ES2197150T3 - Anticuerpos contra p-selectina y sus utilizaciones. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A COMPOSICIONES Y METODOS PARA TRATAR ESTADOS INFLAMATORIOS Y OTROS TRASTORNOS PATOLOGICOS, USANDO NUEVOS ANTICUERPOS DE P-SELECTINA DE BLOQUEO, QUE INHIBEN LA FIJACION O UNION DE UN ANTICUERPO SECRETADO POR UNA LINEA CELULAR DESIGNADA "ATCC ACCESSION NO. HB11041 A P-SELECTINA" SEGUN SE HA MEDIDO POR UN ENSAYO DE INHIBICION COMPETITIVO.

Description

Anticuerpos contra P-Selectina y sus utilizaciones.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para tratar inflamaciones y otras condiciones patológicas mediadas por la adhesión intercelular. En particular, se refiere a la inhibición e la adhesión celular usando nuevas inmunoglobulinas que reaccionan con epítopos funcionales en una P-Selectina receptora de la superficie celular (CD62, proteína-140 de membrana de gránulo [GMP-140]/activación de plaquetas dependiente de la membrana externa de gránulo [PADGEM]/LECCAM-3, implicada en la adhesión intercelular.

Una P-Selectina receptora de la superficie celular especializada, también conocida como GMP-140, está implicada en el reconocimiento de varias células circulantes por parte de las células endoteliales vasculares y plaquetas. La P-Selectina es una glicoproteína de superficie con un dominio parecida a lectina, una región con homología con el factor de crecimiento epidérmico, y una región con homología con las proteínas reguladoras de complemento (ver, McEver, Blood Cells 16:73-83 (1990)).

La estructura de la P-Selectina es similar a la de otros dos receptores de la superficie de células vasculares, la molécula de adhesión de leucocitos endotelial (ELAM-1) y el receptor buscador de blancos de linfocitos (LHR). El término ``selectina'' ha sido sugerido para esta clase general de receptores a causa de su dominio parecido a lectina y la naturaleza selectiva de sus funciones adhesivas.

Estos receptores de la superficie celular se expresan en una variedad de células. La P-Selectina está presente sobre la superficie de plaquetas y células endoteliales en respuesta a una variedad de estímulos, en donde media en la interacciones plaqueta-leucocito y endotelio-leucocito. ELAM-1 se expresa sólo sobre células endoteliales, y LHR se expresa sobre una variedad de leucocitos y venillas endoteliales de nodos linfáticos periféricos.

El rol de las selectinas en la inflamación indica que los compuestos capaces de inhibir su acción podrían ser útiles como agentes anti-inflamatorios. Los anticuerpos contra la P-Selectina han sido descritos (Ver, por ejemplo, la patente estadounidense nº 4.783.330, la solicitud de PCT nº US90/06101, la solicitud de PCT nº FR90/00565, y McEver et al., J. Biol. Chem. 259:9799-9804 (1984)). Además, un anticuerpo contra la P-Selectina ha sido descrito en las presentaciones en el Instituto Scripps, La Jolla, California y en el Keystone Colloquium celebrado el 16 de enero de 1992. Algunos de estos anticuerpos que bloquean la adhesión mediada por P-Selectina dependen del Ca\++.

La P-Selectina se expresa sobre células endoteliales y sobre plaquetas. La expresión de la P-Selectina es inducible y no se expresa en células endoteliales o plaquetas desactivadas. La expresión de la P-Selectina no requiere su síntesis de novo, puesto que se almacena en gránulos secretores (o cuerpos de Weibel-Palade), tanto en plaquetas como en células endoteliales. Por tanto, en los minutos siguientes a la activación de uno de ambos tipos de células por parte de la trombina, histamina, o ésteres de forbol, u otros factores humorales, la P-Selectina es rápidamente redistribuida sobre la superficie de la célula, donde puede adherirse a neutrófilos, monocitos, y otra células.

Hay evidencia de que la P-Selectina reconoce el Le\x como un ligando de alta afinidad (Larsen et al., Cell 63:467-474 (1990)). Se han realizado experimentos adicionales que muestran que un oligosacáridos que contenga SLe\x es un inhibidor más potente de la adhesión mediada por P-Selectina que el Le\x (Polley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:6224-6228 (1991)). Estos experimentos proporcionan una comprensión limitada de la especificidad de ligando de la P-Selectina in vitro. Hay varios informes que muestran que la P-Selectina une neutrófilos, monocitos, y cierta células de carcinoma (Bevilacqua et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:9238-9242 (1987); Geng et al., Nature 343:757-760 (1990); Larsen et al., Cell 63:467-474 (1990); y Polley et al., Id.). No obstante, hay poca información concerniente al papel preciso de la P-Selectina en el reclutamiento de leucocitos in vivo.

Por tanto, no está claro el perfil terapéutico, es decir, si serían efectivas o no in vivo, y en el tratamiento de qué enfermedades podrían usarse, de los anticuerpos anti-P-Selectina de la técnica previa. La técnica previa carece de evidencia que muestre el tratamiento efectivo de enfermedades inflamatorias usando anticuerpos contra la P-Selectina.

J. G. Geng et al. (Nature vol. 343, 1990) descubrieron el uso de anticuerpos monoclonales anti-GMP-140 G1, G2, y S12 y W40 para identificar células Cos transfectadas con GMP-140. El artículo muestra que el anticuerpo G1 bloquea la adhesión de las células HL60 a las células Cos transfectadas con GMP-140. La adhesión de leucocitos a células Cos transfectadas con GMP-140 es inhibida también por el G2, pero no por el S12 o W40, sugiriendo que estos dos anticuerpos reconocen epítopos no esenciales para la unión de leucocitos.

S. Parmentier et al. (Blood, vol. 77, 1991) describen la producción de un anticuerpo monoclonal (LYP20) contra la GMP-140. Este anticuerpo se une específicamente a plaquetas estimuladas por trombina en comparación con células control, e inhibe la agregación inducida por colágeno o trombina de plaquetas lavadas o plaquetas en plasma rico en plaquetas. El número de sitios de unión del LYP20 sobre las plaquetas activadas por trombina fue similar al observado para S12 o KC4. Sin embargo, los autores concluyeron que el S12 y el LYP30 no estaban dirigidos contra el mismo epítopo.

E. Larson et al. (Cell, vol. 59, 1989) está relacionado con la proteína PADGEM. Los autores muestran que la proteína comparte homología no sólo estructural sino también funcional con la ELAM-1 y MEL-14, miembros de una nueva familia de moléculas de adhesión de células vasculares. El artículo discute el uso de anticuerpos anti-PADGEM para ver si bloquean la unión plaquetas-HL60.

G. I. Johnston et al. (Cell, vol. 56, 1989) está relacionado con la clonación de la GMP-140. Los autores descubren los dominios de la proteína y concluyen que es similar en estructura a la ELAM-1, sugiriendo por tanto que la GMP-140 pertenece a una familia de receptores inducibles con estructura relacionada y función de células vasculares.

T. M. Carlos et al. (Immunol. Reviews, vol. 114, 1990) proporcionan un artículo de revisión general sobre las proteínas de adhesión fagocito-endotelio. La revisión contiene una sección sobre terapia anti-adhesión de desórdenes inflamatorios, la cual discute las ventajas de bloquear la interacción de células y lista los tipos de condiciones que podrían tratarse.

La solicitud de patente internacional WO-91/06632 concierne a la inhibición de la unión celular mediada por PADGEM. Descubre el uso de agentes solubles que inhiben competitivamente la unión de células endoteliales a monocitos, bien uniendo PADGEM sobre las células endoteliales, bien uniendo ligando específico para la PADGEM sobre el monocito.

La solicitud de patente internacional WO-92/01718 concierne a péptidos y ligandos para la GMP-140, y descubre un péptido que tiene una secuencia idéntica a la SEQ. Nº ID. 1 de la presente invención. Este péptido procede de la región de unión de lectina de la GMP-140. En ese documentos no hay enseñanzas sobre la producción o uso de anticuerpos contra la GMP-140.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un anticuerpo que bloquea la P-Selectina que inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo secretado por una línea celular, denominada ATCC número de acceso HB11041, a la P-Selectina, medida mediante un ensayo de inhibición competitiva. Los anticuerpos de la invención bloqueadores de la P-Selectina se unen a la P-Selectina en ausencia de Ca\++.

La presente invención proporciona también composiciones farmacéuticas, que comprenden los anticuerpos descritos más arriba, en procedimientos para tratar enfermedades inflamatorias usando estas composiciones farmacéuticas. La lesión pulmonar aguda y la lesión por isquemia-reperfusión son ejemplos de enfermedades inflamatorias y trombóticas tratables mediante la presente invención, tal como se describe con más detalle más abajo.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 presenta datos que muestran que las inmunoglobulinas anti-inflamatorias de la invención inhiben la unión de plaquetas activadas por trombina a neutrófilos.

Las Figuras 2A y 2B muestran que las inmunoglobulinas anti-inflamatorias de la invención efectivamente impiden la lesión pulmonar inducida por la infusión del factor de veneno de cobra (CVF), tal como se midió mediante permeabilidad (Figura 2A) y hemorragia (Figura 2B).

Las Figuras 3A y 3B muestran que el contenido de expresión de P-Selectina en los pulmones de animales se regula en respuesta a la infusión del veneno de cobra, visualizada mediante tinción de la PB1.3 con peroxidasa de rábano silvestre. Los paneles (a)-(d) muestran la expresión de la P-Selectina en venillas pulmonares en varios momentos posteriores a la infusión de CVF; tiempo 0 (a); 5, 10 y 15 minutos, respectivamente paneles b, c y d (Figura 3A). La Figura 3B son micrografías ópticas y electrónicas de transmisión de la lesión pulmonar aguda inducida por CVF en ratas tratadas con 200 \mug de anticuerpo no bloqueador (PNB1.6) (paneles a.c) o con anticuerpo bloqueador de la P-Selectina (PB1.3) contra la P-Selectina (paneles b.d). En los animales tratados con PNB1.6, la lesión vascular se indica mediante hemorragia intra-alveolar extensiva (panel a), asociada con agregados intravasculares de neutrófilos (panel c, flechas) en estrecho contacto con las células endoteliales. Por contra, en los animales tratados con PB1.3 la hemorragia intra-alveolar estaba ausente (panel b) y los neutrófilos intravasculares mostraban poco contraste con el endotelio (panel d, flechas). (Paneles a y b, secciones impregnadas en plástico teñidas con azul de toluidina, \times160; paneles c y d, acetato de uranilo, teñidas con citrato de plomo, \times2250).

La Figura 4 muestra la unión del anticuerpo monoclonal PB1.3 a la P-Selectina: efecto de quelar cationes divalentes con EDTA. En la representación, los símbolos vacíos (trazo inferior) corresponden a la unión en presencia de Ca\++ y Mg\++, mientras que los símbolos rellenos (trazo superior) corresponden a la unión en presencia de EDTA. El anticuerpo mostrado se diluyó a 1,6 mg/ml.

La Figura 5 muestra el efecto del péptido CQNRYTDLVAIQNKNE (SEQ. Nº ID: 1) sobre la unión del PB1.3 a la P-Selectina. Los símbolos rellenos son en presencia de 0,35 mg/ml de péptido, los símbolos vacíos son en ausencia de péptidos. Las diluciones indicadas de PB1.3 se obtuvieron a partir de una solución 1,6 mg/ml.

Las Figuras 6A, 6B y 6C muestran la capacidad de los anticuerpos monoclonales para bloquear de forma cruzadas la P-Selectina. Los anticuerpos bloqueadores estaban presentes a 50 \mug/ml. Las diluciones de anticuerpos biotinilados mostrado eran de 1,6 mg/ml PB1.3, 0,87 mg/ml PNB1.6, y 0,59 mg/ml 84/26.

La Figura 7 muestra que el alcance de la agregación de plaquetas inducida por trombina es equivalente, bajo condiciones control, en ausencia de anticuerpo y en presencia de concentraciones crecientes (1-100 \mug/ml) de anticuerpo PB1.3 purificado.

La Figura 8 muestra que la extensión de la isquemia de miocardio, expresada como porcentaje del área con riesgo, es significativamente inferior en animales tratados con el anticuerpo bloqueador anti-P-Selectina (PB1.3) que en animales tratados con el anticuerpo anti-P-Selectina no bloqueador. Más aún, la capacidad de los anillos de la arteria coronaria para relajarse en respuesta a la acetilcolina es significativamente mayor en animales tratados con PB1.3 que en los tratados con PNB1.6. Que estos fenómenos son atribuibles a una reducción en la acumulación de leucocitos es sugerido por el número reducido de PMN que se unen al endotelio de la arteria coronaria en animales tratados con PB1.3 en comparación con los animales tratados con PNB1.6.

Figura 9 (SEQ Nº ID: 23): secuencia de ADN y su traducción del cADN de la región A: gamma 1 de la línea germinal G-E-A de inmunoglobulina humana.

La Figura 10 (SEQ Nº ID: 4-5) muestra la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos del dominio constante de la cadena ligera de la inmunoglobulina kappa humana.

La Figura 11 (SEQ Nº ID: 6-7) muestra la secuencia y la traducción del péptido señal y la región variable de la cadena pesada de PB1.3.

La Figura 12 (SEQ Nº ID: 8-9) muestra la secuencia y la traducción del péptido señal y la región variable de la cadena ligera de PB1.3.

La Figura 13 (SEQ Nº ID: 10-11) muestra la secuencia y la traducción del péptido señal y la región variable de la cadena-A pesada de PB1.3/humanizado.

La Figura 14 (SEQ Nº ID: 12-13) muestra la secuencia y la traducción del péptido señal y la región variable de la cadena-B pesada de PB1.3/humanizado.

La Figura 15 (SEQ Nº ID: 16-17) muestra la secuencia y la traducción del péptido señal y la región variable de la cadena-A ligera de PB1.3/humanizado.

La Figura 16 (SEQ Nº ID: 18-19) muestra la secuencia y la traducción del péptido señal y la región variable de la cadena-B ligera de PB1.3/humanizado.

La Figura 17 (SEQ Nº ID: 14-15) muestra la secuencia y la traducción del péptido señal y la región variable de la cadena-C pesada de PB1.3/humanizado.

La Figura 18 muestra los cambios en el volumen de la oreja a continuación de la lesión del tejido después de la administración de PB1.3 o un anticuerpo monoclonal de ratón de control.

La Figura 19 muestra el desarrollo de la necrosis a continuación de la isquemia y reperfusión de la oreja del conejo después de la administración de PB1.3 o un anticuerpo monoclonal de ratón de control.

La Figura 20 muestra la inhibición de la acumulación intravascular de leucocitos inducida por células mast después de la administración de PB1.3.

Descripción de las realizaciones preferidas

Esta invención se refiere a composiciones y procedimientos para inhibir las inflamaciones y otras enfermedades en la que está implicada la P-Selectina. Específicamente, la invención proporciona inmunoglobulinas que tienen la capacidad de inhibir la adhesión de células in vivo mediada por selectina. Las inmunoglobulinas de la presente invención se unen selectivamente a epítopos funcionales sobre la P-Selectina y bloquean efectivamente la adhesión de leucocitos al endotelio vascular. La presente invención también proporciona usos diagnósticos y terapéuticos para estas inmunoglobulinas.

``Anticuerpos que bloquean la P-Selectina'' debería significar las inmunoglobulinas anti-P-Selectina de esta inhibición, las cuales inhiben la unión in vivo de neutrófilos a plaquetas activadas y/o a endotelio vascular activado. Los anticuerpos que bloquean la P-Selectina son apropiados para su modificación usando la multitud de técnicas disponibles para los especialistas en la técnica para la producción y manipulación de varias moléculas inmunoglobulinas. Los anticuerpos que bloquean la P-Selectina son proteínas consistentes en uno o más polipéptidos sustancialmente codificado por genes de inmunoglobulinas. Los genes de inmunoglobulinas reconocidos incluyen los genes de las regiones constantes kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como la miríada de genes de la región variable de inmunoglobulinas. Para una discusión de las formas de inmunoglobulinas, ver, por ejemplo, Fundamental Immunology, 2ª edición, Ed. W. F. Paul, Raven Press, NY (1989), Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988), Bird et al., Science 242:423-426 (1988); y Hunkapiller y Hood, Nature 323:15-16 (1986)).

Tal como se usa en ésta, ``inmunoglobulina'', ``anticuerpo'', o ``péptido(s) de anticuerpos'' se refiere a anticuerpos, anticuerpos monoclonales, a una inmunoglobulina o anticuerpo entero, o a cualquier fragmento funcional de una molécula de inmunoglobulina, el cual se une al epítopo funcional de la P-Selectina al que se unen los anticuerpos de esta invención que bloquean la P-Selectina. Los ejemplos de tales péptidos incluyen las moléculas de anticuerpos completas, fragmentos de anticuerpos, tales como Fab, F(ab')_{2}, regiones determinantes de las complementariedad (CDR), V_{L} (región variable de la cadena ligera), V_{H} (región variable de la cadena pesada), y cualquier combinación de esas o cualquier otra porción funcional de un péptido de anticuerpo.

Un fragmento F(ab')_{2} carece de la porción C-terminal de la región constante de la cadena pesada, y tiene un peso molecular de aproximadamente 110 kDa. Retiene los dos sitios de unión a antígeno, y los enlaces disulfuro entre cadenas en la región gozne, pero no tiene las funciones efectoras de una molécula IgG intacta. Un fragmentos F(ab')_{2} podría obtenerse a partir de una molécula IgG mediante digestión proteolítica con pepsina, a pH 3,0-3,5, usando procedimientos estándares tales como los descritos en Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Pubs., N.Y. (1988).

Un fragmento Fab comprende una cadena ligera y la porción N-terminal de la cadena pesada a la que está unida por enlaces disulfuro. Tiene un peso molecular de aproximadamente 50 kDa, y contiene un único sitio de unión a antígeno. Los fragmentos Fab podrían obtenerse a partir de fragmentos F(ab')_{2} mediante reducción limitada, o a partir de anticuerpos completos mediante digestión con papaína en presencia de agentes reductores (Ver, Harlow y Lane, más arriba).

Una multitud de técnicas, disponibles para los especialistas en técnica para la producción y manipulación de varias moléculas de inmunoglobulinas, pueden aplicarse fácilmente para producir anticuerpos para su uso en la presente invención. Los anticuerpos que se unen a la P-Selectina podrían producirse mediante una diversidad de medios. La producción de anticuerpos monoclonales no humanos, por ejemplo, de ratón, lagomorfos, equinos, etc., es bien conocida, y podría conseguirse mediante, por ejemplo, inmunizando el animal con una preparación que contuviera células portadores de P-Selectina (por ejemplo, plaquetas activadas por trombina) o moléculas de P-Selectina aisladas. Las células productoras de anticuerpo obtenidas de los animales inmunizados se inmortalizan y examinan, o se examinan primero por la producción de anticuerpo que se una a la P-Selectina y se inmortalizan a continuación. Para una discusión de procedimientos generales de producción de anticuerpos monoclonales ver Harlow y Lane, más arriba.

Podrían producirse formas menos preferidas de inmunoglobulinas mediante procedimientos bien conocidos por los especialistas en la técnica. Un ejemplo es la purificación cromatográfica de suero policlonal para producir poblaciones de anticuerpos sustancialmente monoespecíficas.

Un anticuerpo monoclonal preferido para su uso en esta invención se produce en la línea celular de hibridoma depositada en la American Type Culture Collection en Rockville, Maryland (ATCC), en conformidad con el Tratado de Budapest, con el número de acceso HB11041. La producción de este anticuerpo monoclonal se describe en el Ejemplo 2, más abajo.

La generación de anticuerpos monoclonales humanos contra un antígeno humano es también conocida en la técnica. La generación de tales anticuerpos monoclonales humanos podría ser difícil mediante técnicas convencionales. Por tanto, podría ser deseable aislar secuencias de ADN que codifican el anticuerpo monoclonal humano que bloquea la P-Selectina (o porciones del mismo) examinando una biblioteca de ADN procedente de células B humanas, de acuerdo con el protocolo general descrito por Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989). Las secuencias que codifican el anticuerpo (o fragmentos del mismo) con la especificidad deseada se clonan a continuación y se amplifican. Alternativamente, se podrían transferir las regiones unidoras de antígeno de anticuerpos no humanos, por ejemplo, el F(ab')_{2} o regiones hipervariables, a regiones constantes (Fc) humanas o regiones estructurales, mediante técnicas de ADN recombinante, para producir moléculas sustancialmente humanas. Tales procedimientos son generalmente conocidos en la técnica y se describen más adelante.

Por tanto, la técnica proporciona también anticuerpos sintéticos o recombinantes que bloquean la P-Selectina, incluyendo inmunoglobulinas quiméricas, anticuerpos humanizados, o anticuerpos híbridos o derivados de cualquiera de éstas. Las inmunoglobulinas quiméricas son típicamente el producto de ADN quimérico, el cual es ADN recombinante que contiene material genético de más de una especie de mamífero.

``Inmunoglobulinas quiméricas'' o ``anticuerpos quiméricos'' se refiere a aquellos anticuerpos o péptidos de anticuerpos en los que una porción del péptido tiene una secuencia de aminoácidos que se deriva de, o es homóloga a, una secuencia correspondiente en una anticuerpo bloqueador de la P-Selectina de esta invención, o péptido derivado de una primera fuente de genes, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es homólogo con secuencias correspondientes de otra fuente de genes. Por ejemplo, una péptido de anticuerpos bloqueador de P-Selectina quimérico podría comprender una cadena pesada de anticuerpo con una región variable de ratón y una región constante humana. Las dos fuentes de genes típicamente implicarán dos especies, pero ocasionalmente implicarán fuentes diferentes de una especie.

Los anticuerpos o péptidos bloqueadores de la P-Selectina quiméricos se producen típicamente usando técnicas recombinantes moleculares y/o celulares. Típicamente, los anticuerpos quiméricos tienen regiones variables de ambas, las cadenas ligera y pesada, que imitan las regiones variables de anticuerpos derivados de una especie de mamífero, mientras que las regiones constantes son homólogas con las secuencias en anticuerpos derivados de una segunda y diferente especie de mamífero. Los procedimientos para la producción de tales anticuerpos son bien conocidos y se describen, por ejemplo, en US-4.816.397, las publicaciones de EP 173.494 y 239.400.

La definición de una inmunoglobulina quimérica, sin embargo, no se limita a este ejemplo. Un anticuerpo quimérico es cualquier anticuerpo en el que una o ambas de las cadenas pesada o ligera está compuesta por combinaciones de secuencias que imitan las secuencias de anticuerpos de diferentes fuentes, sean estas fuentes son clases diferentes, respuestas diferentes a antígeno, o especies de origen diferentes, y sin importar si la fusión tiene lugar en el borde entre variable/constante.

El término ``humanizado'' o ``inmunoglobulina sustancialmente humana'' se refiere a una inmunoglobulina bloqueadora que comprende una región sustancialmente estructural humana y una región constante que corresponde sustancialmente a una región constante de inmunoglobulina humana. Por tanto, la mayoría de las partes de una inmunoglobulina humanizada, excepto posiblemente por los CDR, son sustancialmente homólogas con las partes correspondientes de una o más secuencias de inmunoglobulinas nativas humanas.

``Anticuerpo híbrido'' se refiere a un anticuerpo en el que cada cadena es homóloga por separado con referencia a una cadena de anticuerpo humano, pero cuya combinación representa un ensamblaje nuevo de forma que dos antígenos diferentes son reconocidos por el anticuerpo. En los anticuerpos híbridos, un par de cadena pesada y ligera es homólogo con un par hallado en un anticuerpo generado contra otro epítopo. Esto resulta en la propiedad de valencia multifuncional, es decir, la capacidad de unir simultáneamente al menos dos epítopos diferentes, en donde al menos un epítopo es el epítopo al que se une el anticuerpo bloqueador de la P-Selectina. Por supuesto, tales híbridos podrían formarse también usando cadenas quiméricas.

Por tanto, en un aspecto, la presente invención se dirige a segmentos de ADN recombinante que codifican las regiones variable e hipervariable de la cadena pesada y/o ligera, o las regiones de la cadena ligera kappa humana. Alguien con formación reconocerá que, debido a la degeneración de codones y las sustituciones de aminoácidos no críticas, otras secuencias de podrían sustituir fácilmente esas secuencias, tal como se detalla más abajo.

Los segmentos de ADN típicamente incluirán además una secuencia de ADN de control de la expresión operativamente unida a las secuencias codificantes del anticuerpo quimérico, incluyendo regiones promotoras asociadas naturalmente o heterólogas. Preferiblemente, las secuencias de control de la expresión serán sistemas promotores de eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar células huésped eucariotas. Una vez el vector se ha incorporado en el huésped apropiado, se mantiene el huésped en condiciones apropiadas para la expresión con nivel elevado de las secuencias de nucleótidos, y, si se desea, podría seguir la recolección y purificación de las inmunoglobulinas codificadas.

Es bien sabido que las formas ``maduras'' de inmunoglobulinas nativas variará algo en términos de longitud por supresiones, sustituciones, inserciones o adiciones de uno o más aminoácidos en las secuencias. Por tanto, las regiones variable y constante están sometidas a una sustancial modificación natural, aunque son ``sustancialmente idénticas'' o ``sustancialmente homólogas'', y son todavía capaces de retener sus respectivas actividades. Las fuentes celulares apropiadas para las secuencias de ADN, y las células huésped para la expresión y secreción, pueden obtenerse a partir de un cierto número de fuentes, tales como la American Type Culture Collection (``Catalogue of Cell Lines and Hybridomas'', quinta edición, [1985], Rockville, Maryland, EE.UU.).

Además de estas formas de cadenas de inmunoglobulinas que existen de forma natural, pueden diseñarse fácilmente porciones de cadenas pesada y ligera sustancialmente idénticas, y fabricarse utilizando varias técnicas de ADN recombinante bien conocidas por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, las cadenas pueden variar, respecto la secuencia que ocurre de forma natural, a nivel de estructura primaria por varias sustituciones de aminoácidos, adiciones terminales e intermedias, y supresiones, y similares. Alternativamente, podrían producirse fragmentos de polipéptidos que comprendieran tan sólo una porción (usualmente al menos aproximadamente el 60-80%, típicamente el 90-95%) de la estructura primaria, fragmentos que poseen una o más actividades de inmunoglobulinas (por ejemplo, la actividad de fijación del complemento), mientras que presentan una inmunogenicidad menor. En particular, se destaca que, como muchos genes, los genes relacionados con la inmunoglobulina contienen regiones funcionales separadas, teniendo cada una una o mas actividades biológicas. Estas podrían fusionarse a regiones funcionales procedentes de otros genes (por ejemplo, enzimas) para producir proteínas de fusión (por ejemplo, inmunotoxinas) que tengan nuevas propiedades. En general, las modificaciones de los genes podrían conseguirse fácilmente mediante una variedad de técnicas bien conocidas, tales como la mutagénesis dirigida hacia un sitio (ver, Gillman y Smith, Gene 8:81-97 (1979) y Roberts et al., Nature 328:731-734 (1987)).

Tal como se ha mencionado previamente, las secuencias de ADN se expresarán en huéspedes después de que las secuencias hayan sido unida operativamente a una secuencia de control de la expresión. Estos vectores de expresión son típicamente replicables en organismos huéspedes, bien como episomas o como parte integral del ADN cromosómico del huésped. Comúnmente, los vectores de expresión contendrán marcadores de selección, por ejemplo, tetraciclina o neomicina, para permitir la detección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas (ver, por ejemplo, la patente US-4.704.362).

E. coli es un huésped procariota particularmente útil para clonar las secuencias de ADN y construir los diversos vectores de la presente invención. Por ejemplo, la cepa 294 de E. coli K12 es particularmente útil (ATCC nº 31.446). Otras cepas microbianas que podrían usarse incluyen E. coli B y E. coli X1776 (ATCC nº 31.537). Estos ejemplos son ilustrativos en vez de limitantes.

Las procariotas son útiles también para la expresión. Podrían usarse las cepas mencionadas más arriba, así como E. coli W3110 (F\- \lambda\-; prototrófica; ATCC nº 27.325), bacilos tales como Bacillus subtilis, y otras enterobacterias tales como Salmonella typhimurium o Serratia marcescens, y varias especies de pseudomonas.

En general, con estos huéspedes se usan los vectores de plásmidos que contienen secuencias promotoras y de control que se derivan de especies compatibles con la célula huésped. El vector ordinariamente tiene un sitio de replicación así como secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar la selección fenotípica en células transformadas. Por ejemplo, E. coli se transforma típicamente usando pBR322, un plásmido derivado de un especie de E. coli (Bolivar et al., Gene 2:95 (1977)). pBR322 contiene genes para la resistencia a la ampicilina y tetraciclina y proporciona de ese modo medios fáciles para identificar células transformadas. El plásmido pBR322, u otros plásmidos microbianos, deben contener también, o modificarse para contener promotores y otros elementos de control comúnmente usados en la construcción de ADN recombinante.

Los promotores apropiados para su uso con huéspedes procariotas ilustrativos incluyen los sistemas promotores de la \beta-lactamasa y de la lactosa (Chang et al., Nature 275:615 (1976); y Goeddel et al., Nature 281:544 (1979)), la fosfatasa alcalina, y el sistema promotor del triptófano (trp) (Goeddel, Nucl. Acids Res. 8:4957 (1980)), y promotores híbridos tales como el promotor tac (de Boer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)). No obstante, otros promotores bacterianos funcionales son apropiados. Sus secuencias nucleotídicas son generalmente conocidas, permitiendo por tanto a un especialista formado unirlos operativamente a ADN codificando la sialiltransferasa (Siebenlist et al., Cell 2: 20 de junio:269-281 (1980)) usando engarces o adaptadores para proporcionar cualquier sitio de restricción requerido. Los promotores para uso en sistemas bacterianos contendrán también una secuencia Shine-Dalgamo (S.D.) operativamente unida al ADN que codifica la sialiltransferasa.

Además de los procariotas, también podrían usarse microbios eucariotas tales como los cultivos de levaduras. Saccharomyces cerevisiae, o levadura común de panadería, es el microorganismo eucariota más comúnmente usado, aunque están disponibles un cierto número de otras cepas. Para la expresión en Saccharomyces se usa comúnmente, por ejemplo, el plásmido YRp7 (Stinchomb et al., Nature 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene 10:157 (1980)). Este plásmido ya contiene el gen tpr1 que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carezca de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, la ATCC nº 44.076 o la PEP4-1 (Jones, Genetics 85:12 (1977)). La presencia de la lesión trp1 como una característica del genoma de la célula huésped proporciona entonces una entorno efectivo para detectar la transformación mediante crecimiento en ausencia de triptófano.

Las secuencias promotoras apropiadas para su uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para la quinasa del 3-fosfoglicerato (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073 (1980)) u otros enzimas glicolíticos (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149 (1968); y Holland, Biochemistry 17:4900 (1978)), tales como la enolasa, deshidrogenasa del gliceraldehído-3-fosfato, la hexoquinasa, la descarboxilasa de piruvato, la fosfofructoquinasa, la isomerasa de la glucosa-6-fosfato, la mutasa de la 3-fosfoglicerato, la quinasa de piruvato, la isomerasa de triosefosfato, la isomerasa de fosfoglucosa, y la glucoquinasa.

Otros promotores de levadura, que son inducibles por promotores que tienen la ventaja adicional de que su transcripción está controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para la deshidrogenasa 2 de alcohol, el isocitocromo C, la fosfatasa ácida, los enzimas degradadores asociados con el metabolismo del nitrógeno, la metalotioneína, la deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato, y los enzimas responsables del uso de la maltosa y galactosa. Los vectores y promotores apropiados para su uso en la expresión en levaduras se descritos con más detalle en R. Hitzeman et al., Publicación de Patente Europea nº 73.657A. Los potenciadores de levadura se usan también ventajosamente con los promotores de levadura.

Además de los microorganismos, también podrían usarse los cultivos celulares de tejidos de mamíferos para producir los polipéptidos de la presente invención (ver, Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, W. H. Freeman, N.Y. (1990)). Se prefieren las células eucariotas porque se han desarrollado en la técnica un cierto número de líneas celulares huésped apropiadas capaces de secretar inmunoglobulinas intactas, e incluyen las líneas de células CHO, varias líneas de células COS, células HeLa, líneas celulares de mieloma, células B transformadas, e hibridomas.

``Región control'' se refiere a secuencias específicas en los extremos 5' y 3' de los genes eucariotas que podrían estar implicadas en el control de la transcripción o traducción. Virtualmente todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT ubicada aproximadamente de 25 a 30 bases cadena arriba respecto el sitio en el que se inicia la transcripción. Otra secuencia hallada de 70 a 80 bases cadena arriba respecto el inicio de transcripción de muchos genes es una región CXCAAT, en donde X podría ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que podría ser la señal para la adición de la cola poli-A al extremo 3' del mARN transcrito.

Los promotores preferidos que controlan la transcripción a partir de vectores en células huésped de mamífero podrían obtenerse de varias fuentes, por ejemplo, los genomas de virus tales como: polioma, virus de simios 40 (SV40), adenovirus, retrovirus, virus de la hepatitis-\beta, y, más preferiblemente, citomegalovirus, o a partir de promotores heterólogos de mamíferos, por ejemplo, el promotor de la beta-actina. Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción que contiene también el origen de replicación viral del SV40 (Fiers et al., Nature 273:113 (1978)). El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción HindIII (Greenaway, P. J. et al., Gene 18:355-360 (1982)). Por supuesto, los promotores de la célula huésped o especies relacionadas son también útiles en ésta.

La transcripción de un and que codifica las proteínas basadas en inmunoglobulina por parte de eucariotas superiores se incrementa insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos del ADN que actúan en cis, usualmente con aproximadamente 10-300 p.b., para actuar sobre un promotor para incrementar su transcripción. Los potenciadores son relativamente independientes de su orientación y posición, se han hallado 5' (Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:993 (1981)) y 3' (Lusky et al., Mol. Cell. Biol. 3:1108 (1983)) respecto la unidad de transcripción, dentro de un intrón (Banerji et al., Cell 33:729 (1983)) así como dentro de la misma secuencia codificante (Osborne et al., Mol. Cell. Bio. 4:1293 (1984)). Se conocen muchas secuencias potenciadoras procedentes de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Sin embargo, típicamente, se usará un potenciador procedente de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador del SV40 en el lado tardío del origen de replicación (100-270 p.b.), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lado tardío del origen de replicación, y los potenciadores de adenovirus.

Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas (levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanas, o células nucleadas procedentes de otros organismos multicelulares) contendrán también secuencias necesarias para la terminación de la transcripción que podrían afectar la expresión del mARN. Estas regiones se transcriben como segmentos poliadenilados en la porción no traducida del mARN que codifica el anticuerpo para la P-Selectina. Las regiones 3' no traducidas también incluyen sitios de terminación de la transcripción.

Los vectores de expresión podrían contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Son ejemplos de marcadores seleccionables apropiados para células de mamíferos la reductasa de dihidrofolato (DHFR), la descarboxilasa de ornitina, el marcador bioquímico de la resistencia a múltiples drogas, la desaminasa de adenosina, la sintetasa de asparagina, la sintetasa de glutamina, la quinasa de timidina, o la neomicina. Cuando tales marcadores seleccionables se transfieren exitosamente a una célula huésped de mamífero, la célula huésped de mamífero puede sobrevivir si se coloca bajo presión selectiva. Hay dos categorías distintas ampliamente usadas de regímenes selectivos. La primera categoría se basa en el metabolismo de una célula, y el uso de una línea celular mutante que carece de la capacidad de crecer con independencia de un medio suplementado. Dos ejemplos son las células CHO DHFR- y las células LTK-. Estas células carecen de la capacidad de crecer sin la adición de nutrientes tales como la timidina o hipoxantina. Puesto que esas células carecen de ciertos genes necesarios para una vía completa de síntesis de nucleótidos, no pueden sobrevivir a menos que se proporcione en un medio suplementado el nucleósido de la vía de síntesis ausente. Una alternativa a suplementar el medio es introducir un gen DHFR o TK intacto en las células que carecen de los respectivos genes, alterando por tanto sus necesidades de crecimiento. Las células individuales que no fueron transformadas con el gen DHFR o TK no serán capaces de sobrevivir en medio sin suplementar.

La segunda categoría es de selección dominante, lo que se refiere a un esquema de selección usado en cualquier tipo de célula y no requiere el uso de una línea celular mutante. Estos esquemas típicamente usan una droga para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquéllas células que tienen un gen nuevo expresarán una proteína que conferirá resistencia a la droga y sobrevivirá la selección. Los ejemplos de tal selección dominante usan las drogas neomicina (Southern y Berg, J. Molec. Appl. Genet. 1:327 (1982)), ácido micofenólico (Mulligan y Berg, Science 209:1422 (1980)), o higromicina (Sugden et al., Mol. Cell Biol. 5:410-413 (1985)). Los tres ejemplos dados más arriba emplean genes bacterianos bajo control eucariota para conferir resistencia contra la droga apropiada, respectivamente la G418 o neomicina (genticina), el xgbt (ácido micofenólico), o la higromicina.

``Amplificación'' se refiere al incremento o replicación de una región aislada dentro del ADN cromosómico de las células. La amplificación se consigue usando un agente de selección, por ejemplo, el metotrexato (MTX) que desactiva el DHFR. La amplificación o acumulación de múltiples copias del gene DHFR resulta en la producción de mayores cantidades de DHFR en presencia de mayores cantidades de MTX. No obstante, la presión de amplificación se aplica a pesar de la presencia de dhfr endógeno, añadiendo mayores cantidades de MTX al medio. La amplificación de un gen deseado puede conseguirse co-transfectando una célula huésped de mamífero con un plásmido que tiene un ADN que codifica una proteína deseada y el gen del dhfr o de amplificación, co-integración se denomina como co-amplificación. Se asegura que la célula requiere más dhfr, requerimiento que se satisface mediante replicación del gen de selección, seleccionando sólo células que pueden crecer en presencia de concentraciones aún mayores de MTX. Siempre y cuando el gen que codifica una proteína heteróloga deseada se haya co-integrado con el gen de selección, la replicación de este gen da lugar a la replicación del gen que codifica la proteína deseada. El resultado es que las copias incrementadas del gen, es decir, un gen amplificado, que codifica la proteína heteróloga deseada expresa más cantidad de la proteína heteróloga deseada.

Las células huésped preferidas para expresar los vectores de esta invención, que codifican las proteínas basadas en inmunoglobulina en eucariotas superiores, incluyen: la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea renal embriónica humana (293) (Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977); las células renales de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); las células DHFR de ovario de hámster chino (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); las células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); las células renales de mono (CV1, ATCC CCL 70); las células renales de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL 1587); las células de carcinoma cervical humanas (HELA, ATCC CCL 2); las células renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34); las células de hígado de ratas búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); las células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); las células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); las de tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL 51); y las células TRI (Mathers et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-46 (1982)); las células de baculovirus.

``Transformación'' significa introducir ADN en un organismo de forma que el ADN es replicable, bien como un elemento extracromosómico o mediante integración cromosómica. A menos que se indique lo contrario, el procedimiento usado en ésta para la transformación de las células huésped es el procedimiento de Graham y Van der Eb, Virology 52:456-457 (1973). No obstante, también podrían usarse otros procedimientos para introducir ADN en células, tales como mediante ingestión nuclear o mediante fusión con protoplastos. Si se usan células procariotas o células que contienen construcciones sustanciales de pared celular, el procedimiento de transfección preferido es el tratamiento con calcio usando cloruro cálcico tal como se describen Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110 (1972).

Para el análisis para confirmar secuencias correctas en plásmidos construidos, se usan las mezclas de ligación para transformar la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC 31.446) y los transformantes exitosos se seleccionan mediante resistencia a la ampicilina o tetraciclina según sea apropiado. Los plásmidos procedentes de los transformantes se preparan, analizan mediante restricción, y/o se secuencian mediante el procedimiento de Messing et al., Nucleic Acids Res. 9:309 (1981) o mediante el procedimiento de Maxam et al., Methods in Enzymology 65:449 (1980).

Las células huésped podrían transformarse con los vectores de expresión de esta invención, y cultivarse en medios nutritivos convencionales transformados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar genes. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH y similares, son las previamente usadas con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el especialista ordinariamente formado.

``Transfección'' se refiere a la ingestión de un vector de expresión por parte de una célula huésped, sin importar si alguna de las secuencias codificantes se expresa de hecho. Numerosos procedimientos de transfección son conocidos por el especialista con la formación ordinaria, por ejemplo, el CaPO_{4} y la electroporación. La transfección exitosa se reconoce generalmente cuando ocurre alguna indicación de la operación de este vector dentro de la célula huésped.

Los vectores que contienen los segmentos de ADN de interés (por ejemplo, las secuencias que codifican las cadena pesada y ligera, y las secuencias de control de la expresión) pueden transferirse al interior de la célula huésped mediante procedimientos bien conocidos, los cuales varían dependiendo del tipo de huésped celular. Por ejemplo, la transfección mediante cloruro de calcio su utiliza comúnmente con células procariotas, mientras que el tratamiento con fosfato cálcico podría usarse con otros huéspedes celulares. Ver, de forma general, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, 1989.

Una vez expresados, los anticuerpos quiméricos completos, sus dímeros, o las cadenas ligera y pesada individuales de la presente invención pueden purificarse de acuerdo con procedimientos estándar en la técnica, incluyendo la precipitación con sulfato amónico, la cromatografía en columna de fraccionamiento, la electroforesis en gel, y similares.

Para esta invención, una inmunoglobulina bloqueadora de la P-Selectina es específica para, o reacciona con, un epítopo funcional sobre la molécula de P-Selectina si la inmunoglobulina une el epítopo funcional sobre P-Selectina definido por el anticuerpo bloqueador de P-Selectina de esta invención, según se mide o determina mediante ensayos anticuerpo-antígeno estándares, por ejemplo, ensayos de unión competitiva, ensayos de saturación, o inmunoensayos estándares tales como ELISA o RIA. La unión de este epítopo funcional no es inhibida por el péptido CQNRYTDLVAIQNKNE. El Ca\++ no es necesario para la unión. Esta definición de especificidad se aplica a cadenas ligera y/o pesada únicas, CDR, proteínas de fusión, o fragmentos de las cadenas pesada y/o ligera que son también específicos para la P-Selectina si unen la P-Selectina sola o si, cuando se incorporan apropiadamente en una conformación de inmunoglobulina con regiones variables complementarias y regiones constantes según sea apropiado, son capaces entonces de unir la P-Selectina.

Las inmunoglobulinas de la presente invención preferiblemente tienen afinidad suficiente para asegurar la unión al epítopo funcional de la P-Selectina. La afinidad de unión se representa típicamente por la constante de afinidad (K_{a}) para las concentraciones de equilibrio de las configuraciones asociada y disasociada, es decir, K_{a} = [A-B]/[A][B], en donde [A], [B], y [A-B] son respectivamente las concentraciones en equilibrio del anticuerpo (A), del antígeno (B), y del complejo antígeno-anticuerpo (A-B). Alguien especialista reconocerá, sin embargo, que la afinidad de unión entre las dos moléculas estará influenciada por un cierto número de factores tales como la temperatura, pH, fuerza iónica, y similares.

En base a los activadores de la P-Selectina y ELAM-1, se ha postulado que su expresión representa respuestas inflamatorias y hemostáticas a lesiones de tejidos. No obstante, se requieren múltiples proteínas de adhesión y sus ligandos para la adhesión a leucocitos y la extravasación a través de células endoteliales. No fue hasta esta invención que se mostró que la adhesión in vivo específica al receptor de la P-Selectina era crítica para una respuesta contra la lesión del tejido. Para bloquear los anticuerpos bloqueadores de la P-Selectina de la presente invención comprenden inmunoglobulinas que unen selectivamente un epítopo funcional sobre la P-Selectina en células asociadas con una respuesta a la lesión de tejidos e inflamación.

Las condiciones inflamatorias y trombóticas tratables con la presente invención incluyen, por ejemplo, la lesión de tejidos post-isquémica mediada por leucocitos (lesión por reperfusión) tal como el shock traumático, la apoplejía, el infarto de miocardio, el rechazo agudo de transplantes, la lesión por congelación, el síndrome de compartimento, y condiciones patofisiológicas asociadas con el bypass cardiopulmonar, la lesión pulmonar aguda mediada por leucocitos (por ejemplo, el síndrome de molestias respiratorias de adultos), el shock séptico, las heridas asociadas a una sepsis secundaria a una infección viral, tal como por le virus del herpes simplex, las reacciones alérgicas mediadas por IgE, tales como la enfermedad asmática de fase aguda, y las condiciones inflamatorias crónicas, incluyendo la artritis reumatoide, la dermatitis atópica y la psoriasis. Además, la metástasis de tumores puede prevenirse inhibiendo la adhesión de las células cancerosas circulantes. Los ejemplos incluyen el carcinoma de colon y el melanoma.

Un componente principal de las condiciones alérgicas agudas, incluyendo el asma, es la desgranulación de los mastocitos a continuación de un desafía de los sujetos con antígenos contra los que están específicamente sensibilizados. Las consecuencias de las desgranulación de los mastocitos incluyen una respuesta broncoconstrictora y también una respuesta inflamatoria caracterizada en parte por la acumulación de leucocitos. La histamina, que está contenida junto con otros mediadores inflamatorios en los mastocitos, puede inducir la expresión de P-Selectina sobre células endoteliales vasculares, indicando que la desgranulación de los mastocitos podría resultar también en la expresión de P-Selectina y en la subsiguiente acumulación de leucocitos. Puesto que la desgranulación de mastocitos es un elemento clave en la patogénesis de las condiciones alérgicas, la administración de anticuerpos contra la P-Selectina podría ser útil para el tratamiento de condiciones alérgicas humanas.

Los anticuerpos bloqueadores de la P-Selectina y las composiciones farmacéuticas de esta invención son particularmente útiles para su administración parenteral, es decir, subcutáneamente, intramuscularmente o intravenosamente. Se están desarrollando un cierto número de nuevas estrategias de suministro de drogas, las composiciones farmacéuticas de la presente invención son apropiadas también para su administración usando estos nuevos procedimientos. Ver, Langer, Science 249:1527-1533 (1990).

Los anticuerpos bloqueadores de P-Selectina pueden acoplarse directa o indirectamente al agente quimioterapéutico. El acoplamiento, que podría realizarse por medios generalmente conocidos en la técnica, no debería inhibir sustancialmente la capacidad de la inmunoglobulina para unir el receptor, ni debería reducir sustancialmente la actividad del agente quimioterapéutico. Una diversidad de quimioterapéuticos pueden acoplarse para su apuntamiento. Por ejemplo, los agentes antiinflamatorios que podrían acoplarse incluyen los inmunomoduladores, los antagonistas del factor de activación de plaquetas (PAF), los inhibidores de la ciclooxigenasa, los inhibidores de la lipooxigenasa, y los antagonistas del leucotrieno. Algunos sustituyentes preferidos incluyen la ciclosporina A, la indometacina, el naproxeno, el FK-506, el ácido micofenólico, y similares. Similarmente, los antioxidantes, por ejemplo, la superóxido dismutasa, son útiles para tratar la lesión por reperfusión. De igual forma podrían dirigirse agentes anticáncer, tales como la daunomicina, la doxorubicina, la vinblastina, la bleomicina, y similares.

El apuntamiento a la P-Selectina podría conseguirse también a través de amfipatos, o moléculas con carácter dual (polar:apolar) que existen como agregados en solución acuosa. Los amfipatos incluyen los lípidos no polares, los lípidos polares, los mono- y diglicéridos, las sulfatidas, la lisolecitina, los fosfolípidos, la saponina, los ácidos y sales biliares. Estas moléculas pueden existir como emulsiones y espumas, micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos, dispersiones de fosfolípidos y capas lamelares. Estas se denominan genéricamente en ésta como liposomas. En estas preparaciones, la droga a suministrar se incorpora como parte de un liposoma en el que se inserta una inmunoglobulina anti-P-Selectina. En esta realización, la inmunoglobulina no tiene porque unirse a un epítopo funcional sobre la molécula de P-Selectina, con tal que la inmunoglobulina apunte efectivamente el liposoma hacia las moléculas de P-Selectina. Cuando los liposomas se llevan a la proximidad de las células afectadas, entregan las composiciones terapéuticas seleccionadas.

Hay una variedad de procedimientos disponibles para preparar liposomas, tal como se describe en, por ejemplo, Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980); las patentes estadounidenses nº 4.235.871, 4.501.728, y 4.837.028. Es bien conocido en la técnica cómo apuntar los liposomas usando una variedad de agentes apuntadores (por ejemplo, ligandos, receptores y anticuerpos monoclonales) (ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses nº 4.957.773 y 4.603.044). Pueden usarse procedimientos estándar para acoplar agentes apuntadores a los liposomas. Los liposomas apuntados con anticuerpos pueden construirse usando, por ejemplo, liposomas que incorporan la proteína A (ver, Renneisen et al., J. Biol. Chem. 265:16337-16342 (1990) y Leonetti et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2448-2451 (1990).

Tal como se discute más arriba, las composiciones farmacéuticas (comprendiendo los liposomas apuntados o los anticuerpos libres) son particularmente apropiadas para su administración parenteral. La composición comprenderá comúnmente una solución del anticuerpo o un coctel de los mismos disuelto en un portador aceptable, preferiblemente un portador acuoso. Pueden usarse una variedad de portadores acuosos, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina al 0,4%, glicina al 0,3%, y similares. Estas soluciones son estériles y generalmente libres de materia particulada. Estas composiciones podrían esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales y bien conocidas. Las composiciones podrían contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se precise para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes tamponantes o ajustadores del pH, agentes ajustadores de la tonicidad, y similares, por ejemplo, acetato sódico, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico, lactato sódico, etc. La concentración de anticuerpo en estas formulaciones puede variar ampliamente, es decir, desde menos de aproximadamente un 0,5%, usualmente a, o al menos aproximadamente al 1%, hasta tanto como el 15 ó 20% en peso, y se seleccionarán principalmente en base a volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo concreto de administración seleccionado. Los procedimientos actuales para preparar composiciones administrables parenteralmente serán conocidos o evidentes para los especialistas en la técnica, y se describen con mayor detalle en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17ª edición, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1985.

Los anticuerpos de esta invención pueden liofilizarse para su almacenamiento y reconstituirse en un portador apropiado antes de su uso. Esta técnica se ha mostrado que es efectiva con inmunoglobulinas convencionales, y pueden emplearse técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en la técnica. Los especialistas en la técnica apreciarán que la liofilización y la reconstitución pueden conducir a varios grados de pérdida de actividad de los anticuerpos (por ejemplo, con inmunoglobulinas convencionales, los anticuerpos de IgM tienden a tener una mayor pérdida de actividad que los anticuerpos de IgG) y que los niveles de uso tendrían que ajustarse para compensar.

Las composiciones conteniendo los actuales anticuerpos o un cóctel de los mismos pueden administrarse para los tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En la aplicación terapéutica, las composiciones se administran a un paciente en una cantidad suficiente para curar, o al menos detener parcialmente la infección y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para conseguir esto se define como una ``dosis terapéuticamente efectiva''. Las cantidades efectivas para este uso dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado general sistema inmune del propio paciente, pero generalmente oscilan desde aproximadamente 0,05 mg/kg de peso corporal hasta aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, preferiblemente entre aproximadamente 0,2 mg/kg de peso corporal hasta aproximadamente 1,5 mg/kg de peso corporal.

Se debe tener presente que los materiales de esta invención podrían generalmente emplearse en estados patológicos serios, que son situaciones de amenaza para la vida o potencialmente de amenaza para la vida. En tales casos, con vistas a minimizar las sustancias extrañas y disminuir la probabilidad de rechazos de ``sustancias extrañas'' que se consiguen con las formas de anticuerpos quiméricos humanos de esta invención, es posible, y podría ser considerado deseable por parte del médico que trata, administrar excesos sustanciales de estos anticuerpos.

En las aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los presentes anticuerpos o un cóctel de los mismos se administran a un paciente que todavía no está en un estado morboso para mejorar la resistencia del paciente. Una cantidad tal se define que es una ``dosis profilácticamente efectiva''. En este uso, de nuevo, las cantidades precisas dependen del estado de salud del paciente y del nivel general de inmunidad, pero generalmente están en los rangos descritos más arriba.

Pueden realizarse aplicaciones profilácticas de las composiciones, siendo seleccionados los niveles de dosis y patrones por el médico que trata. En cualquier caso, las formulaciones farmacéuticas deberían proporcionar una cantidad de las inmunoglobulinas de esta invención suficiente para tratar efectivamente el paciente.

Los anticuerpos de la presente invención podrían usarse también con propósitos diagnósticos, tales como identificar áreas de inflamación. Para los propósitos diagnósticos, los anticuerpos podrían estar tanto marcados como sin marcar. Los anticuerpos sin marcar pueden usarse en combinación con otros anticuerpos marcados (segundos anticuerpos) que reaccionan con el anticuerpo, tal como anticuerpos específicos para la región constante de la inmunoglobulina concreta. Alternativamente, los anticuerpos pueden marcarse directamente. Podrían emplearse una amplia variedad de marcas, tales como radionúcleos, fluorescentes, enzimas, sustratos de enzimas, cofactores de enzimas, inhibidores de enzimas, ligandos (particularmente haptenos), etc. Hay numerosos tipos de inmunoensayos disponibles, y son bien conocidos por los especialistas en la técnica.

En las aplicaciones diagnósticas, las composiciones conteniendo las inmunoglobulinas o un coctel de las mismas se administran a paciente que se sospecha tienen un estado morboso inflamatorio. Alternativamente, puede seguirse la eficacia de un tratamiento concreto. Una cantidad suficiente para conseguir esto se define como una ``dosis diagnósticamente efectiva''. En este uso, las cantidades precisas dependerán del estado de salud del paciente y similares.

También pueden proporcionarse equipos para su uso con los anticuerpos. Por tanto, podría proporcionarse la composición de anticuerpos sujeto de la presente invención, usualmente en una forma liofilizada en un contenedor, bien sola o conjuntamente con anticuerpos adicionales específicos para el tipo celular deseado. Los anticuerpos, que podrían estar conjugados a una marca o toxina, o no estar conjugados, se incluyen en los equipos con tampones, tales como Tris, fosfato, carbonato, etc., estabilizantes, biocidas, proteínas inertes, por ejemplo, albúmina de suero, o similares, y un conjunto de instrucciones para su uso. Generalmente, estos materiales estarán presentes en menos de aproximadamente el 5% en peso, basado en la cantidad de anticuerpo activo, y usualmente presente en una cantidad total de al menos aproximadamente el 0,001% en peso, de nuevo en base a la concentración de anticuerpo. Frecuentemente será deseable incluir un extensor o excipiente inerte para diluir los ingredientes activos, mientras que el excipiente podría estar en desde aproximadamente el 1 hasta el 99% en peso de la composición total. Cuando se emplea un segundo anticuerpo, capaz de unirse al anticuerpo quimérico, en un ensayo, éste usualmente estará presente en un vial separado. El segundo anticuerpo está típicamente conjugado con una marca y formulado en una manera análoga con las formulaciones de anticuerpo descritas más arriba.

Un ``epítopo funcional'' es un sitio antigénico unido por el anticuerpo bloqueador de P-Selectina, que cuando se une efectivamente bloquea la adhesión de leucocitos al endotelio vascular asociado con una condición inflamatoria y/o trombótica.

Tal como se usa en ésta, ``inhibición sustancial'' se al menos aproximadamente el 50% de inhibición, preferiblemente aproximadamente el 60% hasta aproximadamente el 80%, y más usualmente aproximadamente superior al 85% o más (tal como se mide en un ensayo de unión competitiva in vitro).

Una inmunoglobulina es ``reactiva con'' o ``se une a'' un antígeno si interacciona con el antígeno. Típicamente, las interacciones de unión entre el ligando o el péptido y el receptor o antígeno implican asociaciones no covalentes reversibles, tales como la atracción electrostática, las fuerzas de Van der Waals, y los enlaces de hidrógeno. Esta interacción es análoga a una reacción química en la que dos reactivos pasan a estar juntos para formar un producto. En el caso de la interacción inmunoglobulina-antígeno, el producto de la interacción es un complejo inmunoglobulina-antígeno.

Un ``ensayo de unión competitiva'' es uno que mide la capacidad de una inmunoglobulina para inhibir la unión de un inmunoglobulina bloqueadora de P-Selectina (por ejemplo, una secretada por la ATCC con número de acceso HB11041) a un determinante sobre una molécula de P-Selectina. Se conocen numerosos tipos de ensayos de unión competitiva, por ejemplo: el radioinmunoensayo (RIA) directo o indirecto de fase sólida, el inmunoensayo enzimático (EIA) directo o indirecto de fase sólida, el ensayo de competición en sandwich (ver Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253 (1983)); el EIA directo biotina-avidina en fase sólida (ver, Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619 (1986)); ensayo de marcado directo en fase sólida, ensayo en sandwich de marcado directo en fase sólido (ver, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1988); el RIA de marcado directo en fase sólida usando I-125 como marcador (ver, Morel et al., Molec. Immunol. 25(1):7-15 (1988)); el EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (Cheung et al., Virology 176:546-552 (1990)); y el RIA de marcado directo (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82 (1990)). Típicamente, un ensayo tal implica el uso de P-Selectina purificada o de células que portadoras de P-Selectina unidas a una superficie sólida, y una inmunoglobulina marcada que se sabe reacciona con la P-Selectina. Se añade la inmunoglobulina a ensayar y se mide la inhibición competitiva determinando la cantidad de marca unida sobre la superficie sólida en presencia de la inmunoglobulina de ensayo. Podrían usarse procedimientos estándar para ensayos de anticuerpos monoclonales, tales como ELISA. Un ejemplo de ensayo de unión competitiva apropiado se presenta más abajo en el EJEMPLO 8.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración, no de limitación.

Ejemplo 1

Preparación de reactivos

Este ejemplo describe la preparación y aislamiento de reactivos usados para las inmunizaciones de los Ejemplos 2 y 3, y los ELISAs del Ejemplo 4.

A. ``Plaquetas caducadas''

Una preparación de plaquetas que se purificó a partir de ``plaquetas caducadas'' obtenidas del Banco de Sangre de San Diego. El procedimiento usado fue una modificación del procedimiento descrito en Moore et al., J. Cell Biol. 112:491-499 (1991). En resumen, 25 unidades de plasma rico en plaquetas caducado se centrifugaron dos veces durante 10 minutos a 1200 r.p.m. (300 \timesg) para suprimir las células sanguíneas contaminantes que no son plaquetas. La preparación de plaquetas purificadas se lavó entonces tres veces con un tampón que contenía NaCl 0,1 M, Tris 20 mM y benzamidina 5 mM. También contenía un 3,8% de citrato sódico. El pH se ajustó a 7,5 con HCl 1 N. Las plaquetas purificadas se almacenaron a 70ºC y se lavaron una vez en PBS antes de su inyección.

B. P-Selectina purificada

Fraccionamiento de plaquetas: Las plaquetas caducas lavadas se fraccionaron esencialmente de acuerdo con Moore et al., 1991, ver más arriba. 25 unidades de plaquetas se hicieron 100 \muM en leupeptina y 1 mM en 4-(2-aminoetil)- bencenesulfonilfluoruro (AEBSF), se congelaron-descongelaron tres veces en hielo seco/metanol, y se homogeneizaron con diez golpes en un homogeneizador Dounce. A continuación se centrifugó la suspensión en un rotor Ti-70 de Beckman, a 4ºC, a 35.000 r.p.m. durante 60 minutos. El sobrenadante de esta centrifugación fue el material de partida para la purificación de P-Selectina ``soluble''. El precipitado se resuspendió en 30 ml de MnCl_{2} 1 mM, CaCl_{2} 1 mM, benzamidina-HCl 5 mM, NaCl 0,1 M, Tris 20 mM, 2% de Triton X-100, pH 7,5, se homogeneizó con 10 golpes en un homogeneizador Dounce, y se incubó durante 1 hora a 4ºC. La suspensión se centrifugó a continuación durante 1 hora en un rotor Ti-70 de Beckman, a 4ºC, a 35.000 r.p.m. El sobrenadante de esta centrifugación fue el material de partida para el aislamiento de la P-Selectina ``unida a membrana''.

Aislamiento de P-Selectina a partir de plaquetas fraccionadas: A continuación, las P-Selectinas ``soluble'' y ``unida a membrana'' fueron purificadas aún más separadamente por alguno o todos de los procedimientos siguientes. El detergente no-iónico Rennex 30 (Accurate Chemical and Scientific Corp.) se incluyó a una concentración del 0,1% en todos los tampones para el aislamiento e la forma unida a membrana de la P-Selectina. Todos los tampones incluían también CaCl_{2} 1 mM y MnCl_{2} 1 mM. Las fracciones conteniendo P-Selectina se detectaron mediante transferencia Western con el anticuerpo monoclonal PNB1.6.

Cromatografía con lentil lectina: El sobrenadante de la ``P-Selectina soluble'' o el extracto con detergente de la ``P-Selectina unida a membrana'' procedentes de 25 unidades de plaquetas se pasaron por una columna (1,5 \times 5,5 cm) de lectina procedente de Lens culinaris (lentil lectina) acoplada a Sepharose™ 4B (Sigma Chemical Co., L-0511). A continuación se lavó la columna con 150 ml de Tris 20 mM, NaCl 0,1 M, pH 7,5. Las glicoproteínas se eluyeron a continuación de la columna con 10 \times 3 ml alícuotas de Tris 20 mM, NaCl 0,5 M, alfa-metil D-manopiranósido 0,5 M, pH 7,5. Las fracciones conteniendo P-Selectina se concentraron hasta 1,5-2 ml en un Centripep™ 30 de Amicon.

Cromatografía de filtración en gel: Las fracciones concentradas procedentes de la lentil lectina se inyectaron en una columna de hplc G3000SW de Toso Haas (21,5 mm \times 30 cm) equilibrada con Tris 20 mM, NaCl 0,1 M, pH 7,5. La columna se eluyó con el mismo tampón a una velocidad de flujo de 0,75 ml/min, se recogieron fracciones (1,5 ml), y se analizaron mediante transferencia Western. Las fracciones que contenían P-Selectina se juntaron y concentraron hasta 1,5-2 ml en un Centriprep™ 30 de Amicon, seguida por varios intercambios de tampón con Tris 20 mM, pH 7,5.

Cromatografía con heparina-agarosa: La muestra, en Tris 20 mM, pH 7,5, se aplicó a una columna de 1 ml de heparina-agarosa, se lavó la columna con el mismo tampón y se eluyó con Tris 20 mM, NaCl 1,5 M, pH 7,5.

Cromatografía de intercambio catiónico: Las fracciones juntas procedentes del paso anterior se intercambiaron en Tris 20 mM, pH 7,5, y se inyectaron en una columna de hplc CM-5PW de Toso Haas (21,5 mm \times 15 cm) equilibrada con Tris 20 mM, pH 7,5, y se eluyó con un gradiente de sal hasta NaCl 1 M. Las fracciones que contenían P-Selectina se juntaron y concentraron hasta 0,5-1 ml en un Centriprep™ 30 de Amicon, y se almacenaron a -80ºC.

C. Aislamiento y desactivación de plaquetas humanas recientes

Todos los compuestos químicos usados a lo largo del procedimiento de aislamiento de plaquetas se obtuvieron de Sigma Chemical Company, St. Louis, MO.

1.

Se extrajeron 42 ml de sangre de un donante de sangre voluntario humano en un jeringa que contenía 7 ml de anticoagulante Dextrosa Citrato Ácido (ACD).

Preparación de anticoagulante ACD

\dotable{\tabskip6pt\hfil#\hfil\+\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Dextrosa \+ 2,0  g\cr  Citrato Sódico \+ 2,49 g\cr  Ácido cítrico
\+ 1,25
g\cr}

Llevar hasta 100 ml con agua destilada.

2.

Se retiró la aguja y se transfirió la sangre a dos tubos de 50 ml estériles.

3.

Se centrifugaron los tubos en una centrífuga IECC-6000 equipada con una cabeza 921 (17,2 cm de radio) a 800 r.p.m. (aprox. 90 \timesg) durante 15 minutos, a temperatura ambiente, con el freno desconectado.

4.

Se retiró el sobrenadante usando una pipeta de plástico. Se retiró el sobrenadante tan cerca de la capa pulida como fue posible.

5.

Se centrifugó el sobrenadante a 1200 r.p.m. (aprox. 300 \timesg) durante 6 minutos.

6.

Se retiró el sobrenadante.

7.

Se centrifugó el sobrenadante a 2000 r.p.m. (aprox. 1200 \timesg) durante 10 minutos. Las plaquetas aparecieron como un botón de células en el fondo del tubo. Se descartó el sobrenadante.

8.

Se lavaron las plaquetas como sigue: Se añadieron 2 ml de tampón Tyrode-Hepes, pH 6,5, conteniendo prostaglandina E_{1} (PGE_{1}) en una concentración final de 100 nM, y las plaquetas se resuspendieron gentilmente. Se añadieron otros 10 ml del mismo tampón y se centrifugó la muestra a 3000 r.p.m. durante 10 minutos.

Preparación de tampón Tyrode-Hepes

\dotable{\tabskip6pt\hfil#\hfil\+\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 NaCl \+ 8,0 g\cr  KCl \+ 0,2 g\cr  NaH _{2} PO _{4} .H _{2} O \+
0,057 g\cr  MgCl _{2} .6H _{2} O \+ 0,184 g\cr  NaHCO _{3}  \+ 0,1
g\cr  Dextrosa \+ 1,0 g\cr  Hepes \+ 2,383
g\cr}

Llevar a 1 litro con agua destilada. Ajustar el pH 6,5 con NaOH 1 N.

9.

Se repitió el paso #8 una vez más y a continuación se lavaron las plaquetas una vez en el mismo tampón sin PGE_{1}.

10.

Se contaron las plaquetas en un Contador Coulter™ y se diluyeron hasta 2 \times 10^{8}/ml.

11.

El pH de la suspensión de plaquetas se ajustó a 7,2, y se determinó la cantidad de trombina (trombina humana, Sigma) requerida para la máxima inactivación.

12.

La cantidad de trombina requerida se añadió a la preparación de plaquetas y se dejó reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos, sin agitación para impedir la agregación.

Ejemplo 2

Preparación del anticuerpo bloqueador de P-Selectina

Este ejemplo describe la preparación de mAB PB1.3, un anticuerpo monoclonal contra la P-Selectina que inhibe la unión de las plaquetas activadas por trombina a neutrófilos.

Un ratón RBF/DnJ macho, recibido de los Laboratorios Jackson, se usó como fuente de células productoras de anticuerpo, y se inmunizó de acuerdo con el siguiente plan (todas las inyecciones se realizaron intraperitonealmente):

1.

Mes 1 - 200 \mul de ``plaquetas caducadas'' empaquetadas, conteniendo aproximadamente 6 \times 10^{9} plaquetas.

2.

Mes 2 - 250 \mul de ``plaquetas caducadas'' empaquetadas (8 \times 10^{9} plaquetas).

3.

Mes 3 - 250 \mul de ``plaquetas caducadas'' empaquetadas (8 \times 10^{9} plaquetas).

4.

Mes 1 - Fracción ``soluble'' de P-Selectina, aislada sobre lentil lectina.

5.

Mes 1 - P-Selectina ``soluble'', purificada mediante cromatografía con lentil lectina, de filtración en gel, con heparina-agarosa, e intercambio iónico.

Los detalles de la preparación de todos los agentes usados en la inmunización se presenta en el EJEMPLO 1.

A. Línea celular de fusión con mieloma

FOX-NY, una línea celular de mieloma de ratón defectuosa para la fosforibosiltransferasa de adenosina (APRT) y la fosforibosiltransferasa de hipoxantina (HPRT) se obtuvo de la American Type Culture Collection (CRL 1732) y se mantuvo en RPMI 1640 que contenía un 10% de suero fetal bovino (Hyclone) y un 1% de L-glutamina.

B. Procedimiento de fusión celular

Cuatro días después del estímulo final, se retiró el bazo y se recuperaron 1,2 \times 10^{8} esplenocitos. Estos se fusionaron con células de mieloma FOX-NY usando PEG 1500 (BMB) usando el siguiente protocolo: los esplenocitos aislados se lavaron dos veces en medio de cultivo de células libre de suero. Los esplenocitos y las células de mieloma de combinaron en una proporción de 1:4,7 (mielomas respecto células de bazo). El precipitado de células combinadas se lavó dos veces en medio sin suero, a continuación se aspiró hasta secarlo. El precipitado de célula se resuspendió mediante golpeteo suave, y se calentó en un baño de agua a 37ºC durante 1 minuto. El precipitado se distribuyó alrededor de los lados y fondo de un tubo cónico de 50 ml de centrífuga. Se añadió un ml de PEG 1500 (50% p/v en HEPES 75 mM, BMB Lote #14702800) previamente calentado hasta 37ºC, a lo largo de 60 segundos, mientras que se giraba el tubo para mantener una fina capa de células. Se añadió lentamente un ml de medio sin suero a lo largo de 60 segundos. Se añadió 1 ml adicional de medio ligeramente más rápido. Se añadieron otros 8 ml de medio, y se dejó reposar le tubo sin molestarlo durante 8 minutos, y a continuación se centrifugó durante 5 minutos a 300 \timesg. El precipitado final se resuspendió en RPMI 1640 conteniendo un 10% de suero fetal bovino (Hyclone), 1% de L-glutamina, 1% de piruvato sódico, y 1\timesAAT (Sigma). Las células se sembraron en 10 placas de microvaloración de 96 pocillos de fondo plano (COSTAR™). No se usaron células alimentadoras.

Ejemplo 3

Preparación del anticuerpo anti-P-Selectina que no bloquea la P-Selectina

Este ejemplo describe la preparación de mAB PNB1.6, un anticuerpo monoclonal contra la P-Selectina que no inhibe la unión de plaquetas activadas por trombina a neutrófilos.

Un ratón RBF/DnJ macho, recibido de los Laboratorios Jackson, se usó como fuente de células productoras de anticuerpo, y se inmunizó de acuerdo con el siguiente plan (todas las inyecciones se realizaron intraperitonealmente):

1.

Mes 1 - 100 \mul de plaquetas recién aisladas activadas con trombina (aproximadamente 3 \times 10^{9} plaquetas).

2.

Mes 2 - 200 \mul de plaquetas recién aisladas activadas con trombina (aproximadamente 6 \times 10^{9} plaquetas).

3.

Mes 3 - 100 \mul de plaquetas recién aisladas activadas con trombina (aproximadamente 3 \times 10^{9} plaquetas).

Cuatro días después del estímulo final, se retiró el bazo y se recuperaron los esplenocitos. Estos se fusionaron con células de mieloma FOX-NY usando PEG 1500 (BMB), generalmente tal como se describe en Oi et al., ``Immunoglobulin-Producing Hybrid Cell Lines'' en Selected Methods in Cellular Immunology., Eds. Mishell y Shiigi, pp. 351-372, 1980.

Ejemplo 4

Examinando en busca de anticuerpos

Este ejemplo describe el examen de medio sobrenadante procedente de células fusionadas producidas en los Ejemplos 2 y 3. Los sobrenadantes del Ejemplo 2 se ensayaron mediante ensayo ELISA contra (a) plaquetas activadas por trombina, (b) P-Selectina purificada, y *(c) P-Selectina recombinante. Los sobrenadantes del Ejemplo 2 se ensayaron mediante ensayo ELISA contra plaquetas activadas por trombina. Cada uno de los ensayos se describe más abajo. La preparación de los reactivos usados en cada uno de los ensayos se describe en el EJEMPLO 1.

A. Plaquetas activadas con trombina

1.

Se recubrió una placa COSTAR™ de 96 pocillos de fondo plano con gelatina al 0,1% (gelatina al 2%, Sigma) añadiendo 100 \mul/pocillo e incubando a 37ºC durante 15 minutos.

2.

Se retiró la gelatina y se añadieron 100 \mul de plaquetas activadas con trombina (10^{8}/ml) a cada pocillo.

3.

Se incubó la placa a 37ºC durante 15 minutos.

4.

Se centrifugó la placa a 800 r.p.m. (90 \timesg) durante 2 minutos.

5.

Las plaquetas no unidas se suprimieron y se lavó la placa \times2 con PBS.

6.

Se añadieron 100 \mul de PBS conteniendo 1% de BSA a cada pocillo y se dejó reposar la placa a temperatura ambiente durante 60 minutos.

7.

Se añadieron 100 \mul de sobrenadante a cada pocillo. Se colocó la placa sobre un agitador a temperatura ambiente durante 60 minutos.

8.

Se lavó la placa 4\times con PBS.

9.

Se añadieron a cada pocillo 100 \mul de IgG anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa, diluida 1/1000 en PBS conteniendo 1% de BSA. Se dejó reposar la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos.

10.

Se lavó la placa \times7 con PBS.

11.

Se añadieron a cada pocillo 100 \mul del sistema de sustrato ABTS™ (Kirkegaard y Perry Laboratories, Inc.).

12.

Se dejó revelar la placa a temperatura ambiente durante hasta 30 minutos.

13.

Se midió la OD a 414 nm en un Multiskan MCC/340 de Titertek™.

B. P-Selectina purificada

1.

La P-Selectina ``soluble'' o ``unida a membrana'', aislada mediante cromatografía con columnas de lentil lectina, filtración con gel, y DEAE, se diluyó (1:50 hasta 1:1000) en DPBS (la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco es una solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene CaCl_{2} (1 mM) y MgSO_{4} (0,5 mM)) y se recubrió, durante la noche a 4ºC, en placas de microvaloración de 96 pocillos Falcon™.

2.

A continuación se bloquearon las placas durante 1 hora con DPBS + 1% de BSA.

3.

Los sobrenadantes a ensayar se añadieron entonces a los pocillos, y se incubaron durante 30-60 minutos a temperatura ambiente.

4.

Se lavaron las placas con DPBS, y a continuación se añadió a los pocillos el conjugado de peroxidasa de rábano silvestre-IgG anti-ratón de oveja (Sigma A-6782, 1:1000 en DPBS + 1% de BSA), y se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 1 hora.

5.

A continuación se lavaron las placas con DPBS, y se revelaron con el sistema de sustrato de micropocillos TMB (Kirkegaard y Perry Laboratories, Inc.).

C. P-Selectina recombinante

1.

Se recubrieron placas de 96 pocillos de fondo plano durante la noche a 4ºC con 100 \mul de P-Selectina, la cual se había vertido en el medio libre de suero de un pool de 293 clones de células transfectadas con el gen de la P-Selectina recombinante. Este sobrenadante contenía al menos 8 ng/ml de P-Selectina, y se recubrió sobre placas COSTAR, bien sin diluir, bien diluido 1:8 con medio.

2.

La placa se lavó una vez con PBS de Dulbecco (DPBS) y se bloqueó con 200 \mul de DPBS que contenía 1% de BSA, durante 30 minutos a temperatura ambiente.

3.

A continuación se procesó la placa para el ensayo de ELISA de acuerdo con los pasos 7-13 en la SECCIÓN A, PÁGINA 44 (Ejemplo 4).

D. Análisis de isotipos de mABs contra la P-Selectina

El análisis de isotipos de mAB PB1.3 y PNB1.6 indicó que ambos anticuerpos monoclonales eran de la subclase IgG1 de inmunoglobulina de ratón. La identificación del isotipo se realizó usando el procedimiento de captura del Equipo para Mouse-Hybridoma Subtyping de Boehringer Mannheim.

Ejemplo 5

Detección de la P-Selectina

Este ejemplo describe la detección de P-Selectina mediante transferencia Western. Las muestras conteniendo P-Selectina se mezclaron con un volumen igual de tampón de muestras para SDS-PAGE (no reductor), se calentaron a 100ºC, se analizaron sobre un gradiente de gel Novex 8-16%, y se transfirieron electroforéticamente a nitrocelulosa. A continuación se bloqueó la membrana de nitrocelulosa durante al menos 1 hora en solución salina tamponada con fosfato (PBS) + 1% de albúmina de suero bovina (BSA). Entonces se incubó la membrana a temperatura ambiente durante 1 hora o más, o con sobrenadante de cultivo de tejido procedente de hibridomas que expresaban el anticuerpo monoclonal apropiado, o con anticuerpo purificado (5 \mug/ml) en PBS + 1% BSA. A continuación se lavó la membrana varias veces en PBS + 1% BSA, y se incubó durante 1 hora con una dilución 1:1000 de conjugado de IgG anti-ratón de oveja y peroxidasa de rábano silvestre (Sigma, A-6782) en PBS + 1% BSA. Entonces se lavó la membrana, y se visualizaron las bandas con tetrametilbencidina/potenciador de membrana (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.).

Para los sobrenadantes de cultivo de tejidos procedentes de ambos, PB1.3 y PNB1.6, se detectó una proteína que tenía un peso molecular de 140 kDa. Esto se observó en preparaciones de membranas solubilizadas de plaquetas, así como con P-Selectina purificada.

Ejemplo 6

Inhibición in vivo de la lesión inflamatoria aguda mediante anticuerpo bloqueador de P-Selectina

Este ejemplo proporciona datos que demuestran la capacidad del anticuerpo bloqueador de la P-Selectina de la invención para tratar la lesión pulmonar aguda. En este ejemplo, se produjo la activación del complemento sistémico mediante infusión del factor del veneno de cobra (CVF) en ratas. La lesión en este modelo se desarrolla rápidamente, y se sabe que es dependiente de los productos de oxígeno tóxicos generados por neutrófilos.

Para estos estudios, se usaron los dos anticuerpos monoclonales descritos en los EJEMPLOS 2 y 3. De especial importancia para este estudio, el anticuerpo PB1.3 bloqueador de la P-Selectina también inhibió la adhesión de plaquetas activadas por trombina a neutrófilos humanos (no se muestran los datos). Estos datos sugieren que el PB1.3 reconoce un epítopo funcional conservado de la P-Selectina, y que un anticuerpo bloqueador de la P-Selectina podría ser útil en el tratamiento de otras lesiones inflamatorias.

Para los experimentos in vivo, se infundieron intravenosamente 20 unidades de CVF/kg de peso corporal en ratas Long-Evans macho adultas. Esto resulta en el secuestro rápido de neutrófilos de la sangre intrapulmonar e intravascularmente, con lesión resultante de las células endoteliales capilares intersticiales en los puntos de contacto físico de células endoteliales y neutrófilos. Cuando se emplearon, el PB1.3 y el PNB1.6 se infundieron intravenosamente, en las cantidades indicadas, junto con el CVF, en un volumen total de 0,5 ml. Los animales control negativos recibieron 0,65 ml de infusión intravenosa de solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, el material de infusión también contenía cantidades traza de [^{125}I]-albúmina de suero bovina y [^{51}Cr]-hematíes (RBC) homólogos. Los parámetros de la lesión pulmonar (pérdida de albúmina y extravasado de RBC) se determinaron a los 30 minutos, de acuerdo con técnicas establecidas (Mulligan et al., J. Clin. Invest. 88:1396 (1991)).

Los resultados de estos experimentos se muestran en las Figuras 2A y 2B. La co-infusión de 200 \mug de PNB1.6 (el anticuerpo anti-P-Selectina no bloqueador) junto con el CVF no consiguió causar reducción alguna de la lesión pulmonar cuando se comparó con los valores de controles positivos de CVF sin tratar. Por tanto, los animales que recibieron CVF PNB1.6 en PBS sirvieron como los valores control positivos de referencia. Cuando se infundieron 100 \mug de PB1.3 con el CVF, la permeabilidad se redujo en el 19,2% (p = 0,002) y la hemorragia se redujo en el 37,5% (p = 0,001) (no se muestran los datos). Cuando se añadieron 200 \mug de PB1.3, la permeabilidad se redujo en el 50,8% (p < 0,001) (Figura 2A) y la hemorragia respectivamente en el 70,0% (p < 0,001) y 70,1% (p < 0,001) (Figura 2B).

Los pulmones procedentes de conjuntos de animales compañeros se homogeneizaron mediante sonicación, y se midió la actividad mieloperoxidasa (MPO) con objeto de obtener una estimación del contenido en neutrófilos del pulmón. La MPO se determinó mediante la descomposición de H_{2}O_{2} en presencia de o-dianisidina de acuerdo con procedimientos estándar, Warren et al., J. Clin. Invest. 84:1873 (1989). Tal como se muestra en la Figura 3, el tratamiento con 100, 200 ó 400 \mug de PB1.3 redujo el contenido en MPO por debajo de los valores en el grupo control positivo (sin tratar) de referencia respectivamente en el 26% (p = 0,024), 41% (p < 0,001) y 50% (p < 0,001). En los animales inyectados con 200 \mug de PNB1.6 no hubo reducción alguna en el contenido de MPO (Figura 3), de forma consistente con la incapacidad de este anticuerpo para proteger contra la lesión pulmonar inducida por CVF. Por tanto, los efectos protectores del anticuerpo bloqueador PB1.3 se correlacionan con su capacidad para interferir con la acumulación de neutrófilos en el tejido pulmonar. El examen mediante microscopio electrónico de transmisión de secciones pulmonares confirmó que el tratamiento con PB1.3 resultó en una acumulación reducida de neutrófilos dentro de los capilares intersticiales pulmonares, una adherencia disminuida de neutrófilos a células endoteliales, y una evidencia reducida de células endoteliales dañadas.

Con objeto de investigar la expresión pulmonar de la P-Selectina a continuación de la inyección intravenosa del CVF, se infundió un grupo adicional de ratas con CVF y se sacrificaron los animales a los 0, 5, 10, 15, 20 y 60 minutos posteriores. Se inflaron los pulmones con O.C.T., se congelaron de golpe, y se obtuvieron secciones y se examinaron por la presencia de P-Selectina mediante técnicas inmunohistoquímicas usando PB1.3. En el minuto 0 se halló poca reactividad detectable en la vasculatura pulmonar, mientras que la tinción era claramente evidente a los 5 minutos e incrementaba a los 15 y 20 minutos de la infusión del CVF. El patrón de tinción implicó las venillas pulmonares y las áreas septales en un patrón consistente con la tinción de capilares intersticiales. A los 60 minutos, la tinción había desaparecido en su mayor parte (no se muestran los datos). Aunque la P-Selectina está presumiblemente presente en los gránulos de almacenamiento intracelular antes de la infusión del CVF, es evidente que la movilización de la P-Selectina hacia la superficie del endotelio potenció dramáticamente su reactividad con el anticuerpo PB1.3.

Ejemplo 7

Ensayo de unión competitiva

Los procedimientos para aislar plaquetas a partir de sangre humana, para la activación de plaquetas aisladas con trombina, y para el aislamiento de PMN (neutrófilos) se describen en el Ejemplo 1 anterior: INCUBACIÓN DE PLAQUETAS ACTIVADAS CON TROMBINA CON ANTICUERPOS MONOCLONALES CONTRA LA P-SELECTINA.

a.

Colocar 20 \mul de plaquetas activadas con trombina (2 \times 10^{8}/ml) en cada uno de 24 tubos Eppendorf™ (1,5 ml) por duplicado.

b.

A 8 de estos tubos, añadirles 20 \mul de la fracción IgG purificada a partir de PNB1.6 a una concentración de 10 \mug/ml en tampón Tyrode-Hepes, pH 7,2 conteniendo CaCl_{2} 1 mM. A una segunda ristra de 8 tubos, añadirles 20 \mul de la misma preparación de IgG a una concentración de 1 \mug/ml. A una tercera ristra de 8 tubos, añadirles 20 \mul del tampón solo.

c.

Mezclar y dejar reposar a temperatura ambiente durante 20 minutos.

d.

Añadir a cada ristra de 8 tubos 20 \mul de la fracción de IgG purificada a partir de PB1.3, en concentraciones que oscilen desde 10 \mug/ml hasta 0,03 \mug/ml.

e.

Mezclar y dejar reposar a temperatura ambiente durante 20 minutos.

f.

Añadir 20 \mul de neutrófilos a 3 \times 10^{6}/ml.

g.

Mezclar y dejar reposar a temperatura ambiente durante 20 minutos.

h.

Evaluar la adhesión microscópicamente como sigue: contar 100 neutrófilos en cada muestra. Puntuar una célula como positiva si ha unido 2 o más plaquetas, y como negativa si ha unido menos de 2. Calcular el porcentaje de células positivas.

Tal como se muestra en la Figura 4, el tratamiento previo de plaquetas activadas con trombina con PNB1.6 no afectó la capacidad del PB1.3 para bloquear su adhesión a neutrófilos mediada por P-Selectina.

Ejemplo 8

Caracterización de la unión de anticuerpos bloqueadores de la P-Selectina

I

(a)

Purificación de anticuerpos monoclonales: Los anticuerpos monoclonales PNB1.6 y 84/26 se aislaron a partir de sobrenadantes de cultivos de tejidos mediante su paso a través de una columna de Proteína G-Sepharose™ 4 Fast Flow (Pharmacia). La columna se lavó extensivamente con solución salina tamponada con fosfato (PBS), y el anticuerpo unido se eluyó con glicina-HCl 0,1 M, pH 2,7, en tubos que contenían de 0,2 a 0,5 en volumen de Tris 1 M, pH 8,8. El procedimiento usado para aislar el PB1.3 fue idéntico, excepto que el anticuerpo unido a la Proteína G se eluyó con acetato-HCl 0,1 M, pH 2,5, en tubos que contenían de 0,3 volúmenes de Tris 2 M, pH 10. Las fracciones que contenían anticuerpo se juntaron, y se dializaron frente varios cambios de PBS a 4ºC.

(b)

Preparación de la columna de afinidad por PB1.3: Para su uso en la purificación de la P-Selectina, el PB1.3 se acopló a agarosa activada con tresil de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Schleicher y Schuell).

(c)

Purificación de P-Selectina: a plaquetas humanas caducadas lavadas, preparadas tal como se describe más arriba, se les añadió 1/100 en volumen de 5 mg/ml de leupeptina, y 1/100 en volumen 35 mg/ml de AEBSF 35 (Calbiochem). Después de mezclarlas, las plaquetas se congelaron/descongelaron tres veces, o en un baño de hielo seco/metanol o en nitrógeno líquido, se homogeneizaron con diez golpes en un homogeneizador Dounce, y se centrifugaron durante 1 h a 35.000 r.p.m., a 4ºC, en un rotor Ti-70 de Beckman. El precipitado se resuspendió en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS, Whittaker Bioproducts, que contiene aproximadamente Ca^{2+} 0,9 \muM y Mg^{2+} 0,5 mM), y se hizo 5 mM en benzamidina-HCl, 100 \muM en leupeptina, y 2% en Triton X-100. Se resuspendió la suspensión y se homogeneizó con 10 golpes en un homogeneizador Dounce. Después de 1 h de incubación a 4ºC, la solución se centrifugó de nuevo en un rotor Ti-70 de Beckman, durante 1 h a 4ºC, a 35.000 r.p.m. El sobrenadante se pasó a través de una columna de PB1.3-agarosa que se había equilibrado previamente con DPBS + 0,05% Rennex 30 (Accurate Chemical and Scientific Corp.). Se lavó la columna extensivamente con DPBS + 0,05% Rennex 30, y la P-Selectina unida se eluyó con trietilamina-HCl 0,1 M, 0,05% Rennex 30, pH 11,5, en tubos que contenían 0,1 volúmenes de fosfato 1 M, pH 6,8. Las fracciones que contenían P-Selectina se juntaron, de dializaron frente DPBS + 0,05% Rennex 30, se concentraron usando o un concentrador rotativo Centricon-30™ o Centripep-30™ (Amicon™, se repartieron en alícuotas, y se almacenaron a -80ºC.

(d)

Preparación del péptido CQNRYTDLVAIQNKNE (Cys-Gln-Asn-Asr-Tyr-Thr-Asp-Leu-Val-Ala-Ile-Gln-Asn-Lys-Asn-Glu-NH_{2}). El péptido se sintetizó en un sintetizador de péptidos 430A de Applied Biosystems (Foster City, CA) usando aminoácidos protegidos con Fmoc y ésteres de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio hexa-fluorofosfato (HBATU) para la activación de aminoácidos. Cada aminoácido se acopló doblemente de forma rutinaria. Los aminoácidos protegidos con Fmoc y la hidroxibenzotriazola se compraron a Applied Biosystems. Todos los solventes se compraron a Burdick y Jackson. El HBTU se compró a Richelieu Biotechnologies (St. Hyacinthe, Canadá). La piperidina y el ácido trifluoroacético, el anhídrido acético, el tioanisol, el fenol, y el etaneditiol se adquirieron a Sigma Chemical Corporation.

La resina Fmoc-amida se cargó (Bachem Biosciences) se cargó en el frasco de reacción de la síntesis de péptidos y se lavó una vez con N-metilpirrolidona (NMP). A continuación se realizaron las siguientes operaciones de forma secuencial:

1.

El grupo protector Fmoc se retiró mediante tratamiento del aminoácido unido a la resina con piperidina al 25% en NMP.

2.

La resina se lavó 5 veces con NMP.

3.

Se añadió una mezcla que contenía N-\alpha-Fmoc-L-ácido glutámico, \gamma-t-butiléster, diisopropiletilenamina, HBTU y NMP al frasco de reacción, y se dejó reaccionar durante 30 minutos con agitación con vórtice.

4.

Se extrajo el solvente, y se lavó la resina tres veces con NMP.

5.

Los pasos (3) y (4) se repitieron dos veces más.

6.

La resina se lavó cuatro veces más con NMP. Los pasos 1-6 se repitieron para cada uno de los aminoácidos del péptido. A continuación del ciclo de acoplamiento final, se desprotegió el péptido unido a la resina mediante reacción con piperidina al 25% en NMP, se lavó siete veces con NMP, y se lavó 2 veces con diclorometano. Se secó la resina al vacío durante 24 horas. Se separó el péptido de la resina mediante tratamiento con ácido trifluoroacético que contenía un 2,5% de etanoditiol, 5% de tioanisol, 7,5% de fenol, y 5% de agua. La resina de poliestireno se separó del ácido trifluoroacético mediante filtración. El ácido trifluoroacético se suprimió mediante evaporación en vacío. El péptido crudo se trituró con dietiléter y se disolvió en agua. El agua se suprimió mediante liofilización. A continuación se purificó el péptido mediante HPLC en fase inversa en una columna C_{8} (VYDAC), usando un gradiente de acetonitrilo y agua, conteniendo cada uno un 0,1% de TFA como modificador.

(e)

Biotinilación de los anticuerpos monoclonales: Los anticuerpos se dializaron frente bicarbonato sódico 0,1 M, pH 8,5. Se añadió NHS-LC Biotina (Pierce) a 0,3 mg/ml. Después de 2 horas a temperatura ambiente, se dializaron los anticuerpos frente varios cambios de PBS.

(f)

Recubrimiento de placas de microvaloración para ELISA: Se recubrieron placas de microvaloración de 96 pocillos (Falcon) durante la noche, a 4ºC, con 50 \mul/pocillo de 2 \mug/ml de P-Selectina, purificada por afinidad, en DPBS.

(g)

Transferencia Western: PB1.3, PNB1.6, y 84/26 se unen todos ellos a una única banda de 140 kDa cuando se disolvieron las plaquetas en tampón de análisis para SDS-PAGE (sin reducir), se sometieron a SDS-PAGE, y se transfirieron a nitrocelulosa (no se muestran los datos). También hemos hallado que el PB1.3 y el PNB1.6 ya no reconocen la P-Selectina sobre transferencias Western cuando las muestras se han reducido con \beta-mercaptoetanol.

II. Efecto de quelar los cationes divalentes sobre la unión de anticuerpos monoclonales a la P-Selectina: Se recubrieron dos placas de microvaloración con P-Selectina, purificada por afinidad, como más arriba. La placa 1 se bloqueó con 200 \mul/pocillo de PBS + 1% de BSA, mientras que la placa 2 se bloqueó con 200 \mul/pocillo de DPBS + 1% de BSA (el DBPS contiene Ca^{2+} y Mg^{2+}). Transcurrida 1 hora, se lavaron las placas (todos los lavados de la placa 1 fueron con PBS, para la placa 2 con DPBS). Se añadieron 25 \mul de EDTA 25 mM en PBS + 1% de BSA a los pocillos de la placa 1, y se añadieron 25 \mul de DPBS + 1% de BSA a la placa 2. Transcurrida 1 hora, se añadieron 25 \mul de las diluciones de los anticuerpos apropiados a los pocillos de cada placa. Las diluciones para la placa 1 se prepararon con PBS + 1% de BSA, para la placa 2 en DPBS + 1% de BSA. Después de 1 hora, se lavaron las placas, y se añadieron 50 \mul de una dilución 1 a 1000 de conjugado de IgG anti-ratón de oveja y peroxidasa de rábano silvestre (las diluciones para la placa 1 se prepararon con PBS + 1% de BSA, para la placa 2 en DPBS + 1% de BSA. Transcurrida 1 hora, se lavaron las placas, y se añadieron 50 \mul del sustrato de peroxidasas TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina, Kirkegaard y Perry Laboratories, Inc.). Una vez se hubo desarrollado el color hasta los niveles apropiados, se detuvo la reacción del sustrato mediante la adición de 25 \mul de ácido fosfórico 1 M y se registró la absorbancia a 450 nm.

La Figura 4 muestra la unión de los anticuerpos anti-P-Selectina a la P-Selectina en el tampón DPBS, el cual contiene Ca^{2+} y Mg^{2+}, y en PBS + EDTA 25 mM, un quelante de cationes metálicos divalentes. La concentración de cationes divalentes en el DPBS es más que suficiente para permitir la adhesión de neutrófilos a P-Selectina (Geng et al., 1991), mientras que el quelante EDTA, a 25 mM, es más que suficiente para bloquear la adhesión de neutrófilos a la P-Selectina. La unión de la totalidad de los anticuerpos monoclonales a la P-Selectina se ve poco afectada por la presencia de EDTA, demostrando que no es necesario que el Ca^{2+} esté presente para que ocurra la unión. PB1.3 es un anticuerpo bloqueador, esto es, es capaz de bloquear la unión de neutrófilos a la P-Selectina, por ejemplo, sobre plaquetas activadas. El PNB1.6 es un \an no bloqueador. La capacidad del 84/26 para bloquear la unión de neutrófilos a P-Selectina no se ha caracterizado completamente todavía. Por contra, de los anticuerpos monoclonales anti-P-Selectina descritos por Geng et al., sólo en anticuerpo no bloqueador S12 es capaz de unirse en ausencia de Ca^{2+}.

III. Efecto del péptido CQNRYTDLVAIQNKNE sobre la unión del PB1.3 a la P-Selectina: Se recubrió una placa de microvaloración con P-Selectina purificada por afinidad como más arriba, se bloqueó con 200 \mul/pocillo de DPBS + 1% de BSA durante 1 hora, y se lavó. Las diluciones de PB1.3 en DPBS + 1% de BSA se mezclaron o con 0,35 mg/ml de CQNRYTDLVAIQNKNE en PBS, o como control, con PBS solo. Transcurrida 1 hora, se añadieron 50 \mul de cada dilución de anticuerpo a la placa de microvaloración, y se incubaron durante 1 hora. Se lavó la placa con DPBS, y se añadió una dilución 1 a 1000 de conjugado de IgG anti-ratón de oveja y peroxidasa de rábano silvestre en DPBS + 1% de BSA. Después de 1 hora, se lavaron las placas, se añadió el sustrato TMB, y se detuvo el desarrollo de color y se leyeron las placas como más arriba.

La Figura 5 muestra que el péptido CQNRYTDLVAIQNKNE, homólogo a los residuos 19-34 del dominio de lectina de la P-Selectina, no tiene efecto alguno sobre la unión del PB1.3 a la P-Selectina cuando el péptido está presente en una concentración de 0,35 mg/ml. Esto distingue este anticuerpo monoclonal concreto de los anticuerpos monoclonales G1, G2 y G3, cuya unión a la P-Selectina es parcial o completamente bloqueada por este péptido.

IV. Capacidad de los anticuerpos monoclonales de Cytel PB1.3, PNB1.6, y 84/26 para bloquear la unión de cada uno de los otros a la P-Selectina: Se bloquearon placas de microvaloración, recubiertas con P-Selectina purificada por afinidad como más arriba, durante 1 hora con DPBS + 1% de BSA, y se lavaron. Se añadieron 25 \mul de una solución de 50 \mug/ml de PB1.3, PNB1.6, o 84/26 en DPBS + 1% de BSA a los pocillos apropiados, y se incubaron durante 1 hora. A continuación, se añadieron 25 \mul de una dilución de anticuerpo biotinilado (en DPBS + 1% de BSA). Entonces se incubó la placa sobre una plataforma agitadora durante 1 hora. Después de lavarlas, se añadieron 50 \mul de una dilución 1 a 1000 de un conjugado de estreptoavidina y peroxidasa de rábano silvestre, y se incubaron durante 1 hora. Después de lavarlas con DPBS, se revelaron las placas con el sustrato TMB como más arriba.

La Figura 6 muestra la capacidad de los anticuerpos monoclonales PB1.3, PNB1.6, y 84/26 para interferir con la unión de cada uno de los otros con la P-Selectina. La Figura 6A muestra que sólo el PNB1.6 es capaz de bloquear la unión de PNB1.6 biotinilado a la P-Selectina, demostrando que el PB1.3 y el 84/26 deben reconocer epítopos diferentes del PNB1.6. De igual forma, en la Figura 6B, PB1.3, pero no PNB1.6 o 84/26, es capaz de bloquear la unión de PB1.3 biotinilado a la P-Selectina, demostrando que los otros dos anticuerpos monoclonales deben reconocer epítopos diferentes. En la Figura 6C, ambos, el 84/26 y el PB1.3, pero no el PNB1.6, son capaces de bloquear la unión del 84/26 biotinilado a la P-Selectina.

V. Los anticuerpos bloqueadores de la P-Selectina no inhiben la agregación de plaquetas humanas inducida por trombina. Este ejemplo demuestra que los anticoagulante contra la P-Selectina, PB1.3 y PNB1.6, no inhiben la agregación de plaquetas inducida por trombina. Las plaquetas recientes humanas se aislaron tal como se ha descrito previamente, y se suspendieron en tampón Tyrode-Hepes, pH 7,2, a una concentración de 2 \times 10^{8}/ml.

La agregometría de plaquetas se realizó en un agregómetro Lumi (Chrono-Log Corp.). Para el ensayo se colocaron 0,45 ml de la suspensión de plaquetas en una cubeta siliconada estándar. A ésta se le añadieron 10 \mul del anticuerpo o vehículo de control. Transcurridos 5 minutos a 37ºC, se añadieron 0,1 unidades de trombina (humana, Sigma), y se registró la agregación.

Cuando se midió la agregación de plaquetas en condiciones control, en ausencia de anticuerpo, se obtuvo una respuesta de agregación de 71 unidades. Se obtuvo una extensión de agregación equivalente en presencia de 10 \mul de sobrenadantes sin diluir de cultivos de células productoras de anticuerpo PB1.3 (Figura 7). Se añadieron diferentes concentraciones de PB1.3 (1-100 \mug/ml) a la suspensión de plaquetas. La agregación de plaquetas no fue diferente a ninguna concentración de PB1.3 de la respuesta determinada en ausencia de anticuerpo (Figura 7).

Ejemplo 9

Efectos protectores in vivo del anticuerpo bloqueador de la P-Selectina, PB1.3, en la isquemia de miocardio y reperfusión de felinos

Se realizó un modelo de isquemia de miocardio y lesión por reperfusión en gatos de acuerdo con los procedimientos de Tsao et al. (Circulation 82:1402-1412 (1990)). En resumen, se anestesiaron gatos machos (2,5-3,5 kg) con pentobarbital sódico (30 mg/kg, i.v.). Se insertó un tubo intratraqueal a través de una incisión en la línea media, y se les suministró a todos los gatos ventilación con presión positiva intermitente mediante un respirador Harvard para animales pequeños. Se insertó un catéter de polietileno en la vena yugular externa, y se canuló la vena femoral derecha, y se conectó a un transductor de presión Statham P23Ac para la medición de la presión arterial. Se realizó una toracotomía siguiendo la línea media, se abrió el pericardio, y se expuso el corazón. Se colocó cuidadosamente un hilo de sutura 2-0 alrededor de la arteria descendiente anterior izquierda (LAB) a 10-12 mm de su origen. Después de un período de estabilización de 30 minutos, se inició la isquemia de miocardio mediante ligación completa de la LAD durante 1,5 horas de isquemia seguidas por 4,5 horas de reperfusión. Los anticuerpos bloqueador (PB1.3) y no bloqueador (PNB1.6) anti-P-Selectina se administraron intravenosamente, a una dosis de 1 mg/kg, 10 minutos antes del inicio de la reperfusión.

El miocardio isquémico se determinó como la porción de tejido que no se teñía con nitroazul de tetrazolio, y se expresó como el porcentaje del área con riesgo. El área con riesgo se determinó mediante oclusión de nuevo de la LAD al final del período de reperfusión seguida por la inyección de colorante azul de Evans en el atrio izquierdo. Por tanto, el área con riesgo se determinó mediante tinción negativa.

La relajación de los anillos de la arteria coronaria dependiente del endotelio se determinó midiendo la relajación inducida por acetilcolina de los anillos previamente contraídos con el mimético U46619 de tromboxano A2. Los datos se expresan como porcentaje de la relajación.

La acumulación de neutrófilos en el miocardio se midió como la actividad mieloperoxidasa de tejido de miocardio homogeneizado con Polytron.

Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 8. En gatos tratados con el anticuerpo anti-P-Selectina no bloqueador, la extensión de la isquemia de miocardio fue del 33 \pm 5% del área con riesgo. Por contra, la extensión de la isquemia en animales tratados con PB1.3 fue significativamente inferior (p < 0,01) al 15 \pm 3% del área con riesgo. La relajación dependiente del endotelio para la acetilcolina también se preservó significativamente en las arterias coronarias obtenidas de gatos tratados con PB1.3 en comparación con el PNB1.6 (67 \pm 6 vs. 11 \pm 3%, p < 0,1). Una reducción significativa (p < 0,1) en el número de PMN que se une al endotelio de arterias coronarias procedentes de animales tratados con PB1.3 (64 \pm 7 PMN/mm^{2}) en comparación con los animales tratados con PNB1.6 (136 \pm 12 PMN/mm^{2}) sugiere que estos fenómenos son atribuibles a una reducción en la acumulación de leucocitos.

Ejemplo 10

Los cADN que codifican las regiones variables de las cadenas pesadas y ligera del anticuerpo monoclonal PB1.3 de ratón, se clonaron y caracterizaron mediante secuenciación. Las secuencias de las regiones variables y péptidos señales de las cadenas pesada y ligera del PB1.3 se dan en las Figuras 11 y 12. Los CDR de las cadenas pesada y ligera del PB1.3 se sustituyeron con los CDR de la cadena pesada y ligera humana. Las regiones estructurales humanas se modificaron usando la metodología descrita en Monoclonal Antibodies, 2: Applications in Clinical Oncology (Editor A. Epenetos; Chapman & Hill, 1992, ver especialmente, Bendig et al., The Humanization of Mouse Monoclonal Antibodies by CDR-Grafting: Examples with Anti-Viral and Anti-Tumor Cell Antibodies, contenida en éstas para generar diferentes versiones de las regiones variables del PB1.3 humanizado. Las regiones variables humanizadas se insertaron en vectores de expresión. Las secuencias de las regiones constantes humanas se dan en las Figuras 9 y 10. Las secuencias de las regiones variables y péptidos señal de las cadenas pesada y ligera de diferentes versiones de PB1.3/humanizado se dan en las Figuras 13, 14, 15, 16 y 17. Mediante la co-expresión de combinaciones apropiadas de cadenas pesadas y ligeras, se pueden expresar varios anticuerpos humanizados. La co-expresión de pHCMV-1748RH_{a}-\gamma1Ci-dhfr y pHCMV-1748RL_{a}-KR-neo da lugar al PB1.3/humanizado versión A. La co-expresión de pHCMV-1747CH-\gamma1Ci-neo y pHCMV-1747CL-KR-neo da lugar al PB1.3 quimera.

Ejemplo 11

Expresión de PB1.3 y PNB1.3/humanizados en células COS I. Electroporación de células COS

Las construcciones de ADN se ensayaron en células COS por su expresión transitoria del anticuerpo PB1.3/humanizado/quimérico y PB1.3/humanizado. Los ADN se introdujeron en las células COS mediante electroporación usando el aparato Gene Pulser™ (Biorad). Las células COS se tripsinizaron y lavaron una vez en solución salina tamponada con fosfato (PBS). El ADN (10 \mug de cada plásmido de cadena pesada y del plásmido de cadena ligera apropiado) y una alícuota de 0,8 ml de 1 \times 10^{7} células/ml en PBS se colocaron en una cubeta de Gene Pulser™ (Biorad, 0,4 cm de hueco). Se suministró un pulo de 1900 voltios, 25 microfaradios de capacitancia. Después de un período de recuperación de 10 minutos a temperatura ambiente, las células electroporadas se añadieron a 10 ml de medio DMEM (GIBCO) que contenía un 10% de suero fetal bovino. Después de 48 horas de incubación, se recolectó el medio, se centrifugó para suprimir restos celulares, y se almacenó en condiciones estériles a 4ºC durante períodos de tiempo cortos.

II. Ensayo inmunoadsorbente unido a enzima (ELISA)

Los medios procedentes de las células COS transfectadas se ensayaron mediante ELISA, primero para determinar la cantidad de anticuerpo humano que se había producido, y segundo para determinar la cantidad de anticuerpo unido específicamente a la P-Selectina. Se recubrieron placas de microvaloración de 96 pocillos (Falcon™ 3912, Microtest III) con 50 \mul de una solución de P-Selectina recombinante (1,2 mg/ml) o una solución de IgG anti-humana de cabra (molécula entera, Sigma, mg/ml) en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS). Las placas se recubrieron o durante la noche a 4ºC, o durante 2 horas a 37ºC. A continuación se bloquearon las placas con 200 microlitros/pocillo de DPBS + 1% de albúmina de suero bovino (BSA) durante una hora o más. A continuación se lavaron las placas con DPBS.

Se añadieron diluciones en serie de los anticuerpos monoclonales en DPBS + 1% de BSA a las placas (50 microlitros/pocillo), y se incubaron las placas durante una hora a temperatura ambiente. A continuación se lavaron las placas tres veces con DPBS.

Se añadieron a las placas 50 microlitros/pocillo de un segundo anticuerpo (conjugado de IgG anti-humana de cabra con peroxidasa, Sigma A-8867) diluido 1 a 1000 en DPBS + 1% de BSA, y se incubaron las placas durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con DPBS.

Se añadieron 50 microlitros de sustrato de peroxidasa tetrametilbencidina (TMB, procedente de Kirkegaard and Perry Laboratories) a cada pocillo, y se dejó desarrollar el color durante un período de tiempo apropiado (usualmente 3 a 15 minutos), y se detuvo la reacción mediante la adición de 50 microlitros/pocillo de ácido fosfórico 1 M. Se leyeron las placas a 450 nm.

La concentración de los anticuerpos producidos en todos los sobrenadantes de células COS se determinó comparando los resultados del ELISA de IgG con un anticuerpo policlonal humano de concentración conocida como estándar (Sigma).

III. Análisis de los datos

La unión a la P-Selectina se representó como densidad óptica a 450 nm frente a la concentración de IgG.

IV. Purificación del PB1.3

El PB1.3 se purificó según se describe en el Ejemplo 8.

Ejemplo 12

El efecto del PB1.3 en la lesión de tejido producida por la isquemia-reperfusión a continuación de la reimplantación de la oreja de conejo.

Se anestesiaron conejos blancos de Nueva Zelanda con una combinación de quetamina y xilazina seguidas por infiltración con lidocaína en la base de la oreja. La oreja izquierda se amputó parcialmente dejando la arteria y vena central, y un puente de cartílago intactos. Todos los nervios se dividieron para hacer la oreja totalmente anestética. A continuación se unió de nuevo la oreja y se colocó un clip microvascular a lo ancho de la arteria para producir una isquemia total. Los conejos se mantuvieron en una habitación mantenida a 23,5ºC durante 6 horas, a continuación se retiró la pinza microvascular y se dejó reperfundir la oreja. El tratamiento se administró inmediatamente antes de la reperfusión, o con PB1.3 (2 mg/kg) o con solución salina o un isotipo (IgG1) emparejado de anticuerpo de ratón denominado PNB1.6 (2 mg/kg). El volumen de la oreja se midió diariamente durante 7 días mediante desplazamiento del agua para cuantificar el edema del tejido. En el día 7 se estimó la necrosis como un porcentaje del área superficial total.

En los animales control administrados o con solución salina o con PNB1.6 se determinó un incremento significativo del volumen de la oreja a continuación de la reperfusión (Figura 18). Puesto que no se notaron diferencias entres los dos grupos control, sus datos se han combinado. También se observó un incremento en el edema en los animales tratados con PB1.3, la magnitud del cual fue significativamente inferior a la observada en el grupo control en todos los intervalos de tiempo medidos. La extensión de la necrosis (Figura 19), medida el día 7, también se redujo significativamente en los animales tratados con PB1.3 en comparación con los animales control.

Por tanto, la isquemia seguida por reperfusión de la oreja de conejo reimplantada produce una respuesta edematosa inicialmente seguida por una necrosis de tejido extensiva. Estas dos manifestaciones de lesión de tejido se reducen sustancial y significativamente en animales tratados previamente con el anticuerpos PB1.3 anti-P-Selectina.

Ejemplo 13

El efecto del PB1.3 sobre la vía libre vascular a continuación de la isquemia y reperfusión del músculo esquelético canino

Este experimento utiliza el modelo de isquemia y reperfusión del músculo gracilis canino aislado. Un aspecto de la lesión por reperfusión es un fenómeno denominado como el fenómeno de ``sin reflujo'', en el que el flujo de sangre a través de la microcirculación de un tejido previamente isquémico está ausente o gravemente reducido a continuación de la reperfusión.

Se utilizó una preparación de músculo gracilis canino aislado tal como se había descrito previamente (Carden, Smith y Korthuis, Circ. Res. 66:1436-1444 (1990)). En resumen, se anestesiaron perros mestizos adultos con pentobarbital sódico. La piel recubriendo el músculo gracilis se dividió y se liberó el músculo del tejido conectivo mediante disección roma. Se seccionó el nervio obturador. La arterial y la vena caudal proximal se canularon, y todos los otros vasos colaterales se ligaron. La cánula de la arteria femoral se conectó a una bomba de perfusión de flujo constante, y el flujo de salida de la vena femoral se extrajo hacia el recipiente de perfusión. Las presiones arteriales y venosa se monitorizaron a través de ramas laterales, y el flujo de sangre se ajustó para mantener la presión de perfusión a 100 mm Hg. El aislamiento vascular se consideró completo si la presión arterial disminuía en menos de 20 mm Hg cuando se desconectaba la bomba de perfusión.

La vía libre microvascular se verificó mediante perfusión del músculo gracilis aislado con medio de contraste (tinta china) al final del protocolo experimental. Se usó imagen de vídeo digitalizada para cuantificar el número de microvasos que contenían tinta (< 10 \mum de diámetro) por fibra muscular en secciones histológicas obtenidas de músculos gracilis caninos aislados sometidos a 4,5 horas de perfusión continua, 4 horas de isquemia, seguidas por 0,5 horas de reperfusión o isquemia-reperfusión en presencia del anticuerpo PB1.3 anti-P-Selectina en una concentración de 40 \mug/ml en el perfusado.

El protocolo de isquemia y reperfusión redujo el número de microvasos con vía libre hasta el 36 \pm 3% del valor determinado en animales control. Cuando se incluyó el PB1.3 en el perfusado, el número de microvasos con vía libre a continuación de la isquemia y reperfusión fue del 119 \pm 18% del control.

Por tanto, el anticuerpo PB1.3 anti-P-Selectina, impidió completamente el desarrollo del fenómeno de ``sin reflujo'', determinado por el número de microvasos con vía libre, en el músculo gracilis canino isquémico y reperfundido.

Ejemplo 14

El efecto del PB1.3 sobre las interacciones leucocitos-células endoteliales inducidas por la desgranulación de los mastocitos del tejido I. Procedimientos

a) Microscopía intravital

Se obtuvieron ratas Wistar macho (200-250 g) de Harlan Sprague Dawley, Indianápolis, se dejaron en ayunas durante 12-24 horas antes de la intervención quirúrgica. La anestesia quirúrgica se indujo mediante un inyección intramuscular de quetamina/rompun/acepromazina. Se colocó un catéter en la vena yugular izquierda, y se practicó una traqueotomía para facilitar la respiración espontánea. Se afeitó el abdomen y se lavó, y se realizó una incisión de 3/4 de pulgada de longitud a través de la línea media hacia la cavidad peritoneal, teniendo cuidado de evitar cualquier sangrado. Se colocó la rata sobre la base de un microscopio específicamente diseñado para el procedimiento intravital microscópico. Se exteriorizó un bucle posterior bien vascularizado del íleo, y el mesenterio se depositó sobre un pedestal para observación calentado a 37ºC. A través del experimento, se superfundió el mesenterio a 2 ml/min con una solución salina tamponada con bicarbonato (37ºC, pH 7,4). Adicionalmente, se colocaron pequeñas piezas de Saran-Wrap (previamente empapadas en alcohol y aclaradas con solución salina) sobre las áreas del íleo y mesentéricas periféricas al área observada, con objeto de mantener húmedas estas zonas. El lecho microcirculatorio se observó a través de un microscopía intravital (Mikron Instruments, San Diego) equipado con oculares 10\times y un objetivo 20\times (inmersión en agua, apertura numérica 0,49. Un sistema de vídeo de alta resolución, consistente en una cámara de vídeo (Hitachi color CCD) fijada sobre el microscopio, un cronómetro de vídeo (American Video Equipment), un VCR (Sony SVO-9550MD), y un monitor (Sony Trinitron), permitieron el registro en vídeo de la imagen del microscopio. En cada preparación de mesenterio, se seleccionaron 3 segmentos de vena postcapilares de aproximadamente 180 \mum de longitud, para registros repetidos, de acuerdo con los siguientes criterios: 1) una venilla postcapilar verdadera recibiendo sangre de capilares confluentes, diámetro 15-30 \mum; 2) flujo activo de sangre, de forma que no pudieran distinguirse los hematíes; 3) cierto rodamiento de fondo de leucocitos (menos de 9 leucocitos presentes en cualquier instante determinado en el segmento vascular), pero sin leucocitos firmemente adheridos. Un leucocito se definió que estaba firmemente adherido si permanecía inmóvil en la pared del vaso durante más de 30 segundos.

b) Protocolo experimental

Se hicieron registros de un minuto de vídeo de la interacción de fondo de los leucocitos en las venillas seleccionadas a los 20 y 25 minutos después de haberse completado el procedimiento quirúrgico. Todos los tratamientos se administraron intravenosamente antes del segundo registro de línea base. A los 30 minutos después de la intervención quirúrgica, se inició la infusión del compuesto 48/80 (Sigma, nº de catálogo C4257) en el tampón de superfusión, y se continuó a lo largo del resto del experimento. Esto rindió una concentración final de 10 \mug/ml en el mesenterio, y se hizo con objeto de inducir la desgranulación de los mastocitos. Se grabaron de nuevo las venilla a los 20 y 30 minutos después del inicio de la aplicación de 48/80. El alcance de las interacciones leucocito-célula endotelial se determinó al final del experimento analizando las cintas de vídeo grabadas. El número de leucocitos claramente visibles (es decir, células interaccionando con la pared del vaso) se determinó a partir de fotogramas congelados exactamente a los 0, 15, 30, 45 y 60 segundos de la secuencia grabada, y se calculó la media de estas cinco determinaciones. Por tanto, los leucocitos contados incluían las células rodantes, así como aquéllas firmemente adheridas.

c) Estadísticas

Cada grupo experimental contenía 5-6 animales con 2-3 venillas de cada animal. Se dan la media y su error estándar. Las diferencias significativas entre las medias de grupos se ensayaron mediante el análisis de variancia, seguido por el test HSD de Tukey-Kramer. Las diferencias antes y después de los tratamientos en venillas individuales se estudiaron mediante t-test pareados. Todos los ensayos se realizaron usando el programa JMP que corría en un Macintosh™ IIsi, y la significación se aceptó a p < 0,05.

II. Resultados

La aplicación tópica del compuesto 48/80 al mesenterio de ratas resultó en la desgranulación visible de más del 90% de los mastocitos, lo cual tuvo lugar durante los 3 minutos siguientes a su aplicación. Subsiguientemente, se observó un incremento en el rodamiento y adhesión de leucocitos. No se detectó una diferencia significativa en la acumulación de leucocitos entre los instantes a 20 y 30 minutos después de la aplicación del 48/80, por tanto, la media de estos dos instantes se usó en el análisis estadístico. La variabilidad de venilla a venilla en el modelo fue bastante elevada, con una interacción de fondo que oscilaba desde 0 hasta 4,8 leucocitos presentes en venillas individuales, y con la interacción inducida por mastocitos oscilando desde 2,8 hasta 25,6 leucocitos presentes en el grupo tratado con PBS (coeficiente de variabilidad, CV, 37%). Las medias por animal mostraron una variabilidad mucho menor (CV, 16%); por tanto, para propósitos estadísticos, cada venilla individual se trató como una entidad experimental separada.

Tal como se observa en la Figura 20, el tratamiento intravenoso con PB1.3 inhibió la acumulación intravascular de leucocitos inducida por mastocitos en el 90%, cuando se compara con el grupo de control con el tampón de formulación. El anticuerpo no reactivo PNB1.6 no tuvo efecto alguno en este modelo.

Por tanto, la administración del anticuerpo anti-P-Selectina PB1.3 a ratas impide completamente la interacción de leucocitos con el endotelio vascular y su migración subsiguiente hacia el interior de los tejidos inducida por la aplicación del agente 48/80 de desgranulación de mastocitos.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

(i)

SOLICITANTE:

(A)

NOMBRE: Cytel Corporation

(B)

DIRECCIÓN: 3525 John Hopkins Court

(C)

CIUDAD: San Diego

(D)

ESTADO: California

(E)

PAIS: Estados Unidos de América

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 92121

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Anticuerpos contra la P-Selectina y sus usos

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 19

(iv)

FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

(B)

ORDENADOR: Compatible con PC de IBM

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D)

PROGRAMA: Patentln Release #1.0, Versión #1.25 (EPO)

(v)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

NÚMERO DE SOLICITUD: EP 93911098.7

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 07/880.196

(B)

FECHA DE REGISTRO: 05-MAYO-1992

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 1:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 16 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

TIPO DE HEBRA: única

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 1:

1

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 2:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1174 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

(iii)

CARACTERÍSTICAS:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

UBICACIÓN: join (3..1055, 1059..1142)

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 2:

2

3

4

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 3:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 379 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 3:

5

6

7

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 4:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 318 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

(iii)

CARACTERÍSTICAS:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

UBICACIÓN: 1..318

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 4:

8

9

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 5:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 106 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 5:

10

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 6:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 342 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii)

CARACTERÍSTICAS:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

UBICACIÓN: 1..336

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 6:

11

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 7:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 112 aminoácidos

(B)

TIPO: ácido nucleico

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 7:

12

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 8:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 336 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii)

CARACTERÍSTICAS:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

UBICACIÓN: 1..336

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 8:

13

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 9:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 112 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 9:

14

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 10:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 417 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii)

CARACTERÍSTICAS:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

UBICACIÓN: 1..417

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 10:

15

16

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 11:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 139 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 11:

17

18

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 12:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 336 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii)

CARACTERÍSTICAS:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

UBICACIÓN: 1..336

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 12:

19

20

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 13:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 112 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 13:

21

22

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 14:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 417 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii)

CARACTERÍSTICAS:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

UBICACIÓN: 1..417

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 14:

23

24

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 15:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 139 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 15:

25

26

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 16:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 378 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii)

CARACTERÍSTICAS:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

UBICACIÓN: 1..378

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 16:

27

28

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 17:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 126 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 17:

29

30

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 18:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 378 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii)

CARACTERÍSTICAS:

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

(B)

UBICACIÓN: 1..378

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 18:

31

32

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 19:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 126 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 19:

33

Claims (15)

1. Anticuerpo bloqueador de la P-Selectina, o fragmento funcional del mismo, que inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo secretado por una línea celular denominada ATCC Nº de acceso HB11041 contra la P-Selectina, según se mide mediante un ensayo de inhibición competitiva, y en donde dicho anticuerpo bloqueador, o fragmento funcional del mismo, es capaz de unirse a la P-Selectina en presencia de un péptido CQNRYTDLVAIQNKNE y en ausencia de Ca^{2+}.

2. Anticuerpo bloqueador de la P-Selectina de la reivindicación 1, que inhibe la unión de neutrófilos a la P-Selectina.

3. Anticuerpo bloqueador de la P-Selectina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que es una inmunoglobulina IgG.

4. Anticuerpo bloqueador de la P-Selectina de las reivindicaciones precedentes que es un anticuerpo de murina.

5. Anticuerpo bloqueador de la P-Selectina de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que es un anticuerpo humano.

6. Anticuerpo bloqueador de la P-Selectina de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que es un anticuerpo humanizado o quimérico.

7. Anticuerpo bloqueador de la P-Selectina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde el fragmento funcional del mismo es Fab, F(ab')_{2}, CDR, V_{L}, V_{H}, o una combinación de los mismos.

8. Utilización de un anticuerpo bloqueador de la P-Selectina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes para la fabricación de una composición para utilizar en un procedimiento para tratar una condición inflamatoria o trombótica.

9. Utilización de la reivindicación 8, en donde la condición inflamatoria es una lesión pulmonar aguda o una lesión por reperfusión de isquemia.

10. Utilización de la reivindicación 8 ó reivindicación 9, en donde la composición está adaptada para ser administrada intravenosamente.

11. Composición farmacéutica que comprende, un portador farmacéuticamente aceptable, y un anticuerpo bloqueador de la P-Selectina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

12. Utilización de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, o de la composición de la reivindicación 11, en donde el anticuerpo bloqueador es secretado por la línea celular denominada ATCC Nº de acceso HB11041.

13. Utilización de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, o de la composición de la reivindicación 11, en donde el anticuerpo es una IgG_{1}.

14. Anticuerpo bloqueador de la P-Selectina secretado por una línea celular denominada ATCC Nº de acceso HB11041.

15. Composición que comprende una línea celular denominada ATCC Nº de acceso HB11041.