ES2197231T3

ES2197231T3 - Nuevos terminadores de cadena, su uso en la secuenciacion y sintesis de acidos nucleicos y metodo para su preparacion.

Info

Publication number: ES2197231T3
Application number: ES96902039T
Authority: ES
Inventors: Marek Kwiatkowski
Original assignee: Quiatech AB
Current assignee: Quiatech AB
Priority date: 1995-01-31
Filing date: 1996-01-30
Publication date: 2004-01-01
Anticipated expiration: 2016-01-30
Also published as: DE69627314T2; EP0808320B1; JPH10513178A; DE69627314D1; EP0808320A1; WO1996023807A1; SE9500342D0; CA2212000A1; US6255475B1

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A COMPUESTOS DE ESTRUCTURA GENERAL (I), O SALES DE LOS MISMOS, DONDE B ES UNA NUCLEOBASE; X Y Z SON, INDEPENDIENTEMENTE, OXIGENO O AZUFRE; Y ES HIDROGENO O HIDROXI, EL CUAL PUEDE ESTAR, OPCIONALMENTE, PROTEGIDO; R{SUB,1} ES HIDROCARBILO, OPCIONALMENTE SUSTITUIDO CON UN GRUPO FUNCIONAL; R{SUB,2} ES HIDROGENO O HIDROCARBILO, EL CUAL ESTA SUSTITUIDO, OPCIONALMENTE, CON UN GRUPO FUNCIONAL; A ES UN GRUPO ACEPTOR O DONADOR DE ELECTRONES, CAPAZ DE MODERAR LA ESTABILIDAD DEL ACETAL DEL COMPUESTO (I); L{SUB,1} Y L{SUB,2} SON GRUPOS DE UNION DE HIDROCARBUROS, QUE PUEDEN SER IGUALES O DIFERENTES, ESTANDO L{SUB,2}, CUANDO EXISTE, BIEN (I) UNIDO A L{SUB,1} A TRAVES DEL GRUPO A, O (II) CONECTADO DIRECTAMENTE A L{SUB,1}, ESTANDO ENTONCES CONECTADO EL GRUPO A, A UNO DE LOS GRUPOS DE UNION L{SUB,1} O L{SUB,2}; F ES UN MARCADOR COLORANTE; Q ES UN GRUPO DE ENLACE PARA F, Y 1, M Y N, SON, INDEPENDIENTEMENTE, 0 O 1, CON LA CONDICION DE QUE 1 ES 1 CUANDO M ES 1, Y 1 ES 1 Y M ES 1, CUANDON ES 1. LOS COMPUESTOS DE FORMULA (I), SON UTILES COMO TERMINADORES DE CADENA DESACTIVABLES. LA INVENCION SE REFIERE, ASIMISMO, A LA UTILIZACION DE LOS COMPUESTOS (I), EN LA SINTESIS DE ACIDOS NUCLEICOS Y EN LA SECUENCIACION DE ACIDOS NUCLEICOS, ASI COMO A UN METODO DE PREPARACION DE LOS COMPUESTOS DE FORMULA (I).

Description

Nuevos terminadores de cadena, su uso en la secuenciación y síntesis de ácidos nucleicos y método para su preparación.

La presente invención se refiere a nuevos terminadores de prolongación de cadenas de ácidos nucleicos, su uso en la secuenciación y síntesis, respectivamente, de ácidos nucleicos, así como un método para preparar dichos compuestos.

Hoy día hay dos métodos predominantes para la determinación de la secuencia del ADN, el método de degradación química (Maxam and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. 74:560-564 (1977)), y el método de la terminación de la cadena didesoxi (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74:5463-5467 (1977)). La mayor parte de los secuenciadores automáticos se basan en el método de la terminación de la cadena usando la detección fluorescente del producto formado. En estos sistemas o se usan compuestos marcados colorimétricamente a los que se añaden desoxinucleótidos y didesoxinucleótidos, o los didesoxinucleótidos añadidos están marcados con fluorescencia. Como alternativa pueden usarse desoxinucleótidos colorimétricamente marcados junto con didesoxinucleótidos no marcados. Este método de la terminación de la cadena se basa en la habilidad de una enzima para añadir nucleótidos específicos al 3'-hidroxilo terminal de un primer fijado a una plantilla. La propiedad de apareamiento de las bases de los ácidos nucleicos determina la especificidad de la adición del nucleótido. Los productos de prolongación se separan después por electroforesis en un gel de poliacrilamida y se detectan por un sistema óptico que utiliza excitación de láser.

Aunque ambos métodos son ampliamente usados, el método de degradación química y el método de la terminación de la cadena didesoxi, hay muchos inconvenientes asociados con ellos. Por ejemplo, los métodos requieren separación por gel de electroforesis. Típicamente, sólo se pueden secuenciar de 400 a 800 pares de bases de un clon único. Como resultado los sistemas requieren trabajo y tiempo intensivo. Intentando aumentar el rendimiento de la secuenciación, se han desarrollado métodos que evitan la separación por el gel.

Se han propuesto métodos de secuenciación por hibridación (SBH) por Crkvenjakov (Drmanac et al., Genomics 4:114 (1989)); Strezoska et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10089-5467 (1991)), Bains y Smith (Bains and Smith, J. Theoretical Biol., 135:303 (1988)) y en el documento US-A-5.202.231. Este tipo de sistema utiliza la información obtenida de hibridaciones múltiples de los polinucleótidos de interés, usando oligonucleótidos cortos para determinar la secuencia del ácido nucleico. Esos métodos tienen la potencialidad de aumentar el rendimiento de la secuenciación puesto que se realizan múltiples reacciones de hibridación al mismo tiempo. Sin embargo, para reconstruir la secuencia se requiere un extenso algoritmo de búsqueda por ordenador a fin de determinar el orden más probable de todos los fragmentos obtenidos de las múltiples hibridaciones.

Los métodos de SBH son problemáticos por varias razones. Por ejemplo, la hibridación depende de la composición de la secuencia del duplex del oligonucleótido y el polinucleótido de interés, de manera que las regiones ricas en GC son más estables que las regiones ricas en AT. Como resultado, durante la detección de la hibridación son frecuentes los falsos positivos y los falsos negativos y se complica la determinación de la secuencia. Adicionalmente, la secuencia del polinucleótido no se determina directamente, sino que se deduce de la secuencia de la sonda conocida, lo que aumenta la posibilidad de errores.

Se han propuesto también métodos que detectan la adición o sustracción de moléculas monocatenarias de ADN. Por ejemplo, Hyman E.D., Anal. Biochem., 174:423 (1988) describe la adición de un nucleótido a un complejo plantilla/primer de ADN inmovilizado en presencia de una polimerasa y determinación de la reacción de polimerización detectando el pirofosfato liberado como resultado de la polimerización.

Jett et al., J. Biomol. Struct. Dyn., 1 p. 301, 1989 describe un método en el que una molécula monocatenaria de ADN o ARN con nucleótidos marcados complementaria con la secuencia que se ha de determinar, se suspende en una corriente de fluido en movimiento. Las bases individuales se segmentan secuencialmente desde el extremo de la secuencia suspendida y se determinan por medio de un detector que pasa por la corriente.

El documento EP-A-223 61 B describe el uso de una plantilla de ADN, primer y polimerasa inmovilizados expuestos a una corriente que contiene sólo una especie de desoxinucleótido. Un sistema de detección al final determina si el nucleótido se ha incorporado o no a la copia por medio de la medida de la diferencia en concentraciones del desoxinucleótido que entra y sale de la célula que contiene el complejo de la plantilla del ADN y la polimerasa.

El documento WO 90/13666 propone un método que mide directamente el crecimiento de la copia de la plantilla en lugar de determinarlo indirectamente por las composiciones del medio del fluido. Sólo uno de cuatro nucleótidos está presente cada vez, y los eventos de polimerización que reflejan la incorporación o no incorporación de un nucleótido se detectan por medios espectroscópicos (espectroscopía de honda evanescente, detección por fluorescencia, espectroscopía de absorción), o por el marcado de los nucleótidos individuales.

Métodos similares que utilizan desoxinucleótidos 3'-bloqueados marcados en los que el grupo bloqueador puede eliminarse y por lo tanto permite pasos secuenciales de adición/detección de desoxinucleótido, se describen en el documento WO 91/066678, US-A-5302.509, DE-A-414 1178 y WO 93/21340. Sin embargo, los grupos 3'-bloqueadores necesarios o no se describen con ningún detalle, o no son aceptados por la enzima requerida, o no permiten el deseado desbloqueo rápido de la cadena monocatenaria creciente de la plantilla después de cada evento de polimerización.

Un objeto de la presente invención es proporcionar derivados originales de nucleótidos que puedan usarse como terminadores de la cadena y que por desprotección puedan fácilmente convertirse en nucleótidos o análogos de nucleótidos que puedan prolongarse más.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para la determinación de la secuencia de un nucleótido usando los nuevos terminadores de prolongación de cadena.

Todavía otro objeto de la presente invención es proporcionar un método de síntesis de oligo o polinucleótidos por medio de los nuevos terminadores de prolongación de cadena.

El documento WO 94/23064 se refiere a trifosfatos de nucleótido que están sustituidos en la posición 3'-hidroxilo con una función éster. Más tarde se ha demostrado, de hecho por los mismos autores, que las ADN polimerasas completamente y sin excepciones hidrolizan el enlace 3'-éster, liberando el 3'-hidroxilo libre con la pérdida simultánea del fluoróforo, ``Catalytic editing properties of DNA polymerises'', B. Canard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 92, pp :10859-10863 . En consecuencia, la adición de sólo una base es imposible, no hay señal fluorescente unida al primer, y toda la estrategia de secuenciación del ADN está en bancarrota.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para la preparación de nuevos terminadores de prolongación de cadena de acuerdo con la invención.

De acuerdo con la invención, estos objetivos se consiguen por la provisión de un nucleótido o análogo de nucleótido terminador de cadena que tiene su grupo 3'-hidroxilo protegido con una estructura acetal o tioacetal, diseñada de tal forma que su grupo 3'-hidroxilo puede ser desprotegido en un tiempo relativamente corto por ácido diluido tal como ácido clorhídrico a pH 2, por ejemplo.

Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención proporciona un compuesto de la fórmula general I:

1

o una sal del mismo, tales como sal de trimetilamonio, amonio, sodio o potasio, donde

B es una nucleobase

X y Z son independientemente oxígeno o azufre,

Y es hidrógeno, un grupo hidroxi o hidroxi protegido, tal como metoxi, etoxi o alquiloxi

R_{1} es hidrocarburo, que puede estar sustituido opcionalmente con un grupo funcional

R_{2} es hidrógeno o hidrocarburo, que puede estar sustituido opcionalmente con un grupo funcional

A es un grupo donador o atractor de electrones capaz de moderar la estabilidad acetálica del compuesto I por medio de L_{1},

L_{1} y L_{2} son enlaces de hidrocarburos, que pueden ser iguales o diferentes, L_{2} cuando está presente está (i) conectado a L_{1 }por medio del grupo A o (ii) directamente conectado a L_{1}, estando entonces conectado el grupo A a uno de los fragmentos enlazadores L_{1} y L_{2},

F es una función marcada colorimétricamente,

Q es un grupo de acoplamiento para F, y

l, m y n independientemente son 0 ó 1, con la condición que l tiene el valor 1, cuando m es 1, y l tiene el valor 1 y m tiene el valor 1 cuando n tiene el valor 1.

En la fórmula I anterior la nucleobase B puede ser natural o sintética. Nucleobases naturales incluyen nucleobases corrientes tales como adenina, guanina, citosina, timina y uracilo, así como nucleobases menos corrientes tales como xantina, hypoxantina, o 2-aminopurina. Las nucleobases sintéticas B son análogos de nucleobases naturales capaces de interaccionar con otras nucleobases de una forma específica, determinada por enlaces de hidrógeno.

Los grupos hidrocarburos representados por R_{1} y R_{2 } incluyen una gran variedad, incluyendo alquilos, alquenilos, arilos, aralquilos, y cicloalquilos de cadena lineal y ramificada que contienen preferiblemente hasta 10 átomos de carbono. Los grupos hidrocarburos preferidos son alquilos primarios, secundarios o terciarios, grupos alquenilos o alquinilos, especialmente grupos alquilos inferiores, tales como metilo y etilo. Los grupos funcionales opcionales sustituyentes de R_{1} y R_{2} son capaces de moderar la labilidad del grupo 3'acetal a través de un efecto inductivo. Son ejemplos de tales grupos funcionales, amino terciario, nitro, ciano y halógeno (fluoruro, cloruro, bromuro y yoduro).

El residuo para la detección o marca F puede escogerse dentro de un gran grupo de tales residuos, conocidos por todos los expertos en la técnica. Ejemplos de tales residuos son funciones marcadas radioactivamente, marcas luminiscentes, electroluminiscentes o fluorescentes, y marcas que absorben luz visible o infrarroja característica. Preferiblemente, F es una marca fluorescente.

El grupo de acoplamiento Q cuando n=0 es un grupo reactivo con el que se puede acoplar una marca F, o cuando n=1 es el resto derivatizado de un grupo reactivo usado para acoplar el enlace L_{2} a la marca F. Un gran número de dichos grupos de acoplamiento capaces de reaccionar con y unirse a la marca F por medio de una función reactiva son conocidos por los expertos en la técnica. Ejemplos de grupos reactivos son amino, tio y carboxilo. En algunos casos, el grupo Q se deriva completamente de la función reactiva en la F no acoplada. Por ejemplo, si la reacción de acoplamiento es una reacción de sustitución, el grupo que reacciona con F que puede ser, por ejemplo, un halógeno (fluoruro, cloruro, bromuro o yoduro), el grupo Q será entonces representado por la función reactiva presente en la marca F.

Como se describirá más adelante, para algunas aplicaciones de los compuestos de fórmula I, no se necesitará ningún residuo detectable, y la marca F y opcionalmente también el grupo Q pueden omitirse.

El grupo donador o atractor de electrones A se incorpora a la estructura como un moderador de estabilidad del acetal. El grupo A puede representar una parte de la cadena L_{1}-A-L_{2}. Grupos representativos de A son en este caso grupos amido, sulfoxi, sulfona, carboalcoxi (éster), éter, tioéter y amino. Alternativamente, A puede ser un sustituyente lateral de la cadena L_{1}- L_{2}, en este caso grupos representativos son, por ejemplo, ciano, nitro y halógeno (halógeno incluyendo fluoruro, cloruro, bromuro y yoduro). En este último caso la unión L_{1} proporcionará la prolongación de la estructura del carbono acetal al lugar de la sustitución, y el enlace L_{2} proporcionará la prolongación de la estructura desde esta sustitución al grupo A. Hay que poner énfasis en que los grupos específicos donadores y atractores de electrones anteriormente mencionados son sólo ejemplos y que muchos más grupos son obvios y conocidos por todos los expertos en la técnica.

La estructura del enlace de hidrocarburo L_{1} se seleccionará en relación con la función A, puesto que los efectos inductivos son muy dependientes de la distancia. Mientras que se prefiere una cadena de hidrocarburo lineal alifática (saturada o no saturada) también se pueden considerar ramificadas o de hidrocarburos cíclicos. Preferiblemente, el enlace L_{1} tiene hasta 10 átomos de carbono, más preferiblemente hasta 6 átomos de carbono.

La función del hidrocarburo de enlace L_{2} es proporcionar, junto con el enlace L_{1}, A y el grupo de acoplamiento Q, una distancia lo suficientemente larga entre el resto marcado F y el resto del compuesto de fórmula I. Esto se requiere por las preferencias espaciales de las enzimas (polimerasas) para las que el compuesto de fórmula I actua como sustrato, o por la necesidad de evitar interacción entre la marca y la nucleobase B. Se entiende fácilmente que la estructura del enlace L_{2} depende altamente de la enzima específica, marca F y posiblemente también nucleobase B que se use. Por lo tanto, la persona versada elegirá una longitud y estructura apropiadas del enlace L_{2} para cada situación específica. Similarmente al enlace L_{1}, una estructura preferida para el enlace L_{2} es una cadena de hidrocarburo lineal alifática (saturada o no saturada), aunque pueden también considerarse hidrocarburos ramificados o cíclicos. Preferiblemente, el enlace L_{2} tiene hasta 10 átomos de carbono, más preferiblemente hasta 6 átomos de carbono.

En los casos en que la marca F y el grupo de acoplamiento Q puedan omitirse, el enlace L_{2} puede, por descontado, también omitirse.

Los compuestos de fórmula I pueden desprotegerse para mostrar un grupo 3'-hidroxilo libre en un tiempo relativamente corto bajo condiciones ácidas, por ejemplo con ácido clorhídrico a pH alrededor de 2. Se entiende que mediante la selección apropiada de los grupos R_{1}, R_{2}, A, L_{1} y L_{2}, puede ajustarse el tiempo de desprotección al intervalo deseado. Bajo las condiciones ácidas mencionadas, los compuestos de fórmula I más preferidos serán desprotegidos dentro de digamos, 0,01 a 15 minutos.

Mientras que los compuestos de fórmula I pueden usarse como inhibidores puros de extensión de cadena, o terminadores de cadena, por ejemplo en la secuenciación del ADN de acuerdo con el método de terminación de cadena, como se conoce per se en el arte, las ventajas de los compuestos son, por descontado, más beneficiosas cuando se usan sus convenientes capacidades de desprotección. Este es, por ejemplo, el caso en el que el compuesto I se usa en métodos de secuenciación del ácido nucleico basados en la incorporación secuencial y la determinación de nucleótidos individuales en una copia monocatenaria de ADN como se describe, por ejemplo en el documento previamente mencionado WO 91/06678, US-A-5.302.509, DE-A-414 1178 y WO 93/21340.

Por lo tanto, otro aspecto de la invención proporciona un método para determinar la secuencia de un ácido nucleico, dicho método comprende proporcionar una plantilla monocatenaria que comprende el ácido nucleico a determinar, y al menos parcialmente sintetizar una molécula complementaria de ácido nucleico de una forma serial, paso a paso, por medio de la adición de nucleótidos en los cuales la identidad de cada nucleótido incorporado en la molécula complementaria de ácido nucleico se determina después de su incorporación, donde dichos nucleótidos son compuestos de fórmula I como se les ha definido anteriormente, y donde el grupo 3'-bloqueador se elimina del nucleótido después de su incorporación para permitir la prolongación adicional de la molécula de ácido nucleico.

En un aspecto de la invención, un método para determinar la secuencia de un ácido nucleico comprende los pasos siguientes:

: (i) proporcionar una plantilla monocatenaria que comprende el ácido nucleico a secuenciar

: (ii) hibridizar un primer a la plantilla para formar un complejo plantilla/primer

: (iii) someter el primer a una reacción de prolongación añadiendo compuestos de fórmula I con distintas nucleobases B que corresponden a las cuatro bases A, C, T y G o sus análogos

: (iv) determinar el tipo de compuesto de fórmula I añadido al primer

: (v) hidrolizar selectivamente el grupo protector acetal y

: (vi) repetir los pasos (iii) a (v) secuencialmente y anotar el orden de incorporación de los compuestos de fórmula I.

Los distintos compuestos de fórmula I en el paso (iii) pueden añadirse secuencialmente, en cuyo caso los cuatro compuestos I diferentes pueden llevar la misma marca F. Alternativamente, los distintos compuestos pueden poseer distintas marcas F y ser añadidos al mismo tiempo.

En una versión preferida del método de la invención, el complejo plantilla/primer está unido a un soporte de fase sólida tal como un chip de secuenciación, por ejemplo. La plantilla puede estar unida al soporte sólido por medio de un enlace de unión, que, por ejemplo, está unido al final 5'de la plantilla o incorporado en uno de los dos extremos de la plantilla por una reacción de cadena de la polimerasa (PCR). El enlace de unión puede estar unido al soporte sólido por medio de un sistema acoplador de estreptavidina. Alternativamente, el primer puede estar unido al soporte sólido.

Los compuestos de fórmula I pueden también convenientemente usarse en la llamada mini-secuenciación (véase, por ejemplo, Syvänen A-C et al., Genomics 8:684-692 (1990).

Como es fácil de entender por una persona versada en la técnica, los compuestos de fórmula I pueden también usarse en la síntesis de cadenas de nucleótidos, y otro aspecto de la invención está relacionado con esta aplicación. Por ejemplo, pueden prepararse oligonucleótidos y polinucleótidos a base de acoplar compuestos de fórmula I en cualquier orden de bases deseado, con la intervención del desbloqueo y usando una polimerasa que no sea dependiente de la plantilla, tal como una transferasa terminal. Para dicha síntesis los grupos L_{2}, Q y F en la fórmula I pueden omitirse, por descontado.

Los compuestos de fórmula I pueden prepararse por métodos conocidos per se. En otro aspecto, sin embargo, la invención proporciona un método especial para la preparación de un subgrupo de compuestos de fórmula I por medio de protección directa del 3'-OH, y más particularmente compuestos de fórmula Ia:

2

O una sal del mismo, en el que B, X, Z R_{1}, R_{2}, Q, F, m y n son como se definió anteriormente, y p y q independientemente son números enteros de 1 a 10, preferiblemente de 1 a 6; haciendo reaccionar un compuesto de fórmula II:

3

O una sal del mismo, en el que B y X son como se definió anteriormente, con un compuesto de fórmula III:

4

en el que R_{1}, R_{2}, Z y p son como se definió anteriormente y R_{3} es un hidrocarburo (por ejemplo, como se han definido R_{1} y R_{2} anteriormente), para producir un compuesto de fórmula IV:

5

O una sal del mismo, en el que B, X Z R_{1}, R_{2}, R_{3} y p son como se definió anteriormente; opcionalmente reaccionando este último compuesto con una diamina H_{2}N-(CH_{2})q-NH_{2}, donde q se define como anteriormente, para producir un compuesto de fórmula V:

6

Donde B, X, Z, R_{1}, R_{2}, R_{3} y p son como se definió anteriormente, opcionalmente puede también acoplarse un marcador colorante F al grupo amino terminal.

A continuación la invención será ilustrada con algunos ejemplos no limitativos. Se hace referencia a las figuras siguientes, en las que:

La Fig. 1 es un esquema de reacción para la síntesis del éter enólico descrito en el Ejemplo 1 que sigue. Los productos intermedios y final que corresponden a varios valores del número entero ``n'' en las fórmulas estructurales respectivas, se identifican con números en corchetes después de los valores n listados bajo las fórmulas respectivas.

La Fig. 2 es un esquema de reacción para la preparación de la timidina modificada en el 3'-acetal descrita en el Ejemplo 2 que sigue. Los productos finales corresponden a varios valores del número entero ``n'' en las fórmulas estructurales respectivas, y se identifican con números en corchetes después de los valores n listados bajo las fórmulas.

La Figura 3 es un gráfico que muestra la hidrólisis de la 3'-acetal-timidina a pH 4 como log % del acetal que permanece versus tiempo en minutos.

La Figura 4 es un esquema de reacción para la síntesis en un paso de los trifosfatos de desoxinucleótidos protegidos en el 3'-acetal descritos en el Ejemplo 4 que sigue. Los productos intermedios y finales que corresponden a varios valores del número entero ``n'' en las fórmulas estructurales respectivas, se identifican con números en corchetes después de los valores n listados bajo las fórmulas respectivas.

Ejemplo 1 Síntesis de éteres enólicos para la derivatización de trifosfatos de nucleótido

Paso 1

Esterificación de cetoácidos

Se añadió rápidamente el cetoácido apropiado (1 eq) a un gran exceso de metanol seco (20 eq) que había sido previamente tratado con cloruro de tionilo (0,1 eq). Se mantuvo a reflujo la mezcla homogénea durante la noche, se evaporó a presión reducida, y se distribuyó entre una solución saturada de bicarbonato sódico y cloruro de metileno. Se secaron los extractos orgánicos combinados con sulfato magnésico, se evaporaron y el residuo se destiló a presión reducida para proporcionar el metil éster apropiado en alto rendimiento (80% a 95%).

Se usaron los siguiente cetoácidos:

1): El ácido 4-oxi-pentanoico (ácido levulínico) (Aldrich)

2): El ácido 5-oxi-hexanoico no se ha aislado. En su lugar un derivado, el éster etílico, que puede obtenerse comercialmente (Merck), se transesterificó en una reacción análoga al procedimiento general anterior descrito.

3): El ácido 6-oxioctanoíco se obtuvo a partir de 2-metil ciclohexanol (Merck) de acuerdo con un procedimiento publicado (Org. Synth.31:3-5, (1951))

4): El ácido 7-oxioctanoico se obtuvo a partir de 2-acetilciclohexanona según se describió en J.Am.Chem.Soc.70: 4023-4026(1948).

Paso 2

Síntesis de los derivados dimetoxiacetálicos (compuestos 1-4 de la Fig.1)

Se añadió ácido bencenosulfónico (0,01 eq) a cada uno de los esteres metílicos anteriores (1 eq) disueltos en metanol (2 eq) y trimetilortoformiato (3 eq). La mezcla marrón oscura se refluyó durante 3h, neutralizó por adición de trimetilamina seca(0,1 eq), y evaporó. El residuo se destiló a presión reducida para rendir el acetal puro.

Compuesto 1. Los datos físicos y de RMN para este acetal corresponden bien con los datos previamente descritos.

Compuesto 2. Rendimiento 85%, p.e. 120º (15 mm Hg) ^{1}H RMN (CDCl_{3}): 1,28 (s, 3H), 1,60-1,69 (m,4H), 2,34 (t, 2H), 3,17 (s, 6H), 3,67 (s, 3H).

Compuesto 3. Rendimiento 92%, p.e. 130-133º (15 mm Hg) ^{1}H RMN (CDCl_{3}): 1,25 (s, 3H), 1,29-1,35 (m, 2H), 1,60-1,70 (m,4H), 2,33 (t, 2H), 3,17 (s, 6H), 3,67 (s, 3H).

Compuesto 4. Rendimiento 87%, p.e. 147-149º (15 mm Hg) ^{1}H RMN (CDCl_{3}): 1,25 (s,3H), 1,27-1,38 (m, 4H), 1,57-1,67 (m, 4H), 2,34 (t, 2H), 3,16 (s, 6H), 3,66 (s, 3H).

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Paso 3

Síntesis de éteres enólicos (compuestos 5-8 de la Fig. 1)

Una mezcla del acetal apropiado (1 eq) y ortoformiato de trimetilo (0,5 eq) se colocaron en un matraz de destilación equipado con una columna Vigreux de 20 cm. Se añadió ácido bencenosulfónico (0,02 eq) y la mezcla se refluyó. La calefacción se reguló de modo que el metanol liberado se evaporó lentamente. Transcurridas cuatro horas la calefacción se aumentó y la mezcla obscura se fraccionó a presión reducida sin neutralización previa del catalizador ácido. Los rendimientos de los éteres enólicos incoloros aislados fue en todos los casos muy alto (85-95%) pero la CG y los análisis RMN mostraron la presencia del acetal de partida en proporciones del 10 al 30%. Como no se esperaba que estas impurezas influyeran en la derivatización de los nucleótidos no se intentó una purificación posterior. La asignación completa de las señales de RMN fue difícil debido a la presencia de material de partida y al hecho de que estos éteres enólicos asimétricos existen como varias formas isómeras. No obstante, en todos los espectros pudo observarse fácilmente una señal vinílica del CH_{2} de uno de los isómeros alrededor de 4,4 a 4,5 ppm y una señal vinílica de CH del otro isómero a 3,55 ppm.

Ejemplo 2 Síntesis de 3'acetal-timidina modificada (Fig.2)

La timidina 5'protegida, 5'-FMOCT (FMOC-fluorenilmetoxicarbonilo), (116 mg, 0,25 mmol) se secó por coevaporación con acetonitrilo seco (10 ml) y se disolvió en dioxano seco (5 ml). A esta solución agitada magnéticamente se añadió un éter enólico apropiado (0,5 ml, \approx 10 eq) preparado en el ejemplo 1, seguido por ácido trifluoroácetico (20 ml, 1 eq). Transcurridos 45 min, el análisis por CCF (Silicagel 60 F254, 10% metanol en cloroformo) mostró la consumición completa del material de partida, se añadió la trietilamina seca para eliminar el grupo FMOC lábil a bases. Después de que este proceso se completó (60 min), toda la mezcla se evaporó a presión reducida. El nucleósido fue separado del exceso del éter enólico por precipitación con éter de petróleo, y el precipitado, disuelto en 5 ml de metanol seco, se trató con 1,3-diaminopropano (2 ml, 100 eq) a 60º durante 180 min. para efectuar la aminolisis de la función éster en el resto de acetal. Finalmente, la mezcla de reacción se evaporó a presión reducida (bomba de aceite) y la materia bruta fue tratada por cromatografia rápida (flash) en una columna de gel de sílice, equilibrada con etanol y usando un gradiente de hidróxido amónico conc. (0-10%) en etanol. Se combinó el material homogéneo por CCF (desarrollada en 1-butanol-hidróxido amónico 8:2), evaporó y coevaporó con tolueno para dar el espectro RMN del producto puro (compuestos 9-12 de la Fig.2) con alto rendimiento (72 a 85%). El material puro se guardó como una solución de reserva en metanol después de la adición de tres gotas de amoniaco.

Ejemplo 3 Hidrólisis ácida (pH 4) de timidina, substituida en la posición 3' con diferentes grupos acetilo

Una solución tampón pH 4,0 de referencia, preparada mediante la mezcla de soluciones de acetato sódico (

\hbox{0,20 M}

, 18,0 ml) con ácido acético (0,20 M, 82,0 ml) se usó en todos los estudios de hidrólisis. A esta solución tampón

\hbox{(10,0  ml)}

, se añadió una solución etanólica de la apropiada timidina 3'acetal derivada (100 ml) preparada como en el ejemplo 2 (compuestos 9-12 de la fig. 2) con agitación suave. Se sacaron muestras de 0,5 ml a diferentes intervalos de tiempo y se colocaron en un tubo que contenía 15 ml de amoniaco concentrado para elevar el pH a 9. Las muestras fueron analizadas por cromatografia rápida (flash) (PFLC) usando una columna de intercambio iónico (MonoQ-Pharmacia Biotech AB) y un sistema de gradiente de bicarbonato de tetraetilamonio pH 8,2 para la elución (0,05 a

\hbox{0,075 M}

). Las áreas del pico correspondientes al material de partida y su timidina de producto de hidrólisis fueron integradas y representadas como se muestra en la fig.3. Ejemplo 4 Síntesis en un solo paso de trifosfato de desoxinucleótido, protegido en su posición 3'-OH por un grupo acetal funcionalizado

Un desoxinucleótido trifosfato comercial (pppdT, pppdC, pppdG, o pppdA) se cromatografió en una columna preparativa Mono Q usando un sistema gradiente de sal de bicarbonato de trietilamonio, pH 8,2 (0,05 a 1,3 M) para obtener el trifosfato puro en la forma de la sal de trietilamonio. Este material se evaporó en un rotavapor, coevaporó con acetonitrilo seco (3x2 ml), y se disolvió en trimetilfosfato (0,5 ml) seco con tamiz molecular. Se añadieron el éter enólico apropiado (compuestos 5-8 de la fig. 1) (0,2 ml) y ácido trifluoracético (10 eq como una solución al 10% en dioxano seco). La mezcla homogénea fue incubada a 20ºC durante 60 min., neutralizada mediante la adición de trietilamina (100 ml), y precipitada con una mezcla 1:1 de éter de petróleo y éter dietílico. El precipitado aceitoso se disolvió en metanol (2 ml) y se añadió 1,3-diaminopropano (0,5 ml) u otra diamina (1,4-diaminobutano, 1,6-diaminohexano) (0,5 ml). La función éster fue sometida a aminolisis durante la noche a 60ºC. La mezcla se precipitó nuevamente con éter de petróleo y dietil éter 1:1, lavada con éter dietílico, y disuelta en agua. La solución acuosa fue analizada y purificada preparativamente en la columna descrita de intercambio iónico. Los productos bien resueltos (compuestos 13-28 de la fig.4) aparecen siempre antes del desoxinucleótido trifosfato original teniendo un tiempo de retención comparable al del desoxi-nucleótido difosfato apropiado ( como se determinó en experimentos de coinyección separados). Una parte alícuota del derivado aislado modificado acetal 3' fue evaporada, tratada con ácido acético al 80% durante 2 min, y, después de la evaporación del ácido, reinyectada en el mismo sistema cromatográfico. En todos los casos todo el material de partida había reaccionado y se había formado un único producto con mayor tiempo de retención que correspondió al desoxinucleótido trifosfato original. La timidina trifosfato reacciona para formar, además del derivado 3'-modificado deseado, también otro producto con aún menor tiempo de retención pero que también se hidroliza al trifosfato de partida durante el tratamiento ácido. Se asume que este producto es el bis-3'-O, 4-O-acetal-derivado de la timidina trifosfato. Este tipo de productos secundarios no estaban presentes en las reacciones en las que se usó otro nucleótido trifosfato. Debe ser remarcado que se formaron muy pocos productos de depurinación en la reacción en la que se usó pppdG y pppdA. Esto puede explicarse por el ácido suave utilizado como catalizador, el gran exceso de éter enólico utilizado en la reacción, y el hecho de que las bases existían en forma no protegida (más resistentes a ácidos).

Ejemplo 5 Acoplamiento de un fluoróforo al desoxinucleótido trifosfato 3'-funcionalizado (Fig. 4)

Esta derivatización puede ser llevada a cabo con una variedad de fluoróforos reactivos que pueden diferir en su reactividad y en sus condiciones óptimas de reacción. Aquí se describe el procedimiento para marcar el desoxinucleótido trifosfato 3'-funcionalizado marcado con isotiocianato de fluoresceína.

El nucleótido trifosfato apropiado, que posee un grupo amino unido a la posición 3' del residuo de azúcar vía una función acetal ( compuestos 13-28 de la Fig. 4), se evaporó y disolvió en tampón de carbonato 0,1 M pH 10

\hbox{(0,5 ml)}

. El isocianato de fluoresceína (un único isómero) (10 eq), se disolvió en dimetilformamida (0,25 ml), se añadió y la mezcla se incubó durante la noche a 20ºC. La mezcla de reacción se aplicó sobre un prototipo FPLC columna de filtración de gel superdex® (Pharmacia Biotech AB)( equivalente a Sepphadex® G-10; Pharmacia Biotech AB), equilibrada y corrida en TEA tampón de HCO_{3} (0,1 M). El material fluorescente que aparece en el primer eluato se recogió (compuestos 29-44 de la fig.4). Como se esperaba, se formó el desoxinucleósido trifosfato original por la acción del ácido sobre el nucleótido marcado de fluoresceína. Ejemplo 6 Incorporación enzimática del trifosfato 3'-modificado paso a paso

Se prepararon cuatro oligonucleótidos, que tienen secuencias correspondientes al M13 primer secuenciado,y designado para incorporarse a sus bases 3'-terminales de T, G, A o C respectivamente:

\dotable{\tabskip6pt#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 (T) \+ 5'CGACGTTGTAAAACGACGGCCAG \+ (23 mer)\cr  (G) \+
5'CGACGTTGTAAAACGACGGCCA \+ (22 mer)\cr  (A) \+
5'CGACGTTGTAAAACGACGGCC \+ (21 mer)\cr  (C) \+
5'CGACGTTGTAAAACGACGGC \+ (20
mer)\cr}

Cada uno de ellos tuvo marcado radioactivo con ^{32}P usando T_{4} polinucleotidoquinasa.

Con objeto de investigar si el nucleótido trifosfato era modificado efectivamente y específicamente por la T7 polimerasa, cada uno de los primer marcados fue sometido a las condiciones de extensión de etapa única. Esas mezclas de reacción (20 ml) fueron compuestas del respectivo primer (0,1 pmol), plantilla M13 (1 pmol), y timidina trifosfato 3'modificada (compuesto 16 de la fig. 4) en un tampón pH 7,5 que contiene Tris/HCl (40 mM ), MnCl_{2} (4 mM), ditiotreitol (DTT) (11 mM),isocitrato sódico (29 mM) y cloruro sódico (23 mM). La mezcla se desnaturalizó a 70ºC, enfrió, e incubó a 42ºC después de la adición de T7 DNA polimerasa (10 U) durante 30 min. Todas las reacciones se pararon mediante la adición de formamida (20 ml), se denaturalizaron a 70ºC, enfriaron sobre hielo, y separaron en una gel de secuenciación denaturalizada al 60%. El autoradiograma desarrollado mostró que había tenido lugar únicamente la extensión de una base en la reacción que contiene 23-mer-T (designado para primerizar la plantilla M13 e incorporar ácido timídilico a su 3'terminal). Ninguna de las otras reacciones que contienen primers designados para la incorporación de dG,dA y dC, respectivamente, mostraron ningún signo de extensión de primer.

Ejemplo 7 Reacción de secuenciación con un terminador de cadena modificado

Todas las reacciones de secuenciación se llevaron a cabo según el estandar protocolo AB1® (Taq Dye Primer Cycle Sequencing Kit- protocolo 901482).

Las reacciones de secuenciación estuvieron constituidas de los siguientes componentes: M13 mp 18 ss-plantilla de DNA (1 pmol), primer universal marcado de 5'-fluoresceina (1 pmol, Pharmacia Biotech AB), Ampli Taq DNA polimerasa (4U) y mezcla de T-terminador en el tampón de secuencia de ciclo (Tris-HCl pH 8,9, 80 mM, sulfato amónico 20 mM, cloruro magnésico 5 mM). En lugar del estandar ddT trifosfato, el compuesto 16 de la fig. 4, en diferentes proporciones con TTP, fue usado como un terminador de cadena. Después de que el ciclo se completó, se añadió un volumen igual de formamida y la mezcla se calentó durante 2 min a 90ºC, se enfrió en hielo y se guardó embebido en una gel de urea de arcnilamida al 6%. La separación y análisis de los productos se llevó a cabo en un secuenciador de DNA A.L.F. (Pharmacia Biotech AB).

Como resultado, fue obtenido un patrón de secuencias marcadas de fluoresceína. Esta imagen electroforética fue específica del terminador aplicado.

Claims

1. Un compuesto de la estructura general I:

7

o una sal del mismo, en el que

B es una nucleobase,

X y Z son independientemente oxígeno o azufre

Y es hidrógeno o un grupo hidroxilo, que opcionalmente puede estar protegido.

R_{1} es alquilo, alquenilo, arilo, aralquilo y cicloalquilo de cadena lineal o ramificada, que contiene preferiblemente hasta 10 átomos de carbono, que opcionalmente está sustituida con un grupo funcional,

R_{2} es hidrógeno o alquilo, alquenilo, arilo, aralquilo y cicloalquilo de cadena lineal o ramificada, que contiene preferiblemente hasta 10 átomos de carbono, que opcionalmente está sustituido con un grupo funcional.

A es (i) un grupo amido, sulfoxi, sulfona, carboalcoxi, éter, tioéter, o amino, cuando el grupo A representa una parte de la cadena L_{1}-A-L_{2}; (ii) ciano, nitro y halógeno, cuando el grupo A es un substituyente lateral de la cadena L_{1}-L_{2},

L_{1} y L_{2} se eligen de alquilo, alquenilo, arilo, aralquilo y cicloalquilo, de cadena lineal y ramificada, que contienen preferiblemente hasta 10 átomos de carbono, que puede ser la misma o diferente, estando L_{2} cuando está presente (i) conectado a L_{1} vía el grupo A o (ii) directamente conectado a L_{1}, estando entonces el grupo A conectado a uno de los fragmentos enlazadores L_{1} y L_{2},

F son funciones marcadas radioactivas, marcadores luminiscentes, electroluminiscentes o fluorescentes y marcadores que absorben luz visible o infraroja característica,

Q es un grupo de acoplamiento para F, y cuando n=0, Q es un grupo reactivo al que puede ser acoplado el marcador F, o cuando n=1, Q es el residuo derivatizado de un grupo reactivo usado para acoplar el fragmento enlazador L_{2} al marcador F, tal como amino, tio, y carboxilo o una función reactiva en una reacción de substitución y presente en F y,

l, m y n independientemente son 0 ó 1, con la condición de que l tiene el valor 1, cuando m es 1, y l tiene el valor 1 cuando n es 1.

2. El compuesto según la reivindicación 1, en el que R_{1} y R_{2} son independientemente seleccionados de alquilos primarios secundarios y terciarios, que contienen hasta 10 átomos de carbono, opcionalmente substituidos con uno o más grupos funcionales.

3. El compuesto según la reivindicación 2, en la que R_{1} y R_{2} están seleccionados entre metilo y etilo.

4. El compuesto según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que A es una parte de la cadena L_{1}-A-L_{2} y está seleccionado entre los grupos amido, sulfoxi, sulfona, carboalcoxi, éter, tioéter y amino.

5. El compuesto según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que A es un substituyente para una cadena L_{1}-L_{2} y está seleccionado entre ciano, nitro o halógeno.

6. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde L_{1} es un grupo alquilo lineal, preferiblemente que tiene hasta 10 átomos de carbono.

7. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde L_{2} es un grupo alquilo lineal, preferiblemente que tiene hasta 10 átomos de carbono.

8. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, en la que Y es un metoxi, etoxi o aliloxi.

9. El uso de los compuestos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en reacciones de síntesis de ácidos nucleicos, especialmente para la preparación de oligo- o polinucleótidos.

10. El uso de los compuestos según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8, en minisecuenciación.

11. Un método para determinar la secuencia de un ácido nucleico, que comprende proporcionar una plantilla monocatenaria que comprende el ácido nucleico que va a ser determinado, y al menos una molécula parcialmente sintetizada de ácido nucleico complementario en forma de etapas seriadas mediante la adición de nucleótidos en los que la identidad de cada nucleótido incorporado en la molécula del ácido nucleico complementario se determina subsecuentemente a su incorporación, en el que dichos nucleótidos son compuestos de fórmula I como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y en donde el grupo bloqueante 3' se elimina del nucleótido después de su incorporación para permitir la prolongación posterior de la molécula de ácido nucleico.

12. El método según la reivindicación 11, en la que el grupo bloqueante 3' se elimina por hidrólisis ácida.

13. El método según la reivindicación 11 o 12, en donde F en la fórmula I es un marcador fluorescente.

14. El método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que la plantilla monocatenaria está unida a un soporte sólido.

15. Un proceso de preparación del compuesto de la fórmula Ia:

8

o una sal del mismo, en el que B, X, R_{1}, R_{2}, Q, F, m y n son como se definen en la reivindicación 1, y p y q independientemente son números enteros de 1 a 10, haciendo reaccionar un compuesto de la fórmula II:

9

\newpage

4

en donde R_{1}, R_{2}, Z y p son como se definió anteriormente, y R_{3} es alquilo, alquenilo, arilo, aralquilo y cicloalquilo de cadena lineal o ramificada, preferiblemente que contiene hasta 10 átomos de carbono, para producir un compuesto de la fórmula IV:

11

o una sal del mismo, en donde B, X, Z, R_{1}, R_{2}, R_{3} y p son como se definieron anteriormente, opcionalmente hacer reaccionar el anterior con una diamina H_{2}N-(CH_{2})q-NH_{2}, en donde q es como se definió anteriormente, para producir un compuesto de la fórmula V:

12

en la que B, X, Z, R_{1}, R_{2}, p y q son como se definieron anteriormente y opcionalmente acoplar un marcador colorante F al grupo amino terminal.