BRPI1105317A2 - produÇço estÁvel e em larga escala de fviii humano em linhagem celular humana sk-hep-1 - Google Patents
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- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2531/00—Microcarriers
Landscapes
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Abstract
PRODUÇçO ESTÁVEL E EM LARGA ESCALA DE FVIII HUMANO EM LINHAGEM CELULAR HUMANA SK-HEP-1. O presente invento refere-se: 1) ao métódo de produção de FVIII recombinante em célula humana Sk-Hep-1, compreendendo o fator de von Willebrand (vWF) e 2) à população de células humanas transduzidas com um vetor que codifica a proteína de coagulação (FVIII). A técnica, objeto deste pedido de patente, destina-se ao cultivo das células humanas em suspensão e em aderência e o isolamento do meio de cultura contendo a proteína desejada. O objetivo da invenção é obter um produto mais seguro (isento de possíveis vírus humanos), mais barato, mais estável e através de processo que obtenha quantidades suficientes e em escala industrial para suprir a demanda nacional.
Description
PRODUÇÃO ESTÁVEL E EM LARGA ESCALA DE FVIII HUMANO EM LINHAGEM CELULAR HUMANA SK-HEP-1.
Objeto da patente
O presente invento refere-se ao método de produção de FVIII 5recombinante em célula humana Sk-Hep-1, compreendendo o fator de von Willebrand (vWF).
A técnica, objeto deste pedido de patente, destina-se ao cultivo das células humanas em suspensão e em aderência e o isolamento do meio de cultura contendo a proteína desejada. A invenção ainda refere-se à lOpopulação de células humanas transduzidas com um vetor que codifica a proteína de coagulação (FVIII). Estas células podem ser utilizadas no método de produção da proteína.
A presente invenção está ligada, portanto, à indústria
farmacêutica. Estado da Técnica
Os pacientes hemofílicos A são tratados por meio de infusão intravenosa de FVIII derivado do plasma ou recombinante (Mannucci e Giangrande, 2000).
Atualmente, no Brasil, devido ao alto custo do recombinante, o 20tratamento destinado aos hemofílicos é realizado com fatores Vlll purificados a partir do plasma de indivíduos normais, estratégia que apresenta desvantagens como risco de infecções virais e alta demanda de plasma de doadores normais. Apesar de ser um tratamento de certa forma eficaz para os pacientes hemofílicos, ainda não é o tratamento ideal. A produção de fator Vlll recombinante (FVIIIr) em células de
mamíferos representa uma alternativa segura e mais eficiente para o tratamento de indivíduos portadores de Hemofilia A.
No mercado brasileiro, cada unidade internacional (UI) de fator Vlll derivado do plasma é comercializada ao preço médio de US$ 0,80. A 30utilização anual média por hemofílico é de 30.000 Ul1 o que representa US$ 17.000,00/paciente/ano. Estima-se com estes números que o país gaste cerca de US$ 140.000.000,00 por ano no tratamento destes pacientes. Trata-se de um tratamento extremamente caro e os pacientes não recebem o tratamento profilático adequado, devido à escassez do produto no mercado e os riscos de contaminação. A ausência de profilaxia diminui a qualidade e a expectativa de vida destes pacientes.
Todos os FVIII recombinantes presentes no mercado são
produzidos transitoriamente, ou seja, por vetores plasmidiais que não se integram no genoma das células e utilizam células murinas para a produção.
O uso de linhagens de células não-humanas na produção de fator Vlll recombinante apresenta certas desvantagens. A principal limitação na lOprodução de FVIII recombinante que se encontra atualmente é o baixo rendimento de FVIII, que é de duas ordens de magnitude menor do que a de outras proteínas.
No momento, os únicos FVIII recombinantes disponíveis no 15mercado estão sob a liderança de três empresas (Bayer, Baxter, Wyeth). São eles o KOGENATE e o KOGENATE FS produzidos pela Bayer, RECOMBINATE pela Baxter e REFACTO pela Wyeth/Genetics Instituí. A proteína recombinante é produzida em células CHO (Chinese Hamster Ovary) ou em BHK (Baby Hamster Kidney), que são transfectadas com o FVIII 20completo ou sem o domínio B. Todos esses recombinantes possuem atividade biológica semelhante ao FVIII derivado do plasma. Ao longo dos anos, formulações mais seguras vêm sendo desenvolvidas, mas estas indústrias utilizam vetores plasmidiais convencionais que geram uma baixa expressão e a proteína recombinante é produzida em linhagens celulares murinas CHO e 25BHK que apresentam padrões diferentes de glicosilação o que gera um produto com maior probabilidade de causar reação imunológica nos pacientes.
A patente US 5362641 (Heparanase derived from human Sk- Hep-1 cell line) utiliza a linhagem Sk-Hep-1 (célula humana hepática de origem 30endotelial) para produzir Heparanase recombinante. A patente (WO/2004/092355) EXPRESSION OF PROTEINS IN CORD BLOOD-DERIVED ENDOTHELIAL CELLS e a US patent 2002/0042130 A1 and Lin et al. (2002) descrevem a produção de FVIII em células humanas endoteliais que podem ser utilizadas em protocolos de 5terapia gênica.
As patentes US 6,228, 620, US 5,789, 203 e US 5,693, 499 descrevem a co-expressão do DNA codificador dás cadeias leve e pesada do FVIII. Estas incorporações também podem ser utilizadas em acordo com esta lOinvenção.
A proteína terapêutica utilizada nesta invenção possui parte do domínio B deletado (ou retirado), o qual não participa da atividade coagulante do FVlII. A retirada de parte do domínio B do FVIII é um processo conhecido, 15as patentes US 6, 346,513, WO 86/06101, WO 92/16557, e EP 0 123 945 descrevem deleções nas seqüências que codificam o domínio B do FVIII. Neste processo, exposto neste pedido de patente, é utilizado o vetor cPPT-C (FVIIIDB), obtido conforme descrito na patente IGWS (W0/2004/092355).
As patentes EP 1 233 064, US 2002/0165177 e US 6,271, 025
descrevem a inserção de íntrons no cDNA codificador do Fator VIII. A patente US 5,422, 260 descreve mutações pontuais na seqüência do DNA codificador do FVIIII.
O Fator Vlllr (recombinante) tem pelo menos uma das
seguintes mutações (EP 1 136 553 A1): - valina na posição 162 é substituído por outro resíduo aminoácido neutro; - serina na posição 2011, é substituído por outro aminoácido hidrofílico; - valina na posição 2223 é substituído por um aminoácido ácido. No domínio B entre as posições arginina 740 e ácido 30glutâmico 1640 há a substituição por um oligopeptídeo "ligador" rico em arginina que contém 10 a 25 aminoacidos, de preferência 14-20 aminoácidos. Estas posições referem-se à seqüência de aminoácidos do fator Vlll humano maduro (Toole et al. 1984,312 Nature (5992): 342-7; Wood et al. 1984,312 Nature (5992): 330-7; Gitschieret al. 1984,312 Nature (5992): 326-30).
O DNA que codifica o FVIIIDB (cDNA do FVIII com parte do domínio B retirado) é parte do vetor que é utilizado para transduzir as células 5humanas.
Objetivos da Invenção e solução proposta para os problemas apontados
O invento que ora se apresenta utiliza-se de uma linhagem celular humana que pode ser cultivada em monocamadas e/ou em suspensão. O objetivo da invenção é obter um produto mais seguro (isento
de possíveis vírus humanos), mais barato, mais estável por meio de processo que obtenha quantidades suficientes e em escala industrial para suprir a demanda nacional.
O avanço técnico que se observa nesta invenção, em relação
ao que existe é a possibilidade de se obter o FVIII mais seguro, uma vez que provém de células humanas, menos suscetíveis de desencadearem reações imunológicas, e em alta escala, devido à produção em suspensão. As técnicas existentes até hoje não preveem a forma de obtenção do FVIIIr produzido 20estavelmente em células humanas e em suspensão.
Em condições fisiológicas, a síntese de FVIII ocorre principalmente nos hepatócitos e nas células endoteliais sinusoidais do fígado (Wion et al., 1985; Zelechowska et al., 1985; Do et al., 1999; Hollestelle et al., 2001). Com base nesta informação, utiliza-se para esta invenção uma célula 25humana hepática de origem endotelial (Sk-Hep-1) para produzir o FVIII recombinante.
A célula Sk-Hep-1 usada nesta invenção é caracterizada quanto à expressão de Fator de von Willebrand (FvW), o qual é secretado no 30meio de cultura (Heffelfinger SC et al., 1992). Quando as células expressam o FVIII1 a razão molar de FvW:FVIII no sobrenadante pode variar de 1:1 e 100:1. O FvW estabiliza o FVIII. Assim, a produção de FVIII recombinante é realizada em linhagem celular humana, Sk-Hep-1.
A proteína recombinante do FVIII da coagulação sangüínea da 5presente invenção possui parte do domínio B deletado (FVIIIDB), é produzida em níveis elevados nas formas de cultivo em aderência (monocamadas) e em suspensão, apresenta boa estabilidade, sendo apropriada para a utilização no tratamento da Hemofilia A.
Definições
10FVIII recombinante - é uma forma artificial de proteína, no caso do FVIII de coagulação, que é criado pela combinação de duas ou mais seqüências. O FVIII recombinante é criado através da introdução de parte do cDNA do FVIII humano em um DNA viral, no caso um lentivirus.
Domínio B - parte da estrutura damoléculade fator VHhqiie não é essencial 15para a atividade de coagulação da mesma. cDNA - DNA complementar. Molécula sintetizada por técnicas de biologia molecular tendo como molde umF^nolécula ^ãe RNA extraída do organismo
—produtor original^A molecular é complementar ao RNA-—·---
GFP - Green fluorescent protein. Proteína fluorescente verde que tem seu 20gene introduzido na célula juntamente com o gene codificador do FVIII. Quando produzida pelas células serve de indicador da produção da molécula de interesse (FVIII) e auxilia na seleção destas células produtoras devido a produção de cor verde.
Sk-Hep-1 - linhagem celular humana imortalizada de origem endotelial. 25FVIIIDB - molécula recombinante de FVIII sem parte do domínio B.Vetor - uma molécula de DNA em que um outro fragmento de DNA pode ser ligado a ele. Um vetor pode, por exemplo, carregar consigo um gene resistente a antibióticos, replicar-se com autonomia, e possuir uma seqüência conhecida por enzimas que cortam esta molécula (endonuclease).
30 Envelope viral - capa de origem proteica que reveste e envolve todo o material formador do vírus. Cada tipo de vírus tem diferentes proteínas formadoras deste envelope dando características únicas a cada vírus. Plasmídeo - plasmídeos são moléculas circulares de DNA capazes de se 5reproduzir independentemente do DNA cromossômico. DNA plamidial - mesma definição anterior
Sk-Hep-FVIIIDB - célula Sk-Hep-1 modificada pela transdução viral e que passa a produzir a molecular de Fator VIII.
pVSV-G - um dos tipos de envelope viral. Derivado do vírus da estomatite IOvesicuIar. Usado com envelope para o Ientivirus empregado nesta patente. Deste modo o material genético do vírus que é de origem do HIV fica circundado por um envelope de outro vírus e é chamado pseudotipado (envelope de outro vírus). Este processo aumenta a segurança para evitar a montagem de um vírus HIV.
15
FACS - Fluorescence Activated Cell Sorting. Processo de seleção das células de acordo com sua fluorescência.
Cytodex 3 - ^esferas dê matriz Ecologicamente inerte usadas como microcarregadores para cultivo de células em suspensão. Consiste de uma 20camada fina de colágeno quimicamente acoplada a uma matriz de dextrana. Cultispher G - esferas macroporosas de gelatina usadas como microcarregadores para cultivo de células que ficam ancoradas na sua superfície.
Transdução - o mesmo que infecção viral. Processo pelo qual os virus 25produzidos são colocados junto às células em cultura. Devido às características intrínsecas dos lentivírus o material genético do vírus funde-se ou integra-se ao material genômico da célula modificando o seu DNA e levando a célula a se transformar numa produtora de FVIII. PBS - Phosphate buffered solution. Solução aquosa de salina a 0,9% de NaCI 30tamponada com fosfato a pH 7,4.
Descrição da Invenção - Processo O método de obtenção de FVIII recombinante sem parte do domínio B compreende as seguintes etapas:
1- Produção de partículas virais contendo FVIIIDB
2- Utilização das partículas virais para a infecção da linhagem Sk-Hep- 1
3- Seleção das células positivas para GFP (Green Fluorescent protein - proteína verde fluorescente utilizada para selecionar as células
produtoras)
4- Cultivo em suspensão
5- Recuperação do FVIIIr produzido pelas células Sk-Hep-1
Etapa 1 do processo: Produção de partículas virais contendo
FVIIIDB
A etapa 1 consiste na produção de partículas virais contendo o
FVIIIDB e é realizada pelo método de Iipofectamina (Lipofectamine 2000, Gibco).
Por meio da Iipofectamina obtém-se partículas virais que 20possuem o cDNA do FVIII com o domínio B parcialmente deletado (FVIIIDB) e a proteína GFP. As partículas virais são utilizadas para inserir o gene de interesse (neste caso o FVIIIDB-GFP) nas células Sk-Hep-1.
São utilizados três vetores plasmideais : o vetor Ientiviral 25contendo o gene de interesse, o plasmídeo responsável pela geração do capsídio viral (p8.91) e um plasmídeo para a formação do envelope viral (pVSV-G).
O vetor contendo o gene de interesse em questão inclui um 30promotor operavelmente ligado a uma seqüência de DNA que codifica o fator de coagulação FVIII. O vetor é viral, pode ser um vetor retroviral, mais preferivelmente um vetor lentiviral. O vetor Ientiviral é um vetor derivado do HIV-1. Além do HIV-1, vetores Ientivirais HIV-2, vírus da imunodeficiência símia do vírus da anemia infecciosa eqüina, o vírus da imunodeficiência felina (FIV) podem ser utilizados. A representação esquemática do vetor está mostrado na seqüência 1A.
5
Os vírus ou partículas virais são produzidos em uma linhagem celular de mamífero (HEK-293) com o uso dos 3 DNAs plasmideais citados acima, método já descrito pela patente US 5994136. As células produzem os vírus que são secretados para o meio de cultura que é recolhido, filtrado e IOarmazenado a -80°C até o momento do uso.
Os vírus produzidos por estas células são chamados de vetores Ientivirais ou partículas virais e são coletados e utilizados na etapa 2.
Etapa 2 do processo: Utilização das partículas virais para a 15infecção da linhagem Sk-Hep-1
Em seguida (ttapa Z), a célula humana Sk-Hep-1 ê" transduzrdaxom^as-partículas-virais-contendeHO-FV4HDBT----
Os vírus produzidos na etapa anterior (vetores lentivirais) são 20utilizados no processo de transdução, ao levar o material genético de interesse (cDNA do FVIIIr humano) para o genoma da célula hospedeira, resultando na integração estável no genoma da célula. Após a integração do material genômico do vírus com o DNA da célula inicia-se a transcrição do transgene e consequentemente a síntese da proteína recombinante. Geralmente, a 25proteína recombinante pode ser detectada em algumas horas após a transdução.
Etapa 3: Seleção das células positivas para GFP
A construção Ientiviral utilizada nesta patente possui o cDNA 30para GFP1 de modo que a eficiência de transdução é medida por citometria de fluxo (FACS). As células que estiverem fluorescentes e forem detectadas pelo citômetro de fluxo indicam que houve a infecção e integração e que como estão expressando GFP também expressam o FVIII.
Após a seleção por FACS, a avaliação do nível de produção 5da proteína recombinante é feita por RT-PCR convencional e por teste de atividade, teste cromogênico.
Etapa 4: Cultivo em Suspensão
A expansão da célula Sk-Hep-FVIIIDB pode ser realizada em IOgarrafas tipo spinner com microcarreadores.
A linhagem celular gerada nesta invenção deve ser previamente expandida em garrafas até a concentração de 1x105células/ml_ e adicionada aos microcarreadores previamente hidratados, esterilizados e equilibrados em meio de cultivo com soro à 37° C.
15
Etapa 5: Recuperação do FVIII recombinante produzido pelas células Sk-Hep-FVIIIDB
Nesta etapa isola-se o FVIII recombinante das células Sk- 20Hep-FVIIIDB. A quantidade de proteína purificada durante e após o processo de purificação pode ser monitorada (ou mensurada) por ELISA e pelos testes de coagulação.
A composição obtida por este método de produção de FVIII é submetida a um tratamento de inativação viral e purificação para remover as 25substâncias químicas.
Exemplo de obtenção
A invenção pode ser obtida de acordo com as etapas anteriormente citadas e explicadas abaixo:
Etapa 1 do processo: Produção de partículas virais contendo
3 OFVMiDB
A etapa 1 consiste na produção de partículas virais contendo o FVIIIDB e é realizada pelo método de Iipofectamina (Lipofectamine 2000, Gibco). A produção de partículas virais pelo usando Iipofectamina é um processo no qual se usa 3 DNAs sendo 10 ug do vetor Ientiviral1 6,5 ug do vetor 8.91 (capsídeo) e 3,5 ug do vetor VSVG (envelope). Antes de iniciar a colocação dos DNAs1 o meio de cultura das células HEK-293 é trocado.
5Coloca-se 7 ml de DMEM contendo 10% de soro bovino fetal (SFB).
Em um tubo de 15 ml, pipetar os DNAs 8.91 e VSVG em 1,5 ml de meio DMEM sem soro. Em outro tubo, misturar 1,5 ml de meio DMEM sem soro com 60 ul de Lipofectamina. Deixar ambos os tubos 5 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, misturar os 2 tubos e deixar mais 20 minutos
incubando a temperatura ambiente. Colocar os 3 ml resultantes na placa com as células e incubar a 37°C 5% C02. Após 6 horas, trocar o meio das placas (7 ml de meio DMEM 10% SFB) e incubar por no mínimo 48 horas a 37 0C 5% C02. Após as 48 horas o sobrenadante da cultura contendo os vírus 15produzidos pelas células é coletado, filtrado e fracionado em alíquotas de 1ml.
Etapa 2 do processo: Utilização das partículas virais para a infecção da linhagem Sk-Hep-1
A transdução pode ser realizada em células aderentes, assim 20como em culturas em suspensão. Diversas técnicas de transdução com vetores virais e não virais tem sido otimizadas para cultura de células em suspensão.
As transduções são realizadas em placas de 24 poços. Vinte e quatro horas antes da transdução são plaqueadas de 2 a 5x104 células Sk- 25Hep-1em meio DMEM com 10% SBF, para que a transdução ocorra na fase exponencial de crescimento celular. Em cada poço é adicionado o vírus produzido e coletado anteriormente sem diluição . As células são centrifugadas (90 minutos, 1250 χ g, 32°C), incubadas por 15-18 horas na estufa úmida de CO2, lavadas com PBS e expandidas com meio apropriado. Etapa 3: Seleção das células positivas para GFP A eficiência de transdução é medida por citometria de fluxo
(FACS).
Para o procedimento de FACS, as células são tripsinisadas com Tripsina/EDTA, lavadas com tampão apropriado (1% soro bovino fetal/ 50,1% Azida de Sódio em PBS) e é adicionado 1% de formaldeído em PBS. Células não transduzidas, que não expressam GFP, são usadas como controle negativo, ou seja, as células Sk-Hep-1 que não receberam vírus são também passadas no citometro de fluxo para avaliar a fluorescência basal das células. A fluorescência basal é comparada com aquela das células transduzidas A identificação e purificação da população de células que
possuem o vetor Ientiviral contendo FVI11DB estão demonstradas nos gráficosIB.
As células positivas para GFP selecionadas por citometria de fluxo podem ser re-cuItivadas enrmeio DMEM com IO0Zoiae SBF alemperatura 15de 37°C e 5% de C02.
Após a seleção por FACS, a avaliação do nível de produção —da proteína recombinante é feita—por RT-PGR convencional e por teste de atividade, teste cromogênico. O teste cromogênico é feito pela metodologia de 20ELISA ou por luminescência. O teste cromogênico utilizado foi o Immuno Chrom (Immuno GmbH, Alemanha).
Etapa 4: Cultivo em Suspensão
--------A expansão da célula Sk-Hep-FVIIIDB pode ser realizada em
25garrafas spinner com microcarreadores. A cultura em microcarregadores permite o cultivo de linhagens celulares dependentes de ancoramento em escala industrial de produção para atender a demanda comercial. Neste tipo de cultura, a célula cresce aderida na superfície de pequenas esferas ou no interior dos poros de partículas macroporosas que encontram-se suspendidas 30no meio de cultura. O sistema permite o controle dos parâmetros de cultivo (pH, concentração de oxigênio dissolvido, temperatura, dentre outros), reduz a necessidade de grandes quantidades de meio de cultura, reduz o trabalho e os riscos de contaminação.
As células podem ser cultivadas em garrafas spinner flasks em incubadoras a 37 °C e 5% de C02. Os microcarreadores são Cytodex 3 (GE 5Healthcare) e Cultispher G (Percell Biolytica). A linhagem celular gerada nesta invenção deve ser previamente expandida em garrafas até a concentração de 1x105células/mL e adicionada aos microcarreadores previamente hidratados, esterilizados e equilibrados em meio de cultivo com soro à 37° C. Para a inoculação da garrafa spinner com Cytodex 3 e Cultispher-G, as células são 1 Omantidas em rotação intermitente (2 minutos de rotação à 30^40 rpm seguido de 30 minutos sem agitação) por 3 horas. Em seguida, o meio de cultura DMEM com 10% SBF é adicionado para completar o volume final e a velocidade de agitação é ajustada para 40 rpm. Em ambos os casos a troca de metade~do volume total do meio ~é~ realizada ã~~cãda 1-2 dias. A remoção do 15meio de cultura é realizada depois da sedimentação dos microcarregadores contendo as células.
Os resultados do escalonamento da produção estão mostrados-nos^gráficos-2:-----
Etapa 5: Recuperação do FVIII recombinante produzido pelas
20Sk-Hep-FVI IIDB
Nesta etapa isola-se o FVIII recombinante das células -Hep- FVIIIB. Métodos de purificação adequadas incluem, mas não estão limitadas a, cromatografia de imunoafinidade, cromatografia de troca iônica, etc, e suas combinações. Protocolos de purificação de execução para os fatores de 25coagulação humanos estão presentes nas patentes: WO 93/15105, EP 0 813 597, WO WO 96/40883, 96/15140/50 e US 7,247,707 B2. Eles podem ser adaptados às exigências necessárias para isolar os fatores recombinantes Vlll e IX.
A quantidade de proteína purificada durante e após o processo 30de purificação pode ser monitorada (ou mensurada) por ELISA e pelos testes de coagulação. A composição obtida por este método de produção de FVIII é submetida a um tratamento de inativação viral que inclui o tratamento de calor (seco ou no estado líquido, com ou sem a adição de substâncias químicas, incluindo inibidores de protease). Após a inativação do vírus mais um passo de 5purificação para remover as substâncias químicas pode ser necessário. A patente WO 93/15105 descreve técnica de isolamento de fator Vlll do plasma sangüíneo por cromatografia de troca iônica, com alto índice de pureza.
Seleção por citometria de fluxo
A construção Ientiviral utilizada nessa invenção possui o cDNA
para GFP1 de modo que a eficiência de transdução foi medida por citometria de fluxo (FACS). Para o procedimento de FACS1 as células foram tripsinisadas com Tripsina/EDTA, foram lavadas com tampão FACS (1% FBS / 0,1% Azide de Sódio em PBS) e foi adicionado 1% de formaldeido em PBS. A medição e 15seleçãó~foi realizada érrTaparelhõ FACScan, com software CeIIQuest da Becton Dickinson. Células não transduzidas, que não expressam GFP.
A avaliação por citometria de fluxo revelou uma população antes da seleção com 8,4% de céluas GFP positivas e após a seleção a —população obtida fõi~de 73%~cfe GFP positiva (Esquema 1 A). RT-ConvencionaI
Moléculas de cDNA foram sintetizadas a partir de 4 μg de RNA total pela incubação de 50 ng/μί. de oligo FVIII ou β-actina, 10 mM dNTPs, em um volume de 10 μί a 65°C por 5 minutos, seguido resfriamento em gelo por 2 25minutos. Subseqüentemente, uma mistura de 2μΙ_ RT-Buffer 10X, 4 μΙ_ de MgCI 25 mM, 2 μΙ_ de DTT 0,1 M e 1 μί de inibidor de ribonuclease foram adicionadas à mistura, obtendo um volume final de 19 μΙ_. A reação foi incubada a 25°C por 2 minutos, foi adicionado 1μΙ_ de SuperScript Il RT (50 unidades) a cada amostra seguindo a 25°C por 10 minutos. A reação foi então 30incubada a 42°C por 50 minutos, e desnaturada a 70°C por 15 minutos e colocada em gelo, com adição de 1μ1_ de RNAse H e incubação a 37°C por 20 minutos. Amostras incubadas na ausência da enzima transcriptase reversa foram preparadas como controle. Após a transcrição reversa, 1μΙ_ de cDNA foi utilizado para amplificação por PCR com oligos específicos para FVIII e β- actina.
A amplificação de regiões do FVIII recombinante está
demonstrado no gráfico 1B.
Quantificação da atividade de FVIII pelo Teste
Cromogênico
O Teste Cromogênico mede a atividade do FVIII não pelo
tempo de coagulação como no teste TTPA1 mas pela produção de fator Xa. Às amostras foram adicionados dois reagentes (A: fosfolipideos e albumina; B: FIXT-FX, Câ2+r=albümina e trombina). O fator Vlll cdnficlo nas amostras funciona como um co-fator, juntamente com FIX, Ca2+ e fosfolipideos, para 15transformar FX em FXa. O FXa degrada o substrato p-nitroanilina, resultando na coloração amarela, cuja concentração é medida a 405 nm. O teste —cromogênico utilizado foi olmmunoChrom (lmmuno GmbHT^Memanha), de acordo com as instruções do fabricante. O teste foi realizado em microplacas de 96 poços. Para cada microplaca foi aplicada uma curva-padrão de diluições 20definidas de plasma humano. O nível mínimo de detecção deste teste é para amostras que apresentam > 1% de atividade.
A atividade de FVIII recombinante obtida é de 4 UI/ml_/10E6 células. Isso pode ser comprovado pela RT-PCR (reverse transcription 25polymerase chain reaction - reação da transcriptase reversa, seguida em cadeia da polimerase) utilizada para detectar a expressão das cadeias leve e pesada do FVIIIr expresso pela a população SK-Hep-FVIIIDB.( Resultado - 1C). Observa-se que a linhagem celular obtida nesta invenção produz 4 vezes mais FVIII do que a quantidade de FVIII no plasma humano. Teste em modelo animal - Funcionalidade da proteína
recombinante Para testar a funcionalidade in vivo da proteína recombinante obtida por esta invenção foi realizado o teste abaixo descrito.
A funcionalidade da proteína recombinante foi testada em 5camundongos Hemofílicos A e comparada com a eficiência do FVIIIdp (derivado do plasma). Cinco camundongos receberam 1 Ul de FVIII recombinante ou FVIIIdp e a atividade biológica foi acompanhada 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas e 6 horas após a infusão do FVIII. Os resultados estão mostrados no gráfico 2A.
Os camundongos hemofílicos A foram anestesiados e receberam 50 Ul de FVIIIDB/Kg, em seguida, foi provocado um sangramento cortando 3mm da cauda. A curva de sobrevivência está mostrada nos gráficos 2B. Todos os animais que receberam FVIIIDB sobreviveram, mostrando a — — — 15eficácia do FVIIIDB gerado por esta invenção errf corrigir a heTnofilia Ã.
Descrição dos gráficos, tabelas e esquemas citados
A descrição que se segue abaixo possibilitará um entendimento global e de cada detalhe do invento.
O esquema 1A é a representação esquemática do vetor Ientiviral de expressão.
Os gráficos 1B exibem a Citometria de Fluxo, células GFP positivas selecionadas e expandidas.
25
Resultado 1C - utilização de RT-PCR ( reverse transcription polymerase chain reãction - reação da transcriptase reversa, seguida de reação em cadeia da polimerase) para detectar a expressão das cadeias leve e pesada do FVIIIr expresso pela a população SK-Hep-FVIIIDB.
Tabela 1D - demonstra a atividade biológica do FVIII
recombinante.
Gráficos 2 A e B - apresentam o teste de avaliação da eficácia do FVIII recombinante em camundongos hemofílicos A. 2Α) Comparação do perfil da atividade do FVIIIr e do FVIIIdp ao longo do tempo. O FVIIIr apresenta níveis mais altos de atividade biológica e é mais estável do que o FVIIIdp.
B) Curva de sobrevida após o sangramento induzido nos camundongos que 5receberam FVIIIr (todos sobreviveram), FVIIIdp (todos sobreviveram, e camundongos controle (não receberam FVIII e morreram até 30 horas após o início do sangramento)
O gráfico 3 ilustra o escalonamento da linhagem gerada Sk- Hep-FVIIIBD e análise da produção do FVIII recombinante em suspensão. A lOutilização dos dois microcarreadores mostra-se ser eficiente para cultivar a Sk-Hep-FVIIIDB, a qual chega a produzir de 1,2 a 1,4 unidades de FVIIIr/mL.
Claims (12)
1. Processo de expressão de FVIII em células humanas hepáticas/ endoteliais (SK- Hep 1), caracterizadas por expressarem Fator de Von Willebrand.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo uso de um vetor Ietiviral que possui o cDNA de proteína, para a transdução de células.
3. Processo de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato da proteína ser um fator de coagulação do sangue.
4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fator de coagulação do sangue ser o fator humano Vlll .
5. População de células- Sk- Hepl- FVIIIDB caracterizadas por serem obtidas porprocéSsosdescritos nasTeivindicações 1 a 4.
6. População de células humanas Sk -Hep, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fator humano Vlll ter o domínio B deletado.
7. População de células humanas, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 e 6 , caracterizada por pelo menos 45 % das células expressar endogenamente o fator vWF .
8. Linhagem celular imortalizada caracterizada por ser obtida a partir de uma população de células humanas Sk- Hep-1 de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5, 6 ou 7.
9. Processo para a produção do fator de coagulação do sangue, caracterizado por ser - em cultura em suspensão utilizando microcarregadores.
10. Processo para a produção de fator de coagulação do sangue, que compreende a cultura de uma população de células Sk-Hep-1, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 8 ou uma linhagem celular de acordo com a reivindicação 9 em condições adequadas, e o isolamento da proteína - o fator de coagulação do sangue - a partir do meio de cultura celular.
11. Processo de acordo com as reivindicações 9 e 10 , caracterizado pela proteína ser o fator de coagulação do sangue Vlll e a etapa de purificação incluir isolamento do fator de coagulação do sangue Vlll na presença do fator de von Willebrand.
12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pela proteína, preferencialmente um fator de coagulação do sangue, ser submetida a um tratamento de inativação viral.
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