ES2197425T3

ES2197425T3 - Superficies union a ligando.

Info

Publication number: ES2197425T3
Application number: ES98307258T
Authority: ES
Inventors: Adrian Charles Dawkes; Jayne Beverly Hipkiss; Heather Anne Edgar; Dymphna Ann Lowbridge
Original assignee: ORTHO CLINICAL DIAGNOSTICS; Ortho Clinical Diagnostics Inc
Current assignee: ORTHO CLINICAL DIAGNOSTICS; Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1997-09-09
Filing date: 1998-09-08
Publication date: 2004-01-01
Anticipated expiration: 2018-09-08
Also published as: CA2246894C; EP0903582B1; GB9719140D0; ATE240521T1; DE69814543D1; CA2246894A1; EP0903582A2; DK0903582T3; DE69814543T2; JP4302798B2; PT903582E; JPH11164686A; EP0903582A3

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR UNA SUPERFICIE DE UNION DE LIGANTES EN DONDE UN ASOCIADO DE UNION UNIDO A UN RECEPTOR DE LIGANTES SE MEZCLA CON UN AGENTE DE UNION ESPECIFICO PARA EL ASOCIADO DE UNION EN UNA RELACION MOLAR DE MANERA QUE SE FORMEN COMPLEJOS QUE TENGAN ZONAS DE UNION PARA PERMITIR QUE LOS COMPLEJOS SE UNAN AL ASOCIADO DE UNION INMOVILIZADO SOBRE UNA SUPERFICIE. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A SUPERFICIES DE UNION DE LIGANTES PREPARADAS MEDIANTE EL PROCEDIMIENTO Y AL USO DE LAS SUPERFICIES DE UNION DE LIGANTES EN ENSAYOS.

Description

Superficie unión a ligando.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de una superficie unión a ligando.

La adsorción pasiva de anticuerpos y otras entidades de unión a ligando a una variedad de sustratos es uno de los procedimientos de inmovilización más ampliamente utilizados para la generación de superficies funcionales para uso en ensayos. El nivel de funcionalidad generado mediante la utilización de este procedimiento es variable debido a los cambios conformacionales en la entidad de unión a ligando en la adsorción (Kochwa y col., 1967; Suter y Buter, 1986; Dieks y col. 1986; Butler y col., 1992; y Davies y col. 1995). Se han hecho mejoras en el nivel de la funcionalidad de las superficies bioactivas utilizando el enlace biotina/avidina. Estas mejoras están bien documentadas (Butler y col., 1992; Davies y col., 1993; Davies y col., 1994).

Tanto la estreptavidina como la avidina tienen una muy alta afinidad de enlace (10^{15} M^{-1}) para la biotina. Esta afinidad de enlace, acoplada junto con la capacidad de la biotina y sus derivados para incorporarse a varios materiales biológicos, dota a los sistemas de estreptavidina biotina de gran versatilidad.

La avidina es una glicoproteína que se encuentra en la clara de huevo y en los tejidos de los pájaros, reptiles y anfibios. La estreptavidina es producida por el Streptomyces avidini. Ambas proteínas de unión a biotina existen como proteínas tetraméricas que tienen cuatro subunidades idénticas.

La biotina, también conocida como vitamina H o ácido cis-hexahidro-2-oxo-1H- tieno-(3,4)- imidazol-4-pentanoico, es una vitamina esencial. En mamíferos, los tejidos que tienen las cantidades mayores de biotina son el hígado, riñones y páncreas.

Las superficies de unión a ligando pueden prepararse por la adición de un agente de unión (por ejemplo, estreptavidina o avidina) a una superficie que tiene una pareja específica de unión (por ejemplo, biotina) inmovilizada sobre ella o acoplando el agente de enlace a la superficie, químicamente o mediante una molécula vehículo secundaria; la eliminación de cualquiera de los compuestos no unidos, la adición de la pareja específica de unión, a la cual está unida un receptor de ligando (por ejemplo, un receptor de ligando biotinilado) de modo que se forman sobre la superficie complejos que comprenden la pareja de unión que tiene el receptor del ligando unido y el agente de unión; y la eliminación de cualquiera de los compuestos no unidos. La Figura 1 da una representación esquemática de dicho procedimiento para la preparación de las superficies de unión a ligando utilizando biotina como pareja de enlace y estreptavidina como agente de enlace.

Se puede observar que la preparación de las superficies funcionales para uso en ensayos es un procedimiento complejo multietapas. La etapa final es generalmente la adición de una pareja de unión, a la que se une un receptor del ligando, para producir una superficie específica de analito. El control de la cantidad de la pareja de enlace, a la que se une un receptor de ligando, es crítico para la realización del ensayo final y es difícil alcanzar niveles de recubrimiento consistentes, especialmente cuando se requiere una concentración limitante del receptor del ligando, tal como en formatos de inmunoensayo de competencia.

Existe por ello una necesidad de un procedimiento de preparación de superficies funcionales que pueda ser más fácilmente controlable y que produzca consistentemente superficies funcionales que tengan un nivel de recubrimiento requerido. Se alcanzan en la presente invención una reducción en la complejidad de los casos de manipulación de líquidos y mejora en el control de la cantidad de receptor del ligando que recubre la superficie. Un mayor control sobre la cantidad de receptor del ligando también mejora el rendimiento de inmunoensayo en términos de precisión, sensibilidad e intervalo.

La presente invención proporciona un procedimiento para la preparación de una superficie de unión a ligando que comprende:

i.: mezclar una pareja de unión, a la que se une un receptor del ligando, y un agente de unión específico para la pareja de unión en una relación molar específica de modo que se forman complejos que tienen suficientes sitios de unión libres en el agente de unión para permitir a los complejos que se unan a la pareja de unión inmovilizada sobre una superficie;

ii.: poner en contacto una superficie sobre la que la pareja de unión se inmoviliza con los complejos de modo que los complejos llegan a unirse a la superficie; y

iii.: eliminar cualquiera de los compuestos no unidos.

El término ``agente de unión'' como se utiliza en la presente memoria significa cualquier compuesto, proteína o agente capaz de unirse específicamente a la pareja de unión. Preferiblemente, el agente de unión es SAV o AV, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo tal como Fv, Fab y fragmentos F(ab')_{2}, capaces de unirse a la pareja de unión. Si la pareja de unión es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo como se ha definido anteriormente, entonces preferiblemente, el agente de unión es un antígeno o uno de sus fragmentos capaces de unirse por la pareja de unión.

En una realización preferida de la presente invención, el agente de unión es cualquier compuesto, proteína o agente que se une a la biotina. Más preferiblemente, el agente de unión es un anticuerpo o uno de sus fragmentos con afinidad por la biotina. Más preferiblemente, el agente de unión es estreptavidina y el homólogo funcional avidita, así como cualquier proteína estreptavidina o avidina recombinante que se une a biotina tal como se describe en el Documento WO 97/11183.

El término ``pareja de unión'' como se utiliza en la presente invención significa cualquier compuesto, proteína o agente capaz de unirse específicamente al agente de unión. Si el agente de unión es un anticuerpo o uno de sus fragmentos entonces, preferiblemente, la pareja de unión es un anticuerpo o uno de sus fragmentos capaces de unirse al agente de unión. Si el agente de unión es un anticuerpo o uno de sus fragmentos entonces, preferiblemente, la pareja de unión es un anticuerpo o uno de sus fragmentos tal como Fv, Fab y fragmentos F(ab')_{2}, capaces de unirse al agente de unión.

En una realización preferida, la pareja de unión es biotina o un derivado o uno de sus homólogos funcionales, en los que el agente de unión es cualquier compuesto, proteína o agente que se une a biotina. Aquellos expertos en la técnica sabrán que sólo se requiere el anillo bicíclico intacto de la biotina para unirse fuertemente con la estreptavidina, avidina o sus homólogos funcionales. El grupo carboxilo de la cadena lateral del ácido pentanoico de la biotina tiene poco que hacer en la interacción. Por ello, los derivados de la biotina pueden prepararse por modificación del grupo carboxilo del ácido pentanoico sin alteración significativa de la capacidad del derivado para unirse a la estreptavidina, avidina o sus homólogos funcionales. Dichos derivados de la biotina se describen en Biomethods, 7 (1996), ``A laboratory guide to biotin labelling in biomolecule analysis'', T.M. Cier y F. Fahrenholz eds., Birkhäuser Verlag, Switzerland.

El término ``receptor de ligando'' como se utiliza en la presente memoria significa cualquier entidad que tenga la capacidad de unirse a un ligando en el que el ligando puede ser cualquier compuesto o molécula. Los agentes de unión a ligando preferidos incluyen antígenos (en los que el ligando es un anticuerpo o sus fragmentos de unión a antígeno, anticuerpos o sus fragmentos funcionales tales como fragmentos Fv, Fab y F(ab')_{2} que son capaces de unirse a un ligando enlazante, Factor Intrínseco, proteína de unión a folato y receptores celulares.

La superficie de la presente invención puede ser cualquier soporte sólido adecuado para la realización de un ensayo. Las superficies preferidas incluyen la superficie de un micropocillo (especialmente micropocillos de poliestireno), una perla (especialmente perlas de látex/magnéticas) o una varilla.

La pareja de unión puede inmovilizarse sobre una superficie utilizando cualquiera de los procedimientos estándar conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la pareja de unión puede inmovilizarse sobre una superficie por adsorción pasiva de la pareja de unión sola o acoplada a un vehículo tal como seroalbúmina bovina (BSA), seroalbúmina humana (HSA) o una poliamina tal como polilisina. Las técnicas adecuadas para la inmovilización de la pareja de unión se describen en Immunoassays, (Diamandis, E.P. and Christopoulos T.K., Eds., Academc Pres, London (1996)) especialmente en las páginas 216 a 222 y 229. La biotinilación de las superficies (esto es, la inmovilización de la biotina sobre una superficie) se describe en Bayer y Wilcheck, 1990.

Los receptores de ligando de la presente invención pueden unirse a la pareja de unión mediante cualquiera de los procedimientos estándar conocidos por los expertos en la técnica. Los procedimientos adecuados incluyen acoplamiento químico utilizando agentes de entrecruzamiento y el uso de las parejas de unión activadas (por ejemplo esteres activos de biotina). Preferiblemente, los receptores de ligando se biotinilan (es decir, concretamente se unen a la biotina) mediante los procedimientos descritos en Bayer y Wilcheck, 1990. Además, se prefiere que los receptores de ligando se unan a la pareja de unión en tal forma que la actividad de los receptores de ligando no se reduzca significativamente comparada con la de los receptores de ligando libres.

En la presente invención, el agente de unión y la pareja de unión, a los que se une un receptor de ligando, se mezclan en una relación molar específica de modo que los complejos que se forman tienen suficientes sitios de unión libres en el agente de unión para permitir que los complejos se unan a la pareja de unión inmovilizada sobre una superficie. Por ello, la cantidad de agente de unión a utilizar se determina por la capacidad de unión de la superficie sobre la cual la pareja de unión se ha inmovilizado. La cantidad de pareja de unión, a la que está unida un receptor de ligando, para complejarse con el agente de unión se determina por la funcionalidad deseada total de la superficie de ligando de unión. Por supuesto, esto variará dependiendo del tipo de ensayo a realizar (competitivo o inmunométrico) y de la relación de los receptores de ligando unidos a las parejas de unión.

La presente invención permite que el agente de unión y a la pareja de unión, a los que está unido un receptor de ligando, se mezclan a sus concentraciones finales antes que se pongan en contacto con la superficie sobre la cual la pareja de unión se inmoviliza. Esto posibilita un mayor control sobre la funcionalidad de la superficie de unión a ligando, mayor consistencia en la preparación de la superficie de unión a ligando y una subsecuente mejora en el rendimiento del ensayo.

Preferiblemente, el agente de unión y la pareja de unión, a la que está unido el receptor de ligando, se mezclan juntos de modo que se forman complejos. Esto puede llevar hasta 18 horas y es dependiente de la concentración de los compuestos utilizados. La superficie sobre la cual la pareja de unión se inmoviliza se pone en contacto con los complejos de modo que los complejos llegan a unirse. Esto puede llevar hasta 16 horas y es dependiente de la concentración de los sitios de unión libres en el agente de unión en los complejos.

En una realización preferida de la presente invenciones utilizan, las combinaciones de las parejas de unión que tienen diferentes receptores de ligando unidos, se utilizan en la preparación de la superficie de unión a ligando, produciendo así una superficie de unión a ligando multifuncional la cual puede unir más de un ligando. Dichas superficies de unión a ligando multifuncionales pueden utilizarse para varios ensayos separados o para ensayos combinados, especialmente si se utilizan diferentes especies registradas (por ejemplo enzimas, marcadores radiactivos, etc) para la detección de diferentes ligandos unidos. Preferiblemente, la presente invención proporciona un procedimiento para la preparación de una superficie de unión a ligando multifuncional que comprende Factor Intrínseco biotinilado y proteína de unión a folato biotinilada como receptores de ligando.

La superficie de unión a ligando de la presente invención puede utilizarse en una variedad de diferentes ensayos que incluyen ensayos en sándwich, ensayos de competición, ensayos inmunométricos, ensayos de antígenos y anticuerpos que son indicativos de enfermedades infecciosas, y ensayos de captura de tipos de anticuerpos. Dichos ensayos se describen en Immunoassays, (Diamandis, E.P. y Christopoulos T.K., Eds., Academc Pres, London (1996)). La superficie de unión a ligando de la presente invención puede utilizarse también en procedimientos cromatográficos tales como cromatografía de afinidad. La superficie de ligando de unión de la presente invención puede utilizarse también como un inmunosensor utilizando, por ejemplo, el ensayo de banco de sangre por resonancia de plasmón de superficie o pruebas de embarazo.

La presente invención se describe ahora adicionalmente además por ejemplo con referencia a las figuras adjuntas en las que:

La Figura 1 muestra el procedimiento de la técnica anterior para la preparación de una superficie de unión a ligando, en el que en la etapa 1, el vehículo biotinilado (pareja de unión) se añade a la superficie; en la etapa 2, se elimina por lavado el exceso de vehículo; en la etapa 3, la estreptavidina (agente de unión) se añade a la superficie; en la etapa 4, se elimina por lavado el exceso de estreptavidina; en la etapa 5, se añade a la superficie; el receptor de ligando biotinilado (pareja de unión a la que está unida un receptor de ligando) y en la etapa 6, se elimina por lavado el exceso de receptor de ligando biotinilado;

La Figura 2 muestra el procedimiento de la presente invención, en el que en la etapa 1, el vehículo biotinilado (pareja de unión) se añade a la superficie; en la etapa 2, se elimina por lavado el exceso de vehículo; en la etapa 3, la estreptavidina (agente de unión) y el receptor de ligando biotinilado (pareja de unión a la que está unida un receptor de ligando) se mezclan juntos; y en la etapa 4, el complejo estreptavidina-receptor de ligando biotinilado se añade a la superficie;

La Figura 3 es una curva patrón de la vitamina B12 en un pocillo funcional dual;

La Figura 4 es una curva patrón de folato en un pocillo funcional dual; y

La Figura 5 es un gráfico de bloques que muestra los niveles de señal obtenidos usando superficies de unión a ligando preparadas mediante el procedimiento de la presente invención y utilizando el procedimiento de la técnica anterior.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de una superficie de micropocillo para uso en un ensayo de Folato

1.: Se biotiniló BSA de acuerdo con procedimientos publicados (Bayer y Wilchek(1990), incorporados a la presente memoria como referencia).

2.: Los micropocillos de poliestireno (obtenidos de PCMD Kodak) se recubrieron con BSA biotinilada mediante adsorción pasiva.

3.: La proteína de unión a Folato biotinilada (B-FBP) preparada de acuerdo con los procedimientos publicados (Bayer y Wilchek(1990)) y la estreptavidina se mezclaron en la relación molar de 1,0 x10^{-8} moles de B-FBP a 1,0 x10^{-8} moles de estreptavidina en tampón de borato 0,075 M a pH 9,30. Esto se dejó equilibrar durante al menos 18 horas a 18 - 25ºC.

4.: 200 \mul de este disolución se añadieron a cada micropocillo recubierto.

5.: Los micropocillos se incubaron a temperatura ambiente durante al menos 16 horas.

6.: Los micropocillos se lavaron con una disolución tampón Tris (pH 8,5 , 0,1 M) que contiene sacarosa al 5%, se vaciaron y secaron.

Protocolo de Ensayo de Folato

A un tubo de ensayo se añaden:

1.: 150 \mul de muestra;

2.: 50 \mul de estabilizador (ditiotreitol al 0,8%; ácido ascórbico al 2%);

3.: Se mezcla y se incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos;

4.: Se añaden 100 \mul de desnaturalizante (NaOH 0,85 M; tetraborato de sodio 0,15 M; colorante Naranja Mordiente al 0,01%);

5.: Se mezcla y se incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos;

6.: Se añaden 100 \mul de neutralizador (ácido bórico 0,6 M, yodato potásico 30 mM, Triton X-100 al 2,5%, antiespumante médico C (obtenido de Dow Corning Francia);

7.: Se mezcla;

8.: Se transfieren 80 \mul al pocillo recubierto;

9.: Se añaden 100 \mul de reactivo conjugado de peroxidasa de rábano picante- folato, preparado medianteacoplamiento con EDAC (tampón de fosfato de sodio 50 mM pH 6,4 que contiene: conjugando folato - HRP para dar una concentración de 0,16 \mug/ml de HRP; seroalbúmina humana al 0,5%; bronidox - L al 0,5%; cloruro de sodio al 0,29%; ferricianuro potásico al 0,01%; y sacarosa al 5%);

10.: Se incuba durante 45 minutos a 37ºC con agitación;

11.: Se lava y se añade reactivo señal usando reactivos Vitros Eci suministrados comercialmente por Ortho Clinical Diagnostics (O.C.D.) Amersham UK; y

12.: Se mide la luminiscencia al cabo de 5 minutos y antes de 20 minutos.

Por favor nótese que todos los porcentajes se dan con respecto al volumen y que todas las soluciones son acuosas.

Resultados del Ensayo de Folato Curva de calibración para el ensayo de folato utilizando el procedimiento de la presente invención

\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Nivel de Calibración \+ Unidades lumínicas \+ Unidades lumínicas \+
Unidades\cr  Unidades\+\+\+\cr  (Folato ng/ml) \+ para Repetición I
\+   Repetición 2    \+                lumínicas\cr  medias\+\+\+\cr
 0        \+           60,87   \+  61,12    \+     61,00\cr  0,93   
\+          55,93   \+  52,64     \+    54,29\cr  1,83     \+       
 42,22     \+   44,87   \+      43,55\cr  4,12      \+        23,37 
 \+     22,23    \+     22,80\cr  11,1       \+        7,16   \+    
 7,50       \+    7,33\cr  19,4        \+       3,03  \+       3,00 
      \+  
3,02\cr}

\newpage

Curva de calibración para el ensayo de folato utilizando el procedimiento de la técnica anterior

\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Nivel de Calibración  \+      Unidades lumínicas \+       Unidades
lumínicas    \+ Unidades\cr  Unidades\+\+\+\cr  (Folato ng/ml) \+  
para Repetición I   \+      Repetición 2    \+  lumínicas\cr 
medias\+\+\+\cr  0    \+             110,65     \+   113,65   \+    
    112,15\cr  0,93  \+            107,65   \+   105,22   \+    
106,44\cr  1,83   \+           91,29     \+   91,21       \+     
91,25\cr  4,12    \+          63,60     \+   64,42       \+   
64,01\cr  11,1     \+         20,93     \+   21,43       \+  
21,18\cr  19,4     \+          6,53      \+   6,72       \+    
6,63\cr}

Precisión para depósitos de plasma que contienen 3 ng/ml de folato (n = 12 repeticiones) (concretamente, la medida de la reproducibilidad del ensayo de folato mediante determinación repetitiva de la concentración de una muestra (en este caso una muestra de plasma que contiene 3 ng/ml de folato)).

Resultado usando el procedimiento de la presente invención

\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Unidades lumínicas    \+    % C.V  de Unidades    \+        Dosis
Media    \+     % C. V de\cr  medias \+   lumínicas    \+  de Folato
   dosis\+\cr  20,02 \+  2,56 \+  3,06 ng/ml \+ 
3,25\cr}

Resultados usando el procedimiento de la técnica anterior

\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Unidades  lumínicas  \+    % C.V  de Unidades  \+    Dosis Media  
\+    % C. V  de\cr  medias  \+    lumínicas  \+   de Folato   \+  
dosis\cr  55,02 \+  4,59 \+  2,92 ng/ml    \+   
10,65\cr}

La precisión del ensayo es significativamente mejor utilizando el procedimiento de la presente invención

Ejemplo 2 Preparación de superficies de micropocillo para utilización en un análisis de Vitamina B12

1.: Se recubrieron micropocillos de poliestireno con BSA biotinilada como en el Ejemplo 1.

2.: El Factor Intrínseco Biotinilado (B - IF) y la estreptavidina se mezclaron en relaciones molares de 7 10^{-10} moles de B -IF con 14 10^{-10} moles de estreptavidina en tampón de fosfato 0,1 M de pH 7,0. Esto se dejó equilibrar durante al menos 18 horas a 20 - 28ºC.

3.: Se añadieron 28 10^{-10} moles de BSA biotinilada (B - BSA) para unirse al complejo BIF - estreptavidina. Se requiere una relación de 1:2:4 de B -IF : estreptavidina: B - BSA se requiere para asegurar que todo el IF esté unido.

4.: Se añadieron 210 \mul de esta disolución a cada micropocillo recubierto.

6.: Los micropocillos se lavaron dos veces con Tampón Tris y una vez con tampón Tris que contenía sacarosa al 5%, se vaciaron y secaron.

Protocolo del Ensayo de Vitamina B12

A un tubo de ensayo se añaden:

1.: 150 \mul de muestra;

2.: 50 \mul de estabilizador (ditiotreitol al 1,6% en cloruro de sodio al 0,8%);

3.: 100 \mul de desnaturalizante (NaOH 0,85 M, KCN al 0,01%, tetraborato disódico 0,15 M, colorante Naranja Mordiente al 0,01%);

4.: Se mezcla y se incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos;

5.: Se añaden 100 \mul de neutralizador (ácido bórico 0,6 M, iodato potásico 30 mM, Triton X-100 al 2,5%, antiespuma C Médica);

6.: Se mezcla;

7.: Se transfieren 60 \mul al pocillo recubierto;

8.: Se incuba durante 15 minutos a 37ºC;

9.: Se añaden 100 \mul de conjugado B12-peroxidasa de rábano picante, preparado medianteacoplamiento con EDAC (tampón de fosfato de sodio 50 mM de pH 6,4 que contiene: conjugado de folato - HRP para dar una concentración de 0,16 \mug/ml de HRP; seroalbúmina humana al 0,5%; bronidox - L al 0,5%; cloruro de sodio al 0,29%; ferricianuro potásico al 0,01%; y sacarosa al 5%);

10.: Se incuba durante 30 minutos a 37ºC con agitación;

11.: Se lava y se añade reactivo señal usando reactivos como se describieron en el ejemplo 1; y

12.: Se mide la luminiscencia al cabo de 5 minutos y antes de 20 minutos.

Resultados del Ensayo de Vitamina B12

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Número de \+     Vitamina B12 \+ Vitamina B12  \+       Vitamina
B12\cr  Muestra  \+      Esperada pg/ml   \+    pg/ml procedimiento
\+  pg/ml  procedimiento\cr  \+ (por RIA) \+  de la técnica \+ de la
invención\cr  \+ \+ anterior\+\cr  3135  \+   1491  \+   148  \+   
189\cr  2993  \+   134   \+  174    \+  131\cr  2986  \+   403   \+ 
386   \+   400\cr  3019  \+   204   \+  294   \+   254\cr  3133  \+ 
 1644  \+   857   \+   1161\cr  3230  \+   1114  \+   749   \+  
1169\cr}

Los ensayos realizados sobre las superficies de micropocillo recubiertas utilizando el procedimiento de la presente invención se corresponden más exactamente con los valores esperados a partir del procedimiento RIA y el intervalo dinámico del ensayo se incrementó.

Ejemplo 3 Preparación de un micropocillo funcional dual para utilización en ensayo de B12 y Folato simultáneo o por separado

1.: Se recubrieron micropocillos de poliestireno con vehículo biotinilado (en este caso BSA biotinilada).

2.: La proteína de unión de Folato biotinilada (B - FBP), Factor Intrínseco biotinilado (B - IF) y estreptavidina se mezclaron en relaciones molares de 1,0 10^{-8} moles de B - FBP con 6,0x10^{-10} moles de B - IF y 2,0 x10^{-8} moles de estreptavidina en tampón borato 0,075 M de pH 9,30. Esto se dejó equilibrar durante al menos 18 horas a 20 - 28ºC.

3.: Se añadieron 210 \mul de esta disolución a cada micropocillo recubierto.

4.: Los micropocillos se incubaron a temperatura ambiente durante al menos 16 horas.

5.: Los micropocillos se lavaron con Tampón Tris que contenía sacarosa al 5%, se llenaron y secaron.

Los protocolos de ensayo de Vitamina B12 y Folato son como se describen en los Ejemplos 1 y 2. Las curvas patrón producidas utilizando los micropocillos se muestran en las figuras 3 y 4.

Preparación de un micropocillo para utilización en un ensayo de colágeno NTx (N - telopéptidos de tipo 1

2.: El péptido NTx biotinilado y la estreptavidina se mezclaron en relaciones molares de 5,13 x10^{-8} moles de péptido de 1,33 x10^{-8} moles de estreptavidina o 1,00 x10^{-7} moles de péptido a 1,66 10^{-8} moles de estreptavidina en tampón de fosfato sódico 0,1 M de pH 7,0.

3.: Se añadieron 200 \mul de esta disolución a cada micropocillo recubierto.

5.: Los micropocillos se lavaron con un tampón Tris (pH 8,4 , 0,1 M) que contenía sacarosa al 5%, se vaciaron y secaron.

Evaluación de Pocillos NTx

1.: Se añaden 200 \mul de una solución de conjugado de peroxidasa de rábano picante y anticuerpo anti-NTX marcado a los pocillos preparados como se describió anteriormente y a los pocillos producidos utilizando el procedimiento de la técnica anterior. (El procedimiento de recubrimiento de la técnica anterior utiliza péptido NTx biotinilado a 100 ng/ml y biotina libre a 100 ng/ml como solución de unión a ligando biotinilado que se adiciona a los pocillos en la etapa 5 del procedimiento de recubrimiento de la técnica anterior mostrado en la Figura 1).

2.: Se incuba durante 30 minutos a 37ºC con agitación;

3.: Se lava y se añade reactivo señal usando los reactivos Vitros Eci suministrados comercialmente por O.C.D. Amersham UK; y

4.: Se mide la luminiscencia al cabo de 5 minutos.

Los resultados se dan en la Figura 5 y muestran que el procedimiento de la presente invención da una superficie de unión a ligando que tiene una mayor capacidad para unir el ligando.

Referencias

1.: Kochwa, S., Bronwell, M., Rosenfield, R.E. and Wasserman, L.R. (1967) Adsorption of proteins by polystyrene particles. I. Molecular unfolding and acquired immunogenicity of IgG. J. Immunol 99.981.

2.: Suter, M. and Butler, J.E. (1986) The Immunochemistry of sandwich ELISAs. II. A novel system prevents denaturation of capture antibodies. Immunol. Lett. 14313.

3.: Dierks S.E., Butler, J.E. and Richardson, H.B. (1986) Altered recognition of surface-absorbed compared to antigen bound antibodies in the ELISA. Mol. Immunol. 23.927.

4.: Butler, J.E., Ni, L., Nessler, R., Joshi, K.S., Suter, M., Rosenberg, B., Chang, J., Brown, W.R., and Cantarero, L.A. (1992) The physical and functional behaviour of capture antibodies adsorbed on polystyrene. J. Immunol. Methods 150, 77 - 90.

5.: Davies, J., Dawkes, A.C., Haymes, A.G., Sunderland, R.F., and Edwards, J.C. (1995) Scanning tunnelling microscopy and dynamic contact angle studies of the effects of partial denaturation on immunoassay solid phase antibody. J. Immunol. Methods 186, 111 - 123.

6.: Davies, J., Dawkes, A.C., Haymes, A.G., Roberts, C.J., Sunderland, R.F., Wilkins, M.J., Davies, M.C., Tendler, S.J.B., and Edwards, J.C. (1994) A scanning tunnelling microscopy comparison of passive antibody adsorption and biotinylated antibody linkage to streptavidin on microtitre wells. J. Immunol. Methods 167, 263 - 269.

7.: Davies, J., Roberts, C.J., Dawkes, A.C., Sefton, J., Edwards, J.C., Claseby, T.O., Haymes, A.G., Davies, M.C., Jackson, D.E., Lomas, m., Shakeshift, K.M., Tendler, S.J.B., Wilkins, M.J., and Williams, P.M. (1994) Use of scanning probe microscopy and surface plasmon resonance as analytical tools in the study of antibody coated microtitre wells. Langmuir 10(8) 2654 - 2661.

8.: Bayer, E.A., and Wilchek, M. (1990) Protein biotinylation. In: M. Wilchek and E.A. Bayer (Eds.), Methods in Enzymology, Vol. 184. Academic Press, New York, pp 138.

Claims

1. Un procedimiento para la preparación de una superficie de unión a ligando que comprende:

i.: mezclar una pareja de unión, a la que se une un receptor del ligando, y un agente de unión específico para la pareja de unión en una relación molar específica de modo que se forman los complejos que tienen suficientes sitios de unión libres en el agente de unión para permitir que los complejos se unan a la pareja de unión inmovilizada sobre una superficie;

iii.: eliminar cualquiera de los compuestos no unidos.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que el agente de unión es un compuesto, proteína o agente que se une a biotina.

3. El procedimiento de la reivindicación 2 en el que el agente de unión es la estreptavidina.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la pareja de unión es biotina o un derivado o uno de sus homólogos funcionales.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que los receptores de ligando son anticuerpos o sus fragmentos funcionales.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que los receptores de ligando son el Factor Intrínseco o la proteína de unión a folato.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que la superficie es la superficie de un micropocillo, una perla o una varilla.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que se prepara una superficie de unión a ligando multifuncional utilizando al menos dos diferentes receptores de ligando.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que los diferentes receptores de ligando son el Factor Intrínseco y la proteína de unión a folato.