JPS5923251A - 多価抗原の測定法及び測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は液体試料中の少なくとも二官能性のりがンド（
抗原）を測定するだめの免疫化学的方法である。

異なる抗原決定基に合わせた２種の抗体を使用する多価
抗原（ペプチド、）０ロチイン）の感度の高い測定は二
部位ラジオイムノアッセイ法もしくは二部位酵素イムノ
アッセイ法として例えはＪ　、Ｃ１１ｎ、Ｃｈｅｍ、Ｃ
１１ｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、第１８巻（１９８０）、第１
９７〜２０８頁に記載されテいる。この公知測定法が最
も多〈実施されており、ここではセファロース、アガロ
ース、プラスチック小管等の好適な担持材に結合させる
ことにより固相に存在する第１の抗体と測定すべき抗原
とをまず共に恒温保持する。この第１の恒温保持の間、
一般に大過剰で存在しなけれはならない第１の抗体は測
定すべき抗原の抗原決定基と結合する。次いで、引き続
き行なわれる第２の恒温保持において人血清フ０ロチイ
ンのような非特異性物質による、もしくは交叉反応性抗
原による妨害を遮断するだめに、常法で固相から試料液
体を分離する。次いで、一定量の第２の標識抗体を液相
中で固相と共に恒温保持する。

この際、測定すべき抗原の同し結合位に対する両方の抗
体間の競合により試験の感度が低下することを防ぐため
に、第２の抗体の特異性は第１の抗体とは異なる決定基
にあわせて選択されているのが有利である。

この第２の恒温保持の間に、同４＊に規則的に過剰に存
在する標識された第２の抗体は測定すべき抗原の分子上
の全結合位と反応する。第２の恒温保持後、標識物質の
活性は固相に関しても上澄中でも測定することかできる
。通常、液相を洗出した後、固相を測定する。最も有利
な場合は一定の活性が測定すべき抗原の量にほぼ比例す
る。

この２工程ザンドイツチ法は場合により交叉反応性抗原
が第１の相分離の際にず−Ｃに除去されるという利点を
有−ノーる。このことは両方の抗体が高置の感度に対す
る要求により本当に異なる特異性を有していなければな
らないテスト系において特に重要である。この場合には
両方の抗体の１方にのみ特異性に関して高い要求があり
、他方の抗体は交叉反応性抗原に対し完全に特異性であ
る必要はない。

しかしながらこの方法は三つの著しい欠点を有する。

１、１し１の恒温保持工程において１方の反応体は固相
として存在し、他方の反応体は溶液中に存在する。従っ
て、反応の速度定数は両方の反応対（抗原及び第１の抗
体）が溶液中に存在するより僅かである。結合していな
い抗原は相分離の際に除去されて、結果が誤差を有する
ようＫなるので、固相にすべての抗原分子が結合するま
で恒温保持を続けなければならない。

２．抗原に特異的に結合性の抗体の固相への結合はその
僅かな結合収量のだめに比較的多量の第１の抗体を必要
とするが、この抗体は多くの場合非常に高価な物質であ
り、特に抗血清を特異性という理由によし小さな動物、
例えば家兎、モルモット等から獲得しなければならない
場合は高価である。更に固相−＼の結合反応の際に抗体
への親和性の減少が生し、このことは感度を低下させる
。

６　回し抗原に異なる特異性の２種の抗体を獲得するこ
とは一般に費用かかかり、かついろいろな限定をうけて
のみ可能である。例えは、ここでは異なる２種の動物を
免疫化するか、又は１種の動物からの抗体ｆ固体群を測
定すべき抗原−＼の免疫吸着により好適なフラグメント
に分離しなければならない。

前記の欠点を取り除くだめの種々の実験もすでに公知で
ある。米国特許第４０９８８７６号明細書によれば、抗
原とアイノトーゾ標識化した溶解した抗体とで第１の恒
温保持を実施する。

その後固相結合抗体を加え、第２の恒温保持を行なう。

ここでは更に相分離のみが必要であり、このことは感度
と操作性をある程度高める。しかしながら、両方の抗体
を高い特異性で抗原に合わせなけれはならないので、特
異性の問題が解決せずに残る。更に、多量の交叉反応性
抗原の存在によりθ１ｊ定すべき抗原の見かけの濃度が
、第２の抗体の場合による非特異性１（おいては高めら
れ、第１の抗体の非特異性においては下げられる。

西ドイツ国特許公開第２９２５５６５号公報に記載され
ている方法では同相で存在する第１の抗体及０・標識化
し溶解した第２の抗体を抗原と同時１・て恒温保持する
。ここでも前にあげた方法におけるような同じ問題が生
じる。更に前記の基礎とした方法に関して記載した欠点
２及び６は未解決のままである。

１９７８９７８年１０月６日イボ昭５３−１２６８０２
号公報に記載された方法は、第２の抗体に対して特異的
に合わせた固相抗体を使用し、第２の抗体は？Ａ１１定
すべき抗原と結合性である。

ここでは抗原に対して合わせた抗体の固相への結合は回
避された。しかしながら、抗原と特異的に結合性の抗体
をただ１種使用するので感度は下がる。測定すべき抗原
の濃度検出は抗原及び一定量のアイソト−プ標識化抗原
間の特異的抗体との競合反応に関して行なわれる。

更に、Ｃ１１ｎ　、　Ｃｈｅｍ　、第２７巻６号、１９
８１年、第８２６〜８２７頁にはクレアチンキナーゼ、
１．Ａ　Ｂ−同種酵素のラジオメトリーによる測定法が
記載されており、この方法では第１の恒温保持において
抗原を同時に異なる特異性で、かつ異なる動物種からの
非標識化皮Ｏ・標識化抗体と反応させる。第２の工程で
は第１の恒温保持工程の非標識抗体に対して特異性を有
する固相に存在する抗体を添加する。この方法の欠点は
、２つの異なる抗原特異性抗体及び３つの異なる動物種
を必要とすると（・う点である。

従って、本発明の課題は前記基礎方法の欠点の１１固以
上を従来公知の方法より良好に回避することである。

この課題は第１及び第６のレセプターが液相にあり、か
つ抗原と結合性であり、第２のレセソ０ターは固相にあ
り、かつ第１のレセプターと結合性であり、第６のレセ
プターは標識を有しており、かつ第１及び第２のレセプ
ターと交叉反応しな（・、三種の異なるレセプターと恒
温保持し、液相から固相を分離（７，１つの相に関して
標識を測定することてより多１ｍｊ抗原を測定するだめ
の方法において、抗原をず′＼ての６つのレセプターと
又は第１及び第２のレセプターと同時に恒温保持して、
次いで相を分離し、場合により固相を第６のレセプター
と恒温保持し、新たに相を分離することにより解決する
。

レセプターとしては本発明の範囲において特異的に結合
性の完全抗体、抗体フラグメント又は抗体又は抗体フラ
グメントとハプテンとの結合体を使用する。第１のレセ
プターとしては完全抗体又はハフ０テンと共有結合した
抗体を使用するのが有利である。

第２のレセプターとしては第１のレセプターの１部との
み結合性の抗体を使用するのが有利であり、特に第１の
レセプターのＦｃ部と結合性である抗体が有利である。

選択的に第２のレセプターとして第１のレセプターの７
・ブテン部又はＦａｂ一部又は第１のレセプター全体と
特異的に結合性の抗体を使用することもできる。

第２のレセプターと交叉反応してはいけない第６のレセ
プターは抗原と結合性で、第１のレセプターとは異なる
動物種から得られる抗体であってよい。

しかしながら、第１のレセプターの１部、例えばフラグ
メントからなり、従って第１のレセプターと同じ動物種
から得られる第６のレセプターを使用するのが有利であ
る。このことは第１のレセプターが・・ブテンを有する
抗体からなり、かつ第２の１７セプクーはこのノ・ブテ
ンとのみ結合性である場合にも言える。第６のレセプタ
ーが第１のレセプターのド非フラグメントである場合特
に有利である。第６のレセプターとしては第２のレセプ
ターと同じ動物種からの抗体も使用することができる。

どちらの選択も６種のレセプターに２種の動物種のみが
必要である。第２のし七ブタ−がハゾテ／とのみ結合性
である場合、三種のレセプターすべてにわスカ１種の動
物種のみが必要である。

公知量で使用される第６のレセプターは専門家に公知の
方法で標識化される。標識化は酵素、螢光物質、化学発
光性物質又は放射性物質とカンプリングすることにより
行なわれる。この種のレセプターの標識化法は専門家に
公知であり、例えば（月ｉｎ　、　Ｃｈｉｍ　、　Ａｃ
ｔａ第８１！（１９７７年）第１〜４０頁に記載されて
おり、ここでは詳しく・説明は省略する。

本発明の方法は測定すべき、少なくとも２価の抗原を含
有する試料を三種すべての受容体と同時に恒温保持する
ことにより実施することができる。この場合、恒温保持
の後固相及び液相を分離し、標識化した第６のレセプタ
ーの量を液相中で又は有利に固相中で…り定する。

しかしながら本発明の有利な実施形によれは、抗原含有
試料を先ず第１及び第２のレセプターと共′恒温ツ持し
・その後この相を分離し・分離した同相のみを第６のレ
セプターと共に第２の恒温保持工程で恒温保持する。そ
の後、再び液相から固相を分離し、前記のように標識化
した第６のレセフ０ターの量を１方の相で測定する。

第１又は第６のレセプターが抗原と特異的に結合性であ
り、他のレセプターは他の抗原とも結合性である、すな
わち非特異性である場合、この２工程恒６児保持で十分
である。１工程恒温保持、すなわち三種全部のレセフ０
ターとの１工程恒温保持の場合、第１及び第６のレセフ
０り−は特異的に結合性でなければならない。

固相中に存在する第２のレセプターの不溶性担持拐への
結合は固体の担持物頂上に生物学的に活性の蛋白質を固
定するために専門家に公知の常法により実施することか
できる。共−ｈ結合でも吸着結合でも好適である。しか
しながら高い収址が達せられ、方法も簡単であるので、
例えはプラスデックへのだだの吸着結合が有利である。

この際、特に好適であるのは内部表面が第２のレセプタ
ーを吸着的に積層しているボリスヂロール及び類似のシ
ラスチックからなる小施し、相分離のためには液相を手
拭、１管から例えは吸引等により除去することで１−分
である。

小試験管の洗浄の後、標識の測定もその中で行ない、特
（（標識が酵素で行なわれている時有利である。標識酵
素、例えはベルオキ／ダーゼ又はβ−ガラクト／ダーゼ
の活性は−・般に単にこのために公知の方法で測定する
だけで十分である。測定した酵素活性は測定すべき多価
抗原の址の尺度である。第２の１７セプターの固体相担
持拐としては粒状物質１例えばイオン交換体、モレキュ
ラーシープ材料、ガラス小粒子、プラスチック小管等を
挙げることかできる。

標識が酵素ではなく放射性物質、アイノト−プ、螢光性
物質又は化学発光性物質で行なわれるならば、ここでも
専門家に公知の方法で実施される。この測定法の記載は
ここでは省略する。

意外にも、本発明により常用の二層ザンドイソチ法にお
けるより明らかに高い感度が達せられることがわかった
。更に、第１のレセプターが固相に存在する場合に可能
である濃度より著しく僅かな濃度で第１のレセプターを
使用することができる。

本発明の有利な実施形により、第１のレセフ０クーのＦ
ｃ一部又は第１のレセプターとカップリングしているハ
シテンに対して合わせた第２のレセプターを使用すると
、第１のレセプターの結合部と抗原との結合反応の場合
により存在する立体的障害が回避されるので、更に感度
の上昇が達せられる。このことは抗原を特に僅かな濃度
で測定しなければならない時、例えば血清中のチレオト
ロピンの測定における場合、特に有利である。

本発明により第６のレセプターとして第１の１／セプタ
ーのＦａｂ−フラグメントを使用するならば、レセプタ
−２は抗体のｌｉで一部に対する、又は抗体とカンフ０
リングしたハプテンに対する決定基のみを有しているの
でレセプター１及びレセプタ−６は同し動物種からのも
のが有利であるということは明らかである。

本発明のもう１つの課題は多価抗原の測定のための乾燥
試薬であり、この試薬は異なる溶解性の、抗原と結合性
の、そのうちの１種が標識を有するレセプター２種と、
溶解性の非標識Ｉ／セゾターと結合性の不溶性の第ろの
レセプターとを自負し、かつ標識化レセプターが第１の
レセプターの１部を含有するか、又は不溶性の第６のレ
セプターと同し動物種から由来しており、ここで不溶性
レセプター及び可溶性非標識レセプターが物理的に分離
して存在することを特徴とする。

物理的分離とは例えは不溶性レセプター及び可溶性非標
識レセプターを段階的に順次凍結乾燥させるが、その際
例えば裾からなっていてよい不活性中間層をはじめに凍
結乾燥したアクセプターの層上に担持させることにより
行なうことができる。こうして、例えは第２のレセプタ
ーを先ずプラスチック小管の内壁上に凍結乾燥により不
溶性とし、その上に例えば蔗糖からなる不活性中間層を
凍結乾燥させ、次いで同様に凍結乾燥した非標識化可溶
性レセプターである第１のレセプターを加えることによ
り可能である。この除温３の可溶性標識化レセプターは
第１のレセプターと混合して、又はこれと分離して添加
することができる。不活性中間層としては炭水化物の他
にも容易に可ｍ性のホリマーを、例えば水溶性ポリマー
からの箔の形で使用するととがてきる。

本発明は少なくとも抗原決定基を２つ有するすべての抗
原を測定するために好適である。このための例はチレオ
トロピン（ＴＳＨ）、１−フェトプロティン（Ａ、ＦＰ
）、ｈｃｃ、癌胎生的抗原、黄体化ホルモン（ＬＨ）　
、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、β２−ミクログロブリ
ン、酸性前立腺ホスファターゼ、プロラクチン、フェリ
チン及びイン７ユリ／である。

本発明においてはレセプター１は抗原と同一相間で反応
する。従って、この反応は固相に結合した第１のレセプ
ターを使用する場合におけるより高い速度定数を有する
。固相への固定の際の抗体損失を回避することができる
ので、第１のレセプターの量は更に減少させることがで
きる。

Ｃ１１ｎ　、　Ｃｈｅｍ　、第２７巻６号（１９８１）
に記載されている方法と異なり、第１及び第６レセゾタ
ーを２種の異なる動物種から獲得し、かつレセプタ−２
がレセプター１とだけ反応し、し化ブタ−６と反応しな
いように選択するということは本発明においては必要な
（・のである。

レセプタ−１及びレセプター６のだめの抗体を同一動物
種から獲得することは抗血清獲得のために大きな動物を
利用することをも可能とする。

前記の利点は唯一の恒温保持工程を有する本発明方法を
実施する際にも言える。しかしながら唯一の恒温保持工
程を有する場合、二面の恒温保持工程を有する有利な実
施形におけるような高い特異性は達せられない。

更に、本発明により感度も上昇する。ＴＳ）］にとって
感度は４０　ｐｊｉ　／ｍｂ　（１μＵ含１７０　ｐｙ
／ｍｅ）より小さく・ことが判明し、２部位アッセイ法
（サンドイツチ法）ｌＬおいては１００　ｐｇ／　ｍｅ
を越える。

次に実施例につき本発明を更に詳細に説明する： 例１ チレオトロピン（’ｒｓＨ）の測定 家兎Ｉ戸からのＦｃＹ−フラグメントで免疫化すること
により得られた羊の抗−家兎−ＦｃＹ約１００　ｎｇを
吸着的に積層した（積層法は常用の公知法と同じ）プラ
スチック手拭１験管中に試料又は標準液（チレオトロぎ
ンを上昇量で又は未知歓で含有）２００μｌ及び緩衝剤
Ａ及び家兎の抗−ＴＳＨ−抗体２０　ｎｙ　／　ｍｌか
らなる溶液１０００μｌをピペットで入れる。（緩衝剤
１〜：　ＮａＨ２ＰＯ４，／　ＫＨ２ＰＯ４，Ｉ　Ｄ　
ｍＭ、　■、Ｈ７，０）この溶液を室温で１２〜１６時
間恒温保持する；その後試験管内容物を吸引除去し、０
．９％ＮａＣ１ｍ液で１回洗浄し、引き続きペルオキシ
ダーゼ濃度６７　ｍＵ　／　ｍｅでＰｏｌ、）が共付結
合している羊の抗−ＴＳ）Ｉ−抗体の水Ｍ液からなる共
存溶液１０００μｅを小試験管にビペツＩ・で入れる。

室温で恒温保持２時間後、試験管の内容物を吸引除去し
、洗浄し、引き続きペルオキシダーゼ活性を検出するだ
めの試薬１０００　ＩＬｌを試１験管にピペットで入れ
る。

試薬としてはＡＢＴＳ（１，８ｌｌ１ｌｖｆ、過硼酸塩
ろ、ろｍ１ｖｌ、燐酸塩／クエン酸塩−緩衝液１００　
ｍＭ中１、、Ｈ４，４）を使用する。更に室温で１時間
恒温保持した後、内容物をクイベット中に入れ、吸光を
空値として試薬に対し４．０５　ｎｍで測定する。得ら
れた吸光から第１図に記載した検量線が得られる。

抗体へのペルオキシダーゼの共有結合（カップリング）
はウィルソン（Ｍ　、　　Ｂ　、Ｗｉ］−５ｏｎ　）、
ナカネ（Ｐａｕｌ　Ｋ、　Ｎａｋａｎｅ）の方法、エル
ゼフイア／ノースホランド、ビオメディカル、プレス（
Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　／Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ　Ｂ
ｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ）の゛′イムンフルオ
レツセンス・アンド・リレイテソド・ステイニング・テ
クニックス（Ｉｍｍ−ｕｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　
ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈ
−ｎｉｑｕｅｓ）　”、１９７８年の第２１５〜２２４
頁、゛′ソリ−ント・デベロソプメンソ・イン・ず・パ
ーヨーディト・メトード・オプ・コンニュケゞイテイン
グ・ホース・ラデイソ／ユ・ノｅ　−Ｊ−キンダーゼ（
ＨＲＰＯ）・ツー・アンチボディーズ（Ｒｅｃｅｎｔ　
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｐｅｒｊｏ
ｄ、ａｔｅ　Ｍｅｔ−ｈｏｄｅ　ｏｆ　Ｃｏｎｊｕｇａ
ｔｉｎｇ　Ｈｏｒｓｅ　Ｒａｄ、ｊ−ｓｈ　Ｐｅｒｏｘ
ｉｄ−ａｓｅ（ＨＲＰＯ）　ｔｏ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ　）　”中に記載の方法により行なわれる。

ＡＢＴＳ　＝　２．２’−アジノジ〔６−ニチル−ベ／
ズチアゾリンースルホネ−）（６））。

例２ α１−フエトフ０ロチイン（／＼ＦＰ）の測定試料又は
Ａｉ♂Ｐの上昇量を含有する標準２００μｌＪを燐酸塩
緩衝液、１００．　ｍＭ　、　ｐＨ６，８，１０００μ
ｌ中に溶けている抗−ＡＦＰ−抗体ろＯｎ、９と共に、
例１に使用した（家兎ＩｇＣ−のＦｃ　−７ラグメント
含有）小試験管中にピペノ）・で装入する。

室温で２時間恒温保持した後吸引除去し、洗浄し、ベル
オキ／ダーゼに結合した羊の抗−ＡＦＰ−抗体からなる
結合体１０００μｌ（ナカネによる）を小試験管中にピ
ペットで入れる。更に室温で２時間恒温保持した後、あ
らたに吸引除去し、洗浄し、基質溶液を小試験管壁に固
定したペルオキシダーゼ活性の検出のためにピベノＩ・
で測り入れる。１時間恒温保持した後、４０５　ｎｍで
光度計により吸収を測定する。

評価を例１におけると同様に記載した第２図の検量線に
より行なう。

例６ α１−フェトプロティンの測定 この実施形においては家兎の抗−ジゴキシン−抗体を吸
着的に積層した（抗−ジゴキシン−抗体１００　ｎｇ）
小試験管を使用する。

抗体１としてはジゴキシン及び羊の抗−Ａ、ＦＰ−抗体
’（２０ｎｇ／ｍｌ　）からなる結合体を使用する。結
合体の製造は西ドイツ国特許第２５６７１２９号明細書
中に記載されている。

これ以外は例２と同様に行なう。得られだ検量線を第６
図に記載する。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第６図は本発明による実施例により得られた検
量線の図であり、第１図は実施例１の方法により得られ
た試料中のチレオトロビンの量と４０５　ｎｍにおける
吸光度との関係を示す検量線の図であり、第２図は実施
例２の方法により得られた試料中のＡＦＰの川と４０５
　ｎｍにおける吸光度との関係を示を検量線の図であり
、第６図は実施例乙の方法により得られた検７５／−ｆ ＦＩＧ、１ ＡＦＰ町／、、ＬＬ １ＫＩ ＦＩＧ、２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　第１及び第６のレセプターが液相中に存在し、か
   つ抗原と結合性であり、第２のレセプターは固相中に存
   在し、かつ第１のレセプターと結合性であり、第６のレ
   セプターは標識を有しており、かつ第１及び第２のレセ
   プターと交叉反応しない、三種の異なるレセプターと恒
   温保持し、液相から固相を分離し、１方の相の標識を測
   定することにより多価抗原を測定するだめの方法におい
   て、抗原を三種すべてのレセプターと同時に、又は第１
   及び第２のレセプターと同時に恒温保持し、次いで相を
   分離し、場合により固相を第６のレセプターと共に恒温
   保持し、新たに相を分離することを特徴とする多価抗原
   の測定法。 ２、第１のレセプターとして抗体を使用する特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ６、　第１のレセプターとしてハプテンと共有結合した
   抗体を使用する特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、　第１のレセプターの１部とたけ結合性の第２のレ
   セプターを使用する特許請求の範囲第２項記載の方法。 ５、　第１のレセプターのＦｃ一部又はハゾテ／部と結
   合性である第２のレセプターを使用する特許請求の範囲
   第ろ項記載の方法。 ６、　第６のレセプターとして第１のレセフ０ターの１
   部を使用する特許請求の範囲第２項〜第５項のいずれか
   １項に記載の方法。 Ｚ　第１のレセプターのＦａｂ−フラグメントである第
   ３のレセプターを使用する特許請求の範囲第６項記載の
   方法。 ８、　第６のレセプターとして第２のレセプターと同し
   動物種から由来する抗体を使用する特許請求の範囲第１
   項〜第７項のいずれか１項に記載の方法。 ９、　三種すべてのレセプターか同じ動物種から由来す
   る抗体もしくはそのフラグメントを含有する特許請求の
   範囲第８項記載の方法。 １０、酵素、螢光性物質、化学発光性物質又は放射性物
   質で標識されている第６のレセフ０クーを使用する特許
   請求の範囲第１項〜第９項のいずれか１項に記載の方法
   。 １１、第１及び第６のレセプターが液相中に存在し、〃
   ・つ抗原と結合性であり、第２のレセプターは固相中に
   存在し、かつ第１のレセプターと結合性であり、第３の
   レセプターは標識を有しており、かつ第１及び第２のレ
   セフ０ターと交叉反応しない、三種の異なるレセプター
   と恒温保持し、液相から固相を分離し、１方の相の標識
   を測定することにより多価抗原を測定するための乾燥試
   薬において、この試薬は抗原と結合性の異なる溶解性の
   、そのう＼ ちの１種が標識を有するレセプター２種と、可溶性の非
   標識レセプターと結合性の不溶性の第６のレセプターと
   を含有し、かつ標識化レセプターが第１のレセプターの
   １部を含有するか、又は不溶性のレセプターと同じ動物
   種から由来しており、ここで不酸性しセゾター及び可溶
   性非標識レセプターが物理的に分離して存在することを
   特徴とする多価抗原の測定試薬。