ES2178640T5 - Proteina de transferencia de trigliceridos microsomicos. - Google Patents
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Abstract
SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO PARTICULARMENTE SECUENCIAS DE ADN, QUE CODIFICAN TODA O PARTE DE LA SUBUNIDAD DE PESO MOLECULAR ELEVADO DE PROTEINA DE TRANSFERENCIA DE TRIGLICERIDO MICROSOMAL, VECTORES DE EXPRESION QUE CONTIENEN LAS SECUENCIAS DE ADN, CELULAS HUESPED QUE CONTIENEN LOS VECTORES DE EXPRESION, Y METODOS QUE UTILIZAN ESTOS MATERIALES. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A MOLECULAS DE POLIPEPTIDO QUE COMPRENDEN TODA O PARTE DE LA SUBUNIDAD DE PESO MOLECULAR ELEVADO DE PROTEINA DE TRANSFERENCIA DE TRIGLIRECIDO MICROSOMAL, Y METODOS PARA PRODUCIR ESTAS MOLECULAS. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A NUEVOS METODOS PARA PREVENIR, ESTABILIZAR O CAUSAR LA REGRESION DE ARTEROSCLEROSIS Y AGENTES TERAPEUTICOS QUE TIENEN TAL ACTIVIDAD. LA PREVENCION SE REFIERE ADICIONALMENTE A NUEVOS METODOS PARA REDUCIR LOS NIVELES DE LIQUIDO DE SUERO Y AGENTES TERAPEUTICOS QUE TIENEN TAL ACTIVIDAD.
Description
Proteína de transferencia de triglicéridos
microsómicos.
Esta invención se refiere a genes de la proteína
de transferencia de triglicéridos microsómicos, a vectores de
expresión que comprenden los genes, a células huésped que comprenden
los vectores, a procedimientos para producir la proteína, a
procedimientos para detectar los inhibidores de la proteína y a
procedimientos de uso de los inhibidores.
La proteína de transferencia de triglicéridos
microsómicos (PTM) cataliza el transporte de triglicéridos (TG),
ésteres de colesterilo (EC) y fosfatidilcolinas (PC) entre las
vesículas unilamelares pequeñas (SUV). Wetterau & Zilversmit,
Chem. Phys. Lipids 38, 205-222 (1985). Cuando se
expresan las velocidades de transferencia como el porcentaje del
lípido donante transferido por tiempo, la PTM expresa una clara
preferencia por el transporte de lípidos neutros (TG y EC), respecto
del transporte de fosfolípidos. Se ha aislado y caracterizado la
proteína de hígado bovino. Wetterau & Zilversmit, Chem. Phys.
Lipids 38, 205-222 (1985). El análisis de
electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) de la proteína
purificada sugiere que la proteína de transferencia es un complejo
de dos subunidades de pesos moleculares aparentes 58.000 y 88.000,
puesto que estaba presente una sola banda cuando se sometió a
electroforesis la PTM purificada en condiciones no
desnaturalizantes, mientras que se identificaron dos bandas de pesos
moleculares aparentes 58.000 y 88.000 cuando se realizó la
electroforesis en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS). Estos
dos polipéptidos se denominan en la descripción adjunta como 58 kDa
y 88 kDa, respectivamente, o el componente de 58 kDa y el componente
de 88 kDa de MTP, respectivamente, o la subunidad de bajo peso
molecular y la subunidad de alto peso molecular de PTM,
respectivamente.
La caracterización del componente de peso
molecular 58.000 de la PTM bovina indica que es la proteína
multifuncional previamente caracterizada, la proteína disulfuro
isomerasa (PDI). Wetterau et al. J. Biol. Chem. 265,
9800-7 (1990). La presencia de PDI en la proteína de
transferencia está apoyada por las evidencias que muestran que (1)
los 25 aminoácidos aminoterminales del componente de 58.000 kDa
bovino de la PTM son idénticos a los de la PDI bovina, y (2) la
actividad de la disulfuro isomerasa se expresó por PTM bovina
después de la disociación del complejo de proteína de 58
kDa-88 kDa. Además, los anticuerpos desencadenados
frente a PDI bovina, una proteína que no tiene por sí misma
actividad de transferencia de TG, fueron capaces de inmunoprecipitar
la actividad de transferencia de TG bovinos a partir de una solución
de PTM bovina purificada.
La PDI desempeña normalmente un papel en el
plegamiento y ensamblado de las proteínas unidas por enlaces
disulfuro recientemente sintetizados dentro del diámetro interior
del retículo endoplásmico. Bulleid & Freedman, Nature 335,
649-51 (1998). Cataliza el apareamiento apropiado de
los residuos de cisteína en enlaces disulfuro, catalizando así el
plegamiento apropiado de proteínas unidas por disulfuros. Además, se
ha informado que la PDI es idéntica a la subunidad beta de la
prolil-4-hidroxilasa humana. Koivu
et al., J. Biol. Chem. 262, 6447-9 (1987). El
papel de la PDI en la proteína de transferencia bovina no está
claro. Parece ser un componente esencial de la proteína de
transferencia, puesto que la disociación de la PDI del componente de
88 kDa de la PTM bovina por bajas concentraciones de
desnaturalizante (HCl de guanidina), un agente caotrópico
(perclorato de sodio) o un detergente no desnaturalizante (glucósido
de octilo) da como resultado una pérdida de la actividad de
transferencia. Wetterau et al., Biochemistry 30,
9728-35 (1991). La PDI bovina aislada no tiene
actividad de transferencia de lípidos aparente, sugiriendo que el
polipéptido de 88 kDa es la proteína de transferencia o que
confiere la actividad de transferencia al complejo de proteína.
Se ha investigado la distribución de la
actividad de PTM en tejido y subcelular en ratas. Wetterau &
Zilversmit, Biochem. Biophys. Acta 875, 610-7
(1986). Se encontró actividad de transferencia de lípidos en hígado
e intestino. No se encontró actividad de transferencia en plasma,
cerebro, corazón o riñón, o muy poca. En el hígado, la PTM era una
proteína soluble localizada dentro del diámetro interior de la
fracción microsómica. Se encontraron concentraciones aproximadamente
iguales en los microsomas suaves y rugosos.
La abetalipoproteinemia es una enfermedad
recesiva autosómica caracterizada por una virtual ausencia de
lipoproteínas en el plasma que contengan la apolipoproteína B
(apoB). Kane & Havel en The Metabolic Basis of Inherited
Disease, sexta edición, 1139-64 (1989). Los niveles
de TG de plasma pueden ser tan bajos como de unos pocos mg/dl, y no
consiguen subir después de la ingestión de grasas. Los niveles de
colesterol en sangre son a menudo de sólo 20-45
mg/dl. Estas anormalidades son el resultado de un defecto genético
en el ensamblado y/o secreción de lipoproteínas de muy baja densidad
(VLDL) en el hígado y en los quilomicrones del intestino. La base
molecular para este defecto no se ha determinado previamente. En
los sujetos examinados, la síntesis de triglicéridos, fosfolípidos y
colesterol parece normal. En la autopsia, los sujetos están exentos
de aterosclerosis. Schaefer et al., Clin. Chem. 34,
B9-12 (1988). Se ha excluido un vínculo entre el gen
apoB y la abetalipoproteinemia en varias familias. Talmud et
al., J. Clin. Invest. 82, 1803-6 (1988) y Huang
et al., Am. J. Hum. Genet. 46, 1141-8
(1990).
Los sujetos con abetalipoproteinemia están
afectados por numerosas enfermedades. Kane & Havel,
supra. Los sujetos tienen una falta de absorción de grasa y
acumulación de TG en sus enterocitos y hepatocitos. Debido a la
ausencia de lipoproteínas de plasma ricas en TG, existe un defecto
en el transporte de vitaminas solubles en grasas tales como la
vitamina E. Esto da como resultado acantocitosis de eritrocitos,
ataxia espinocerebelar con degeneración de los fascículos cuneatus
y gracilis, neuropatía periférica, retinopatía pigmentaria
degenerativa y miopatía ceroide. El tratamiento de los sujetos
abetalipoproteinémicos incluye restricciones dietéticas de toma de
grasas y suplementos dietéticos con vitaminas A, E y K.
Hasta la fecha, no se ha demostrado el papel
fisiológico de la PTM. In vitro, cataliza el transporte de
moléculas lipídicas entre membranas fosfolipídicas. Probablemente,
desempeña un papel similar in vivo y por tanto desempeña
algún papel en el metabolismo lipídico. La distribución subcelular
(diámetro interno de la fracción microsómica) y en tejido (hígado e
intestino) de la PTM ha conducido a la especulación de que desempeña
un papel en el ensamblado de lipoproteínas de plasma, ya que éstos
son los sitios de ensamblado de las lipoproteínas de plasma.
Wetterau & Zilversmit, Biochem. Biophys. Acta 875,
610-7 (1986). La capacidad de la PTM de catalizar el
transporte de TG entre membranas es consistente con esta hipótesis,
y sugiere que la PTM puede catalizar el transporte de TG desde su
sitio de síntesis en la membrana del retículo endoplásmico (RE) a
las partículas de lipoproteína emergentes en el diámetro interno del
RE.
Olofsson y colaboradores han estudiado el
ensamblado de lipoproteínas en células HepG2. Bostrom et al.,
J. Biol. Chem. 263, 4434-42 (1988). Sus resultados
sugieren que las lipoproteínas pequeñas precursoras se hacen
grandes con el tiempo. Esto sería consistente con la adición o
transferencia de moléculas de lípido a las lipoproteínas emergentes
según se ensamblan. La PTM puede desempeñar un papel en este
proceso. En apoyo de esta hipótesis, Howell y Palade, J. Cell.
Biol. 92, 833-45 (1982) aislaron lipoproteínas
emergentes de la fracción de Golgi hepática de hígado de rata.
Había un espectro de tamaños de partículas presente con
composiciones variables de lípidos y proteínas. Se encontraron
partículas de lipoproteínas de alta densidad (HDL), aunque
contenían apoB. Higgins y Hutson, J. Lipid Res. 25,
1295-1305 (1984) reseñaron que las lipoproteínas
aisladas de Golgi eran consistentemente mayores que las del
retículo endoplásmico, sugiriendo de nuevo que el ensamblado de
lipoproteínas es un suceso progresivo. Sin embargo, no existen
evidencias directas en la técnica anterior que demuestren que la
PTM desempeña un papel en el metabolismo lipídico o en el ensamblado
de lipoproteínas de plasma.
La presente invención se refiere a una molécula
de ácido nucleico aislada como se define en la reivindicación 1.
La presente invención se refiere también a una
molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria a
las secuencias anteriores.
La presente invención también se refiere a
vectores de expresión que comprenden una secuencia de ADN de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
La presente invención se refiere adicionalmente
a células huésped procarióticas o eucarióticas que contienen un
vector de expresión que comprende una secuencia de ADN de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
La presente invención se refiere también a
procedimientos para la detección de secuencias de ácidos nucleicos
de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o
secuencias de ácidos nucleicos relacionadas.
La presente invención se refiere además a
procedimientos para la detección de un inhibidor de PTM.
La presente invención se refiere además a usos
médicos como se definen en las reivindicaciones 13 a 17.
La figura 1 muestra clones de ADNc bovino. Se
ilustran cinco inserciones de ADNc bovino. La línea continua en la
parte superior de la figura representa la secuencia de ADNc total
aislado. Las barras pequeñas marcadas por encima de esta línea
mapean el péptido y las secuencias de la sonda. El marco de lectura
abierto está indicado por la segunda línea, seguida por **
correspondiente a secuencias no codificantes 3'. El número y la
longitud del clon se indican a la izquierda de cada línea que
representa la correspondiente región de la secuencia compuesta. Los
clones 64 y 76 se aislaron con la sonda 2A, los clones 22 y 23 con
la sonda 37A y el clon 2 con la sonda 19A. Los engarces Eco RI
añadidos durante la construcción de la genoteca de ADNc contribuyen
con sitios de restricción Eco RI en los extremos 5' y 3' de cada
inserción. El sitio interno Eco RI en las inserciones 22 y 76 está
codificado por la secuencia de ADNc. El sitio de restricción Nhe I
se utilizó en la preparación de sondas para el aislamiento de
clones de ADNc humano (a continuación). Las flechas debajo de cada
línea de inserción indican las reacciones de secuenciación
individuales.
La figura 2 muestra la actividad de
transferencia de TG en sujetos normales. La transferencia estimulada
por proteína de TG-^{14}C de las SUV donantes a
las SUV receptoras se midió en biopsias intestinales homogeneizadas
obtenidas de cinco sujetos normales. Los resultados se expresan como
el porcentaje de TG del donante transferido por hora en función de
la proteína de la biopsia intestinal homogeneizada.
La Figura 3 muestra la actividad de
transferencia de TG en sujetos abetalipoproteinémicos. Se midió la
transferencia estimulada por proteína de
TG-^{14}C de las SUV donantes a las SUV receptoras
en biopsias intestinales homogeneizadas obtenidas de cuatro sujetos
abetalipoproteinémicos. Los resultados se expresan como el
porcentaje de TG donante transferido/hora en función de la proteína
de la biopsia intestinal homogeneizada.
La figura 4 muestra la actividad de
transferencia de TG en sujetos de control. Se obtuvo la
transferencia estimulada por proteína de
TG-^{14}TG de las SUV donantes a las SUV
receptoras en biopsias intestinales homogeneizadas obtenidas de
tres sujetos de control, uno con enfermedad de retención de
quilomicrones (círculos vacíos), otro con hipobetalipoproteinemia
homocigótica (círculos rellenos) y uno sin ayuno (x). Se expresan
los resultados como el porcentaje de TG donante transferido/hora en
función de la proteína de biopsia intestinal homogeneizada.
La figura 5 muestra el análisis por
transferencia Western de PTM en sujetos normales. Se fraccionaron
por PAGE-SDS una alícuota de PTM bovina purificada
(carril 1) o las proteínas tras 103.000 x g después de tratamiento
con desoxicolato de 23 \mug de biopsias intestinales
homogeneizadas de 3 sujetos normales (carriles 2-4)
y después se transfirieron a nitrocelulosa. Se sondearon las
transferencias con anti-88 kDa.
La figura 6 muestra el análisis de transferencia
Western de PTM en sujetos de control. Se fraccionaron por
PAGE-SDS una alícuota de PTM bovina purificada
(carril 1) o las proteínas tras 103.000 x g después de tratamiento
con desoxicolato de 15 \mug, 25 \mug y 25 \mug de biopsias
intestinales homogeneizadas de un sujeto con enfermedad de
retención de quilomicrones (carril 2), un sujeto con
hipobetalipoproteinemia homocigota (carril 3) y un sujeto no ayunado
(carril 4), respectivamente y después se transfirieron a
nitrocelulosa. Se sondearon las transferencias con
anti-88 kDa.
anti-88 kDa.
La figura 7 muestra el análisis de transferencia
Western de PTM en sujetos normales con anticuerpos de afinidad
purificados. Se fraccionaron una alícuota de la PTM bovina
purificada (carril 1) o las proteínas tras 103.000 x g después de
tratamiento con desoxicolato de 34 \mug (carril 2) o 25 \mug
(carril 3) de biopsias intestinales homogeneizadas de 2 sujetos
normales y después se transfirieron a nitrocelulosa. Se sondearon
las transferencias con anti-88 kDa purificado por
afinidad.
La figura 8 muestra el análisis de transferencia
Western de PTM en sujetos abetalipoproteinémicos. Se fraccionaron
por PAGE-SDS una alícuota de PTM bovina purificada
(carril 1) o proteínas tras 103.000 x g después de tratamiento con
desoxicolato de 18 \mug (carril 2), 23 \mug (carril 3), 23
\mug (carril 4), 23 \mug (carril 5) de biopsias intestinales
homogeneizadas de cuatro sujetos abetalipoproteinémicos diferentes y
después se transfirieron a nitrocelulosa. En los carriles 6 y 7, se
fraccionaron por PAGE-SDS 100 \mug del
homogeneizado intestinal entero (sujetos correspondientes a los
carriles 4 y 5) y se transfirieron a nitrocelulosa. Se sondearon las
transferencias con anti-88 kDa.
La figura 9 muestra un análisis de transferencia
Southern de un defecto génico en un sujeto abetalipoproteinémico. Se
cortaron completamente con Taq I diez \mug de ADN genómico de un
control, del sujeto abetalipoproteinémico (caso índice) y de la
madre y el padre del sujeto, se sometieron a electroforesis sobre
agarosa al 1% y se transfirieron a nitrocelulosa. Se realizó la
hibridación Southern utilizando ADNc del exón 13 como sonda. Dos
bandas hibridantes en el carril normal indicaron la presencia de un
sitio Taq I en el exón normal 13. Una banda hibridante en el carril
del sujeto abetalipoproteinémico demostró la ausencia de esta
secuencia de restricción en ambos alelos del exón 13, confirmando
una mutación homocigótica en este sujeto. Se muestra el estado
heterocigótico de la madre y el padre por las tres bandas
hibridantes, correspondientes a los patrones de restricción tanto
normales como mutantes.
La Figura 10 muestra la inhibición en el
transporte catalizado por PTM de TG de las SUV donantes a las SUV
receptoras mediante el compuesto A descrito a continuación en la
descripción adjunta. Se disolvió el compuesto A en DMSO y después
se diluyó en tampón 15/40. Se añadieron alícuotas a un ensayo de
transferencia de lípidos para llevar el compuesto a las
concentraciones finales indicadas. La concentración de DMSO no
superó nunca 2 \mul/600 \mul, una concentración que se determinó
independientemente que tenía un efecto mínimo sobre el ensayo. Se
midió el transporte lipídico catalizado por PTM durante 30 minutos a
37ºC. Se calculó la transferencia de TG y se comparó con un ensayo
de control sin inhibidor. Se utilizaron tres condiciones de ensayo
independientes para demostrar la inhibición de PTM por el compuesto
A. Las condiciones de ensayo fueron: 8 nmol de PC donante, 48 nmol
de PC receptor y 75 ng de PTM (círculos vacíos); 24 nmol de PC
donante, 144 nmol de PC receptor y 100 ng de PTM (círculos
rellenos); 72 nmol de PC donante, 432 nmol de PC receptor y 125 ng
de PTM (cuadrados vacíos).
La Figura 11 muestra la respuesta a la dosis del
compuesto A sobre la secreción de ApoB, ApoAI y HSA de células
HepG2. Se trataron las células HepG2 con compuesto A a las dosis
indicadas durante 16 horas. Se midió la concentración en los medios
de cultivo celular de apoB, apoAI y HSA después del periodo de
incubación con el ensayo ELISA apropiado, y se normalizó para la
proteína celular total. Los datos mostrados se expresan como
porcentaje del control (sólo DMSO).
La Figura 12 muestra el efecto del compuesto A
sobre la secreción de TG de células HepG2. Se trataron las células
HepG2 con compuesto A a las dosis indicadas durante 18 horas, las
dos últimas horas de las cuales fueron en presencia de
^{3}H-glicerol 5 \muCi/ml. Se midió la
concentración de triglicéridos marcados radiactivamente en el medio
de cultivo mediante extracción cuantitativa, seguida de análisis de
cromatografía en capa fina y normalización para la proteína celular
total. Los datos mostrados se expresan como porcentaje del control
(sólo DMSO).
La Figura 13 muestra la inhibición en el
transporte de TG catalizado por PTM de las SUV donantes a las SUV
receptoras mediante el compuesto B descrito a continuación en la
descripción adjunta. Se disolvió el compuesto B en DMSO y después
se diluyó en tampón 15/40. Se añadieron alícuotas a un ensayo de
transferencia lipídica para llevar el compuesto a las
concentraciones finales indicadas. La concentración de DMSO en el
ensayo no superó nunca los 2 \mul/600 \mul, una concentración
que se determinó independientemente que tenía un efecto mínimo
sobre el ensayo. Se midió el transporte lipídico catalizado por PTM
durante 30 minutos a 37ºC de temperatura. Se calculó la
transferencia de TG y se comparó con un ensayo de control sin
inhibidor. Se utilizaron dos condiciones de ensayo independientes
para demostrar la inhibición de PTM por el compuesto B. Las
condiciones de ensayo fueron: 24 nmol de PC donante, 144 nmol de PC
receptor y 100 ng de PTM (círculos vacíos); 72 nmol de PC donante,
432 nmol de PC receptor y 125 ng de PTM (círculos rellenos).
\global\parskip0.900000\baselineskip
La Figura 14 muestra la respuesta a la dosis del
compuesto B sobre la secreción de ApoB, ApoAl y HSA de células
HepG2. Se trataron las células HepG2 con compuesto B a las dosis
indicadas durante 16 horas. Se midió la concentración en el medio
de cultivo de apoB, apoAl y HSA después del periodo de incubación
con el ensayo ELISA apropiado, y se normalizó para la proteína
celular total. Los datos mostrados se expresan como porcentaje del
control (sólo DMSO).
Las siguientes definiciones se aplican a los
términos utilizados a lo largo de esta memoria descriptiva, a menos
que se limite de otro modo en ejemplos específicos.
El término "PTM" representa un complejo de
polipéptido o proteína que (1) si se obtiene de un organismo (por
ejemplo, vacas, humanos, etc.), puede aislarse de la fracción
microsómica del tejido homogeneizado; y (2) estimula el transporte
de triglicéridos, ésteres de colesterol o fosfolípidos desde
vesículas fosfolipídicas sintéticas, membranas o lipoproteínas a
vesículas sintéticas, membranas o lipoproteínas, y que es distinta a
la proteína de transferencia de ésteres de colesterol [Drayna et
al., Nature 327, 632-634 (1987)], que puede
tener propiedades catalíticas similares. Sin embargo, las moléculas
de PTM de la presente invención no necesitan ser necesariamente
catalíticamente activas. Por ejemplo, la PTM catalíticamente
inactiva o fragmentos de ésta pueden ser útiles para desencadenar
anticuerpos ante la proteína.
El término "modificado", cuando se refiere
a una secuencia de nucleótidos o polipéptido, significa una
secuencia de nucleótidos o polipéptido que es distinta de la
secuencia de tipo silvestre encontrada en la naturaleza.
El término "relacionado", cuando se refiere
a una secuencia de nucleótidos, significa una secuencia de ácido
nucleico que es capaz de hibridarse con una sonda de
oligonucleótidos basada en la secuencia de nucleótidos de la unidad
de alto peso molecular de la PTM.
La expresión "regiones de control"
representa secuencias de nucleótidos que regulan la expresión de la
PTM o de cualquier subunidad de ésta, incluyendo pero sin
limitación, cualquier promotor, silenciador, elemento potenciador,
sitio de empalme, elemento de iniciación transcripcional, elemento
de terminación transcripcional, señal de poliadenilación, elemento
de control de la traducción, sitio de inicio de la traducción, sitio
de terminación de la traducción y elemento de estabilidad del
mensaje. Dichas regiones de control pueden estar localizadas en
secuencias 5' ó 3' a la región de codificación o en intrones que
interrumpen la región de codificación.
La expresión "estabilización" de la
aterosclerosis, como se utiliza en la presente solicitud, representa
la deceleración del desarrollo y/o la inhibición de la formación de
nuevas lesiones ateroscleróticas.
La expresión "que causa la regresión de"
aterosclerosis, como se utiliza en la presente solicitud, representa
la reducción y/o eliminación de lesiones ateroscleróticas.
Los ácidos nucleicos de la presente invención
pueden utilizarse en una variedad de formas según la presente
invención. Por ejemplo, pueden utilizarse como sondas de ADN para
rastrear otras genotecas de ADNc y ADN genómico de modo que
seleccionen mediante hibridación otras secuencias de ADN que
codifiquen proteínas relacionadas con la subunidad de alto peso
molecular de la PTM. Además, los ácidos nucleicos de la presente
invención, que codifican toda o parte de la subunidad de alto peso
molecular de PTM bovina, pueden utilizarse como sondas de ADN para
rastrear otras genotecas de ADNc y ADN genómico para seleccionar
mediante hibridación secuencias de ADN que codifiquen moléculas de
PTM de otros organismos. Los ácidos nucleicos pueden utilizarse
también para generar cebadores para amplificar ADNc o ADN genómico
utilizando técnicas de reacción en cadena con polimerasa (PCR). Las
secuencias de ADN de la presente invención pueden utilizarse también
para identificar secuencias adyacentes en el ADNc o el genoma, por
ejemplo, aquellas que codifican el gen, sus secuencias adyacentes y
sus elementos reguladores.
Los polipéptidos de la presente invención son
útiles en el estudio de las características de la PTM, por ejemplo,
su estructura, mecanismo de acción, y papel en el metabolismo
lipídico o ensamblado de partículas de lipoproteínas.
Se describen con detalle a continuación diversos
otros procedimientos de utilización de los ácidos nucleicos,
polipéptidos, vectores de expresión y células huésped.
Al llevar a cabo los procedimientos de la
presente invención, pueden administrarse los agentes que reducen la
actividad o la cantidad de PTM a diversas especies de mamíferos,
tales como monos, perros, gatos, ratas, humanos, etc., necesitados
de dicho tratamiento. Estos agentes pueden administrarse por vía
sistémica, tal como oral o parenteralmente.
Los agentes que reducen la actividad o la
cantidad de PTM pueden incorporarse a una forma de dosificación
sistémica convencional, tal como un comprimido, cápsula, elixir o
formulación inyectable. Las formas de dosificación anteriores
incluirán también el material portador, excipiente, lubricante,
tampón, antibacteriano, agente de carga (tal como manitol),
antioxidantes (ácido ascórbico ó bisulfito sódico) o similares
fisiológicamente aceptables necesarios. Se prefieren las formas de
dosificación oral, aunque las formas parenterales son bastante
satisfactorias también.
La dosis administrada tiene que ajustarse
cuidadosamente según la edad, peso y estado del paciente, así como
de la vía de administración, la forma y régimen de dosificación y el
resultado deseado. En general, las formas de dosificación descritas
anteriormente pueden administrarse en dosis sencillas o divididas de
una a cuatro veces diarias.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere a una molécula
de ácido nucleico como se define en la reivindicación 1.
El listado de secuencias muestra una secuencia
de nucleótidos bovina (SEC Nº ID 1), una secuencia de ADNc humano
(SEC Nº ID 2), una comparación de las secuencias de ADNc humano y
bovinol, la secuencia de aminoácidos bovina (SEC Nº ID 3), la
secuencia de aminoácidos humana (SEC Nº ID 4) y una comparación de
las secuencias de aminoácidos humana y bovina. En las comparaciones
de secuencia, las regiones encerradas en cajas representan una
identidad perfecta entre las dos secuencias.
El ADNc bovino es un compuesto de 2.900 bases de
las secuencias de ADNc de los clones 2 y 22 y tiene un marco
abierto de lectura entre las bases 1 y 2.580, que predice un
producto de traducción de 860 aminoácidos, seguido por un codon de
paro TGA, 298 bases de secuencia 3' no codificante y una región poli
A.
En el ADNc humano, las 3.185 bases predicen un
producto de traducción de 894 aminoácidos de las bases 48 a 2.729,
seguido por un codon de paro TGA, 435 bases de secuencia 3' no
codificante y una región poli A.
En la comparación de ADNc, existe
aproximadamente un 88% de identidad entre las secuencias solapadas
en la región de codificación (bases bovinas 1-2.583
y bases humanas 150-2.732). No es necesario
introducir ningún hueco para obtener este alineamiento en la región
de codificación. La homología es algo más débil en la región no
codificante 3', que incluye la introducción de varios huecos para
obtener un alineamiento óptimo.
La secuencia de proteína bovina (SEC ID Nº 3) es
el producto de traducción de 860 aminoácidos de la secuencia
combinada de los clones de ADNc bovino 2 y 22. Las secuencias para
los fragmentos peptídicos utilizados para diseñar las sondas de
oligonucleótidos son las siguientes: el péptido 19A se encuentra
entre los residuos 37 y 51, el péptido 37A entre los residuos 539 y
550, y el péptido 2A entre los residuos 565 y 572.
La secuencia de proteína humana (SEC Nº ID 4) es
el producto de traducción de 894 aminoácidos del clon 693 de ADNc
humano.
En la comparación de aminoácidos, la proteína
bovina muestra aproximadamente un 86% de identidad con el producto
de traducción humano. Cuando se consideran las sustituciones
altamente conservadas en residuos no idénticos, las dos proteínas
son aproximadamente un 94% homólogas.
Los inventores extendieron su conocimiento del
extremo 5' de la secuencia de ADNc bovino precedente con la
secuencia mostrada a continuación, 5' a 3'. La línea superior
muestra la secuencia de nucleótidos (SEC Nº ID 5), y la línea
inferior la secuencia de aminoácidos (SEC Nº ID 6). La nueva
secuencia obtenida (83 bases) está subrayada.
Los inventores han extendido también su
conocimiento del extremo 5' de la secuencia de ADNc humano
precedente. La secuencia adicional (SEC Nº ID 7) es la
siguiente:
- AGAGTCCACTTCTCA
Esta secuencia extiende el extremo 5' de la
secuencia de ADNc de la PTM humana en 15 bases. Estas secuencias se
generaron a partir del clon 754 de ADNc de hígado humano durante la
clonación de ADNc humano inicial (véase el ejemplo 3), pero se
caracterizaron después con el clon 693.
Los inventores han clarificado también una
secuencia de ADN genómico humano parcial (SEC Nº ID 8) para la
subunidad de alto peso molecular de PTM. Las líneas verticales
indican los límites intrón/exón. Las secuencias de exón están en
tipo de letra normal, las secuencias de intrón en negrita. Las
flechas indican las porciones de los intrones para las que no se
reseña la secuencia (las longitudes de las flechas no indican el
tamaño de los intrones). Los números en la columna derecha indican
la primera y última base de cada exón respecto de la secuencia de
ADNc humano mostrado supra. Este ácido nucleico genómico
extendido, así como el ADNc extendido y los fragmentos de éstos,
son útiles en la presente invención.
Los ácidos nucleicos de la presente invención
pueden aislarse a partir de una serie de fuentes, aunque las
secuencias preferidas en la presente se han aislado de ADNc humano y
bovino y de genotecas humanas genómicas. La secuencia de aminoácidos
exacta de la molécula polipeptídica producida variará con la
secuencia de ADN inicial.
Los ácidos nucleicos de la presente invención
pueden obtenerse utilizando diversos procedimientos bien conocidos
para los conocedores de la técnica. Pueden emplearse al menos tres
procedimientos principales alternativos:
- (1)
- el aislamiento de una secuencia de ADN de doble cadena a partir de ADN genómico o ADN complementario (ADNc) que contiene la secuencia;
- (2)
- la síntesis química de la secuencia de ADN; y
- (3)
- la síntesis de la secuencia de ADN mediante reacción en cadena con polimerasa (PCR)
En el primer procedimiento, puede rastrearse una
genoteca genómica o de ADNc para identificar una secuencia de ADN
que codifica toda o parte de la subunidad de alto peso molecular de
PTM. Por ejemplo, pueden rastrearse genotecas de ADNc bovino o
humano para identificar una secuencia de ADN que codifica toda o
parte de la PTM. Pueden utilizarse diversas genotecas de ADNc, por
ejemplo, una genoteca de lambda gt10 de intestino delgado bovino
(Clontech Laboratories, Inc. Palo Alto, CA), una genoteca de
UNI-ZAP^{TM} XR de lambda de hígado humano
(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), o una genoteca lambda de
gt 10 (Clontech).
Pueden utilizarse diversas técnicas para
rastrear genotecas de ADN genómico ó ADNc para secuencias blanco
que codifican la subunidad de alto peso molecular de la PTM. Esta
técnica puede, por ejemplo, emplear una sonda de ADN de doble
cadena marcada con una secuencia complementaria con la secuencia que
codifica la subunidad de alto peso molecular de la PTM. Por
ejemplo, pueden utilizarse procedimientos de hibridación ADN/ADN
para identificar la secuencia en las copias clonadas de ADN
genómico o ADNc que se han desnaturalizado hasta una forma de
cadena sencilla. Las sondas adecuadas incluyen ADNc para la
subunidad de alto peso molecular de la PTM obtenido de la misma
especie o una relacionada, oligonucleótidos sintéticos y
similares.
También puede rastrearse una genoteca de ADN
genómico ó ADNc para un ADN genómico o ADNc que codifica toda o
parte de la subunidad de alto peso molecular de la PTM utilizando
técnicas de inmunotransferencia.
En un procedimiento de rastreo típico adecuado
para las técnicas de hibridación, se dispersa primero una genoteca
de ADN genómico o ADNc en placas de agarosa, y después se
transfieren los clones a membranas de filtro, por ejemplo membranas
de nitrocelulosa. La genoteca genómica está contenida habitualmente
en un vector tal como EMBL3 ó EMBL4 o derivados de éstos (por
ejemplo, lambda DASH^{TM}). La genoteca de ADNc está habitualmente
contenida en un vector tal como \lambdagt10, \lambdagt11 ó
lambda ZAP. Puede hibridarse entonces una sonda de ADN con los
clones para identificar aquellos clones que contienen el ADN
genómico o ADNc que codifica toda o parte de la subunidad de alto
peso molecular de la PTM. Como alternativa, puede inducirse a cepas
apropiadas de E. coli que contienen los vectores
\lambdagt11 ó lambda ZAP a sintetizar proteínas de fusión que
contienen fragmentos de proteínas correspondientes a la inserción
de ADNc en el vector. Las proteínas de fusión pueden transferirse a
membranas de filtro, por ejemplo, nitrocelulosa. Puede unirse
entonces un anticuerpo a la proteína de fusión para identificar
toda o parte de la subunidad de alto peso molecular de la PTM.
En el segundo procedimiento, pueden sintetizarse
químicamente los ácidos nucleicos de la presente invención que
codifican toda o parte de la PTM. Los oligonucleótidos más cortos,
tales como de 15 a 50 nucleótidos, pueden sintetizarse
directamente. Para oligonucleótidos más largos, la secuencia de ADN
que codifica la subunidad de alto peso molecular de la PTM puede
sintetizarse como una serie de oligonucleótidos de
50-100 bases que pueden estar secuencialmente
ligados (mediante sitios de restricción terminales apropiados) de
modo que formen la secuencia lineal correcta de nucleótidos.
En el tercer procedimiento, pueden sintetizarse
los ácidos nucleicos de la presente invención que codifican toda o
parte de la subunidad de alto peso molecular de la PTM utilizando
PCR. Resumiendo, se utilizan partes de oligonucleótidos de ADN
sintéticos, generalmente de al menos 15 bases de longitud (cebadores
de PCR) que se hibridan a las cadenas opuestas de la secuencia
blanco de ADN para amplificar enzimáticamente la región intermedia
de ADN en la secuencia blanco. Los ciclos repetidos de
desnaturalización por calor del molde, reasociación de los
cebadores y extensión de los extremos 3' de los cebadores
reasociados, dan como resultado la amplificación del segmento
definido por los cebadores de PCR. Véase White, T.J. et al.,
Trends Genet. 5, 185-189 (1989).
Pueden modificarse también los ácidos nucleicos
de la presente invención que codifican toda o parte de la PTM (es
decir, mutarse) para preparar diversas mutaciones. Dichas mutaciones
pueden cambiar la secuencia de aminoácidos codificada por el codon
mutado, o pueden ser silenciosos y no cambiar la secuencia de
aminoácidos. Estos ácidos nucleicos modificados pueden prepararse,
por ejemplo, mediante mutación del ácido nucleico que codifica la
subunidad de alto peso molecular de la PTM de modo que la mutación
dé como resultado la deleción, sustitución, inserción, inversión o
adición de uno o más aminoácidos en el polipéptido codificado
utilizando uno o más procedimientos conocidos en la técnica. Por
ejemplo, pueden emplearse los procedimientos de mutagénesis
dirigida a sitio descritos en Taylor, J.W. et al., Nucl.
Acids Res. 13, 8749-8764 (1985) y Kunkel, J.A.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 482-492 (1985).
Además, pueden adquirirse estuches para mutagénesis dirigida a sitio
de proveedores comerciales. Por ejemplo, puede adquirirse un estuche
para realizar mutagénesis dirigida a sitio en Amersham Corp.
(Arlington Heigths, IL). Además, pueden emplearse también
procedimientos de adición, disrupción, deleción o truncamiento como
se describen en Sayers, J.R. et al., Nucl. Acids Res. 16,
791-800 (1988). Las mutaciones pueden ser
ventajosas para la producción o el uso de los polipéptidos de la
presente invención. Por ejemplo, estas mutaciones pueden modificar
la función de la proteína (por ejemplo, dando como resultado una
actividad mayor o menor), permitir niveles mayores de producción de
proteína o una purificación más sencilla de la proteína, o
proporcionar sitios de reconocimiento de endonucleasas de
restricción en el ácido nucleico. Todas dichas moléculas de ácidos
nucleicos y polipéptidos modificados están incluidas en el alcance
de la presente invención.
La presente invención se refiere además a
vectores de expresión que comprenden una secuencia de ADN como se
define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. Se prefieren
además vectores de expresión que comprenden una o más secuencias
reguladoras de ADN unidas operativamente a la secuencia de ADN como
se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. Como se
utiliza en este contexto, el término "unido operativamente"
significa que las secuencias reguladoras de ADN son capaces de
dirigir la replicación y/o expresión de la secuencia de ADN que
codifica toda o parte de la subunidad de alto peso molecular de la
PTM.
Los vectores de expresión de utilidad en la
presente invención están a menudo en forma de "plásmidos", que
representan bucles de ADN de doble cadena circular que, en su forma
de vector, no están unidos al cromosoma. Sin embargo, la invención
se pretende que incluya dichas otras formas de vectores de expresión
que tengan funciones equivalentes y que se den a conocer en la
técnica posteriormente. Los vectores de expresión de la presente
invención pueden utilizarse también para integrar de forma estable
la secuencia de ADN que codifica la subunidad de alto peso
molecular de la PTM en el cromosoma de una célula huésped apropiada
(por ejemplo, células COS ó HepG2).
Los vectores de expresión útiles en la presente
invención contienen típicamente un origen de replicación, un
promotor localizado 5' a (es decir, cadena arriba de) la secuencia
de ADN, seguido de la secuencia de ADN que codifica toda o parte de
la subunidad de alto peso molecular de la PTM, secuencias de
terminación de la transcripción y el vector restante. Los vectores
de expresión pueden incluir también otras secuencias de ADN
conocidas en la técnica, por ejemplo secuencias líder de
estabilidad, que proporcionan estabilidad al producto de expresión,
secuencias líder secretoras, que proporcionan la secreción del
producto de expresión, secuencias que permiten la modulación de la
expresión del gen estructural a modular (por ejemplo mediante la
presencia o la ausencia de nutrientes u otros inductores en el
medio de crecimiento), secuencias de marcaje que son capaces de
proporcionar una selección fenotípica en células huésped
transformadas, secuencias que proporcionan sitios para el corte
mediante endonucleasas de restricción y secuencias que permiten la
expresión en varios tipos de huéspedes, incluyendo pero sin
limitación, procariotas, levaduras, hongos, plantas y eucariotas
superiores. Las características del vector de expresión real
utilizado deben ser compatibles con la célula huésped que se va a
emplear. Por ejemplo, cuando se expresan secuencias de ADN en un
sistema celular mamífero, el vector de expresión debe contener
promotores aislados del genoma de células de mamífero (por ejemplo,
el promotor de metalotionina de ratón), o de virus que crezcan en
estas células (por ejemplo, promotor 7,5 K de virus de vacuna). Un
vector de expresión como se contempla en la presente invención es
capaz al menos de dirigir la replicación, y preferiblemente la
expresión, de los ácidos nucleicos de la presente invención. Los
orígenes de replicación adecuados incluyen, por ejemplo, los
orígenes de replicación Col E1, SV40 viral y M13. Los promotores
adecuados incluyen, por ejemplo, el promotor de citomegalovirus, el
promotor lac Z, el promotor gal 10 y el promotor polihédrico del
virus de la polihedrosis nuclear múltiple de Autographa
californica (AcMNPV). Las secuencias de terminación adecuadas
incluyen, por ejemplo, las señales de poliadenilación de la hormona
del crecimiento bovina, SV40, lac Z y AcMNPV polihédrico. Los
ejemplos de marcadores selectivos incluyen la resistencia a
neomicina, ampicilina e higromicina y similares. Todos estos
materiales son conocidos en la técnica y están comercialmente
disponibles.
Los vectores de expresión comercialmente
disponibles adecuados en los que las secuencias de ADN de la
presente invención pueden insertarse incluyen los vectores de
expresión de mamíferos pcDNAI ó pcDNA/Neo, el vector de expresión
de baculovirus pBlueBac, el vector de expresión procariótica pcDNAII
y el vector de expresión de levadura pYes2, todos los cuales pueden
obtenerse de Invitrogen Corp., San Diego, CA.
Los vectores de expresión adecuados que
contienen las secuencias de codificación y control deseadas pueden
construirse utilizando técnicas de ADN recombinante convencionales
conocidas en la técnica, muchas de las cuales se describen en
Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
NY (1989).
La presente invención se refiere además a
células huésped que contienen un vector de expresión como se ha
definido anteriormente. Véanse, por ejemplo, las células huésped del
ejemplo 4 a continuación en la descripción adjunta, que son
preferidas. Las células huésped contienen preferiblemente un vector
de expresión que comprende toda o parte de una secuencia de ADN con
la secuencia de nucleótidos sustancialmente como se muestra en las
SEC Nº ID 1, 2, 5, 7, 8, 1 junto con 5, 2 junto con 7, las primeras
108 bases de 2 junto con 8, y las primeras 108 bases de 2 junto con
7 y 8. Véase por ejemplo el vector de expresión que aparece en el
ejemplo 4 a continuación en la descripción adjunta, que es
preferido. Se prefieren además células huésped que contienen un
vector de expresión que comprende una o más secuencias reguladoras
de ADN capaces de dirigir la replicación y/o la expresión de, y
operativamente unidas a, una secuencia de ADN que codifica toda o
parte de la subunidad de alto peso molecular de la PTM. Las células
huésped adecuadas incluyen tanto células procarióticas como
eucarióticas. Las células huésped procarióticas adecuadas incluyen,
por ejemplo, las cepas de E. coli HB101, DH5a, XL1 Blue,
Y1090 y JM101. Las células huésped eucarióticas adecuadas incluyen,
por ejemplo, células de insecto de Spodoptera frugiperda,
células COS-7, fibroblastos de piel humana y células
de Saccharomyces cerevisiae.
Los vectores de expresión pueden introducirse en
células huésped mediante diversos procedimientos conocidos en la
técnica. Por ejemplo, puede llevarse a cabo la transfección de
células huésped con vectores de expresión mediante el procedimiento
de precipitación con fosfato de calcio. Sin embargo, pueden
emplearse también otros procedimientos para la introducción de
vectores de expresión en células huésped, por ejemplo electroporado,
fusión liposómica, inyección nuclear e infección viral o por
fago.
Después de introducir un vector de expresión en
una célula huésped apropiada, la célula huésped puede cultivarse en
condiciones que permitan la expresión de grandes cantidades del
polipéptido deseado, en este caso una molécula de polipéptido que
comprende toda o parte de la subunidad de alto peso molecular de la
PTM.
Las células huésped que contienen un vector de
expresión como se ha definido anteriormente pueden identificarse
mediante uno o más de los siguientes seis enfoques: (a) la
hibridación ADN-ADN; (b) la presencia o ausencia de
funciones de gen marcador; (c) la evaluación del nivel de
transcripción medido por la producción de transcriptos de ARNm que
codifican la subunidad de alto peso molecular de la PTM en la célula
huésped; (d) la detección del producto génico inmunológicamente;
(e) el ensayo enzimático; y (f) PCR.
En el primer enfoque, puede detectarse la
presencia de una secuencia de ADN como se ha definido anteriormente
mediante hibridación ADN-ADN ó
ARN-ARN utilizando sondas complementarias con la
secuencia de ADN.
En el segundo enfoque, puede identificarse y
seleccionarse el sistema huésped del vector de expresión
recombinante basándose en la presencia o ausencia de ciertas
funciones génicas de marcador (por ejemplo, actividad timidina
quinasa, resistencia a antibióticos, etc.). Puede colocarse un gen
marcador en el mismo plásmido que la secuencia de ADN como se ha
definido anteriormente bajo la regulación del mismo promotor
utilizado para regular la secuencia de codificación de la PTM o uno
diferente. La expresión del gen marcador indica la expresión de la
secuencia de ADN como se ha definido anteriormente.
En el tercer enfoque, la producción de
transcriptos de ARNm que codifican la subunidad de alto peso
molecular de la PTM puede evaluarse mediante ensayos de
hibridación. Por ejemplo, puede aislarse ARN poliadenilado y
analizarse por transferencia Northern o un ensayo de protección de
nucleasa, utilizando una sonda complementaria con la secuencia de
ARN. Como alternativa, puede extraerse el ARN total de la célula
huésped y ensayarse la hibridación a tales sondas.
En el cuarto enfoque, puede evaluarse la
expresión de toda o parte de la subunidad de alto peso molecular de
la PTM inmunológicamente, por ejemplo, mediante inmunotransferencia
con anticuerpo frente a PTM (transferencia Western).
En el quinto enfoque, puede medirse la expresión
de la subunidad de alto peso molecular de la PTM ensayando la
actividad enzimática de la PTM utilizando procedimientos conocidos.
Por ejemplo, puede emplearse el ensayo descrito a continuación en la
descripción adjunta.
En el sexto enfoque, se utilizan cebadores
oligonucleótidos homólogos a las secuencias presentes en el sistema
de expresión (es decir, secuencias del vector de expresión o
secuencias PTM) en una PCR para producir un fragmento de ADN de
longitud predicha, indicando la incorporación del sistema de
expresión a la célula huésped.
Las secuencias de ADN de vectores de expresión,
plásmidos o moléculas de ADN de la presente invención pueden
determinarse mediante diversos procedimientos conocidos en la
técnica. Por ejemplo, puede emplearse el procedimiento de
terminación didesoxi de la cadena, como se describe en Sanger et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467
(1977), o el procedimiento Maxam-Gilbert como se
describe en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560-564
(1977).
Para expresar la PTM catalíticamente activa,
puede ser necesario producir un complejo de proteína que contenga
tanto la subunidad de alto como de bajo peso molecular de la PTM. La
subunidad de bajo peso molecular de la PTM es una proteína
caracterizada anteriormente, la proteína disulfuro isomerasa (PDI).
Se ha clonado el ADNc de PDI de humano [Pihlajaniemi et al.,
EMBO J. 6, 643-649 (1987)], bovina [Yamaguchi et
al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 146, 1485-1492
(1987)], de rata [Edman et al., Nature 317,
267-270 (1985)] y de pollo [Kao et al.,
Connective Tissue Research 18, 157-174 (1988)].
Pueden utilizarse diversos enfoques en la
producción de una proteína que contiene tanto las subunidades de
alto como de bajo peso molecular de la PTM. Por ejemplo, pueden
insertarse secuencias de ADNc que codifican las subunidades en el
mismo vector de expresión o vectores de expresión diferentes y
expresarse en una célula huésped apropiada para producir la
proteína.
Debe entenderse, por supuesto, que no todos los
vectores de expresión y secuencias reguladoras de ADN funcionarán
igualmente bien para expresar las secuencias de ADN de la presente
invención. Ni todas las células huésped funcionarán igualmente bien
con el mismo sistema de expresión. Sin embargo, un conocedor de la
técnica puede hacer una selección entre vectores de expresión,
secuencias reguladoras de ADN y células huésped utilizando la guía
proporcionada en la descripción adjunta sin experimentación indebida
y sin salirse del alcance de la presente invención.
Se describen además moléculas de polipéptidos
que comprenden toda o parte de la subunidad de alto peso molecular
de la PTM, teniendo las citadas moléculas de polipéptido
preferiblemente toda o parte de la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC Nº ID 3, 4 ó 3 junto con 6. En el caso de
moléculas de polipéptido que comprenden parte de la subunidad de
alto peso molecular de la PTM, se prefiere que las moléculas de
polipéptido sean al menos de aproximadamente 5 a 8 aminoácidos
secuenciales de longitud, más preferiblemente al menos de
aproximadamente 15 a 20 aminoácidos secuenciales de longitud. Se
describen también los polipéptidos de al menos aproximadamente 180
aminoácidos secuenciales de longitud, que pueden aproximarse al
tamaño de un dominio estructural en una proteína.
Todas las secuencias de aminoácidos se
representan en la descripción adjunta mediante fórmulas cuya
orientación de izquierda a derecha está en la dirección convencional
de extremo amino a extremo carboxi.
Los polipéptidos pueden obtenerse por medios
sintéticos, es decir, síntesis química del polipéptido a partir de
sus aminoácidos componentes, mediante procedimientos conocidos por
los conocedores de la técnica. Por ejemplo, puede emplearse el
procedimiento de fase sólida descrito en Houghton et al.,
Proc. Natl. Aca. Sci. USA, 82, 5131-5135 (1985).
Los polipéptidos se obtienen mediante producción en células huésped
procarióticas o eucarióticas que expresan una secuencia de ADN de
acuerdo con la invención o mediante traducción in vitro del
ARNm codificado por una secuencia de ADN de acuerdo con la presente
invención. Por ejemplo, pueden sintetizarse la secuencia de ADN de
SEC. Nº ID 1, 2, 8, 1 junto con 5, 2 junto con 7, las primeras 108
bases de 2 junto con 7 y 8, utilizando PCR como se describió
anteriormente e insertándolas en un vector de expresión adecuado,
que a su vez puede utilizarse para transformar células huésped
adecuadas. La célula huésped recombinante puede cultivarse entonces
para producir la subunidad de alto peso molecular de la PTM. Las
técnicas para la producción de polipéptidos con estos medios son
conocidas en la técnica, y se describen en la descripción
adjunta.
Los polipéptidos producidos de esta manera
pueden aislarse entonces y purificarse hasta cierto grado utilizando
diversas técnicas de purificación de proteína. Por ejemplo, pueden
emplearse procedimientos cromatográficos tales como cromatografía
de intercambio iónico, cromatografía de filtración de gel y
cromatografía de inmunoafinidad.
Los polipéptidos pueden utilizarse en una amplia
variedad de maneras. Por ejemplo, pueden utilizarse para preparar
de manera conocida anticuerpos monoclonales o policlonales capaces
de unirse a los polipéptidos. Estos anticuerpos pueden utilizarse a
su vez para la detección de los polipéptidos de la presente
invención en una muestra, por ejemplo una muestra celular,
utilizando técnicas de inmunoensayo, por ejemplo radioinmunoensayo,
inmunoesnsayo enzimático o inmunocitoquímica. Estos anticuerpos
pueden utilizarse también en cromatografía de afinidad para el
aislamiento o la purificación de los polipéptidos de la presente
invención de diversas fuentes.
Los polipéptidos se han definido mediante ADN
determinados y se ha deducido la secuenciación de aminoácidos.
Debido a la degeneración del código genético, pueden utilizarse
otras secuencias de ADN que codifican las mismas secuencias de
aminoácidos descritas en las SEC Nº ID 3, 4, 3 junto con 6 o
cualquier parte de éstas para la producción de los
polipéptidos.
Debe entenderse también que existen de forma
natural variaciones alélicas de estos ADN y secuencias de
aminoácidos, o que pueden introducirse intencionalmente utilizando
procedimientos conocidos en la técnica. Estas variaciones pueden
demostrarse mediante uno o más cambios de aminoácidos en la
secuencia general, tales como deleciones, sustituciones,
inserciones, inversiones o adición de uno o más aminoácidos en la
citada secuencia. Dichos cambios pueden ser ventajosos para la
producción o uso de los polipéptidos de la presente invención; por
ejemplo en el aislamiento de PTM o de polipéptidos por purificación
de afinidad. Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse,
por ejemplo, basándose en la similaridad de polaridad, carga,
solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza
anfipática de los residuos implicados. Por ejemplo, los aminoácidos
cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico;
los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina;
los aminoácidos con grupos de cabeza polares no cargados o grupos de
cabeza no polares incluyen los siguientes: leucina, isoleucina,
valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina,
fenilalanina, tirosina. Otras variaciones contempladas incluyen las
sales y ésteres de los polipéptidos anteriormente citados, así como
los precursores de los polipéptidos anteriormente citados; por
ejemplo, precursores con sustituyentes N-terminales
tales como metionina, N-formilmetionina y secuencias
líder. Todas dichas variaciones están incluidas en el alcance de la
presente invención.
La presente invención se refiere además a un
procedimiento para la detección de una secuencia de ácido nucleico
como se define en la reivindicación 7.
Puede aislarse una muestra de ADN que contiene
la secuencia de ADN utilizando diversos procedimientos de
aislamiento de ADN que son bien conocidos para los conocedores de
la técnica. Por ejemplo, puede aislarse una muestra de ADN genómico
a partir de tejido mediante un rápido congelamiento del tejido del
que se va a aislar el ADN, trituración del tejido para producir
trozos fácilmente digeribles, colocación del tejido triturado en una
solución de proteinasa K y SDS, e incubación de la solución
resultante hasta que se degrada la mayoría de la proteína celular.
Se desproteiniza entonces el ADN genómico mediante extracciones
sucesivas con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico, se recupera por
precipitación con etanol y se seca y resuspende en tampón.
Se prefiere también el procedimiento en el que
la secuencia de ácido nucleico es una secuencia de ARN.
Preferiblemente, la secuencia de ARN es una secuencia de ARNm. Se
prefiere adicionalmente el procedimiento en el que la secuencia de
ARN está localizada en las células de una muestra de tejido. Puede
aislarse una muestra de ARN que contiene la secuencia de ARN
utilizando diversos procedimientos de aislamiento de ARN que son
bien conocidos por los conocedores de la técnica. Por ejemplo,
puede aislarse una muestra de ARN de células cultivadas mediante
lavado de las células exentas de medio y después lisado de las
células mediante colocación en una solución de guanidinio
4 M. Se reduce la viscosidad de la solución resultante mediante el empuje del lisado a través de una aguja de calibre 20. Se sedimenta entonces el ARN mediante una etapa de gradiente de cloruro de cesio, y se retira cuidadosamente el fluido sobrenadante del ARN encontrado en el sedimento del ADN y proteína contaminantes.
4 M. Se reduce la viscosidad de la solución resultante mediante el empuje del lisado a través de una aguja de calibre 20. Se sedimenta entonces el ARN mediante una etapa de gradiente de cloruro de cesio, y se retira cuidadosamente el fluido sobrenadante del ARN encontrado en el sedimento del ADN y proteína contaminantes.
El marcador detectable útil para detectar una
secuencia de ácido nucleico que codifica toda o parte de la
subunidad de alto peso molecular de la PTM o un secuencia de ácido
nucleico relacionado puede ser una secuencia de ADN marcado,
incluyendo una secuencia de ADNc marcado, con una secuencia de
nucleótidos complementaria con al menos una parte de la secuencia
de ADN que codifica toda o parte de la subunidad de alto peso
molecular de la PTM.
El marcador detectable puede ser también un ARN
marcado con una secuencia complementaria con al menos una parte de
la secuencia de ADN que codifica toda o parte de la subunidad de
alto peso molecular de la PTM.
Los marcadores detectables de la presente
invención pueden estar marcados con marcas radiactivas empleadas
habitualmente, tales como ^{32}P y ^{35}S, aunque pueden
emplearse otras marcas tales como biotina o mercurio. Pueden
utilizarse diversos procedimientos bien conocidos por aquellos
conocedores de la técnica para marcar los marcadores detectables.
Por ejemplo, pueden marcarse las secuencias de ADN y ARN con
^{32}P ó ^{35}S utilizando el procedimiento del cebador
aleatorio.
Una vez se ha obtenido el marcador detectable,
pueden emplearse diversos procedimientos bien conocidos por los
conocedores de la técnica para poner en contacto el marcador
detectable con la muestra de interés. Por ejemplo pueden realizarse
hibridaciones ADN-ADN, ARN-ARN y
ADN-ARN utilizando procedimientos estándares
conocidos en la técnica. En un procedimiento de hibridación
ADN-ADN típico para detectar secuencias de ADN que
codifican toda o parte de la PTM en ADN genómico, se aisla en
primer lugar el ADN genómico utilizando procedimientos conocidos, y
después se digiere con una o más enzimas de restricción. Se separan
los fragmentos de ADN resultantes en geles de agarosa, se
desnaturalizan in situ, y se transfieren a filtros de
membrana. Después de la prehibridación para reducir la hibridación
no específica, se hibrida una sonda de ácido nucleico omarcado
radiactivamente a los fragmentos de ADN inmovilizados. Se lava
entonces la membrana para retirar la sonda no unida o unida
débilmente, y después se autorradiografía para identificar los
fragmentos de ADN que se han hibridado a la sonda.
La presencia de marcador detectable unido puede
detectarse utilizando diversos procedimientos bien conocidos por
los conocedores de la técnica. Por ejemplo, si el marcador
detectable está marcado radiactivamente, puede emplearse una
autorradiografía. Dependiendo de la marca empleada, pueden emplearse
también otros procedimientos de detección tales como
espectrofotometría.
Debe entenderse que las secuencias de ácidos
nucleicos relacionadas con las secuencias de ácidos nucleicos que
codifican toda o parte de la subunidad de alto peso molecular de la
PTM pueden detectarse también utilizando los procedimientos
descritos en la descripción adjunta. Por ejemplo, puede utilizarse
una sonda de ADN que tiene regiones conservadas del gen de la
subunidad de alto peso molecular de PTM humana o bovina para
detectar y aislar secuencias de ADN relacionadas (por ejemplo, una
secuencia de ADN que codifica la subunidad de alto peso molecular de
PTM de ratones, ratas, hámsteres o perros). Todos dichos
procedimientos están incluidos dentro del alcance de la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se describen además procedimientos para la
detección de inhibidores de PTM. En particular, la presente
invención se refiere a un procedimiento para la detección de un
inhibidor de PTM que comprende: (a) incubar una muestra que se cree
que contiene un inhibidor de PTM con lípidos marcados
detectablemente en partículas donantes, partículas receptoras y
PTM; y (b) medir la transferencia estimulada por PTM de los lípidos
marcados detectablemente de las partículas donantes a las
partículas receptoras. En este ensayo, un inhibidor reduciría la
velocidad de transferencia estimulada por PTM del lípido marcado
detectable de las partículas donantes a receptoras. La detección
puede llevarse a cabo mediante resonancia magnética nuclear (RMN),
resonancia de espín de electrón (ESR), marcaje radiactivo (que se
prefiere), marcaje fluorescente y similares. Las partículas donantes
y receptoras pueden ser membranas, HDL, lipoproteínas de baja
densidad (LDL), SUV, lipoproteínas y similares. HDL y SUV son las
partículas donantes preferidas; LDL y SUV son las partículas
receptoras preferidas.
Se llevó a cabo el siguiente procedimiento para
identificar el inhibidor de PTM.
\vskip1.000000\baselineskip
A (compuesto de
referencia)
\vskip1.000000\baselineskip
que tiene como nombre clorhidrato
de
2-[1-(3,3-difenilpropil)-4-piperidinil]-2,3-dihidro-3-oxo-1H-isoindol
(representado en la descripción adjunta como "compuesto A"). El
procedimiento precedente identificaba también el inhibidor de
PTM
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
que tiene como nombre
1-[3-(6-fluoro-1-tetraalanil)-metil]-4-O-metoxifenilpiperazina
(representado en la descripción adjunta como "compuesto
B").
Estos compuestos se identificaron mediante los
procedimientos descritos en los ejemplos de trabajo a continuación
en la descripción adjunta.
La presente invención se refiere también a usos
de acuerdo con las reivindicaciones 13 a 17.
Pueden utilizarse diversos agentes que reducen
eficazmente la cantidad o actividad de la PTM en la práctica de los
procedimientos de la presente invención. Los inhibidores de PTM
pueden aislarse utilizando la metodología de rastreo descrita
anteriormente en la descripción adjunta y en el ejemplo 5 a
continuación en la descripción adjunta. El compuesto B, que se
identifica como inhibidor de PTM (véase el ejemplo 6 a continuación
en la descripción adjunta), es útil en realizaciones específicas de
los procedimientos de tratamiento precedentes.
Pueden utilizarse moléculas sin sentido para
reducir la cantidad de PTM. [Véase Toulme y Helene, Gene 72,
51-58 (1988); Inouye Gene 72, 25-34
(1988); y Uhlmann y Peyman, Chemical Reviews 90,
543-584 (1990)]. Las moléculas de PTM sin sentido
pueden diseñarse basándose en el ADN genómico y ADNc precedentes,
correspondientes a las regiones de control adyacentes 5' y 3',
otras regiones adyacentes o secuencias de intrón. Dichas moléculas
sin sentido incluyen oligodesoxi-rribonucleótidos
sin sentido, oligorribonucleótidos, análogos de oligonucleótidos y
similares, y pueden comprender de aproximadamente 15 a 25 bases o
más. Dichas moléculas sin sentido pueden unirse no covalentemente o
covalentemente al ADN o ARN de la subunidad de alto peso molecular
de la PTM. Dicha unión puede, por ejemplo, cortar o facilitar el
corte del ADN ó ARN de PTM, aumentar la degradación del ARNm
nuclear o citoplasmático o inhibir los factores de transcripción,
traducción, unión o transactivación, o el empalme o procesamiento
pre-ARNm. Todos estos efectos reducirían la
expresión de PTM y harían por ello útiles a las moléculas sin
sentido para los procedimientos precedentes de tratamiento.
Las secuencias blanco potenciales para un
enfoque sin sentido incluyen, pero sin limitación, la secuencia de
ADN ó ARN que codifica PTM, sus regiones de control adyacentes 5' y
3', otras regiones adyacentes y las secuencias de apareamiento de
bases no clásicas de Watson y Crick utilizadas en la formación de
ADN triplex. Las moléculas sin sentido dirigidas hacia secuencias
tándem de la subunidad de alto peso molecular de PTM pueden ser
ventajosas.
Las moléculas sin sentido pueden contener además
funciones adicionales que aumenten su estabilidad, actividad,
transporte dentro y fuera de las células y similares. Dichas
funciones adicionales pueden, por ejemplo, unir o facilitar la unión
a moléculas blanco, o cortar o facilitar el corte de moléculas
blanco.
Pueden construirse vectores que dirijan la
síntesis de ADN ó ARN sin sentido. En este caso, la longitud de la
molécula sin sentido puede ser mucho mayor; por ejemplo de 400
pb.
Los procedimientos de la presente invención para
reducir los niveles de colesterol o TG en suero o prevenir,
estabilizar o causar la regresión de la aterosclerosis están basados
en parte en el descubrimiento por los inventores de que la
enfermedad genética abetalipoproteinemia está causada por una falta
de PTM funcional. Los inventores han demostrado un defecto génico
en dos sujetos abetalipoproteinémicos mediante los siguientes
procedimientos.
Se midió la actividad de transferencia de TG
como la velocidad de transferencia de TG de SUV donantes a SUV
receptoras estimulada por proteína. Para preparar las vesículas
donantes y receptoras, se mezclaron los lípidos apropiados en
cloroformo en un tubo de vidrio borosilicato con tapa de rosca de 16
x 125 mm (Fisher Scientifc Co., Pittsburgh, PA, nº cat.
14-933-1A) y después se secó en
corriente de nitrógeno. Se añadieron 2 ml de tampón 15/40 (Tris 15
mM, pH 7,4, cloruro de sodio 40 mM, EDTA 1 mM y
NaN_{3} al 0,02%) a los lípidos secados (ó 100 \mul por ensayo,
que es siempre el volumen menor), se hizo pasar una corriente de
nitrógeno sobre el tampón, después se roscó rápidamente la tapa a
una trampa con atmósfera de nitrógeno sobre la suspensión lipídica.
Se sonicaron en baño los lípidos en el tampón en un Special
Ultrasonic Cleaner (nº cat. G112SP1, Laboratory Supplies Co.,
Hicksville, NY). Se marcaron radiactivamente la fosfatidilcolina
donante y receptora (PC)
(L-alfa-fosfatidilcolina de huevo,
Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) mediante la adición de trazas de
[^{3}H]-dipalmitoilfosfatidilcolina
(L-alfa-dipalmitoil
[2-palmitoil-9,10-^{3}H(N)],
33 Ci/mmol, DuPont NEN) hasta una actividad específica aproximada de
100 cpm/nmol. Se mezclaron vesículas donantes que contenían 40 nmol
de PC de huevo, [^{14}C]TG al 0,2% en moles [mezcla de
(trioleína[carboxilo-^{14}C],
aproximadamente 100 mCi/mmol, DuPont NEN) y trioleína sin marcar
(trioleína, Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) para una actividad
específica final de aproximadamente 200.000 cpm/nmol] y cardiolipina
al 7,3% en moles (cardiolipina cardiaca bovina, Sigma Chemical Co.)
y vesículas receptoras que contenían 240 nmol de PC de huevo y TG al
0,2% en moles, con 5 mg de albúmina de suero bovino exenta de ácidos
grasos (BSA) y una alícuota de las muestras de PTM en 0,7 a 0,9 ml
de tampón 15/40, y se incubó durante 1 hora a 37ºC de temperatura.
Se terminó la reacción de transferencia mediante la adición de 0,5
ml de suspensión de DEAE-celulosa (suspensión 1:1 de
DE-52, intercambiador de aniones de
DEAE-celulosa prehinchado, Fisher, nº cat.
05720-5 en Tris 15 mM, pH 7,4, EDTA 1
mM y NaN_{3} al 0,02%). Se agitó la mezcla de reacción
durante 5 minutos y se sedimentó la DEAE-celulosa
con membranas donantes unidas (las membranas donantes contenían la
cardiolipina cargada negativamente y unida a la DEAE) mediante
centrifugación a baja velocidad.
Se cuantificaron los ^{14}C-TG
y ^{3}H-PC restantes en el sobrenadante mediante
recuento de centelleo. Se calculó la transferencia de TG mediante
comparación de la proporción de ^{14}C-TG
(transferido de las membranas donantes a las membranas receptoras)
a ^{3}H-PC (un marcador de recuperación de
vesículas receptoras) presente en el sobrenadante antes de la
reacción de transferencia. Se calculó el porcentaje de transferencia
de ^{14}C-TG como sigue:
Para calcular la velocidad de transferencia de
TG estimulada por PTM, se restó la velocidad de transferencia de TG
en ausencia de PTM de la velocidad de transferencia de TG en
presencia de PTM. Se utilizó una cinética de primer orden para
calcular la transferencia de TG total.
Se obtuvieron anticuerpos
anti-88 kDa de la Universidad de Cincinatti. Se
había descrito anteriormente la producción de
anti-88 kDa. Wetterau et al., J. Biol. Chem.
265, 9800-9807 (1990). Para ayudar a dirigir la
especificidad de los antisueros en homogeneizados intestinales
humanos, se generó anti-88 kDa. Se dializaron de 8
a 10 mg de PTM purificada en MOPS 0,1 M, pH 7,5 y después se
añadieron a 4 ml de BioRad Affigel 15 (Bio-Rad,
Richmond, CA), que se habían prelavado 3 veces con agua a 4ºC de
temperatura. Se permitió a la PTM acoplarse a la matriz a
temperatura ambiente durante 2 horas y después se colocó a 4ºC
durante la noche. Se bloquearon los sitios reactivos restantes en
Affigel mediante la adición de 0,1 ml de etanolamina 1 M, pH
8,0, por ml de gel. Se realizaron las medidas de densidad óptica de
proteína eluida según las instrucciones del fabricante, que
indicaron que más del 90% de la PTM estaba acoplada a la columna. Se
lavó la columna con 50 ml de Tris 10 mM, pH 7,5, seguido de
50 ml de glicina
100 mM, pH 2,5, seguido de 50 ml de Tris 10 mM, pH 8,8, seguido de 50 ml de trietilamina 100 mM, pH 11,5 y finalmente se reequilibró la columna con Tris 10 mM, pH 7,5.
100 mM, pH 2,5, seguido de 50 ml de Tris 10 mM, pH 8,8, seguido de 50 ml de trietilamina 100 mM, pH 11,5 y finalmente se reequilibró la columna con Tris 10 mM, pH 7,5.
Se purificaron parcialmente los anticuerpos en
el antisuero mediante precipitación con sulfato de amonio (226 mg de
sulfato de amonio por ml de suero). Se resuspendió el residuo y se
dializó con Tris 15 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, azida de
sodio al 0,02% y cloruro de sodio 150 mM. Se aplicaron
lentamente los anticuerpos parcialmente purificados a la columna de
PTM-Affigel durante un periodo de dos horas (se
pasaron tres veces los anticuerpos por la columna). Se lavó la
columna con 100 ml de Tris 10 mM, pH 7,5, seguido de 100 ml
de Tris 10 mM, pH 7,5, cloruro de sodio
500 mM, seguido de 50 ml de glicina 100 mM, pH 2,5 (esta fracción se recogió en 5 ml de Tris 1 M (pH 8,0), seguido de Tris 10 mM, pH 8,8 hasta que la columna estuvo a pH neutro, seguido de 50 ml de trietilamina pH 11,5 (esta fracción se recogió en 5 ml de Tris 1 M, pH 8,0) y finalmente se reequilibró la columna con Tris 10 mM, pH 7,5. Se retuvieron los anticuerpos que eluyeron en el lavado ácido y se utilizaron para análisis de inmunotransferencia de las fracciones de proteína.
500 mM, seguido de 50 ml de glicina 100 mM, pH 2,5 (esta fracción se recogió en 5 ml de Tris 1 M (pH 8,0), seguido de Tris 10 mM, pH 8,8 hasta que la columna estuvo a pH neutro, seguido de 50 ml de trietilamina pH 11,5 (esta fracción se recogió en 5 ml de Tris 1 M, pH 8,0) y finalmente se reequilibró la columna con Tris 10 mM, pH 7,5. Se retuvieron los anticuerpos que eluyeron en el lavado ácido y se utilizaron para análisis de inmunotransferencia de las fracciones de proteína.
Para confirmar la especificidad de los
anticuerpos y para detectar el componente de 88 kDa de la PTM en
homogeneizados de tejido, se fraccionaron PTM bovina purificada o
la fracción a ensayar mediante PAGE-SDS
(esencialmente como se describe en Laemmli, Nature 227,
680-685 (1970)], utilizando un Gel Apparatus de 0,74
mm de Hoeffer Scientific Instruments (San Francisco, CA). Se
transfirió entonces la proteína a nitrocelulosa mediante
transferencia Western utilizando una célula de transferencia Trans
de BioRAd (Bio-Rad, Richmond, EE.UU.). Se preenfrió
el tampón de transferencia (Tris 25 mM, glicina 192
mM, pH 8,3, 20% de metanol) a 4ºC de temperatura. Se
transfirieron las proteínas durante 100 minutos a 250 miliamperios
a temperatura ambiente. Se bloquearon las membranas
5-10 minutos con tampón de bloqueo (400 \mul
antiespumante, aproximadamente 10 mg de tiomersal y 200 g de leche
secada exenta de grasa en 4 litros de Tris 50 mM, pH 7,7,
cloruro sódico 150 mM). Se añadió una alícuota del antisuero
(dilución 1:300) o anticuerpo purificado por afinidad (dilución 1:25
de anticuerpos de afinidad purificados) y se dejó reaccionar durante
la noche a temperatura ambiente. Después del lavado con tampón de
bloqueo, se añadió el anticuerpo secundario, la IgG de cabra anti-
conejo acoplada a peroxidasa de rábano picante (BioRad) a una
dilución de 1:2000 y se dejó reaccionar durante 3 horas a
temperatura ambiente. Después de una etapa de lavado, se visualizó
el anticuerpo secundario con un revelador, 50 mg de imidizal, 50 mg
de tetraclorhidrato de 3,3'-diaminobencidina y 50
\mul de H_{2}O_{2} (solución al 30%) en 50 ml de tampón de
bloqueo.
Se congelaron biopsias intestinales de sujetos
de control en ayunas y enfermos y se enviaron a
Bristol-Myers Squibb, Princeton en hielo seco. Se
homogeneizaron las biopsias con un politrón (Polytron PT4000,
Brinkmann Instrument, Inc., Westbury, NY) a ½ del valor máximo.
Típicamente, se homogeneizó una biopsia en 0,25 ml de tampón de
homogeneización (Tris 50 mM, pH 7,4, KCl 50 mM, EDTA 5
mM, leupeptina 5 \mug/ml y PMSF 2 mM). Se ajustó
una alícuota de la proteína a 0,7 ml de SDS al 1,4% y se midió la
concentración de proteína mediante el procedimiento de Lowry et
al., [J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951)]. Se
diluyó el homogeneizado con tampón de homogeneización hasta
aproximadamente 1,75 mg de proteína/ml. En algunos casos, la
proteína estaba ya más diluida y se utilizó directamente. Para
liberar las proteínas solubles de la fracción microsómica, se añadió
una parte de la solución de desoxicolato (0,56%, pH 7,5) a 10
partes de homogeneizado diluido con agitación con vórtice. Se incubó
la muestra a 4ºC de temperatura durante 30 minutos, después se
centrifugó a 103.000xg durante 60 minutos. Se retiró el
sobrenadante, se diluyó 1:1 con tampón 15/40 y después se dializó
durante la noche con tampón 15/40. Se ensayó en alícuotas de las
biopsias tratadas la actividad de transferencia de TG y se utilizó
análisis de transferencia Western para detectar la proteína de 88
kDa. Se expresó la actividad de transferencia de TG como el
porcentaje de TG donante transferido por hora en función de la
proteína de biopsia intestinal homogeneizada.
Para investigar si existe una relación entre el
defecto de PTM y la abetalipoproteinemia, se midió la actividad de
PTM en biopsias duodenales y de dudodeno-yeyuno de
cinco sujetos de control y cuatro sujetos abetalipoproteinémicos
con la forma recesiva genéticamente clásica de la
abetalipoproteinemia. Se homogeneizaron las biopsias intestinales
de los cinco sujetos normales y se trataron con detergente como se
describió anteriormente en la descripción adjunta. La transferencia
de actividad TG era fácilmente detectable en todas las biopsias de
los cinco sujetos (figura 2).
Se caracterizó adicionalmente la actividad de
transferencia de TG. Para confirmar que la hidrólisis de TG no
interfería con las medidas de actividad de transferencia de lípidos,
se extrajeron vesículas de un sujeto receptor (que contenían el
lípido transportado) después de la reacción de transferencia, y se
confirmó la identidad de los ^{14}TG por cromatografía en capa
fina. Todos los ^{14}C-TG tenían una movilidad
idéntica a la de los TG auténticos, confirmando que se estaba
transportando TG auténticos en el ensayo.
Se caracterizó la PTM humana por su estabilidad
térmica. Se inactivó al calentar a 60ºC durante 5 minutos. La
pérdida de actividad demuestra que la actividad de transferencia de
lípidos que se mide no era de un una forma intracelular de la
proteína de transferencia de éster de colesterilo (CETP), que es
térmicamente estable en estas condiciones. Ihm et al., J.
Biol. Chem. 257, 4818-4827 (1982).
Se obtuvieron biopsias intestinales de cuatro
sujetos abetalipoproteinémicos, se homogeneizaron y se midió la
actividad de transferencia de TG como se describió anteriormente en
la descripción adjunta. No se recuperó actividad de transferencia
de las biopsias de ninguno de los cuatro sujetos (figura 3). La
falta de actividad de transferencia de TG detectable podría haberse
relacionado con una incapacidad de liberar PTM de los microsomas de
las biopsias abetaliproproteinémicas por el tratamiento con
desoxicolato. Para ensayar esa posibilidad, se sometieron a
sonicación los microsomas de un sujeto además de tratarse con
detergente. La sonicación en baño libera independientemente una
actividad de transferencia de TG comparable a la del tratamiento con
detergente. Incluso en estas condiciones, no era detectable
actividad de transferencia de TG.
La siguiente posibilidad considerada era que la
falta de actividad de transferencia de TG detectable estuviera
relacionada con la incapacidad de detectarla en células que
contienen grandes gotas de grasa intracelular, tales como aquellas
que aparecen en la abetalipoproteinemia. Para ensayar esta
posibilidad, se realizaron tres controles. En primer lugar, se
midió la actividad de transferencia de TG de una biopsia de un
sujeto con enfermedad de retención de quilomicrones. Los sujetos
con enfermedad de retención de quilomicrones tienen un defecto en
el ensamblado o secreción de los quilomicrones y tienen grandes
gotas de grasa en sus enterocitos, análogas a las de los sujetos
abetalipoproteinémicos. Además, se midió la actividad de
transferencia de TG de una biopsia tomada de un individuo que no
había ayunado antes de la biopsia y de un sujeto
hipobetalipoproteinémico homocigótico. Ambos sujetos tenían también
enterocitos llenos de grasa. En los tres casos, se encontró una
actividad de transferencia de TG comparable a la de los sujetos
normales (figura 4), confirmando que la presencia de gotas de
lípido intracelular no interfieren con nuestra capacidad de
recuperar y detectar la actividad de transferencia de TG.
Para establecer el defecto bioquímico
responsable de la ausencia de actividad de transferencia de TG, se
analizaron las proteínas solubles después de la liberación de PTM
de la fracción microsómica de la biopsia homogeneizada mediante
transferencia Western con anticuerpos desencadenados frente al
componente de 88 kDa de la PTM bovina. Cuando se examinaron sujetos
normales (figura 5) ó control (figura 6) con un anticuerpo
policlonal anti-88 kDa, se observó una banda
comparable a la del componente de 88 kDa de la PTM bovina. Además,
proteínas adicionales de movilidad aumentada reaccionaron también
de forma cruzada con este anticuerpo. Para confirmar la identidad
del componente de 88 kDa de la PTM humana, se purificó por afinidad
el anticuerpo en una columna de afinidad de PTM. Después de este
tratamiento, sólo era inmunorreactiva la proteína de peso molecular
comparable con el componente de 88 kDa de PTM bovina (figura
7).
El análisis de transferencia Western de las
proteínas solubles después del tratamiento con detergente de los
microsomas de los cinco sujetos normales y los tres sujetos de
control demostró la presencia del componente de 88 kDa de la PTM
(figuras 5 a 7). En contraposición, no apareció ninguna proteína
correspondiente al componente de 88 kDa de PTM bovina en los
sujetos abetalipoproteinémicos (figura 8). Además, se realizó un
análisis similar con 100 \mug de proteína de los homogeneizados
intestinales enteros de dos sujetos abetalipoproteinémicos. De
nuevo, no apareció ninguna banda correspondiente al componente de 88
kDa (figura 8). Como control, el análisis de inmunotransferencia
con anticuerpos anti-PDI demostró la presencia de
PDI en estos dos últimos sujetos abetalipoproteinémicos. Estos
resultados demuestran que la base bioquímica para la ausencia de
actividad de PTM en los sujetos abetalipoproteinémicos es la
deficiencia marcada o la ausencia del componente de 88 kDa de la
PTM.
Se obtuvieron dos biopsias intestinales a partir
de la mucosa duodenal de un paciente abetalipoproteinémico de 39
años. Los análisis previos demostraron que no eran detectables la
actividad de PTM ni el componente de 88 kDa de la PTM en biopsias
intestinales tomadas de este sujeto. Cada biopsia pesó
5-10 mg y se almacenó congelada a -70ºC. Para
aislar el ARN total, se colocó una biopsia congelada en un tubo de
microcentrífuga que contenía 0,8 ml de RNAzol B frío (CinnaBiotecx
labs, Friendswoos, Tejas). Se homogeneizó inmediatamente la biopsia
mediante politrón (Brinkmann, Westbury, NY) con 6 carreras a un
valor de 10. Se añadió cloroformo (80 \mul) y se invirtió
suavemente la mezcla 20 veces. Después de 5 minutos de incubación en
hielo, se centrifugó la mezcla a 14.000 rpm en un Eppendorf de
microcentrífuga 5415 (Brinkmann) durante 15 minutos a 4ºC de
temperatura. Se precipitó el ARN total mediante la adición de 350
\mul de isopropanol al sobrenadante. El rendimiento de la biopsia
fue de 20 \mug de ARN total, o aproximadamente 2 \mug de ARN por
mg de tejido (0,2%).
Se transcribió de forma inversa el ARN (50 ng) a
la primera cadena de ADNc utilizando cebadores hexámeros aleatorios
2,5 \muM, cloruro de magnesio 5 mM, cada trifosfato
de desoxinucleótido 1 mM (dNTP), RNAsina 1 U/\mul,
transcriptasa inversa del virus de la leucemia Moloney murina
((M-MLV-RT) 2,5 U/\mul y tampón
de reacción de PCR 1x (estuche de PCR de ARN nº
N808-0017 de
Perkin-Elmer-Cetus). Se incubaron
los 20 \mul de reacción a temperatura ambiente durante 10 minutos
para reasociar los cebadores, y después a 42ºC de temperatura
durante 30 minutos para transcribir de forma inversa el ARN. Se
terminó la reacción mediante el calentamiento a 99ºC de temperatura
durante 5 minutos y enfriamiento a 5ºC. Se añadió la primera cadena
de ADNc a 100 \mul de PCR que contenía cebadores directos e
inversos 0,15 \muM, cloruro de magnesio 2 mM, cada
dNTP 0,2 mM y polimerasa Taq 2,5 U en tampón PCR 1,25x. Se
realizó la amplificación en un ciclador térmico modelo Gene Amp PCR
System 9600 de Perkin-Elmer durante 50 ciclos
constituidos por 94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 30 segundos,
y 72ºC durante 1 minuto. Se incubó después la reacción a 72ºC
durante 7 minutos. Se muestran a continuación los cebadores
directos e inversos utilizados para amplificar la región 5' del ARN
que codifica el componente de 88 kDa de la PTM, 5' a 3'.
\vskip1.000000\baselineskip
Se muestran a continuación las combinaciones de
cebadores utilizados y la longitud del producto PCR
Las secuencias del cebador se basan en el ADNc
humano normal que codifica el componente de 88 kDa de la PTM. Todos
los cebadores se escriben de 5' a 3'. F se refiere al cebador
directo y R al cebador inverso. El subrayado identifica los sitios
de restricción reconocidos por Eco RI (cebador 578F) ó Bam HI
(cebadores 1029R y 2117R), que se incorporaron al extremo 5' de los
cebadores.
Se aisló ADN genómico de una segunda biopsia
intestinal congelada. Se colocó la biopsia en un tubo de
microcentrífuga que contenía 400 \mul de tampón de extracción
(Tris.Cl 10 mM, pH 8,0, EDTA 0,1 M, SDS al 0,5%,
RNAasa I 20 \mug/ml) y se homogeneizó inmediatamente. Se realizó
la homegeneización con 5 carreras a un valor de 10. Se añadió
proteinasa K a una concentración final de 100 \mug/ml y se incubó
la reacción a 50ºC de temperatura durante 3 horas. Se agitó
periódicamente la mezcla.
Después del enfriar la reacción hasta
temperatura ambiente, se añadieron 400 \mul de fenol/cloroforomo
saturado con Tris (pH 8,0). Se invirtió suavemente el tubo durante
5 minutos y después se centrifugó a 14.000 rpm a temperatura
ambiente. Se añadieron cloruro de sodio 2 M (35 \mul) y
etanol (0,7 ml) al sobrenadante (350 \mul) para precipitar el ADN.
Se centrifugó brevemente el ADN, se lavó suavemente con etanol al
70%, se secó brevemente y se resuspendió en 20 \mul de agua
desionizada (dH_{2}O). El rendimiento del ADN fue de 20 \mug, o
aproximadamente 2 \mug de ADN por mg de tejido (0,2%).
Se calentó ADN genómico (0,5 \mug) a 95ºC de
temperatura durante 5 minutos y se añadió inmediatamente a 100
\mul de una reacción PCR que contenía cebadores directos e
inversos 0,15 \muM, cloruro de magnesio 2 mM, cada
dNTP 0,2 mM, y polimerasa Taq 2,5 U en tampón de PCR 1,25x
(Perkin-Elmer-Cetus). Se realizó la
amplificación en un ciclador térmico modelo GeneAmp PCR System 9600
de Perkin-Elmer durante 3 ciclos constituidos por
97ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1
minuto. Se incubó después la reacción a 72ºC durante 7 minutos.
El exón 2 del gen codifica las bases
109-296 del componente de 88 kDa del ARN de PTM. Los
cebadores (SEC Nº ID 18 y 19) utilizados para amplificar el exón 2
del gen que codifica el componente de 88 kDa de la PTM del ADN
genómico del sujeto se muestran a continuación.
Se diseñaron estos cebadores basándose en la
secuencia de ADN humano normal que codifica el componente de 88 kDa
de la PTM. Los cebadores son complementarios con los intrones
adyacentes al exón 2 de 188 pb, de modo que el exón entero es
amplificado en la reacción PCR. El tamaño del producto de
amplificación, incluyendo los cebadores y regiones intrónicas
adyacentes, es de 292 pb de longitud.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometieron a electroforesis los productos de
PCR obtenidos de PCR de ARN y ADN en un gel de agarosa al 1,4% en
tampón TAE (Tris-acetato 40 mM, EDTA 1
mM, pH 8,0). Se tiñó el gel durante 5 minutos con bromuro de
etidio 0,5 mg/ml en agua, y se destiñó en agua durante 10 minutos.
Se visualizó el ADN en una cámara de luz ultravioleta. Se cortaron
las bandas que contenían el producto PCR deseado con una cuchilla de
afeitar, y se purificó el ADN mediante el procedimiento GeneClean
(Bio 101, La Jolla, CA). Se eluyó el ADN de la matriz de sílice con
20 \mul de agua destilada. Cada reacción de PCR proporcionó
aproximadamente 1 \mug del fragmento de ADN deseado. Se secuenció
directamente una porción del ADN purificado mediante secuenciación
cíclica con polimerasa Taq en un secuenciador automático 373 de
Applied Biosystems, Inc., 373, como se describe en Tracy y Mulcahy,
Biotechniques 11, 68 (1991).
Se preparó el ADN restante para clonación en un
vector plásmido mediante la producción de extremos romos con
ADNpolimerasa T4 seguida de fosforilación con polinucleótido quinasa
T4. Se añadió ADN (500 ng) a 50 \mul de una mezcla de reacción
que contenía cada dNTP 20 \muM, ATP 1 mM, 4,5
unidades de ADNpolimerasa T4, 5 unidades de polinucleótido quinasa
T4 en Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, cloruro de magnesio 10
mM, ditiotreitol 1 mM y BSA 50 \mug/ml. La
incubación fue a 37ºC de temperatura durante 1 hora. Se purificó
entonces el ADN a partir de la mezcla de reacción con GeneClean. Se
eluyó el ADN con 10 \mul de dH_{2}O. Se ligó el ADN de extremos
romos a pUC18 cortado previamente con Sma I y defosforilado
(Pharmacia). Se transformaron células Dh5\alpha (100 \mul,
Gibco-RL) según el protocolo suministrado por el
fabricante. Se amplificó el ADN del plásmido y se aisló mediante un
procedimiento de lisis alcalina descrito en Molecular
Cloning (Sambrook, Fritsch y Maniatis, eds.) Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1.25-1.28 (1989). Se secuenciaron
los clones del plásmido como se describe en el ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuenciación directa de las tres reacciones
de PCR-ARN independientes reveló una citosina
eliminada en la base 262 del ADNc respecto de sitio de inicio de la
traducción en el sujeto abetalipoproteinémico. La deleción de una
base desplaza el marco de lectura y conduce a un codon de paro (TGA)
21 bases cadena abajo. La traducción del ARN mutante terminaría en
el residuo de aminoácido 78. A continuación se muestra una
comparación del ADN de los sujetos normal y abetalipoproteinémico y
las secuencias de aminoácidos deducidas.
El análisis de la secuencia directa de 2
amplificaciones de PCR independientes de ADN genómico mostró la
deleción. Esto indica que ambos alelos del gen que codifica el
componente de 88 kDa de la PTM de este sujeto exhiben la mutación
de desplazamiento de marco. Además, se clonaron los fragmentos de
ADN en pUC18 para secuenciación. Ocho clones de plásmido exhiben
también la citosina eliminada, confirmando adicionalmente la
mutación de desplazamiento de marco en ambos alelos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló ADN genómico de sangre de un segundo
sujeto abetalipoproteinémico utilizando el estuche nº 13343 de
Qiagen (Chatsworth, CA), siguiendo el protocolo del fabricante. Como
en el primer sujeto, la solicitante ha demostrado previamente que
ni la actividad de PTM ni el componente de 88 kDa de PTM podían
detectarse en biopsias intestinales de este sujeto. Se enviaron 300
\mug de este ADN genómico a Stratagene (La Jolla, CA) para
introducirse en una genoteca de ADN genómico en el vector lambda
DASH^{TM} (Stratagene). Además, se adquirió una genoteca genómica
normal en el vector lambda DASH^{TM} en Stratagene (nº de catálogo
943202).
Se rastrearon en dos millones de placas de fagos
recombinantes independientes las inserciones de ADN genómico que
contenían secuencias homólogas al ADNc de PTM bovina. El
procedimiento de rastreo fue similar al del rastreo de genoteca de
ADNc del ejemplo 1, excepto porque la cepa de E. coli era PLK
17, las temperaturas de hibridación y lavado eran de 60ºC y el
tampón de lavado era SSC 1 x, SDS al 0,1%. La sonda para el rastreo
de genoteca genómica era el fragmento de Eco RI de 2,4 kb del clon
de ADNc bovino nº 22, marcado con ^{32}P exactamente como en el
ejemplo 2. Se volvieron a rastrear los supuestos clones positivos
(aproximadamente 30 de cada genoteca) y siguieron siendo positivos
después de dos rondas adicionales de análisis de hibridación.
Después del rastreo terciario, se cortaron placas positivas
aisladas individuales de las placas de agar y se depositaron en 1
ml de tampón SM con 50 \mul de cloroformo. Se amplificó la
titulación de fago para cada depósito de fagos siguiendo el
protocolo "Small-scale liquid cultures" de
Sambrook et al., supra, pág. 2.67. Se mezclaron 100
\mul de los depósitos amplificados con 100 \mul de las células
de placa PLK 17 y 100 \mul de cloruro de magnesio 10 mM,
cloruro de calcio 10 mM y se incubó a 37ºC durante 15
minutos. Se utilizó después esta mezcla para inocular 50 ml de NZY
2x (Bethesda Research Laboratories) con Casamino acids al 0,2% (CAA,
Fisher Scientific nº DF0288-01-2) y
se hicieron crecer durante la noche a 37ºC de temperatura. Se aisló
ADN de lambda de los cultivos lisados utilizando el estuche nº
12543 de Qiagen utilizando los tampones y el protocolo Qiagen.
Se realizó la secuenciación directa de ADN de
las inserciones de ADN genómico como se describe en el ejemplo 1,
utilizando ADN de lambda como molde. Se utilizaron oligonucleótidos
de aproximadamente 20 bases, complementarios con la secuencia de
ADNc humano, como cebadores para la secuenciación de clones
genómicos normales o abetalipoproteinémicos. Se realizaron en
paralelo la caracterización y la secuenciación de clones normales y
abetalipoproteinémicos (véase el ejemplo 9). Se identificaron los
límites intrón/exón mediante la comparación de las secuencias de
ADN genómico y ADNc. Se diseñaron los cebadores de secuenciación
frente a las secuencias de intrón 5' y 3' para cada exón y se
utilizaron para confirmar los límites intrón/exón mediante
resecuenciación de los límites. Además, se secuenció la secuencia
de codificación de ambas cadenas de ADN para cada exón de al menos
un clon genómico de abetalipoproteinemia. El análisis de la
secuencia de ADN del exón 13 del sujeto abetalipoproteinémico
reveló una mutación puntual C a T en la base 1830 del ADNc humano.
Este cambio de base introduce un codon de paro en el sitio que
codifica normalmente el residuo de aminoácido Arg_{595}.
La secuencia de nucleótidos alrededor de la base
1830 codifica un sitio de restricción de endonucleasa Taq I (TCGA)
en la secuencia de ADN normal, pero no en la secuencia de ADN de
sujeto abetalipoproteinémco (TTGA). Para confirmar este cambio de
nucleótido y dirigir la homocigosidad de este alelo, se realizaron
digestiones con Taq I en ADN genómico de un control normal, el
sujeto abetalipoproteinémico y ambos padres del sujeto
abetalipoproteinémico. Se aisló el ADN genómico de la sangre de un
control normal, el sujeto abetalipoproteinémico y el padre y la
madre del sujeto como se describió anteriormente. Se digirieron 10
\mug de ADN genómico de cada muestra con 100 unidades de TaqI
(Bethesda Research Laboratories) en 100 \mul de tampón nº 2
1xReact (Bethesda Research Laboratories) a 65ºC de temperatura
durante 5 horas. Se agitó cada reacción de digestión a 2.000 rpm en
una unidad de filtrado Ultrafee-MC 10.000 NMWL (nº
UFC3 TGC 00 de Millipore) con un corte de peso molecular de 10.000
durante 30 minutos, para reducir el volumen de reacción a 50 \mul.
Se sometieron entonces las reacciones de digestión de restricción a
electroforesis en gel de agarosa a través de un gel al 1% en tampón
TEA a 20 voltios durante 16 horas. Se tiñó el gel de agarosa con
bromuro de etidio, se fotografió y después se transfirió a una
membrana de nitrocelulosa mediante el procedimiento Southern, E.M.
Southern, J. Mol. Biol. 98, 503-517 (1975).
La sonda para la hibridación Southern era un
producto de PCR que contenía el exón 13 y algunas secuencias
adyacentes del intrón (véase SEC Nº ID 24, a continuación). Se
realizó la PCR utilizando los componentes y el protocolo del
estuche GeneAmp (Perkin-Elmer, Cetus Industries) con
0,3 \mug de ADN genómico normal como molde y 10 picomoles de cada
uno de los cebadores directo e inverso en un volumen de reacción de
100 \mul. Se incubó la mezcla de reacción a 97ºC durante 2
minutos, después se sometió a 30 ciclos constituidos por 94ºC
durante 30 segundos, 45ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1
minuto, seguido de una incubación de 7 minutos a 72ºC y
almacenamiento a 4ºC. Se sometió el ADN amplificado a electroforesis
a través de agarosa como en el ejemplo I, se cortó el fragmento
esperado de 302 pb y eluyó del gel. Se marcó entonces este producto
de PCR del exón 13 con ^{32}P como en el ejemplo 2, y se utilizó
como sonda para hibridación Southern. Las condiciones de
hibridación y lavado fueron como en el ejemplo 2. Se expuso la
transferencia a una película de rayos X a -80ºC durante 5
días.
días.
\vskip1.000000\baselineskip
Se generó una genoteca genómica humana a partir
de ADN aislado de un segundo sujeto abetalipoproteinémico. Se
sondearon dos millones de fagos con una sonda de ADNc bovino y se
caracterizaron treinta fagos con inserciones de ADN genómico humano
homólogos con los del ADNc de PTM bovina.
El análisis de la secuencia de ADN de las
inserciones de ADN genómico del sujeto abetalipoproteinémico reveló
una mutación puntual C a T en la base 1830 en el exón 13 del gen de
PTM humano (el exón 13 corresponde a las bases 1817 a 1914 del ADNc
humano). Esta mutación puntual C a T cambia el codon de arginina
normal CGA en el residuo 595 a una señal de paro de la traducción
TGA, dando como resultado un truncamiento de 300 aminoácidos de
esta proteína. Esta cambio de nucleótido se encontró en las cuatro
inserciones de ADN genómico independientes caracterizadas en este
individuo.
Se muestra a continuación la posición de la
mutación C a T en el exón 13 de un sujeto abetalipoproteinémico. Se
muestra la secuencia de ADN de 302 bases del exón normal 13 con la
secuencia adyacente del intrón. Se indican en la parte superior el
ADN correspondiente a los cebadores de PCR directo (\rightarrow) e
inverso (\leftarrow) utilizados para preparar la sonda para
hibridación Southern con las flechas apropiadas. Las líneas
horizontales representan los límites intrón/exón. La secuencia de
reconocimiento de Taq I está en una caja. Un asterisco (*) designa
la base 1830, el sitio de la mutación C a T.
\newpage
- SEC Nº ID 24
La secuencia de nucleótidos normal que rodea la
C de la base 1830 (TCGA) codifica un sitio de restricción de Taq I.
En este sujeto abetalipoproteinémico, la secuencia en este sitio
está mutada (TTGA). Por lo tanto, Taq I debería cortar el exón 13
en este sitio en el ADN normal, pero no en el ADN que contiene la
mutación. Existe sólo un sitio Taq I en el exón normal 13.
Una transferencia Southern confirma este cambio
de nucleótido (figura 9). El ADN genómico aislado de un sujeto de
control, del sujeto abetalipoproteinémico, y de la madre y el padre
del sujeto se cortaron con Taq I y se sondearon con secuencias del
exón 13; el ADN de abetalipoproteinemia no se corta con Taq I,
evidenciado por una sola banda hibridante. Este resultado confirma
la falta de una secuencia de reconocimiento de Taq I. El ADN de
ambos padres exhibe un patrón mixto, demostrando la presencia de un
alelo normal y un alelo mutado.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados precedentes y las conclusiones
extraídas de ellos pueden resumirse de la siguiente manera.
La actividad de la PTM y la proteína son
indetectables en los sujetos abetalipoproteinémicos estudiados. Las
mutaciones en el gen de PTM explican totalmente la falta de proteína
y actividad. Los resultados anteriores demuestran que la
abetalipoproteinemia es una enfermedad monogenética. Kane &
Havel, supra. De estos resultados puede concluirse que la
abetalipoproteinemia está causada por una pérdida de actividad de la
PTM.
Estos resultados demuestran que la actividad de
la PTM es necesaria para un ensamblado y secreción correctos de las
partículas de lipoproteína que contienen apolipoproteína B. La
pérdida de actividad de la PTM da como resultado menores niveles de
colesterol, triglicéridos, fosfolípidos y ésteres de colesterol en
suero. Puede concluirse que una reducción de la cantidad de
actividad de PTM dará como resultado niveles de lípido en suero
bajos.
Además, los niveles de lípido en suero bajos
están asociados con la prevención, estabilización o regresión de la
aterosclerosis. Como se discutió anteriormente, la pérdida de la
cantidad o actividad de PTM da como resultado niveles bajos de
lípido en suero. Schaefer, supra; Dische y Porro, Am. J.
Med., 49, 568-571 (1970); y Sobrevilla et
al., Am. J. Med. 37, 821 (1964). Puede concluirse por tanto que
la inhibición de la PTM dará como resultado la prevención,
estabilización o regresión de la aterosclerosis.
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente
la presente invención. Estos ejemplos no se pretende que limiten el
alcance de la presente invención, y pueden proporcionar una mayor
comprensión de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se adquirió una genoteca de ADNc de bacteriófago
lambda gt10/intestino delgado bovino comercialmente disponible en
Clontech. Se rastreó en 1x10^{6} placas de fagos recombinantes
independientes el ADNc correspondiente al componente de 88 kDa de
la PTM bovina.
Se preparó un huésped bacteriano E. coli,
la cepa C600 (Clontech), para la infección de fagos mediante
crecimiento durante la noche hasta saturación a 30ºC de temperatura
en 50 ml de caldo Luria (LB = 10 g de cloruro de sodio, 10 g de
Bacto-Tryptone y 5 g de extracto de levadura por
litro) suplementado con maltosa al 0,2% y sulfato de magnesio 10
mM. Se sedimentaron las células mediante centrifugación a
baja velocidad, se resuspendieron en 20 ml de sulfato de magnesio
10 mM y se almacenaron a 4ºC. Se incubaron 20 alícuotas cada
una de 50.000 fagos y 300 \mul de células C600 a 37ºC durante 15
minutos, se mezclaron con 7 ml de LB + agarosa al 0,7% y se
sembraron en placas LB de 132 mm. Se incubaron las placas durante
7-10 horas a 37ºC hasta que aparecieron placas de
fagos distinguibles, después se transfirieron a 4ºC.
Se realizaron transferencias de placas por
duplicado a membranas de nitrocelulosa para cada placa como se
indica a continuación. Se colocó directamente una membrana de
nitrocelulosa (Schleicher & Schuell, Keene, NH) en el fago
durante 1 minuto (primera transferencia) ó 3 minutos (segunda
transferencia). El ADN de fago adherido a la membrana se
desnaturalizó entonces durante 1 minuto en hidróxido de sodio 0,5 N,
cloruro de sodio 1,5 M, se neutralizó durante 1 minuto en
Tris 1 M, pH 8,0, cloruro de sodio 1,5 M y finalmente
se lavó durante 1 minuto en 2 x SSC (1 x SSC = cloruro de sodio
0,15 M, citrato de sodio 0,015 M, pH 7,0). Se fijó
entonces permanentemente el ADN en la membrana de nitrocelulosa
mediante calentamiento a 80ºC en estufa a vacío durante 2 horas.
Se ha descrito anteriormente el aislamiento de
PTM bovina, incluyendo el componente de 88 kDa. Véase Wetterau y
Zilversmitt, Chem. Phys. Lipids 38, 205-272 (1985);
Wetterau et al., J. Biol. Chem. 265,
9800-9807 (1990). Se utilizaron las secuencias de
péptidos internos del componente de 88 kDa para diseñar
oligonucleótidos que se hibridarían con el ADNc que codifica la
proteína. Véase Lathe, R., J. Mol. Biol. 183, 1-12
(1985).
Los procedimientos descritos en la descripción
adjunta emplearon sondas con las siguientes secuencias de ADN
(listadas de 5' a 3');
La sonda 2A es una mezcla de 32 oligonucleótidos
de 20 bases, codificando cada uno la secuencia de aminoácidos del
péptido a partir del que se diseñó esta sonda. La sonda 37A es una
secuencia única de 33 bases y la sonda 19A es un único oligómero de
30 unidades. Estas secuencias de oligonucleótidos codifican
secuencias de aminoácidos que corresponden a péptidos internos.
Se obtuvieron oligonucleótidos de fuentes
comerciales como se indica en la descripción adjunta o se
sintetizaron en un sintetizador de ADN 8700 de Milligen/Biosearch
(Millipore Corp., Bedford, MA) utilizando la química de la
betacianoetilfosforamidita. Se desalaron los cebadores de
secuenciación en columnas NAP-10 (Pharmacia LKB
Biotechnologies, Inc., Piscataway, NJ) antes del uso. Se purificaron
las sondas sobre resina preparativa NENSORB (DuPont Company, NEN
Research Products, Boston, MA).
Se adquirió la sonda 2A en Genosys
Biotechnologies Inc., (The Woodlands, Tejas) y se marcó mediante
incubación de 1 \mug del oligonucleótido con
Tris-Cl 50 mM, pH 7,5, cloruro de magnesio 10
mM, ditiotreitol 5 mM (DTT), ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,1 mM y espermidina 0,1
mM con 10 unidades de polinucleótido quinasa T4 y 120
\muCi de ATP marcado gamma con ^{32}P en un volumen de reacción
de 50 \mul a 37ºC de temperatura durante 30 minutos, seguido de
inactivación térmica de la quinasa a 68ºC de temperatura durante 5
minutos. Se retiró el ATP sin reaccionar utilizando una columna de
espín G-25 Sephadex (Boehringer Mannheim Corp.,
Indianápolis, IN) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los
oligonucleótidos marcados tenían una actividad específica de
aproximadamente 2 x 10^{8} dpm/\mug.
Se prehibridaron las membranas de nitrocelulosa
durante 2 horas a 37ºC en 150 ml de tampón de hibridación (6 x SSC,
NaPO_{4} 20 mM, 2x Denhardts, SDS al 0,1% y 100 \mug/ml
de ADN de esperma de salmón) (Véase Sambrook et al.,
supra, pág. B15 para Denhardts). Se reemplazó el tampón de
hibridación y se añadió la sonda de oligonucleótidos marcados 2A y
se dejó hibridar durante la noche a 37ºC. Se lavaron las membranas
en 1 litro de 2 x SSC, SDS al 0,1% a 40ºC, se secaron al aire y se
expusieron a una película de rayos X Kodak XAR-5
durante 5 días a -80ºC, con iluminación Dupont más una pantalla de
intensificación (Dupont, NEN).
Se volvieron a rastrear los clones positivos
supuestos (40) con la misma sonda durante dos rondas consecutivas de
hibridación. Se cortaron tacos de agarosa correspondientes a las
señales positivas en las películas de rayos X de las placas
originales y se colocaron en 1 ml de SM + CHCl_{3} al 5% (SM = 5,8
g de cloruro de sodio, 2,0 g de sulfato de magnesio, 50 ml de
Tris-Cl 1 M, pH 7,5 y 5 ml de gelatina al 2%
por litro). Se volvió a sembrar el fago mezclando 0,001 \mul de
depósito de fago con 100 \mul de células C600 en sulfato de
magnesio 10 mM, se incubó a 37ºC durante 15 minutos, se
añadieron 3 ml de LB + agarosa al 0,7% y se sembró en placas LB de
82 mm. Después de incubación durante la noche a 37ºC, seguida de 1
hora a 4ºC, se transfirieron las placas de fagos a nitrocelulosa, y
se volvieron a sondear con la sonda 2A de oligonucleótido marcado
como anteriormente. Después del rastreo de hibridación terciario, se
aislaron 16 placas de fagos.
Se amplificaron por PCR las inserciones de cada
uno de los 16 fagos recombinantes utilizando los amplímeros lamba
gt10 comercialmente disponibles (Clontech) y el estuche GeneAmp
(Perkin-Elmer, Cetus Industries, Norwalk, CT),
siguiendo exactamente las instrucciones del fabricante. Se sometió
el ADN amplificado a electroforesis a través de geles de agarosa al
1,2% en tampón Tris-EDTA-acetato
(TEA = Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM)
durante 2-3 horas a 100 voltios. Se tiñeron entonces
los geles de agarosa con bromuro de etidio (EtBr), se lavaron con
agua y se fotografiaron. Se transfirió el ADN entonces del gel a una
membrana de nitrocelulosa mediante el procedimiento de Southern. Se
realizó una hibridación Southern utilizando la sonda 2A de
oligonucleótidos marcada en 50 ml de tampón de hibridación
(anterior) a 40ºC durante la noche y después lavado a 45ºC, 48ºC y
51ºC. Se hibridaron dos inserciones amplificadas, correspondientes
al fago nº 64 y 76 (figura 1), a la sonda 2A a 51ºC en 2 x SSC. Se
preparó el ADN lambda de estos dos clones siguiendo el procedimiento
de lisado de placa (Sambrook et al., supra, pág. 2.118). Se
digirió un décimo (5 ml de 50 ml) del ADN de fago con 20 unidades
de la enzima de restricción Eco RI (New England Biolabs, Beverly,
MA) en el tampón del fabricante a 37ºC durante 2 horas, y se
sometió a electroforesis en gel de agarosa. Por corte con Eco RI de
estos, el fago nº 64 proporcionó un fragmento de inserción de 1,0
kb y el ADNc del fago nº 76 proporcionó dos trozos de Eco RI, de 0,9
kb y 0,4 kb. Se cortaron estas bandas del gel.
Se eluyó el ADN de los cortes de gel de agarosa
forzando en primer lugar los cortes de agarosa a través de una aguja
de calibre 22 en 3 ml de T_{10}E_{1}N_{3}
(Tris-Cl, 10 mM, p 7,4, EDTA 1 mM, pH
8,0 y cloruro de sodio 0,3 M) y congelación a -20ºC durante
la noche. Se descongelaron entonces las muestras a 37ºC durante 30
minutos, se centrifugaron para sedimentar la agarosa, se diluyeron
1:1 con agua y se pasaron a través de una columna Elu.Tip
(Schleicher y Schuell), siguiendo el protocolo del fabricante. Se
precipitaron después las muestras de ADN con etanol, se lavaron con
etanol y se resuspendieron hasta una concentración aproximada de
0,05 pmoles/\mul.
Se preparó el vector plásmido bluescript SK+
(Stratagene) para recibir las inserciones de ADNc mediante digestión
con 20 unidades de la endonucleasa de restricción Eco RI (New
England Biolabas) en el tampón del fabricante a 37ºC durante 2
horas, seguida de un tratamiento de 30 minutos con 1 unidad de
fosfatasa alcalina de ternero
(Boehringer-Mannheim), que se añade directamente a
la reacción Eco RI. Se sometió entonces este ADN a electroforesis a
través de un gel de agarosa al 1,2%/TEA a 100 voltios durante 2
horas. Se cortó la banda de plásmido lineal, se eluyó y se
resuspendió como anteriormente.
Se ligaron los fragmentos de inserción de ADNc
en el vector plásmido bluescript preparado mediante la mezcla de
0,05 pmol de vector con 0,10 pmoles de inserción de ADNc en
Tris-Cl 50 mM, pH 7,4, cloruro de magnesio 10
mM, DTT 1 mM, ATP 1 mM y 40 unidades de ADN
ligasa T4 (New England Biolabs). Se incubaron los 10 \mul de
reacción a 15ºC durante la noche. Se mezcló entonces la reacción de
ligamiento con 100 \mul de células E. coli competentes de
transformación, cepa DH5a (Bethesda Research Laboratories), y se
transformó el ADN del plásmido en las células de E. coli
siguiendo el protocolo estándar de Sambrook et al., supra,
pág. 1.74. Se sembraron células transformadas en placas de
LB-agar que contenían 100 \mug/ml de ampicilina y
se dejaron crecer durante la noche a 37ºC.
Se aisló ADN de plásmido de colonias resistentes
a la ampicilina siguiendo el procedimiento de lisis alcalina de
Birnboin y Doly [Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523
(1979)]. Se digirió el ADN de plásmido purificado con Eco RI como
anteriormente, se sometió a electroforesis en gel de agarosa y se
analizó la generación del tamaño correcto del fragmento de
inserción de ADNc Eco RI. Se utilizaron células de una única colonia
positiva de una inserción de ADNc para inocular 100 ml de LB que
contenía 100 \mug/ml de ampicilina, y se hizo crecer hasta
saturación a 37ºC. Se extrajo el ADN del plásmido utilizando un
estuche de aislamiento de plásmido Qiagen nº 12143 (Qiagen, Inc.,
Chatsworth, CA), siguiendo el protocolo del fabricante.
Se realizó la secuenciación de los clones de
ADNc con el secuenciador automático de ADN 373 de Applied
Biosystems, Inc. (ABI, Foster City, CA) utilizando cebadores
marcados con tinte o didesoxinucleótidos marcados con tinte. Se
realizó la secuenciación cíclica con cebadores marcados con tinte
con estuches de secuenciación cíclica de cebador con tinte Taq
(ABI, nº pieza 401121 y 401122). Se utilizó 1 \mug de ADN de doble
cadena por reacción. Los procedimientos utilizados para la
ciclación y concentración de las muestras de secuenciación fueron
como se describieron en el manual de secuenciación cíclica del ADN
con cebadores con tinte (ABI, nº de pieza 901482). Como
alternativa, se realizó la secuenciación cíclica con
didesoxinucleótidos marcados con tinte utilizando el estuche de
secuenciación cíclica con terminador Taq
Dye-Deoxy^{TM} (ABI, nº pieza 401113).
Típicamente, se utilizaron 1,25 \mug de molde con 4 pmol de
cebador por reacción. Se variaron las concentraciones de molde y
cebador según era necesario para optimizar las reacciones de
secuenciación. Se realizó el ciclado de las reacciones utilizando
un ciclador térmico
Perkin-Elmer-Cetus (modelo 9810)
como se describe en el protocolo del secuenciador cíclico con
terminador Taq Dye Deoxy^{TM }(ABI, nº pieza 901497).
Después de las reacciones cíclicas, se
utilizaron columnas de espín Centri-Sep^{TM
}(Princeton Separations, Adelphia, NJ) para retirar el
exceso de cebadores y terminadores de tinte. Se precipitaron
entonces los eluyentes de la columna de espín y se lavaron como se
describe en el protocolo del secuenciador cíclico con terminador
Taq Dye Deoxy^{TM} (ABI, nº pieza 901497). Se preparó un gel
desnaturalizante de acrilamida al 6% como se describe en el manual
del usuario del sistema de secuenciación de ADN ABI 373A. Justo
antes de desarrollar el gel, se resuspendieron las muestras en 5
\mul de formamida desionizada/EDTA 50 mM (pH 8,0) 5/1
(v/v). Se desnaturalizaron las muestras a 90ºC durante dos minutos,
se enfriaron rápidamente sobre hielo, después se cargaron en un gel
pre-desarrollado (el gel se predesarrolló durante
aproximadamente 15-20 minutos). Se desarrolló el
gel durante 12 horas en las siguientes condiciones: 2500 voltios, 40
amperios, 30 vatios, 40ºC. Se realizó el análisis de la secuencia
con software de análisis de ADN ABI 373A (versión 1.0.2). Se obtuvo
la secuencia final utilizando el software de editor de secuencia de
ADN seqED^{TM} (versión 1.0) ABI, Inc.
Se secuenció la inserción de 1036 pb del clon nº
64. Codificaba 936 pb del marco abierto de lectura, continuando
hacia el extremo 3' de la inserción (correspondiente a un
polipéptido con un peso molecular de al menos 34.000). La
comparación de la secuencia de este clon con la secuencia disponible
en los bancos de datos de secuencias de nucleótidos, revela que las
primeras 91 bases del extremo 5' del clon, correspondían al genoma
microcondrial bovino. Por lo tanto, la inserción de 1036 pb del
clon 64 era el resultado del ligamiento de dos ADNc independientes
durante la construcción de esta genoteca.
Se secuenció enteramente el fragmento Eco RI de
400 pb del clon nº 76, indicando 81 pb de marco abierto de lectura
seguidas por 298 bases de secuencia 3' no traducida y una región
poliA.
Se volvió a rastrear la genoteca de ADNc de
lambda gt10 de intestino delgado bovino con una sonda de
oligonucleótido 37A, una réplica exacta de 33 pb con la secuencia
de péptidos más 5' codificada por el clon nº 64. Se aislaron dos
clones positivos, nº 22 y nº 23 (figura 1) mediante rastreos
terciarios, se subclonaron y se secuenciaron como para el clon nº
64.
Los clones nº 22 y 23 contenían inserciones de
2,8 kb y 1,7 kb de ADNc, respectivamente. La inserción de ADNc de
2,8 kb del clon nº 22 predecía un marco abierto de lectura de 835
aminoácidos entre las bases 2 y 2506 (correspondiente a un
polipéptido de 93,2 kDa), seguido por 298 bases de secuencias 3' no
traducidas y una región poli A.
Se volvió a rastrear la genoteca lambda gt10 con
la sonda 19A, una réplica exacta de la secuencia del clon nº 22
correspondiente el péptido más 5' codificado por ese clon, y se
aisló el clon nº 2 como anteriormente. El análisis de la secuencia
de ADN de la inserción de ADNc de 1 kb del clon nº 2 indicaba que se
superponía con el clon nº 22 y extendía el extremo 5' del ADNc
bovino en 100 bases. Se muestran un compuesto de la secuencias de
ADN de los clones nº 2 y nº 22 y el producto de traducción predicho
en las SEC Nº ID 1 y 3, respectivamente.
En resumen, la secuenciación de los clones de
ADNc de intestino delgado bovino correspondientes al componente de
88 kDa de PTM proporcionó 2900 pb de una secuencia continua que
codifica un marco abierto de lectura de 860 aminoácidos seguido por
una región 3' de 398 pb no codificante y una región poli A. El
producto de proteína predicho de esta secuencia compuesta es de
96,1 kDa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó un análisis de hibridación Southern
en ADN de vaca, humano, ratón, hámster (células de ovario de hámster
chino o CHO), rata y perro. Se digirieron 10 \mug de cada ADN
genómico (Clontech) con 140 unidades de Eco RI (New England Biolabs)
en 100 \mul de 1 x tampón Eco RI (England Biolabs) a 37ºC durante
la noche. Se agitó cada reacción de digestión a 2.000 rpm en una
unidad de filtración Ultrafree-MC 10.000 NMWL (nº
UFC3 TGC 00 de Millipore) con un corte de peso molecular de 10.000
durante 30 minutos, para reducir el volumen de reacción a 50 \mul.
Se sometieron entonces las reacciones de digestión de restricción a
electroforesis en gel de agarosa a través de un gel al 0,75% en
tampón TEA a 80 voltios durante 3 horas. Se tiñó el gel de agarosa
con bromuro de etidio, se fotografió y después se transfirió a una
membrana de nitrocelulosa mediante el procedimiento Southern.
Se realizó una hibridación Southern utilizando
el fragmento Eco RI de 2,4 kb del clon de ADNc bovino nº 22 como
sonda. Se marcaron 25 ng del fragmento de ADN utilizando el sistema
de marcado de ADN Multiprime (Amersham Corp., Arlington Heights,
IL) y 50 \muCi de
^{32}P-\alpha-dCTP. Se separó el
^{32}P no incorporado de la sonda marcada utilizando una columna
de espín Sephadex G25 como anteriormente. Se prehibridaron las
membranas de nitrocelulosa en 100 ml de tampón de hibridación
(anterior) a 37ºC durante 2 horas. Se realizó la hibridación
durante la noche en 50 ml de tampón de hibridación reciente a 60ºC
con 1,2 x 10^{7} dpm de sonda desnaturalizada. Se lavó la
membrana con 500 ml de 1 x SSX, SDS al 0,1% a 65ºC durante 1 hora,
se secó al aire y después se expuso a una película de rayos X a
-80ºC con una pantalla intensificadora durante 4 días. El fragmento
Eco RI de 2,4 kb del clon bovino nº 22 se hibridó específicamente al
menos a dos bandas en cada especie ensayada. Por lo tanto, se
concluyó que las condiciones de hibridación establecidas para la
sonda de ADNc bovino permiten la detección de ADN homólogos de
otras especies, tales como humano, ratón, hámster, rata y perro.
Para obtener la secuencia de codificación
completa del componente de 88 kDa de la PTM humana, se rastreó una
genoteca de ADNc de hígado humano con una inserción de ADNc de PTM
bovina descrita anteriormente en la descripción adjunta. Se obtuvo
la genoteca de Stratagene. Contenía ADNc de hígado cebado con
oligo-dT clonado direccionalmente (Eco RI a XhoI)
en el vector lambda ZAP. Se obtuvo la sonda mediante la digestión de
10 \mug del clon intestinal bovino nº 22 anterior en tampón
universal (Stratagene) con 50 unidades de Eco RI, electroforesis a
80-150 voltios a través de un gel constituido por
un 0,9% de agarosa de bajo punto de fusión (Bethesda Research
Laboratories, Gaithersburg, MD), TAE (Tris-acetato
40 mM, EDTA 1 mM) y 0,5 \mug/ml de bromuro de
etidio. Se purificó el fragmento resultante de 2,4 kb mediante
extracción con fenol como se describe en Sambrook et al.,
supra, pág. 6.30. Se marcó entonces radiactivamente el
fragmento purificado con un estuche de marcaje de ADN multiprime y
alfa-^{32}P-dCTP (Amersham) a
10^{9} cpm/\mug utilizando las instrucciones del fabricante. Se
separó el ^{32}P no incorporado de la sonda marcada utilizando
una columna de espín Sephadex G-25 como
anteriormente.
Se rastrearon 10^{6} placas de la genoteca
como se indica a continuación según las instrucciones del fabricante
(Stratagene). Se hicieron crecer bacterias E. coli, cepa XL 1 Blue
(Stratagene) con agitación durante la noche a 37ºC en 50 ml de
caldo LB (Bethesda Research Laboratories) suplementado con maltosa
al 0,2% y sulfato de magnesio 10 mM. Se sedimentaron las
células mediante centrifugación a baja velocidad y después se
resuspendieron en sulfato de magnesio 10 mM hasta una
DO_{600} = 0,5 y se almacenaron a 4ºC. Se diluyó el fago hasta una
concentración de 50.000 unidades de formación de placa/25 \mul de
tampón SM. Para cada placa se mezclaron 600 \mul de bacterias y
25 \mul de fagos y se incubaron a 37ºC durante 15 minutos. Se
añadieron agar superior (6,5 ml) constituido por caldo NZY
(Bethesda Research Laboratories) y agarosa al 0,7% (Bethesda
Research Laboratories) precalentado a 50ºC a la mezcla de bacterias
y fagos, y después se sembró en una placa NZY de 150 mm. Se dejó
solidificar el agar superior y se incubaron las placas durante la
noche a 37ºC.
Se enfriaron entonces las placas hasta 4ºC
durante 2 horas y se llevaron las placas sobre filtros de
nitrocelulosa. Se realizaron tomas duplicadas en las que se
registró la alineación de las membranas respecto de la placa
perforando orificios con una aguja a través del filtro en la placa
de agar. Se incubaron los filtros 1 minuto en hidróxido de sodio 0,5
N, cloruro de sodio 1,5 M, 1 minuto en Tris 1
M, pH 8,0, cloruro de sodio 3 M, y 1 minuto en 2 x SSC. Se
calentaron entonces los filtros a 80ºC en una cámara de vacío
durante 2 horas. Se incubaron los filtros durante 2 horas a 60ºC en
5 ml por filtro de tampón de hibridación (6 x SSC, NaPO_{4} 20
mM, 2 x Dendardts, SDS al 0,1% y 100 \mug/ml de ADN de
esperma de salmón). Se reemplazó el tampón con un volumen igual de
tampón de hibridación que contenía la sonda a una concentración de
3,5 x 10^{6} cpm por filtro y se incubó durante la noche a 60ºC.
Se lavaron los filtros en 1 x SSC, SDS al 0,1%, primero a
temperatura ambiente y después a 50ºC durante 2 horas. La
autorradiografía reveló 56 positivos.
Se incubó una pequeña capa de agarosa que
contenía cada positivo durante la noche a 4ºC con 1 ml de tampón SM
y una gota de cloroformo. Se purificó el fago positiva mediante
resembrado a baja densidad (aproximadamente 50-500
por placa de 100 mm), rastreo y aislamiento de las placas positivas
individuales como se describió anteriormente.
Cuando se infectan las células XL1 Blue con el
vector ZAP (Stratagene) y se coinfectan con un fago auxiliar, la
parte bluescript del vector se replica selectivamente, se
circulariza y se empaqueta en un fagémido de cadena sencilla. Este
fagémido se convierte en un plásmido de doble cadena en la posterior
infección en células no tratadas con XL1 Blue. La inserción de ADNc
del plásmido resultante puede secuenciarse directamente. Se
cortaron los plásmidos que contenían las inserciones de ADNc de
hígado humano de esta manera, utilizando el fago auxiliar
proporcionado por Stratagene, según las instrucciones del
fabricante.
Se purificó el ADN de estos clones como se
indica a continuación. Se inoculó una sola colonia en 2 ml de LB y
se incubó con agitación a 37ºC durante la noche. Se centrifugaron
1,5 ml de esta y se resuspendieron en 50 \mul de LB. Se añadieron
300 \mul de TENS (1 x TE, hidróxido de sodio 0,1 N, SDS al 0,5%) y
se agitó con vórtice durante 5 segundos. Se añadieron 150 \mul de
acetato de sodio 3M, pH 5,2 y se agitó con vórtice durante 5
segundos. Se agitaron entonces las muestras en una microcentrífuga
durante 10 minutos. Se recuperó el sobrenadante, se añadieron 0,9
ml de etanol y se agitaron las muestras en una microcentrífuga
durante 10 minutos. Se lavó el sedimento con etanol al 70%, se secó
y se resuspendió en 20 \mul de TE (Tris 10 mM, pH 7,4, EDTA
1 mM, pH 8).
Se caracterizó el ADN de los clones como se
indica a continuación. Se digirieron 5 \mul del ADN de cada clon
con 10 unidades de Eco RI, 10 unidades de XhoI y 10 \mug de
ARNasa, y después se fraccionó y visualizó mediante electroforesis a
través de gel de agarosa al 1%, TBE (Tris-borato 45
mM, EDTA 1 mM), bromuro de etidio 0,5 \mug/ml. Se
realizó una transferencia Southern del gel como se describe en
Sambrook et al., supra, pág. 9.41. Se sondeó esta
transferencia Southern con un fragmento de ADNc bovino cercano al
extremo 5' de la secuencia de codificación. Se preparó esta sonda
5' mediante la digestión de 25 \mug del clon intestinal nº 2 con
50 unidades de Eco RI y 50 unidades de NheI, aislando como
anteriormente el fragmento de 376 pares de bases de un gel de
agarosa de bajo punto de fusión al 2%, TBE, bromuro de etidio 0,5
\mug/ml, y marcado radiactivo como se describió anteriormente.
Los resultados son los siguientes: el clon nº 693, inserción de 3,7
kb, hibrida con la sonda 5'; el clon nº 754, inserción de 1,2 kb,
hibrida con la sonda 5'; el clon nº 681, inserción de 1,8 kb, no
hibrida con la sonda 5'.
Se hicieron crecer cultivos durante la noche que
contenían estos tres clones en 200 ml de LB con 100 \mug/ml de
ampiclina. Se purificaron grandes cantidades de plásmido utilizando
un estuche maxiprep de plásmido Qiagen, según las instrucciones del
fabricante. La secuencia del clon nº 693 revela que contiene dos
inserciones. La inserción 5' de 500 pb era homóloga con la
haptoglobina y no se discutirá más. Esta estaba seguida por un
sitio de restricción mutante XhoI y un Eco RI (los dos sitios
utilizados en la clonación direccional). La inserción 3' era el ADNc
de interés. Contenía algunas secuencias 5' no traducidas como
indican las secuencias de paro en los tres marcos de lectura. En
las bases 48-2729 hay un marco abierto de lectura
iniciado por ATG correspondiente a 894 aminoácidos. La secuencia de
aminoácidos deducida empieza con
- M I L L A V L F L C F I
(SEC nº ID 28). El codon de paro se encuentra en
las bases 2730-2732, seguido por una región 3' no
traducida de 435 bases y una región poli A. Se secuencia del clon nº
681 confirmó las 1768 bases 3' de este clon, y el clon 754 confirmó
las bases 1 a 442.
\vskip1.000000\baselineskip
La transferencia Northern multitejido (Clontech)
contenía 2 \mug por carril de ARN poliA+ de corazón, cerebro,
placenta, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón o páncreas
humano. Se realizó la hibridación Northern como para la
transferencia Southern genómica. Se prehibridación fue en 50 ml de
tampón de hibridación a 37ºC durante 2 horas, seguida de una
hibridación durante la noche en 20 ml de tampón reciente a 60ºC con
el fragmento Eco RI de 2,4 kb marcado con 5,2x 10^{7} dpm del
clon intestinal bovino nº 22 como anteriormente. Se lavó la
transferencia Northern en 500 ml de 0,2 x SSC, SDS al 0,1% a 60ºC, 1
hora y se sometió a autorradiografía a -80ºC. Después de 20 horas
de exposición a una película de rayos X, existe una señal
predominante en el carril de ARN de hígado a aproximadamente 4,4 kb
y ninguna otra hibridación detectable. Por lo tanto, la hibridación
cruzada del fragmento de 2,4 kb del ADNc bovino detecta
específicamente un ARN en hígado humano. Puesto que el hígado y el
intestino son los únicos dos tejidos en los que se ha reseñado una
actividad de PTM significativa, la clonación y análisis de
transferencia Northern apoyan la localización bioquímica de la PTM.
Además, los resultados del análisis Northern extienden esta
detección para incluir híbridos ADN:ADN, así como interacciones
ADN:ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
Se tomaron todos los protocolos de biología
molecular estándares de Sambrook, supra, excepto cuando se
indica a continuación. Todas las enzimas de restricción utilizadas
en este ejemplo se obtuvieron de Bethesda Research Laboratories
(BRL, Gaithersburg, MD). Se construyó un fragmento de 3,2 kb que se
extendía desde el nucleótido -64 a 3135 (respecto del sitio de
inicio de la traducción con la A del codon ATG del sitio de inicio
de la traducción designada como +1) a partir de los plásmidos p754
(bases -64 a 384) y p693 (bases 385 a 3135) como se indica a
continuación. Se cortaron un fragmento de endonucleasa de
restricción Eco RI-NcoI de 448 pb y un fragmento de
endonucleasa de restricción NcoI-XhoI de 2750 pb de
p754 y p693, respectivamente. Después de la purificación del gel,
se ligaron los fragmentos en el plásmido
pBlueScript-SK cortado con Eco
RI-XhoI, proporcionando el plásmido pBS/hPTM. Se
aisló el fragmento de hPTM entero de pBS/hPTM mediante digestión con
las endonucleasas de restricción HindIII y XhoI y se subclonó en el
plásmido pcDNA/Neo (Invitrogen, San Diego, CA), proporcionando el
plásmido pcDNA/PTM. Este coloca la secuencia de codificación hPTM de
longitud completa bajo el control transcripcional del promotor de
citomegalovirus altamente activo.
Se transfectaron los plásmidos en fibroblastos
1508T de piel humana transformados [J. Biol. Chem., 267,
13229-132238 (1992)] mediante el reactivo
lipofectina (BRL). Se dividieron las células en placas de 100 mm a
una densidad del 25% de confluencia, 24 horas antes de la
transfección. En el momento de la transfección, se disolvieron 50
mg de plásmido por 100 mm de placa en 1,5 ml de medio Eagles
modificado de Dulbecco exento de suero (DMEM) y se añadieron gota a
gota a una solución de 120 \mul de reactivo lipofectina en 1,5 ml
de DMEM exento de suero. Después de una incubación de 15 minutos a
temperatura ambiente, se añadieron las mezclas de transfección a
los cultivos 1508T que contenían 7 ml de DMEM exento de suero. 24
horas después, se retiraron las mezclas de transfección y se
añadieron 10 ml de DMEM reciente que contenía suero bovino fetal al
10% durante 24 horas adicionales. Se rasparon las células de la
placa y se lavaron dos veces con una solución salina tamponada con
fosfato enfriada con hielo (PBS). Se llevaron a cabo los extractos
celulares, las medidas de actividad de PTM y los análisis Western
como se describió en el precedente "Ensayo para la transferencia
de actividad de transferencia de TG en sujetos
abetalipoproteinémicos" en la descripción adjunta.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se subclonó el ADNc que contenía la secuencia de
codificación completa para PTM en el vector de expresión pcDNA/Neo,
proporcionando el constructo pcDNA/PTM. Se expresó transitoriamente
este plásmido en fibroblastos de piel humana transformados 1508T
[J. Biol. Chem., 267, 13229-13238 (1992)] mediante
transfección mediada por liposomas. Cuarenta y ocho horas después
de la transfección, la actividad de transferencia de TG era
fácilmente detectable por encima de los niveles de fondo ensayados
en extractos de células transfectadas con el plásmido original,
pcDNA/Neo. El análisis de transferencia Western mostró la presencia
del componente de 88 kDa de la PTM en células transfectadas con
pcDNA/PTM, pero no en células transfectadas con pcDNA/Neo. Una
comparación de la masa y la actividad de la proteína en las células
transfectadas con la encontrada en células HepG2 sugiere que la PTM
expresada se incorporaba eficazmente a un complejo de proteína de
transferencia activo con PDI.
En este rastreo, se mide la velocidad de
transferencia de lípido marcado detectablemente (por ejemplo TG, EC
ó PC marcado con RMN, ESR, radiactiva o fluorescentemente) de
partículas donantes (por ejemplos membranas, vesículas o
lipoproteínas donantes) a partículas receptoras (por ejemplo
membranas, vesículas o lipoproteínas receptoras) en presencia de
PTM. Puede utilizarse una reducción de la velocidad de transferencia
observada en presencia de un inhibidor de PTM (por ejemplo
contenido en un extracto de productos naturales o compuestos
conocidos) como ensayo para identificar y aislar inhibidores de la
función de PTM. Podrían utilizarse una serie de ensayos con este
fin, por ejemplo, los ensayos de vesículas sintéticas publicados
previamente por Wetterau & Zilversmit, J. Biol. Chem., 259,
10863-10866 (1984) o Wetterau et al., J.
Biol. Chem. 265, 9800-9807 (1990) o el ensayo
esquematizado anteriormente en la descripción adjunta en el
"Ensayo para la actividad de transferencia de TG en sujetos
abetalipoproteinémicos". Un ejemplo de uno de dichos ensayos es
el siguiente.
En un rastreo típico que utiliza lipoproteínas
marcadas, el marcaje de las lipoproteínas con
[^{3}H]-TG se realiza mediante el procedimiento
de dispersión de lípidos descrito en Morton y Zilversmitt [Morton,
R.E. et al., J. Biol. Chem. 256, 1992-1995
(1981)] utilizando materiales comercialmente disponibles. En esta
preparación, se mezclan 375 \muCi de
[^{3}H]-trioleína (trioleína,
[9,10-^{3}H (N)], NEN Research Products, nº cat.
NET-431), 1,5 mg de fosfatidilcolina de huevo y 160
\mug de trioleína sin marcar en cloroformo y se evapora en
corriente de nitrógeno hasta sequedad completa. Se añaden 2 ml de
Tris-HCl 50 mM, Na_{2}EDTA al 0,01%,
ditiotreitol 1 mM, pH 7,4 y se purga el tubo con nitrógeno.
Se resuspenden los lípidos con agitación con vórtice y se somete
entonces la suspensión a sonicación durante dos intervalos de 20
minutos en un baño sonicador. Se añaden los lípidos sonicados a 75
ml de plasma de conejo (Pel-Freez Biologicals,
Rogers, AR) con 5,8 ml de p-nitrofenilfosfato de
dietilo 8,2 mM (Sigma, nº cat. D9286) y 0,5 ml de
Na_{2}EDTA 0,4 M, NaN_{3} al 4%. Se incuba entonces el
plasma en atmósfera de nitrógeno durante 16-24 horas
a 37ºC. Se aislan lipoproteínas de baja densidad (LDL) y
lipoproteínas de alta densidad (HDL) de la mezcla de incubación y
del plasma de control que no estaba marcado mediante
ultracentrifugación secuencial [Schumaker & Puppion, Methods
Enzymology 128, 155-170 (1986)]. Se dializan las
lipoproteínas aisladas a 4ºC frente a cloruro de sodio al 0,9%,
Na_{2}EDTA al 0,01% y NaN al 0,02% y se almacenan a 4ºC.
En un ensayo típico de 150 \mul, se determina
la actividad de transferencia mediante la medida de la transferencia
de TG marcado radiactivamente de partículas donantes con
[^{3}H]-HDL (5 \mug colesterol) a partículas
receptoras LDL (50 \mug colesterol) a 37ºC durante tres horas en
Tris 15 mM, pH 7,4, MOPS 125 mM, acetato de Na 30
mM, NaCl 160 mM, Na_{2}EDTA 2,5 mM, NaN_{3}
al 0,02%, BSA al 0,5% con aproximadamente 50-200 ng
de PTM purificada en un pocillo de una placa de 96 pocillos. El
material a ensayar (por ejemplo extractos de productos naturales en
un disolvente compatible con el ensayo tal como etanol, metanol ó
DMSO (típicamente, se añaden 5 \mul del material en DMSO al 10%)
puede rastrearse mediante la adición a un pocillo antes de la
incubación. La transferencia se termina con la adición de 10 \mul
de solución de heparina/MnCl_{2} a 4ºC recién preparada (1,0 g de
heparina, Sigma nº cat. H3393 187 U/mg a 13,9 ml de MnCl_{2} 1,5
M, heparina al 0,4% (187 UI)/MnCl_{2} 0,1 M) para
precipitar las partículas receptoras
^{3}H-TG-LDL y la placa se
centrifugó a 800 x g. Se transfiere una alícuota del sobrenadante de
cada pocillo que contenía las partículas donantes
[^{3}H]-TG-HDL a un cóctel de
centelleo y se cuantifica la radiactividad. La actividad enzimática
está basada en el porcentaje de transferencia de TG y se calcula
mediante la siguiente ecuación:
En dicho ensayo, el porcentaje de transferencia
de TG aumentará al aumentar la concentración de PTM. Un candidato a
inhibidor reducirá el porcentaje de transferencia de TG. Podría
realizarse un ensayo similar con EC ó PC marcado.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Utilizando el procedimiento esquematizado en el
ejemplo 5, se identificaron los compuestos inhibidores de PTM A y
B. El ensayo midió la velocidad de transporte de TG marcado
radiactivamente catalizado por PTM bovina de los HDL donantes a los
LDL receptores. En este procedimiento, un inhibidor reduce la
velocidad de transferencia del TG marcado radiactivamente.
La actividad inhibidora de PTM de estos
compuestos se confirmó en un ensayo independiente siguiendo los
procedimientos esquematizados en el "Ensayo para la actividad de
transferencia en sujetos abetalipoproteinémicos" precedente. Ese
ensayo medía el transporte catalizado por PTM bovina de TG marcado
radiactivamente de las SUV donantes a las receptoras.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo la línea celular de hepatoblastoma
humano, HepG2, de American Type Culture Collection (Rockville, MD,
nº de acceso ATCC 8065). Se mantuvieron los cultivos a 37ºC en una
atmósfera de dióxido de carbono al 5%, en matraces de cultivo
T-75 con 12 ml de medio RPMI 1640 que contenía suero
bovino fetal al 10% (todos los medios de cultivo celular y tampones
se obtuvieron de GIBCO Life Technologies, Gaithersburgh, MD). Se
subcultivaron las células 1:4 una vez a la semana y se alimentaron
con medio reciente 3 veces a la semana.
Se llevaron a cabo experimentos para medir los
efectos de los compuestos A y B sobre la secreción de proteína en
placas de 48 pocillos. Se subcultivaron células HepG2 1:2 y se
dejaron llegar a confluencia al menos 24 horas antes del
tratamiento con el fármaco. Antes de iniciar el tratamiento con el
fármaco, se retiró el medio de cultivo, se lavaron las células una
vez con PBS y se añadió cuantitativamente 1 ml de medio reciente. Se
añadió el compuesto A a pocillos duplicados en 10 \mul de
dimetilsulfóxido (DMSO), proporcionando concentraciones de
compuesto variables. Se utilizó DMSO solo (10 \mul) como control
negativo. (Nota: el DMSO a esta concentración tiene un efecto
despreciable sobre las células HepG2). Después de 16 horas de
incubación en condiciones de cultivo celular estándar, se
centrifugaron las placas a 2500 rpm durante 5 minutos a 4ºC de
temperatura para sedimentar cualquier célula suelta. Se diluyeron
los medios con medio de cultivo celular 10 veces para los ensayos
de apolipoproteína B (apoB) y albúmina de suero humano (HSA). Se
lavaron las células dos veces con PBS frío y se añadieron entonces
0,5 ml de tampón de homogeneización (fosfato de sodio 0,1 M, pH 8,0,
Triton X-100 al 0,1%). Se homogeneizaron las
células mediante trituración con una micropipeta de 1 ml, y se midió
la proteína utilizando el reactivo de Coomasie (Pierce Chemical
Co., Rockford, IL) como describe el fabricante.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ensayos ELISA para medir la masa de proteína
fueron de diseño "sandwich". Se recubrieron placas de
microvaloración con un anticuerpo monoclonal (anticuerpo primario)
específico de la proteína de interés (Biodesigns International,
Kennebunkport, ME), seguido del antígeno o la muestra, un anticuerpo
policlonal (anticuerpo secundario) dirigido hacia la proteína de
interés (Biodesigns International) y un tercer antibiótico conjugado
a fosfatasa alcalina dirigido hacia el anticuerpo secundario (Sigma
Biochemicals, St. Louis, MO). Se recubrieron las placas de
microvaloración de 96 pocillos (Corning, nº 25801) durante la noche
a temperatura ambiente con 100 \mul de anticuerpo monoclonal
diluido (las concentraciones finales fueron 1 \mug/ml, 2 \mug/ml
y 4 \mug/ml para anti-apoB, -apoAI y -HSA,
respectivamente, en carbonato de sodio/bicarbonato de sodio 0,1
M, pH 9,6 y azida de sodio 0,2 mg/ml). Se llevó a cabo el
recubrimiento durante la noche a temperatura ambiente. Después del
recubrimiento y entre cada etapa posterior de incubación, se lavaron
las placas cinco veces con cloruro de sodio al 0,9% con Tween 20 al
0,05%. Se añadieron alícuotas duplicadas (100 \mul) de medio de
cultivo diluido o estándar (apoB, apoAI ó HSA purificadas diluidas
a 0,3125-320 ng/ml con medio de cultivo celular) a
los pocillos recubiertos con anticuerpo monoclonal. Después de la
incubación durante 1,5 horas a temperatura ambiente, se retiró el
antígeno o la muestra y se lavaron los pocillos. Se diluyeron los
anticuerpos secundarios 1:500 en PBS + Tween 20 al 0,05% (tampón
III), después se añadieron 100 \mul a cada pocillo y se incubaron
durante 1 hora a temperatura ambiente. Se retiró el anticuerpo y se
lavaron los pocillos. Todos los anticuerpos secundarios eran
antisueros policlonales desencadenados en cabra frente a proteínas
humanas. Se diluyó 1:1000 una anti-IgG de conejo
anti-cabra conjugada a fosfatasa alcalina con tampón
III y se añadieron 100 \mul a cada pocillo. Después de la
incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, se retiró el
anticuerpo y se lavaron los pocillos ocho veces. Se añadió el
sustrato fosfato de p-nitrofenilo (Sigma
Biochemical, St. Louis, MO) a 1 mg/ml en carbonato de
sodio-bicarbonato de sodio 0,05 M, pH 9,8 +
cloruro de magnesio 1 mM. Después de una reacción de 45
minutos a temperatura ambiente, se paró el ensayo y se estabilizó el
color con la adición de 100 \mul de Tris 0,1 M, pH 8,0 +
EDTA 0,1 M. Se leyeron las placas de microvaloración a 405
nm en un lector de placas de 96 pocillos V-Max
(Molecular Devices, Menlo Park, CA).
Después de restar el fondo, se representaron los
patrones en una gráfica semilogarítmica y se realizó una regresión
logarítmica. Se utilizó la ecuación de la curva para calcular la
concentración de apoB, apoAI y HSA. Se normalizó la concentración
de proteína a la proteína celular total, proporcionando
concentraciones en unidades de ng/ml/mg de proteína celular. Cada
tratamiento de fármaco se realizó por duplicado y se promediaron
los resultados. Se dividieron las concentraciones de apoB, apoAI y
HSA para cada tratamiento de fármaco entre la correspondiente
concentración de proteína en el control DMSO. Se representaron los
resultados como porcentaje de control frente a la concentración de
fármaco.
Se subcultivaron células HepG2 en placas de 6
pocillos y se dejaron llegar a confluencia al menos 24 horas antes
del tratamiento del fármaco. Antes de la adición del fármaco, se
retiraron los medios de cultivo, se lavaron las células una vez con
PBS y se añadió cuantitativamente 1 ml de medio reciente (RPMI 1640
+ FBS al 10%). Se añadió el compuesto A a pocillos duplicados en 10
\mul de DMSO, proporcionando concentraciones variables del
compuesto. Se utilizó DMSO solo (10 \mul) como control negativo.
Después de 16 horas de incubación en condiciones de cultivo celular
estándar, se retiraron los medios y se añadió 1 ml de medio de
marcaje (RPMI 1640, BSA exenta de ácidos grasos 16,5 mg/ml, oleato
de sodio 1 mM, glicerol 1 mM,
^{3}H-glicerol 5 \muCi/ml (Amersham, Arlington
Heights, IL, nº catálogo TRA.24.4), con una segunda adición del
compuesto A. Se incubaron los cultivos durante 2 horas en
condiciones de cultivo celular estándar. Se retiraron los medios (1
ml) a tubos de vidrio de 15 ml y se diluyeron inmediatamente con 2
ml de metanol enfriado con hielo y 1 ml de dH_{2}O. Se lavaron
las células una vez con PBS y se procesaron para las medidas de
proteína total como se describió en la sección
I-B.
Se extrajeron los lípidos totales de los medios
y se analizaron como a continuación. Después de la adición de 5,0
ml de cloroformo y 0,2 ml de ácido acético al 2%, se agitaron con
vórtice los tubos durante 1 minuto y se centrifugaron a 2000 rpm
durante 5 minutos para separar las fases acuosa y orgánica. Se
retiró la fase acuosa superior y se añadieron 3,6 ml de
metanol:agua (1:1) que contenían ácido acético al 0,1%. Después de
agitar con vórtice brevemente, se centrifugaron los tubos como
anteriormente y se retiró de nuevo la fase orgánica. Se transfirió
la fase orgánica cuantitativamente a tubos de vidrio limpios de 15
ml y se evaporó el disolvente en atmósfera de nitrógeno. Se
disolvieron los lípidos secados en 0,1 ml de cloroformo y se
añadieron 30 \mul de cada muestra a gel de sílice 60A, en placas
de cromatografía de capa fina de 19 canales (Whatman). Se añadieron
5-10 \mug de TG en 10 \mul de cloroformo como
vehículo y se revelaron las placas en hexano:diisopropiléter:ácido
acético (130:7:4, v/v). Después del secado, se tiñó el lípido
mediante exposición de las placas a yodo. Se rascaron las bandas
correspondientes a TG en viales de centelleo. Se añadieron 0,5 ml de
dH_{2}O y 10 ml de fluido de centelleo EcoLite (ICN Biochemicals)
y se agitaron con vórtice vigorosamente las muestras. Se
normalizaron los datos brutos para la proteína celular y se
expresaron como porcentaje del control de DMSO.
\vskip1.000000\baselineskip
El rastreo primario sugirió que el compuesto A
(compuesto de referencia) inhibía el transporte de
^{3}H-TG catalizado por PTM de HDL a LDL. Se
confirmó la capacidad del compuesto A de inhibir el transporte de
lípidos catalizado por PTM en un segundo ensayo que mide el
transporte de ^{3}H-TG catalizado por PTM de SUV
donante a SUV receptora. La IC_{50} para el compuesto A es de
aproximadamente 1 \muM (figura 10).
Se administró el compuesto A a células HepG2 en
series de dilución doble en el intervalo de 0,156 a 20
\muM. Después de 16 horas de incubación en condiciones de
cultivo celular estándar, se ensayaron apoB, apoAI y HSA en
alícuotas de los medios acondicionados mediante ELISA. Se inhibió la
secreción de apoB de manera sensible a la dosis con una IC_{50}
de 5 \muM (figura 11). La secreción de apoI y HSA no se vio
afectada por la dosis máxima de 20 \muM, confirmando que
la inhibición era específica de apoB. Estos datos indican que la
adición de un inhibidor de PTM a una línea celular de hígado humano
inhibe la secreción de lipoproteínas que contienen apoB.
Se trataron células HepG2 con dosis de compuesto
A en el intervalo de 1,25 \muM-20 \muM en
condiciones idénticas a las utilizadas para el experimento de
secreción de apoB, apoAI y HSA. Se marcó radiactivamente el
conjunto intracelular de TG durante dos horas con
^{3}H-glicerol en presencia de un vehículo o dosis
variables de compuesto A. Se midió la acumulación de TG marcado
radiactivamente en el medio mediante extracción cuantitativa,
seguida de análisis de cromatografía en capa fina y normalización a
proteína celular total. Se utilizó DMSO solo como control. Se
inhibió la secreción de TG mediante el compuesto A de manera
dependiente de la dosis. Se observó que la IC_{50} era de
aproximadamente 2,0 \muM, que es similar a la IC_{50}
para la inhibición de la secreción de apoB (figura 12). Los datos
confirman que el compuesto A inhibe la secreción de lipoproteínas
ricas en TG que contienen apoB.
Se repitieron los procedimientos precedentes con
el compuesto B. El compuesto B inhibe el transporte de
^{3}H-TG catalizado por PTM de las SUV donantes a
las SUV receptoras. La IC_{50} es de aproximadamente 6
\muM (figura 13). Se inhibe también la secreción de
lipoproteínas que contienen apoB en células HepG2 por el compuesto B
(figura 14).
Para medir el efecto del compuesto A sobre el
transporte de EC ó PC entre membranas catalizado por PTM bovina, se
modificó el ensayo de transferencia de lípidos que mide la
transferencia de TG entre SUV. La composición de las vesículas
donantes era la misma, excepto porque ^{14}C-EC ó
^{14}C-PC reemplazaban los TG marcados. La
composición de las vesículas receptoras era la misma, excepto porque
no se incluían el PC marcado y los TG sin marcar. Después de la
precipitación de las vesículas donantes, se calculó el porcentaje de
transferencia de lípidos comparando el ^{14}C-EC
ó ^{14}C-PC en las vesículas receptoras en el
sobrenadante después de una reacción de transferencia con el
^{14}C-EC ó ^{14}C-PC en el
ensayo. Se restó el lípido marcado en el sobrenadante en ausencia
de PTM del lípido marcado en presencia de PTM para calcular la
transferencia de lípido catalizada por PTM de las SUV donantes a
las SUV receptoras. El resto del ensayo era esencialmente como se
describió anteriormente.
Se investigó también la capacidad del compuesto
A de inhibir el transporte de EC y PC marcados radiactivamente
catalizado por PTM entre membranas. El compuesto A inhibía la
transferencia de EC de manera comparable a la inhibición de la
transferencia de PC, pero era menos eficaz en la inhibición de la
transferencia de PC que en la transferencia de EC y TG. Se inhibía
aproximadamente un 40% de la transferencia de PC a concentraciones
de inhibidor que reducían la transferencia de TG y EC más del
80%.
Se obtuvo una genoteca de ADNc de intestino
delgado bovino, empaquetada en lambda gt10, de Clontech (nº
BL1010A). Se diluyó la genoteca en SM para contener 50.000
fagos/100 \mul (una dilución 1:100.000). Se mezcló el fago
diluido (100 \mul) con 300 \mul de células C600 de E.
coli (Clontech) y se incubó durante 15 minutos a 37ºC. Después
de añadir 7 ml de agarosa superior, se vertió la mezcla en una placa
de 150 mm que contenía 75 ml de agarosa LB. Se prepararon de esta
manera un total de 25 placas, cada una conteniendo aproximadamente
5 x 10^{4} fagos. Se incubaron las placas durante la noche a 37ºC
de temperatura.
Para aislar el ADN de fago, se añadieron 10 ml
de SM (sin gelatina) a cada placa. Se agitaron entonces suavemente
las placas a temperatura ambiente durante 2 horas. Se recogieron los
fagos eluidos (aproximadamente 8 ml/placa) y se reunieron. Se
sedimentaron las células de E. coli mediante centrifugación
durante 10 minutos a 12.000 x g.
Se aisló ADN de lambda de sobrenadante
utilizando la preparación QIAGEN tip-100 (midi)
según el protocolo suministrado por el fabricante. Se resuspendió el
ADN purificado en un total de 200 \mul de TE
(Tris-Cl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1
mM).
Se añadió 1 \mug de ADN de fago lambda
(aproximadamente 3 x 10^{7} moléculas) a 100 \mul de reacción
PCR que contenía cloruro de magnesio 2 mM, trifosfato de cada
desoxinucleótido 0,2 mM, 1,25 x tampón y 2,5 unidades de
polimerasa Taq (Perkin-Elmer-Cetus,
nº de estuche N801-0555). La concentración de cada
cebador era de 0,15 mM. La secuencia del cebador directo
(SEC Nº ID 29) era la siguiente:
La secuencia del cebador directo estaba basada
en la secuencia de ADNc humano que codifica las bases 41 a 66 del
componente de 88 kDa de la PTM. El cebador inverso (SEC Nº ID 30)
tenía la siguiente secuencia:
La secuencia del cebador inverso estaba basada
en la secuencia del ADNc bovino conocido que codifica el componente
de 88 kDa de la PTM y que se hibrida de la base 658 a 636 del ADNc
bovino, que corresponde a las bases 807-785 del
ADNc humano.
La amplificación PCR se realizó en un ciclador
térmico modelo 9600 de Perkin-Elmer. Después de dos
minutos de incubación a 97ºC, se cicló la reacción a 94ºC durante
30 segundos, a 50ºC durante 30 segundos y a 72ºC durante 1 minuto
durante 35 ciclos. Se realizó una incubación final a 72ºC durante 7
minutos.
Se sometió a electroforesis el producto de PCR
en un gel de agarosa al 1% en tampón TAE como se describió
anteriormente. El rendimiento del fragmento de 766 pares de bases
deseado fue de aproximadamente 2 \mug. Se cortó el ADN del gel,
se purificó utilizando GeneClean (Bio101 La Jolla, CA), se embotaron
sus extremos, se clonó en pUC 18-Sma1 (Pharmacia) y
se secuenció como se describió anteriormente.
Se muestra la nueva secuencia obtenida del ADNc
bovino que codifica la región del componente de 88 kDa de la PTM em
la SEC nº ID 5. La secuencia añade 83 bases al extremo 5' del ADNc
bovino reseñado anteriormente.
Se llevó a cabo la secuenciación del ADN
genómico humano mediante los procedimientos descritos en
"Demostración de un defecto génico en un segundo sujeto
abetalipoproteinémico" y en el ejemplo 1. El resultado de este
procedimiento es la secuencia genómica humana SEC nº ID 8.
Claims (19)
1. Una molécula de ácido nucleico que comprende
una secuencia de ácido nucleico (i) que codifica toda o parte de la
subunidad de alto peso molecular de la proteína de transferencia de
triglicéridos microsómicos y (ii) con la secuencia de nucleótidos
mostrada en la SEC Nº ID 1, 2, 8, 1 junto con 5, 2 junto con 7, las
primeras 108 bases ó 2 junto con 8, ó las primeras 108 bases de 2
junto con 7 y 8.
2. La molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 1, que es una molécula de ADN y en la que la
secuencia de ácido nucleico es una secuencia de ADN.
3. Una molécula de ADN que comprende una
secuencia de ADN que
- (a)
- es complementaria con la secuencia de ADN según la reivindicación 2; ó
- (b)
- se hibrida a la secuencia de ADN según la reivindicación 2 y codifica una proteína con la actividad biológica o actividad antigénica de la subunidad de alto peso molecular de la proteína de transferencia de triglicéridos microsómicos; ó
- (c)
- es un derivado alélico de cualquiera de las secuencias según la reivindicación 2 ó (b) o
- (d)
- está degenerada a cualquiera de las secuencias según la reivindicación 2, (b) ó (c).
4. Un vector de expresión que comprende la
secuencia de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,
estando la citada secuencia de ADN bajo el control de elementos
regulatorios adecuados para la expresión directa en una célula
huésped apropiada.
5. Una célula huésped procariótica o eucariótica
que comprende el vector de expresión según la reivindicación 4.
6. Un procedimiento para producir una molécula
de polipéptido con toda o parte de la subunidad de alto peso
molecular de la proteína de transferencia de triglicéridos
microsómicos, que comprende el cultivo de una célula huésped según
la reivindicación 5 en condiciones que permitan la expresión del
polipéptido.
7. Un procedimiento para detectar una secuencia
de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
3 que codifica toda o parte de la subunidad de alto peso molecular
de la proteína de transferencia de triglicéridos microsómicos o una
secuencia de ácidos nucleicos relacionados, que comprende:
- (a)
- poner en contacto la secuencia de ácido nucleico con un marcador detectable, que se une específicamente al menos a parte de la secuencia de ácido nucleico, y
- (b)
- detectar el marcador así unido;
indicando la presencia de marcador unido la
presencia de secuencias de ácido nucleico.
8. El procedimiento según la reivindicación 7,
en el que el marcador detectable es una secuencia de nucleótidos de
al menos aproximadamente 15 nucleótidos de longitud complementaria
con al menos una porción de la secuencia de ácido nucleico que
codifica la subunidad de alto peso molecular de la proteína de
transferencia de triglicéridos microsómicos.
9. El procedimiento según la reivindicación 8,
en el que la secuencia de nucleótidos es una secuencia de ADN
genómico, una secuencia de ADNc, una secuencia de ARN, una secuencia
de ARN con sentido o una secuencia de ARN sin sentido.
10. El procedimiento según la reivindicación 9,
en el que el marcador detectable se marca con un isótopo radiactivo
y la etapa de detección se lleva a cabo mediante
autorradiografía.
11. La molécula de ácido nucleico según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 ó la subunidad de alto peso
molecular de la proteína de transferencia de triglicéridos
microsómicos codificada por una molécula de ácido nucleico de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para uso en terapia o
diagnóstico.
12. Una composición farmacéutica que comprende
la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 ó la subunidad de alto peso molecular de la
proteína de transferencia de triglicéridos microsómicos codificada
por una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, opcionalmente junto con un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
13. El uso de una cantidad terapéuticamente
eficaz de (a) un inhibidor de la actividad de la proteína de
transferencia de triglicéridos microsómicos o (b) de la molécula de
ADN de la reivindicación 3(a) que reduce la cantidad de la
proteína de transferencia de triglicéridos microsómicos, para la
preparación de una composición farmacéutica para prevenir,
estabilizar o causar la regresión de aterosclerosis en una especie
de mamífero, donde dicho inhibidor es
1-[3-(6-fluoro-1-tetralanil)metil]-4-O-metoxifenil
piperazina.
14. El uso de una cantidad terapéuticamente
eficaz de (a) un inhibidor de la actividad de la proteína de
transferencia de triglicéridos microsómicos o (b) de la molécula de
ADN de la reivindicación 3(a) que reduce la cantidad de la
proteína de transferencia de triglicéridos microsómicos, para la
preparación de una composición farmacéutica para reducir los
niveles de lípidos en suero en una especie de mamífero, donde dicho
inhibidor es
1-[3-(6-fluoro-1-tetralanil)metil]-4-O-metoxifenil
piperazina.
15. El uso de la reivindicación 14, en el que el
lípido es colesterol, triglicérido, éster de colesterol o
fosfatidilcolina.
16. El uso de una cantidad terapéuticamente
eficaz de (a) un inhibidor de la actividad de la proteína de
transferencia de triglicéridos microsómicos o (b) de la molécula de
ADN de la reivindicación 3(a) que reduce la cantidad de la
proteína de transferencia de triglicéridos microsómicos, para la
preparación de una composición farmacéutica para la prevención o el
tratamiento de pancreatitis en una especie de mamífero, donde dicho
inhibidor es
1-[3-(6-fluoro-1-tetralanil)metil]-4-O-metoxifenil
piperazina.
17. El uso de una cantidad terapéuticamente
eficaz de (a) un inhibidor de la actividad de la proteína de
transferencia de triglicéridos microsómicos o (b) de la molécula de
ADN de la reivindicación 3(a) que reduce la cantidad de la
proteína de transferencia de triglicéridos microsómicos, para la
preparación de una composición farmacéutica para la prevención o el
tratamiento de obesidad en una especie de mamífero, donde dicho
inhibidor es
1-[3-(6-fluoro-1-tetralanil)metil]-4-O-metoxifenil
piperazina.
18. Un procedimiento para la preparación de una
molécula de ácido nucleico o una molécula de ADN según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 ó 11, que comprende el uso
de cualquiera de las siguientes técnicas:
- (a)
- rastreo en una genoteca genómica de de ADNc de la respectiva secuencia de ADN y aislamiento, ó
- (b)
- síntesis química de la secuencia de ADN, ó
- (c)
- síntesis de la secuencia de ADN mediante la reacción en cadena con polimerasa (PCR).
19. Un procedimiento para la preparación de la
composición farmacéutica de la reivindicación 12, que comprende la
combinación de la molécula de ácido nucleico o de la proteína con un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
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