ES2250105T3 - Anticuerpos policlonales humanos de animales transgenicos no humanos. - Google Patents

Abstract

Una composición de antisuero policlonal de un animal transgénico no humano que reconoce específicamente un inmunógeno, en la que dicha composición de antisuero comprende principalmente moléculas de proteína inmunoglobulina que comprenden al menos una porción de una región constante de cadena pesada humana, y secuencias aminoacídicas de región variable codificadas por fragmentos de más de una región variable (V), en la que (i) dichas moléculas de proteína inmunoglobulina se unen específicamente a dicho inmunógeno, y en la que (ii) dicho animal transgénico no humano genera la diversidad de anticuerpos principalmente mediante conversión génica.

Description

Anticuerpos policlonales humanos de animales transgénicos no humanos.

Campo de la invención

El campo de esta invención es antisuero policlonal sustancialmente humano para el tratamiento profiláctico y terapéutico de seres humanos.

Antecedentes

La terapia de enfermedades infecciosas causadas por bacterias, hongos, virus y parásitos está basada en gran medida en la quimioterapia. Sin embargo, la emergencia de organismos resistentes a fármacos requiere el continuo desarrollo de nuevos antibióticos. Al mismo tiempo, el control de infecciones está amenazado por la emergencia de nuevos patógenos. El número creciente de individuos inmunocomprometidos debido a malnutrición, SIDA, terapias médicas del cáncer, enfermedades autoinmunes y transplante de órganos reduce la eficacia de la terapia de antibióticos y aumenta la dificultad de controlar las infecciones.

Las terapias de pacientes con malignidades y cáncer están también basadas en la quimioterapia. Sin embargo, muchas de estas terapias son ineficaces y la mortalidad de los pacientes enfermos es alta. Los avances en la tecnología de anticuerpos monoclonales han proporcionado pocas mejoras debido a la inmunogenicidad de los anticuerpos monoclonales y a su falta de potencia. Las respuestas anti-idiotípicas de anticuerpos en pacientes que experimentan terapia de anticuerpos monoclonales pueden hacer ineficaz la terapia de anticuerpos.

La terapia del rechazo resistente a esteroides de órganos transplantados requiere el uso de reactivos biológicos (preparaciones de anticuerpos monoclonales o policlonales) que inviertan la respuesta aloinmune continua en el receptor del transplante. Sin embargo, la inmunogenicidad de las preparaciones de anticuerpos puede hacer ineficaz dicha terapia y evitar la reversión del rechazo. Como consecuencia, puede rechazarse un órgano transplantado. De forma similar, las terapias de anticuerpos de pacientes con enfermedad autoinmune son de éxito limitado debido a la inmunogenicidad de las preparaciones de anticuerpos. Aunque la humanización de los anticuerpos reduce la inmunogenicidad, la eficacia de dichos anticuerpos está limitada por las respuestas anti-idiotípicas de anticuerpos y la falta de potencia de los anticuerpos monoclonales. Han de desarrollarse reactivos no inmunogénicos potentes para la modulación de las respuestas inmunes.

La terapia de anticuerpos policlonales para el tratamiento de enfermedades infecciosas se introdujo al final del siglo pasado. En los años 30, se utilizaba la terapia de suero para el tratamiento de infecciones bacterianas y víricas, incluyendo neumonía, meningitis, escarlatina, tos ferina, carbunco, botulismo, gangrena, tétanos, brucelosis, disentería, tularemia, difteria, sarampión, poliomielitis, paperas y varicela. Sin embargo, la administración sistémica de suero animal causaba fiebres, escalofríos y reacciones alérgicas. La enfermedad sérica aparecía en 10-50% de los individuos tratados.

El potencial de uso de anticuerpos en el tratamiento de una variedad de indicaciones es muy alto. La capacidad de unirse específicamente a una entidad diana proporciona diversas oportunidades de secuestrar y destruir la entidad. Sin embargo, como se demostró anteriormente, ha habido muchos impedimentos para el uso de anticuerpos heterólogos y humanizados. Las limitaciones de los anticuerpos monoclonales añaden el impedimento adicional de una afinidad reducida. Por tanto, existe una necesidad apremiante de encontrar modalidades alternativas que proporcionen protección frente a enfermedades infecciosas y malignidades o la inmunomodulación de receptores de transplantes y pacientes de enfermedades autoinmunes.

Bibliografía relevante

Las terapias basadas en anticuerpos de enfermedades infecciosas se revisaron recientemente por A. Casadevall y M.D. Scharff, Clinical Infectious Diseases 1995, 150-161.

El uso de anticuerpos para el tratamiento del cáncer y malignidades se revisó recientemente por C. Botti, A. Marinetti, S. Nerini-Molteni y L. Ferrari, Int. J. Biol. Markers 1997; 12(4): 141-147; D.R. Anderson, A. Grillo-López, C. Varns y K.S. Chambers, Biochem. Soc. Trans. 1997; 25(2): 705-708; C. Renner, L. Trumper y M. Pfreundschuh, Leukemia 1997; 11, supl. 2: S55-59; B. Bodey, S.E. Siegel y H.E. Kaiser, Anticancer Res. 1996; 16(2): 661-674.

El uso de preparaciones de anticuerpos policlonales para el tratamiento del rechazo de transplantes se revisó recientemente por N. Bonnefoy-Berard y J.P. Revillard, J. Heart Lung Transplant 1996; 15(5); 435-442; C. Colby, C.A. Stoukides y T.R. Spitzer, Ann. Pharmacother. 1996; 30(10): 1164-1174; M.J. Dugan, T.E. DeFor, M. Steinbuch y A.H. Filipovich, Ann. Hematol. 1997, 75 (1-2): 41-46.

El uso de terapias de anticuerpos policlonales para enfermedades autoinmunes se ha descrito por W. Cendrowski, Boll. Ist Sieroter Milan, 1997; 58(4): 339-343; L.K. Kastrukoff, D.R. McLean y T.A. McPherson, Can. J. Neurol. Sci. 1978; 5(2): 175-178; J.E. Walker, M.M. Hoehn y N. Kashiwagi, J. Neurol. Sci. 1976; 29 (2-4): 303-309.

La depleción de células grasas utilizando preparaciones de anticuerpos se ha descrito por L. De Clercq, J. Mourot, C. Genart, V. Davidts y C. Boone, J. Anim. Sci. 1997; 75(7): 1791-1797; J.T. Wright y G.J. Hausman, Obes. Res. 1995; 3(3): 265-272.

La clonación de animales a partir de células se ha descrito por T. Wakayama, A.C.F. Perry, M. Zuccotti, K.R. Johnson y R. Yanagachi, Nature 1998, 394: 369-374; J.B. Cibelli, S.L. Stice, P.J. Golueke, J.J. Kane, J. Jerry, C. Blackwell, A. Ponce de León y J.M. Robl, Science 1998; 280: 1256-1258; J.B. Cibelli, S.L. Stice, P.J. Golueke, J.K. Kane, J. Jerry, C. Blackwell, F. Abel de León y J. Robl, Nature Biotechnology 1998; 16: 642-646; A.E. Schnieke, A.J. Kind, W.A. Ritchie, K. Mycock, A.R. Scott, M. Ritchie, I. Wilmut, A. Colman A. y K.H. Campbell, Science 1997; 278 (5346): 2130-2133; K.H. Campbell, J. McWhir, W.A. Ritchie e I. Wilmut, Nature 1996; 380 (6569): 64-66.

La producción de anticuerpos a partir de animales transgénicos se describe en las patentes de EE.UU. nº 5.814.318, 5.545.807 y 5.570.429. Se ejemplifica la recombinación homóloga de hospedadores mamíferos quiméricos en la patente de EE.UU. nº 5.416.260. Se describe un método para introducir ADN en un embrión en la patente de EE.UU. nº 5.567.607. Se describe el mantenimiento y la expansión de células madre embrionarias en la patente de EE.UU. nº 5.453.357.

Además, los documentos EP A 1288229, así como WO A 00/26373 se refieren principalmente a la producción de antisuero utilizando una translocación de inmunoglobulina humana o humanizada en animales no conversores de genes. Los loci de inmunoglobulina humana descritos en estas referencias no contienen secuencias de codificación de Ig humana múltiples flanqueadas/separadas por secuencias múltiples no de codificación derivadas de animales. Además, los loci de inmunoglobulina humana o humanizada descritos en estas referencias no soportan la conversión génica y, por lo tanto, dan como resultado la expresión de anticuerpos que contienen una región variable codificada por un solo segmento de gen V, incluso en animales conversores de genes. El documento WO 00/31141 se refiere a anticuerpos humanizados específicos del antígeno de superficie de HPV pre-S1, que muestran una afinidad de unión similar al anticuerpo monoclonal de ratón y mostraron inmunogenicidades reducidas, ya que tienen menos restos aminoacídicos derivados de ratón.

Sumario de la invención

Se proporcionan anticuerpos policlonales de un antígeno específico y un animal transgénico no humano, que comprenden loci de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada genéticamente alterados o al menos una porción de loci de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada humana. Se utiliza un método que emplea la modificación por etapas de un animal doméstico en el que el repertorio de anticuerpos se diversifica principalmente mediante conversión génica (por ejemplo, conejos, ovejas, cerdos, vacas). El método implica el reemplazo mediante recombinación homóloga de elementos endógenos de los loci de inmunoglobulina por las correspondientes contrapartidas humanas, en particular, el reemplazo de uno o varios exones que codifican regiones constantes de cadena pesada y ligera y uno o varios elementos de región variable, incluyendo el proximal al locus de la región D. En animales, cuando la diversidad de anticuerpos se genera predominantemente mediante conversión génica, el reemplazo de la región V más proximal a la región D por un elemento de la región V humana da como resultado la expresión del elemento V humano en la mayoría de las inmunoglobulinas. Esta ingeniería genética es seguida por la crianza de hospedadores de la misma especie y la selección de un hospedador que sea capaz de responder a la inmunización con la producción de antisuero sustancialmente humano con glicosilación de hospedador, teniendo la inmunoglobulina al menos una porción funcional de la cadena pesada humana. Los animales que expresan las inmunoglobulinas de secuencia proteica sustancialmente humana se utilizan para la generación de preparaciones de anticuerpos policlonales mediante inmunización con inmunógenos de interés, particularmente, inmunógenos que inician la producción de anticuerpos que tienen actividad terapéutica. Después de la purificación del antisuero, dicho antisuero puede utilizarse, por sí mismo o en combinación, con otros reactivos para la depleción de reactivos infecciosos, células malignas, cánceres, células diana indeseables o inmunomodulación.

Descripción de las realizaciones específicas

Se proporcionan métodos para la producción de antisuero sustancialmente humano en un hospedador heterólogo mediante la inmunización del hospedador con un inmunógeno. En particular, se proporciona una composición de antisuero policlonal de un animal transgénico no humano que reconoce específicamente un inmunógeno, en la que dicha composición de antisuero comprende principalmente moléculas de proteína inmunoglobulina que comprenden al menos una porción de una región constante de cadena pesada humana, y secuencias aminoacídicas de región variable codificadas por fragmentos de más de un gen de región variable (V), (i) en la que dichas moléculas de proteína inmunoglobulina se unen específicamente a dicho inmunógeno, y (ii) en la que dicho animal transgénico no humano genera la diversidad de anticuerpos principalmente mediante conversión génica. El hospedador se caracteriza por ser al menos sustancialmente incapaz de producir antisuero endógeno y capaz de producir principalmente antisuero polipeptídico sustancialmente humano tras la exposición a una sustancia inmunogénica; y por retener su capacidad de transposición de los locus de inmunoglobulina y recombinación de las regiones V, (D_{H}), J y C produciendo antisuero de proteína sustancialmente humano, que incluye al menos una región constante de inmunoglobulina humana y/o al menos un elemento de región variable (V) humana. Son de interés particular las regiones constantes de las subclases C\alpha o C\gamma, incluyendo cualquiera de las subclases 1, 2, 3 y 4. Los fragmentos de ADN que codifican regiones constantes y elementos variables humanos se integran en el genoma mediante recombinación homóloga y reemplazan los elementos endógenos correspondientes.

Pueden emplearse diversos animales, particularmente animales domésticos, que pueden proporcionar volúmenes razonables de antisuero. Los animales son generalmente de al menos 1 kg, preferiblemente 2 kg, y pueden ser de 5 kg o más cuando son adultos, sin embargo, pueden utilizarse animales menores según sea apropiado. También el periodo de gestación debería ser menor de 12 meses, estando habitualmente en el intervalo de 1 a 4 meses. Los animales ilustrativos incluyen lagomorfos, por ejemplo, conejos, animales ovino, bovino, canino, felino, equino y similares, excluyendo múridos. Los animales son aquellos en que la diversificación del repertorio de anticuerpos se realiza principalmente mediante conversión génica (concretamente, conejos, cerdos, ovejas, vacas). En estos animales, el reemplazo del elemento de la región V proximal a la región D por un elemento de región V humana dará como resultado la expresión del elemento de región V humana en la mayoría de las inmunoglobulinas. El enfoque de ingeniería genética descrito de la invención en cuestión es sustancialmente más sencillo que otros enfoques que se han realizado con ratones. Sin embargo, en ratones, la diversificación del repertorio de anticuerpos se realiza principalmente mediante transposición génica.

Las células hospedadoras, por ejemplo, fibroblastos, queratinocitos, miocitos, hepatocitos, células epiteliales u otras células que pueden hacerse crecer y expandirse en cultivo y no tienen un genoma transpuesto, se transforman (se modifican genéticamente) mediante la introducción de fragmentos de ADN en las células, donde los fragmentos se integran en el genoma hospedador. La introducción puede ser mediante una variedad de métodos, incluyendo ADN desnudo, transfección con un vector vírico, fusión, biolística, liposomas, etc. El método particular se seleccionará según el fin de la introducción del ADN y la eficacia de la integración. Los loci de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina funcionales se modifican mediante recombinación homóloga, reemplazando al menos una porción de la región constante de cadena pesada del hospedador por al menos una porción funcional de la región constante de cadena pesada humana y, si se desea, análogamente la región constante de cadena ligera del hospedador por una región constante de cadena ligera humana. Es también de particular interés el reemplazo de la región V más proximal a la región D por un elemento de región V humana. De este modo, aunque algunas porciones de la inmunoglobulina sean secuencias de hospedador, no es probable que el antisuero cause una fuerte respuesta inmune a la vista de la gran variedad de regiones variables en el antisuero. En animales en los que la diversidad de anticuerpos se genera principalmente mediante conversión génica, el reemplazo de la región V más proximal a la región D por un elemento de región V humana da como resultado la expresión del elemento V humano en la mayoría de las inmunoglobulinas. Para el reemplazo de regiones constantes, es de particular interés incluir al menos 2 de los 3 dominios C_{H1}, C_{H2} y C_{H3} de la región constante, incluyendo particularmente C_{H3}. En la medida en que dicho antisuero pueda funcionar en un hospedador, particularmente un hospedador inmunocomprometido, es atractivo el número reducido de etapas para conseguir hospedadores que produzcan dicho antisuero.

Para la integración en un sitio predeterminado, se preparan constructos que incluyen, secuencialmente, el fragmento de ADN para integración y un primer gen marcador limitado por secuencias homólogas de al menos aproximadamente 30 nt y un segundo gen marcador, con lo que la integración homóloga da como resultado la pérdida del segundo gen marcador. Al tener el segundo gen marcador que proporciona selección negativa, se seleccionan negativamente las células con el segundo gen marcador y se retiran de la mezcla celular; al tener el primer gen marcador que proporciona selección positiva, se retienen las células que tienen el primer gen marcador, utilizando un medio al que el segundo gen marcador sea sensible. De esta manera, se reducen aquellas células en las que el constructo se integra aleatoriamente. Al seguir con un medio selectivo del primer gen marcador, se reducirán las células que no retienen el primer gen marcador. De este modo, las células restantes deberían ser aquellas que tienen recombinación homóloga. Deseablemente, las células están en un estado de proliferación rápida, en lugar de un estado de no proliferación. Al emplear un medio de crecimiento tal como RPMI1640 o DMEM, suplementado con FCS y factores de crecimiento, puede inducirse un ciclo de crecimiento.

Después de haber transformado o transfectado las células, se ponen las células en un medio selectivo según el marcador empleado, habitualmente un gen de resistencia a antibiótico o el gen tk. Se expanden las células en cultivo y después se clonan. En las células individuales en los clones, puede después examinarse la modificación genética deseada. Convenientemente, puede utilizarse PCR para identificar que ha tenido lugar la modificación, deleción o integración deseada.

Las modificaciones genéticas pueden ser una modificación sencilla o, si se desea, después de la expansión de células que tienen la primera modificación, las células pueden someterse después a una segunda modificación. Por ejemplo, después de reemplazar las regiones constantes de cadena pesada, pueden reemplazase las regiones constantes de cadena ligera.

Cuando aparece una modificación individual, puede utilizarse un solo marcador para selección positiva y utilizarse repetidamente el mismo marcador. Cuando se generan dos o más modificaciones en la misma célula, deberían utilizarse diferentes marcadores de selección positiva para seleccionar independientemente en cada etapa. Como ya se indicó, existen numerosos genes de resistencia a antibióticos, dichos genes pueden utilizarse en combinación, permitiendo la selección en cada etapa. Los genes útiles para selección incluyen neo, tet, cam, tk, pen, mtx, etc. Después de haber modificado las células hospedadoras y demostrado que tienen la modificación deseada, pueden fusionarse después las células con células unitarias de transferencia nuclear enucleadas, por ejemplo, oocitos o células madre embriónicas, células que son totipotentes y capaces de formar un neonato funcional. La fusión se realiza según técnicas convencionales que están bien establecidas. Véase, por ejemplo, Cibelli et al., Science (1998), 280: 1256. Como alternativa, la enucleación de oocitos y la transferencia nuclear pueden realizarse mediante microcirugía utilizando pipetas de inyección. (Véase, por ejemplo, Wakayama et al., Nature (1998) 394: 369). Las células huevo funcionales resultantes se cultivan después en un medio apropiado y se transfieren a recipientes sincronizados.

Otro método para producir células unitarias de transferencia nuclear es introducir constructos de ADN que comprenden transgenes humanos en huevos fertilizados. Los huevos pueden expandirse después proporcionando células madre embriónicas, en las que se examina la modificación genética deseada y la posterior transferencia embriónica a madres de crianza, donde los huevos se llevan a término, y en los neonatos resultantes se examina el genotipo modificado.

Los hospedadores mutados resultantes pueden utilizarse entonces para criar con otros hospedadores mutados. Por ejemplo, pueden criarse hospedadores con un locus de inmunoglobulina de cadena pesada alterada con hospedadores que tienen un locus de inmunoglobulina de cadena ligera alterada para criar un hospedador capaz de producir inmunoglobulinas polipeptídicas sustancialmente humanas. Los hermanos hemicigóticos que contienen los dos genes mutados se crían después para producir hermanos homocigóticos. La homocigosidad puede determinarse fácilmente por la ausencia de las secuencias génicas indeseadas. Después de cada crianza, se ensaya en el hospedador la presencia de la modificación genética en sus células, particularmente las células germinales, y puede criarse una generación adicional, habitualmente no más de tres generaciones, para asegurar que la modificación se mantiene establemente a lo largo de generaciones sucesivas. Puede analizarse en los genomas de las diversas progenies el mantenimiento de las modificaciones genéticas o, según sea apropiado, puede analizarse en la progenie el cambio biológico que generó la modificación genética.

Una vez se ha generado el hospedador, puede utilizarse ahora el hospedador para producir antisuero en una variedad de condiciones. Dependiendo del uso del antisuero, pueden utilizarse antígenos, inmunógenos que comprenden un hapteno unido covalentemente a un antígeno, organismos, por ejemplo, virus y organismos unicelulares vivos, atenuados o muertos, fragmentos de organismos, orgánulos, células, particularmente células humanas o fragmentos de células, o similares. Por tanto, el antisuero puede dirigirse a un antígeno, una molécula orgánica pequeña o una célula, pudiendo ser las diversas entidades endógenas o exógenas al hospedador humano. La composición de inmunización puede administrarse de cualquier manera conveniente, con o sin un coadyuvante, y puede administrarse según un esquema predeterminado. La afinidad por la composición de inmunización puede monitorizarse después, y recogerse el antisuero cuando el antisuero tenga la especificidad y afinidad deseadas. La afinidad del antisuero será generalmente de al menos aproximadamente 10^{-7}, habitualmente al menos aproximadamente 10^{-8}, preferiblemente al menos aproximadamente 10^{-9} o mayor.

Para algunas aplicaciones, pueden utilizarse hospedadores en los que el elemento V proximal a las regiones D se ha reemplazado por diversos elementos de región V humana. De este modo, se obtendrán diferentes respuestas inmunes al mismo inmunógeno por los diferentes hospedadores, pudiendo estar proporcionando la región de secuencia variable diferentes alelos como resultado de la conversión génica. Los antisueros de los diferentes hospedadores pueden mezclarse para proporcionar un repertorio más amplio de anticuerpos. Pueden emplearse hasta 10 o más hospedadores diferentes, dependiendo del antígeno de interés.

Las preparaciones de anticuerpos se obtienen fraccionando sangre de animales modificados por ingeniería genética que expresan inmunoglobulinas de secuencia humana. Puede prepararse una fracción de inmunoglobulina concentrada mediante cromatografía (afinidad, intercambio iónico, permeación sobre gel, etc.), precipitación selectiva con sales tales como sulfato de amonio, disolventes orgánicos tales como etanol o polímeros tales como polietilenglicol.

Los anticuerpos fraccionados pueden disolverse o diluirse en medios no tóxicos no pirógenos adecuados para administración intravenosa a seres humanos, por ejemplo, solución salina tamponada estéril. En algunas aplicaciones, las preparaciones de anticuerpos pueden aplicarse directamente al epitelio. Para dichas aplicaciones, los anticuerpos fraccionados pueden disolverse en un gel soluble en agua tal como gelatina KY y similares.

Las preparaciones de anticuerpos utilizadas para administración se caracterizan generalmente por contener una población de anticuerpos policlonales que tienen concentraciones de inmunoglobulina de 0,1 a 100 mg/ml, más habitualmente de 1 a 10 mg/ml. La preparación de anticuerpos puede contener inmunoglobulinas de diversos isotipos. Como alternativa, la preparación de anticuerpos puede contener anticuerpos de sólo un isotipo, o una serie de isotipos seleccionados.

En la mayoría de los casos, la preparación de anticuerpos consistirá en inmnoglobulinas no modificadas. Como alternativa, la fracción de inmunoglobulina puede someterse a tratamiento tal como digestión enzimática (por ejemplo, con pepsina, papaína, plasmina, glicosidasas, nucleasas, etc.), calentamiento, etc., y/o fraccionarse adicionalmente.

Las preparaciones de anticuerpo se administran generalmente al sistema vascular, convenientemente por vía intravenosa mediante inyección o infusión a través de un catéter implantado en una vena apropiada. La preparación de anticuerpos se administra a una velocidad apropiada, generalmente en el intervalo de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 24 horas, más habitualmente de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 6 horas, según la velocidad a la que el líquido pueda aceptarse por el paciente. La administración de la dosificación eficaz puede tener lugar en una sola infusión o en una serie de infusiones. Pueden administrarse infusiones repetidas una vez al día, una vez a la semana, una vez al menos o una vez cada tres meses, dependiendo de la semivida de la preparación de anticuerpos y de la indicación clínica. Para aplicaciones sobre superficies epiteliales, las preparaciones de anticuerpo se aplican a la superficie necesitada de tratamiento en una cantidad suficiente para proporcionar el resultado final pretendido, y pueden repetirse en caso necesario.

Las preparaciones de anticuerpos encuentran uso por su capacidad de unirse a y neutralizar entidades antigénicas en tejidos del cuerpo humano que causan enfermedades o que desencadenan respuestas inmunes indeseadas o anormales. Una "entidad antigénica" se define en la presente memoria por abarcar cualquier molécula soluble o unida a la superficie celular, incluyendo proteínas, así como células u organismos causantes de enfermedades infecciosas o agentes que son al menos capaces de unirse a un anticuerpo y preferiblemente son también capaces de estimular una respuesta inmune.

La administración de una preparación de anticuerpos frente a un agente infeccioso como monoterapia o en combinación con quimioterapia da como resultado la eliminación de partículas infecciosas. Una sola administración de anticuerpos reduce el número de partículas infecciosas generalmente de 10 a 100 veces, más habitualmente más de 1.000 veces. De forma similar, la terapia con anticuerpos en pacientes con enfermedades malignas como monoterapia o en combinación con quimioterapia reduce el número de células malignas generalmente de 10 a 100 veces, o más de 1.000 veces. La terapia puede repetirse durante un periodo extendido de tiempo para asegurar la eliminación completa de partículas infecciosas, células malignas, etc. En algunos casos, la terapia con preparaciones de anticuerpos continuará durante periodos extendidos de tiempo en ausencia de cantidades detectables de partículas infecciosas o células indeseables. De forma similar, el uso de terapia de anticuerpos para la modulación de las respuestas inmunes puede consistir en administraciones únicas o múltiples de anticuerpos terapéuticos. La terapia puede continuarse durante periodos extendidos de tiempo en ausencia de cualquier síntoma de enfermedad.

El tratamiento en cuestión puede emplearse junto con quimioterapia a dosificaciones suficientes para inhibir enfermedades infecciosas o malignidades. En pacientes con enfermedad autoinmune o receptores de transplantes, la terapia de anticuerpos puede emplearse junto con terapia inmunosupresiva a dosificaciones suficientes para inhibir las reacciones inmunes.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.

Parte experimental Generación de conejos transgénicos que expresan inmunoglobulina sustancialmente humana

Se integran los exones que codifican elementos de región constante y elementos de región variable humanas en el genoma de fibroblastos de conejo mediante recombinación homóloga. Se transfectan los fibroblastos de conejo con diversos constructos de ADN linealizados que contienen elementos de locus de inmunoglobulina humana. Se seleccionan las células transfectadas exitosamente y se utilizan para la clonación de conejos.

Clonación de conejos

Se hacen superovular conejas Dutch Belton maduras mediante inyección subcutánea de hormona estimulante de folículo (FSH) cada 12 horas (0,3 mg x 2 y 0,4 mg x 4). Se induce la ovulación mediante la administración intravenosa de 0,5 mg de hormona luteinizante (LH) 12 horas después de la última inyección de FSH. Se recuperan los oocitos mediante lavado oviductal 17 horas después de la inyección de LH. Se enuclean mecánicamente los oocitos 16-19 horas después de la maduración. Se evalúa la retirada cromosómica con tinción con bisBENZIMIDE (HOECHST 33342, Sigma, St. Louis, MO) bajo luz ultravioleta. Se fusionan los oocitos enucleados con fibroblastos en división activa utilizando un pulso eléctrico de 180 V/cm durante 15 \mus (Electrocell Manipulator 200, Genetronics, San Diego, CA). Después de 3-5 horas, se activan químicamente los oocitos con ionóforo de calcio (6 \muM) durante 4 min (nº 407952, Calbiochem, San Diego, CA) y 6-dimetilaminopurina 2 mM (DMAP, Sigma) en medio CR2 (Specialty Media, Lavalett, NJ) con albúmina de suero bovino 3 mg/ml (exenta de ácidos grasos, Sigma) durante 3 horas. Después de la activación, se lavan los embriones con medio de cultivo de embrión de hámster (HECM)-Hepes cinco veces y posteriormente se cultivan en medio CR2 que contiene 3 mg/ml de BSA exenta de ácidos grasos durante 7 días a 37,8ºC y 5% de CO_{2} en el aire. Se transfieren después los embriones a recipientes sincronizados. Se analiza en la progenie mediante PCR un segmento del transgén.

Unión de anticuerpos humanos expresados en conejos a antígeno de superficie de hepatitis B

Se inmunizan por vía intramuscular conejos modificados por ingeniería genética (como se describe anteriormente) con antígeno de superficie de hepatitis B purificado (HBsAg) (10 \mug en coadyuvante incompleto de Freund) el día 0 y el día 14. El día 28, se toma sangre a los animales de la oreja y se prepara suero. Se recubren placas ELISA (NUNC, Dinamarca) con HBsAg 1 \mug/ml en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, se bloquean los sitios de unión disponibles mediante incubación con leche desecada desnatada al 1% (NFM) en PBS (300 \mul/pocillo). Se diluye el suero de conejo en PBS/1% de NFM y se añade a los pocillos recubiertos. Después de una incubación de 1 hora, se lavan las placas 3 veces con PBS/0,05% de Tween 20 y se detecta la Ig unida utilizando Ig de cabra anti-humana conjugada con peroxidasa de rábano picante. Se detecta el anticuerpo de cabra conjugado utilizando diclorhidrato de o-fenilendiamina (Sigma) a 1 mg/ml. Se detiene la reacción colorimétrica mediante la adición de una solución de HCl 1 M y se mide la absorbancia a 490 nm. Como control, se utiliza suero de conejos no inmunizados. El suero de conejos no inmunizados no reacciona con HBsAg. A una dilución de 1:100, la densidad óptica medida en pocillos no recubiertos y recubiertos con HBsAg está por debajo de 0,4. En contraposición, el suero de conejos inmunizados contiene anticuerpos sustancialmente humanos reactivos con HBsAg. A una dilución de suero de 1:100, la densidad óptica medida es 2,8. Tras una dilución posterior del suero, la densidad óptica medida se reduce a 0,2 (a una dilución de 25.600). No pueden detectarse anticuerpos reactivos con un conjugado de IgG-HRP de cabra anti-conejo. Esto demuestra que los conejos modificados por ingeniería genética producen anticuerpos anti-HBsAg sustancialmente humanos después de inmunización.

Citotoxicidad mediada por complemento de estirpes celulares de infección vírica utilizando anticuerpos humanos

Se marca con 0,1 mCi de ^{51}Cr en 100 \mul de PBS durante 1 h a 37ºC una estirpe celular de carcinoma hepático humano que expresa HBsAg. Se incuban 2.000 células marcadas con ^{51}Cr con suero de conejos modificados por ingeniería genética que expresan inmunoglobulina anti-HBsAg (véase anteriormente). Después de 2 horas a 37ºC, se determina la liberación de ^{51}Cr en el sobrenadante midiendo la radiactividad utilizando un contador de centelleo. Para la determinación de la liberación máxima, se añade Triton X100 al 1%. Se calcula el grado de lisis celular de la siguiente manera: % de lisis= CPM experimentales \pm CPM espontáneas / CPM totales \pm CPM espontáneas. La incubación de las células marcadas con suero (diluido 1:30) de conejos no inmunizados no da como resultado la lisis celular (<10%). Sin embargo, la incubación de células con suero de conejos inmunizados causa un 80% de lisis celular. La inactivación del complemento en el suero mediante tratamiento térmico (56ºC durante 30 minutos) vuelve inactivo el suero de conejos inmunizados. Estos resultados demuestran que los anticuerpos sustancialmente humanos producidos mediante conejos modificados por ingeniería genética se unen a células positivas de HBsAg y causan una lisis dependiente del complemento.

Tratamiento de animal con infección

Se purifica inmunoglobulina sustancialmente humana del suero de conejos modificados por ingeniería genética mediante precipitación con sulfato de amonio y cromatografía de intercambio iónico. Se inyectan ratones SCID con un millón de células de carcinoma hepático humano que expresan HBsAg. Posteriormente, se inyectan por vía peritoneal 25 \mug de inmunoglobulina una vez al día. Los animales tratados con anticuerpos aislados a partir de suero de conejo no inmunizado mueren después de aproximadamente 60 días. Esto es similar a receptores no tratados de células de carcinoma hepático. En contraposición, los ratones tratados con anticuerpos aislados a partir de suero de conejo inmunizado sobreviven durante más de 150 días. Esto demuestra que los anticuerpos humanos producidos en conejos modificados por ingeniería genética son capaces de eliminar células de carcinoma humano de ratones SCID.

Resulta evidente por los resultados anteriores que utilizando conejos modificados por ingeniería genética que expresan genes de inmunoglobulina sustancialmente humanos, pueden generarse preparaciones de anticuerpos policlonales contra antígenos, partículas infecciosas, células cancerosas y similares. Dichas preparaciones de anticuerpos policlonales pueden utilizarse para tratar pacientes que padecen una enfermedad infecciosa o una malignidad. El antisuero puede utilizarse también para modular una respuesta inmune mediante la eliminación de subpoblaciones celulares, citocinas o similares. La preparación de anticuerpo humano tiene una probabilidad sustancialmente reducida de generar una respuesta inmune en pacientes humanos, comparado con antisuero heterólogo, tendrá pocos efectos secundarios y puede utilizarse con seguridad con resultados positivos.

Resultará evidente para un experto en la técnica que pueden hacerse muchos cambios y modificaciones sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (35)

1. Una composición de antisuero policlonal de un animal transgénico no humano que reconoce específicamente un inmunógeno, en la que dicha composición de antisuero comprende principalmente moléculas de proteína inmunoglobulina que comprenden al menos una porción de una región constante de cadena pesada humana, y secuencias aminoacídicas de región variable codificadas por fragmentos de más de una región variable (V), en la que (i) dichas moléculas de proteína inmunoglobulina se unen específicamente a dicho inmunógeno, y en la que (ii) dicho animal transgénico no humano genera la diversidad de anticuerpos principalmente mediante conversión génica.

2. La composición de antisuero policlonal según la reivindicación 1, en la que dicho animal transgénico no humano comprende al menos una porción de genes de inmunoglobulina de cadena pesada humana funcional que incluye más de un gen de región V integrado mediante recombinación homóloga en su genoma.

3. El antisuero policlonal según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende principalmente moléculas de proteína inmunoglobulina que comprenden al menos dos de las regiones constantes de cadena pesada humana C_{H1}, C_{H2} y C_{H3}.

4. El antisuero policlonal según la reivindicación 3, que comprende principalmente moléculas de proteína inmunoglobulina que comprenden la región constante de cadena pesada humana C_{H3}.

5. La composición de antisuero policlonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que en el genoma de dicho animal no humano el gen de la región V proximal a la región D está reemplazado por un gen de la región V humana.

6. La composición de antisuero policlonal según la reivindicación 5, que comprende antisueros de diversos animales no humanos en los que el gen de la región V proximal a la región D está reemplazado por diferentes genes de la región V humana.

7. La composición de antisuero policlonal según la reivindicación 6, que comprende antisueros de hasta 10 animales no humanos diferentes.

8. La composición de antisuero policlonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que tiene una afinidad de al menos aproximadamente 10^{-7}.

9. La composición de antisuero policlonales según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que tiene una afinidad de al menos aproximadamente 10^{-8}.

10. La composición de antisuero policlonales según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que tiene una afinidad de al menos aproximadamente 10^{-9}.

11. La composición de antisuero policlonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que dicho animal transgénico no humano es del orden de los lagomorfos.

12. La composición de antisuero policlonal según la reivindicación 11, en la que dicho animal transgénico no humano se selecciona del grupo constituido por conejo, animales ovino, bovino, canino, felino y equino.

13. La composición de antisuero policlonal según la reivindicación 12, en la que dicho animal transgénico no humano es un conejo, un cerdo, una oveja o una vaca.

14. Un animal transgénico no humano que pesa al menos 1 kg, que comprende al menos una porción de genes de inmunoglobulina de cadena pesada humana funcional integrada mediante recombinación homóloga en su genoma, en el que dicha porción de genes de inmunoglobulina de cadena pesada humana funcional se transpone en fase con genes de inmunoglobulina de cadena pesada endógenos de dicho animal no humano, codificando moléculas de anticuerpo funcional que comprenden al menos una porción de una región constante de cadena pesada humana y secuencias aminoacídicas de región variable codificadas por fragmentos de más de un gen de región variable (V), en el que dicho animal transgénico no humano genera la diversidad de anticuerpos principalmente mediante conversión génica y produce dichas moléculas de anticuerpo funcional cuando se inmuniza.

15. Un animal transgénico no humano que pesa al menos 1 kg, que comprende al menos una porción de genes de inmunoglobulina de cadena ligera humana funcional integrada mediante combinación homóloga en su genoma, en el que dicha porción de genes de inmunoglobulina de cadena ligera humana funcional se transpone en fase con genes de inmunoglobulina de cadena ligera endógenos de dicho animal no humano, codificando moléculas de anticuerpo funcional que comprenden al menos una porción de una región constante de cadena ligera humana y secuencias aminoacídicas de región variable codificadas por fragmentos de más de un gen de región variable (V), en el que dicho animal transgénico no humano genera la diversidad de anticuerpos principalmente mediante conversión génica y produce dichas moléculas de anticuerpo funcional cuando se inmuniza.

16. El animal transgénico no humano según la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en el que dicho animal transgénico no humano es del orden de los lagomorfos.

17. El animal transgénico no humano según la reivindicación 14, en el que dicha porción de genes de inmunoglobulina de cadena pesada humana funcional comprende al menos un gen de región constante.

18. El animal transgénico no humano según la reivindicación 14, en el que dichos genes de región variable comprenden el gen de región variable proximal a la región D.

19. El animal transgénico no humano según la reivindicación 15, en el que dicho gen de cadena ligera de inmunoglobulina humana codifica la cadena \kappa de inmunoglobulina.

20. Un método in vitro para neutralizar una entidad antigénica en un componente del cuerpo humano, comprendiendo dicho método: poner en contacto dicho componente del cuerpo con una composición de antisuero según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que las moléculas de proteína inmunoglobulina en la composición de antisuero se unen específicamente a y neutralizan dicha entidad antigénica.

21. El método según la reivindicación 20, en el que dicha entidad antigénica es de un organismo que causa una enfermedad infecciosa.

22. El método según la reivindicación 20, en el que dicha entidad antigénica es una molécula de superficie celular.

23. El método según la reivindicación 22, en el que dicha molécula de superficie celular es de un linfocito o un adipocito.

24. El método según la reivindicación 20, en el que dicha entidad antigénica es una citocina humana o una quimiocina humana.

25. El método según la reivindicación 20, en el que dicha entidad antigénica es una molécula de superficie celular sobre una célula cancerosa maligna.

26. El uso de una composición de antisuero según cualquiera de las reivindicaciones 1-13 para la preparación de un medicamento para neutralizar una entidad antigénica en un componente del cuerpo humano.

27. El uso según la reivindicación 26, en el que dicha entidad antigénica es de un organismo que causa una enfermedad infecciosa.

28. El uso según la reivindicación 26, en el que dicha entidad antigénica es una molécula de superficie celular.

29. El uso según la reivindicación 28, en el que dicha molécula de superficie celular es de un linfocito o un adipocito.

30. El uso según la reivindicación 26, en el que dicha entidad antigénica es una citocina humana o una quimiocina humana.

31. El uso según la reivindicación 26, en el que dicha entidad antigénica es una molécula de superficie celular sobre una célula cancerosa maligna.

32. Un método de producción de un animal transgénico no humano que comprende al menos una porción de genes de inmunoglobulina humana funcional integrada mediante recombinación homóloga en su genoma, en el que dicha porción de genes de inmunoglobulina humana funcional se transpone en fase con genes de inmunoglobulina humana endógenos de dicho animal no humano, codificando moléculas de anticuerpo funcionales que comprenden al menos una porción de regiones constantes de inmunoglobulina humana, y secuencias aminoacídicas de región variable codificadas por fragmentos de más de un gen de región variable (V), en el que dicho animal transgénico no humano genera la diversidad de anticuerpos principalmente mediante conversión génica y produce dichas moléculas de anticuerpo funcional cuando se inmuniza, comprendiendo dicho método:

producir un primer animal mutado que comprende loci de inmunoglobulina de cadena pesada, en el que genes de la región constante y/o variable están reemplazados por uno o varios exones del locus de inmunoglobulina de cadena pesada humana mediante alteración genética de un núcleo celular de dicho animal, introduciendo dicho núcleo celular en una primera célula unitaria de transferencia nuclear enucleada, proporcionando una primera célula madre embriónica, e introduciendo dicha primera célula unitaria de transferencia nuclear en un hospedador receptor hembra para producir un primer neonato mutado;

producir un segundo animal mutado que comprende loci de inmunoglobulina de cadena ligera, en el que genes de la región constante y/o variable están reemplazados por uno o varios exones del locus de inmunoglobulina de cadena ligera humana mediante alteración genética de un núcleo celular de dicho animal, introduciendo dicho núcleo celular en una segunda célula unitaria de transferencia nuclear enucleada, proporcionando una segunda célula madre embriónica, e introduciendo dicha segunda célula unitaria de transferencia nuclear en un hospedador receptor hembra para producir un segundo neonato mutado; y

criar hasta la madurez los primer y segundo neonatos mutados y seleccionar animales capaces de producir antisueros que comprenden principalmente moléculas de proteína inmunoglobulina que comprenden al menos una porción de regiones constantes de inmunoglobulina humana, y secuencias aminoacídicas de región variable codificadas por fragmentos de más de un gen de región variable (V), en el que (i) dichas moléculas de proteína inmunoglobulina se unen específicamente a dicho inmunógeno, (ii) en el que dicho animal transgénico no humano genera la diversidad de anticuerpos principalmente mediante conversión génica.

33. Un método de producción de un animal transgénico no humano que pesa al menos 1 kg, que comprende al menos una porción de genes de inmunoglobulina humana funcional integrada mediante recombinación homóloga en su genoma, en el que dicha porción de genes de inmunoglobulina humana funcional se transpone en fase con genes de inmunoglobulina humana endógenos de dicho animal no humano, codificando moléculas de anticuerpo funcionales que comprenden secuencias aminoacídicas de región variable codificadas por fragmentos de más de un gen de región variable (V), en el que dicho animal transgénico no humano genera la diversidad de anticuerpos principalmente mediante conversión génica y produce dichas moléculas de anticuerpo funcional cuando se inmuniza, comprendiendo dicho método:

producir un animal mutado que comprende loci de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera en los que genes de la región constante y/o variable están reemplazados por uno o varios exones del locus de inmunoglobulina de cadena pesada y/o ligera humana mediante alteración genética de un núcleo celular de dicho animal, introduciendo dicho núcleo celular en una célula unitaria de transferencia nuclear enucleada, proporcionando una célula madre embriónica, e introduciendo dicha célula unitaria de transferencia nuclear en un hospedador receptor hembra para producir un neonato mutado; y

criar hasta la madurez los neonatos mutados y seleccionar animales capaces de producir antisueros que comprenden principalmente moléculas de proteína inmunoglobulina que comprenden al menos una porción de una región constante de cadena pesada humana, y secuencias aminoacídicas de región variable codificadas por fragmentos de más de un gen de región variable (V), en el que (i) dichas moléculas de proteína inmunoglobulina se unen específicamente a dicho inmunógeno, y (ii) en el que dicho animal transgénico no humano genera la diversidad de anticuerpos principalmente mediante conversión génica.

34. El método según la reivindicación 33 o la reivindicación 34, en el que dicho animal es del orden de los lagomorfos.

35. El método según la reivindicación 33 o la reivindicación 34, en el que dicho animal comprende un gen de región variable proximal a la región D.