ES2196187T7 - Conjugados peptidicos derivados de las homonas timicas, su utilizacion a titulo de medicamento y composiciones que lo contienen. - Google Patents

Conjugados peptidicos derivados de las homonas timicas, su utilizacion a titulo de medicamento y composiciones que lo contienen. Download PDF

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Description

Conjugados peptídicos derivados de las hormonas tímicas, su utilización a título de medicamento y composiciones que los contienen.
La invención se refiere a unos nuevos derivados sintéticos de dos hormonas tímicas, la timulina y la timosina, y a sus aplicaciones, tanto como medicamento como en el sector de la cosmética.
Los numerosos estudios sobre el funcionamiento del sistema inmunitario, han puesto de manifiesto el papel capital del timo y de las hormonas tímicas, en la estimulación de las defensas inmunitarias del organismo.
Las hormonas tímicas, en particular la timulina, "J.F. BACH y col"., la timopoietina "GRANDSTEIN" y la timosina "DAYNE" se identificaron por ser de naturaleza polipeptídica y peptídica.
Dichas hormonas y principalmente la timulina y la timopoieitina, presentan la propiedad de inducir la maduración de los linfocitos T y de estimular la respuesta inmunitaria del organismo.
Se ha demostrado científicamente que ha existido una estrecha relación entre la disminución de las funciones tímicas con la edad, y el envejecimiento cutáneo en el plano fisiológico normal.
A nivel patológico, la pérdida de actividad del timo, "involución" se traduce por la aparición de trastornos fisiológicos: "enfermedades auto-inmunes, alopecias (caída anómala de los cabellos) etc...".
Se ha demostrado asimismo que existía una relación entre las propiedades fisiológicas del timo y determinadas células de la epidermis.
Existe en efecto una similitud de estructura entre determinadas células del timo y los queratinocitos. Se ha demostrado que los queratinocitos secretan igualmente, en determinadas condiciones, una hormona del tipo timopoietina idéntica a la secretada por el timo, y son capaces de inducir una maduración linfocitaria post tímica, y de este modo tomar el relevo del timo.
Dicha relación, entre las actividades fisiológicas de las células del timo y los queratinocitos, se ha confirmado recientemente por haberse constatado en las células del timo, la presencia de queratina y de queratoialina, de estructuras idénticas a la queratina y a la queratoialina secretada por los queratinocitos de la epidermis.
Por otra parte, la demostración aportada en el plano científico, de que los queratinocitos en fase de diferenciación secretaban una sustancia activando el crecimiento de los timocitos, el ETAF confirma las relaciones fisiológicas existentes entre el timo y los queratinocitos. (ETAF: Epidermal Thymocyte Activating Factor).
Existe un paralelismo entre la "involución" del timo y la disminución de la síntesis del ETAF por los queratinocitos en función de la edad, pero con un desfase funcional a favor de los queratinocitos, (maduración linfocitaria post
tímica).
La utilización de las hormonas tímicas, en particular la timulina y la timopoeitina en terapéutica, ha representado el objeto de numerosos trabajos farmacológicos y clínicos, a la vista de la estimulación y de la regulación de las defensas inmunitarias del organismo.
Utilizadas en forma de extractos o de moléculas obtenidas por síntesis química, dichos productos han dado unos resultados irregulares y decepcionantes, debido a su falta de estabilidad, y de un efecto ubiquitario ligado a la ausencia de las relaciones dosis-efectos.
La solicitud de patente FR 2.411.174 da a conocer una secuencia de aminoácido -ALA-LYS-SER-GLN- que presenta una actividad biológica por inyección, útil para el sistema inmune de los seres humanos y de los animales.
La solicitud de patente EP 166 612 describe unos penta-péptidos derivados de la timopoietina, útiles en el tratamiento de las enfermedades que implican unas infecciones crónicas.
La presente invención tiene por objetivo, la obtención por síntesis química de unos derivados peptídicos de las hormonas tímicos, cuya estructura se ha orientado con el fin de asegurar una gran estabilidad físico-química, y una actividad farmacológica perfectamente definida.
Utilizando el conjunto de conocimientos adquiridos y desarrollados recientemente por nuestros equipos, con referencia al papel primordial de la epidermis en las defensas inmunitarias y sus relaciones con el timo (International Society of Development and Comparative Immunology), la presente invención tiene por objetivo, la preparación de derivados peptídicos de síntesis, cuya actividad fisiológica y terapéutica se orienta hacia la estimulación y la modulación de las defensas inmunitarias de la dermis y de la epidermis preferentemente a cualquier acción sistémica.
\newpage
Uno de los objetivos preferentes de la invención se refiere a la preparación por síntesis química de los metalopéptidos cuyas propiedades fisiológicas se orientan específicamente hacia la activación del sistema inmunitario cutáneo, y la estimulación de las funciones germinativas de las células basales de la epidermis con exclusión de cualquier efecto secundario sobre la inmunidad sistémica (general).
La presente invención tiene por objetivo la preparación de moléculas peptídicas, homólogas o derivadas de las secuencias peptídicas activas de las principales hormonas tímicas, "la timulina y la timopoietina".
Los numerosos ensayos clínicos efectuados con dichos mediadores hormonales no han permitido poner de manifiesto su interés terapéutico.
En efecto, utilizados en forma de preparaciones inyectables para el tratamiento de las deficiencias inmunitarias y de las afecciones auto-inmunes, todos los resultados han sido negativos, debido a su actividad ubiquitaria en función de las dosis administradas.
Parece que dichos efectos ubiquitarios están ligados a la estructura de dichos compuestos, obtenidos por síntesis, que no les permite fijarse normalmente sobre las globulinas y los receptores celulares, teniendo en cuenta su administración parenteral.
Debido a ello uno de los objetivos de la invención es la preparación de unos compuestos en forma de metalopéptidos obtenidos por síntesis, cuyas propiedades fisiológicas se orientan hacia la modulación del sistema inmunitario y la activación de las células germinativas de la epidermis, mediante las aplicaciones tópicas locales, según el principio farmacológico de las "relaciones-estructuras-actividades" (Principio de Hänch).
Más particularmente, la presente invención tiene por objeto una composición farmacéutica o cosmética que contiene por lo menos un conjugado peptídico que comprende una secuencia de por lo menos tres aminoácidos derivados de la secuencia total de la timulina o de la timopoietina, pudiendo estar los aminoácidos en forma D, L o DL, conjugándose dicha secuencia químicamente o físicamente con por lo menos un compuesto seleccionado de entre:
-
los ácidos monocarboxílicos de fórmula general
(I)HOOC-R
en la que R representa un radical alifático en C_{1}-C_{20}, lineal o ramificado, eventualmente sustituido, pudiendo presentar una o diversas insaturaciones,
así como los derivados alcohol o aldehído o amida de los ácidos de la fórmula I;
-
los ácidos dicarboxílicos de la fórmula general
(II)HOOC-R_{1}-COOH
en la que R_{1} representa un radical alifático divalente, que presenta por lo menos 3 átomos de carbono, preferentemente de 3 a 10 átomos de carbono, lineal o ramificado, principalmente un radical alquilo, alquileno, alquenileno o alquinileno, pudiendo presentar una o diversas insaturaciones eventualmente sustituido, principalmente por uno o diversos grupos amino, hidroxi, oxo o un radical alquilo en C_{1}-C_{3}, R_{1} pudiendo además formar un ciclo con una de las funciones ácidas.
Los conjugados según la invención son derivados de bajo peso molecular, que se obtienen principalmente en forma de sales, de ésteres o de amidas de los compuestos de la fórmula I o II.
De entre los compuestos de la fórmula I, se prefieren particularmente los ácidos carboxílicos, con una actividad metabólica esencial del ciclo tricarboxílico de Krebs, actuando a nivel de las mitocondrias, como coenzima de descarboxilación oxidativa, y cuyas propiedades son las de fijarse preferentemente mediante un enlace covalente sobre las funciones \varepsilon aminadas de determinados péptidos, en forma de lipo amidas, facilitando de este modo la presentación de los conjugados peptídicos, obtenidos según la invención, al receptor beta de clase G de las células de la epidermis.
Para dichos ácidos, y otros aptos para la puesta en práctica de la invención, R puede representar un radical alifático lineal o ramificado en C_{1}-C_{20}, principalmente en C_{1}-C_{4}, sustituido o no, principalmente por un radical alquilo, alquenilo o alquinilo, pudiendo presentar una o diversas insaturaciones y pudiendo estar sustituido por uno o diversos radicales seleccionados de entre el grupo que comprende:
NH_{2}, OH, oxo, tiol o un radical cíclico no aromático presentando de 5 a 6 átomos en el ciclo en el que 1 ó 2 pueden ser diferentes del carbono, en particular, S, O o N, pudiendo estar dichos ciclos sustituidos por unos radicales alquilo en C_{1} a C_{3}, principalmente metilo.
\newpage
En particular, cuando R representa una cadena alifática en C_{1}-C_{20}, puede estar sustituida por un ciclo seleccionado de entre
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\vskip1.000000\baselineskip
Otros compuestos de la fórmula I adaptados para la puesta en práctica de la invención son aquellos para los que, en la fórmula general I, R puede representar un radical monoinsaturado de configuración cis o trans, de la fórmula general
R_{2}-CH=CH-
en la que R_{2} puede representar un radical alquilo lineal o ramificado que comprende por lo menos 6 átomos de carbono, preferentemente 6 a 16 átomos de carbono, eventualmente sustituido por un grupo amino, hidroxi u oxo.
De forma ventajosa, en la fórmula II, R_{1} representa un residuo alquileno en C_{4}-C_{8} eventualmente sustituido.
Unos conjugados peptídicos según la invención son principalmente aquellos para los que el ácido de la fórmula general I se seleccionan de entre el ácido acético, el ácido piroglutámico, el ácido DL-lipoico, el ácido dihidrolipoico, la N-lipoil-lisina, los ácidos hidroxidecenoicos y decenoilicos, el ácido retinoico y sus derivados, el retinal y el retinol, el ácido mirístico y sus derivados, el ácido palmítico, en forma de sales, de ésteres o de amidas, o bien el ácido de la fórmula general II se selecciona de entre el ácido adípico, el ácido \alpha-amino adípico, el ácido pimélico, el ácido sebácico y sus derivados.
Los ácidos de las fórmulas generales I o II se seleccionan preferentemente de entre el ácido acético y sus derivados, el ácido piroglutámico, el ácido \alpha-DL-lipoico y sus derivados, el ácido dihidrolipoico, la N-Lipoil-Lisina, el ácido adípico, el ácido \alpha-amino-adípico, el ácido pimélico, el ácido sebácico y sus derivados, el ácido trans-10-hidroxi-\Delta2-decenoico y el ácido trans-oxo-9-deceno-2-oico, el ácido retinoico y sus derivados, el retinol, y el retinal, el ácido mirístico y el ácido palmítico.
La secuencia de aminoácidos de los conjugados según la invención contendrá una de las 3 secuencias siguientes:
Gln-Gly-Gly
Arg-Lys-Asp
Lys-Asp-Val
En efecto, más específicamente, la presente invención se refiere a la preparación de dos series de moléculas peptídicas cuyas actividades son complementarias, a nivel de las aplicaciones en los sectores de la medicina humana y la dermocosmética.
La presente invención se refiere preferentemente a unos conjugados peptídicos, derivados de la hormona tímica circulante, la timulina, y cuyas actividades fisiológicas se orientan hacia la maduración del sistema inmunitario y de los diferentes mediadores del sistema inmunitario cutáneo.
Dichos conjugados se orientan particularmente hacia el tratamiento de enfermedades auto-inmunes de la piel, y en particular, la prevención y el tratamiento de las alopecias ya sean de origen fisiológico (envejecimiento), traumáticas o patológicas.
La presente invención se refiere asimismo a la preparación de unos conjugados peptídicos, derivados de la hormona tímica celular, la timopoietina, y cuyas actividades fisiológicas se orientan igualmente hacia la maduración del sistema inmunitario de la piel, presentando al mismo tiempo una actividad preferente para la estimulación de los metabolismos, de las células de la epidermis, en particular de los queratinocitos germinativos, de los que estimulan las secreciones y las síntesis endocelulares de las moléculas de estructuras "queratinas de pesos moleculares bajos y queratoialinas".
Dicha serie de conjugados peptídicos está particularmente indicada para el tratamiento de las enfermedades de la piel, ligadas a unas deficiencias inmunitarias, y en particular al tratamiento preventivo y curativo del envejecimiento cutáneo de origen fisiológico (edad) o patológico.
\newpage
Preferentemente la secuencia de aminoácidos de los conjugados peptídicos derivados de la timulina responde a la fórmula general siguiente:
X-Gln-Gly-Gly-Y
en la que Gln representa la glutamina o un derivado de la glutamina, Gly representa la glicina o un derivado de la glicina; los derivados comprenden principalmente los derivados halogenados de los aminoácidos implicados. Los aminoácidos pueden estar en forma natural o no.
Según uno de los aspectos de la invención, los conjugados peptídicos presentarán por tanto la fórmula siguiente:
(III)A-X-Gln-Gly-Gly-Y
en la que A es un compuesto de fórmula general I o II tal como se ha definido anteriormente, en particular el ácido DL-lipoico, el ácido dihidrolipoico o la N-lipoillisina.
\vskip1.000000\baselineskip
- X representa:
Ser, Lys-Ser, Ala-Lys-Ser, Pyr-Ala-Lys-Ser, un enlace o
\quad
Glx-Ala-Lys-Ser
\hskip0.1cm
en la que Glx representa: Pyro-Glu, Glu o Gly y sus derivados
- Y representa:
Ser-Asn-OH
\quad
Ser-Asn-NH2
\quad
Ser-OH
\quad
Ser-NH2
\vskip1.000000\baselineskip
Los aminoácidos están en forma L, D o DL.
En las fórmulas que siguen, Pyr representa el ácido piroglutámico.
Preferentemente, los conjugados peptídicos de la fórmula III presentan una secuencia de por lo menos 4 aminoácidos, en particular de 4 a 9 aminoácidos, presentando la misma ventajosamente la secuencia Gln-Gly-Gly-Ser.
La presente invención se refiere más particularmente a los conjugados siguientes:
I
A-Pyr-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH_{2}
II
A-Pyr-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-NH_{2}
III
A-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH_{2}
IV
A-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-NH_{2}
V
A-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH_{2}
VI
A-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-NH_{2}
VII
A-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH_{2}
VIII
A-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-NH_{2}
IX
A-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH_{2}
X
A-Gln-Gly-Gly-Ser-NH_{2}
XXIII
A-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-OH
\vskip1.000000\baselineskip
A se ha definido anteriormente así como los derivados de dichas moléculas en forma de sales, de ésteres o de amidas.
Las secuencias de aminoácidos mencionados anteriormente pueden ser unas secuencias de aminoácidos naturales o no naturales.
Se precisa asimismo que los conjugados peptídicos mencionados anteriormente y que son el objeto de la presente invención, se pueden obtener en la forma terminal NH_{2} y en la forma terminal OH.
Asimismo, en determinados casos, es posible que algunos de dichos aminoácidos presenten unas funciones, por ejemplo, unas glicosilaciones.
Según otro aspecto, la invención se refiere a unos conjugados peptídicos derivados de la timopoietina y que responden a la fórmula general siguiente:
(IV)A-W-Lys-Asp-Z
en la que A es un compuesto de fórmula general I o II tal como se ha definido anteriormente o el radical correspondiente, y principalmente el ácido acético y sus derivados, el ácido \alpha-DL-lipoico y sus derivados, el ácido dihidrolipoico, la N-lipoil-lisina, el ácido adípico, el ácido \alpha-amino-adípico, el ácido pimélico, el ácido sebácico y sus derivados, el ácido trans-oxo-9-deceno-2-oico y el ácido trans-hidroxi-10-deceno-2-oico.
W representa:
Glu-Gln-Arg, Gln-Arg, Arg,
\quad
Arg-Lys-, Arg-Lys-Asp o un enlace
Z representa:
Val-Tyr-NH_{2}, Val-Tyr-OH
\quad
Val-NH_{2}, Val-OH, Tyr-OH, Tyr-NH_{2},
\quad
OH o NH_{2}
W y Z se seleccionan de tal modo que por lo menos una de las secuencias Arg-Lys-Asp o Lys-Asp-Val está presente en los compuestos de la fórmula IV, con la excepción de los conjugados de fórmula XI, XII, XIV, XV y XVI tal como se definen en la reivindicación 1.
Los conjugados peptídicos de la fórmula IV y que presentan la secuencia Arg-Lys-Asp-Val proporcionan unos resultados excelentes.
Los aminoácidos pueden estar en forma D, L o DL y pueden estar eventualmente glicosilados.
Unos conjugados peptídicos particularmente aptos, y cuyas actividades biológicas son complementarias de los conjugados peptídicos de la fórmula III, son los conjugados de la fórmula IV siguientes:
XVII
A-Lys-Asp-Val-Tyr-NH_{2}
XVIII
A-Lys-Asp-Val-Tyr-OH
XIX
A-Arg-Lys-Asp-Val-NH_{2}
XX
A-Arg-Lys-Asp-Val-OH
XXI
A-Arg-Lys-Asp-NH_{2}
XXII
A-Arg-Lys-Asp-OH
"A" se ha definido anteriormente así como los derivados de dichas moléculas en forma de sales, de ésteres o de amidas.
Las secuencias de aminoácidos mencionados anteriormente pueden ser unas secuencias de aminoácidos naturales o no naturales.
Se precisa asimismo que los conjugados peptídicos mencionados anteriormente se pueden obtener en forma terminal NH_{2} u OH.
Los conjugados según la invención pueden asimismo presentarse en forma de complejos moleculares con un metal, principalmente zinc.
Los conjugados según la invención podrán asimismo obtenerse por síntesis, mediante unas técnicas conocidas por los expertos en la materia.
Las síntesis de los péptidos libres pueden llevarse a cabo mediante las técnicas de MERRIFIELD, según dos procedimientos.
En un primer procedimiento, se utiliza un derivado de la Glutamina protegido en su función de amida \gamma por el "Mbh" 4,4-dimetoxibencidril.
En un segundo procedimiento, la síntesis se lleva a cabo sin la protección de la amida \gamma de los residuos de la Glutamina.
Utilizando el primer y el segundo procedimiento, la parte protegida C-terminal del dipéptido se asocia respectivamente al tetrapéptido protegido Ser-Gln-Gly y al hexapéptido protegido Ala-Lys-Gln-Gly-Gly.
De este modo, la preparación de los polipéptidos de secuencia
X-Gln-Gly-Gly-Y,
en la que Y representa Ser-Asn y X representa Ser o Ala-Lys-Ser, se lleva a cabo asociando el dipéptido protegido Ser-Asn con el péptido protegido X-Gln-Gly-Gly y por la eliminación consecutiva posible de los grupos
protectores.
Utilizando el segundo procedimiento, se obtiene por tanto el octapéptido Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn, mientras que utilizando el primer procedimiento, se prepara el mismo octapéptido a partir del hexapéptido Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn pasando por el heptapéptido Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn.
El octapéptido Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn permite por lo tanto preparar las dos formas, por asociación del primer residuo PyroGlu o Gln.
El procedimiento utilizado para asociar el residuo PyroGlu en la secuencia Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Y es el mismo sean cuales sean las posibles significaciones de Y, a saber Ser y Ser-Asn, y las significaciones posibles que de ella se derivan por la modificación de un ácido aminado, por ejemplo Ser-Asp, Ala-Asn.
Dicha asociación se obtiene de forma ventajosa por medio del derivado PyroGlu-OTcp en la secuencia Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Y, en la que determinados aminoácidos presentan la posibilidad de estar protegidos en su función en la cadena lateral.
Los derivados peptídicos que son el objeto de la presente invención y que se han descrito anteriormente, se pueden utilizar en su forma peptídica o en forma de conjugados, con los ácidos carboxílicos anteriormente descritos que responden a la fórmula general I.
Dichos mismos conjugados petídicos se pueden utilizar en forma de complejos moleculares con un metal.
El metal utilizado en la preparación de los complejos metalo-peptídicos de la presente invención es, por ejemplo, el zinc, en forma de ZnCl_{2} que se puede unir en forma de sal, con un grupo carboxílico del aminoácido terminal, en forma de complejos "peptídicos-Zn^{2}" en las proporciones siguientes del 0,5 al 5% preferentemente 1% de ZnCl_{2} por molécula peptídica.
Dichas proporciones son variables en función del peso molecular del conjugado peptídico.
El complejo metalo-peptídico se puede obtener principalmente en solución al 10% de ZnCl_{2}, para una molécula peptídica, después de calentamiento a una temperatura de 20ºC durante 10 minutos.
A continuación se purifica el complejo, por ejemplo sobre una columna de biogel P-2, y se eluye con agua destilada y liofilizada.
Se obtiene un coliofilizado estable conteniendo 1% de Zinc fijado sobre la molécula de péptido por afinidad.
El conjunto de los compuestos según la presente invención puede ser útil a título de medicamento.
En particular, los conjugados según la presente invención pueden servir para la preparación de un medicamento destinado a corregir las deficiencias del sistema inmunitario.
Unas composiciones farmacéuticas pueden contener por lo menos un conjugado según la invención y unos excipientes adaptados para la administración parenteral o por vía tópica externa.
Dichas composiciones pueden utilizarse tanto en el sector de la medicina humana como en la veterinaria, y son administrables por vía oral, o parenteral, pero preferentemente en forma administrable por vía tópica externa.
Unas composiciones particularmente aptas para la puesta en práctica de la invención son las que contienen el conjugado siguiente:
-
Pyr-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-OH
eventualmente en forma de complejo con un metal.
Los conjugados peptídicos que son el objeto de la invención, sus derivados y sus composiciones galénicas pueden estar presentes en forma de cremas, de leches, de lociones o de aerosol, y presentar unos excipientes conocidos y eventualmente otros principios activos.
Se pueden utilizar solos o en forma de asociaciones o de composiciones galénicas, para el tratamiento de las enfermedades auto-inmunes en los diferentes sectores de la dermatología.
La invención se refiere asimismo a la utilización de los conjugados peptídicos en dermocosmética y en cosmética.
La presente invención tiene, por tanto, por objeto unas composiciones galénicas farmacéuticas y cosméticas, que comprenden por lo menos uno de los conjugados peptídicos descritos anteriormente.
Los conjugados peptídicos de la invención, sus derivados y sus asociaciones con unos principios activos conocidos, se pueden utilizar en forma de preparaciones cosméticas y capilares, principalmente para el rejuvenecimiento y la renovación de las capas superficiales de la piel, y en particular para el tratamiento cosmético-capilar de la caída del cabello.
Los ejemplos que siguen están destinados a ilustrar la invención, y principalmente la actividad inmunoestimulante de los péptidos tímicos de síntesis administrados por vía tópica, sin limitar de ningún modo el alcance de la invención.
En los ejemplos, se hará referencia a las figuras siguientes:
Figura 1: Acción del ETF sobre la síntesis de ADN.
Figura 2: Acción del ETF sobre las células NK por vía tópica (células diana: YAC1). EL porcentaje de lisis se representa a los días 1, 3, 6, 9, 15, 18 y 21 de la inyección, para las diferentes proporciones células efectoras/células diana.
Figura 3: Acción del ETF sobre las células NK por vía tópica (células diana: P815).
Figura 4: Acción del ETF sobre las células NK in vitro. El porcentaje de lisis en función de la proporción células efectoras/células diana se proporciona para las diferentes dosis de ETF.
Figura 5: Acción del ETF sobre las células NK por vía inyectable. El porcentaje de lisis en función de la proporción células efectoras/células diana se representa después de la estimulación con 15 \mug de ETF, y para unos animales control.
Figura 6: Papel del interferón en la estimulación de las células NK por ETF por vía inyectable. El porcentaje de lisis se proporciona en función de la proporción células efectoras/células diana, en presencia o no de anti-interferón
Figura 7: Acción del ETF sobre las células NK por vía inyectable: cinética de la respuesta 1, 3 y 8 días después de la administración de 15 \mug ETF por vía intra-peritoneal.
Ejemplo Nº 1 Preparación del conjugado Nº II
A-Pyro-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-NH_{2}
A= ácido DL-lipoico
La síntesis se lleva a cabo según la metodología general descrita en las etapas siguientes:
1-
Boc-Gln-Gly-Gly-OMe
2-
Trifluoroacetato-Gln-Gly-Gly-OMe
3-
Z-Ser-NH-NH_{2}(But) -> Bop -> DIEA -> DMF
4-
Z-Ser-Glu-Gly-Gly-Ser-NH_{2}
5-
Ácido Lipoico -> BOP -> DIEA -> DMF
6-
Lipoil-Pyro-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-NH_{2}
Análisis HPLC de los aminoácidos
Asp-1,02; Ser-1,77; Glu-1,0; Gly-2,00; Ala-0,91
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo Nº 2 Preparación del conjugado Nº III
A-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH_{2}
A= ácido Adípico
La síntesis se lleva a cabo según la metodología general descrita en las etapas siguientes:
1-
Z-D-Ala-Lys-(Boc)-Ser(But) -> DMF
2-
Lys-(Boc)-Ser(But)-Gln(Mbh) -> DMF
3-
Gly-Gly-Ser (but)-Asn-O-But
4-
Me.OH -> CH_{3}COOH ->D-Ala-Lys(Boc)-Ser (But)- Gln (Mbh) -> Gly-Gly-Ser - Asn(But)
5-
Ácido adípico -> BOP -> DIEA
6-
Adipoil-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH_{2}
Análisis HPLC de los aminoácidos
Asp-1,02; Ser-1,77; Glu-1,0; Gly-2,00; Ala-0,91
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo Nº 3 Preparación del conjugado Nº I
A-Pyro-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH_{2}
A= ácido acético
Dicho conjugado se obtiene mediante la metodología descrita en el ejemplo 1 a partir del derivado:
Ala-Lys (Boc)-Ser(But-Gln-Mbh)-Gly-Gly-Ser(But)-Asn(But) descrito anteriormente.
Se obtiene un producto homogéneo por cromatografía en los solventes G y H, a un pH 2,3.
Análisis HPLC de los aminoácidos
Asp-0,97; Ser-1,67; Glu-1,84; Gly-2,00; Ala-0,98
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo Nº 4 Medición de la actividad sobre las células de langerhans Ia+ y los timocitos THY.1.2+ de la epidermis de ratones C57-BL/6 I- Resumen
Los queratinocitos de los ratones "C57-BL/6" estimulados con los derivados peptídicos de las hormonas tímicas liberan los mediadores (mensajeros celulares) tales como el ETAF, la IL1, y la IL6, que inducen una activación de la respuesta inmunitaria de las células inmunocompetentes de la epidermis, las células de Langerhans Ia+ y los Timocitos Thy 1.2+.
La medición de dicha activación mediante las técnicas de inmunofluorescencia es característica de la actividad inmunomoduladora de los péptidos tímicos.
II- Material y método 1- Muestras experimentales - Código: ETF
En solución en propilenglicol a (c) = 10^{-5} M/ml.
ETF - péptido - nº I
ETF - péptido - nº III
ETF - péptido - nº XV
ETF - péptido - nº XIX - ejemplo comparativo
Control = propilenglicol
2- Metodología
Unos ratones machos C57 - BL/6 de 5 a 7 semanas de edad, repartidos a razón de 4 por jaula, con libre acceso al agua y a la alimentación sometidos a un fotoperiodo de 12 horas de luz por 24 horas, reciben diariamente y durante 5 días consecutivos una aplicación tópica del péptido en propilenglicol (vol 50 \mul), sobre la cara dorsal de la oreja.
El día 6, se sacrifican los animales. Se procede a la extracción de las orejas con separación de la cara dorsal y de la cara ventral.
Los tejidos de la cara dorsal se sumergen en EDTA de Na (0,020 M) durante 2 h a una temperatura de 37ºC.
Después de la incubación, se extrae la epidermis en forma de hojas intactas fijada en acetona y rehidratada en PBS (tampón fosfato).
Las CED (células epidérmicas dendríticas) Thy 1-2+ y Ia + se identifican por doble marcaje en inmunofluorescencia indirecta.
El número de células por mm^{2} se determina, para cada hoja epidérmica, en las zonas periféricas de la misma superficie.
Las CED (células epidérmicas dendríticas) que presentan el marcador Ia+ se identificaron utilizando un anticuerpo monoclonal anti-Ia+.
Las hojas epidérmicas se fijan con acetona, a continuación se incuban durante 1 h a una temperatura 37ºC en presencia del anticuerpo monoclonal anti-Ia+ y se marcan por el método de la inmunoperoxidasa indirecta (kit).
Tras la incubación durante 10 minutos a una temperatura de 37ºC con una solución de amino-etil-carbazol, se lava la preparación con PBS.
Las CED Thy 1,2+ se identificaron por doble marcaje en inmunofluorescencia indirecta. Las hojas epidérmicas se fijaron con acetona y después se rehidrataron en PBS.
Los tejidos marcados simultáneamente con unos anticuerpos de ratón anti-Thy 1.2+ diluidos al 1:100 durante 16 h a una temperatura de 4ºC. Las muestras de tejidos se lavaron tres veces en PBS durante 60 min y después se incubaron 60 min a una temperatura de 37ºC, o bien con unos anticuerpos de cabra anti-ratón unidos a la rodamina, diluidos al 1:20, o bien con unos anticuerpos de cabra anti-conejo unidos a la fluoresceína (fluoresceína diluida al 1:20 en PBS. Los tejidos se lavaron a continuación en el PBS antes de montarlos tal como se ha descrito anteriormente).
Los controles presentaban unas hojas epidérmicas no marcadas con el anticuerpo primario e incubadas únicamente en presencia de los reactivos secundarios, con el fin de poner de manifiesto eventuales reacciones cruzadas con los anticuerpos conjugados con la rodamina y con la fluoresceína.
El número de células de Langerhans Ia+ o de CED Thy 1.2+ por milímetro cuadrado se determinó en cuatro zonas periféricas de igual superficie para cada hoja epidérmica, por inmunofluorescencia, al microscopio confocal Zeiss equipado para tal efecto. Se estudiaron por lo menos cuatro animales control en cada uno de los grupos. La densidad de las células de Langerhans Ia+ y de CED Thy 1.2 + se indica para cada medición.
3- Resultados
Los resultados resumidos en la tabla I muestran que ETF y sus homólogos, administrados por vía tópica a unos ratones C57/BL6 aumentan de forma altamente significativa, la actividad de las células residentes del sistema inmunitario.
Se observa principalmente un aumento significativo de los fenotipos de las células dendríticas epidérmicas de Langerhans Ia+ - (HLADR) a unas dosis de 0,1 a 1 nanogramos.
Paralelamente, se observa igualmente un aumento significativo de la actividad de los timocitos epidérmicos de fenotipo Thy 1.2+, es decir ETAF dependientes, a unas dosis idénticas.
La respuesta inmunitaria cutánea se encuentra bajo la dependencia de la actividad de los queratinocitos nucleados que secretan el ETAF y los mediadores de la inmunidad, es decir la 2ª señal sin la que no hay función inmunitaria fisiológica normal (Immuno-dermatologie L.D.H.). Se puede considerar que el ETF y sus homólogos, restablecen las funciones inmunitarias de la epidermis por activación de los queratinocitos de las capas basales de forma fisiológica, por oposición a la estimulación antigénica exógena.
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Resultados expresados sobre 4 lotes de 4 ratones C 57 BL/6
2 
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Ejemplo 5 Medición de la actividad ETF Nº IX sobre los queratinocitos de piel humana resultantes de un primocultivo I- Material y método 1- Modelo celular
Cultivo de los queratinocitos humanos normales
- Fuentes:
Cirugía mamaria
- Primocultivo:
Los tejidos recientemente biopsiados, en asepsia total, se digieren a una temperatura de +4ºC en la tripsina al 0,25% con el fin de separar la epidermis de la dermis.
La epidermis se disocia a continuación bajo una acción mecánica suave o enzimática con el fin de obtener unas células individualizadas. Únicamente las células basales serán capaces de multiplicarse in vitro.
El cultivo se lleva a cabo en atmósfera húmeda controlada (95% O_{2} - 5% CO_{2}) a una temperatura de 37ºC.
En un cultivo monocapa, la concentración en calcio se sitúa entre 0,05 y 0,1 mM. En dichas condiciones, los queratinocitos proliferan rápidamente pero no forman estratos. La síntesis de los queratinocitos se mantiene. Los espacios intersticiales son grandes: las conexiones celulares se aseguran mediante las microvellosidades y no mediante las "tight-junctions". Los tonofilamentos del espacio perinuclear son visibles pero no se han unido de nuevo a las placas de anclaje.
La estratificación se puede inducir mediante un aumento de la concentración final en calcio en el medio de cultivo hasta 1,2 mM. Entonces la formación de desmosomas aparece al cabo de 2 horas.
La tasa de sodio y de potasio intracelular aumenta a partir de la 12ª hora, además, no se bloquea por lo inhibidores clásicos del flujo Ca^{2+}/Na^{+}.
La estratificación vertical es visible al cabo de 2 días y la diferenciación terminal se consigue mediante unas células de envuelta cornificada. (Hennings et col., 1980)
2- Muestras analizadas
I-
Derivados ETF nº IX, liofilizado en dextrano (40 g/l) 10^{-6} M en un medio de cultivo final.
II-
Timopoietina Crist. SIGMA - 10^{6} M en un medio de cultivo final.
III-
Control: Dextrano 15.000 D - (40 g/l).
IV-
Proteínas celulares- Sol. de triturado celular de referencia a 50 microgramos por ml.
3- Metodología
El cultivo de queratinocitos humanos se lleva a cabo tal como se ha descrito por Henning y col. (1983) o Fuchs y col. (1981), Se efectúan asimismo unos cultivos en aire líquido según la metodología siguiente.
- Matriz de colágeno sobre una parrilla
Se incorpora el colágeno de tipo I o IV al medio de cultivo.
Se añaden a la solución unos fibroblastos 3T3 a la concentración de 1,5\cdot10^{5}/ml y se siembran en placas de petri de 35 mm que se colocan a continuación a una temperatura de 37ºC.
Después de la formación del gel, se añade de nuevo medio de forma que se recubren completamente las matrices. Los queratinocitos se siembran y se mantienen de este modo en un cultivo sumergido durante 7 días.
En dicha etapa se transfieren las matrices sobre unas parrillas de acero inoxidable. Dichas parrillas se colocan en unas cajas conteniendo medio de cultivo durante un periodo de 7a 24 días.
- Membrana basal artificial
Unas células endoteliales de córnea de buey se cultivan sobre unos filtros recubiertos de colágeno. Después de la estimulación con un factor de crecimiento de tipo FGF, dichas células secretan colágeno IV y laminina, así como otras moléculas que se depositan sobre el colágeno reconstituyendo de este modo una pseudo-membrana basal.
Después de la eliminación de las células endoteliales bovinas, los queratinocitos se siembran sobre dicho soporte.
- Dermis artificial
Unos fibroblastos se incorporan en un gel de colágeno. Después de la retracción del gel, los queratinocitos se siembran sobre dicha matriz.
- Membrana basal de la dermis
Se desepidermizan unos fragmentos de piel humana por inmersión durante 5 días en el PBS a una temperatura de 37ºC. Después de tal tratamiento de la epidermis se despega completamente sobre la membrana basal. Unas congelaciones y descongelaciones sucesivas mataran los fibroblastos. Dicho tejido, presentando la dermis y la basal, servirá de capa alimenticia para los queratinocitos.
3 
\hskip0.5cm
I = sumergido 
\hskip8cm
E= emergente 
\vskip1.000000\baselineskip
El control de diferenciación de la epidermis se realiza por microscopia electrónico (Prunieras, 1988), por un análisis bioquímico (Tinois y col., 1993) y por un análisis inmunológico (Woodcock y col., 1982, Prunieras, 1988). Dicha última puede utilizar unos anticuerpos anti-involucrina, anti-transglutamina epidérmica, anti-fillagrina y anti-queratinas (AE1, AE2, AE3).
Las queratinas 48 kD son los marcadores de la proliferación.
Las queratinas 50 y 58 kD son los marcadores permanentes de las queratinas.
Las queratinas 56,5 y 65/67 kD son los marcadores de la diferenciación.
Los marcadores celulares seleccionados son las queratinas de bajo peso molecular 46/47 kD específicos del crecimiento de las células germinativas y de su diferenciación celular.
Las filagrinas marcadoras de la queratoialina.
Marcaje fluorescente indirecto según la técnica de sandwich - 48 horas después del aporte de calcio al medio de cultivo (estratificación).
I -
\underline{Anticuerpos primarios "SIGMA"}
\quad
- Ac de rata antiqueratina humana 46-47 kD.
\quad
- Ac humano antiqueratina humana 56,5/68 kD.
\quad
- Ac humano antiqueratoialina (Filagrina).
II -
\underline{Anticuerpos secundarios "SIGMA"}
\quad
- Ac de ratón anti Ig G2 de rata marcados con FITC.
\quad
- Ac de cabra anti Ig G humana marcada con FITC.
\quad
* Dosificaciones microscópicas
\quad
- "Microscopio ZEISS Confocal Laser Scanner"
\quad
- Epi-fluorescent - LSM 310
\quad
- Medición de los marcadores celulares por inmunoflurescencia, con un registro gráfico.
\quad
* Dosificaciones espectrofluorimétricas
\quad
- Espectrofluorímetro Perkin Elmer LS-50 B''
\quad
- Sobre triturado sobrenadantes celulares.
\quad
* Dosificaciones de las proteínas celulares
\quad
- Técnica de LOWRY en el espectrofotómetro UV Perkin Elmer (Sobrenadantes de los triturados celula- {}\hskip0.26cm res).
II- Resultados
Las tablas nº II y III resumen la actividad del péptido nº IX "ETF" sobre el crecimiento de las células germinativas de las capas basales y suprabasales de la epidermis - "queratinocitos jóvenes".
La intensidad de la fluorescencia de las células tratadas con ETF nº IX se aprecia comparativamente a la intensidad de fluorescencia de los controles.
Se observa un aumento significativo de las células pre-queratinocitarias germinativas y de su actividad metabólica. En particular a nivel de las síntesis de queratina de bajo peso molecular y de las queratoialinas "Filagrinas", de estructuras similares a las de la médula del timo.
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TABLA II "Resumen" Acción del ETF sobre la síntesis queratinocitaria de la queratina 46-47 kD y de las proteínas celulares comparativamente con un control (expresados en microgramos/ml)
4 
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\vskip1.000000\baselineskip
TABLA III "Resumen" Acción del ETF sobre la síntesis queratinocitaria de la queratoialina y de las proteínas celulares comparativamente con un control (expresados en microgramos/ml)
5 
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Ejemplo Nº 6 Acción del ETF sobre los granulocitos "Mononuclear Phagocyte System" I- Introducción
La respuesta inmunitaria de la epidermis es dependiente de los queratinocitos y de las células de Langerhans, en asociación con otras líneas células "granulocitos-timocitos", etc...
Las células de Langerhans son considerablemente menos competentes para la fagocitosis que los queratinocitos, lo cual las diferencia formalmente de los macrófagos.
Son similares fenotípicamente y funcionalmente a las células "veladas" (Veiled Cells) de la linfa aferente y de las células interdigitalizadas de los nódulos linfáticos.
La acción de las células de Langerhans es el resultado de una cooperación celular, en particular con las células granulocitarias "fagocitos" bajo la dominante de los queratinocitos.
\newpage
Por lo tanto ha sido interesante apreciar la actividad del ETF, sobre la actividad fagocitaria de los granulocitos polimorfonucleados y de los sistemas celulares vecinos, principalmente las células NK (ENKAF, Epidermal Cell derived Natural Killer Activating Factor).
II- Acción del ETF sobre los granulocitos sanguíneos 1) Protocolo
Unas células polimorfonucleadas de sangre periférica humana (granulocitos neutrófilos), a una concentración de 10^{6} células/ml, se preincuban durante 20 min a una temperatura de 37ºC antes de la adición de luminolet de las partículas zymosan opsonizadas con suero.
La quimioluminiscencia se mide cada 3 minutos después de la adición del último reactivo. Los resultados representan una media de 5 medidas independientes para cada punto . (Desviación estándar inferior al 5% de media).
Se utilizan dos sistemas:
A: El Agente inductor es el péptido ETF nº 1 presente durante toda la duración del ensayo
Unos granulocitos normales de sangre periférica humana, enriquecidos por sedimentación en dextrano y desprovistos de los eritrocitos por lisis hipotónica. Se ensaya el ETF a unas concentraciones de 10, 1 y 0,1 \mug/ml.
B. El agente inductor ETF se elimina por el lavado después de la preincubación y antes de la adición de los reactivos quimioluminiscentes
Unos granulocitos normales de sangre periférica humana, purificados por decantación sobre dextrano y lisis hipotónica de los eritrocitos. Se incuba el ETF durante 20 min a una temperatura de 37ºC con los granulocitos y después se eliminan por el lavado antes de la adición de zymosan opsonizado y de luminol.
2 - Resultados: (los valores representan la media de 5 medidas)
Sistema A
6 
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\vskip1.000000\baselineskip
Sistema B
7
3 - Conclusiones
A.
ETF presenta un efecto considerable sobre la potenciación de la quimioluminiscencia a partir de los primeros instantes, a unas concentraciones de 10 y 1 \mug/ml.
B.
Incluso después del lavado, ETF induce una activación significativa de los granulocitos a 10 y 0,1 \mug/ml.
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Ejemplo 7 Acción del ETF sobre la síntesis del ADN I- Protocolo - Muestra péptido ETF nº VII
Un conjunto de células esplénicas de ratones normales se obtiene y se incuba en unas microplacas con ETF sólo a unas dosis crecientes. El ADN se dosifica a J1, J3, J5.
Los resultados se presentan en la figura 1.
II- Conclusiones
El ETF muestra una respuesta muy clara, proporcional a la dosis. La dosis más elevada utilizada (10 \mug/ml) proporciona la mayor síntesis del ADN en todos los días del control con un máximo al 3er día. Debe observarse, sin embargo, que los valores de base son superiores al 3er día, la respuesta específica es quizás en realidad más
precoz.
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Ejemplo 8 Acción del ETF sobre las células formantes de las colonias de lisis (PFC) I- Protocolo
Se inyectan por vía i.v, 50 ratones Balb/c que reciben 5 \mug de ETF por vía s.c. 108 GRM (glóbulos rojos de cordero) en 0,1 ml de PBS a los 20, 10 y 3 días después del ETF o 2 días antes. Técnica PFC de Cunningham y Szenberg.
II- Resultados
8
III- Conclusiones
Se observa una respuesta que presenta un máximo a J+4 con un aumento importante, muy significativo, del número de PFC en los animales que han recibido el ETF 10 días antes del antígeno.
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Ejemplo 9 Acción de ETF sobre las células NK I- Acción de ETF sobre las células NK - vía tópica 1- Protocolo general vía tópica
Ratones CBA/H (90 ratones)
Células diana
* YAC-1 sensibles a las NK
* P 815 no sensibles a las NK
* ETF nº VII
Los ratones reciben cada día por vía tópica 15 \mug de ETF en solución en propilenglicol al 10 ^{-5} M/ml, durante 14 días consecutivos. Se administra una dosis idéntica de recuerdo el 18º día.
La medición de la actividad lítica se realiza cada 3 días mediante recuento del ^{51}Cr liberado para unas proporciones de células efectoras: células marcadas de 200:1, 100:1, 50:1, 25:1, durante 4 horas de incubación.
Los resultados sobre las células NK por vía tópica se presentan en las figuras 2 y 3.
Los resultados son extremadamente claros. Se constata, en función del tiempo, después del inicio del tratamiento con ETF, un aumento altamente significativo de la actividad NK. Dicha actividad que es apreciable a partir del 3er día se vuelve muy importante al 6º y al 9º día y se mantiene a un nivel muy elevado durante todo la duración del experimento (21 días).
2- Conclusiones
No se ha apreciado ninguna citotoxicidad no específica sobre las células P 815 en ningún momento del experimento. Esto excluye que la administración del ETF conduzca a la inducción de células de naturaleza citolítica no específica o a la activación policlonal de células T citolíticas.
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II- Acción de ETF sobre las células NK - In vitro 1- Protocolo del ensayo "in vitro"
Células esplénicas normales de ratón CBA. Incubador a una temperatura de 37ºC + CO_{2}, 10^{7} células por ml de medio RPMI 1640 + 5% de suero bovino fetal. Incubación con unas cantidades variables de la sustancia a estudiar. Células diana YAC-1.
La medición de la lisis se realiza mediante recuento del ^{51}Cr liberado para unas proporciones de células efectoras/células diana de 200:1, 100:1, 50:1, 25:1, durante 4 horas de incubación.
Los resultados se presentan en la figura 4.
2- Conclusiones
ETF estimula muy fuertemente la actividad de las células NK in vitro de forma proporcional a la dosis.
A una concentración de 0,1 \mug/ml, la actividad del ETF resulta todavía muy superior a 25 \mug/ml de poli I:C.
(Actividad por lo menos 100 veces superior a la del producto de referencia poli I:C, inductor interferón).
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III- Acción de ETF sobre las células NK - vía inyectable I- Protocolo general vía inyectable
Ratones CBA/H de 4 a 5 meses (140 ratones)
Células diana
* YAC-1 sensibles a las NK (linfoma inducido/virus moloney)
* P 815 insensibles a las NK (DBA/2 mastocitona)
La sustancia a ensayar (ETF nº VII) se inyecta por vía i.p. en 0,2 ml de PBS, 24 horas antes del ensayo. La medición de la lisis se realiza mediante recuento del ^{51}Cr liberado para unas proporciones de células efectoras: diana de 200:1, 100:1, 50:1, 25:1, durante 4 horas de incubación.
2- Resultados NK/vía inyectable
Los resultados de la actividad de estimulación de las células NK por ETF se representan en la figura 5. Muestran una fuerte activación de las células NK, muy significativa (P< 0,01), en los animales que han recibido el ETF (15 mg/i.p.) en relación con los controles. No hay citotoxicidad no específica sobre las P 815.
En la figura 6, se observa que la activación de las células NK por ETF se debe a un efecto inductor del interferón. Se observa una reducción drástica de las células NK en el momento de la administración simultánea de anti-interferón (\alpha-IF).
La cinética de la respuesta de las células NK a los días 1, 3 ó 8 de la inyección en relación con un control PBS, se representa en la figura 7. La estimulación de las células NK por ETF es de corta duración por vía inyectable.
En los animales jóvenes (7 a 9 meses), ETF estimula a la vez las células NK y pre-NK de forma idéntica a unas dosis de tilorone de 1 mg por animal.
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Leyendas de las figuras
Figura 1:
ETF. Síntesis de ADN.
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Figura 2:
ETF. Células NK/vía tópica
\circ- - - - - - -\circ
\vtcortauna tratados/ETF
\bullet- - - - - - -\bullet
\vtcortauna controles
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Figura 3:
ETF. Células NK/vía tópica
\bullet- - - - - - -\bullet
\vtcortauna controles
\circ- - - - - - -\circ
\vtcortauna tratados
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 4:
ETF. Células NK "in vitro"
Comparación ETF 0,1 \rightarrow 100 \mug/ml
Con poli I:C 25 \mug/ml
\circ- - - - -\circ- - - -
\vtcortauna Poli I:C 25 \mug/ml (control +)
*- - - - - -*- - - -
\vtcortauna PBS (control -)
\bullet- - - - -\bullet- - - -
\vtcortauna ETF 0,1 \mug/ml
+- - - - -+- - - -
\vtcortauna ETF 1,0 \mug/ml
\Box- - - -\Box- - -
\vtcortauna ETF 10,0 \mug/ml
\Delta- - - - -\Delta- - - -
\vtcortauna ETF 100,0 \mug/ml
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 5:
ETF. Células NK vía inyectable
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 6:
ETF. Células NK vía inyectable
Papel del interferón en la estimulación de las células NK por ETF.
\newpage
Figura 7:
ETF. Células NK vía inyectable
Cinética de la respuesta NK ETF
Ensayo NK 1,3 ó 8 días después de 15 \mug ETF vía (i.p.)
\vskip1.000000\baselineskip
Bibliografía
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Claims (23)

1. Composición para la administración por vía tópica, caracterizada porque contiene:
(i) por lo menos un conjugado peptídico, que comprende una secuencia de por lo menos 3 aminoácidos derivados de una hormona tímica seleccionada de entre la timulina o de la timopoietina, pudiendo estar los aminoácidos independientemente en forma D, L o DL,
conjugándose dicha secuencia químicamente o físicamente con por lo menos un compuesto seleccionado de entre:
- los ácidos monocarboxílicos de fórmula general
(I)HOOC-R
en la que R representa un radical alifático en C_{1}-C_{20}, lineal o ramificado, eventualmente sustituido, pudiendo presentar una o diversas insaturaciones,
así como los derivados alcohol o aldehído o amida de los ácidos de la fórmula I;
- los ácidos dicarboxílicos de la fórmula general
(II)HOOC-R_{1}-COOH
en la que R_{1} representa un radical alifático divalente, que comprende por lo menos 3 átomos de carbono, preferentemente de 3 a 10 átomos de carbono, lineal o ramificado, principalmente un radical alquilo, alquileno, alquenileno o alquinileno, pudiendo presentar una o diversas insaturaciones eventualmente sustituido, principalmente por uno o diversos grupos amino, hidroxi, oxo o un radical alquilo en C_{1}-C_{3}, R_{1} pudiendo formar un ciclo con una de las funciones ácidas
(ii) en combinación con un excipiente farmacéuticamente y/o cosméticamente aceptable, adaptado para la administración por vía tópica externa,
y porque el conjugado presenta la fórmula general
(III)A-X-Gln-Gly-Gly-Y
en la que
A es un compuesto de fórmula general I o II o el radical correspondiente
- X representa: Ser, Lys-Ser, Ala-Lys-Ser, Pyr-Ala-Lys-Ser, un enlace o Glx-Ala-Lys-Ser
en la que Glx representa: Pyro-Glu, Glu o Gly y sus derivados
-Y representa:
Ser-Asn-OH
\quad
Ser-Asn-NH_{2}
\quad
Ser-OH
\quad
Ser-NH_{2}
estando los aminoácidos en forma D, L o DL, o el conjugado presenta la fórmula general
(IV)A-W-Lys-Asp-Z
en la que
A es un compuesto de fórmula general I o II o el radical correspondiente
W representa:
Glu-Gln-Arg, Gln-Arg, Arg,
\quad
Arg-Lys-, Arg-Lys-Asp o un enlace
\newpage
Z representa:
Val-Tyr-NH_{2}, Val-Tyr-OH
\quad
Val-NH_{2}, Val-OH, Tyr-OH, Tyr-NH_{2}
\quad
OH o NH_{2}
estando presente, por lo menos una de las secuencias Arg-Lys-Asp o Lys-Asp-Val,
estando los aminoácidos en forma D, L o DL.
con la excepción de los conjugados peptídicos de fórmula siguiente:
XI
A-Glu-Gln-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-NH_{2}
XII
A-Glu-Gln-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH
XIII
A-Gln-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-NH_{2}
XIV
A-Gln-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH
XV
A-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-NH_{2}
XVI
A-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH
2. Composición según la reivindicación 1, caracterizada porque en la fórmula general I, R puede representar:
- un radical monoinsaturado de configuración cis o trans, de la fórmula general
R_{2}-CH=CH-
en la que R_{2} puede representar un radical alquilo lineal o ramificado que comprende por lo menos 6 átomos de carbono, preferentemente de 6 a 16 átomos de carbono, eventualmente sustituido por un grupo amino, hidroxi u oxo.
- un radical alifático lineal o ramificado en C_{1}-C_{20}, sustituido o no, principalmente por un radical alquilo, alquenilo o alquinilo, pudiendo presentar una o diversas insaturaciones y pudiendo estar sustituido por uno o diversos radicales seleccionados de entre el grupo que comprende:
NH_{2}, OH, oxo, tiol o un radical cíclico no aromático que presenta de 5 a 6 átomos en el ciclo en el que 1 ó 2 pueden ser diferentes del carbono, en particular, S, O o N, pudiendo estar dichos ciclos sustituidos por unos radicales alquilo en C_{1} a C_{3}, principalmente metilo.
3. Composición según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque en la fórmula II, R1 representa un residuo alquileno en C4-C8 eventualmente sustituido.
4. Composición según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque los ácidos de la fórmula general I o II se seleccionan de entre el ácido acético y sus derivados, el ácido piroglutámico, el ácido DL-lipoico y sus derivados, el ácido dihidrolipoico y sus derivados, la N-lipoil-lisina, el ácido adípico, el ácido \alpha-amino-adípico, el ácido pimélico, el ácido sebácico y sus derivados, los ácidos grasos \alpha-mono-insaturados para los que "R2" representa un residuo alquilo, lineal o ramificado en C7, en particular los ácidos hidroxidecenoicos y decenoílicos.
5. Composición según la reivindicación 4, caracterizada porque los ácidos de la fórmula general I o II se seleccionan preferentemente de entre el ácido acético y sus derivados, el ácido piroglutámico, el ácido DL-lipoico y sus derivados, el ácido dihidrolipoico, el ácido N-lipoil-lisina, el ácido adípico, el ácido \alpha-amino-adípico, el ácido pimélico, el ácido sebácico y sus derivados, el ácido trans-10-hidroxi-\Delta2-decenoico y el ácido trans-oxo-9-decenoico.
6. Composición según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos está asociada al ácido o al derivado de fórmula I o II, en forma de sal, de éster o de amida.
7. Composición según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el conjugado se selecciona de entre los derivados peptídicos siguientes:
I
A-Pyr-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH_{2}
II
A-Pyr-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-NH_{2}
III
A-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH_{2}
\newpage
IV
A-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-NH_{2}
V
A-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH_{2}
VI
A-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-NH_{2}
VII
A-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH_{2}
VIII
A-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-NH_{2}
IX
A-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH_{2}
X
A-Gln-Gly-Gly-Ser-NH_{2}
XVII
A-Lys-Asp-Val-Tyr-NH_{2}
XVIII
A-Lys-Asp-Val-Tyr-OH
XIX
A-Arg-Lys-Asp-Val-NH_{2}
XX
A-Arg-Lys-Asp-Val-OH
XXI
A-Arg-Lys-Asp-NH_{2}
XXII
A-Arg-Lys-Asp-OH
XXIII
A-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-OH
siendo A un compuesto de fórmula I o II, o el radical correspondiente, y
pudiendo los aminoácidos estar en forma D, L o DL.
8. Composición según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque por lo menos una parte de los aminoácidos está en forma glicosilada.
9. Composición según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque por lo menos un conjugado se encuentra en forma de complejo metalopeptídico asociado químicamente o físicamente a una sal de Zinc.
10. Composición según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque contiene el conjugado siguiente:
Pyr-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-OH
11. Utilización de una composición según una de las reivindicaciones 1 a 10, para la preparación de un medicamento destinado a corregir las deficiencias del sistema inmunitario.
12. Utilización de un conjugado según una de las reivindicaciones 1 a 10, para la preparación de una composición destinada al tratamiento y a la prevención de la caída del cabello.
13. Composición según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque se trata de una preparación para utilización dermatológica, utilizable en forma de cremas, de leches, de lociones, de aerosoles, para administración tópica para el tratamiento preventivo y curativo de las alopecias.
14. Composición según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque se trata de una composición dermocosmética.
15. Composición según una de las reivindicaciones 1 a 10 ó 14, caracterizada porque se trata de una preparación dermocosmética o cosmética, para la utilización en cuidados de belleza y de rejuvenecimiento cutáneo en aplicaciones locales, utilizables en forma de cremas, de geles, de leches, de lociones y de aerosoles.
16. Composición según una de las reivindicaciones 1 a 10 ó 14, caracterizada porque se trata de preparaciones cosmético-capilares destinadas a la prevención y al tratamiento de la caída del cabello, aplicables localmente en forma de lociones, de aerosoles, y de ampollas liofilizadas, con un solvente, para aplicaciones locales.
17. Conjugado peptídico susceptible de incorporarse en una composición según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende una secuencia de por lo menos 3 aminoácidos derivados de la timulina, pudiendo los aminoácidos estar independientemente en forma D, L o DL,
conjugándose dicha secuencia químicamente o físicamente con por lo menos un compuesto seleccionado de entre:
- los ácidos monocarboxílicos de fórmula general
(I)HOOC-R
en la que R representa un radical alifático en C_{1}-C_{20}, lineal o ramificado, eventualmente sustituido, pudiendo presentar una o diversas insaturaciones,
así como los derivados alcohol o aldehído o amida de los ácidos de la fórmula I;
- los ácidos dicarboxílicos de la fórmula general
(II)HOOC-R_{1}-COOH
en la que R_{1} representa un radical alifático divalente que presenta por lo menos 3 átomos de carbono, preferentemente de 3 a 10 átomos de carbono, lineal o ramificado, principalmente un radical alquilo, alquileno, alquenileno o alquinileno, pudiendo presentar una o diversas insaturaciones eventualmente sustituido, principalmente por uno o diversos grupos amino, hidroxi, oxo o un radical alquilo en C_{1}-C_{3}, pudiendo R_{1} formar un ciclo con una de las funciones ácidas,
y porque presenta la fórmula general
(III)A-X-Gln-Gly-Gly-Y
en la que
A es un compuesto de fórmula general I o II o el radical correspondiente
- X representa: Ser, Lys-Ser, Ala-Lys-Ser, Pyr-Ala-Lys-Ser, un enlace o Glx-Ala-Lys-Ser
en la que Glx representa: Pyro-Glu, Glu o Gly y sus derivados
- Y representa:
Ser-Asn-OH
\quad
Ser-Asn-NH2
\quad
Ser-OH
\quad
Ser-NH2
estando los aminoácidos en forma D, L o DL.
18. Conjugado peptídico según la reivindicación 17, caracterizado porque en la fórmula general I, R puede representar:
- un radical monoinsaturado de configuración cis o trans, de la fórmula general
R_{2}-CH=CH-
en la que R_{2} puede representar un radical alquilo lineal o ramificado que comprende por lo menos 6 átomos de carbono, preferentemente de 6 a 16 átomos de carbono, eventualmente sustituido por un grupo amino, hidroxi u oxo.
- un radical alifático lineal o ramificado en C_{1}-C_{20}, sustituido o no, principalmente por un radical alquilo, alquenilo o alquinilo, pudiendo presentar una o diversas insaturaciones y pudiendo estar sustituido por uno o diversos radicales seleccionados de entre el grupo que comprende:
NH_{2}, OH, oxo, tiol o un radical cíclico no aromático presentando de 5 a 6 átomos en el ciclo en el que 1 ó 2 pueden ser diferentes del carbono, en particular, S, O o N, pudiendo estar dichos ciclos sustituidos por unos radicales alquilo en C_{1} a C_{3}, principalmente metilo,
en la fórmula general II, R_{1} representa un residuo alquileno en C_{4}-C_{8}, eventualmente sustituido.
19. Conjugado según una de las reivindicaciones 17 ó 18, caracterizado porque los ácidos de la fórmula general I o II se seleccionan de entre el ácido acético y sus derivados, el ácido piroglutámico, el ácido DL-lipoico y sus derivados, el ácido dihidrolipoico y sus derivados, la N-lipoil-lisina, el ácido adípico, el ácido \alpha-amino-adípico, el ácido pimélico, el ácido sebácico y sus derivados, los ácidos grasos \alpha-mono-insaturados para los que "R2" representa un residuo alquilo, lineal o ramificado en C7, en particular los ácidos hidroxidecenoicos y decenoílicos, tales como el ácido trans-10- hidroxi- \Delta2-decenoico y el ácido trans-oxo-9-decenoico.
20. Conjugado según una de las reivindicaciones 17 a 19, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos está ligada al ácido o al derivado de fórmula I o II, en forma de sal, de éster o de amida.
21. Conjugado según una de las reivindicaciones 17 a 20, caracterizado porque se selecciona de entre los derivados peptídicos siguientes:
I
A-Pyr-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH_{2}
II
A-Pyr-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-NH_{2}
III
A-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH_{2}
IV
A-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-NH_{2}
V
A-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH_{2}
VI
A-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-NH_{2}
VII
A-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH_{2}
VIII
A-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-NH_{2}
IX
A-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH_{2}
X
A-Gln-Gly-Gly-Ser-NH_{2}
XXIII
A-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-OH
siendo A un compuesto de fórmula I o II, o el radical correspondiente, pudiendo estar los aminoácidos en forma D, L o DL, pudiendo una parte de los aminoácidos estar en forma glicosilada.
22. Conjugado según una de las reivindicaciones 17 a 21, caracterizado porque se encuentra en forma de complejo metalo-peptídico asociado químicamente o físicamente a una sal de zinc.
23. Conjugado según una de las reivindicaciones 17 a 22, a título de medicamento.
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