ES2183394T5 - Análisis de la secuencia de ácidos nucleicos - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para la secuenciación de un polinucleótido, que comprende las etapas de: (i) hacer reaccionar un polinucleótido diana con una enzima polimerasa que se inmoviliza sobre un soporte sólido, y los diferentes nucleótidos, en condiciones suficientes para la reacción de la polimerasa; y (ii) detectar un efecto consecuente a la incorporación de un nucleótido específico complementario al polinucleótido diana, llevándose a cabo la detección mediante medida de la radiación.

Description

Análisis de la secuencia de ácidos nucleicos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la determinación de la secuencia de un polinucleótido.

Antecedentes de la invención

La capacidad de determinar la secuencia de un polinucleótido es de gran importancia científica. Por ejemplo, el Proyecto del Genoma Humano es un ambicioso esfuerzo internacional para trazar el mapa y la secuencia de los tres mil millones de bases de ADN codificadas en el genoma humano. Cuando se complete, la base de datos de lasecuencia resultante será una herramienta de poder sin precedentes para la investigación biomédica. El principalobstáculo para una conclusión con éxito de este proyecto tiene que ver con la tecnología usada en el procedimientode secuenciación.

El procedimiento principal de uso general para la secuenciación del ADN a gran escala es el procedimiento determinación de cadena. Este procedimiento se desarrolló primero por Sanger y Coulson (Sanger y col. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 1977; 74: 5463-5467), y se basa en el uso de derivados didesoxi de los cuatro trifosfatos de nucleósidos que se incorporan a la cadena polinucleotídica naciente en la reacción de la polimerasa. Tras la incorporación, los derivados didesoxi terminan la reacción de la polimerasa y seguidamente los productos seseparan por electroforesis en gel y se analizan para revelar la posición en la que el derivado didesoxi particular se haincorporado en la cadena.

Aunque este procedimiento se usa ampliamente y produce resultados fiables, se reconoce que es lento, laborioso y caro.

Un procedimiento de secuenciación alternativo se propone en el documento EP-A-0471732, que utiliza mediosespectroscópicos para detectar la incorporación de un nucleótido en la cadena polinucleotídica naciente complementaria al molde. El procedimiento se basa en un complejo inmovilizado de molde y cebador, que seexpone a un flujo que contiene solamente uno de los diferentes nucleótidos. Las técnicas espectroscópicas se usandespués para medir una señal dependiente del tiempo que se origina del crecimiento de la copia del molde catalizado por la polimerasa. Las técnicas espectroscópicas descritas son espectroscopía de resonancia delplasmón superficial (SPR), que mide los cambios en un analito dentro de un campo de ondas evanescentes, y técnicas de medida de fluorescencia. Sin embargo, se reconoce que este procedimiento tiene limitaciones; lo másgrave de la técnica SPR es que, a medida que el tamaño de la cadena copiada crece, el tamaño absoluto de la señaltambién crece debido al movimiento de la cadena fuera del campo de ondas evanescentes, haciendo más difícildetectar los incrementos. Las técnicas de medida de fluorescencia tienen la desventaja de aumentar la interferencia de fondo de los fluoróforos incorporados en el crecimiento de la cadena polinucleotídica naciente. A medida que lacadena crece, el “ruido” de fondo aumenta y el tiempo requerido para detectar cada incorporación de nucleótidosnecesita incrementarse. Esto restringe gravemente el uso del procedimiento para secuenciar polinucleótidos grandes.

Por lo tanto, es necesario un procedimiento mejorado para la determinación de la secuencia de polinucleótidos queincremente significativamente la velocidad a la que un polinucleótido se secuencia y que se lleve a cabo preferentemente por un proceso automatizado, reduciendo la complejidad y el coste asociados con los procedimientos existentes.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en la verificación de que la medida de una radiación electromagnética u otra puede utilizarse para detectar un cambio de masa y/o de conformación en una enzima polimerasa, el cual se producecuando un nucleótido se incorpora a la cadena de polinucleotídica naciente.

Según la presente invención, un procedimiento para la secuenciación de un polinucleótido comprende las etapas de:

(i)

hacer reaccionar un polinucleótido diana con una enzima polimerasa inmovilizada en un soporte sólido, y losdiferentes nucleótidos, en condiciones suficientes para la reacción de la polimerasa; y

(ii)

detectar la incorporación de un nucleótido específico complementario al polinucleótido objetivo, midiendo uncambio en, o la absorción de, la radiación aplicada durante la interacción entre el nucleótido y la enzima, en el que las etapas (i) y (ii) se llevan a cabo con cada uno de los nucleótidos diferentes por turnos, hasta que se detecta laincorporación, y después se repite, o en el que la etapa (i) se lleva a cabo con todos los nucleótidos presentes,comprendiendo los nucleótidos un grupo bloqueante en 3’ que se retira tras la reacción de la polimerasa.

La radiación puede aplicarse a una muestra utilizando un número de técnicas, incluyendo las técnicas de detección sensible en superficies, donde un cambio en la respuesta óptica en una superficie óptica sólida se utiliza para indicaruna interacción de unión en la superficie. En una realización preferida de la invención; se usa la técnica de espectroscopía de ondas evanescentes, en particular la espectroscopía de resonancia del plasmón superficial (SPR).

En una realización de la invención, los nucleótidos utilizados en el procedimiento incluyen un grupo bloqueante en laposición 3’, y opcionalmente en la posición 5’, el cual evita la incorporación de los nucleótidos en la cadenapolinucleotídica. Sin embargo, los grupos bloqueantes pueden eliminarse selectivamente para permitir que suceda laincorporación. Utilizando los nucleótidos bloqueantes, es posible llevar a cabo el procedimiento usando todos losnucleótidos presentes en la reacción en un momento dado. La eliminación selectiva de los grupos bloqueantes se lleva a cabo de forma que asegure la detección de cada nucleótido incorporado. Por lo tanto el procedimiento puede proceder en “tiempo real”, para lograr una alta velocidad de análisis de la secuencia.

Descripción de los dibujos

La invención se describirá a modo de ejemplo solamente con referencia a los siguientes dibujos, en los que:

La Figura 1 es una ilustración esquemática de un análisis de secuencia polinucleotídica utilizando la espectroscopía SPR; y

La Figura 2 ilustra las diferentes señales de respuesta detectadas para la polimerización de cada uno de losdiferentes nucleótidos.

La Figura 3 ilustra el procedimiento de síntesis de los nucleótidos doblemente bloqueados.

Descripción de la invención

El presente procedimiento para secuenciar un polinucleótido implica el análisis de la interacción cinética entre una enzima polimerasa, un polinucleótido diana y un nucleótido complementario. La medida de la interacción cinética selleva a cabo controlando los cambios de absorción de la radiación electromagnética u otra que ocurren si la reaccióncontinúa.

El término “polinucleótido” como aquí se usa se ha a interpretar ampliamente, e incluye ADN y ARN, incluyendo ADNy ARN modificados, así como otras moléculas similares de ácidos nucleicos que hibridan, por ejemplo ácido nucleicopeptídico (PNA).

Típicamente, el procedimiento se lleva a cabo aplicando radiación electromagnética, utilizando las técnicas deresonancia del plasmón superficial o resonancia magnética nuclear. Sin embargo, pueden considerarse otras técnicas que miden cambios en la radiación, por ejemplo espectroscopía de fluorescencia reflectante interna total(TIRF), reflexión total atenuada (ATR), reflexión total frustrada (FTR), reflectometría angular de Brewster, reflexióninterna total dispersa (STIR) o elipsometría de ondas evanescentess.

También se prevén otras técnicas distintas de aquellas que requieren radiación eletromagnética, en particulartécnicas fotoquímicas tal como la quimioluminiscencia, y técnicas gravimétricas que incluyen sistemas de resonanciatales como las técnicas de ondas acústicas superficiales (SAW) y técnicas de microbalanza de cristal de cuarzo(QCM).

La espectroscopía de resonancia del plasmón de superficie (SPR) es un procedimiento preferido, y mide laspropiedades de una solución detectando las diferencias del índice de refracción entre la fase mayoritaria de lasolución y la región de ondas evanescentes. La luz monocromática incidente se refleja en un ángulo específico fuera de una superficie óptica sólida (chip sensor) en el lado opuesto a la muestra en estudio. La luz se extiende hacia dentro de la muestra en una distancia muy corta y está afectada por una interacción en la superficie.

Los chips sensores adecuados se conocen en la técnica. Típicamente, comprenden un material ópticamentetransparente, por ejemplo vidrio, y una película delgada reflectante, por ejemplo plata u oro. Para una revisión de laespectroscopía SPR véase la publicación de patente europea N.º 0648328 (la divulgación de la cual se incorpora ensu totalidad en el presente documento como referencia).

La espectroscopía de resonancia magnética nuclear (NMR) es otro procedimiento preferido, y mide las propiedadesmagnéticas de los compuestos. Los núcleos de los compuestos se orientan energéticamente por una combinacióndel campo magnético aplicado y una radiación de radiofrecuencia. Cuando la energía ejercida sobre un núcleoiguala a la diferencia de energía entre los estados de rotación (la diferencia entre la orientación paralela o antiparalela a la dirección de los campos aplicados), se logra un estado conocido como resonancia. La absorción y emisión posterior de energía asociadas con el cambio de un estado de rotación a otro, se detecta mediante unreceptor de radiofrecuencia.

Un aspecto importante del procedimiento de la presente invención es el uso de una enzima polimerasa inmovilizadaen un soporte sólido. La inmovilización de la polimerasa ofrece varias ventajas importantes para el éxito de esteprocedimiento. Primeramente, se reduce considerablemente el problema de “ruido” aleatorio asociado a la medidade la absorción de energía en las moléculas solubles. En segundo lugar, se reduce el problema del ruido de lainteracción de cualquier sustrato (por ejemplo nucleótidos) no relacionado directamente con la polimerasa, ya que lapolimerasa puede mantenerse dentro de un área definida específicamente respecto al campo de medida. Esto es departicular relevancia si la técnica utilizada para medir los cambios en radiación requiere la medida de la fluorescencia, como en la TIRF, en la que la fluorescencia de fondo se incrementa a medida que crece la cadenanaciente. Asimismo, si se utiliza la espectroscopía SPR, las reacciones de la polimerasa se mantienen dentro delcampo de ondas evanescentes y así se pueden hacer medidas exactas pueden realizarse sin tener en cuenta eltamaño del polinucleótido. Finalmente, como ni el polinucleótido diana ni el oligonucleótido cebador se unen irreversiblemente a la superficie sólida, es relativamente sencillo regenerar la superficie, para permitir reacciones desecuenciación adicionales que tienen lugar utilizando la misma polimerasa inmovilizada.

La inmovilización se puede realizar utilizando procedimientos estándar conocidos en la técnica. En particular, sepuede utilizar la inmovilización que usa procedimientos estándar de acoplamiento de aminas, con la unión de aminasasociadas a ligando, por ejemplo, a una superficie activada por un éster de dextrano o N-hidroxisuccinimida. En unarealización preferida de la invención, la polimerasa se inmoviliza en la superficie de un chip sensor de SPR que mantiene la polimerasa en estrecha proximidad a la superficie del sensor en que se pueden medir los cambios delíndice de refracción. Se describen ejemplos de los procedimientos utilizados para inmovilizar biomoléculas ensensores ópticos en el documento EP-A-0589867, y en Löfas y col., Biosens. Bioelectron. (1995) 10: 813-822.

La polimerasa utilizada en la invención puede ser de cualquier tipo conocido. Por ejemplo, la polimerasa puede sercualquier polimerasa de ADN dependiente de ADN. Si el polinucleótido diana es una molécula de ARN, entonces lapolimerasa puede ser una polimerasa de ADN dependiente de ARN, es decir transcriptasa inversa, o una polimerasade ARN dependiente de ARN, es decir replicasa de ARN. En una realización preferida de la invención, la polimerasa5 es la Taq polimerasa. En una realización preferida adicional de la invención, la polimerasa es la holoenzima polimerasa III de E. coli (McHenry, Ann. Rev. Biochem. 1988; 57:519), la polimerasa del T7 (Schwager y col.,Methods in Molecular and Cellular Biology (1989/90); Vol.1 (4): 155-159), o la polimerasa del gen 5 del bacteriofagoT7 complejada con Tiorredoxina de E. coli (Tabor y col., J. Biol. Chem. (1987); 262: 1612-1623). Cada una de estasenzimas polimerasas permite que se produzca la unión con el polinucleótido diana con una alta fidelidad, y por tanto

10 mantiene el complejo polinucleótido – polimerasa, incluso cuando la polimerización no tiene lugar activamente.

La holoenzima de la polimerasa III se compone de tres subcomplejos que funcionan para crear la enzima procesiva:

(I) el núcleo de la polimerasa, que incluye la subunidad a de la polimerasa; (II) la subunidad dimúa

érica � que actcomo una estructura similar a un brazalete alrededor del ADN; y (III) un subcomplejo de dos subunidades, T e y, utilizadas para unir e hidrolizar ATP y así formar el dímero � alrededor del ADN.

15 Como primera etapa en el procedimiento de secuenciación, el polinucleótido diana se puede poner en contacto con un cebador apropiado en el tampón de hibridación/polimerización. Típicamente, el tampón estará a una temperatura suficientemente alta para romper (o fundir) cualquier estructura secundaria que exista en el polinucleótido diana.Cuando se enfría, el cebador se unirá a su complemento en la diana. Esta muestra puede seguidamente ponerse encontacto con la polimerasa inmovilizada para formar el complejo polinucleótido diana/polimerasa.

20 En una realización de la invención, la adición de los nucleótidos se controla de manera que los diferentes nucleótidos se añaden secuencialmente al complejo polimerasa/diana. Por ejemplo, puede añadirse dGTP y permitir que pase sobre el complejo polimerasa/ polinucleótido; detectándose entonces cualquier incorporación. El dGTP nounido se va del sitio de reacción y se introduce un nucleótido adicional. De este forma, la detección de unainteracción cinética puede relacionarse con el nucleótido particular presente en ese momento y la secuencia

25 polinucleotídica puede entonces determinarse.

El procedimiento puede también llevarse a cabo con todos los diferentesnucleótidos presentes. Por ello, parallevarse a cabo con éxito, es necesario que los nucleótidos incorporen un grupo bloqueante al menos en la posición3’, pero preferiblemente en las posiciones 3’ y 5’. Los grupos bloqueantes pueden ser fotosensibles y puedeneliminarse aplicando luz de una determinada longitud de onda, para liberar la molécula activa. Si los nucleótidos30 incorporan grupos bloqueantes en las posiciones 3’ y 5’, los grupos bloqueantes deben ser capaces de distinguirse en base a su absorbancia espectral, es decir debe ser posible eliminar selectivamente uno de los gruposbloqueantes aplicando luz a una longitud de onda específica que no elimine el otro grupo bloqueante. También esdeseable que el grupo bloqueante de la posición 3’ necesite que la luz se aplique durante una mayor duración que larequerida para eliminar el grupo bloqueante de la posición 5’. Esto permite que los grupos bloqueantes se distingan

35 tanto por medios espectrales como temporales.

Generalmente, los grupos bloqueantes fotosensibles sufren fotolisis a longitudes de onda en el intervalo de 200 nm a450 nm. Los grupos bloqueantes derivarán típicamente de un compuesto de fórmula R1-[O-CO-] X en la que R1es un grupo fotolábil y X es un grupo saliente. Por ejemplo, R1 es o-nitrobencilo. Los grupos bloqueantes que se prefieren de forma particular incluyen los grupos protectores de o-nitrobencilo descritos en el documento WO-A-92/10092 y en

40 el WO-A-97/39151. Estos grupos incluyen nitroveratriloxicarbonilo (NVOC), nitropiperoniloxicarbonilo (NPOC), ametil-nitroveratriloxicarbonilo (MeNVOC), a-metil-nitropiperoniloxicarbonilo (MeNPOC) y 1-pirenilmetiloxicarbonilo(PYMOC).

Un grupo bloqueante de 3’ apropiado es el grupo (4,5-dimetoxi-2-nitrobencil) oxicarbonilo que puede formarse porreacción del nucleótido con un compuesto de fórmula (I):

en la que R es un grupo de esterificación apropiado, por ejemplo metilo. Este grupo bloqueante puede eliminarseselectivamente con un pulso de luz con una longitud de onda de 360 nm.

Un grupo bloqueante apropiado en la posición 5’ es el grupo 1-(2-nitrofenil) etilo (II):

en la que R es cualquier grupo funcional apropiado, por ejemplo un halógeno. Este grupo bloqueante puedeeliminarse selectivamente a una longitud de onda de 260 nm.

Como ejemplo, los nucleótidos doblemente bloqueados se inyectan sobre el polinucleótido diana cebado (mantenidoen asociación con un complejo de polimerasa de alta fidelidad), y se hace converger una luz monocromática cadenaarriba de la polimerasa a una longitud de onda suficiente para liberar el grupo bloqueante del fosfato terminal decada nucleótido. Seguidamente los nucleótidos son capaces de pasar sobre la polimerasa unida, y puede ocurrir quese incorporen a la cadena polinucleotídica naciente. Sin embargo, como el grupo bloqueante en la posición 3’permanece unido, sólo se incorpora un nucleótido. Por lo tanto, la medida de la interacción cinética suministraráinformación acerca del nucleótido particular incorporado a la cadena naciente. La polimerasa utilizada puede ser unapolimerasa de alta fidelidad que no se disocia fácilmente de la diana cuando la reacción se detiene. Por otra parte,puede utilizarse un inhibidor competitivo para evitar la disociación de la polimerasa de la diana.

Después de medir el nucleótido incorporado, se hace converger un pulso de luz monocromática en el grupobloqueante dentro del sitio catalítico de la polimerasa, para eliminar el grupo bloqueante en la posición 3’. El pulsode luz monocromática puede tener una duración mayor que la necesaria para la eliminación en la posición 5’, y deesa forma solamente el grupo bloqueante asociado al nucleótido en el complejo de polimerasa experimentará laseparación. Esto reduce la probabilidad de adición de nucleótidos no asociados al complejo de la polimerasa.

Una vez que el grupo bloqueante 3’ se libera, se permite continuar la reacción de la polimerasa a medida que lleganlos nucleótidos adicionales al sitio de la reacción de la polimerasa. La polimerización descontrolada se evita alternando los pulsos de luz requeridos para eliminar los grupos bloqueantes.

Aunque se prefiere utilizar nucleótidos doblemente bloqueados, como se ha descrito anteriormente, el procedimientopuede también llevarse a cabo utilizando nucleótidos que tengan un grupo bloqueante en la posición 3’ solamente.En este caso es conveniente utilizar un inhibidor competitivo de la polimerasa, que reducirá la probabilidad de queun nucleótido, que pierde un grupo bloqueante en la posición 3’, se incorpore en la cadena naciente. Un inhibidor competitivo apropiado de la polimerasa es el carbonildifosfonato (COMDP).

El siguiente ejemplo ilustra la invención con referencia a los dibujos.

Ejemplo

El siguiente análisis se llevó a cabo en un sistema BIAcore 200 modificado (BIAcore AB, UPPSALA, Suecia) con un chip sensor CM5 (calidad de investigación, BIAcore AB) como superficie sensora óptica. El instrumento fue suministrado con un cartucho de microflujo integrado (IFC) que permite el análisis en cuatro celdas mediante unainyección única de la muestra.

Preparación de la polimerasa

La holoenzima polimerasa III de E. coli se preparó según (Millard y col., Methods Enzymol. (1995); 262: 22) que utiliza cromatografía de interacción hidrofófica sobre valilsefarosa, para purificar la holoenzima a altasconcentraciones salinas. Después de la purificación, la enzima aislada se concentró utilizando la técnica de filtracióniónica descrita por Kirkegaard y col., Anal. Biochem. (1972); 50: 122.

Inmovilización de la polimerasa

La inmovilización de la polimerasa en la superficie del chip sensor se llevó a cabo según (Jönson y col., Biotechniques (1991); 11:620-627). Brevemente, el entorno del chip sensor se equilibró con tampón Hepes (Hepes10 mM, NaCl 150 mM, tensioactivo P20 (BIAcore AB, Uppsala, Suecia) 0,05 %, pH 7,4). Se mezclaron juntosvolúmenes iguales de N-hidroxisuccinimida (0,1 M en agua) y N-etil-n’-(dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) (0,1M en agua) y se inyectaron a través de la superficie del chip (CM5), para activar el dextrano carboximetilado. El núcleo del subcomplejo polimerasa III (160 Pl, 500 U) se mezcló con acetato sódico 10 mM (100

Pl,pH 5) y seinyectó a través de la superficie activada. Finalmente, los ésteres residuales de N-hidroxisuccinimida de la superficiedel chip sensor se hicieron reaccionar con etanolamina (35 Pl, 1 M en agua, pH 8,5), y la polimerasa no unida seeliminó de la superficie. El procedimiento de inmovilización se realizó con un flujo continuo de tampón Hepes (5Pl/min) a una temperatura de 25 ºC.

Oligonucleótidos

Se sintetizaron dos oligonucleótidos utilizando la química de la fosforamidita estándar. El oligonucleótido definido como SEC ID N.º 1 se utilizó como polinucleótido diana, y el oligonucleótido definido como SEC ID N.º 2 se utilizó como cebador.

CAAGGAGAGGACGCTGTCTGTCGAAGGTAAGGAACGGACGAGAGAAGGGAGAG SEC ID N.º 1

CTCTCCCTTCTCTCGTC SEC ID N.º 2

Los dos oligonucleótidos se hicieron reaccionar en condiciones de hibridación para formar el complejo diana cebador.

Seguidamente el ADN cebado se resuspendió en tampón (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, MgCl2 8 mM, glicerol al 4 % (v/v), ditiotreitol (DDT) 5 mM, 40 Pg albúmina sérica bovina) que contiene 21 Pg de proteína de unión a ss ADN y elsubcomplejo de la pol III, requerido para formar una estructura similar a un brazalete 1,6 pmol de dímero y 195 fmol de subunidades y). Se empleó ATP 0,5 mM junto con carbonildifosfonato (COMDP) 60 PM. En esta reacción, lasubunidad y actúa como un intermediario molecular, hidrolizando el ATP para colocar las subunidades del dímero en el ADN y formar el subcomplejo de la polimerasa (Studwell y col., UCLA Simp. Mol. Cell. Biol. New Ser. 1990;

127: 153).

El complejo ADN cebado/subcomplejo se inyectó seguidamente sobre la polimerasa III en la superficie del chipsensor a una velocidad de flujo de 5 Pl/min, y se le permitipolimerasa por medio de la acción de las

ó unirse a la subunidades y.

En este experimento son necesarios magnesio y ATP para que la Pol III se una al ADN cebado. Sin embargo, elmagnesio también promueve la eliminación del cebador por la actividad correctora exonucleasa 3’�5’. Este problema se puede superar incluyendo el carbonildifosfonato, que es un inhibidor competitivo de la actividad de lapolimerasa (puede usarse una pol III sin actividad exonucleasa 3’�5’ para evitar este problema particular).

Se mantiene un flujo continuo de carbonildifosfonato 60 PM sobre la superficie del chip para evitar que la actividadexonucleasa elimine el cebador del ADN diana.

Nucleótidos que incorporan dos grupos bloqueantes

Cada nucleótido (dCTP, dTTP, dGTP y dATP) contenía un grupo bloqueante de 1-(2-nitrofenil) etilo en la posición 5’y un grupo bloqueante (4,5-dimetoxi-2-nitrobencil) oxicarbonilo en la posición 3’, como se muestra en la Figura 3. Lasíntesis de los nucleótidos doblemente bloqueados fue como sigue:

Etapa 1: - Síntesis de (4,5-dimetoxinitrobencil) oxicarbonil- nucleósido trifosfato.

El mismo procedimiento general se aplicó a dGTP, dCTP y dTTP. Una mezcla de dATP dihidratado (0,4 mmoles) y aproximadamente 3 mmoles de 4,5-dimetoxi-2-nitrofenildiazometano, recién preparado a partir de 900 mg (4 mmoles) de 4,5-dimetoxi-2-nitrofenilhidrazona (sintetizada mediante tratamiento del 6-nitroveraldehído con monohidrato de hidracina en cloroformo por el procedimiento de Wootton y Trentham, Photochemical Probes inBiochemidtry (Nielsen, P.E., Ed,) NATO ASI Ser. C, Vol. 272, p277-296 (1989), se agitó en 15 ml de DMSO atemperatura ambiente en oscuridad durante 40 h. El control de la reacción por CCF en un sistema de disolventes decloroformo/metanol (5:1 v/v) reveló la aparición de una mancha con un Rf de 0,54 correspondiente al nucleótidofijado. Se eliminaron el DMSO, el compuesto diazo sin reaccionar, y los productos de reacción con baja polaridad mediante extracción repetida con 60 ml de éter. El material residual, que entre otras sustancias contenía nucleótidossin reaccionar y el producto deseado, se disolvió en una cantidad mínima de cloroformo y se separó mediantecromatografía ultrarrápida en columna de sílice (3 x 30 cm). La elución con cloroformo al 100 % ymetanol/cloroformo (95:5 v/v) retiró los productos secundarios hidrofóbicos de 4,5-dimetoxi-2-nitrofenildiazometanode la columna. Las fracciones se secaron en un evaporador rotatorio. Seguidamente se liofilizaron 78 mg del producto fijado. El rendimiento total fue del 45 %. El dATP bloqueado en 3’ con 4,5-dimetiloxi-2nitrobenciloxicarbonilo se aisló directamente con una pureza mayor mediante una cromatografía HPLC preparativade fase inversa a partir del producto en bruto.

Etapa 2: - Adición del grupo 1-(2-nitrofenil) etilo en 5’ al dATP bloqueado en 3’ con 4,5-dimetoxi-2nitrobenciloxicarbonilo.

Una mezcla de dATP bloqueado en 5’ con 4,5-dimetiloxi-2-nitrobenciloxicarbonilo (0,4 mmoles) y aproximadamente3 mmoles de 1-(2-nitrofenil) diazoetano, recién preparado a partir de 716,7 mg (4 mmoles) de hidrazona de 2nitroacetofenona (sintetizada por tratamiento de 2-nitroacetofenona con monohidrato de hidracina en etanol) y 2,9 g (30 mmoles) de MnO2 (al 90 %) en 20 ml de cloroformo por el procedimiento de Walker y col., (Walker y col.,Methods Enzymol. 1989; 172: 288-301), se agitó en 15 ml de DMSO a temperatura ambiente en oscuridad durante40 h. El control de la reacción por CCF en un sistema disolvente de cloroformo/metanol (5:1 v/v) reveló la apariciónde un par de manchas con un Rf de 0,68 y un Rf de 0,58, correspondiente a los dos diaestereoisómeros de la formaaxial y los dos diaestereoisómeros de la forma ecuatorial del éster de 1(2-nitrofenil) etilo de dATP bloqueado en 5’con 4,5-dimetoxi-2-nitrofeniloxicarbonilo, respectivamente. El DMSO, el compuesto diazo sin reaccionar, y losproductos de reacción de baja polaridad se separaron por extracción repetida con 50 ml de éter.

El material residual, que, entre otras sustancias, contenía dATP bloqueado en 5’ con 4,5-dimetoxi-2nitrobenciloxicarbonilo sin reaccionar y el dATP doblemente bloqueado deseado, se disolvió en una cantidad mínimade cloroformo y se separó por cromatografía rápida en columna de sílice de 3 x 30 cm. La elución con cloroformo al100 % eliminó los productos secundarios hidrófobos de 1-(2-nitrofenil) diazoetano de la columna. El producto sesecó en un evaporador rotatorio. La liofilización dio 74 mg del compuesto fijado. El rendimiento total fue del 57 %.

Cada nucleótido estuvo presente a una concentración de 0,2 mM en el tampón de polimerización (Tris-HCl 1mM, pH 8,8, KCl 8,5 mM, MgCl2 0,15 mM, gelatina al 0, 01 % (p/v)).

Secuenciación del ADN

La Figura 1 muestra un sistema de sensibilidad de SPR y una celda de fluido (7), que tiene un medio para aplicaruna radiación electromagnética (1) a un chip sensor (2) con una enzima polimerasa inmovilizada (3) en la superficiedel sensor, una entrada (4) para introducir los diferentes nucleótidos en la celda y dos montajes de enfoque (5) y (6)para aplicar el pulso de la luz monocromática en la celda.

Los diferentes nucleótidos se introducen en la celda de fluido (7) con una velocidad de flujo de 30 Pl/min., a una temperatura de 25 ºC y una velocidad de recogida de datos de 10 Hz. A medida que los nucleótidos pasan almontaje de enfoque (5), se aplica un pulso de luz monocromática a una longitud de onda de 260 nm para eliminar elgrupo bloqueante de la posición 5’. Seguidamente los nucleótidos pasan sobre el chip sensor (2) y se ponen encontacto con el complejo polinucleótido diana/polimerasa (3) que se mantiene en su sitio por el subcomplejo deldímero �. Puesto que la posición 3’ de la secue ncia del cebador está libre para reaccionar, la polimerización puedetener lugar a medida que un nucleótido se incorpora sobre su complemento en el polinucleótido diana. Seguidamente esta incorporación se detecta mediante la luz p-polarizada monocromática del dispositivo de SPR.Puesto que el nucleótido incorporado tiene un grupo bloqueante a en la posición 3’ no se produce ningunapolimerización adicional. Seguidamente el montaje de enfoque (6) emite un pulso de luz monocromática de longitudde onda de 360 nm en el sitio de la polimerización. La alta velocidad de flujo en la celda del fluido asegura que losnucleótidos no unidos a la polimerasa se separen de la celda antes de que se haya absorbido una energía suficiente para liberar sus grupos bloqueantes en 3’.

Una vez que el grupo bloqueante en 3’ se ha liberado del nucleótido polimerizado, se puede producir una polimerización adicional.

La Figura 2 muestra los resultados del experimento de secuenciación con cada nucleótido incorporado en la cadena naciente que se detecta. Los resultados muestran una secuencia complementaria a la de la SEC ID N.º 1.

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para la secuenciación de un polinucleótido, que comprende las etapas de :

   (i)

   hacer reaccionar un polinucleótido diana con una enzima polimerasa que se inmoviliza sobre un soporte sólido, y los diferentes nucleótidos, en condiciones suficientes para la reacción de la polimerasa; y

   (ii)

   detectar la incorporación de un nucleótido específico complementario al polinucleótido diana, llevándose a cabola detección mediante medida de un cambio en, o la absorción de, la radiación aplicada durante la interacción entreel nucleótido y la enzima, en el que las etapas (i) y (ii) se llevan a cabo con cada uno de los nucleótidos diferentespor turnos, hasta que se detecta la incorporación, y después se repite, o en el que la etapa (i) se lleva a cabo contodos los nucleótidos presentes, comprendiendo los nucleótidos un grupo bloqueante en 3’ que se retira tras lareacción de la polimerasa.

2. 2.

   Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el grupo bloqueante puede eliminarse selectivamentemediante pulsos de luz monocromática.

3. 3.

   Un procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que los nucleótidos comprenden un grupo bloqueante adicional en el grupo fosfato terminal de la cadena de trifosfato, y el grupo bloqueante adicional seelimina antes de la eliminación del grupo bloqueante en 3’.

4. 4.

   Un procedimiento según la reivindicación 3, en el que el grupo bloqueante adicional puede eliminarseselectivamente mediante pulsos de luz monocromática en condiciones diferentes de las requeridas para eliminar elgrupo bloqueante en 3’.

5. 5.

   Un procedimiento según la reivindicación 4, en el que el grupo bloqueante adicional se elimina mediante pulsosde luz monocromática de una duración diferente de la requerida para eliminar el grupo bloqueante en 3’.

6. 6.

   Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa (i) comprendeademás la introducción de un inhibidor competitivo de la enzima polimerasa.

7. 7.

   Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el polinucleótido diana de laetapa (i) se une a la enzima polimerasa mediante un complejo de dímero 2.

8. 8.

   Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la polimerasa es la ADN polimerasa III de E. coli o la polimerasa T7.

9. 9.

   Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la polimerasa es la Taq polimerasa.

10. 10.

    Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la polimerasa es la transcriptasainversa.

11. 11.

    Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa (ii) comprende la detección de un cambio en la señal de resonancia con el tiempo.

12. 12.

    Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la radiación es electromagnética.

13. 13.

    Un procedimiento según la reivindicación 12, en el que la radiación electromagnética está en el espectro infrarrojo.

14. 14.

    Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa (ii) comprende el usode resonancia del plasmón superficial.

15. 15.

    Un procedimiento según la reivindicación 12, en el que la radiación electromagnética está en el espectro de radiofrecuencia.

16. 16.

    Un procedimiento según la reivindicación 15, en el que la incorporación de un nucleótido se detecta usando resonancia magnética nuclear.

17. 17.

    Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el polinucleótido es ADN.