ES2157920T5

ES2157920T5 - Procedimiento para recuperar un complejo factor viii/factor von willebrand inactivado de virus y de elevada pureza mediante cromatografia de intercambio anionico.

Info

Publication number: ES2157920T5
Application number: ES93902233T
Authority: ES
Inventors: Monika Stadler; Horst Schwinn
Original assignee: Octapharma AG
Current assignee: Octapharma AG
Priority date: 1992-02-01
Filing date: 1993-01-20
Publication date: 2007-12-16
Anticipated expiration: 2013-01-20
Also published as: NO942832D0; JPH07503241A; DK0625161T3; NO942832L; US5714590A; DE69330458T3; ES2157920T3; FI943545A0; KR950700925A; GR3036849T3; DK0625161T4; FI943545L; TW362099B; DE69330458T2; DE4204694C2; EP0625161A1; FI109908B; RU2096414C1; WO1993015105A1; AU670776B2

Abstract

SE DESCRIBE UN PROCESO ECONOMICO PARA LA RECUPERACION DEL FACTOR VIII DEL PLASMA SANGUINEO O CRIOPRECIPITADO. EN DICHO PROCESO, LA CROMATOGRAFIA INTERCAMBIADORA DE ANION SE REALIZA UTILIZANDO UN MATERIAL DE SEPARACION BASADO EN PORTADORES QUE CONTIENEN GRUPOS HIDROXIL, ESTANDO CUBIERTAS LAS SUPERFICIES DE TALES PORTADORES CON POLIMEROS LIGADOS COVALENTEMENTE, CONTENIENDO DICHOS POLIMEROS UNIDADES DE REPETICION REPRESENTADOS POR LA FORMULA (I) DONDE R1, R'' Y R", Y Y N ESTAN DEFINIDOS EN LA LLAMADA 1.

Description

Procedimiento para recuperar un complejo factor VIII/factor von Willebrand inactivado de virus y de elevada pureza mediante cromatografía de intercambio aniónico.

La presente invención se refiere a un procedimiento para recuperar de un crioprecipitado un complejo factor VIII/factor von Willebrand, en el que se ha detenido la actividad de los virus, sumamente puro, mediante cromatografía de intercambio aniónico.

En el documento EP-A-0 238 701 se ha descrito un procedimiento para la producción de un factor antihemofilia (AHF) no infeccioso, de elevada pureza, en el que se separan del crioprecipitado, mediante una precipitación con etanol, el fibrinógeno, las globulinas, las albúminas y otros componentes que interfieren. Es necesaria la acumulación a partir del precipitado porque el factor VIII está contenido en el material solamente en muy pequeñas cantidades. Sin embargo, esta etapa de acumulación perjudica al contenido de AHF en el producto final. Los procedimientos que se conocen hasta el momento para la producción de factor VIII solamente producen cantidades muy bajas de sustancia activa. Así, mediante la aplicación del factor VIII producido por la vía convencional, al paciente se le cargará con grandes cantidades de sustancias antigénicas. Este método no está exento de riesgos. Por consiguiente, ha habido muchos intentos de acumular más el factor VIII mediante operaciones de separación. Así, se ha intentado obtener productos con mayor actividad específica mediante cromatografía de afinidad, utilizando anticuerpos animales dirigidos frente al factor VIII. Sin embargo, esta técnica es muy cara e intensa en costes. Por otra parte, esta técnica tampoco es del todo incuestionable, porque también siempre se eluye una cierta cantidad de proteína animal de la columna en cada separación cromatográfica.

El documento EP-A-343 275 describe un procedimiento para producir un factor antihemofilia, libre de virus, sumamente puro, en el que se trata un crioprecipitado que comprende factor VIII con hidróxido de aluminio y con disolventes orgánicos/detergentes biológicamente compatibles, en una realización preferida seguido de una cromatografía de permeación en gel adicional, utilizando material de intercambio iónico. El documento EP-A-0 367 840 describe un material cromatográfico en base a copolímeros de oligoetilenglicoles, metacrilatos de glicidilo y dimetacrilatos de pentaeritritol, como particularmente adecuados para producir un factor VIII libre de virus, sumamente puro.

El documento WO 90/14886 describe un medio para separar proteínas. El material descrito en el mismo describe una matriz insoluble en agua que lleva una pluralidad de fragmentos de poliamina, comprendiendo dichos fragmentos de poliamina al menos 3 átomos de nitrógeno básico, estando separados dichos átomos de nitrógeno por una cadena de al menos dos átomos de carbono situada entre estos, estando presentes al menos 5 de dichos átomos de carbono en el caso de que cada grupo poliamina tenga un total de 3 átomos de nitrógeno. Este medio de separación es adecuado para al menos una purificación parcial de factor VIII.

El documento EP-A-0416 983 describe un procedimiento para preparar el complejo factor VIII/factor von Willebrand, mediante cromatografía de intercambio aniónico con plasma sanguíneo humano como material de partida.

El documento EP 0 343 275 A1 se refiere a un procedimiento para producir un factor antihemofilia (AHF o factor VIII) sumamente puro, el cual, al purificar un crioprecipitado, se ha vuelto libre de virus mediante un tratamiento con disolventes orgánicos/detergentes biológicamente compatibles. El procedimiento se caracteriza porque el crioprecipitado, antes de separar los virus del mismo, se descongela, se extrae con agua que contiene de 1 a 3 U/ml de heparina a un valor de pH 6,5-7,5, a continuación se mezcla con una suspensión de hidróxido de aluminio y, después de enfriar a una temperatura de 10ºC a 18ºC, y ajustar el valor de pH de 6 a 7, se somete a centrifugación y filtración, y a continuación se procesa más en una forma conocida per se. Es particularmente ventajoso que la muestra, después de separar los virus, se somete a cromatografía de permeación en gel sobre materiales de intercambio iónico.

Es cierto, el procedimiento descrito en el documento EP-A-0 343 275 proporciona un incremento en el rendimiento de factor VIII; sin embargo, el rendimiento del factor VIII biológicamente activo todavía no es óptimo.

Por consiguiente, el problema técnico que define el objetivo de la invención es proporcionar un procedimiento el cual puede mejorar la recuperación de un factor VIII biológicamente activo de las fuentes de crioprecipitado, y asegura un método más económico.

Este problema sorprendentemente se resuelve mediante un procedimiento conforme a las características de la reivindicación 1. Las subreivindicaciones se refieren a realizaciones preferidas del procedimiento conforme a la invención.

Los materiales de separación a utilizar conforme a la invención se componen de partículas de soporte como se describe en el documento EP-A-0 337 144. Estas son partículas de soporte con grupos hidroxilo, en las cuales se ha injertado un material polimérico por vía de los átomos de carbono en las posiciones \alpha relativas a los grupos hidroxilo. Los materiales de soporte pueden incluir cualquiera de los generalmente conocidos soportes cromatográficos porosos y no porosos que tienen funciones hidroxilo alifático primario o secundario presentes sobre la superficie del mismo. Entre estos preferidos están los polímeros hidrófilos en base a acrilatos y/o metacrilatos, polímeros en base a alcoholes polivinílicos, geles de sílice con sustituciones de diol, polisacáridos en base a agarosa, celulosa, derivados de celulosa y polímeros en base a dextranos. Por supuesto, también se pueden emplear otros polímeros o copolímeros en base a monómeros tales como compuestos de vinilo, acrilamida, ésteres del ácido metacrílico o metacrilonitrilo en forma hidroxilada.

El material polimérico de la fórmula I conforme a la reivindicación 1, unido a las partículas de soporte por medio de los átomos de carbono en las posiciones \alpha relativas a los grupos hidroxilo, procede de monómeros representados por las fórmulas II y/o III, en las que los sustituyentes son como se define aquí más adelante.

1

Estos monómeros representan al ácido metacrílico (Y = -COOH), derivados del ácido metacrílico

2

alilaminas (Y = -CH_{2}NH_{2}, -CH_{2}NR^{2}R^{3}), metacrilonitrilos (Y = -CN), acroleínas (Y = -CHO), carboxilatos de vinilo (Y = -OCOCHR^{5}R^{6}) o carbonatos de vinileno de la fórmula III.

Todos estos monómeros son sustancias que son polimerizables en una solución acuosa por vía de una polimerización iniciada por radicales libres y tienen grupos que se enlazan de forma reversible, los cuales pueden ser neutros, ácidos o básicos.

Si se utilizan carbonatos de vinileno de la fórmula III, o carboxilatos de vinilo CR^{7}R^{8}=CR^{1}-OCOCHR^{5}R^{6} de la fórmula II, entonces se prefiere que el producto resultante se convierta en un material de separación con grupos hidroxilo. Esta conversión en una fase hidroxílica se lleva a cabo por medio de una saponificación ácida o alcalina suave conocida per se. Por ejemplo, la reacción se puede llevar a cabo con una solución en metanol de K_{2}CO_{3} a temperatura ambiente como describen, por ejemplo, Y. Tezuka et al., en Macromol. Chem. 186, 685-694 (1985).

R^{1} en la fórmulas I (cf. reivindicación 1), II y III preferiblemente representa hidrógeno, es decir, se prefieren los derivados del ácido acrílico.

Y en la fórmula II preferiblemente representa 3 -CH_{2}NH_{2}, -CH_{2}NR^{2}R^{3}

X en la fórmula I, así como en la fórmula II, representa -NR^{2}R^{3}.

Se prefieren los compuestos en los cuales X representa -NR^{2}R^{3} y uno de R^{2} y R^{3} es H.

Los fragmentos R^{2} y/o R^{3} cada uno representa un grupo alquilo, fenilo, fenilaquilo o alquilfenilo, en los que los grupos alquilo y/o fenilo están mono- o polisustituidos con amino, mono- o dialquilamino, trialquilamonio, y pueden estar mono- o polisustituidos, preferiblemente mono- o disustituidos y particularmente preferido, pueden estar monosustituidos con un grupo alcoxilo, isociano, carboxilo, ácido sulfónico, acetoxilo o acetamino.

Los fragmentos R^{2} y/o R^{3} preferiblemente representan alquilo, alcoxialquilo, cianoalquilo, aminoalquilo, mono- o dialquilaminoalquilo, trialquilamonioalquilo, carboxialquilo con hasta 10 átomos de carbono, más preferiblemente hasta 6 átomos de carbono, y especialmente preferido hasta 4 átomos de carbono en el grupo alquilo, el cual puede ser lineal o ramificado. Así, R^{2} y/o R^{3} tienen el significado preferido de metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, metoximetilo, etoximetilo, 2-metoxietilo, 2-, 3- ó 4-oxapentilo, 2-, 3-, 4- ó 5-oxahexilo, 2-, 3-, 4-, 5- ó 6-oxaheptilo, isopropilo, 2-butilo, isobutilo, 2-metilbutilo, isopentilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 2-oxa-3-metilbutilo, 3-oxa-4-metilbutilo, 2-metil-3-oxapentilo, 2-metil-3-oxahexilo, y además también heptilo, octilo, nonilo o decilo.

También se prefieren más los grupos alquilo los cuales se han sustituido con un grupo isociano, carboxilo, o ácido sulfónico. De esta forma, R^{2} y/o R^{3} tienen el significado preferido de cianometilo, cianoetilo, cianopropilo, cianobutilo, cianopentilo, cianohexilo, 2-cianopropilo, 2-cianobutilo, carboxilmetilo, carboxiletilo, carboxilpropilo, carboxilisopropilo, carboxilbutilo, carboxilpentilo, carboxilhexilo, carboxil-2-metilpropilo, carboxil-2-metilbutilo, ácido metilsulfónico, ácido etilsulfónico, ácido propilsulfónico, ácido butilsulfónico, ácido pentilsulfónico, ácido hexilsulfónico, ácido 2-metilpropilsulfónico, ácido 2-metilbutilsulfónico, ácido 3-metilbutilsulfónico, ácido 2-metilpentilsulfónico, ácido 3-metilhexilsulfónico, o ácido 2-etilpentilsulfónico.

Se prefiere más que los grupos alquilo estén monosustituidos con un grupo amino, mono- o dialquilamino o trialquilamonio. Los grupos alquilo pueden ser los mismos o diferentes y pueden tener hasta 10, preferiblemente hasta 6, átomos de carbono, y especialmente preferido, hasta 4 átomos de carbono. Así, tienen los significados preferidos de dimetilaminoetilo, dietilaminoetilo, metilaminoetilo, metilaminopropilo, dimetilaminopropilo, etilaminoetilo, propilaminoetilo, propilaminopropilo, dipropilaminoetilo, dipropilaminobutilo, dietilaminoetilo, trimetilamonioetilo, trimetilamoniopropilo, trimetilamoniobutilo, trietilamonioetilo, trietilamoniopropilo, trietilamonioetilo, aminoetilo, aminopropilo, aminobutilo, o aminopentilo. Todos estos grupos alquilo, o alquilo sustituidos, también se prefieren como sustituyentes del grupo fenilo.

Igualmente preferido para R^{2} y/o R^{3} es un sulfuro de sulfona con la estructura -(CH_{2})_{n}-SO_{2}-(CH_{2})_{n}-S-(CH_{2})_{n}OH con n= 2, 3, 4, 5 ó 6, preferiblemente 2, 3 ó 4.

Preferiblemente, R^{2} y/o R^{3} también tiene/tienen el(los) significado(s) de un grupo fenilo, el cual preferiblemente está monosustituido con un grupo isociano, cianoalquilo, amino, aminoalquilo, mono- o dialquilamino, alquilo, alcoxilo, alcoxialquilo, mono- o dialquilaminoalquilo, trialquilamonio- o trialquilamonioalquilo, carboxilo, carboxialquilo, ácido sulfónico o ácido alquilsulfónico. Los significados preferidos de estos sustituyentes corresponden a aquellos grupos alquilo y grupos alquilo sustituidos, especificados aquí anteriormente como preferidos. El sustituyente del grupo fenilo preferiblemente está unido en la posición p.

El p-acetoxifenilo, p-aminofenilo o p-acetaminofenilo también son significados preferidos para R^{2} y/o R^{3}. Más preferidos como fragmentos R^{2} y/o R^{3} son un grupo alquilfenilo o fenilalquilo, donde el significado preferido especificado también se pretende que sea aplicable a los grupos alquilo, alquilo sustituidos o fenilo sustituidos.

En consecuencia, por ejemplo, los siguientes grupos fenilos sustituidos se considera que son especialmente preferidos: 4-cianofenilo, 4-alquilfenilo, 4-(N,N,-dimetilamino)-fenilo, 4-(N,N-dialquilaminoetil)-fenilo, 4-etoxifenilo, 4-etoxietilfenilo, 4-trialquilamoniofenilo, 4-carboxilfenilo, ácido 4-fenilsulfónico, feniletilo, 4-(N-etilamino)fenilpropilo o 4-cianofeniletilo.

Más preferidos son los fragmentos con la fórmula I y/o los monómeros de la fórmula II, en los que R^{2} y/o R^{3} representan un grupo cíclico o bicíclico el cual puede ser aromático o saturado y contiene de 5 a 10 átomos de carbono, en cuyos anillos uno o más grupos CH- o CH_{2} habrán sido sustituidos por N o NH, N o NH y S, o N o NH y O.

Así, R^{2} y R^{3} preferiblemente también representan un fragmento piridina, grupo imidazolilo, grupo indolilo, más preferido un fragmento pirrol, pirimidina, pirazina, quinolina o isoquinolina.

R^{2} y/o R^{3} también pueden representar, por ejemplo, un fragmento tiazol, tiadiazol, morfolina, triazina, piperazina, benzotiazol, purina, pirazol, triazol, pirrolidina o isoxazol.

Entre estos, los grupos heterocíclicos aromáticos son particularmente preferidos.

Con el fin de producir intercambiadores adecuados, los grupos R^{2} yR^{3} se pueden ajustar uno a otro de una forma tal que ambos fragmentos, o contienen un grupos básico, o uno de los fragmentos es neutro. El experto no tendrá ningún problema en asignar los grupos en conformidad y así, combinar fragmentos adecuados para R^{2} yR^{3}, dependiendo de la función y objeto del intercambio aniónico deseado.

Se prefiere que uno de los dos fragmentos R^{2} y R^{3} sea un fragmento neutro.

R^{7} y R^{8} en los monómeros de la fórmula II preferiblemente representan H, de forma que R' y R'' en la fórmula I también representan preferiblemente hidrógeno.

También se prefieren los materiales de separación en los que en la fórmula I, Y representa -OH y uno de los fragmentos R' y R'' también representa -OH. Entonces, se tiene que emplear como monómero un carbonato de vinileno de la fórmula III, y el producto resultante tendrá que ser convertido posteriormente en una fase hidroxilo.

R^{7} y R^{1} en la fórmula III preferiblemente representan H. En la fórmula I, n significa el número de unidades que se repiten y representa de 2 a 100, y preferiblemente de 5 a 60, siendo preferidas largas cadenas de 10 a 30.

Woods, K., y Orme, Th., en el documento EP-A-0 239 859, describen que es ventajoso, después de la separación o inactivación de los virus, y antes de la separación cromatográfica, extraer la muestra con aceites, y preferiblemente con aceite de soja, aceite de ricino y/o aceite de semillas de algodón.

Los métodos conforme a la invención por primera vez permiten preparar un factor antihemofilia sumamente puro, en un elevado rendimiento, factor el cual tiene una actividad específica que no se ha conseguido hasta el momento.

Se divide un crioprecipitado que se puede obtener comercialmente en partes de alrededor de 1 a 2 cm de tamaño, y se deja descongelar a temperatura ambiente de 3 a 4 horas. Estas partes se suspenden, a la vez que se agitan, en alrededor de dos veces su volumen de agua que contiene de 1 a 3 U/ml de heparina sódica, a temperaturas entre 101C y 251C. La suspensión se ajusta a un valor de pH de entre al menos 7,0 a 8,0, y preferiblemente de 7,0 a 7,1, con ácido acético 0,1 M. La agitación se continua a temperatura ambiente durante de 15 a 60 minutos, y preferiblemente durante 30 minutos. Entonces, se añaden alrededor de 108 g de una suspensión de hidróxido de aluminio al 2%, por 1 kg de crioprecipitado, y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante de 1 a 10 minutos, y preferiblemente durante 5 minutos. A continuación, la acidez se ajusta con ácido, preferiblemente ácido acético 0,1 M, hasta un valor de pH de 6,0 a 7,0 y preferiblemente de 6,5 a 6,6. La muestra se enfría a una temperatura de 18ºC a 10ºC, y preferiblemente de 16ºC a 14ºC. A esta temperatura, la mezcla se somete a centrifugación, por ejemplo en una centrífuga Sharples AS-16 (Cepa 61), a una velocidad de 1,0 litros/min. A esto le sigue una filtración del sobrenadante, a través de un filtro Pall AB-1 UOlOZP. La inactivación de los virus se realiza preferiblemente después de la centrifugación y filtración. Se ha visto que una inactivación de los virus mediante Tween/TNBP (tri-n-butil-fosfato) es particularmente útil. También se obtienen buenos resultados utilizando colato sódico/TNBP. A su vez, se pueden separar el Tween/TNBP o la mezcla colato sódico/TNBP mediante extracción con aceite.

La muestra se carga en una columna cromatográfica que contiene el material de permeación en gel conocido por el nombre comercial EMD-TMAE-Fractogel (M) 650, material que muestra actividad de intercambiador iónico. El EMD-TMAE-Fractogel (M) 650 ya ha sido caracterizado aquí anteriormente. La capacidad de la columna preferiblemente es tal que están presentes en la columna 0,5 kg del material de la columna por kg del crioprecipitado. La muestra se carga en la columna y se lava con tampones. Después de eluir la muestra con un tampón de fuerza iónica superior, el producto resultante se diluye con un tampón que tiene un bajo contenido en sales y, si se requiere, se ajusta a un valor de pH de 6,5 a 7,5, y preferiblemente a un valor de 6,9 a 7,1. A continuación, se realiza otra filtración, preferiblemente en filtros de nitrocelulosa, la cual es seguida por una filtración estéril.

De acuerdo con la invención, la purificación de factor VIII se efectúa lavando y eluyendo con tampones con fuerzas iónicas que incrementan más tarde, la fuerza iónica del tampón se ajusta mediante sales de amonio cuaternario con al menos una cadena de hidrocarbilo con de 1 a 6 átomos de carbono y que lleva un sustituyente hidrófilo solo, o en combinación con sal común.

Se ha comprobado que esos tampones de separación son particularmente ventajosos, la fuerza iónica de los cuales se ha ajustado utilizando cloruro sódico y/o una sal de amonio cuaternario con al menos una cadena de hidrocarbilo con de 1 a 6 átomos de carbono y que tiene un sustituyente hidrófilo, tal como cloruro de colina.

Así, en el procedimiento conforme a la invención, la columna que contiene el anteriormente descrito Fractogel (M) 650 se lava y equilibra con un tampón A. El tampón A contiene cloruro sódico o colina en una concentración de 50 a 200 mM, y preferiblemente 120 mM, y tiene un valor de pH de 5,8 a 7,8, y preferiblemente de 6,5 a 7,0.

La muestra preferiblemente se aplica a la columna en un tampón que tiene una osmolaridad de 200 a 600 mosm, y preferiblemente de 380 a 520 mosm, a un valor de pH de 5,8 a 7,8, y preferiblemente de 6,5 a 7,0. Se recomienda que la capacidad de la columna no exceda de alrededor de 50 UI de factor VIII por 1 ml de gel. Después de cargar la columna, se lava con tampón A.

A continuación la columna se lava con tampón B, el cual también contiene citrato sódico, cloruro cálcico, glicina, si bien tiene una fuerza iónica superior que el tampón A. La concentración de la sal de amonio cuaternario del tipo anteriormente descrito y/o de cloruro sódico deben estar entre 150 mM y 250 mM, y preferiblemente de 180 a 200 mM, y el valor de pH debe estar entre 5,8 y 7,8, y preferiblemente alrededor de 7,0.

La elución de la columna del producto se lleva a cabo con un tampón C el cual tiene una fuerza iónica más incrementada que la del tampón B. El contenido de la sal de amonio cuaternario del tipo anteriormente descrito, especialmente cloruro de colina, y/o de cloruro sódico, debe estar dentro del intervalo de 200 mM a 500 mM, y preferiblemente equivaler a alrededor de 400 mM, a un valor de pH de 5,8 a 7,8, y preferiblemente de alrededor de 7,0.

Mediante el proceso conforme a la invención, la recuperación de factor VIII se lleva a cabo en un rendimiento superior y con una estabilidad de producto superior. Es ventajoso que en el procedimiento conforme a la invención el denominado factor von-Willebrand no se separa, sino que permanece en las fracciones de factor VIII. Así, es posible utilizar las preparaciones de factor VIII también para pacientes que padecen una deficiencia en factor von-Willebrand. Además, el factor VIII también se puede emplear en técnicas de infusión continua, debido a la presencia del factor von-Willebrand, el cual facilita una estabilización natural del factor VIII.

El procedimiento se ilustra más por medio de los siguientes ejemplos.

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Ejemplo 1 Acumulación de factor VIII del crioprecipitado

Se divide un crioprecipitado, que se puede obtener comercialmente, en partes de alrededor de 1 a 2 cm de tamaño y se deja descongelar a temperatura ambiente en un período de 3 a 4 horas. Estas piezas se suspenden, a la vez que se agita, en alrededor de dos veces su volumen de agua que contiene 2 U/ml de heparina sódica a temperaturas entre 20ºC y 25ºC. La suspensión se ajusta a un pH de 7,0 a 7,1 con ácido acético 0,1 M. Se continua la agitación a una temperatura de 20ºC a 25ºC durante 30 minutos. Se añaden 108 g de una suspensión de hidróxido de aluminio al 2% por 1 kg de criprecipitado, y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante 5 minutos. A continuación, el valor de pH se ajusta con ácido acético 0,1 M a un valor de 6,5 a 6,6. La muestra se enfría a una temperatura de 16ºC a 14ºC, se somete a centrifugación en una centrífuga Sharples AS-16 (Cepa 61) a una velocidad de 1,0 l/min. El sobrenadante se filtra a través de un filtro Pall AB-1 U010ZP.

Ejemplo 2 Preparación de la columna cromatográfica

Para la separación del crioprecipitado extraído, se utiliza una columna que contiene al menos 0,5 l de resina de intercambio iónico por 1 kg del crioprecipitado. La altura de la columna debe ser \leq el diámetro. Después de rellenar la columna con la resina, la columna de cromatografía primero se lava con 5 volúmenes de solución de cloruro sódico 0,1 M. Esto es seguido por un lavado con un tampón A que tiene la siguiente composición:

: 120 mM de cloruro sódico,

: 10 mM de citrato sódico . 5 H_{2}O,

: 120 mM de glicina,

: 1 mM de cloruro sódico . 2H_{2}O,

: valor de pH 6,5 a 7,5, ajustado con HCl 1 M.

Todos los tampones deben estar libres de virus, puesto que las operaciones siguientes se llevan a cabo con extractos libres de virus del crioprecipitado.

Ejemplo 3

La muestra se carga en la columna, y se observa la absorción del flujo a una longitud de onda de 280 nm. Se recoge el filtrado y se analiza en cuanto a actividad de factor VIII, así como el producto en la forma que estaba antes de llevar a cabo la separación en columna. A continuación la columna se lava con tampón A, hasta que la absorción haya alcanzado otra vez su valor inicial. A continuación la columna se lava con tampón B, hasta que la absorción haya vuelto otra vez a la línea de base.

El tampón B tiene la siguiente composición :

: 180 a 200 mM de cloruro sódico,

: 10 mM de citrato sódico. 5H_{2}O,

: 120 mM de glicina,

: 1 mM de cloruro cálcico.2 H_{2}O,

: un valor de pH de 6,9 a 7,0.

La elución del producto se efectúa con tampón C. Se recoge la fracción proteica que aparece después de la adición de tampón C.

El tampón C tiene la siguiente composición:

: 400 mM de cloruro sódico,

: 1 mM de citrato sódico. 5H_{2}O,

: 120 mM de glicina,

: 1 mM de cloruro cálcico.2 H_{2}O,

: un valor de pH de 6,9 a 7,0.

Después de que ha eluido el producto deseado, la columna se lava con 5 volúmenes de tampón D, el cual contiene una solución de cloruro sódico 1 M.

La regeneración de la columna se lleva a cabo lavando con NaOH 0,1 N (3 volúmenes de columna), seguido de lavado de la columna con ácido clorhídrico 0,1 N (3 volúmenes de columna y lavado de la columna con 5 volúmenes de columna de alcohol al 25% en agua).

Ejemplo 4

Se diluyen las fracciones recogidas con tampón E, que se compone de

: 20 mM de citrato sódico,

: 80 mM de glicina,

: 2,5 mM de cloruro cálcico^{R} 2H_{2}O,

: un valor de pH de 6,9 a 7,1,

hasta que tienen una actividad de 26 o 35 U/ml. A continuación se ajusta el valor de pH, si se requiere, a un valor de 6,9 a 7,1, a lo cual sigue una filtración a través de un filtro Sealklean de 0,45 \mum. Posteriormente se realiza una filtración estéril más.

Ejemplo 5 Experimento comparativo

En cada uno de dos experimentos, se procesan 0,3 kg de un crioprecipitado obtenido de un idéntico plasma, siendo un procedimiento de acuerdo con la invención, y el otro de acuerdo con el procedimiento del documento EP 0343 275 A1. Las fracciones se someten a análisis, y los resultados relativos a los ingredientes se muestran en la siguiente Tabla.

TABLA

Comparación de purificaciones cromatográficas de una solución de crioprecipitado, mediante el procedimiento de acuerdo con la invención (I), y mediante el procedimiento del documento EP 0343 275 A1 (II).

4

La preparación mediante el procedimiento conforme a la invención da como resultado 33 partes repartidas, que contienen cada una 270 UI de factor VIII, de acuerdo con un rendimiento de 29.700 UI de factor VIII/kg de crioprecipitado o 297 UI/kg de plasma.

La preparación mediante el procedimiento conforme al documento EP 0 343 275 A1 da como resultado solamente 23 partes repartidas que contiene cada una 270 UI de factor VIII, que corresponden a un rendimiento de 20.700 UI de factor VIII/kg de crioprecipitado, o 207 UI/kg de plasma. De ahí resulta una ventaja, con respecto al rendimiento, de casi 51% sobre el método de preparación del documento EP 0343 275 A1.

Las proteínas no deseables tales como fibrinógeno e inmunoglobulina M (IgM) se separan más eficazmente en el procedimiento conforme a la invención.

Claims

1. Procedimiento para recuperar de un crioprecipitado un complejo factor VIII/factor von Willebrand, en el que se ha detenido la actividad de los virus, sumamente puro, por medio de una cromatografía de intercambio aniónico, caracterizado porque se utiliza, como material de intercambio aniónico, un material de separación en base a soportes que contienen grupos hidroxilo, soportes cuyas superficies se han recubierto con polímeros unidos covalentemente, conteniendo dichos polímeros unidades que se repiten, las cuales son las mismas o diferentes, y están representadas por la fórmula I

5

en la que

\quad: R^{1} representa H o CH_{3}

\quad: Y preferiblemente representa 6 -CH_{2}NH_{2}, -CH_{2}NR^{2}R^{3},

\quad: R' y R'' representan cada uno H o CH_{3},

\quad: X representa -NR^{2}R^{3}

\quad: R^{2} y/o R^{3} representan cada uno un grupo alquilo, fenilo, fenilaquilo o alquilfenilo, con hasta 10 átomos de carbono en el fragmento alquilo, grupos que están mono- o polisustituidos con amino, mono- o dialquilamino, trialquilamonio, carboxilo y pueden estar mono- o polisustituidos con fragmentos alcoxilo, ciano, ácido sulfónico, acetoxilo o acetamino,

\quad: un fragmento cíclico o bicíclico con de 5 a 10 átomos de carbono, en el que uno o más grupos CH o CH_{2} han sido sustituidos con N o NH, N o NH y S, o N o NH y O,

\quad: uno de R^{2} y R^{3} también pueden representar H,

\quad: mientras que R^{2} y R^{3} se han ajustado uno a otro de forma que ambos fragmentos, o contienen grupos básicos, o uno de los dos fragmentos es neutro, y n representa de 2 a 100

y en que la purificación del factor VIII se realiza lavando y eluyendo con tampones con fuerzas iónicas que incrementan más tarde, la fuerza iónica del tampón se ajusta mediante sales de amonio cuaternario con al menos una cadena de hidrocarbilo con de 1 a 6 átomos de carbono y que lleva un sustituyente hidrófilo solo, o en combinación con sal común.

2. El procedimiento conforme a la reivindicación 1, en el que Y en la fórmula I de la reivindicación 1 representa

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\quad: con X = -NR^{2}R^{3}, en la que

\quad: R^{2} y R^{3} representan cada uno aminoalquilo, mono- o dialquilaminoalquilo, trialquilamonioalquilo, cada uno con hasta 10 átomos de carbono en el fragmento alquilo, fenilo el cual no está sustituido o ha sido mono- o disustituido con grupo(s) alquilo, alcoxilo, alcoxialquilo, ciano, cianoalquilo, aminoalquilo, amino, mono- o dialquilamino, mono- o dialquilaminoalquilo, trialquilamonio, trialquilamonioalquilo, carboxilo, carboxialquilo, ácido sulfónico, ácido alquilsulfónico, acetoxilo o acetamino, con hasta 10 átomos de carbono en el fragmento alquilo,

un fragmento cíclico o bicíclico con de 5 a 10 átomos de carbono, en el que uno o más grupos CH o CH_{2} han sido sustituidos con N o NH, N o NH y S, o N o NH y O,

uno de R^{2} y R^{3} también pueden representar H,

mientras que R^{2} y R^{3} han sido ajustados uno a otro de forma que ambos fragmentos, o contienen grupos básicos, o uno de los dos fragmentos es neutro.

3. El procedimiento conforme a la reivindicación 1, en el que Y en la fórmula I de la reivindicación 1 representa -CH_{2}NH_{2} o -CH_{2}NR^{2}R^{3}, siendo R^{2} y R^{3} como se definió en la reivindicación 1.

4. El procedimiento conforme a la reivindicación 1, caracterizado porque la sal de amonio cuaternario es cloruro de colina.

5. El procedimiento conforme al menos una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el gradiente salino, establecido por el sistema de tampones utilizado, es de 0,1 a 1 M, como el total de las concentraciones de cloruro sódico y/o la sal de amonio cuaternario conforme a las reivindicaciones 1 y/o 4.