ES2194016T5 - Factores biologicos y celulas germinales neurales. - Google Patents
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Abstract
SE DESCRIBEN METODOS PARA AUMENTAR EL NUMERO DE CELULAS ALARGADAS NEURONALES QUE DIFERENCIAN ENTRE ASTROCITOS, OLIGODENDROCITOS O NEURONAS. LOS METODOS COMPRENDEN LA PROLIFERACION DE CELULAS ALARGADAS NEURONALES AISLADAS EN UN MEDIO DE CULTIVO QUE TIENE UN PRIMER FACTOR DE CRECIMIENTO PARA PRODUCIR CELULAS PRECURSORAS. LAS CELULAS PRECURSORAS SE DIFERENCIAN ENTONCES EN ASTROCITOS, OLIGODENDROCITOS U HORMONAS EN UN SEGUNDO MEDIO DE CULTIVO, LIBRE DEL PRIMER FACTOR DE CRECIMIENTO, QUE CONTIENE UN SEGUNDO FACTOR DE CRECIMIENTO O COMBINACION DE FACTORES DE CRECIMIENTO.
Description
Factores biológicos y células germinales
neurales.
La presente invención se dirige al cultivo,
desarrollo y diferenciación de células germinales neurales usando
diversos factores biológicos. Más particularmente la invención se
refiere a un método para aumentar el número de células precursoras
que experimentan diferenciación en un fenotipo particular mediante
la exposición de las células a factores biológicos específicos o
combinaciones de los mismos.
Se describe un método de preparación de células
diferenciadas a partir de células madre neurales de mamífero, cuyo
método consiste en las siguientes etapas:
- (a)
- hacer proliferar al menos una célula madre neural de mamífero aislada del tejido de un donante, con la condición de que el tejido no derive de un embrión humano, en suspensión en un medio de cultivo libre de suero que contiene factor de crecimiento epidérmico como mitógeno que hace proliferar a dicha al menos una célula madre para producir células precursoras neurales, cuya al menos una célula madre responde al EGF y es capaz de producir progenie capaz de diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, y
- (b)
- diferenciar las células precursoras neurales eliminando el mitógeno y cultivando dichas células precursoras neurales en un medio de cultivo inductor de la diferenciación libre de EGF para producir células diferenciadas, cuyo medio contiene un substrato sobre el que se pueden adherir las células precursoras neurales, siendo preparado dicho medio con un factor de crecimiento exógeno seleccionado entre el grupo consistente en CNTF, bFGF, BDNF y ácido retinoico.
El desarrollo del sistema nervioso comienza en
una etapa temprana del desarrollo fetal. La neurogénesis, la
generación de neuronas nuevas, se completa en el periodo postnatal
temprano. Sin embargo, las conexiones sinápticas implicadas en los
circuitos neurales se alteran continuamente durante la vida del
individuo, debido a la plasticidad sináptica y la muerte
celular.
La primera etapa en el desarrollo neural es el
nacimiento celular, que es la secuencia temporal y espacial precisa
en la que las células precursoras o progenitoras proliferan y se
diferencian. Las células en proliferación dan lugar a los
neuroblastos, glioblastos y células germinales.
La segunda etapa es un periodo de diferenciación
y migración de los tipos celulares en el que las células
progenitoras se transforman en neuronas y neurogliocitos y emigran
a sus posiciones finales. Las células que se derivan del tubo
neural dan lugar a neuronas y neurogliocitos del sistema nervioso
central (SNC), mientras que las células derivadas de la cresta
neural dan lugar a las células del sistema nervioso periférico
(SNP). Algunos factores presentes durante el desarrollo, como el
factor de crecimiento nervioso (NGF), promueven el crecimiento de
las células neurales. El NGF es secretado por células de la cresta
neural y estimula el nacimiento y crecimiento de los axones
neuronales.
La tercera etapa del desarrollo ocurre cuando
las células adquieren cualidades fenotípicas específicas, tales
como la expresión de neurotransmisores particulares. En este
momento, las neuronas también extienden prolongaciones que forman
sinapsis con sus dianas. Las neuronas no se dividen después de la
diferenciación.
Finalmente, ocurre una muerte celular selectiva,
en la que la degeneración y muerte de las células, fibras y
conexiones sinápticas específicas "ponen a punto" el complejo
circuito del sistema nervioso. Esta "puesta a punto" continúa
durante la vida del hospedador. Más adelante en la vida, la
degeneración selectiva debida al envejecimiento, infección y otras
etiologías desconocidas puede llevar a enfermedades
neurodegenerativas.
Recientemente, se ha aplicado el concepto de
injerto de tejido neurológico al tratamiento de enfermedades
neurológicas como la enfermedad de Parkinson. Los injertos neurales
no sólo pueden evitar la necesidad de una constante administración
de fármacos, sino también de los complicados sistemas de
administración de fármacos que surgen debido a la barrera de la
circulación del cerebro. Sin embargo, hay limitaciones a esta
técnica. Primero, las células provenientes de una célula
diferenciada de otro hospedador que se usan para los transplantes
que portan moléculas en la superficie celular pueden inducir una
reacción inmunológica en el hospedador. Además, las células deben
estar en una etapa de desarrollo en la que son capaces de formar
conexiones neurales normales con las células adyacentes. Por estos
motivos, los estudios iniciales sobre el neurotransplante se
centran en el uso de células fetales. Perlow y cols. describen el
transplante de neuronas dopaminérgicas fetales en ratas adultas con
lesiones del cuerpo negro estriado inducidas químicamente en
"Brain grafts reduce motor abnormalities produced by destruction
of nigrostriatal dopamine system", Science 204:
643-647 (1979). Estos injertos mostraban una buena
supervivencia, crecimiento de axones y redujeron de forma
significativa las anormalidades motoras en los animales
hospedadores. Lindvall y cols., en "Grafts of fetal dopamine
neurons survive and improve motor function in Parkinson's
disease", Science 257: 574:577 (1990), demostraron
que los transplantes neurales de neuronas productoras de dopamina
mesencefálicas fetales humanas pueden restaurar la síntesis y
almacenamiento de dopamina, y reducir la rigidez y bradiquinesia en
pacientes que padecen al enfermedad de Parkinson. Freed, y cols. en
"Transplantation of human fetal dopamine cells for Parkinson's
Disease", Arch. Neurol. 47:505-512
(1990) muestran también la mejora de un paciente que recibió un
transplante fetal.
Las referencias anteriores describen que el
tejido cerebral fetal de mamífero tiene unas buenas características
de supervivencia en el transplante inmediato. Se cree que la
capacidad de supervivencia aumentada de las neuronas fetales se
debe a la reducida susceptibilidad de las neuronas fetales a la
anoxia comparada con las neuronas adultas, y también a la carencia
de marcadores en la superficie celular de las células fetales cuya
presencia puede llevar al rechazo del tejido injertado de adultos.
Sin embargo, aunque se considera que el cerebro es un sitio
inmulógicamente privilegiado, puede ocurrir algún rechazo del
tejido fetal. Por lo tanto, la capacidad de usar tejido fetal está
limitada, no sólo debido al rechazo del tejido fetal aislado de otro
hospedador, y debido a la necesidad de fármacos inmunosupresores
resultante, sino debido también a problemas éticos para obtener
tejido fetal. Sin embargo, el tejido cerebral neonatal posee una
capacidad limitada de supervivencia y las neuronas del SNC mamífero
generalmente no sobreviven al transplante en el cerebro.
Aunque las neuronas del SNC adulto no son buenas
candidatas para el neurotransplante, se ha demostrado que las
neuronas del sistema nervioso periférico (SNP) de adultos
sobreviven al transplante, y ejercen efectos neurotrópicos y
gliotrópicos sobre el tejido neural en desarrollo del hospedador.
Una fuente de tejido neural no del SNC para transplante es la médula
suprarrenal. Los cromocitomas suprarrenales se originan en la
cresta neural al igual que las neuronas del SNP, y reciben sinapsis
y producen proteínas de transporte y enzimas similares a las
neuronas del SNP. Aunque estas células funcionan de forma endocrina
en la médula suprarrenal intacta, en cultivo estas células pierden
su fenotipo glandular y desarrollan características neurales en
cultivo en presencia de ciertos factores y hormonas de crecimiento
(Notter y cols., "Neuronal properties of monkey adrenal medulla
in vitro", Cell Tissue Research 244:
69-76 (1986)]. Cuando se injertan al SNC mamífero,
estas células sobreviven y sintetizan cantidades significativas de
dopamina que pueden interactuar con los receptores de dopamina en
áreas adyacentes del SNC.
En la patente de Estados Unidos nº 4.980.174, el
trasplante de células que contienen monoamina aisladas de la
glándula pineal y de la médula suprarrenal de ratas adultas al
cortex frontal de ratas dio como resultado el alivio de la
impotencia aprendida, una forma de depresión, en el hospedador. En
la patente de Estados Unidos nº 4.753.635, los cromocitomas y el
tejido medular suprarrenal derivado de bueyes se implantaron el
tronco cerebral o médula espinal de ratas y produjo la analgesia
cuando se indujo al tejido o célula implantado a liberar sustancias
que interactúan con los nociceptores (por ejemplo catecolaminas
como dopamina). Se han injertado células de la médula suprarrenal
de forma antóloga a los humanos, y han sobrevivido, produciendo una
mejora de leve a moderada de los síntomas (Watts, y cols.,
"Adrenal- caudate transplantation in patients with Parkinson's
Disease (PD): 1-year follow-up",
Neurology 39 Supl 1:127 [1989]: Hurtig y cols.,
"Post-mortem análisis of
suprarenal-medulla-to-caudate
autograft in a patient with Parkinson's Disease", Annals of
Neurology 25: 607-614 [1898]). Sin
embargo, las células suprarrenales no obtienen un fenotipo neural
normal, y son por lo tanto probablemente de uso limitado para
trasplantes en los que deben formarse conexiones sinápticas.
Otra fuente de tejido para el neurotranspiante
es a partir de líneas celulares. Las líneas celulares son células
inmortalizadas que se derivan ya sea por transformación de células
normales con un oncogén (Cepko, "Inmortalization of neural cells
via retrovirus-mediated oncogene transduction",
Ann. Rev. Neurosci. 12:47-65 [1989]) o
por cultivo de células con características de crecimiento alterado
in vitro (Ronnett, y cols., "Human cortical neuronal cell
line: Establisment from a patient with unilateral
megalencephaly", Science 248:
603-505 [1990]). Tales células pueden desarrollarse
en cultivo en grandes cantidades para usarse para trasplantes
múltiples. Se ha visto que algunas líneas celulares se diferencian
al ser tratadas químicamente para expresar una variedad de
propiedades neuronales como la formación de neuritas, membranas
excitables y síntesis de neurotransmisores y sus receptores.
Además, al diferenciarse, estas células parecen sen amitóticas, y
por lo tanto no cancerosas. Sin embargo, el potencial de estas
células para inducir respuestas inmunitarias adversas, el uso de
retrovirus para inmortalizar las células, el potencial de reversión
de estas células a un estado amitótico, y la falta de respuesta de
estas células a las señales de inhibición del crecimiento normales
hacen que las líneas celulares no sean óptimas para su uso
generalizado.
Las células O-2A son
progenitoras de neurogliocitos que dan lugar in vitro
únicamente a oligodendrocitos y astrocitos de tipo II. Se ha
demostrado que las células que parecen tener el fenotipo
O-2A por inmunotinción in vivo remielinizan
con éxito las neuronas desmilienizadas in vivo. Godfraind y
cols., J. Cell Biol. 109:2405-2416 (1989).
Se requiere la inyección de un gran número de células
O-2A para remielinizar adecuadamente todas las
neuronas diana in vivo, dado que parece que las células
O-2A (al igual que otras preparaciones de
neurogliocitos) no siguen dividiéndose in situ. Aunque las
células progenitoras O-2A pueden desarrollarse en
cultivo, actualmente la única técnica de aislamiento disponible
emplea nervio óptico como materia prima. Esta es una fuente de bajo
rendimiento, que requiere numerosas etapas de purificación. Existe
un inconveniente adicional porque las células O-2A
aisladas por los procedimientos disponibles pueden dividirse
únicamente un número de veces limitado. Raff Science 243:
1450-1455 (1989).
Las líneas celulares O-2A
trasformadas no son adecuadas para ser trasplantadas debido al
hecho de que el proceso de trasformación lleva a una división
celular controlada genéticamente (oncogén) al contrario que las
líneas celulares primarias o las células germinales o células
progenitoras en las que la regulación de la división es a nivel
epigenético. Otros problemas potenciales adicionales incluyen la
inestabilidad de las líneas celulares durante largos periodos de
tiempo, y patrones aberrantes de diferenciación o de respuesta a
factores de crecimiento. Goldman Trends Neuro. Sci. 15:
359-362 (1992).
La incapacidad en la técnica anterior de que el
trasplante se integrara completamente en el tejido hospedador, y la
falta de disponibilidad de células en cantidades ilimitadas a
partir de una fuente fiable para ser injertadas son, quizás, las
limitaciones mayores del neurotrasplante.
Por lo tanto, en vista de las deficiencias
mencionadas anteriormente que acompañan a los métodos de la técnica
anterior de cultivo y trasplante de células neurales, debería ser
aparente que existe todavía una necesidad en la técnica de una
fuente fiable de números ilimitados de células para el
neurotransplante, que sean capaces de diferenciarse en neuronas y
neurogliocitos.
En consecuencia, es un objeto de la presente
invención proporcionar una fuente fiable de células reguladas
epigenéticamente para el trasplante, que sean capaces de
diferenciarse en neuronas y neurogliocitos.
Es otro objeto de la invención proporcionar un
método para influenciar la diferenciación de las células
precursoras usando factores de crecimiento específicos.
Estos y otros objetos y características de la
invención serán aparentes para los expertos en la técnica a partir
de la descripción detallada y las reivindicaciones anexas a
continuación.
Se cree que ninguna de las referencias
anteriores describe la presente invención como se reivindica y no
se presume que sea técnica anterior. Las referencias se ofrecen
como información sobre los antecedentes.
El término "célula germinal" se refiere a
una célula no diferenciada que es capaz de proliferar y dar lugar a
más células germinales que tienen la capacidad de generar un gran
número de células progenitoras que pueden a su vez dar lugar a
células hija diferenciadas o diferenciables.
El término "célula germinal neural" (SNC)
se refiere a las células germinales de la presente invención, cuya
progenie, en condiciones de cultivo apropiadas, incluye tanto las
células progenitoras gliales como neuronales.
El término "células progenitoras" se
refiere a las células no diferenciadas de la presente invención,
derivadas de células germinales neurales, cuya progenie puede, en
las condiciones apropiadas, incluir células progenitoras gliales
y/o neuronales.
El término "oligodendrocito" se refiere a
un neurogliocito diferenciado que forma la mielina que rodea los
axones en el sistema nervioso central (SNC). Los oligodendrocitos
son del fenotipo galactocerebrósido (+), proteína básica de mielina
(+), y proteína ácida fibrilar glial (-) [GalC(+), MBP(+),
GFAP(-)]
El término "neurona" se refiere a una
célula que tiene el fenotipo enolasa neuroespecífica (+) o
neurofilamento (+) [NSE(+) o NF(+)].
El término "astrocito tipo I" se refiere a
un tipo de neurogliocito diferenciado con una morfología
protoplásmica plana/tipo fibroblasto que es GFAP(+), A2B5(-),
GalC(-), y MBP(-).
El término "astrocito tipo II" se refiere a
un neurogliocito diferenciado que presenta una morfología de
prolongaciones estrelladas de fenotipo GFAP(+), A2B5(+), GalC(-), y
MBP(-).
El término "células progenitoras
neuronales" se refiere a células que producen células hija que
en las condiciones apropiadas se vuelven o dan lugar a
neuronas.
El término "células precursoras de
oligodendrocitos" se refiere a células que dan lugar a
oligodendrocitos. Las células precursoras de oligodendrocitos
pueden tener el fenotipo A2B5(+), O4(+)/GalC(-), MBP(-) y GFAP(-)
[pero no se están limitadas a este fenotipo].
El término "neuroesfera" se refiere a un
agrupamiento de células derivadas de células germinales neurales y
cultivadas in vitro. Al menos algunas de las células son del
fenotipo nestina (+). El agrupamiento está comprendido por células
germinales y/o células progenitoras y puede o no incluir células
diferenciadas.
El término "células precursoras" se refiere
a las células vivas de la presente invención que se derivan de
células germinales neurales que se hacer proliferar en un medio de
cultivo que contiene un factor o factores de crecimiento, e incluye
tanto células progenitoras como germinales. Las células precursoras
típicamente crecen en forma de neuroesferas, pero pueden mostrar
diferentes patrones de crecimiento dependiendo de las condiciones de
cultivo.
El término "factor de crecimiento" se
refiere a una proteína, péptido u otra molécula que tiene un efecto
de crecimiento, proliferativo, diferenciador o trópico.
El término "donante" se refiere al humano o
animal que es la fuente de las células germinales neurales usadas
en la presente invención, del que se excluyen los embriones humanos
como fuente.
Se ha comunicado y descrito el uso potencial de
las células germinales neurales (NSC). (Reynolds y Weiss,
Science 255: 1707 (1992)). Se ha demostrado que las
NSC dan lugar a neuroblastos (Reynolds y Weiss, Restorative
Neuroloy & Neuroscience 4: 208 (1992)). Se sabe ahora
que las NSC dan lugar también a los tipos celulares macrogliales
principales (astrocitos y oligodendrocitos).
Las células germinales neurales pueden aislarse
y cultivarse mediante el método de Reynolds y Weiss (referencia
anterior). Brevemente, se induce la división de la célula germinal
que responde al factor de crecimiento epidérmico (EGF), cuando se
cultiva en un medio sin suero definido, y en presencia de un
mitógeno como EGF o similares, dando lugar a un agrupamiento de
células no diferenciadas. Los agrupamientos de células no son
inmunorreactivos a GFAP, neurofilamento (NF), enolasa
neuroespecífica (NSE) o MBP. Sin embargo, las células precursoras
en el agrupamiento son inmunorreactivas a la nestina, una proteína
filamentosa intermedia que se encuentra en las células del CNS no
diferenciadas. El marcador de nestina fue caracterizado por Lehndahl
y cols., Cell 60: 585-595 (1990). Los
fenotipos maduros asociados con los cuatro tipos celulares que
pueden diferenciarse de la progenie de las células precursoras son
predominantemente negativas para el fenotipo de nestina.
En presencia continuada de un mitógeno como EGF
o similares, las células precursoras en la neuroesfera continúan
dividiéndose, dando como resultado un aumento del tamaño de la
neuroesfera y del número de células no diferenciadas [nestina(+),
GFAP(-), NF(-), NSE(-), MBP(-)]. En esta etapa, las células no son
adherentes y tienden a formar los agrupamientos que flotan
libremente característicos de las neuroesferas. Sin embargo pueden
variarse las condiciones de cultivo de forma que aunque las células
precursoras todavía expresen el fenotipo de nestina, no formen las
neuroesferas características. Después de eliminar el mitógeno, las
células se adhieren al sustrato (plástico o vidrio tratado con
poliornitina), se aplanan, y comienzan a diferenciarse en neuronas
y neurogliocitos. En esta etapa el medio de cultivo puede contener
suero como suero bovino fetal (FBS) al 0,5-1,0%. A
los 2-3 días, la mayor parte o todas las células
precursoras comienzan a perder la inmunorreactividad a la nestina y
comienzan a expresar filamentos intermedios específicos de neuronas
o de astrocitos como indica la inmunorreactividad a NF o GFAP
respectivamente.
La identificación de neuronas se logra usando la
inmunorreactividad a la enolasa neuroespecífica (NSE) y las
proteínas neurofilamentosas tau-1 y
MAP-2. Debido a que estos marcadores son altamente
fiables, continuarán siendo útiles para la identificación primaria
de neuronas, sin embargo, las neuronas pueden identificarse también
basándose en su fenotipo neurotrasmisor específico.
Usando métodos de inmunofluorescencia de marcaje
doble e inmunoperoxidasa, pueden analizarse los cultivos de
neuroesferas diferenciados para determinar la expresión de
neurotransmisores o, en algunos casos, las enzimas responsables de
la síntesis de neurotransmisores. De forma alternativa, puede
realizarse la histoquímica de hibridación in situ usando
sondas de ADNc o ARN específicas del neurotransmisor peptídico o los
ARNm enzimáticos que sintetizan neurotransmisor. Estas técnicas
pueden combinarse con métodos inmunocitoquimicos para mejorar la
identificación de fenotipos específicos. Si fuera necesario, pueden
aplicarse los anticuerpos y sondas moleculares analizadas
anteriormente a procedimientos de transferencia de Western y
Northern respectivamente para ayudar a la identificación
celular.
De forma alternativa, pueden usarse métodos de
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en la
identificación de fenotipos. La HPLC es particularmente útil para
la identificación de numerosos neurotransmisores peptídicos
pequeños y neurotransmisores de catecolamina e indolamina. Estas
técnicas son altamente sensibles y pueden usarse en paradigmas de
selección a gran escala que requieren volúmenes de muestra
relativamente pequeños.
Además de la presencia de neuronas y astrocitos,
un gran número de células que no expresan ni los filamentos
intermedios específicos de neuronas ni de astrocitos, comienzan a
expresar marcadores específicos de oligodendrocitos de una forma
temporalmente correcta. Es decir, las células primero se hacen
inmunorreactivas a 04 (un antígeno de la superficie celular),
galactocerebrosido (GalC, un glicolípido de mielina) y finalmente,
proteína básica de mielina (MBP). Estas células poseen también una
morfología de oligodendrocito característica.
La presente invención proporciona un método para
influenciar la proporción relativa de estos tipos celulares
diferenciados mediante la adición de factores de crecimiento
exógenos durante la etapa de diferenciación de las células
precursoras. Usando métodos de inmunofluorescencia e
inmunoperoxidasa de marcaje doble con diversos anticuerpos
específicos de neurona y neurogliocito, puede determinarse el
efecto de los factores de crecimiento exógeno sobre las células en
diferenciación.
\newpage
Los efectos biológicos de los factores de
crecimiento y trópicos están generalmente mediados por la unión a
los receptores sobre la superficie celular. Se han identificado
receptores de numerosos de estos factores y hay disponibles
anticuerpos y sondas moleculares para receptores específicos.
Pueden analizarse células germinales neurales
para determinar la presencia de receptores de factor de crecimiento
en todas las etapas de la diferenciación. En muchos casos, la
identificación de un receptor particular definirá la estrategia a
usar para hacer que las células se diferencien adicionalmente
siguiendo rutas de desarrollo específicas añadiendo factores de
crecimiento o tráficos exógenos.
Los factores de crecimiento exógenos pueden
añadirse solos o en diversas combinaciones. Pueden añadirse también
en secuencia temporal (es decir, la exposición a un primer factor
de crecimiento influencia la expresión de un segundo receptor de
factor de crecimiento, Neuron 4:
189-201 (1990). Los factores de crecimiento usados
para influenciar la diferenciación de células precursoras in
vitro seleccionados son los factores de crecimiento de
fibroblastos básicos (bFGF), el factor neurotrófico ciliar (CNTF),
factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), y ácido
retinóico.
La diferenciación de las células precursoras
puede inducirse también mediante diversos sustratos además de
poli-L-ornitina como colágeno,
fibronectina, laminina, matrigel, etc.
Se decapitaron ratones albinos embriónicos de 14
días (E14) CD_{1} (Charles River) y se eliminaron el cerebro y el
cuerpo estriado usando un procedimiento estéril. El tejido se
disoció mecánicamente con una pipeta de Pasteur esmerilada al fuego
en un medio sin suero compuesto de una mezcla 1:1 de medio de Eagle
modificado por Dulbecco (DMEM) y mezcla de nutrientes
F-12 (Gibco). Las células se centrifugaron a 800 rpm
durante 5 minutos, se aspiró el sobrenadante, y se resuspendieron
las células en medio DMEM/F-12 para el
recuento.
Se suspendieron las células en un medio sin
suero denominado en lo sucesivo "medio completo", compuesto de
DMEM/F-12 (1:1) que incluía glucosa (0,6%),
glutamina (2 mM), bicarbonato sódico (3 mM), tampón HEPES (ácido
4-[2-hidroxietil]-1-piperazinetanosulfónico)
(5 mM) y una mezcla de hormonas y sales definida (para sustituir al
suero) que incluía insulina (25 \mug/ml), transferrina (100
\mug/ml), progesterona (20 nM), putrescina (60 \muM), y cloruro
de selenio (30 nM) (todas de Sigma excepto glutamina [Gibco]).
Además, el medio contenía 16-20 ng/ml de EGF
(purificado a partir de submaxilar de ratón, Collaborative
Research) o TGF\alpha (humano recombinante, Gibco). Las células
se plaquearon a 0,2 x 10^{6} células/ml en 75 cm^{2} de matraces
con cultivo tisular (Corning) sin tratamiento previo del sustrato y
se mantuvieron en una incubadora a 37ºC, humedad del 100%, aire al
85%/CO_{2} al 5%.
Cuando proliferaron las células, en las primeras
48 horas y a los 3-4 días in vitro (DIV),
formaron pequeños agrupamientos, conocidos como neuroesferas, que
se desprendieron del sustrato entre el DIV 4-6.
Después de 7 DIV, se eliminaron las
neuroesferas, se centrifugaron a 400 rpm durante
2-5 minutos, y se disoció el sedimento mecánicamente
para obtener células individuales con una pipeta de Pasteur
esmerilada al fuego en 2 ml de medio completo.
Se volvieron a plaquear 1 x 10^{6} células en
un matraz de cultivo de tejido de 75 cm^{2} con 20 ml de medio
completo que contenía EGF. Se reinició la proliferación de las
células germinales y la formación de neuroesferas nuevas. Este
procedimiento puede repetirse cada 6-8 días.
Se diferenciaron las neuroesferas usando los
siguientes paradigmas. Las neuroesferas usadas para cada paradigma
se generaron como se esquematiza en el Ejemplo 1. Todas las
neuroesferas usadas se trasvasaron al menos una vez antes de su
diferenciación.
Paradigma
1
De 6 a 8 días después del primer trasvase, se
extrajeron las neuroesferas y se centrifugaron a 400 rpm. Se
eliminó el sobrenadante que contenía EGF y se suspendió el
sedimento en medio completo sin EGF que contenía suero bovino fetal
(FBS) al 1%.
Se plaquearon las neuroesferas (aproximadamente
0,5-1,0 x 10^{6} células/pocillo) sobre cubres de
cristal recubiertos con
poli-L-ornitina (15 \mug/ml) en
placas de cultivo Nuclon de 24 pocillos (1,0 ml/pocillo). Después de
24 horas en cultivo, se transfirieron los cubres a placas de
cultivo de 12 pocillos (Costar) que contenían medio completo con
FBS al 0,5%. El medio se cambió cada 4-7 días. Este
procedimiento de diferenciación se denomina "Paradigma de
diferenciación rápida" o RDP.
Paradigma
2
De 6 a 8 días después del primer trasvase, se
extrajeron las neuroesferas y se centrifugaron a 400 rpm. Se
eliminó el medio que contenía EGF y se suspendió el sedimento en
medio completo sin EGF que contenía FBS al 1%. Se disociaron
mecánicamente las neuroesferas para obtener células individuales
con una pipeta de Pasteur esmerilada al fuego y se centrifugaron a
800 rpm durante 5 minutos. Se plaquearon entre 0,5 x 10^{6} y 1,0
x 10^{6} células sobre cubres de cristal recubiertos con
poli-L-ornitina (15 \mug/ml) en
placas de cultivo Nuclon de 24 pocillos (1,0 ml/pocillo). El medio
de cultivo sin EGF que contenía FBS al 1% se cambió cada
4-7 días.
Paradigma
3
Se lavaron las neuroesferas para eliminar el EGF
mediante transferencias en serie a través de cambios de medio sin
EGF. Se plaqueó una neuroesfera individual sobre cubres de cristal
recubiertos con poli-L-ornitina (15
\mug/ml) en una placa de 24 pocillos. El medio de cultivo
utilizado era medio completo con o sin FBS al 1%. El medio se
cambió cada 4-7 días.
Paradigma
4
Se lavaron las neuroesferas para eliminar el EGF
mediante transferencias en serie a través de cambios de medio sin
EGF. Se disoció una neuroesfera individual mecánicamente en un tubo
de centrifugado Eppendorf y todas las células se plaquearon en una
placa de cultivo de 35 mm. Se utilizó medio completo con o sin FBS
al 1%.
Se examinaron los efectos de CNTF, bFGF, BDNF y
ácido retinóico sobre la diferenciación de las neuroesferas usando
los paradigmas de diferenciación descritos en el Ejemplo 2.
Se ensayó el efecto de CNTF en los paradigmas 1
y 3. Para ambos paradigmas se añadió CNTF al comienzo del
experimento con una concentración de 10 ng/ml o diariamente con una
concentración de 1 ng/ml.
En el paradigma 1, la adición de CNTF aumentó el
número de células inmunorreactivas a la enolasa neuroespecífica
(NSE) además del número de células inmunorreactivas a
tau-1, lo que sugiere que el CNTF tiene un efecto
sobre la proliferación, supervivencia, o diferenciación de neuronas.
Los análisis preliminares con anticuerpos que reconocen los
neurotransmisores GABA y la Sustancia P sugieren que no aumenta el
número de células que contienen estas proteínas. Esto sugiere que
se está produciendo un fenotipo neuronal diferente.
Se usaron tres anticuerpos diferentes dirigidos
contra o4, galactocerebrósido (GalC) y proteína básica de mielina
(MBP) para estudiar el efecto de CNTF sobre los oligodendrocitos
del paradigma 1. El CNTF no tuvo efecto sobre el número de células
O4(+), pero hubo un aumento en el número de células GalC(+) y
MBP(+) comparado con el control. Así parece que el CNTF juega un
papel en la maduración de los oligodendrocitos.
En un experimento, las neuroesferas se
diferenciaron como se esquematiza en el paradigma 1 pero nunca se
añadió suero al medio de cultivo. Mientras que el efecto del CNTF
sobre las neuronas y los oligodendrocitos no era aparente en
presencia de suero, hubo un aumento de la proliferación de
astrocitos protoplásmicos planos. Por lo tanto, el CNTF afectará la
diferenciación de astrocitos en diversas condiciones de cultivo.
En el paradigma 3, la adición de CNTF dio como
resultado un aumento de las células NSE(+).
Se analizó el efecto de BDNF usando el Paradigma
3. Se dio un aumento del número de neuronas NSE(+) por neuroesfera.
De forma adicional hubo un aumento en la ramificación neuronal y la
migración de las neuronas desde la esfera.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se analizó el efecto de bFGF usando los
paradigmas 2 y 4. En el paradigma 2, se añadieron 20 ng/ml de bFGF
al comienzo del experimento y se tiñeron las células 7 días
después. El bFGF aumentó el número de células GFAP(+) y el número
de células NSE(+). Esto sugiere que el bFGF tiene un efecto
proliferativo o de supervivencia sobre las neuronas y los
astrocitos.
En el paradigma 4, se añadieron 20 ng/ml de bFGF
al comienzo del experimento y se ensayaron 7-10
días después. El bFGF indujo la proliferación de las células
precursoras generada por la célula germinal que responde a EGF.
Indujo la división de dos tipos diferentes de células, los
neuroblastos y células progenitoras bipotenteses. Los neuroblastos
produjeron, de media, 6 neuronas, mientras que la célula bipotentes
produjo aproximadamente 6 neuronas y varios astrocitos.
En estudios previos, se observó que cuando se
plaquean a baja densidad (2500 células/cm^{2}), la adición de EGF
hasta el día 7 in vitro (DIV) podía iniciar la proliferación
de la célula germinal, pero no si se aplicaba después de 7 DIV. Las
células del cuerpo estriado (E14, 2500 células/cm^{2}) se
plaquearon en ausencia o presencia de 20 ng/ml de bFGF. Después de
11 DIV, se lavaron los cultivos y se añadió medio que contenía 20
ng/ml de EGF. Después de 4-5 DIV, en cultivos
cebados con bFGF, más del 70% de los pocillos examinados contenían
agrupamientos de células en proliferación de las que se
desarrollaban colonias con las propiedades morfológicas y antígenas
de las células generadas mediante EGF. Los cultivos que no habían
sido cebados con bFGF no mostraron proliferación en respuesta al
EGF. Estos hallazgos sugieren que las células germinales que
responden al EGF poseen receptores de bFGF que regulan su
supervivencia a largo plazo.
Se analizó el efecto del ácido retinóico
10^{-7}M usando el paradigma 1. Hubo un aumento en el número de
células NSE(+) y tau-1 (+), lo que sugiere que el
ácido retinóico aumenta el número de neuronas.
Se examinó la expresión de la familia trk
de receptores de neurotropina en neuroesferas generadas mediante
EGF mediante análisis por transferencia de Northern. Se aisló el
ARNm total de neuroesferas estriadas generadas mediante EGF de
ratón y rata. Tanto las neuroesferas de rata como de ratón
expresaron niveles altos de ARNm del receptor trkB, pero no
expresaron ARNm de trk ni de trkC. En los
experimentos preliminares, se plaquearon neuroesferas individuales
de ratón generadas mediante EGF sobre cubres de cristal recubiertos
con poli-L-ornitina y se cultivaron
en ausencia o presencia de 10 ng/ml de BDNF. Cuando se examinaron
después de 14-28 días in vitro, se
plaquearon las neuroesferas en presencia de células NSE(+) que
contenían BDNF con prolongaciones extensas y altamente ramificadas;
no se observaron células NSE(+) bien desarrolladas en ausencia de
BDNF. La activación del receptor trkB en neuroesferas
generadas mediante EGF puede potenciar la diferenciación,
supervivencia y/o crecimiento de neuritas a partir de neuronas
recién generadas.
La proteína asociada al crecimiento
(GAP-43) es una fosfoproteína de membrana
específica de sistema nervioso que se regula por disminución
durante el desarrollo. Originariamente, se creía que
GAP-43 era neuroespecífica, sin embargo, trabajos
recientes indican que esta proteína puede expresarse al menos de
forma transitoria durante el desarrollo en algunos astrocitos,
oligodendrocitos y células de Schwann. En este momento no se conoce
el papel de GAP-43 en la macroglia. Se investigó la
expresión transitoria de GAP-43 en neurogliocitos
generada a partir de las células germinales que responden a EGF
derivadas del cuerpo estriado murino embriónico y adulto. Se indujo
la diferenciación de los neurogliocitos (astrocitos y
oligodendrocitos) plaqueando las células precursoras en un medio que
contenía FBS al 1% sin EGF. Entonces se sondearon las células con
anticuerpos específicos de GAP-43, nestina, GFAP,
O4, y GalC. Para identificar las células que expresan
GAP-43, se juntaron los anticuerpos en diversas
combinaciones usando métodos de inmunofluorescencia de marcaje
doble.
Durante los dos primeros días después del
plaqueo, hubo un nivel de expresión de GAP-43 de
bajo a moderado en casi todas las células (planas, bipolares y
estrelladas), pero a los 3-4 días después del
plaqueo, el nivel de expresión de GAP-43 se
restringió a las células bipolares y estrelladas. A los 4 días la
mayor parte de las células que expresaban GAP-43 se
marcaban también con los marcadores de oligodendrocitos O4 y GalC,
aunque GFAP y GAP-43 se coexpresaban en varias
células. Una semana después del plaqueo, sin embargo, esencialmente
todos los astrocitos que expresaban GFAP ya no expresaban
GAP-43 mientras que la mayoría de las células que
expresaban O4 y GalC seguían expresando GAP-43. A
los 7-10 días, estos oligodendrocitos comenzaron a
expresar MBP y a perder la expresión de GAP-43. Las
células germinales que respondían a EGF pueden representar un
sistema de modelo útil para el estudio del papel de
GAP-43 en el desarrollo de neurogliocitos y
neuronas.
(El ejemplo 5 no está dentro del ámbito de la
presente memoria según se reivindica a continuación).
Claims (5)
1. Un método para preparar células diferenciadas
a partir de células madre neurales de mamífero consistente en las
siguientes etapas:
- (a)
- hacer proliferar al menos una célula madre neural de mamífero aislada del tejido de un donante, con la condición de que el tejido no derive de un embrión humano, en suspensión en un medio de cultivo libre de suero que contiene factor de crecimiento epidérmico como mitógeno que hace proliferar a dichas, al menos una, célula madre de las cuales al menos una célula madre neural responde al EGF y es capaz de producir progenie capaz de diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, y
- (b)
- diferenciar las células precursoras neurales y eliminar el mitógeno y cultivar dichas células precursoras neurales en un medio de cultivo inductor de la diferenciación libre de EGF para producir células diferenciadas, cuyo medio contiene un substrato sobre el que se pueden adherir las células precursoras neurales, siendo preparado dicho medio con un factor de crecimiento exógeno seleccionado entre el grupo consistente en CNTF, bFGF, BDNF y ácido retinoico.
2. El método de acuerdo con la reivindicación
1, en el que el sustrato se selecciona del grupo que consiste en
poli-L-ornitina, colágeno,
fibronectina, laminina, y matrigel.
3. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que las células
diferenciadas son neuronas.
4. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que las células
diferenciadas son oligodendrocitos maduros.
5. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que las células
diferenciadas son astrocitos.
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