ES2191064T5 - Procedimiento para producir proteinas. - Google Patents
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Abstract
UN PROCESO PARA PRODUCIR UNA PROTEINA, CULTIVANDO CELULAS HUESPED CAPACES DE EXPRESAR LA PROTEINA DIANA MEDIANTE UN CULTIVO DE ALIMENTACION, EN EL QUE EL INDICE DE CRECIMIENTO ESPECIFICO DE LAS CELULAS HUESPED SE CAMBIA DEL VALOR INICIAL A UN VALOR DADO, VARIANDO CONTINUAMENTE EL INDICE DE ADICION DEL SUBSTRATO QUE CONTROLA EL CRECIMIENTO DE LAS CELULAS HUESPED EN EL MEDIO DE CULTIVO. EL MODO DE VARIACION DEL INDICE DE ADICION, DE ACUERDO CON LA INVENCION, PUEDE CONSEGUIR PAUTAS OPTIMAS DE INDICE DE CRECIMIENTO ESPECIFICO E INDICE DE PRODUCCION ESPECIFICO, DIRIGIDO A OPTIMIZAR EL SISTEMA DE CULTIVO DE ALIMENTACION. COMO RESULTADO, ES POSIBLE LLEVAR A CABO UN CULTIVO DE ALTA DENSIDAD DE CELULAS HUESPED MEDIANTE UN CULTIVO DE ALIMENTACION, Y PRODUCIR PROTEINAS DESEADAS EFICAZMENTE EN POCO TIEMPO.
Description
Procedimiento para producir proteínas.
La presente invención se refiere a un método de
producción de una proteína, que comprende controlar la velocidad de
adición de un sustrato a un medio durante el proceso de cultivo para
conseguir una producción eficaz de la proteína. Más
específicamente, la presente invención se refiere a un método de
producción eficaz de una proteína, que comprende controlar la
velocidad de adición de un sustrato a un medio para optimizar el
entorno de cultivo de un sistema de cultivo discontinuo alimentado
mediante la utilización de la velocidad específica de
multiplicación \mu como índice.
La mayoría de las proteínas con un valor
comercial se producen actualmente mediante cultivo de una célula
anfitriona capaz de expresar el gen de tal proteína.
La producción de una proteína mediante técnicas
de cultivo o recombinación genética se basa en el mecanismo que
permite la producción de una proteína deseada junto con la
proliferación funcional exponencial de la célula anfitriona. Para
aumentar la productividad de la proteína, se necesita preparar o
controlar el entorno de cultivo de la célula anfitriona, de tal
manera que la actuación de la célula anfitriona (función de la
célula) pueda ser empleada lo más eficazmente posible. Con este
fin, se han investigado diversos métodos adecuados para la
producción por cultivo referidos a procesos de cultivo para producir
una proteína deseada en un tiempo corto, con una eficacia de
producción alta y con un rendimiento alto.
Existe una relación estrecha entre la velocidad
específica de multiplicación de la célula anfitriona y la cantidad
de proteína producida por la mencionada célula anfitriona, y la
producción máxima de la proteína requiere un control de la
velocidad específica de multiplicación de la célula anfitriona para
mantenerse constante a un valor óptimo. Para conseguir esto, hasta
ahora se ha estudiado desde varios aspectos la relación entre la
cantidad de producto producido por la célula anfitriona
(microorganismo) y la velocidad específica de multiplicación de la
misma, lo que ha conducido a sugerir numerosos modelos.
De acuerdo con esos modelos, algunas veces la
velocidad específica de multiplicación de la célula debe variarse
al menos una vez durante el cultivo para aumentar la producción
[Hakko KogakuKaishi, vol. 70, Nº 5, pp.
395-404 (1992)].
Sin embargo, los estudios realizados por los
presentes inventores revelaron, en primer lugar, que la variación
de la velocidad específica de multiplicación con el fin de optimizar
el cultivo no conduce a un aumento de la producción del producto
objetivo en el grado deseado (Ejemplo 1 de la presente memoria
descriptiva).
Por ello, se demanda un método de cultivo para
aumentar la productividad del producto deseado producido por la
célula anfitriona, que sea capaz de producir eficazmente el producto
sin afectar a la actuación de la célula anfitriona debido a cambios
en la velocidad específica de multiplicación de la célula
anfitriona.
Por lo tanto, uno de los objetivos de la
presente invención es proporcionar un método de producción de una
proteína que comprende controlar, en un sistema de cultivo
discontinuo alimentado, la velocidad específica de multiplicación
\mu de la célula anfitriona mediante el cambio de la velocidad de
alimentación del sustrato dentro del medio, para producir así la
proteína deseada en grandes cantidades y en un tiempo corto.
Otro aspecto de la presente invención trata de
proporcionar un método de cultivo de la célula anfitriona capaz de
producir la proteína deseada de una manera altamente eficaz.
Los presentes inventores han investigado la
relación entre la velocidad de alimentación del sustrato dentro de
un cultivo discontinuo alimentado y la velocidad específica de
multiplicación de la célula anfitriona. Además, se ha investigado
la relación entre la velocidad de alimentación y la cantidad de
producto objetivo producido (proteína), para encontrar un método
para ajustar o controlar la velocidad específica de multiplicación
\mu de la célula anfitriona al valor óptimo (valor objetivo) sin
control de la respuesta. Los autores de la invención han encontrado
que la variación continua de la velocidad de alimentación del
sustrato dentro del medio durante el cultivo, con el fin de cambiar
la velocidad específica de multiplicación \mu de la célula,
conduce a un aumento de la productividad del producto objetivo sin
ejercer una influencia adversa sobre la función de la célula o la
producción del producto objetivo.
Esto es, la presente invención proporciona un
método para producir una proteína deseada que comprende hacer que
se multiplique, mediante cultivo discontinuo alimentado, una célula
anfitriona capaz de expresar la mencionada proteína, en el que la
velocidad específica de multiplicación de la célula anfitriona se
cambia desde la velocidad inicial a una predeterminada mediante el
cambio continuo de la velocidad de adición del sustrato que controla
la multiplicación de la célula anfitriona y en el que el periodo de
tiempo durante el cual se mantiene la velocidad de multiplicación
específica inicial se determina a partir de la relación entre la
velocidad específica de multiplicación y la velocidad específica de
producción. Preferiblemente la célula anfitriona expresa
constitutivamente la proteína deseada o expresa la proteína deseada
cuando la célula anfitriona se cultiva en presencia de un
inductor.
La Fig. 1 muestra los cambios de la velocidad de
adición de metanol a un medio a lo largo del tiempo (Ejemplo 1).
La Fig. 2 muestra los cambios de la velocidad
específica de multiplicación \mu en el sistema a lo largo del
tiempo (la presente invención), que incluye los cambios continuos de
la velocidad de adición de metanol [Figura (a)], y los cambios a lo
largo del tiempo de la velocidad específica de multiplicación \mu
en el sistema (control \ding{192}), que incluye un cambio
instantáneo de la velocidad de adición de metanol [Figure (b)].
La Fig. 3 muestra una comparación de la densidad
de células que se multiplican en el sistema en el que la velocidad
de adición de metanol se cambia de manera continua (la presente
invención, - \Delta -) y en el sistema en el que la velocidad
mencionada se cambia instantáneamente (control \ding{192}, -
\ding{108} -).
En la presente invención, la "expresión
constitutiva de la proteína deseada" significa que la proteína
deseada se expresa constantemente, independientemente de las
condiciones de multiplicación de la célula anfitriona.
En la presente invención, además, "la
expresión sustancialmente constitutiva de la proteína deseada cuando
la célula anfitriona puede proliferar mediante un inductor"
significa que hay alguna relación entre las condiciones de
multiplicación de la célula anfitriona y la expresión de la
proteína, y cuando la sustancia necesaria para la proliferación de
la célula anfitriona y el inductor son iguales, la proliferación de
la célula anfitriona y la expresión de la proteína deseada suceden
simultáneamente.
Tal como se utiliza aquí, "un inductor" se
refiere a una sustancia que inicia la transcripción y la traducción
del gen que codifica la proteína deseada, que se ejemplifica con
metanol, galactosa y sacarosa.
Ejemplos de "célula anfitriona capaz de
expresar la proteína deseada" (de aquí en adelante denominadas
brevemente "células anfitrionas") que serán utilizadas en la
presente invención incluyen células naturales y células mutadas
capaces de producir una proteína extraña (de aquí en adelante
también denominadas de manera apropiada "células
transformadas").
El origen de la célula anfitriona no está
limitado particularmente, y la célula anfitriona se ejemplifica con
microorganismos tales como bacterias (e.g., las que pertenecen al
género Escherichia y las que pertenecen al género
Bacillus) y levaduras (e.g., el género Saccharomyces y
el género Pichia). De manera específica, el género
Escherichia incluye, por ejemplo, Escherichia coli (de
aquí en adelante E. coli) K12DH1, M103, JA221, HB101, X600,
XL-1 Blue y JM109. El género Bacillus
incluye, por ejemplo, Bacillus subtilis MI114 y
207-21. Las levaduras incluyen, por ejemplo,
Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R^{-},
NA87-11A y DKD-5D y Pichia
pastoris. Nótese que el origen no está limitado a los ejemplos
mostrados arriba. De estos, se prefieren las levaduras.
Cuando una levadura se utiliza como célula
anfitriona, puede ser una levadura metilotrófica. Ejemplos de
levaduras metilotróficas adecuadas incluyen, pero no se limitan a,
las levaduras que pertenecen al género Hansenula o el género
Pichia, que son capaces de multiplicarse en metanol [The
Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)]. Se prefieren levaduras
metilotróficas que pertenecen al género Pichia, tales como la
auxotrófica Pichia pastoris GTS115 (NRRL
Y-15851), Pichia pastoris GS190 (NRRL
Y-18014), Pichia pastoris PPF1 (NRRL
Y-18017), y la cepa de Pichia pastoris
salvaje (NRRL Y-11430, NRRL
Y-11431).
Preferiblemente las células anfitrionas
incluyen, por ejemplo, células transformadas capaces de producir una
proteína deseada heteróloga de la célula anfitriona (de aquí en
adelante denominada "proteína heteróloga" de manera
apropiada). Tales células tienen un ADN extraño que codifica la
secuencia de aminoácidos de la proteína heteróloga, y expresan y
producen la proteína heteróloga deseada de acuerdo con los códigos
de ADN mencionados. El método para obtener la célula no está
limitado particularmente. Por ejemplo, la célula puede obtenerse
utilizando la técnica del ADN recombinante mediante transformación
con un plásmido o fago que porta el ADN que codifica la proteína
deseada.
Un ejemplo específico de célula anfitriona en el
sentido de la presente invención es una célula anfitriona que
produce HSA. La preparación de esta célula y la expresión y
producción de HSA utilizando la mencionada célula puede ser llevada
a cabo mediante un método conocido o un método de acuerdo con el
método conocido.
Ejemplos específicos del método incluyen un
método que utiliza un gen de albúmina de suero humano conocido
(Publicación no examinada de las Patentes Japonesas Nº 56684/1983,
90515/1983 y 150517/1983), un método que utiliza un gen nuevo de
albúmina de suero humano (Publicación no examinada de las Patentes
Japonesas Nº 29985/1987 y 98486/1989), un método que utiliza una
secuencia de señales sintéticas (Publicación no examinada de la
Patente Japonesa Nº 240191/1989), un método que utiliza una
secuencia de señales de albúmina de suero (Publicación no examinada
de la Patente Japonesa Nº 167095/1990), un método que comprende
integrar un plásmido recombinante en un cromosoma (Publicación no
examinada de la Patente Japonesa Nº 72889/1991), un método que
comprende la fusión de receptores (Publicación no examinada de la
Patente Japonesa Nº 53877/1991), un método que comprende la
mutación en un medio que contiene metanol, un método que utiliza un
promotor del mutante AOX_{2} (Publicación no examinada de la
Patente Japonesa Nº 299984/1992), un método que comprende la
expresión de HSA por el Bacillus subtilis (Publicación no
examinada de la Patente Japonesa Nº 25133/1987), un método que
comprende la expresión de HSA por una levadura (Publicación no
examinada de las Patentes Japonesas Nº 41487/1985, 39576/1989 y
74493/1989) y un método que comprende la expresión de HSA mediante
una levadura Pichia (Publicación no examinada de Patente la
Japonesa Nº 104290/1990).
La proteína que puede ser la diana del método de
la presente invención no está limitada particularmente, y puede ser
cualquier proteína tal como una proteína constitutiva de la célula
anfitriona natural mencionada anteriormente, la cual se produce de
este modo, y una proteína extraña producida por células
transformadas.
Ejemplos específicos de la proteína constitutiva
de la célula anfitriona incluyen ARN-polimerasa,
actina, y enzimas involucradas en el sistema respiratorio o el
sistema de glicolisis; y ejemplos de la proteína heteróloga
incluyen interferón, uroquinasa, prouroquinasa, t-PA
(activador plasminógeno del tejido), G-CSF (factor
estimulante de colonias de granulocitos), M-CSF
(factor estimulante de colonias de macrófagos), HSA (albúmina de
suero humano), IGF (factor de crecimiento de tipo insulina) e
inhibidor de tripsina urinaria (UTI), con preferencia dada a HSA,
interferón, uroquinasa, prouroquinasa, IGF y UTI, y más preferencia
dada a HSA.
La combinación de la célula anfitriona y la
proteína heteróloga no está sujeta a una limitación particular y
pueden combinarse de la manera conveniente. Algunos ejemplos son la
combinación de Escherichia coli e interferón, la de
Saccharomyces cerevisiae y prouroquinasa, la de
Saccharomyces cerevisiae y HSA, y la de Pichia
pastoris y HSA.
La célula anfitriona (célula transformada) puede
ser cultivada mediante cultivo discontinuo alimentado en un medio
que contiene diversas fuentes de energía de carbono y/o nutrientes.
Esto es, una célula anfitriona se cultiva durante un cierto periodo
en un medio (medio primario) que contiene diversas fuentes de
energía de carbono y/o nutrientes adecuados para su proliferación
y, después de un cierto punto en el tiempo, el sustrato que
controla la proliferación de la célula anfitriona se añade al
mencionado medio, y el cultivo se completa sin retirar la proteína
objetivo del sistema (Publicación no examinada de la Patente
Japonesa Nº 83595/1991).
El "sustrato que controla la proliferación de
la célula anfitriona" en la presente invención significa un
sustrato adecuado para la proliferación de la célula anfitriona, que
puede ser preferiblemente una fuente de energía de carbono.
Como ejemplos de sustratos se incluyen metanol,
glicerina, sorbitol, glucosa, fructosa, galactosa y sacarosa, que
pueden ser utilizados a solas o en combinación.
Como ejemplos de sustratos preferidos para ser
utilizados cuando se emplea Pichia pastoris como célula
anfitriona se incluyen metanol, glicerina, y combinaciones de ellos.
Como ejemplos de sustratos preferidos para ser utilizados cuando se
emplea Saccharomyces cerevisiae como célula anfitriona se
incluyen galactosa y sacarosa, y como ejemplos de sustratos para
ser utilizados cuando se emplea Escherichia coli como célula
anfitriona se incluye lactosa.
La forma del sustrato que se añade al medio
puede ser la del propio sustrato, o la de una composición que
incluya otros componentes tales como vitaminas y sales inorgánicas.
Cuando se añade, el sustrato puede ser sólido, polvo, granulado,
líquido o en cualquier otra forma, dando preferencia a la de
líquido, que puede disolverse rápida y uniformemente en el
medio.
Las diversas fuentes de energía de carbono y/o
nutrientes que serán utilizados para el cultivo primario de las
células anfitrionas son fuentes de energía de carbono y/o nutrientes
conocidos que son adecuados para el cultivo de la célula
anfitriona. Ejemplos de fuentes de energía de carbono incluyen
glucosa y glicerina, y ejemplos de nutrientes incluyen fuentes de
nitrógeno (e.g., extracto de levadura, bactopeptona, casaminoácidos,
amoniaco, fosfato amónico y acetato amónico), fuentes de fosfato
(e.g., ácido fosfórico y fosfato amónico), fuentes inorgánicas y
otros elementos en trazas (e.g., hierro, zinc, cobre, magnesio,
manganeso, calcio, molibdeno y cobalto), y vitaminas (e.g.,
biotina, ácido pantoténico y tiamina).
La "variación continua de la velocidad de
adición del sustrato" en la presente invención significa cambiar
continuamente la velocidad de adición del sustrato al tanque de
cultivo sin interrupción. En consecuencia, la velocidad específica
de multiplicación \mu de la célula anfitriona cambia moderadamente
desde la velocidad inicial hasta una velocidad predeterminada.
La "velocidad específica de multiplicación
\mu de la célula anfitriona" en la presente invención significa
la cantidad de proliferación de célula anfitriona por unidad de
tiempo (h) y cantidad de célula unidad, que se expresa generalmente
mediante la fórmula siguiente:
\mu =
\frac{1}{XV} \ x \ \frac{\Delta XV}{\Delta
t}
donde X es la densidad de células
(g/L), V es la cantidad de medio (L), t es el tiempo de cultivo (h),
y \DeltaXV y \Deltat son los incrementos de XV y t,
respectivamente.
Cambiar la velocidad específica de
multiplicación \mu de la célula anfitriona desde la velocidad
inicial hasta una velocidad predeterminada en la presente invención
significa cambiar la velocidad específica de multiplicación de la
célula anfitriona a un valor diferente, predeterminado durante el
cultivo discontinuo alimentado. La velocidad específica de
multiplicación inicial preferible, la velocidad específica de
multiplicación predeterminada y el momento del cambio (i.e., el
periodo de tiempo durante el cual la velocidad específica de
multiplicación inicial se mantiene) puede determinarse a partir de
la relación entre la velocidad específica de multiplicación \mu y
la velocidad de producción específica \rho [Hakko
KogakuKaishi, vol. 70, Nº 5, pp. 395-404
(1992)].
La velocidad de producción específica \rho
aquí significa el incremento de la cantidad de producción de la
proteína por unidad de tiempo (h) y cantidad unitaria de célula, que
se expresa generalmente mediante la siguiente fórmula:
\rho =
\frac{1}{XV} \ x \ \frac{\Delta PV}{\Delta
t}
donde P es la cantidad de proteína
producida (g/L), X es la densidad de células (g/L), V es la cantidad
de medio (L), t es el tiempo de cultivo (h), y \DeltaPV y
\Deltat son los incrementos de PV y t,
respectivamente.
La velocidad específica de multiplicación puede
cambiarse más de una vez.
La temperatura de cultivo que debe ser utilizada
en la presente invención es preferiblemente adecuada para la
proliferación de la célula anfitriona y la producción de la proteína
deseada, la cual varía dependiendo de la célula anfitriona que se
cultiva. Cuando la célula anfitriona es Escherichia coli, la
temperatura es 20-46ºC, preferiblemente
36-38ºC; cuando es una levadura, la temperatura es
alrededor de 20-35ºC, preferiblemente alrededor de
23-30ºC; y cuando es Bacillus subtilis, la
temperatura es 28-40ºC, preferiblemente
36-38ºC.
El pH del medio se puede ajustar a un valor
adecuado para la proliferación de la célula anfitriona y la
producción de la proteína deseada, el cual varía dependiendo de la
célula anfitriona que se cultiva. El contenido de oxígeno disuelto
de la cuba de cultivo se selecciona apropiadamente dentro del
intervalo de aproximadamente 10-70% de la
saturación.
La presente invención se describe a continuación
con más detalle haciendo referencia a los Ejemplos y los Ejemplos de
Referencia, que no deben interpretarse como limitativos.
El HSA se produjo en un sistema de cultivo que
comprende un cambio de la velocidad específica de multiplicación
\mu de la cepa UHG42-3 de la levadura
Pichia, capaz de expresar y producir HSA desde la velocidad
específica de multiplicación inicial \mu' = 0,025 hasta una
velocidad específica de multiplicación predeterminada \mu'' =
0,002, y estando descrita la preparación de la cepa en una
Publicación no examinada de la Patente Japonesa Nº 29984/1992. En
concreto, el cultivo comprendió las siguientes etapas:
La cepa se precultivó en un caldo de YPD (2%
bactopeptona, 1% extracto de levadura, 2% glucosa). En concreto, se
inoculó 1 ml de una suspensión de células (OD_{540} = 10) de
levadura Pichia UHG42-3 almacenada en
congelador en 20% de glicerol en un matraz Erlenmeyer de 300 ml con
deflectores que contenía 50 ml del caldo de YPD, y se le sometió a
cultivo con agitación a 30ºC durante 24 horas.
El caldo se sometió a un cultivo discontinuo
alimentado durante un tiempo predeterminado en un medio (medio
primario) con la composición mostrada en la Tabla 1, y entonces fue
cultivado con adiciones sucesivas de metanol a la velocidad de
alimentación mostrada en la Fig. 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Composición de la solución
YTM*
Para ser preciso, el líquido de precultivo (34
ml) se inoculó en una jarra de fermentación de 10 L (Biomaster tipo
D, 10 L) que contenía 1,7 L de un medio cargado inicialmente (medio
primario) y se sometió a cultivo con agitación y aereación. La
temperatura del cultivo fue 30ºC. La velocidad de agitación se
mantuvo constante a 900 rpm durante el cultivo discontinuo
alimentado. El pH se ajustó constantemente a 5,85.
Para eliminar las espumas, se añadió la cantidad
necesaria de un agente desespumante.
Cuando se consumió completamente el glicerol en
el medio primario (24 horas de cultivo) durante el cultivo
discontinuo alimentado, se inició la adición de metanol.
La velocidad de adición de metanol se controló
de acuerdo con las siguientes fórmulas en las cuales t significa el
periodo de tiempo (h) después del inicio de la adición de
metanol:
cuando 0 \leq t < 72, F(t) = 3,712 x
exp (0,025 x t) (g/h)
cuando 72 \leq t < 92, F(t) = 22,456
x exp [-0,025 x (t-72)]
cuando 92 \leq t, F(t) = 13,62 x exp
[0,002 x (t-92)].
Los cambios de la velocidad de adición de
metanol a lo largo del tiempo se muestran en la Fig. 1, en donde se
muestra con línea de trazo continuo desde alrededor de la hora 24
hasta la hora 96 de cultivo; se muestra con una línea fina de trazo
discontinuo desde alrededor de la hora 96 hasta la hora 116 de
cultivo; y se muestra con una línea de trazo continuo desde
alrededor de la hora 116 hasta la hora 360.
\newpage
Durante el cultivo, desde alrededor de la hora
24 (tiempo de inicio de adición de metanol) hasta alrededor de la
hora 96, se añadió metanol para conseguir una velocidad específica
de multiplicación inicial \mu' de la levadura Pichia de
0,025, y la velocidad de adición de metanol se disminuyó una vez
moderadamente, tal como muestra la línea fina de trazo discontinuo
en la figura, y se añadió metanol para que en todo momento la
velocidad específica de multiplicación predeterminada \mu'' de la
levadura Pichia fuese de 0,002.
Como experimentos control se realizaron
\ding{192} un cultivo en un sistema en el que \mu se cambió
desde 0,025 hasta 0,002 mediante cambios instantáneos en la
velocidad de adición y \ding{193} un cultivo en un sistema sin
cambios en \mu.
Para cambiar \mu en \ding{192}, la velocidad
de adición de metanol en el sistema que comprende cambios
instantáneos en la velocidad de adición de metanol se controló de
acuerdo con las fórmulas siguientes, en las que t significa el
periodo de tiempo (h) después del inicio de la adición de metanol,
la cual se expresa mediante una línea de trazo continuo y una línea
gruesa de trazo continuo en la Fig. 1:
cuando 0 \leq t < 72, F(t) = 3,712 x
exp (0,025 x t) (g/h)
cuando 72 \leq t, F(t) = 13,086 x exp
[0,002 x (t-72)].
Durante el cultivo, desde alrededor de la hora
24 (tiempo de inicio de la adición de metanol) hasta alrededor de
la hora 96, se añadió metanol para que la velocidad específica de
multiplicación \mu' de la levadura Pichia fuese de 0,025,
y para cambiar a la velocidad específica de multiplicación \mu''
de la levadura Pichia a 0,002 se cambió instantáneamente la
velocidad de adición de metanol para ajustar \mu al valor de
0,002.
La velocidad de adición de metanol en el sistema
\ding{193} sin cambios en \mu se controló de acuerdo con las
fórmulas siguientes donde t significa el periodo de tiempo (h)
después del inicio de la adición de metanol. El control de acuerdo
con las siguientes fórmulas es el método de cultivo adecuado en el
sistema sin cambio de \mu. Esto es, la alimentación se inició
para que \mu fuese 0,015, y cuando la concentración de oxígeno
disuelto (concentración de oxígeno disuelto en el líquido de
cultivo) disminuyó por debajo de un cierto nivel, se inició la
alimentación a una velocidad constante. Los cambios de la velocidad
de adición de metanol a lo largo del tiempo en este sistema están
representados mediante una línea fina de trazo discontinuo en la
Fig. 1:
cuando 0 \leq t < 127, F(t) = 2,176
x exp (0,015 x t) + 1,632 (g/h)
cuando 127 \leq t, F(t) = 16,253.
La Fig. 2 muestra una comparación de los cambios
de \mu en el sistema que comprende un cambio continuo en la
velocidad de adición de metanol [la presente invención, Fig.
2(a)] y los cambios de \mu en el sistema que comprende
cambios instantáneos en la velocidad de adición [control
\ding{192}, Fig. 2(b)].
Los resultados de cada cultivo se muestran en la
Fig. 3 como cambios en la densidad de células en función del tiempo
(la presente invención y el control \ding{192}) y la Tabla 2
muestra la relación de la producción de HSA al completar el cultivo
(la presente invención, el control \ding{192} y el control
\ding{193}).
La comparación de la cantidad de HSA producido
después de 360 horas de cultivo muestra que, si bien el cultivo dio
mejores resultados cuando se cambió \mu (la presente invención,
control \ding{192}) que cuando no (control \ding{193}), la
cantidad de HSA producida fue mayor (156%) en el sistema que
comprende un cambio continuo en la velocidad de alimentación (la
presente invención) que en el caso en que la velocidad de
alimentación se cambió instantáneamente (control \ding{192},
107%), por lo que quedó claro que el cambio continuo de la velocidad
de alimentación del sustrato (metanol) en un intento para cambiar
\mu condujo a una mayor cantidad de la proteína deseada (HSA)
producida.
La cepa se cultivó de la misma manera que en el
Ejemplo 1, excepto que se utilizó el medio de alimentación mostrado
en la Tabla 3 en vez de metanol en el cultivo principal.
Los resultados fueron similares a los obtenidos
en el Ejemplo 1.
Ejemplo Referencia
1
Se tomó una muestra de líquido de cultivo
después de un tiempo de cultivo opcional, se diluyó con agua
destilada para que el valor OD_{540} después de su determinación
estuviese por debajo de 0,3, y se sometió a la determinación de su
absorbancia a 540 nm utilizando un espectrofotómetro (UV tipo 2200,
Shimazu Corporation). El valor obtenido se multiplicó por la
relación de dilución y se utilizó como la absorbancia del líquido de
cultivo. Utilizando el valor de OD_{540}/5,6 como un índice, se
calculó la densidad de células secas a partir de la absorbancia
obtenida.
Ejemplo Referencia
2
Se tomó una muestra de líquido de cultivo
después de un tiempo de cultivo opcional y se centrifugó a 15.000
rpm durante 5 minutos. El sobrenadante obtenido se filtró a través
de Ultrafree C3HV para conseguir una solución clara, que fue
sometida a una filtración en un gel mediante HPLC bajo las
condiciones siguientes.
Columna: TSKgel G3000SW_{x1}
Fase Móvil: NaCl 0,3 M, fosfato sódico 50 mM,
0,1% de NaN_{3}, pH 6,5
Caudal: 1,0 ml/min
Inyección: 50 \mul
Detección: A_{280}, A_{350} (dos longitudes
de onda).
Ejemplo Referencia
3
Se tomó una muestra de líquido de cultivo
después de un tiempo de cultivo opcional y se centrifugó a 15.000
rpm durante 5 minutos. El sobrenadante obtenido se filtró a través
de un Ultrafree C3HV para obtener una solución clara, que fue
sometida a un análisis cuantitativo por HPLC bajo las siguientes
condiciones.
Columna: Sugar-pak Ca (fabricada
por Waters)
Fase Móvil: 0,02% NaN_{3}
Temperatura de la columna: 80ºC
Inyección: 28 \mul
Detección: refractrómetro diferencial.
De acuerdo con el modo de cambio de la velocidad
de adición del sustrato al medio de la presente invención, se
pueden realizar patrones óptimos de velocidad específica de
multiplicación \mu y velocidad específica de producción \rho
para optimizar el sistema de cultivo discontinuo alimentado. Como
consecuencia de la realización, ha sido posible llevar a cabo un
cultivo de alta densidad de la célula anfitriona mediante un cultivo
discontinuo alimentado, y puede producirse la proteína deseada de
manera eficaz en un tiempo corto.
Por lo tanto, el método de la presente invención
es extremadamente útil como un método de producción industrial de
proteínas tales como la HSA, IGF, prouroquinasa y UTI, que tienen
altos valores comerciales.
Claims (12)
1. Un método para producir una proteína deseada,
que comprende hacer que prolifere, mediante un cultivo discontinuo
alimentado, una célula anfitriona capaz de expresar la mencionada
proteína, en el que la velocidad específica de multiplicación de la
célula anfitriona se cambia desde la velocidad inicial hasta una
predeterminada, mediante cambios continuos de la velocidad de
adición de un sustrato, que controla el crecimiento de la célula
anfitriona y en el que el periodo de tiempo durante el cual se
mantiene la velocidad de multiplicación específica inicial se
determina a partir de la relación entre la velocidad específica de
multiplicación y la velocidad específica de producción.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que la célula anfitriona expresa constitutivamente la proteína
deseada.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que la célula anfitriona expresa la proteína deseada cuando
la célula anfitriona se multiplica en presencia de un inductor.
4. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que la célula anfitriona es
derivada de una levadura.
5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4,
en el que la célula anfitriona es derivada de una levadura
metilotrófica.
6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5,
en el que la célula anfitriona es derivada de la levadura
Pichia.
7. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que el sustrato que
controla el crecimiento de la célula anfitriona es una fuente de
energía de carbono.
8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7,
en el que la fuente de energía de carbono se selecciona de entre
metanol, glicerina, sorbitol, glucosa, fructosa, galactosa y
sacarosa.
9. Un método de acuerdo con la reivindicación 6,
en el que la célula anfitriona es derivada de una levadura
Pichia, y el sustrato que controla la multiplicación de la
célula anfitriona se selecciona de metanol, glicerina y
combinaciones de ambos.
10. Un método de acuerdo con la reivindicación
4, en el que la célula anfitriona es derivada del género
Saccharomyces, y el sustrato que controla el crecimiento de
la célula anfitriona se selecciona de galactosa, sacarosa y
combinaciones de ambos.
11. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína deseada es
heteróloga a la célula anfitriona.
12. Un método de acuerdo con la reivindicación
11, en el que la proteína heteróloga es albúmina de suero
humano.
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