

Seguidamente, se procede a la quimerización. El anticuerpo monoclonal que se utiliza en la presente invención para este propósito de quimerización preferentemente tiene una constante de afinidad de por lo menos 10^{12}, más preferentemente de por lo menos 5 x 10^{12} y, lo más preferentemente, de por lo menos 10^{13}, por ejemplo de hasta 10^{14}, 10^{15} l/mol, o más elevada.

Se pueden utilizar varias técnicas de quimerización, todas las cuales implican el ensamblaje de secuencias procedentes de un anticuerpo de elevada afinidad y secuencias procedentes de anticuerpos humanos. Un anticuerpo entero quimérico de la invención comprende la región variable del primero y la región constante del último. Las técnicas para producir anticuerpos enteros quiméricos son conocidas.

La tecnología recombinante, para los propósitos de producir un anticuerpo de acuerdo con la invención, puede comprender una primera etapa en la que un gran número de moléculas de anticuerpos de vaca u ovinos enteros, se secuencian desde la región "bisagra" hacia arriba, por ejemplo a lo largo de un intervalo de IgG1's de oveja. Ello se puede hacer bien sea por aislamiento del ARNm de varios clones de células B, quizás utilizando la PCR y así secuenciando el ADN, o secuenciando anticuerpos policlonales de tipo IgG1, purificados por afinidad, o bien un gran número de monoclonales, si se puede disponer de ellos. Seguidamente, las secuencias se pueden utilizar para definir los límites entre las regiones constante, variable e hipervariable, tanto para la cadena pesada como para la cadena ligera. Seguidamente, se puede utilizar el modelado estructural, con propósitos de comparación con regiones constantes humanas y de ratón, a fin de determinar cuánto de la secuencia monoclonal de elevada afinidad, esto es, la región variable, es preciso añadir al gen constante humano para dar el producto entero.

Un anticuerpo de la invención se puede utilizar en terapia. Es probable que sea de un valor particular en el tratamiento del cáncer, la inflamación, por ejemplo, la artritis reumatoide, y en el ataque séptico, tras un trasplante de órganos, en la inmunomodulación, para la inmunoterapia pasiva en el tratamiento de virus, y para proporcionar anticuerpos frente a bacterias. Para este propósito, el anticuerpo se puede formular en forma de una composición adecuada con un excipiente, diluyente o vehículo, fisiológicamente aceptable.

Las ventajas particulares de los anticuerpos de elevada afinidad para la terapia son:

(i)

La afinidad está ligada a una respuesta biológica. Cuanto más alta sea la afinidad tanto mejor es probable que sea la respuesta.

(ii)

Los anticuerpos con una afinidad más elevada darán como resultado una unión más rápida de los anticuerpos a las células diana, o una inmunoneutralización más rápida. Ello quiere decir que habrá una mayor proporción de anticuerpo concentrada en los sitios diana, lo que conduce directamente a una mejor localización del anticuerpo o el conjugado del anticuerpo, reduciendo la unión no-específica a otros sitios. Esto es una consideración importante en el tratamiento del cáncer, donde la unión al tumor se desea a expensas de la unión a otros tejidos tales como el riñón, la médula ósea y el hígado.

(iii)

Una afinidad más elevada significa que se pueden utilizar menos anticuerpos por dosis, lo que conduce a terapias más económicamente viables. Ello constituye una consideración relevante cuando están implicadas reacciones de competencia, por ejemplo, la unión con un virus o una linfoquina en lugar de que el virus o la linfoquina se unan a una superficie de la célula o a un receptor.

El Ejemplo 1 que se aporta a continuación ilustra la preparación de un anticuerpo monoclonal ovino que tiene una elevada afinidad ("Guildhay" se refiere a Antisueros Guildhay, Guildford, Reino Unido).

Ejemplo 1 Preparación del "partner" de fusión sfp1 del heteromieloma

El SFP1 es un "partner" de fusión del heteromieloma de oveja derivado originariamente de la línea de células NSI. La línea no secreta inmunoglobulinas ni de múrido ni ovinas. Las células SFP1 se han tratado con 8-azoguanina o 6-tioguanina, se han clonado por dilución limitante y se han probado para determinar la sensibilidad HAT. La línea de células no se ha invertido a la resistencia a la HAT durante un período de 3 años.

1. RIA para los anticuerpos anti-T3 ovinos

El nivel de secreción de anticuerpos era desconocido, posiblemente cantidades del orden de sub-nanogramos inicialmente. El RIA para llevar a cabo una selección ("screening") del sobrenadante del cultivo necesitaba ser sensible, y se adaptó a partir de un ensayo T3 utilizado rutinariamente. Resumiendo, los sobrendanates de los cultivos se incubaron con T3 yodadas y se ligaron, separadas por un espaciador, utilizando un procedimiento del PEG para segundos anticuerpos.

Todas las diluciones se hicieron en tampón de barbitona 0,05 M (pH 8,6) que contenía BSA de grado RIA al 0,1% (Sigma). 100 \mul de T3 yodadas 7,4 x 10^{5} s^{-1}/ml (20 \muCi/ml) [>4,44 x 10^{7} s^{-1}/\mug (>1,2 mCi/\mug) de T3, Amersham International] se añadieron a 100 \mul de ácido 8-anilino-1-naftalenosulfónico (4 mg/ml), 200 \mul de sobrenadante del cultivo, 100 \mul de inmunoglobulina anti-oveja, de mono, (Guildhay) y 75 \mul de medio de cultivo de tejidos. Una parte alícuota de anticuerpo policlonal de oveja frente a las T3 (Guildhay) que daba un 30% de unión de los recuentos totales se incluyó en el ensayo de selección ("screening") como control positivo. Los tubos se agitaron en un agitador vorticial y se incubaron durante 2 horas a 37ºC, o durante la noche a 4ºC, antes de la separación por adición de 500 \mul de PEG 6000 al 6% (p/v) (BDH), la agitación vorticial y la centrifugación durante 30 minutos a 3.000 rpm. Los gránulos sedimentados se contaron durante 60 segundos.

2. ELISA de la IgG ovina

200 \mul de una disolución, a 7,5 \mug/ml, de inmunoglobulina anti-oveja, de mono, purificada por afinidad, (Guildhay), pretratada para eliminar anticuerpos que reaccionaban cruzadamente con las inmunoglobulinas presentes en el suero fetal de ternera (FCS), en tampón bicarbonato (pH 9,6), se adsorbieron en placas para microvaloraciones, de 96 pocillos, (Nunc Maxisorp) durante 2 horas a 37ºC, o durante la noche a 4ºC. Las placas se lavaron con PBS que contenía un 0,1% de gelatina y un 0,05% de Tween® 20, pH 7,4 (PBSGT). 200 \mul del sobrenadante del cultivo de tejidos o de estándares de gamma-globulina de oveja (Sigma), diluidos a 1-1000 ng/ml en medio para cultivo de tejidos, se añadieron a los pocillos y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Las placas se lavaron con PBSGT y a los pocillos se añadieron 200 \mul de inmunoglobulina anti-oveja, de mono, marcada con peroxidasa de rábano picante (Guildhay). Las placas se incubaron durante 30 minutos a 37ºC y se lavaron con PBSGT.

Se añadieron 200 \mul de substrato, 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) (Boehringer-Mannheim), en tampón citrato-fosfato de pH 5,5 + H_{2}O_{2} al 0,04%, y se dejó desarrollar el color durante 30 minutos a 37ºC. La reacción se detuvo por adición de 50 \mul de H_{2}SO_{4} 2,5 M, y se leyó la absorbancia a 450 nm en un "Titerek Multiskan Plus®" (Flow Labs).

Fusión

Los linfocitos para la fusión se obtuvieron del bazo de una oveja que había sido inmunizada repetidamente con conjugados T3-BSA durante un periodo de 15 años, a fin de obtener antisuero policlonal frente a las T3. El refuerzo final tuvo lugar 1 semana antes de la fusión. Se separó aparte una pequeña zona de bazo para producir una suspensión de células (los grupos grandes de células no disociadas se desecharon). La suspensión de células se lavó y se centrifugó dos veces en RPMI (sin FCS ni suplementos). Antes de la fusión no se llevó a cabo ningún otro procedimiento, esto es, ni mitógenos, ni enriquecimientos, ni precultivo alguno.

Se llevaron a cabo fusiones paralelas utilizando el partner de fusión SFP1 del heteromieloma, y el mieloma NS2 de origen múrido. Las fusiones se realizaron en una proporción de 8 células de bazo por 1 célula de mieloma, con un número total de células de 9 x 10^{8} en cada uno de los casos, utilizando 1 ml dePEG 500 al 50% (BDH) en RPMI a lo largo de 2 minutos, seguido por dilución lenta con 20 ml de RPMI a lo largo de 8 minutos más. Las fusiones se sembraron de la manera siguiente:

i.

FCS al 20%, RPMI, piruvato (1 mm), glutamina (2 mm), HAT (Gibco) más alimentadores del bazo de ratón.

ii.

FCS al 20%, RPMI, piruvato, glutamina, HAT + ningún alimentador.

iii.

FCS al 10%, suero de oveja al 10%, piruvato, glutamina, HAT más alimentadores.

iv.

FCS al 10%, suero de oveja al 10%, piruvato, glutamina, HAT, ningún alimentador.

\newpage

Cada una de las fusiones se realizó en 3 x placas de 96 pocillos de cada uno de los 4 parámetros (24 x 96 pocillos en total). Durante la primera semana, se añadieron penicilina y estreptomicina a los cultivos cuando el bazo se extrajo y se transportó en condiciones no estériles, (tiempo de tránsito aproximadamente 2 horas). Catorce días después de la fusión, el HAT se reemplazó por HT.

Resultados

El número de clones derivados de los diversos tratamientos se puede ver en la Tabla 1. Es del todo evidente que resultaron más líneas de células del cruce con el SFP1 (634 en total) que con el NS2 (634 en total). Aunque no es significativo, las células alimentadoras de ratón parecen ser beneficiosas en este sistema desde el punto de vista del número de hibridomas producidos. El suero de oveja no aumentó el número de hibridomas producidos, a pesar de las indicaciones de lo contrario de la literatura.

Dos meses después de la fusión, 57 líneas eran todavía débilmente positivas; se eligió una línea para un ulterior estudio puesto que era considerablemente más fuerte que las demás. Ello tenía su origen en el cruce SFP1 x bazo hecho crecer en FCS al 20% sin células alimentadoras. La línea de células resultante 17C6 era visible al microscopio 11 días después de la fusión (las líneas más precoces 4 días después de la fusión) pero no se consideró lo suficientemente grande para la selección ("screening") hasta 22 días después de la fusión. Aunque fuertemente positiva para los anticuerpos T3 en este estadio, por RIA no era lo suficientemente confluente, durante 2 semanas más, para transferir a los pocillos de 2 ml, cuando el HAT en el medio fue substituido por HT. La línea se subclonó 33 días después de la fusión (los niveles de secreción de anticuerpos no habían disminuido) y se volvió a subclonar de nuevo 3 meses después de la fusión. A pesar del ritmo de crecimiento inicialmente muy lento, el ritmo aumentó de manera que la línea actualmente se divide a velocidades comparables a las de las líneas de múridos y humanas, convencionales; esto es, aproximadamente 26 horas.

La Tabla 2 muestra el efecto de las concentraciones de FCS y de suero de cordero sobre la producción de anticuerpos. Otros experimentos que investigaban los efectos del suero de cordero y mezclas de suero de cordero y FCS, o FCS solo, sobre una gama del 5-20% sobre cultivos de crecimiento exponencial mostró que, después de 1 semana en cultivo, los niveles de actividad enlazante de las T3 eran iguales para el FCS en la gama ensayada, con aproximadamente un 85% de unión T3 disponible (los cultivos confluentes se unirían un 100%). En la misma gama, en el suero de cordero, aproximadamente el 45% de las T3 estaba ligado, mientras que la mezcla de FCS y suero de cordero mostró una unión intermedia del 55% después de 1 semana. Después de 48 horas de crecimiento, se puso de manifiesto que el suero de cordero era mejor para la línea de células.

Características de los anticuerpos

Se halló que la constante de asociación K_{a} para el anticuerpo monoclonal de oveja 17C6 era de 2,6 x 10^{13} l/mol, lo que es perfectamente comparable con el valor 1,39 x 10^{13} l/mol para el suero de un exudado precoz, y 2,13 x 10^{13} l/mol para el mejor exudado policlonal (4 meses antes de la fusión). Las reactividades cruzadas de estos tres anticuerpos se muestran en la Tabla 3. Las curvas estándar para el mejor antisuero clonal y el monoclonal 17C6 eran
similares.

El 17C6 se subclasificó utilizando IgG1, IgG2, IgA, IgM y cadenas ligeras, ovinas monoclonales, sobre un sistema de transferencia por puntos basado en nitrocelulosa, y se halló que era una IgG1.

La línea de células 17C6 es estable en cultivo continuo. Desde el segundo subclón, no ha habido evidencia de hipercrecimiento por células no secretoras ni disminución de la producción de anticuerpos. La línea se ha vuelto a subclonar dos veces y todos los subclones resultantes en ambas ocasiones secretaban cantidades idénticas de anticuerpo. La línea de células se ha congelado y descongelado con éxito y ha continuado produciendo cantidades normales de anticuerpo. Los intentos para desestabilizar la línea por "estrés" han fallado, secretando la línea niveles similares de anticuerpo en FCS al 2,5 - 20%. Utilizando el lote de FCS en el que se realizó la fusión, no se detectó ninguna variación en los niveles de secreción de anticuerpo. Sin embargo, a lo largo de un período de tiempo comparable, en medio exento de suero Ultroser, las velocidades de secreción disminuyeron, pero se volvieron a recuperar al volver a los medios que contenían suero. El efecto está, pues, en el entorno de las células más bien que en un cambio en el interior de la célula. Otras líneas de hibridomas, de origen múrido y humano, han mostrado secretar cantidades comparables de inmunoglobulina en medios tanto con suero como exentos del mismo. Ello sugiere que los medios químicamente definidos que soportan el crecimiento tanto del hibridoma de origen múrido como el hibridoma de origen humano y las velocidades de secreción comparables con suero se pueden modificar para posibilitar que las líneas de origen ovino crezcan bajo tales condiciones. El factor adicional requerido para esta línea de células no se halla en las células alimentadoras de ratón.

Otros intentos de desestabilizar la línea de células implicaban la subclonación en ausencia de factores de crecimiento o de células alimentadoras. La línea de células se subclonaba bien bajo estas condiciones, soportando el tipo de estrés que muchas líneas de origen múrido robustas no pueden tolerar. La línea de células no ha mostrado ningún requerimiento para pasar por una fase de adaptación para resistir las fuerzas de corte cuando se transfieren desde cultivos estáticos a cultivos giratorios en FCS al 2,5%, a diferencia de algunas líneas de origen múrido que necesitan una aclimatación.

El Ejemplo 2 que se aporta a continuación ilustra la humanización del anticuerpo monoclonal de elevada afinidad del Ejemplo 1.

Ejemplo 2

El anticuerpo del Ejemplo 1 se somete a una quimerización por cualquiera de las técnicas conocidas, anteriormente descritas. El producto es un anticuerpo que constituye una realización de la presente invención, adecuado para a administración a los seres humanos.

TABLA 1

1

TABLA 2

2

TABLA 3 Que muestra el % de reactividades cruzadas del anticuerpo monoclonal ovino en comparación con el antisuero policlonal

3

Claims (10)

1. Anticuerpo monoclonal quimérico que comprende la región constante de una inmunoglobulina humana y la región variable de un anticuerpo monoclonal ovino o un anticuerpo monoclonal de una vaca que presenta una afinidad de por lo menos 10^{11} l/mol.

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que dicha afinidad es de por lo menos 10^{12} l/mol.

3. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que dicha afinidad es de por lo menos 5 x 10^{12} l/mol.

4. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que dicha afinidad es de por lo menos 10^{13} l/mol.

5. Fragmento de anticuerpo que es un fragmento F(ab')2 o Fab de un anticuerpo según la reivindicación 1, en el que por lo menos una parte deriva de una inmunoglobulina humana.

6. Fragmento de anticuerpo según la reivindicación 5, en el que dicha afinidad es de por lo menos 10^{12} l/mol.

7. Fragmento de anticuerpo según la reivindicación 5, en el que dicha afinidad es de por lo menos 5 x 10^{12} l/mol.

8. Fragmento de anticuerpo según la reivindicación 5, en el que dicha afinidad es de por lo menos 10^{13} l/mol.

9. Utilización de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para la preparación de un medicamento destinado a su utilización en el tratamiento de un sujeto humano que hospeda un antígeno al que se une un anticuerpo.

10. Utilización de un fragmento de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, para la preparación de un medicamento destinado a su utilización en el tratamiento de un sujeto humano que hospeda un antígeno al que se une el fragmento de anticuerpo.