JPH10513178A

JPH10513178A - 新規な鎖停止剤、核酸配列決定および合成用のその使用、ならびにその製法

Info

Publication number: JPH10513178A
Application number: JP8523466A
Authority: JP
Inventors: クヴィアトコヴスキー，マレク
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1995-01-31
Filing date: 1996-01-30
Publication date: 1998-12-15
Also published as: DE69627314D1; ES2197231T3; SE9500342D0; DE69627314T2; EP0808320A1; CA2212000A1; WO1996023807A1; US6255475B1; EP0808320B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、式(Ｉ)で示される化合物またその塩に関し、式中、Ｂはヌクレオ塩基であり、ＸおよびＹは、独立して、酸素または硫黄であり、Ｙは所望により保護されていてもよい水素またはヒドロキシであり、Ｒ₁は、所望により官能基で置換されていてもよいヒドロカルビルであり、Ｒ₂は、水素または所望により官能基で置換されていてもよいヒドロカルビルであり、Ａは、化合物Ｉのアセタール安定性を改善し得る電子吸引性または電子供与性基であり、Ｌ₁およびＬ₃は、同一または異なっていてもよい炭化水素リンカーであり、(ｉ)基を介してＬ₁に結合しているか、または(ｉｉ)Ｌ₁に直接結合しているいずれかのＬ₂が存在する場合には、基ＡはリンカーＬ₁およびＬ₂のうちの１つに結合しており、Ｆは色素標識であり、ＱはＦについてのカップリング基であり、および、ｌ、ｍおよびｎは、独立して、０または１であるが、但し、ｍが１である場合にはｌは１であって、ｎが１である場合にはｌが１であってｍは１である。式Ｉで示される化合物は、非不活化性の鎖伸長停止剤として有用である。本発明は、また、核酸合成および核酸配列決定における化合物(Ｉ)の使用、ならびに式(Ｉ)で示される化合物の製法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】新規な鎖停止剤、核酸配列決定および合成用のその使用、ならびにその製法本発明は、新規な核酸鎖伸長停止剤、各々、核酸配列決定および合成におけるその使用、ならびにかかる化合物の製法に関する。今日、ＤＮＡ配列決定用の２種の専ら使用されている方法：化学分解法(Maxam およびGilbert、Proc．Natl．Acad．Sci．74:560-564(1977)、およびジデオキシ鎖停止法(Sangerら、Proc．Natl．Acad．Sci．74:5463-5467(1977)))が存在する。大部分の自動化シークエンサーは、生成物形成の蛍光検出を利用した鎖停止法をベースとする。これらの系においては、デオキシヌクレオチドおよびジデオキシヌクレオチドが付加されたいずれかのプライマーが色素-標識されているか、または付加されたジデオキシヌクレオチドが蛍光標識されている。別法として、色素標識デオキシヌクレオチドは、非標識ジデオキシヌクレオチドと結合させて用いることができる。この鎖停止法は、鋳型にアニーリングしたプライマーの３ ’ヒドロキシル末端上に特異的ヌクレオチドを付加させる酵素の可能性をベースとしている。核酸の塩基対形成特性は、ヌクレオチド付加の特異性を決定する。ついで、伸長産物をポリアクリルアミドゲル上で電気泳動的に分離し、レーザー励起を利用した光学系によって検出する。該化学分解法および該ジデオキシ鎖停止法の双方は広範に使用されているが、それらに関連する多くの短所が存在する。例えば、該双方の方法はゲル−電気泳動分離を要する。典型的には、４００−８００塩基対しか単一のクローンから配列決定できない。その結果、該双方の系は、多大な時間と労力とがかかる。配列決定仕事量を増大させる試行において、ゲル電気泳動を回避する方法が開発されている。ハイブリダイゼーション配列決定(Sequencing by Hybridization；ＳＢＨ)法が、Crkvenjakovによって提唱されている(Drmanacら、Genomics 4:114(1989)；S trezoskaら、(Proc．Natl．Acad．Sci．USA88:10089(1991))、BrainsおよびSmit h(BrainsおよびSmith、J．Theoretical Biol．135：303(1988))および米国特許第5,202,231号)。このタイプの系は、短いオリゴヌクレオチドを用いて目的のポリヌクレオチドの多重ハイブリダイゼーションから得られた情報を利用して、該核酸配列を決定する。これらの方法は配列仕事量を増大させ得る可能性がある。なぜならば、多重ハイブリダイゼーション反応が同時に起こるからである。しかしながら、配列を再構築するためには、多重ハイブリダイゼーションから得られたすべての断片の最もありそうな順番を決定するために広範囲のコンピューター検索論理式を要する。ＳＢＨ法は幾つかの点で問題がある。例えば、ＧＣ-リッチな領域の方がＡＴ- リッチな領域よりもより安定であるように、ハイブリダイゼーションが、目的のオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの二重らせんの配列組成に依存する。その結果、ハイブリダイゼーション検出の間に不正確な陽性および不正確な陰性がしばしば存在し、配列決定を複雑にしている。さらに、ポリヌクレオチドの配列は直接決定されずに、公知のプローブの配列から推測され、このことによりエラーの可能性が上昇する。また、ＤＮＡ鎖からの単一分子の付加または除去を検出する方法も提唱されている。例えば、Hyman E．D.，Anal．Biochem.，174：423(1988)はポリメラーゼ存在下でヌクレオチドを固定化ＤＮＡ鋳型／プライマー複合体に付加し、重合の結果として遊離するピロリン酸を検出することによって重合反応を測定することを開示している。 Jettら、J．Biomol．Struct．Dyn.，I,ｐ.301，1989は、決定すべき配列に対して相補的である標識ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を運動する流動流に懸濁する方法を開示している。ついで、個々の塩基を懸濁した配列の末端から順次切断し、流動流を透過する検出器によって決定する。欧州特許出願-A-223 618号は、１種のみのデオキシヌクレオチドを含有する流動に同時に暴露する、固定化ＤＮＡ鋳型、プライマーおよびポリメラーゼの使用を開示している。ついで、下流検出系が、ＤＮＡ鋳型およびポリメラーゼの複合体を含有する流動セルに入ってゆくデオキシヌクレオチド濃度と出て行く濃度における差を検出することによって、デオキシヌクレオチドが該コピーに取り込まれたか否かを決定する。 WO 90/13666号は、流動媒質中の組成から鋳型コピーの増幅(growth)を間接的に測定するというよりもよりむしろそれを直接的に測定する方法を提唱している。同時に４種のヌクレオチドのうちの１種のみが存在し、ヌクレオチドが取り込まれたか否かを反映する重合事象が分光分析的手段(減衰波分光分析、蛍光検出、吸光度測定)によってか、または標識された個々のヌクレオチドによって検出される。標識３'-ブロック基が除去可能であり、よって一連のデオキシヌクレオチドの付加／検出工程が許容される、該ブロック・デオキシヌクレオチドを使用する同様な方法がWO 91／06678号、米国特許出願第5,302,509号、ドイツ特許出願第414 ,1178号およびWO 93／21340号に開示されている。しかしながら、必要な３'-ブロック基については、全く詳細に記載されていないか、または必要な酵素によって受容されないか、または各重合事象後の鋳型コピー鎖の増幅の望ましい迅速な脱ブロックを許容しないかのいずれかである。本発明の１つの目的は、鎖停止剤として使用し得、脱保護によってさらに伸長させ得るヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに容易に変換し得る新規なヌクレオチド誘導体を提供することにある。本発明のもう１つの目的は、該新規な鎖停止剤を用いてヌクレオチド配列を配列決定する方法を提供することにある。本発明のなおもう１つの目的は、該新規な鎖停止剤によりオリゴ-またはポリヌクレオチドを合成する方法を提供することにある。本発明のもう１つの目的は、本発明による新規な鎖停止剤の製法を提供することにある。本発明によれば、これらの目的が、３'-ヒドロキシルを例えばｐＨ２の塩酸のごとき希酸中で比較的短時間に脱保護し得るように設計されたアセタールまたはチオアセタール構造によって保護された３'-ヒドロキシル基を有する鎖停止剤ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの規定により達成される。したがって、１つの態様において、本発明は、一般式Ｉ：［式中、Ｂはヌクレオ塩基であり、ＸおよびＺは、独立して、酸素または硫黄であり、Ｙは水素、ヒドロキシまたはメトキシ、エトキシもしくはアリルオキシのごとき保護ヒドロキシであり、Ｒ₁は所望により官能基で置換されていてもよいヒドロカルビルであり、Ｒ₂は水素または所望により官能基で置換されていてもよいヒドロカルビルであり、ＡはＬ₁を介して化合物Ｉのアセタール安定性を調節することができる電子吸引性または電子供与性の基であり、Ｌ₁およびＬ₂は同一でも異なっていてもよい炭化水素リンカーであって、Ｌ₂ が（ｉ）基Ａを介してＬ₁に結合しているか、または（ｉｉ）Ｌ₁に直接結合しているかのいずれかで存在する場合、基ＡはリンカーＬ₁およびＬ₂のうちの１つに結合されており、Ｆは色素標識であり、ＱはＦ用のカップリング基であって、ｌ、ｍおよびｎは、独立して、Ｏまたは１であるが、但し、ｍが１である場合にはｌは１であり、ｎが１である場合にはｌが１であってｍが１である］で示される化合物、またはトリメチルアンモニウム、アンモニウム、ナトリウムまたはカリウム塩のごときその塩を提供する。上記式Ｉにおいて、ヌクレオ塩基Ｂは天然物でも合成物でもよい。天然ヌクレオ塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルのごとき一般的なヌクレオ塩基、ならびにキサンチン、ヒポキサンチンまたは２-アミノプリンのごときあまり一般的でないヌクレオ塩基が含まれる。合成ヌクレオ塩基Ｂは、該天然ヌクレオ塩基のアナログであり、特異的な水素結合所定様式で他のヌクレオ塩基と相互作用し得る。Ｒ₁およびＲ₂によって表されるヒドロカルビル基には、好ましくは１０個までの炭素原子を含む、直鎖および分岐鎖のアルキル、アルケニル、アリール、アラルキルおよびシクロアルキルを包含する広範な変種が包含される。好ましいヒドロカルビル基は、第一級、第二級または第三級のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基、特にメチルおよびエチルのごとき低級アルキル基である。Ｒ₁およびＲ₂上の任意の官能置換基は、誘起効果を通して３'アセタール基の反応活性を調節することができる。かかる官能基の例はtert-アミノ、ニトロ、シアノおよびハロゲン(フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物)である。検出可能な基または標識Ｆは、当業者に公知であるような膨大な数の基から選択することができる。かかる基の例は、放射能標識した官能基、発光基、電子発光基または蛍光標識、および特定の可視光または赤外光を吸収する標識である。好ましくは、Ｆは蛍光標識である。カップリング基Ｑは、ｎ＝０である場合には、それに標識Ｆがカップリングすることができる反応基であり、または、ｎ＝１である場合には、それはリンカーＬ₂を標識Ｆにカップリングするのに使用される反応基の誘導残基である。標識Ｆと反応し、その反応官能基を介してそれに結合することができる膨大な数のかかるカップリング基が当業者に公知である。反応基の例は、アミノ、チオおよびカルボキシルである。ある種の場合においては、基Ｑは非カップる化Ｆの反応官能基に完全に由来する。例えば、Ｆと反応する基が例えば、ハロゲン(フッ化物、塩化物、臭化物またはヨウ化物)である、カップリング反応が置換反応である場合には、基Ｑは標識Ｆ上に存在する反応官能基によって表されるであろう。式Ｉで示される化合物の特定の適用については、後記するごとく、検出基を必要とせず、標識Ｆ、および所望により基Ｑをも省略することができる。電子吸引性または供与性基Ａは、アセタール安定性の調節基として構造中に取り込まれる。基Ａは、鎖Ｌ₁-Ａ-Ｌ₂の一部を表し得る。その場合の代表的な基Ａは、アミド、スルホキシ、スルホン、カルボアルコキシ(エステル)、エーテル、チオエーテルおよびアミノ基である。別法として、ＡはＬ₁-Ｌ₂鎖の側鎖置換基となることもでき、その場合の代表的な基は、例えば、シアノ、ニトロおよびハロゲン(フッ化物、塩化物、臭化物およびヨウ化物を包含するハロゲン)となる。この後者の場合においては、リンカーＬ₁はアセタール炭素から該置換基の位置への構造引き伸ばしを供与し、リンカーＬ₂はこの置換基から基Ａへの構造引き伸ばしを供与するであろう。前記した特異的な電気吸引性および電子供与性の基が例にすぎず、より多くのかかる基が当業者に公知かつ自明であることは強調しなければならない。炭化水素リンカーＬ₁の構造は、官能基Ａ、距離に大きく依存される誘起効果に関して選択されるであろう。(飽和または不飽和の)直鎖脂肪族炭化水素鎖が好ましいが、分岐または環状の炭化水素も意図し得る。好ましくは、リンカーＬ₁ は１０個までの炭素原子、より好ましくは６個までの炭素原子を有する。炭化水素リンカーＬ₂の機能は、Ｌ₂、Ａおよびカップリング基Ｑと一緒になって、反応活性基Ｆと式Ｉで示される化合物の残部との間に十分に長い距離を提供することにある。このことは、式Ｉの化合物が基質として作用する酵素(ポリメラーゼ)の空間選択によるか、または標識とヌクレオ塩基Ｂとの間の相互作用を回避する必要性により要求される。リンカーＬ₂の構造が、用いる特定の酵素、標識Ｆ、および可能性としてヌクレオ塩基Ｂにも大きく依存することは容易に理解される。したがって、適当な長さおよび構造のリンカーＬ₂は、各々の特定の状況について当業者により選択されるであろう。リンカーＬ₁と同様に、分岐または環状の炭化水素も意図し得るが、リンカーＬ₂の好ましい構造は(飽和または不飽和の)直鎖脂肪族炭化水素鎖である。好ましくは、リンカーＬ₂は１０個までの炭素原子、好ましくは６個までの炭素原子を有する。標識Ｆおよびカップリング基Ｑを省略し得る場合においては、勿論、リンカーＬ₂も省略し得る。例えば、約ｐＨ２の塩酸を含む、酸性条件下で比較的短時間に、式Ｉで示される化合物を脱保護して、遊離３'-ヒドロキシ基を示させることができる。基Ｒ₁ 、Ｒ₂、Ａ、Ｌ₁およびＬ₂を互いに適当に選択することによって脱保護時間を望ましい範囲に調整できることは理解される。前記酸性条件下では、式Ｉで示される最も好ましい化合物は、いわば０.０１ないし１５分以内に脱保護されるであろう。式Ｉで示される化合物は、例えば、当該分野で自体公知であるような鎖停止法によるＤＮＡ配列決定において純粋な鎖伸長阻害剤または鎖停止剤として使用できるが、該化合物の利点は、勿論、化合物の簡便な脱保護能力を利用する場合からより良好な恩恵を受ける。このことは、例えば、前記したWO 91／06678号、米国特許出願第5,302,509号、ドイツ特許出願第414 1178号およびWO 93／21340号に記載されている増幅する核酸コピー鎖中の個々のヌクレオチドの順次取り込みおよび決定をベースとする核酸配列決定法で化合物Ｉを使用する場合である。したがって、本発明のもう１つの態様は、核酸の配列を決定する方法を提供し、この方法は、決定すべき核酸を含む一本鎖鋳型を提供すること、および、相補的核酸分子に取り込まれる各ヌクレオチドの同一性をその取り込みにつづいて決定するヌクレオチドの付加による段階的な一連の様式で相補的核酸分子を少なくとも部分的に合成することを含み、ここにヌクレオチドは前記定義の式Ｉで示される化合物であり、３'-ブロッキング基はその取り込み後にヌクレオチドから除去されて、核酸分子のさらなる伸長が許容される。１つの具体例において、核酸の配列を決定する方法は以下の工程： (ｉ) 配列決定すべき核酸を含む一本鎖鋳型を得ること、 (ｉｉ) プライマーを鋳型にハイブリダイズさせて鋳型／プライマー複合体を形成させること、 (ｉｉｉ)４種の塩基Ａ、Ｃ、ＴおよびＧに対応する異なるヌクレオ塩基Ｂまたはそれらのアナログと一緒に式Ｉで示される化合物を付加することによる伸長反応にプライマーを付すこと、 (ｉｖ) プライマーに付加された式Ｉで示される化合物のタイプを決定すること、 (ｖ) アセタール保護基を選択的に加水分解すること、および (ｖｉ) 工程(ｉｉｉ)ないし(ｖ)を順次繰り返し、式Ｉで示される化合物の取り込み順序を記録することを含む。工程(ｉｉｉ)における式Ｉで示される異なる化合物は、４種の異なる化合物Ｉが同一の標識Ｆを運搬し得る場合には、連続で付加し得る。別法として、異なる化合物Ｉは異なる標識Ｆを有し、同時に付加される。本発明の方法の好ましい具体例において、該鋳型／プライマー複合体は、例えば、配列決定チップのごとき固相担体に結合されている。該鋳型は結合リンカーを介して固体支持体に結合されていてもよく、それは、例えば、ポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)によって、鋳型の５'-末端に連結されるか、または鋳型の末端のうちの１つに取り込まれる。ついで、結合リンカーを、ストレプトアビジン・カップリング系を使用することにより、固体支持体に結合することができる。別法として、該プライマーは、固体支持体に結合してもよい。ら、Genomics 8：684-692(1990))にも簡便に使用することができる。当業者により容易に理解されるごとく、式Ｉで示される化合物は、ヌクレオチド鎖の合成にも使用することができ、本発明のもう１つの態様はかかる使用に関する。例えば、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、脱保護を介在させ、ターミナル・トランスフェラーゼのごとき鋳型非依存性のポリメラーゼを用いて、望ましい塩基順番で互いに式Ｉで示される化合物を順次カップリングさせることにより調製できる。かかる合成には、式Ｉ中の基Ｌ₂、ＱおよびＦを、勿論、省略してもよい。式Ｉで示される化合物は、自体公知の方法によって調製できる。しかしながら、さらなる態様において、本発明は、直接３’-ＯＨ保護による式Ｉで示される化合物のサブグループ、さらに特別には、式ＩＩ：［式中、ＢおよびＸは前記定義に同じである］で示される化合物またはその塩と、式ＩＩＩ：［式中、Ｒ₁、Ｒ₂およびＺは前記定義に同じで、ｐは１ないし１０、好ましくは１ないし６の整数であって、Ｒ₃は（例えば、後記Ｒ₁およびＲ₂定義のような）ヒドロカルビルである］で示される化合物とを反応させて、式ＩＶ：［式中、Ｂ、Ｘ、Ｚ、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびｐは前記定義に同じである］で示される化合物またはその塩を得、所望により後者とジアミンＨ₂Ｎ-(ＣＨ₂) ｑ-ＮＨ₂［式中、ｑは、独立して、１ないし１０、好ましくは１ないし６の整数である］とを反応させて式Ｖ：［式中、Ｂ、Ｘ、Ｚ、Ｒ₁、Ｒ₂、ｐおよびｑは前記定義に同じである］で示される化合物を得、ついで、所望により色素標識Ｆを末端アミノ基にカップリングさせてもよいことを特徴とする式Ｉａ：［式中、Ｂ、Ｘ、Ｚ、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｑ、Ｆ、ｍ、ｎ、ｐおよびｑは前記定義に同じである］で示される化合物またはその塩の製法を提供する。以下に本発明をある種の非限定的な実施例によって説明する。添付図面を説明する：図１は、以下の実施例１に記載するエノールエーテル合成の反応図式である。対応構造式中の種々の値の整数「ｎ」に対応する中間および最終生成物は、対応構造式下に掲載するｎ-値の後の括弧内に示す数字によって同定される。図２は、以下の実施例２記載の３’-アセタール-修飾チミジン調製の反応図式である。対応構造式中の種々の値の整数「ｎ」に対応する調製した最終化合物は、式下に掲載するｎ−値の後の括弧内に示す数字によって同定される。図３は残存するアセタールのｌｏｇ％としてのｐＨ４におけるチミジン３’- アセタール加水分解-対-時間（分）を示すグラフである。図４は以下の実施例４記載の３’-アセタール保護デオキシヌクレオチド三リン酸の１ポット合成の反応図式である。対応構造式中の種々の値の整数「ｎ」に対応する中間および最終生成物は、対応式下に掲載されるｎ-値の後の括弧内に示す数字によって同定される。実施例１ヌクレオチド三リン酸誘導化用のエノールエーテルの合成（図１）工程１．ケト酸のエステル化適当なケト酸（１当量）を、塩化チオニル（０.１当量）で予め処理した大過剰量の無水メタノール（２０当量）に一度に添加した。その均一混合物を一晩還流し、減圧下にて蒸発させ、飽和炭酸水素ナトリウムとジクロロメタンとの間に分配させた。合した有機抽出物を硫酸マグネシウムで乾燥させ、蒸発させ、その残渣を減圧下にて蒸留して、適当なメチルエステルを高収率(８０％ないし９５％)で得た。以下のケト酸を用いた：１）４-オキシペンタン酸（レブリン酸）（Aldrich社製）２）５-オキシヘキサン酸は単離されなかった。その代わりに、市販されているこの酸のエチルエステル-誘導体（Merck社製）を、上記一般手法に類似の反応でエステル交換した。３）６-オキシヘプタン酸は、公開手法（Org.Synth.31：3-5(1951)）に従って、２-メチルシクロヘキサノール（Merck社製）から得た。４）７-オキシオクタン酸は、記載されている(J.Am.Chem.Soc.70：4023-4026 (1948)）のと同様にして２-アセチルシクロヘキサノンから得た。工程２．ジメトキシアセタール誘導体（図１中の化合物１−４）の合成ベンゼンスルホン酸（０.０１当量）を、メタノール（２当量）およびトリメチルオルトギ酸（３当量）中に溶解した前記の各メチルエステル（１当量）に添加した。該暗茶色混合物を３時間還流し、乾燥トリエチルアミン（０.１当量）を添加することによって中和し、蒸発させた。該残渣を減圧下にて蒸留して純粋なアセタールを得た。化合物１このアセタールについての物理およびＮＭＲデータは以前に報告されているデータによく対応する。化合物２収率８５％、沸点１２０℃（１５ｍｍＨｇ）¹ＨＮＭＲ(ＣＤＣl₃)： 1.28(s，3H)，1.60-1.69(m，4H)，2.34(t，2H)，3.17(s，6H)，3.67(s，3H) 化合物３収率９２％、沸点１３０-１３３℃（１５ｍｍＨｇ）¹ＨＮＭＲ(ＣＤＣl₃)：1.25(s，3H)，1.29-1.35(m，2H)，1.60-1.70(m，4H)，2.33(t，2H)，3.1 7(s，6H)，3.67(s，3H) 化合物４収率８７％、沸点１４７-１４９℃（１５ｍｍＨｇ）¹ＨＮＭＲ(ＣＤＣl₃)：1.25(s，3H)，1.27-1.38(m，4H)，1.57-1.67(m，4H)，2.31(t，2H)，3.1 6(s，6H)，3.66(s，3H) 工程３．エノールエーテル(図１中の化合物５-８)の合成適当なアセタール（１当量）およびトリメチルオルトギ酸（０.５当量）の混合物を２０ｃｍ Vigreuxカラムを装備した蒸留フラスコに入れた。ベンゼンスルホン酸（０.０２当量）を添加し、その混合物を還流した。加熱は、遊離メタノールが徐々に蒸発するように調節した。４時間後に加熱を上昇させ、酸触媒の予中和なしに該暗色混合物を減圧下にて分画した。単離無色エノールエーテルの収量は、すべての場合につき非常に高かった(８５-９５％)が、ＧＣおよびＮＭＲ分析は１０ないし３０％の比率の出発アセタールの存在を示した。これらの不純物がヌクレオチドの誘導化に影響するとは予想されないため、さらにそれらを純化する試みは行わなかった。ＮＭＲシグナルの完全な指定は困難であった。なぜならば、出発物質が存在し、これらの不斉エノールエーテルは幾つかの異性体形として存在するという事実のためである。それにもかかわらず、すべてのスペクトルにおいて、４.４ないし４.５ｐｐｍ周辺の１つの異性体からのＣＨ₂のビニルのシグナルおよび３.８５ｐｐｍの他の異性体からのＣＨのビニルのシグナルは容易に認めることができた。実施例２３'アセタール-修飾チミジンの合成（図２）５'-保護チミジン、５'-ＦＭＯＣＴ(ＦＭＯＣ-フルオレニルメトキシカルボニル)（１１６ｍｇ、０.２５ミリモル）を無水アセトニトリル（１０ｍｌ）との共沸によって乾燥させ、乾燥ジオキサン（５ｍｌ）中に溶解した。この磁気撹拌した溶液に、実施例１で調製した適当なエノールエーテル(０.５ｍｌ、≒１０当量)、つづいてトリフルオロ酢酸（２０ｍｌ、１当量）を添加した。４５分後に、ＴＬＣ分析（シリカゲル６０Ｆ₂₅₄、クロロホルム中の１０％メタノール）は、出発物質の完全な消費を示し、塩基-遊離ＦＭＯＣ-基を除去するために乾燥トリエチルアミン(２ｍｌ)を導入した。このプロセスが完了した（６０分）後に、減圧下にて全混合物を蒸発させた。石油エーテルから沈殿させ、乾燥メタノール５ｍｌ中に溶解した該沈殿を、６０℃の１,３-ジアミノプロパン（２ｍｌ、１００当量）で１８０分間処理して、アセタール基のエステル機能のアミノリシスに作用させることによって過剰量のエノールエーテルからヌクレオチドを分離した。最後に、反応混合物を減圧下（オイルポンプ）にて蒸発させ、その粗製物質を、エタノール中で平衡化し、エタノール中の濃水酸化アンモニウム（０-１０％）の段階勾配を用いたシリカゲルカラム上のフラッシュクロマトグラフィーに付した。ＴＬＣ(１-ブタノール-水酸化アンモニウム８：２で展開)によって均一なその物質を合し、蒸発させ、トルエンと共沸させてＮＭＲ純粋な生成物（図２中の化合物９-１２）を高収率（７２ないし８５％）で得た。アンモニア３滴を添加した後に、純粋な物質をメタノール中のストック溶液として保存した。実施例３３'-位で種々のアセチル基で置換されたチミジンの酸加水分解(ｐＨ４) 酢酸ナトリウム（０.２０Ｍ、１８.０ｍｌ）の溶液と酢酸(０.２０Ｍ、８２.０ｍｌ)とを混合することによって調製した参照酢酸緩衝液ｐＨ４.０をすべての加水分解実験で用いた。この緩衝液(１０.０ｍｌ)に実施例２で調製した適当なチミジン３'-アセタール誘導体(図２中の化合物９-１２)のエタノール溶液(１００ｍｌ)を穏やかに撹拌しつつ添加した。異なる時点で０.５ｍｌの試料を採取し、濃アンモニア１５ｍｌを含む試験管中に入れてｐＨを９まで上昇させた。アニオン交換カラム(Ｍono Ｑ-Ｐharmacia Ｂiotech AB社製)および溶出用に重炭酸テトラエチルアンモニウムｐＨ８.２の勾配系（０.０５ないし０.７５Ｍ）を用いたＦＰＬＣによって試料を分析した。出発物質およびその加水分解産物チミジンのピーク領域を合し、図３に示すごとくプロットした。実施例４３'-ＯＨ位で官能化アセタール基によって保護されたデオキシヌクレオチド三リン酸の１ポット合成（図４）市販のデオキシヌクレオチド三リン酸（pppdT、pppdC、pppdG、またはpppdA）を、重炭酸テトラエチルアンモニウムｐＨ８.２(０.０５ないし１.３Ｍ)の勾配系を用いた分取用MonoＱカラム上のクロマトグラフィーに付して、トリエチルアンモニウム塩形の純粋な三リン酸を得た。この物質をRotavapor上で蒸発させ、無水アセトニトリル(３×２ｍl)と共沸させ、モレキュラー・シーブ-乾燥トリメチルリン酸(０.５ｍｌ)中に溶解した。適当なエノールエーテル(図１中の化合物５-８)(０.２ｍｌ)およびトリフルオロ酢酸(乾燥ジオキサン中の１０％溶液として１０当量)を添加した。均一混合物を２０℃にて６０分間インキュベートし、トリエチルアミン(１００ｍｌ)を添加することによって中和し、石油エーテルおよびジエチルエーテルの１：１混合液から沈殿させた。油性沈殿をメタノール(２ｍｌ)に溶解し、１,３-ジアミノプロパン(０.５ｍｌ)または他のジアミン( １,４-ジアミノブタン、１,６-ジアミノヘキサン)(０.５ｍｌ)を添加した。そのエステル官能基を６０℃にて一晩アミノリシスに付した。その混合物を１：１石油エーテルおよびジエチルエーテルから再度沈殿させ、ジエチルエーテルで洗浄し、水中に溶解した。その水溶液を分析し、前記アニオン交換カラム上で分取的に精製した。よく解明された生成物(図４中の化合物１３-２８)は、(分離した同時注射実験から判明したごとく)適当なデオキシヌクレオチド二リン酸の保持時間に匹敵するものを有する元のデオキシヌクレオチド三リン酸の前に常にあるようである。単離した３'-アセタール-修飾誘導体のアリコットを蒸発させ、８０％酢酸で２分間処理し、酸を蒸発させた後に、同一のクロマトグラフィー系に再注射した。すべての場合において、すべての出発物質が反応し、より高い保持時間を有する単一生成物が形成し、それは元のデオキシヌクレオチド三リン酸に対応した。チミジン三リン酸は反応して、所望の３'-修飾誘導体に加えて、なおより短い保持時間を有するが、しかし酸処理の間に出発三リン酸にも加水分解する他の生成物も形成する。この生成物はチミジン三リン酸のビス-３'-Ｏ,４-Ｏ-アセタール-誘導体であると予想される。このタイプの副産物は、他のヌクレオチド三リン酸を用いる反応には存在しなかった。pppdGおよびpppdAを用いる反応において非常に微量の脱プリン生成物が形成されたことも強調しておく。このことは、触媒として適用した温和な酸、反応において用いた大過剰量のエノールエーテル、および塩基が（より酸耐性である）非保護形に存在するという事実によって説明できる。実施例５３'-官能化デオキシヌクレオチド三リン酸への蛍光団のカップリング（図４）この誘導化は、その反応性およびその最適反応条件で異なっていてもよい種々の反応性蛍光団で行うことができる。ここに、３'-官能基化デオキシヌクレオチド三リン酸をフルオレセイン・イソチオシアネートで標識する手法を記載する。アセタール官能基を介して糖残基の３'-位に結合したアミノ基を有する適当なヌクレオチド三リン酸（図４中の化合物１３-２８）を蒸発させ、０.１Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ１０(０.５ｍｌ)中に溶解した。ジメチルホルムアミド(０.２５ｍｌ)中に溶解したフルオロセイン・イソチオシアネート(単一異性体)(１０当量)を添加し、その混合物を２０℃にて一晩インキュベートした。該反応混合物を平衡化しＴＥＡＨＣＯ₃緩衝液（０.１Ｍ）中に通したプロトタイプＦＰＬＣ Superdex^R ゲル濾過カラム(Ｐharmacia Ｂiotech AB社製)(Ｐharmacia Ｂiotech AB社製；S ephadex^R G-10と同等物)上に適用した。ボイドに出てくる蛍光物質を採取した( 図４中の化合物２９-４４)。予想したごとく、元のデオキシヌクレオチド三リン酸が、フルオレセイン-標識ヌクレオチドの酸の作用で形成された。実施例６３'-修飾三リン酸の段階酵素的取り込みＭ１３配列決定用プライマーに相当する配列を有し、その３'-末端Ｔ、Ｇ、ＡまたはＣ塩基に各々取り込まれるように設計された４種のオリゴヌクレオチド： (T)5'CGACGTTGTAAAACGACGGCCAG (23mer) (G)5'CGACGTTGTAAAACGACGGCCA (22mer) (A)5'CGACGTTGTAAAACGACGGCC (21mer) (C)5'CGACGTTGTAAAACGACGGC (20mer) を調製した。その各々をＴ₄ポリヌクレオチドキナーゼを用いて³²Ｐで放射能標識した。修飾ヌクレオチド三リン酸がＴ７ポリメラーゼによって有効かつ特異的に受容されるかを検査するために、各標識プライマーを単一段階伸長条件に付した。これらの反応混合物（２０ｍｌ）は、トリス-ＨＣｌ(４０ｍＭ)、ＭｎＣｌ₂(４ｍＭ) 、ジチオスライトール（ＤＴＴ）(１１ｍＭ)、イソクエン酸ナトリウム（２９ｍＭ）および塩化ナトリウム（２３ｍＭ）を含有する緩衝液系ｐＨ７.５中の各プライマー(０.１ピコモル)、Ｍ１３鋳型(１ピコモル)および３'-修飾チミジン三リン酸(図４中の化合物１６)よりなる。その混合物を７０℃にて変性させ、冷却し、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ(１０Ｕ)を添加した後、４２℃にて３０分間インキュベートした。ホルムアルデヒド(２０ｍｌ)を添加することによって全反応を停止させ、７０℃にて変性させ、氷上で冷却し、６％変性配列決定用ゲル上で分離した。発色させたオートラジオグラムは、１-塩基伸長が（Ｍ１３鋳型に結合し(pr imed)、その３'-末端にチミジル酸を取り込むように設計された）２３-mer-Ｔを含有する反応において唯一起こったことを示した。ｄＧ、ｄＡおよびｄＣを各々取り込むように設計されたプライマーを含有する他の反応はいずれも、プライマー伸長のいずれの兆候も示さなかった。実施例７修飾鎖停止剤を用いた配列決定反応すべての配列決定反応は、標準的なＡＢＩプロトコール(Taq Dye Primer Cycle Sequencing Kit-プロトコール901482)に従って行った。配列決定反応は、以下の成分よりなる:循環配列決定用緩衝液（トリス-ＨＣｌ、ｐＨ８.９、８０ｍＭ、２０ｍＭ硫酸アンモニウム、５ｍＭ塩化マグネシウム）中のＭ１３ｍｐ１８ｓｓ-ＤＮＡ鋳型(１ピコモル)、５'-フルオレセイン標識ユニバーサルプライマー(１ピコモル、Pharmacia Biotech AB社製)、Ampli Ta q DNAポリメラーゼ(４Ｕ)およびＴ-停止混合物。標準的ｄｄＴ三リン酸の代わりに、ＴＴＰが異なる比率である図４中の化合物１６を鎖停止剤として用いた。循環が完了した後に、等容量のホルムアルデヒドを添加し、その混合物を９０℃にて２時間加熱し、氷上で冷却し、６％アクリルアミド尿素ゲル上に負荷した。生成物の分離および分析は、Ａ.Ｌ.Ｆ．ＤＮＡ-sequencer(Pharmacia Biotech AB 社製)上で行った。その結果、蛍光-標識配列のパターンを得た。この電気泳動図は、適用した停止剤について特異的であった。

Claims

【特許請求の範囲】１．式Ｉ：［式中、Ｂはヌクレオ塩基であり、ＸおよびＹは、独立して、酸素または硫黄であり、Ｙは所望により保護されていてもよい水素またはヒドロキシであり、Ｒ₁は、所望により官能基で置換されていてもよいヒドロカルビルであり、Ｒ₂は、水素または所望により官能基で置換されていてもよいヒドロカルビルであり、Ａは、化合物Ｉのアセタール安定性を改善し得る電子吸引性または電子供与性基であり、Ｌ₁およびＬ₂は、同一または異なっていてもよい炭化水素リンカーであり、 (ｉ)基Ａを介してＬ₁に結合しているか、または(ｉｉ)Ｌ₁に直接結合しているいずれかのＬ₂が存在する場合には、基ＡはリンカーＬ₁およびＬ₂のうちの１つに結合しており、Ｆは色素標識であり、ＱはＦについてのカップリング基であり、およびｌ、ｍおよびｎは、独立して、０または１であるが、但し、ｍが１である場合にはｌは１であって、ｎが１である場合にはｌが１であってｍは１である］で示される化合物またはその塩。２．Ｒ₁およびＲ₂が、独立して、所望により１または２以上の官能基で置換されていてもよい第一級、第二級および第三級アルキルから選択される請求項１記載の化合物。３．Ｒ₁およびＲ₂がメチルおよびエチルから選択される請求項２記載の化合物。４．Ａが鎖Ｌ₁-Ａ-Ｌ₂の一部分であって、かつアミド、スルホキシ、スルホン、カルボアルコキシ、エーテル、チオエーテルおよびアミノから選択される請求項１-３いずれか１項記載の化合物。５．Ａが鎖Ｌ₁-Ｌ₂への置換基であって、シアノ、ニトロおよびハロゲンから選択される請求項１-３いずれか１項記載の化合物。６．Ｌ₁が好ましくは１０個までの炭素原子を有する直鎖脂肪族炭化水素鎖である請求項１-５いずれか１項記載の化合物。７．Ｌ₂が好ましくは１０個までの炭素原子を有する直鎖脂肪族炭化水素鎖である請求項１-６いずれか１項記載の化合物。８．Ｙがアルコキシである請求項１-７いずれか１項記載の化合物。９．特にオリゴ-またはポリヌクレオチド調製用の、核酸合成反応における請求項１-８いずれか１項記載の化合物の使用。１０．微小配列決定における請求項１-８いずれか１項記載の化合物の使用。１１．決定すべき核酸を含む一本鎖鋳型を供し、相補的核酸分子中に取り込まれた各ヌクレオチドの同一性をその取り込みにつづいて決定するヌクレオチドの付加による段階的一連様式で相補鎖核酸分子を少なくとも部分的に合成することよりなり、ここに、該ヌクレオチドが請求項１-８いずれか１項定義の式Ｉで示される化合物であって、３'-ブロッキング基がその取り込み後にヌクレオチドから除去されて核酸分子のさらなる伸長が許容されることを特徴とする核酸配列決定方法。１２．３'-ブロッキング基が酸加水分解によって除去される請求項１１記載の方法。１３．式Ｉ中のＦが蛍光標識である請求項１１または１２いずれか１項記載の方法。１４．該一本鎖鋳型が固体支持体に結合している請求項１１-１３いずれか１項記載の方法。１５．式ＩＩ： [式中、ＢおよびＸは請求項１の定義に同じである] で示される化合物またはその塩と、式ＩＩＩ：［式中、Ｒ₁、Ｒ₂およびＺは請求項１の定義に同じで、ｐは１ないし１０、好ましくは１ないし６の整数であって、Ｒ₃はヒドロカルビルである］で示される化合物とを反応させて、式ＩＶ：［式中、Ｂ、Ｘ、Ｚ、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびｐは前記定義に同じである］で示される化合物またはその塩を得、所望により後者とジアミンＨ₂Ｎ-(ＣＨ₂) ｑ-ＮＨ₂［式中、ｑは１ないし１０、好ましくは１ないし６の整数である］とを反応させて式Ｖ：［式中、Ｂ、Ｘ、Ｚ、Ｒ₁、Ｒ₂、ｐおよびｑは前記定義に同じである］で示される化合物を得、ついで、所望により色素標識Ｆを末端アミノ基にカップリングさせてもよいことを特徴とする式Ｉａ：［式中、Ｂ、Ｘ、Ｚ、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｑ、Ｆ、ｍおよびｎは請求項１記定義に同じであって、ｐおよびｑは前記定義に同じである］で示される化合物またはその塩の製法。