ES2264181T3 - Procedimiento para la produccion de proteinas. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DE PREPARACION DE UNA PROTEINA ENDOGENA O HETEROLOGA, MEDIANTE CULTIVO DE UNA CELULA EUCARIOTICA TRANSFORMADA O NO TRANSFORMADA, UTILIZANDO UN SUSTRATO REPRESOR COMO FUENTE DE CARBONO.

Description

Procedimiento para la producción de proteínas.

Las levaduras metilotróficas se han investigado durante los últimos años como sistemas idóneos de expresión de proteínas heterólogas. Se han descrito en particular la Hansenula polymorpha y la Pichia pastoris como organismos hospedantes fáciles de manipular para una gran variedad de genes ajenos (para una visión de conjunto, véase
Gelissen & Melber 1996 y Cregg & Madden 1988). Dado que se ha constatado que los promotores de las enzimas que intervienen en el metabolismo del metanol son muy fuertes, generalmente se emplean para el control de la expresión heteróloga de proteínas (véase EP-0 173 378, EP-0 299 108, EP-0 183 071).

Se sabe que las fuentes de carbono empleadas para cultivar estos organismos tienen una influencia enorme en la regulación del promotor. Gelissen y col. (1994) describen que las enzimas claves para el metabolismo del metanol en la Hansenula polymorpha están presentes en grandes cantidades durante su cultivo en metanol. Se ha observado también que pueden detectarse niveles significativos de las enzimas metanol oxidasa (MOX) y formiato-deshidrogenasa (FMDH) en células cultivadas en glicerina, pero que están ausentes cuando el cultivo se realiza en glucosa como fuente de carbono (véase p.ej. EP-0 299 108). Basándose en estos datos, se concluye que estas enzimas están inducidas por el metanol. La expresión de la MOX y de la FMDH durante el cultivo en glicerina se explica por la desrepresión de los promotores. En los cultivos de la Hansenula polymorpha y la Kloeckera sp. 2201 en glucosa, limitados quimiostáticamente, solamente se produce la FMDH en velocidades de crecimiento muy bajas, del orden de 0,1 h^{-1}, en cantidades muy pequeñas (Egli y col. 1980). Por lo tanto, hasta el presente no se han utilizado fuentes de carbono represivas para la expresión heteróloga de proteínas con levaduras metilotróficas. La Hansenula polymorpha se cultiva para la producción de una gran variedad de proteínas farmacéuticas en procesos por lotes, ya sea en el modo de fuente de carbono única con glicerina, ya sea en modo de fuente de carbono doble, con glicerina y metanol adicional (Gelissen & Melber 1996). La estrategia del proceso habitual se describe con mayor detalle en Weydemann y col. (1995) para la producción de la hirudina. Chen y col. (1996) describen un proceso para la producción de la trombomodulina con una cepa de Pichia pastoris, empleando también glicerina como fuente de carbono no represiva.

Sin embargo, debido al precio elevado de la glicerina, este proceso hasta el presente no es idóneo para la producción de proteínas de bajo coste, como son las enzimas para alimentación o las industriales.

Por consiguiente, un objeto de la presente invención consiste en superar tales obstáculos y proporcionar un proceso para la obtención de proteínas heterólogas mediante cultivo de una célula eucariota transformada con una secuencia de DNA que contiene una secuencia de DNA que codifica a la proteína heteróloga, dicho proceso se caracteriza porque la célula se transforma con una secuencia de DNA que contiene el promotor de la formiato-deshidrogenasa (FMD o FMDH) o el promotor de la metanol-oxidasa (MOX); porque un sustrato represivo constituye del 90 al 100% de la fuente de carbono y dicho sustrato es un compuesto que contiene azúcar; porque la fuente de carbono es limitada durante la fase de alimentación y porque no tiene lugar una limitación de oxígeno continua durante todo el cultivo.

En una forma preferida de ejecución de la invención, el proceso se caracteriza además porque la proteína es una enzima, en especial una enzima de alimentación, p.ej. una fitasa, celulosa, xilanasa o una enzima industrial, p.ej. una amilasa, una proteasa, una invertasa, una lipasa, una catalasa, una celulosa, una glucosa-oxidasa, una alcohol-oxidasa, una pectinasa, una naraginasa, una colagenasa, una peroxidasa o una pululanasa.

En otra forma de ejecución de la invención, el proceso se caracteriza además porque la célula es una levadura metilotrófica, con preferencia Hansenula, Pichia, Candida o Torulopsis, p.ej. la Hansenula polymorpha o la Pichia pastoris.

El sustrato es un azúcar del tipo mono-, di- oligo- o polisacárido, p.ej. glucosa, fructosa, sucrosa, maltosa, almidón, glucógeno, celulosa o dextrosa o un compuesto que contiene azúcar, p.ej. melazas, jarabes de glucosa o jarabes de fructosa.

Precisamente en otra forma de ejecución de la invención, el proceso se efectúa por lotes con alimentación repetida. Tal proceso se caracteriza además porque el intervalo de velocidad de alimentación está limitado por las características metabólicas de los microorganismos y la eficacia de la transferencia de masa del biorreactor, en particular la del oxígeno. Las velocidades de alimentación se mantienen con preferencia entre un mínimo que permita la producción y un máximo que evite la limitación de oxígeno en el cultivo.

La célula eucariota se transforma con una secuencia de DNA o un vector que contenga una secuencia de DNA que codifica a tal proteína heteróloga, p.ej. la fitasa en el caso de los 5 ejemplos de la presente invención. Los expertos en biología molecular ya están familiarizados con los métodos aplicados para obtener células eucariotas transformadas, p.ej. para los métodos específicos del caso presente véase el documento EP-684 313 o la solicitud de patente europea nº 97810175.6.

"Cultivo" en el contexto de la presente invención tiene el significado habitual, con el que los expertos están ya familiarizados. Las condiciones de cultivo específicas dependerán de las células empleadas y de las proteínas a producir así como de sus sistemas de expresión. Los expertos en la producción de proteínas por fermentación están ya familiarizados con este tipo de condiciones. Se da por supuesto además que para la práctica de la presente invención durante la fase de partida corta, a saber, la fase de cultivo de las células, puede utilizarse una fuente de carbono represiva o no represiva, p.ej. glucosa y glicerina, respectivamente. Durante la fase de partida alimentada, que es la fase de producción de la proteína deseada, el proceso de cultivo se lleva a cabo de la manera descrita en la presente
invención.

Las levaduras metilotróficas de interés para la práctica de la presente invención pueden tomarse además p.ej. del documento EP-173 378, páginas 37 y 38.

Ejemplos Ejemplo 1 Producción de fitasa de A. fumigatus con Hansenula polymorpha empleando como fuente principal de carbono la glicerina o la glucosa

Para comparar la producción de la fitasa empleando glicerina o glucosa como sustratos de alimentación se llevan a cabo dos ensayos de partida alimentada en reactores de 15 l con una cepa de Hansenula polymorpha que contiene unas 80 copias del gen de fitasa de tipo salvaje del Aspergillus fumigatus (Pasamontes y col., 1997) bajo el control del promotor de FMD.

Se inician los cultivos en matraz agitado inoculando 1 ml de una suspensión de células patrón en glicerina, mantenida a -70ºC en 50 ml de un medio que tiene la composición siguiente: 30,0 g/l de glicerina; 2,5 g/l de KH_{2}PO_{4}; 5 g/l de NH_{4}H_{2}PO_{4}; 2,25 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O; 2,5 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}; 1,15 g/l de KCl; 0,25 g/l de NaCl; 0,375 g/l de CaCl_{2}\cdot2H_{2}O; 0,25 mg/l de H_{3}BO_{3}; 0,05 g/l de (NH_{4})_{2}Fe(SO_{4})_{2}\cdot6H_{2}O; 4 mg/l de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O; 15 mg/l de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O; 20 mg/l de MnSO_{4}\cdotH_{2}O; 0,05 g/l de EDTA-Na; 0,5 mg/l de NiSO_{4}\cdot6H_{2}O; 0,5 mg/l de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O; 0,5 mg/l de Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O; 0,5 mg/l de KI; 0,05 mg/l de tiamina\cdotHCl; 0,15 mg/l de biotina. Se cultivan a 30ºC y 200 rpm durante 24 h, se transfieren 30 ml a un segundo matraz agitado con 300 ml del mismo medio, se cultivan a 30ºC y 200 rpm durante 24 h más.

Se utilizan 300 ml de este cultivo de siembra como inóculo para un fermentador de 15 l con 5 l de medio inicial, de la composición siguiente: 10,0 g/l de glicerina; 5,0 g/l de KH_{2}PO_{4}; 10 g/l de NH_{4}H_{2}PO_{4}; 4,5 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O; 5,0 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}; 2,3 g/l de KCl; 0,5 g/l de NaCl; 0,2 ml/l de antiespumante; 0,75 g/l de CaCl_{2}\cdot2H_{2}O; 0,5 mg/l de H_{3}BO_{3}; 0,1 g/l de (NH_{4})_{2}Fe(SO_{4})_{2}\cdot6H_{2}O; 8 mg/l de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O; 30 mg/l de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O; 40 mg/l de MnSO_{4}\cdotH_{2}O; 0,1 g/l de EDTA-Na; 1,0 mg/l de NiSO_{4}\cdot6H_{2}O; 1,0 mg/l de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O; 1,0 mg/l de Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O; 1,0 mg/l de KI; 0,1 mg/l de tiamina\cdotHCl; 0,3 mg/l de biotina. Durante todo el proceso, la temperatura, el pH y la aireación se mantienen constantes en 30ºC, pH 4,6 y 5 l/h, respectivamente. El pH se controla con la adición de NH_{3} del 25%. Se mantiene la saturación de oxígeno en un valor mínimo del 20% en el reactor, controlando la velocidad del agitador y la presión (0-0,5 bar). El consumo total de la glicerina inicial en el medio conduce a un incremento rápido del valor de pO_{2} e indica el final de la fase de la partida. En este momento se inicia la alimentación de 700 g/l de soluciones, ya sea de glicerina, ya sea de glucosa. Se aplica una velocidad de alimentación inicial de 25 g de solución por hora durante las primera 18 h y después se aumenta la velocidad a 50 g/h. El volumen de cultivo aumenta, debido a la alimentación de unos 6 litros de solución de fuente de carbono hasta los 11 litros del final del cultivo.

En el caso de realizarse el cultivo con glucosa, el 98% de la fuente de carbono total que se metaboliza durante el proceso es glucosa y el 2% restante corresponde a la glicerina empleada durante la fase de partida. Durante todo el proceso no se cuantifica glucosa en el líquido sobrenadante.

Después de un tiempo de proceso de 165 h se cuantifican 5,86 g/l de fitasa en las muestras tomadas del cultivo con glicerina, empleando el método de Bradford para la determinación de la proteína. En el caso del cultivo con glucosa, las muestras tomadas 160 h de proceso contienen 7,12 g/l de fitasa, determinada por el mismo método. Estos resultados confirman que el efecto represivo de la glucosa puede evitarse con una estrategia de alimentación que asegure una limitación estricta del carbono durante la fase de alimentación. En la figura 1 se representa el curso temporal comparativo de los cultivos realizados con glicerina y con glucosa como principal fuentes de
carbono.

Ejemplo 2 Producción de fitasa de A. fumigatus con Hansenula polymorpha empleando sucrosa como principal fuente de carbono

En este ejemplo, el cultivo se realiza en un biorreactor de 15 l, empleando la misma cepa que en el ejemplo 1. Las condiciones del cultivo de siembra y del cultivo principal son exactamente las mismas que en el ejemplo 1, excepto la solución de alimentación que contiene ahora 700 g/l de sucrosa. Durante el proceso, las concentraciones de sucrosa en las muestras de líquido sobrenadante nunca son superiores a 1 g/l, mientras que en dichas muestras no se detecta ni glucosa ni fructosa. Después de un período de cultivo de 167 h, en el medio de cultivo se hallan 5,27 g/l de fitasa según método de Bradford de determinación de proteínas.

Ejemplo 3 Producción de fitasa de A. fumigatus con Hansenula polymorpha empleando glucosa como principal fuente de carbono

En este ejemplo, el cultivo se realiza en un biorreactor de 15 l, empleando la misma cepa que en los ejemplos 1 y 2. El cultivo de siembra se obtiene en las mismas condiciones que en los ejemplo 1 y 2. El cultivo principal se inicial con 5 l del medio inicial en el biorreactor, que tiene la misma composición que se ha descrito en el ejemplo 1, excepto los 10 g/l de glicerina iniciales se sustituyen por 10 g/l de glucosa. La solución de alimentación contiene 700 g/l de glucosa y se añade al cultivo exactamente en las mismas condiciones que se han descrito en el ejemplo 1. Después de un período de cultivo de 160 h, en el medio se hallan 7,21 g/l de fitasa según método de determinación de proteínas de Bradford.

Ejemplo 4 Producción de fitasa de A. fumigatus con Hansenula polymorpha en un modo de partida de alimentación repetida

En este ensayo se realizan cultivos por partida de alimentación repetida en un reactor de 15 l, en el que se utiliza la misma cepa de Hansenula polymorpha que en los ejemplos 1, 2 y 3. Para el primer cultivo se obtiene un cultivo de siembra inoculando 1 ml de una suspensión celular patrón en glicerina, mantenida a -70ºC, en 300 ml de medio de la composición siguiente: 30,0 g/l de glicerina; 13,3 g/l de NH_{4}H_{2}PO_{4}; 3,0 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O; 6,7 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}; 3,3 g/l de KCl; 0,33 g/l de NaCl; 1,0 g/l de CaCl_{2}\cdot2H_{2}O; 0,67 mg/l de H_{3}BO_{3}; 0,067 g/l de (NH_{4})_{2}Fe(SO_{4})_{2}\cdot6H_{2}O; 5,3 mg/l de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O; 20 mg/l de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O; 26 mg/l de MnSO_{4}\cdotH_{2}O; 0,067 g/l de EDTA-Na; 0,67 mg/l de NiSO_{4}\cdot6H_{2}O; 0,67 mg/l de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O; 0,67 mg/l de Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O; 0,67 mg/l de KI; 0,13 mg/l de tiamina\cdotHCl; 0,4 mg/l de biotina. El cultivo en el matraz agitado se realiza 30ºC y 200 rpm durante 30 h, se emplean 300 ml como inóculo para el cultivo principal en un biorreactor de 15 l que contiene: 150,0 g de glicerina; 100,0 g de NH_{4}H_{2}PO_{4}; 22,5 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O; 50,0 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}; 25 g de KCl; 2,5 g de NaCl; 7,5 g de CaCl_{2}\cdot2H_{2}O; 5 mg de H_{3}BO_{3}; 0,5 g de (NH_{4})_{2}Fe(SO_{4})_{2}\cdot6H_{2}O; 40 mg de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O; 150 mg de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O; 40 mg de MnSO_{4}\cdotH_{2}O; 0,5 g de EDTA-Na; 5,0 mg de NiSO_{4}\cdot6H_{2}O; 5,0 mg de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O; 5,0 mg de Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O; 5,0 mg de KI; 1 g de tiamina\cdotHCl; 3 mg de biotina, para un volumen inicial de 7,5 l de medio.

Durante todo el proceso, la temperatura, el pH y la aireación se mantienen constante en 30ºC, 5,0 y 9,0 l/h, respectivamente. El pH se controla con la adición de NH_{3} del 25%. Se mantiene la saturación de oxígeno en un valor mínimo del 20% en el reactor, controlando la velocidad del agitador y la presión (0-0,5 bar). El consumo total de la glicerina inicial en el medio conduce a un incremento rápido del valor de pO_{2} e indica el final de la fase de la partida. En este momento se inicia la alimentación con una solución que contiene un 40% de glucosa y un 60% de glicerina hasta una concentración total de fuente de carbono de 700 g/l. La velocidad de alimentación controlada es de 45 g/l durante toda la fase de alimentación.

Para los cultivos por partida de alimentación repetida que siguen se mantienen de 0,5 a 1 l de caldo de cultivo de la partida anterior en el biorreactor en el momento final del proceso, que se emplean como inóculo para la partida siguiente. Al biorreactor se le añade el nuevo medio estéril que contiene la misma cantidad total de sales, descrita anteriormente, pero sin fuente de carbono, hasta completar un volumen inicial predefinido. Las soluciones de alimentación contienen un total de 700 g/l de fuente de carbono. A continuación se indican las diferentes proporciones de glicerina y de glucosa que se emplean, así como el volumen inicial.

2º ciclo: 66% de glucosa, 34% de glicerina, volumen inicial: 7,5 l

3er ciclo: 90% de glucosa, 10% de glicerina, volumen inicial: 7,5 l

4º y 5º ciclos: 100% de glucosa, volumen inicial: 5 l

Las concentraciones conseguidas de fitasa al término de cada ciclo son: 4,7 g/l, 3,9 g/l, 4,3 g/l, 6,0 g/l y 4,4 g/l para los ciclos de 1º a 5º, respectivamente, tal como se representa en la figura 2. En el 4º ciclo se aplica un modo de alimentación extensa, más lento, al término de la fase de cultivo, lo cual conduce a una concentración más elevada de producto.

Ejemplo 5 Producción de fitasa de consenso con Hansenula polymorpha

En este ejemplo se cultiva una cepa de Hansenula polymorpha que contiene unas 40 copias de un gen de fitasa de consenso (solicitud de patente europea nº 97810175.6) bajo el control del promotor FMD, en un biorreactor de 15 l, con el mismo medio y las mismas condiciones que se han descrito en el ejemplo, utilizando una solución de alimentación que contiene 700 g/l de glucosa para la fase de partida de alimentación. Después de un período de cultivo de 165 h, la concentración de fitasa en el medio es de 13,1 g/l según método de determinación de Bradford.

Bibliografía técnica

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Claims (6)

1. Un proceso para la obtención de una proteína heteróloga por cultivo de una célula eucariota, transformada con una secuencia de DNA que contiene una secuencia de DNA que codifica a la proteína heteróloga, dicho proceso se caracteriza porque:

- la célula se transforma con una secuencia de DNA que contiene el promotor de la formiato-deshidrogenasa (FMD o FMDH) o el promotor de la metanol-oxidasa (MOX);

- porque un sustrato represivo constituye del 90 al 100% de la fuente de carbono y dicho sustrato es un compuesto que contiene azúcar;

- porque la fuente de carbono es limitada durante la fase de alimentación y

- porque no tiene lugar una limitación de oxígeno continua durante todo el cultivo.

2. El proceso de la reivindicación 1, en el que la proteína es una enzima, en especial una enzima de alimentación, en particular una fitasa, celulasa o xilanasa o una enzima industrial, en particular una amilasa, una proteasa, una invertasa, una lipasa, una catalasa, una celulasa, una glucosa-oxidasa, una alcohol-oxidasa, una pectinasa, una naraginasa, una colagenasa, una peroxidasa o una pululanasa.

3. El proceso reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la célula eucariota es una levadura metilotrófica, elegida entre el grupo formado por la Hansenula, en particular la Hansenula polymorpha, la Pichia, en particular la Pichia pastoris, la Candida y la Torulopsis.

4. El proceso reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, en el que el sustrato represivo es la fuente única de carbono.

5. El proceso reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, en el que el sustrato represivo se elige entre el grupo formado por los mono-, di-, oligo- y polisacáridos, la glucosa, la fructosa, la sucrosa, la maltosa, el almidón, el glucógeno, la celulosa y la dextrosa, las melazas y los jarabes de glucosa y los jarabes de fructosa.

6. El proceso reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, dicho proceso se efectúa en forma de partidas de alimentación repetida.