ES2197125T3 - Proceso de elaboracion de un gel de plaquetas autologas y un equipo para realizar este proceso. - Google Patents

Proceso de elaboracion de un gel de plaquetas autologas y un equipo para realizar este proceso.

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Abstract

Proceso para la elaboración de un gel de plaquetas que consta de mezclar un concentrado de plaquetas con cloruro cálcico y batroxobina, en el que dicho concentrado de plaquetas se obtiene mediante un proceso compuesto por: I) el centrifugado de 40-50 ml de sangre venosa a 180 g durante 20 minutos, obteniendo de este modo dos fases: una oscura constituida por células rojas y blancas precipitadas al fondo de la probeta de la máquina centrifugadora y una clara visible en la parte superior de la misma probeta, que consta de plasma rico en plaquetas. II) el centrifugado del plasma rico en plaquetas recuperado a 580 g. durante 20 minutos que permite obtener la sedimentación de plaquetas en forma de "pellets" y un flotante líquido de plasma pobre en plaquetas; III) la suspensión de dichos pellets en una alícuota de dicho plasma pobre en plaquetas necesaria para obtener un concentrado de plaquetas de aproximadamente 6 ml.

Description

Proceso de elaboración de un gel de plaquetas autólogas y un equipo para realizar este proceso.
Sector de la invención
La presente invención se relaciona con un proceso de elaboración de un gel de plaquetas autólogas y un equipo para realizar este proceso.
Antecedentes de la invención
Marx y sus colegas han demostrado que el uso de un concentrado de plaquetas representa un método innovador de modulación y aceleración del proceso de curación de heridas, así como los procesos de regeneración ósea (Oral surg., Oral Med., Oral Path 1998, 85: 638-646). Por tanto, estos autores han elaborado una técnica que permite aislar y precipitar plaquetas, obteniendo de este modo un concentrado de plaquetas autólogas que no es tóxico ni inmunorreactivo. Dicha sustancia es capaz de perfeccionar los efectos de los factores de crecimiento contenidos en los gránulos de plaquetas, que son los que inician el camino metabólico correspondiente a las fases de curación de heridas.
Según el procedimiento de Marx, que abarca el uso de un separador celular, se elabora el concentrado de plaquetas extrayendo una muestra de sangre venosa de 500 ml, en concreto mediante una operación que se realiza con un catéter venoso. El concentrado de plaquetas se activa posteriormente con cloruro cálcico y trombina bovina para conseguir un gel de plaquetas que se puede combinar con tanto hueso autólogo esponjoso y cortical como matriz ósea compuesta por biovidrios.
La técnica de Marx para la activación de un gel de plaquetas no se puede llevar a cabo en Italia porque la trombina bovina ya no está disponible en el mercado. Además, este método, que implica el uso de cantidades de sangre muy importantes y exige una instrumentación específica y personal cualificado para la elaboración de concentrado de plaquetas, no se puede realizar en un clínico médico de forma que se permita un uso rutinario del gel de plaquetas.
En la USP 5.585.007 y WO 98/11925 se divulgan métodos de elaboración de gel de plaquetas. Estos métodos, aunque representan una mejora al compararse con el protocolo de Marx, puesto que necesitan unas cantidades de sangre muy inferiores (50-60 ml), requieren el uso de trombina bovina o humana para la formación de gel de plaquetas.
En la WO 96/27397 se divulga un concentrado de plasma/capa leucoplaquetaria (Buffy coat) combinado con trombina o batroxobina para formar un sellador de heridas de adhesivo plaquetario, con una indicación de la preferencia de trombina.
Problema técnico
Se apreciaba la necesidad de un proceso de elaboración de gel de plaquetas que no presentase las desventajas de los procesos del estado anterior de la técnica, asociado con el uso como activador de trombina humana o bovina.
Resumen de la invención
El solicitante ha encontrado inesperadamente que es posible superar la desventaja indicada, utilizando batroxobina en lugar de trombina como activador.
La presente invención se refiere, por tanto, a un proceso de elaboración de un gel de plaquetas que consta de la mezcla de un concentrado de plaquetas con una sal de calcio inorgánico u orgánico y batroxobina.
Otro objeto de la presente invención se refiere a un equipo para llevar a cabo el proceso de acuerdo con la presente invención que consta concretamente de:
a)
una cápsula estéril desechable de plástico transparente o cristal, dotada de un tapón de rosca cuya parte superior consta de una membrana perforable revestida de un revestimiento estéril adecuado, permitiendo dicha membrana perforable la inserción de la aguja de una jeringuilla que contiene el concentrado de plaquetas y evitando simultáneamente el contacto de aire con la parte interior de la cápsula;
b)
dos inyectores de pistón superpuestos sobre dicha membrana perforable que contienen respectivamente la sal cálcica y batroxobina.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 y 2 representan dos realizaciones preferentes del equipo de acuerdo con la presente invención.
En concreto, en estas tres figuras: (3) representa la cápsula estéril desechable, (4) el tapón de rosca cuya parte superior consta de una membrana perforable (5). (1) y (2) representan los dos inyectores de pistón que se superponen sobre dicha membrana perforable (5). Por último (6) representa la jeringuilla que contiene el concentrado de plaquetas y (7) el gel de plaquetas formado durante la reacción.
Descripción detallada de la invención 1. Condiciones operativas preferentes del proceso de acuerdo con la presente invención
Preferentemente la sal de calcio inorgánico utilizada en el proceso de acuerdo con la presente invención es cloruro cálcico, aunque en el caso de utilizar una sal de calcio orgánico, ésta sería gluconato cálcico, preferentemente. De acuerdo con una realización especialmente preferente, el proceso se realiza utilizando gluconato cálcico.
La sal de calcio inorgánico u orgánico tiene la forma de una solución acuosa que contiene cantidades de entre 5.10^{-5} y 0,5 M.
De acuerdo con una realización preferente del proceso de la presente invención, se utiliza 8.10^{-5}M (80\muM) de cloruro cálcico.
Una realización más preferente prevé el uso de 0,23 M de gluconato cálcico.
La batroxobina utilizada se presenta preferentemente en forma de una solución acuosa con una unidad internacional de trombina y es vendida por Ravizza Farmaceutici S.p.A. bajo la denominación comercial Botropase®.
2. Método de elaboración del concentrado de plaquetas
El concentrado de plaquetas utilizado en el proceso de acuerdo con la presente invención se elabora de sangre entera (muestra de 40-50 ml de sangre venosa) recogida en jeringuillas de 20 ml, que contienen 4 ml. de citrato sódico como anticoagulante) mediante una centrifugación de dos fases, obteniendo de este modo un producto intermedio de plasma rico en plaquetas. Este método permite recuperar al menos el 80% de las plaquetas presentes en la sangre entera.
En concreto esta técnica abarca los siguientes pasos. La sangre venosa se recoge en cuatro probetas y se centrífuga a 180 g. durante 20 minutos. Este tratamiento proporciona dos fases: una oscura constituida por células rojas y blancas precipitadas al fondo de las probetas y una clara visible en la parte superior de la sonda, que consta de plasma rico en plaquetas. Este plasma se recoge y se transfiere mediante una pipeta Pasteur a otras cuatro probetas y se centrifuga a 580 g. durante 20 minutos. Gracias a esta centrifugación más rápida (580 g. contra 180 g.) es posible conseguir la sedimentación de plaquetas como fondo denso, denominado ``pellet''. El flotante líquido consta de plasma pobre en plaquetas.
Las probetas se vacían, dejando sin embargo en cada uno de ellas una pequeña alícuota (1,5 ml) de plasma pobre en plaquetas necesaria para suspender de nuevo el ``pellet'', obteniendo de este modo una suspensión homogénea.
Este procedimiento permite obtener un concentrado final de plaquetas (de aproximadamente 6 ml) derivado de la unificación de las suspensiones de plaquetas presentes en las cuatro probetas.
Después de un periodo de descanso de unos 15 minutos a temperatura ambiente, el concentrado está preparado para ser utilizado como reactivo en el proceso de acuerdo con la presente invención.
3. Membranas obtenidas con el proceso de acuerdo con la presente invención
Mediante el proceso de acuerdo con la presente invención es posible preparar una membrana que puede contener, aparte del gel de plaquetas, principios activos como agentes antibacterianos, desinfectantes y/o excipientes estériles etc.
Preferentemente esta membrana consta esencialmente del gel de plaquetas autólogas preparado con el proceso de acuerdo con la presente invención.
Estas membranas se obtienen simplemente eliminando el exceso de líquido.
Por ejemplo, si se utilizan platos Petri de plástico o cristal (como los que se usan en cultivos celulares) para la elaboración de gel de plaquetas, es posible conseguir una membrana fina, puesto que el gel toma la forma del recipiente durante la activación.
En este caso, la eliminación del líquido sobrante liberado durante la formación de gel, por ejemplo mediante una pipeta Pasteur, permite obtener una membrana flexible con un contorno bien definido.
El líquido sobrante extraído, que consta de batroxobina y sal cálcica, se añade al plasma pobre en plaquetas procedente de la segunda centrifugación y determina después de 20-30 minutos la formación de un gel adicional rico en plaquetas.
4. El equipo de acuerdo con la presente invención
Las Figuras 1 y 2 representan una realización preferente del equipo de acuerdo con la presente invención.
En estas Figuras (3) representa la cápsula desechable estéril, (4) el tapón de rosca cuya parte superior consta de una membrana perforable (5). Dicha membrana está revestida de un revestimiento estéril de uso habitual en la industria farmacéutica y diagnóstica, tal como una película de aluminio u otro material equivalente. (1) y (2) representan los dos inyectores de pistón que se sobreponen en dicha membrana perforable (5) y que contienen respectivamente la sal de calcio inorgánico u orgánico (más preferentemente 0,23 M gluconato cálcico) y batroxobina. Por último (6) representa la jeringuilla que contiene el concentrado de plaquetas y (7) el gel de plaquetas que se forma durante la reacción. La presión manual en el inyector de pistón (1) permite la salida a la cápsula (3) de gluconato cálcico en cantidades de entre 0,3 y 0,5 ml. De forma análoga una presión manual en el inyector de pistón (2) permite la salida de batroxobina en cantidades de entre 0,3 y 0,5 ml. La cápsula (3) mostrada en la Figura 1 tiene preferentemente una capacidad de entre 10 y 20 ml, y la misma cápsula del equipo mostrado en la Figura 2 permite la obtención de membranas de un diámetro de entre 3 y 9 cm, puesto que la cápsula puede tener un diámetro de entre 3,5 y 10 cm.
El proceso de acuerdo con la presente invención llevado a cabo con dicho equipo se compone de las siguientes fases:
A) carga de una jeringuilla de 10 ml (6) con una cantidad de concentrado de plaquetas entre 3 y 9 ml;
B) extracción del revestimiento estéril de la membrana perforable (5) e introducción de la aguja de la jeringuilla en la cápsula (3) a través de la membrana perforable (5);
C) presión en rápida sucesión de los inyectores de pistón (1) y (2) que contienen respectivamente el gluconato cálcico y la batroxobina y el pistón de la jeringuilla (6) dentro de la cápsula (3);
D) agitación suave de la cápsula (3) con una remoción rotativa durante unos 30 segundos;
E) desenroscado del tapón de rosca (4) y extracción del gel de plaquetas (7) formado de este modo.

Claims (11)

1. Proceso para la elaboración de un gel de plaquetas que consta de mezclar un concentrado de plaquetas con cloruro cálcico y batroxobina, en el que dicho concentrado de plaquetas se obtiene mediante un proceso compuesto por: i) el centrifugado de 40-50 ml de sangre venosa a 180 g durante 20 minutos, obteniendo de este modo dos fases: una oscura constituida por células rojas y blancas precipitadas al fondo de la probeta de la máquina centrifugadora y una clara visible en la parte superior de la misma probeta, que consta de plasma rico en plaquetas. ii) el centrifugado del plasma rico en plaquetas recuperado a 580 g. durante 20 minutos que permite obtener la sedimentación de plaquetas en forma de ``pellets'' y un flotante líquido de plasma pobre en plaquetas; iii) la suspensión de dichos pellets en una alícuota de dicho plasma pobre en plaquetas necesaria para obtener un concentrado de plaquetas de aproximadamente 6 ml.
2. Proceso de elaboración de un gel de plaquetas que consta de mezclar un concentrado de plaquetas con una sal de calcio orgánico o inorgánico y batroxobina, en el que se obtiene dicho concentrado de plaquetas mediante un proceso compuesto por: i) el centrifugado de 40-50 ml de sangre venosa a 180 g durante 20 minutos, obteniendo de este modo dos fases: una oscura constituida por células rojas y blancas precipitadas al fondo de la probeta de la máquina centrifugadora y una clara visible en la parte superior de la misma probeta, que consta de plasma rico en plaquetas. ii) el centrifugado a 580 g. durante 20 minutos que permite obtener la sedimentación de plaquetas en forma de ``pellets'' y un flotante líquido compuesto por plasma pobre en plaquetas; iii) la suspensión de dichos pellets en una alícuota de dicho plasma pobre en plaquetas necesaria para obtener un concentrado de plaquetas de aproximadamente 6 ml.
3. Proceso de acuerdo con la reivindicación 2 en el que dicha sal orgánica es gluconato cálcico.
4. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en el que la sal cálcica tiene la forma de una solución acuosa que la contiene en cantidades de entre 5.10^{-5} y 0,5 M.
5. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4 en el que se utiliza 8.10^{-5} (80 \mum) de cloruro cálcico.
6. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en el que se utiliza 0,23 M de gluconato cálcico.
7. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la batroxobina tiene una unidad internacional de trombina /ml.
8. Equipo para llevar a cabo el proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, compuesto por: a) una cápsula (3) estéril desechable de plástico transparente o cristal, dotada de un tapón de rosca (4) cuya parte superior consta de una membrana perforable (5) revestida de un revestimiento estéril adecuado, permitiendo dicha membrana perforable (5) la inserción de la aguja de una jeringuilla (6) que contiene el concentrado de plaquetas y evitando simultáneamente el contacto de aire con la parte interior de la cápsula (3); b) dos inyectores de pistón (1) y (2) sobrepuestos a dicha membrana perforable (5) que contienen respectivamente la sal cálcica y batroxobina.
9. Equipo de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la capacidad de la cápsula (3) es entre 10 y 
\hbox{20
ml.}
10. Equipo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 y 9 en el que la cápsula tiene un diámetro de entre 3,5 y 10,0 cm. que permite obtener una membrana con un diámetro de entre 3 y 9 cm.
11. Proceso de elaboración de un gel de plaquetas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, llevado a cabo con el equipo de acuerdo con la reivindicación 8, compuesto por los siguientes pasos:
A)
carga de una jeringuilla de 10 ml (6) con una cantidad de concentrado de plaquetas entre 3 y 9 ml;
B)
extracción del revestimiento estéril de la membrana perforable (5) e introducción de la aguja de la jeringuilla (6) en la cápsula (3) a través de la membrana perforable (5);
C)
presión en rápida sucesión de los inyectores de pistón (1) y (2) que contienen respectivamente 0,23 M de gluconato cálcico en 0,3-0,5 ml de agua y 0,3-0,5 ml de batroxobina con una concentración de una unidad internacional de trombina /ml y el pistón de la jeringuilla (6) dentro de la cápsula (3);
D)
agitación suave de la cápsula con una remoción rotativa durante unos 30 segundos (3);
E)
desenroscado del tapón de rosca (4) y extracción del gel de plaquetas (7) formado de este modo;
en el que el concentrado inicial de plaquetas se obtiene mediante un proceso compuesto por:
i)
el centrifugado de 40-50 ml de sangre venosa a 180 g durante 20 minutos, obteniendo de este modo dos fases: una oscura constituida por células rojas y blancas precipitadas al fondo de la probeta de la máquina centrifugadora y una clara visible en la parte superior de la misma probeta, que consta de plasma rico en plaquetas;
ii)
centrifugado del plasma rico en plaquetas a 580 g. durante 20 minutos que permite obtener la sedimentación de plaquetas en forma de ``pellets'' y un flotante líquido de plasma pobre en plaquetas;
iii)
suspensión de dichos pellets en una alícuota de dicho plasma pobre en plaquetas necesaria para obtener un concentrado de plaquetas de aproximadamente 6 ml.
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