ES2157295T5

ES2157295T5 - Metodo para diagnosticar trastornos de la coagulacion de la sangre.

Info

Publication number: ES2157295T5
Application number: ES95304016T
Authority: ES
Inventors: Kenneth William Ernest Denson
Original assignee: Diagnostic Reagents Ltd
Current assignee: Diagnostic Reagents Ltd
Priority date: 1994-12-23
Filing date: 1995-06-09
Publication date: 2005-07-01
Anticipated expiration: 2015-06-09
Also published as: ATE200710T1; DE69520725T2; EP0718628A1; EP0718628B1; ES2157295T3; EP0718628B2; DE69520725T3; DE69520725D1

Abstract

SE PROPORCIONA UN METODO Y UN ACCESORIO PARA CRIBAR UN PLASMA SANGUINEO PARA UN COFACTOR APC. EL METODO COMPRENDE: (I) INCUBAR UNA PRIMERA PORCION DE LA MUESTRA CON (A) UN REACTIVO EXOGENO QUE CONTENGA FOSFOLIPIDO QUE ACTIVE EL MECANISMO DE CONTACTO EN LA COAGULACION INTRINSECA O UN REACTIVO EXOGENO QUE INICIE LA COAGULACION EXTRINSECA; E INCUBACION DE UNA SEGUNDA PORCION DE LA MUESTRA CON (B) EL REACTIVO DEL PASO (I) (A) Y UN ACTIVADOR DE PROTEINA C (PC) EXOGENA QUE PRODUZCA PC ACTIVADO (APC) A PARTIR DE LA PROTEINA C Y LA PROTEINA S ENDOGENO. (II) AÑADIR A CADA UNA DE LAS DOS PORCIONES UN AGENTE DE COAGULACION Y MONITORIZAR LA VELOCIDAD DE CONVERSION DE FIBRINOGENO A FIBRINA INSOLUBLE; Y (III) CALCULAR EL INDICE DE TIEMPO VELOCIDAD DE SEGUNDA PORCION DE LA MUESTRA CON LA VELOCIDAD DE LA PRIMERA PORCION Y COMPARAR ESTE INDICE CON EL INDICE CORRESPONDIENTE DE MUESTRAS DE SUJETOS NORMALES.

Description

Método para diagnosticar trastornos de la coagulación de la sangre.

La presente invención se refiere a un nuevo método útil para los estudios de detección y el diagnóstico de enfermedades tromboembólicas, tales como la trombofilia hereditaria. La invención se puede utilizar también para determinar el riesgo de trombosis en mujeres embarazadas, pacientes sometidos a cirugía y sujetos que toman fármacos anticonceptivos.

La coagulación de la sangre comprende un sistema complejo de proenzimas, enzimas y cofactores interrelacionados que reaccionan en las superficies de las plaquetas activadas y las células endoteliales. Cuando el sistema se activa el resultado final es la formación de un coágulo sanguíneo que contiene fibrina insoluble. La iniciación y la terminación de la formación de fibrina está cuidadosamente regulada en la homeostasis normal. In vitro, las superficies de las plaquetas y las células endoteliales se sustituyen habitualmente con fosfolípidos adecuados. Para la invención, la parte relevante del sistema de coagulación es la que se muestra a continuación:

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1

La Proteína C es un zimógeno que puede ser activado in vitro por la trombina (Factor IIa) sola, la combinación trombina-trombomodulina, una fracción de ciertos venenos de serpientes tales como Agkistrodon Contortrix Contortrix o el Factor Xa purificado. La activación de la Proteína C endógena de una muestra de plasma o la adición de Proteína C activada de forma exógena a una muestra de plasma en presencia de Proteína S (PS) y el cofactor de la Proteína C Activada (abreviada APC, del inglés Activited Protein C) neutraliza los Factores Va y VIIIa y conduce a tiempos de coagulación sanguínea prolongados en las muestras de plasma de individuos sanos. Los Factores V y VIII se activan mediante pequeñas cantidades de trombina o Factor Xa. La Proteína S es un cofactor de la Proteína C. Se encuentran deficiencias homocigóticas o heterocigóticas hereditarias en Proteína C, Proteína S y Antitrombina III (ATIII, un inhibidor de los factores XIa, IXa, Xa y Trombina) en aproximadamente 10 - 15% de los pacientes con enfermedad tromboembólica diagnosticada antes de los 40 años. Las deficiencias homocigóticas en las Proteínas C y S suponen una amenaza para la vida y los individuos afectados desarrollan trombosis microvascular generalizada y púrpura fulminante en el período neonatal.

Las deficiencias en las Proteínas C y S y en ATIII se miden tanto por métodos funcionales como inmunológicos. Un medio de determinar la actividad de la Proteína C funcional implica las etapas de mezclar la muestra de plasma a ensayar con un exceso de plasma humano deficiente en Proteína C, añadir un activador de la Proteína C y controlar la adecuada conversión del sustrato. Se han utilizado sustratos alternativos para enzimas tales como la trombina y el Factor Xa; sus actividades están influenciadas por la actividad de la Proteína C activada (es decir, las actividades enzimáticas que son generadas o moduladas por la APC). En determinados casos los ensayos con Proteína C han implicado el aislamiento del zimógeno y la subsecuente activación y adición al sustrato de la forma activada.

Para determinar la actividad funcional de la Proteína S en una muestra de plasma el método más común implica mezclar la muestra de plasma con Proteína C activada, un exceso de plasma deficiente en Proteína S y otros reactivos necesarios para conseguir la coagulación (Waart et al., Thromb. Res. 48, 427-37 (1987); Suzuki et al., Thromb. Res. 49, 241-51 (1988); Bertina et al., Thromb. Haemost. 53, 268-72 (1985); y Comp et al., J. Clin. Invest. 74, 2084-88 (1984)). Se ha sugerido también medir la Proteína S incubando la muestra de plasma con Factor IXa y Proteína C activada y midiendo el tiempo de coagulación o la conversión de un sustrato cromogénico de la trombina (Documento WO-A-9101382).

Además de las anormalidades de la Proteína C y la Proteína S se ha demostrado (Dahlback B, Carlsson M y Svensson BJ. Proc. Natl Acad Sci 1993; 90:1004-08) que la anormalidad más común en la trombofilia hereditaria implica al cofactor de la APC.

Este cofactor forma parte de la molécula del Factor V acelerador, que forma con la APC un inhibidor que destruye el Factor Va y el Factor VIIIa, regulando así el mecanismo de la coagulación y previniendo la trombosis. La anormalidad en la molécula del Factor V que predispone a la trombosis se debe habitualmente a una mutación de transición que tiene como resultado la sustitución de la Arg^{506} por Gln^{506}, conocida como Factor V Leiden.

En la publicación anteriormente citada de Dahlback et al. se describía una prueba in vitro específica para la detección del cofactor de la APC en muestras de plasma humano tal como se indica a continuación:

Una muestra de plasma obtenida del sujeto se incubó durante 5 minutos con

(a): un reactivo exógeno (1) que activa el mecanismo de coagulación intrínseco seguido de la adición de cloruro cálcico (2) para completar la reacción de coagulación, y separadamente con

(b): el mismo reactivo exógeno (1) en el cual la reacción de coagulación se completó mediante la adición de cloruro cálcico que contenía una preparación exógena de APC (3).

La etapa (a) se conoce como un tiempo de tromboplastina parcial activada (abreviado APTT debido a su expresión en inglés Activated Partial Thromboplastin Time) normal. La etapa (b) es un APTT con la adición de APC. Éste último elude el mecanismo inhibitorio que implica a la Proteína C y la Proteína S. Los tiempos de coagulación de una muestra en la etapa (a) variarán entre 25 segundos y 45 segundos dependiendo del tipo de agente activador exógeno (reactivo de APTT). En presencia del cofactor normal de la APC el tiempo de coagulación en la etapa (b) se prolongará. Dahlback expresó esto como una relación entre b/a, que es una relación APC.APTT/APTT. En las personas normales la relación varía de 2,0 a 4,0 y en los pacientes con defectos heterocigóticos u homocigóticos en el cofactor de la APC la relación es menor que 2,0. Así, para el diagnóstico de los diversos defectos en la trombofilia en los que está implicada la Proteína C es necesario llevar a cabo tres ensayos separados: un ensayo de Proteína C, un ensayo de Proteína S y un ensayo del cofactor de la APC. El ensayo del cofactor de la APC solo no detectará la presencia o ausencia de PS y
PC.

Para medir correctamente la relación APC.APTT/APTT en pacientes que reciben tratamiento para trombofilia, se ha propuesto, por ejemplo por Jorquera et al., Lancet 1994, vol. 344, pag. 1162-3, diluir la muestra de plasma 1:5 en plasma empobrecido en Factor V.

La Proteína C puede ser activada por una fracción del veneno de la serpiente A. Contortrix Contortrix, que es conocido como un activador de la Proteína C (abreviado PCA, del inglés Protein C Activator), y cuando se añade PCA a plasma normal, el mecanismo inhibidor en el que están implicadas la PC, la PS y el cofactor de la APC se inicia mediante la PC, la PS y el cofactor de la APC endógenos. El documento WO 94/17415 describe un ensayo para la actividad de la APC que es similar al ensayo del cofactor de la APC arriba descrito extraído de la publicación de Dahlback et al., excepto en que se añade una mezcla de PCA - cloruro cálcico para completar la reacción de coagulación en lugar de una mezcla de APC - cloruro cálcico. El documento EP-0236985 describe un método espectrofotométrico para la determinación de la actividad de la Proteína C o de la Proteína S en una muestra de plasma basado en la medida de la cantidad de trombina producida en la activación de Proteína C endógena con un PCA exógeno.

La presente invención proporciona un ensayo de la presencia o ausencia del cofactor de la APC en muestras de plasma humano en las que los niveles de PC y PS son normales según los ensayos. Detectará también defectos homocigóticos de PC y PS y la mayor parte, aunque no todos, los defectos heterocigóticos en la PC. Las muestras analizadas son de plasma humano.

La invención proporciona un método de detección in vitro para la exclusión de trastornos en el cofactor de la APC como causa de trombofilia en un sujeto, como por ejemplo un sujeto humano, o para determinar el riesgo de desarrollar trombofilia en un sujeto.

De acuerdo con la invención, se proporciona un ensayo de la deficiencia en el cofactor de la APC para determinar si una muestra de plasma sanguíneo en la que los niveles de proteína C y proteína S son normales según los ensayos es deficiente en el cofactor de la APC, que comprende:

(i): incubar una primera porción de la muestra, preferiblemente a 37ºC, con

a): un reactivo exógeno que contiene un fosfolípido que activa el mecanismo de contacto en la coagulación intrínseca (un reactivo de APTT) o un reactivo exógeno que inicia la coagulación extrínseca (un reactivo de tiempo de protrombina (PT, del inglés Prothrombine Time)), e incubar una segunda porción de la muestra con

b): el reactivo de la etapa (i) (a) y un activador exógeno de la Proteína C (PC) que produce PC activada (APC) a partir de Proteína C y Proteína S endógenas;

luego (ii)

\;

añadir a cada una de las dos porciones incubadas un agente coagulante, tal como una sal divalente o trivalen-{}\hskip1,5cm te, preferiblemente cloruro cálcico, y controlar la velocidad de conversión del fibrinógeno en fibrina insolu-{}\hskip1,5cm ble por ejemplo manualmente o con un instrumento mecánico, fotoeléctrico o nefelométrico; y

(iii): calcular la relación entre la velocidad de conversión en la segunda porción de la muestra y la velocidad de conversión en la primera porción y comparar esta relación con la relación correspondiente a las muestras de sujetos normales.

: Se alude a esta relación como la relación PCA.APTT/APTT o la relación PCA.PT/PT.

La invención es un método in vitro utilizado como un ensayo de detección para eliminar defectos en el cofactor de la APC que podrían dar lugar a la trombofilia. Los defectos en el cofactor de la APC tienen una probabilidad de aparición menor que 5% en la población normal. Se cree que el método de la invención exhibe una discriminación mayor que los ensayos de la técnica anterior, tales como el ensayo del cofactor de la APC.

Se ha encontrado que la relación PCA.APTT en individuos normales es superior a 2,0 y puede llegar hasta 10,0, mientras que las relaciones PCA.APTT en caso de defectos en el cofactor de la APC varían entre 2,0 y 1,0. Estos valores pueden presentar ligeras variaciones con diferentes reactivos de APTT y diferentes instrumentos, y el límite inferior de normalidad puede ser una relación de 2,2 a 2,5.

La invención proporciona también un ensayo de mayor grado de definición para la resistencia a la APC. Un problema potencial con la prueba del cofactor de la APC es que los pacientes con trombofilia pueden recibir una terapia anticoagulante que conduce a la reducción de los Factores II, IX y X. Esto da como resultado que la prueba del cofactor de la APC descrita anteriormente muestre una relación PCA.APTT/APTT o una relación PCA.PT/PT mayor de la que debería mostrar, dando lugar a un diagnóstico erróneo potencial de los pacientes resistentes a la APC como normales. De acuerdo con este segundo aspecto de la invención, los Factores II, IX y X se normalizan en la muestra de plasma (que puede ser resistente o sensible a la APC) diluyéndola con plasma empobrecido en Factor V. Además, la dilución con Factor V normaliza los niveles de PC y PS en la muestra diluida, independientemente de los niveles en la muestra sin diluir. Preferiblemente, el plasma se diluye 1:5 ó 1:10 con el plasma empobrecido en Factor V. La relación PCA.APTT/APTT o PCA.PT/PT se determina entonces en consonancia con el aspecto amplio de la invención descrito más arriba.

La actividad como cofactor de la APC y la actividad como coagulante del Factor V forman parte ambas de la molécula del Factor V y se encuentran ausentes, por tanto, del plasma empobrecido en Factor V. En consecuencia, la dilución mantiene en la muestra de plasma el equilibrio entre el Factor V coagulante y el cofactor de la APC anticoagulante.

Los factores intrínsecos de coagulación y la PC y la PS están al mismo nivel aproximadamente en cualquier muestra diluida; así, el intervalo de valores de PCA.APTT/APTT o PCA.PT/PT observado en las muestra de plasma de pacientes normales es más estrecho que el intervalo correspondiente en los ensayos en los que se usa plasma no diluido.

El reactivo exógeno de APTT utilizado en la etapa (i) (a) puede incluir sílice micronizada (preferiblemente a concentraciones de alrededor de 0,06% en agua y tampón), caolín (preferiblemente a concentraciones que varían de 0,25 a 10 mg/ml), bentonita, ácido elágico o cualquier sustancia que active el mecanismo de contacto de la coagulación intrínseca, o bien cualquier líquido comercial o reactivo de APTT liofilizado. El fosfolípido puede ser un sustituto de las plaquetas tal como un extracto de cerebro o un fosfolípido relativamente puro.

El reactivo de PT exógeno utilizado en la etapa (i) (a) implicado en la ruta extrínseca puede ser tromboplastina de cerebro bovino o cualquier otro tipo de órgano que dé lugar a un tiempo de coagulación prolongado con plasma normal en presencia de PCA. Preferiblemente, el reactivo de PT es el sobrenadante resultante de centrifugar, preferiblemente a alrededor de 500 g, una solución al 4% de cerebro bovino deshidratado en acetona y activado en solución salina. La tromboplastina humana o la de conejo no son satisfactorias.

El activador de Proteína C utilizado en la etapa (i) (b) puede provenir de componentes humanos o animales o de fracciones de venenos de serpiente o ser cualquier otro activador exógeno de la Proteína C. El PCA utilizado en la etapa (i) (b) se combina con activador exógeno en forma líquida o liofilizada. Los autores de la invención utilizaron una fracción de A. Contortrix Contortrix (Exner T y Vaasjoki R. Thromb. Haemost. 59:40-44 (1988)). La concentración preferida de activador de la PC oscila de 0,25.10^{-8} M a 2,5.10^{-8} M, siendo lo más preferible 1,25-10^{-8} M.

La dilución óptima en el reactivo de APTT o PT es la que da lugar en la etapa (ii), efectuada sobre el producto de la etapa (i) (b), a la prolongación máxima del tiempo de coagulación de plasma normal mezcla de muestras de distintos orígenes. Se pueden usar concentraciones más altas o más bajas pero en ambos casos los tiempo de coagulación son más cortos, las relaciones referentes al PCA son más bajas y la sensibilidad es menor.

Preferiblemente, los reactivos están en forma liofilizada y se reconstituyen con agua u otro diluyente.

El cloruro cálcico de la etapa (ii) está, de forma opcional, a 25 mM, pero se pueden utilizar concentraciones de 10 mM a 50 mM. Las concentraciones por encima de 25 mM pueden ser inhibitorias y las concentraciones por debajo de 10 mM pueden ser insuficientes para que tenga lugar la coagulación. Se pueden incorporar magnesio y otros cationes divalentes y trivalentes.

En la técnica anterior, se utiliza solución salina en la preparación de la porción de muestra en la cual se mide el tiempo APC.APTT. Se prefiere la utilización de solución salina tanto en la medida del APTT como en la del PCA.APTT para asegurar que los tiempos de coagulación observados sean debidamente comparables. Preferiblemente, la concentración de la solución salina varía entre 0,075 M y 0,15 M.

Preferiblemente, el reactivo exógeno contiene de 0,01 a 0,2%, preferiblemente 0,04%, de fosfolípido sin tratar. El tiempo de incubación óptimo en (i) es de 5 a 10 minutos tanto para el reactivo de APTT como para el de PT, pero se pueden utilizar tiempos de hasta 2 minutos como límite inferior y de hasta 15 minutos como límite superior. Tiempos de incubación más prolongados pueden dar lugar al deterioro de los componentes de la muestra de plasma.

También de acuerdo con la invención se proporciona un kit para llevar a cabo el método de la invención que contiene un reactivo de APTT o un reactivo de PT y, de forma separada, el mismo reactivo con un activador de la PC. El kit contiene además un agente de coagulación, preferiblemente una sal divalente o trivalente, siendo lo más preferible cloruro cálcico. Preferiblemente, el kit contiene cloruro sódico, que se puede combinar con el activador de coagulación. La concentración preferida de la solución de cloruro sódico varía entre 0,075 M y 0,15 M.

Ejemplo

Un APTT llevado a cabo con y sin la inclusión del reactivo PCA.

Método

Es preferible la sangre tratada con citrato pero se pueden usar como anticoagulantes oxalato o EDTA. El plasma se obtiene por centrifugación a 3000 g. Los autores de la invención han llevado a cabo el ensayo de forma manual y, en el modo APTT, con el instrumento ACL del Instrumentation Laboratory, Milán, Italia. Se pueden utilizar otros instrumentos comerciales. Se va a describir el método manual.

Método (i): Se coloca plasma (0,1 ml) en un tubo de coagulación a 37ºC, seguido por el reactivo de APTT (reactivo de APTT Diagen de sílice micronizada, Thame, Oxon, Reino Unido) (0,1 ml). Los contenidos se mezclan e incuban durante 5 minutos. Se añade entonces una mezcla de 1 parte de cloruro cálcico 50 mM y una parte de solución salina fisiológica (0,15 M) (0,1 ml) y se determina el tiempo de coagulación mediante el método del tubo de inclinación variable. Éste es el APTT normal; los tiempos de coagulación normales varían entre 30 segundos y 45 segundos. El ensayo se repite con el mismo reactivo de APTT que contiene PCA a 1,25.10^{-8} M (reactivo de PCA.APTT Diagen). El tiempo normal de coagulación oscilará entre 65 y 300 segundos y al dividirlo por el APTT normal, dará relaciones de 2,0 a 10,0.

Método (ii): Se coloca plasma (0,1 ml) en un tubo de coagulación a 37ºC seguido por tromboplastina bovina (tromboplastina bovina Diagen, Thame, Oxon, Reino Unido) (0,1 ml). Los contenidos se mezclan e incuban durante 5 minutos. Se añade entonces cloruro cálcico 25 mM (0,1 ml) y se determina el tiempo de coagulación por el método del tubo de inclinación variable. Éste es tiempo normal de protrombina (PT); los tiempos normales de coagulación varían entre 27 segundos y 42 segundos. El ensayo se repite con el mismo reactivo de tromboplastina bovina que contiene PCA a 2,5.10^{-8} M (reactivo PCA de tromboplastina bovina Diagen). El tiempo de coagulación con PCA oscilará entre 45 y 60 segundos y, al dividirlo por el PT normal, dará relaciones de 1,6 a 2,5.

Ha de preferirse el método (i) debido al mayor incremento en los tiempos de coagulación en presencia de PCA. Esto confiere mayor sensibilidad en la detección de anormalidades.

Resultados experimentales

Se analizaron con el ensayo del PCA.APTT y con el ensayo del cofactor de la APC de Chromogenix (Quadratech, Epsom, Surrey, Reino Unido) muestras de plasma de cuatro pacientes con defectos conocidos en el cofactor de la APC, 57 muestras de plasma normal y 58 muestras consecutivas de pacientes que requerían la detección de una posible trombofilia. El límite del intervalo de anormalidad para ambos ensayos se fijó en un valor para la relación de 2,1 o inferior. Los cuatro individuos con defectos conocidos en el cofactor de la APC dieron relaciones menores que 2,1 con ambos ensayos. De las 57 muestras de plasma normal, tres dieron relaciones menores que 2,1 con ambos ensayos, indicando un defecto en el cofactor de la APC. De los 58 pacientes sometidos a detección de una posible trombofilia, tres dieron relaciones menores que 2,1 con ambos ensayos, cuatro dieron relaciones menores que 2,0 con el ensayo de PCA.APTT, pero relaciones de 2,1, 2,2, 2,4 y 2,6 con el ensayo de APC.APTT. Los cuatro mostraron una PC normal. Se sospechó que estas muestras podían ser heterocigóticas para el defecto en el cofactor de la APC; el DNA genómico obtenido de tres de estos pacientes se sometió a amplificación mediante el método de la reacción en cadena de la polimerasa y resultaron ser heterocigóticos para la mutación del Factor V Leiden. La muestra de un paciente dio una relación de 2,5 con la prueba de APC.APTT, pero un valor anormal de 1,7 para la relación de PCA.APTT. Un ensayo específico para la PC mostró que la muestra tenía sólo 29% de la PC media normal. Todas las demás muestras anormales tenían PC y PS normales según las pruebas. Una muestra inmuno-deprimida en PS dio una relación de APC.APTT de 1,7 y un valor de PCA.APTT de sólo 1,3. Así, el método del PCA ha demostrado detectar todos los defectos en el cofactor de la APC detectados por el método de la APC y también en la PC y la PS. Las muestras que eran normales dieron generalmente valores de las relaciones más altos con el método del PCA y siete muestras anormales de nueve dieron valores de las relaciones más bajos con el método del PCA. Esto, junto con el reconocimiento de cuatro muestras anormales extra, puede simplemente estar reflejando un mayor grado de discriminación del ensayo del PCA. El ensayo debe de mostrar ser un ensayo útil para la resistencia a la APC en la práctica hospitalaria rutinaria. El uso del ensayo de PCA.APTT puede servir también para descubrir cualesquiera otros posibles Factores o cofactores que puedan estar implicados en la formación endógena de la APC.

En los métodos de acuerdo con el segundo aspecto de la invención, cuando el paciente está o puede estar recibiendo tratamiento por trombofilia, la metodología es la misma que para el ensayo general, pero la muestra de plasma se diluye inicialmente entre 1:5 y 1:10 en plasma empobrecido en Factor V. Los valores de las relaciones PCA.APTT/APTT o PCA.PT/PT se determinan entonces de la misma manera que para el plasma sin diluir; se puede confiar en los resultados como un buen indicador de la deficiencia en el cofactor de la APC. Así, en el ejemplo precedente, la muestra de 0,1 ml de plasma contendría 20 \mul de plasma del paciente y 80 \mul de plasma empobrecido en Factor V.

Claims

1. Un ensayo de la deficiencia en el cofactor de la APC para determinar si una muestra de plasma sanguíneo en el que los niveles de proteína C y proteína S son normales según los ensayos es deficiente en el cofactor de la APC, que comprende:

(i): incubar una primera porción de la muestra con

(a): un reactivo exógeno que contiene un fosfolípido que activa el mecanismo de contacto en la coagulación intrínseca o un reactivo exógeno que inicia la coagulación extrínseca; e incubar una segunda porción de la muestra con

(b): el reactivo de la etapa (i) (a) y un activador exógeno de la Proteína C (PC) que produce Proteína C activada (APC) a partir de Proteína C y Proteína S endógenas;

luego (ii)

\;

añadir a cada una de las dos porciones incubadas un agente de coagulación y controlar la velocidad de {}\hskip1.5cm conversión del fibrinógeno en fibrina insoluble; y

(iii): calcular el valor de la relación entre la velocidad de conversión de la segunda porción de la muestra y la velocidad de conversión de la primera porción y comparar esta relación con la relación correspondiente para muestras de sujetos normales.

2. Un ensayo de la deficiencia en el cofactor de la APC que comprende las etapas (i) a (iii) de la reivindicación 1, en el que la muestra de plasma se diluye inicialmente con plasma empobrecido en Factor V.

3. Un ensayo de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la dilución de la muestra de plasma en plasma empobrecido en Factor V varía de 1:5 a 1:10.

4. Un ensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el agente de coagulación añadido en la etapa (ii) es una sal divalente o trivalente, preferiblemente cloruro cálcico.

5. Un ensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las porciones se incuban con un reactivo exógeno, en el que el cloruro sódico se añade a los productos de la etapa (i) (a) y la etapa (i) (b).

6. Un ensayo de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la concentración salina de los productos varía entre 0,075 M y 0,15 M.

7. Un ensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el reactivo de la etapa (i) (a) es un reactivo de APTT.

8. Un ensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la velocidad de conversión controlada en la etapa (ii) se controla por la formación de coágulos.

9. Un ensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el activador exógeno de la Proteína C es cualquier activador exógeno de la Proteína C o de la Proteína S.

10. Un ensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los reactivos están en forma liofilizada y se reconstituyen con agua u otro diluyente.

11. Un kit para utilizar en un ensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende:

un reactivo exógeno que contiene un fosfolípido que activa el mecanismo de contacto en la coagulación intrínseca o un reactivo exógeno que inicia la coagulación extrínseca; y, separadamente, el mismo reactivo exógeno con un activador exógeno de la Proteína C (PC) que produce PC activada (APC) a partir de Proteína C y Proteína S endógenas, y

un agente coagulante, preferiblemente una sal divalente o trivalente, siendo lo más preferible cloruro cálcico.

12. Un kit de acuerdo con la reivindicación 11 para utilizar en un ensayo de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3 o con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10 cuando dependa de la reivindicación 2 ó 3, que comprende además plasma empobrecido en Factor V.

13. Un kit de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12, en el que al menos uno de los reactivos está en forma liofilizada.

14. Un kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, que comprende un reactivo exógeno que comprende además solución de cloruro sódico.

15. Un kit de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la concentración de cloruro sódico varía entre 0,075 M y 0,15 M.

16. Un ensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o un kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en el que el reactivo exógeno contiene de 0,01 a 0,2%, preferiblemente 0,04% de fosfolípido bruto.

17. Un ensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 16 o un kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en el que el reactivo exógeno es el sobrenadante resultante de centrifugar una solución al 4% de cerebro bovino deshidratado en acetona y activado en solución salina.

18. Un ensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, 16 y 17 o un kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en el que la concentración de PCA en el reactivo exógeno que contiene PCA varía entre 0,25.10^{-8} M y 2,5.10^{-8} M, siendo preferiblemente 1,25.10^{-8} M.